ES2252964T3 - Promotores preferidos de semillas. - Google Patents
Promotores preferidos de semillas.Info
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Abstract
Un promotor aislado que es capaz de dirigir la transcripción de un modo preferido de semillas, donde dicho promotor comprende (a) la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC.ID.Nº 1 ó 7; o (b) una secuencia que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia con SEC.ID.Nº 1 ó 7, donde el % de identidad de secuencia con SEC.ID.Nº 1 ó 7, se basa en la secuencia completa de SEC.ID.Nº 1 ó 7 y se determina por análisis con GAP versión 10 usando parámetros por defecto; o (c) una secuencia que hibrida con SEC.ID.Nº 7, en condiciones rigurosas; o (d) un ácido nucleico complementario a un ácido nucleico de (a), (b) o (c).
Description
Promotores preferidos de semillas.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular de plantas, más particularmente a la regulación
de la expresión génica en plantas.
La expresión de secuencias de ADN heterólogas en
un hospedador vegetal depende de la presencia de un promotor unido
de manera operativa que es funcional en el hospedador vegetal. La
elección de la secuencia promotora determinará cuándo y dónde, en
el organismo, se expresa la secuencia de ADN heteróloga. Cuando se
desea la expresión continua en todas las células de una planta, se
utilizan promotores constitutivos. Por el contrario, cuando se
desea la expresión génica en respuesta a un estimulo, los promotores
inducibles son el elemento regulador de elección. Cuando se desea
la expresión en tejidos u órganos específicos, pueden usarse
promotores específicos de tejido. Es decir, pueden dirigir la
expresión en tejidos u órganos específicos. Dichos promotores
específicos de tejido pueden ser constitutivos o inducibles. En
cualquier caso, pueden incluirse secuencias reguladoras adicionales
cadena arriba y/o cadena abajo de la secuencia promotora central en
construcciones de expresión de vectores de transformación para
provocar niveles variados de expresión de secuencias de nucleótidos
heterólogas en una planta transgénica.
Frecuentemente, es deseable tener una expresión
constitutiva o inducible de una secuencia de ADN en tejidos u
órganos particulares de una planta. Por ejemplo, el valor
nutricional aumentado de una planta puede conseguirse por
manipulación genética del genoma de la planta para que comprenda un
promotor preferido de semillas unido de manera operativa a un gen
heterólogo de modo que se produzcan proteínas con contenido de
aminoácidos potenciados en la semilla de la planta.
Como alternativa, puede ser deseable inhibir la
expresión de una secuencia de ADN nativa en un tejido de la planta
para conseguir un fenotipo deseado. En este caso, dicha inhibición
puede conseguirse con transformación de la planta para que
comprenda un promotor específico de tejido unido de manera operativa
a una secuencia de nucleótidos antisentido, de modo que la
expresión de la secuencia antisentido produzca un trascrito de ARN
que impida la traducción del ARNm de la secuencia de ADN nativa.
El desarrollo de semillas implica embriogénesis y
sucesos de maduración así como procesos de adaptación fisiológica
que suceden en la semilla para asegurar la supervivencia de la
progenie. Las semillas vegetales en desarrollo acumulan y almacenan
carbohidratos, lípidos, y proteínas que se usan posteriormente
durante la germinación. La expresión de genes de proteínas de
almacenamiento en semillas sucede principalmente en el eje
embrionario y cotiledones y en el endosperma de semillas en
desarrollo pero nunca en tejidos vegetativos maduros. Generalmente,
los patrones de expresión de proteínas de semilla están altamente
regulados. Esta regulación incluye la regulación espacial y
temporal durante el desarrollo de la semilla. Se acumulan y se
descomponen una diversidad de proteínas durante la embriogénesis y
el desarrollo de la semilla y proporcionan un excelente sistema para
investigar diferentes aspectos de la regulación génica así como
para proporcionar secuencias reguladoras para su uso en
manipulación genética de plantas.
Por tanto, el aislamiento y caracterización de
promotores preferidos de semillas que pueden servir como regiones
reguladoras para la expresión de secuencias de nucleótidos
heterólogas de interés de un modo preferido de semillas son
necesarios para la manipulación genética de plantas.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar una nueva secuencia de nucleótidos para modular la
expresión génica en una planta.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un promotor aislado capaz de dirigir la trascripción
de un modo preferido de semillas.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporciona un método de control mejorado de un producto endógeno o
exógeno en la semilla de una planta transformada.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un método para proporcionar cambios útiles en el
fenotipo de una semilla de una planta transformada.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un método para producir un nuevo producto en la
semilla de una planta transformada.
Un objeto adicional de la presente invención en
proporcionar un método para producir una nueva función en la
semilla de una planta transformada.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente
invención se refiere a:
un promotor aislado capaz de dirigir la
trascripción de un modo preferido de semillas, donde dicho promotor
comprende:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos espuesta en SEC.ID.Nº 1 ó 7; o
- (b)
- una secuencia que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia con SEC.ID.Nº 1 ó 7, donde el% de identidad de secuencia con SEC.ID.Nº 1 ó 7 se basa en la secuencia completa de SEC.ID.Nº 1 ó 7 y se determina por análisis con GAP versión 10 usando parámetros por defecto; o
- (c)
- una secuencia que hibrida con SEC.ID.Nº 7, en condiciones rigurosas; o
- (d)
- un ácido nucleico complementario al ácido nucleico de (a), (b) o (c).
En otros aspectos, la presente invención se
refiere a casetes de expresión que comprenden el promotor unido de
manera operativa a una secuencia de nucleótidos, vectores que
contienen el casete de expresión, y plantas transformadas de manera
estable con al menos un casete de expresión.
En un aspecto adicional, la presente invención se
refiere a un método para modular la expresión en la semilla de una
planta transformada de manera estable que comprende las etapas de
(a) transformar una célula vegetal con un casete de expresión que
comprende el promotor de la presente invención unido de manera
operativa a al menos una secuencia de nucleótidos; (b) hacer crecer
la célula vegetal en condiciones de crecimiento vegetal y (c)
regenerar una planta transformada de manera estable a partir de la
célula vegetal donde la expresión de la secuencia de nucleótidos
altera el fenotipo de la semilla.
Se proporcionan composiciones y métodos para
regular la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en
una planta. Las composiciones son nuevas secuencias de nucleótidos
para promotores vegetales preferidos de semillas, más
particularmente regiones de inicio de la trascripción aisladas de
los genes vegetales Cim1 (mensaje inducido por citoquinina); cZ19B1
(zeína de 19 KDa de maíz); y mi1ps
(mio-inositol-1-fosfato
sintasa). Se proporciona un método para expresar una secuencia de
nucleótidos heteróloga en una planta usando las secuencias de
inicio de la transcripción descritas en este documento. El método
comprende transformar una célula vegetal con un vector de
transformación que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga
unida de manera operativa a uno de los promotores vegetales de la
presente invención y regenerar una planta transformada de manera
estable a partir de la célula vegetal transformada. De este modo,
las secuencias promotoras son útiles para controlar la expresión de
productos endógenos así como exógenos de un modo preferido de
semillas.
Cadena abajo de y bajo la regulación del inicio
de la transcripción de la region específica de semillas habrá una
secuencia de interés que proporcionará la modificación del fenotipo
de la semilla. Dicha modificación incluye la modulación de la
producción de un producto endógeno, como la cantidad, distribución
relativa, o similares, o producción de un producto de expresión
exógeno para proporcionar una nueva función o producto en la
semilla.
De acuerdo con la invención, se proporcionan
construcciones de nucleótidos que permiten el inicio de la
transcripción en semillas. Las construcciones de la invención
comprenden regiones de inicio de la transcripción reguladas
asociadas con la formación de semillas y tejidos de semilla. Por
tanto, las composiciones de la presente invención comprenden nuevas
secuencias de nucleótidos para promotores vegetales, más
particularmente promotores preferidos de semillas para los genes
Cim 1 (mensaje inducido por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 KDa de
maíz); mi1ps
(mio-inositol-1-fosfato
sintasa).
Los promotores para estos genes pueden aislarse a
partir de la region 5’ no traducida que flanquea sus sitios de
inicio de la transcripción respectivos. Los métodos para el
aislamiento de regiones promotoras son bien conocidos en la
técnica. Por "aislado" se entiende que las secuencias
promotoras pueden extraerse por técnicas moleculares o sintetizarse
por un medio químico. En cualquier caso, el promotor se retira de al
menos una de sus secuencias flanqueantes en su estado nativo. Las
secuencias para las regiones promotoras se exponen como se ha
indicado anteriormente.
Los métodos están fácilmente disponibles en la
técnica para la hibridación de secuencias de ácido nucleico. Las
secuencias promotoras de otras plantas pueden aislarse de acuerdo
con técnicas bien conocidas basadas en su homología de secuencia
con las secuencias promotoras expuestas en este documento. En estas
técnicas, toda o parte de la secuencia promotora conocida se usa
como sonda que hibrida selectivamente con otras secuencias
presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonados
(es decir, bibliotecas genómicas) a partir de un organismo
elegido.
Por ejemplo, la secuencia promotora completa o
partes de la misma pueden usarse como sondas capaces de hibridar de
manera específica con secuencias promotoras correspondientes. Para
conseguir la hibridación específica en una diversidad de
condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas y son
preferiblemente de al menos aproximadamente 10 nucleótidos de
longitud, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 20
nucleótidos de longitud. Dichas sondas pueden usarse para amplificar
secuencias promotoras correspondientes a partir de un organismo
elegido por el proceso bien conocido de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Esta técnica puede usarse para aislar secuencias
promotoras adicionales a partir de un organismo deseado o como
ensayo de diagnostico para determinar la presencia de la secuencia
promotora en un organismo.
Dichas técnicas incluyen exploración por
hibridación de bibliotecas de ADN sembradas en placas (placas o
colonias; véase, por ejemplo Innis et al. (1990) PCR
Protocols, A Guide to Methods and Applications, eds., Academia
Press).
Los términos "condiciones rigurosas" o
"condiciones de hibridación rigurosa" incluyen referencia a
condiciones en las que una sonda hibridará con su secuencia diana,
a un grado detectablemente superior que otras secuencias (por
ejemplo, al menos 2 veces por encima de la de fondo). Las
condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y serán
diferentes en diferentes circunstancias. Controlando la rigurosidad
de las condiciones de hibridación y/o lavado, pueden identificarse
secuencias diana que son un 100% complementarias a la sonda (sondeo
homólogo). Como alternativa, pueden ajustarse las condiciones de
rigurosidad para permitir alguna falta de coincidencia en
secuencias de modo que se detecten grados más bajos de similitud
(sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda es de menos de 1000
nucleótidos de longitud, preferiblemente de menos de 500 nucleótidos
de longitud.
Típicamente, las condiciones rigurosas serán
aquellas en las que la concentración salina es de menos de
aproximadamente 1,5 M de iones Na, típicamente aproximadamente de
0,01 a 1,0 M de concentración de iones Na (u otras sales) a un pH
de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30ºC
para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos
aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, de más de 50
nucleótidos). Las condiciones rigurosas también pueden conseguirse
con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida.
Las condiciones de rigurosidad baja de ejemplares incluyen
hibridación con una solución tampón de formamida del 30 al 35%,
NaCl 1 M, SDS al 1% (dodecil sulfato sódico) a 37ºC, y un lavado en
1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) de 50 a
55ºC. Las condiciones de rigurosidad moderada ejemplares incluyen
hibridación en formamida del 40 al 45%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC,
y un lavado en 0,5X a 1X SSC de 55 a 60ºC. Las condiciones de
rigurosidad alta ejemplares incluyen hibridación en formamida al
50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,1X SSC de 60 a
65ºC. Los tiempos de hibridación pueden variar de aproximadamente
cuatro horas a aproximadamente dieciséis horas y no definen la
rigurosidad del protocolo.
La especificidad típicamente es la función de los
lavados después de la hibridación, siendo los factores críticos la
fuerza iónica y temperatura de la solución de lavado final. Para
híbridos ADN-ADN, la T_{m} puede aproximarse a
partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138:
267-284 (1984): T_{m} = 81,5ºC + 16,6 (log M) +
0,41 (% GC) -0,61 (% form) -500/L; donde M es la molaridad de
cationes monovalentes,% GC es el porcentaje de nucleótidos de
guanosina y citosina en el ADN,% form es el porcentaje de formamida
en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en
pares de bases. La T_{m} es la temperatura (a fuerza iónica y pH
definidos) a la que el 50% de una secuencia diana complementaria
hibrida con una sonda que coincide perfectamente. T_{m} se reduce
en aproximadamente 1ºC por cada 1% de falta de coincidencia; por
tanto, T_{m,} las condiciones de hibridación y/o lavado pueden
ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por
ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la
T_{m} puede disminuirse 10ºC. Generalmente, las condiciones
rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC por
debajo del punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia
específica y su complementaria a una fuerza iónica y pH definidos.
Sin embargo, las condiciones tremendamente rigurosas pueden utilizar
una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, ó 4ºC por debajo del punto de
fusión térmico (T_{m}); las condiciones de rigurosidad moderada
pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, ó 10ºC por
debajo del punto de fusión térmico (T_{m}); las condiciones de
rigurosidad baja pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11,
12, 13, 14, 15, ó 20ºC por debajo del punto de fusión térmico
(T_{m}). Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y
lavado, y T_{m} deseados, los especialistas entenderán que se
describen de manera inherente las variaciones en la rigurosidad de
las soluciones de hibridación y/o lavado. Para propósitos de
definición de la invención, las condiciones rigurosas serán las que
incluyen un lavado a aproximadamente 5ºC por debajo del punto de
fusión térmico (T_{m}) para la secuencia específica y su
complementaria y a una fuerza iónica y pH definidos. Si el grado
deseado de falta de coincidencia provoca una T_{m} por debajo de
45ºC (solución acuosa) o 32ºC (solución de formamida) se prefiere
aumentar la concentración de SSC de modo que pueda usarse una
temperatura más alta. Se encuentra una directriz amplia acerca de
la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization
with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of
principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe
assays", Elsevier, Nueva York (1993); y Current Protocols in
Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel, et al., Eds., Greene
Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York
(1995). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y.). En general, las secuencias que corresponden a
secuencias promotoras de la invención e hibridan con la secuencia
promotora descrita en este documento serán al menos un 50%
homólogas, un 70% homólogas, e incluso un 85% homólogas o más con
las secuencias descritas. Es decir, la similitud de secuencia de
las secuencias puede variar, compartiendo al menos aproximadamente
un 50%, aproximadamente un 70%, e incuso un 85% de similitud
de
secuencia.
secuencia.
Las regiones promotoras de la invención pueden
aislarse de cualquier planta, incluyendo, aunque sin limitación
maíz (Zea mays), Brassica que no son verdura (Brassica
napus, Brassica rapa ssp.), alfalfa (Medicago sativa),
arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo
(Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus
annuus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine
max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum
tuberosum), cacahuete (Arachis hypogaea), algodón
(Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), yuca
(Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos
nucifera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos
(Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té
(Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate
(Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba
(Psidium guajava), mango (Mangifera indica), aceituna
(Olea europaea), avena, cebada, verduras, ornamentales, y
coníferas. Preferiblemente, las plantas incluyen maíz, soja,
girasol, cártamo, Brassica, trigo, cebada, centeno, alfalfa,
y
sorgo.
sorgo.
La secuencia codificante expresada por los
promotores de la invención puede usarse para variar el fenotipo de
las semillas. Son de interés diversos cambios en el fenotipo
incluyendo la modificación de la composición de ácidos grasos en
semillas, alteración del perfil de almidón o carbohidratos,
alteración del contenido de aminoácidos de la semilla, y similares.
Estos resultados pueden conseguirse proporcionando la expresión de
productos heterólogos o la expresión aumentada de productos
endógenos en semillas. Como alternativa, los resultados pueden
conseguirse proporcionando una reducción de la expresión de uno o
más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores en la
semilla. Estos cambios provocan un cambio en el fenotipo de la
semilla transformada.
Los genes de interés incluyen, generalmente, los
implicados en el metabolismo de aceites, almidón, carbohidratos o
nutrientes, así como los que afectan al tamaño del grano, carga de
sacarosa y similares.
Las categorías generales de genes de interés para
los propósitos de la presente invención incluyen, por ejemplo, los
genes implicados en la información, tal como dedos de cinc, los
implicados en la comunicación, tal como quinasas, y los implicados
en gestiones internas, tal como proteínas de choque térmico. Las
categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen
genes que codifican rasgos importantes para la agronomía,
resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a
herbicidas, y características del grano. Se reconoce que cualquier
gen de interés puede unirse de manera operativa al promotor de la
invención y expresarse en la semilla.
Los rasgos agronómicamente importantes tales como
contenido de aceite, almidón y proteínas pueden alterarse
genéticamente además del uso de los métodos de cruce tradicionales.
Las modificaciones incluyen aumentar el contenido de ácido oleico,
aceites saturados e insaturados, aumentar los niveles de lisina y
azufre y proporcionar aminoácidos esenciales, y también la
modificación de almidón. Las modificaciones de la proteína
hordiotionina se describen en los documentos de Estados Unidos con
Nº de serie 08/838.763 presentado en 10 de abril de 1997 (patente
de Estados Unidos Nº 5.990.389); 08/824.379 presentado el 26 de
marzo de 1997 (patente de Estados Unidos Nº 5.885.801); y
08/824.382 presentado el 26 de marzo de 1997 (patente de Estados
Unidos Nº 5.885.802). Otro ejemplo es una proteína de semilla rica
en lisina y/o azufre codificada por la albúmina 2S de soja descrita
en documento de Estados Unidos Nº de serie 08/618.911 presentado el
20 de marzo de 1996 (documento WO97/35023), y el inhibidor de
quimiotripsina de cebada, Williamson et al. (1987) Eur. J.
Biochem. 165:99-106. Los derivados de los
siguientes genes pueden hacerse por mutagénesis dirigida de sitio
para aumentar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el
polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el
polipéptido con alto contenido en lisina de cebada (BHL), se
obtiene del inhibidor de quimiotripsina de cebada, documento de
Estados Unidos Nº de serie 08/740.682 presentado el 1 de noviembre
de 1996 y el documento PCT/US97/20441 presentado el 31 de octubre
de 1997, (documento WO98/20133). Otras proteínas incluyen proteínas
vegetales ricas en meteonina tales como de la semilla del girasol
(Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress
on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal
Feedstuffs; Applewhite, H. (ed.); American Oil Chemists Soc.,
Champaign, IL: 497502), maíz (Pedersen et al. (1986) J.
Biol. Chem. 261: 6279; Kirihara et al. (1988) Gene
71: 359) y arroz (Musumura et al. 1989) Plant Mol.
Biol. 12: 123). Otros genes agronómicamente importantes
codifican látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de
almacenamiento en la semilla y factores de transcripción.
Los rasgos agronómicos en las semillas se pueden
mejorar alterando la expresión de genes que afectan a la respuesta
del crecimiento y desarrollo de la semilla durante estrés
medioambiental, Cheikh-N et al (1994)
Plant Physiol. 106 (1): 45-51) y genes que
controlan el metabolismo de carbohidratos para reducir el malogro
del grano en el maíz, Zinselmeier et al (1995) Plant
Physiol. 107(2): 385-391.
Los genes de resistencia a insectos pueden
codificar resistencia a plagas que tienen gran resistencia de
producción tales como el gusano de la raíz, la oruga cortadora, el
Barrenador Europeo del Maíz, y similares. Dichos genes incluyen,
por ejemplo, genes de la endotoxina de Bacillus thuringiensis
(Patentes de Estados Unidos Nº 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514;
5.723.756; Geiser et al. (1986) Gene 48: 109);
lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol.
24: 825); y similares.
Los genes que codifican rasgos de resistencia a
enfermedades pueden incluir genes de destoxificación, tales como
frente a fumonosina (Solicitud de Patente Nº 08/484.815 presentada
el 7 de junio de 1995); genes de resistencia a virulencia (avr) y
enfermedad (R) (Jones et al. (1994) Science 266: 789;
Martin et al. (1993) Science 262: 1432; Mindrinos
et al. (1994) Cell 78: 1089; y similares.
La calidad del grano se refleja en rasgos tales
como nivel y tipos de aceite, saturados e insaturados, calidad y
cantidad de aminoácidos esenciales, y niveles de celulosa. En el
maíz, las proteínas hordotionina modificadas, descritas en los
documentos de Estados Unidos Nº de serie 08/838.763 (Patente de
Estados Unidos Nº 5.990.389) presentado el 10 de abril de 1997;
08/824.379 presentado el 26 de marzo de 1997 (Patente de Estados
Unidos Nº 5.885.801); y 08/824.382 presentado el 26 de marzo de
1997 (Patente de Estados Unidos Nº 5.885.802) proporcionan
descripciones de modificaciones de proteínas para propósitos
deseados.
Los rasgos comerciales también pueden codificarse
en un gen o genes que podrían alterar o aumentar por ejemplo, el
almidón para la producción de papel, tejidos y etanol, y
proporcionar la expresión de proteínas con otros usos comerciales.
Otro uso comercial importante de plantas transformadas es la
producción de polímeros y bioplásticos tales como los descritos en
la Patente de Estados Unidos Nº 5.602.321 presentada el 11 de
febrero de 1997. Los genes tales como
\beta-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxibutirato
sintasa), acetoacetil-CoA reductasa (véase,
Schubert et al. (1988) J. Bacteriol
170(12):5837-5847) facilitan la expresión de
polihidroxialcanoatos (PHA).
Los productos exógenos incluyen enzimas vegetales
y productos así como los de otras fuentes incluyendo procariotas y
otras eucariotas. Dichos productos incluyen enzimas, cofactores,
hormonas, y similares. Puede aumentarse el nivel de proteínas de la
semilla, particularmente proteínas de semilla modificadas que tienen
una distribución de aminoácidos mejorada para mejorar el valor
nutricional de la semilla. Esto se consigue por la expresión de
dichas proteínas que tienen un contenido de aminoácidos
potenciado.
Como se ha observado, la secuencia de nucleótidos
heteróloga unida de manera operativa a uno de los promotores
descritos en este documento puede ser una secuencia antisentido para
un gen diana. Por "secuencia de nucleótidos de ADN
antisentido" se entiende una secuencia que está en una
orientación inversa a la orientación
5'-a-3' normal de esa secuencia de
nucleótidos. Cuando se suministra a una célula vegetal, la expresión
de la secuencia de ADN antisentido evita la expresión normal de la
secuencia de nucleótidos de ADN para el gen diana. La secuencia de
nucleótidos antisentido codifica un transcrito de ARN que es
complementario a y capaz de hibridar con el ARN mensajero endógeno
(ARNm) producido por transcripción de la secuencia de nucleótidos de
ADN para el gen diana. En este caso, la producción de la proteína
nativa codificada por el gen diana se inhibe para conseguir una
respuesta fenotípica deseada. Por tanto, las secuencias promotoras
descritas en este documento pueden unirse de manera operativa a
secuencias de ADN antisentido para reducir o inhibir la expresión de
una proteína nativa de la semilla vegetal.
Por "promotor" o "región del inicio de la
transcripción" se entiende una región reguladora de ADN que
comprende habitualmente una caja TATA capaz de dirigir la ARN
polimerasa II para que inicie la síntesis del ARN en el sitio de
inicio de la transcripción apropiado para una secuencia codificante
particular. Un promotor puede comprender adicionalmente otras
secuencias de reconocimiento generalmente colocadas cadena arriba o
5’ de la caja TATA, mencionadas como elementos promotores cadena
arriba, que influyen en la velocidad del inicio de la
transcripción. Se reconoce que teniendo identificadas las secuencias
de nucleótidos para las regiones promotoras descritas en este
documento, pertenecen al objetivo de la técnica aislar e identificar
elementos reguladores adicionales en la región no traducida 5’
cadena arriba de las regiones promotoras particulares identificadas
en este documento. Por tanto, las regiones promotoras descritas en
este documento generalmente se definen adicionalmente porque
comprenden elementos reguladores cadena arriba tales como los
responsables de la expresión tisular y temporal de la secuencia
codificante, potenciadotes y similares. Del mismo modo, los
elementos promotores que posibilitan la expresión en el tejido
deseado tales como la semilla, pueden identificarse, aislarse, y
usarse con otros promotores centrales para confirmar la expresión
preferida de semillas.
Las secuencias reguladoras de la presente
invención, cuando se unen de manera operativa a una secuencia de
nucleótidos heteróloga de interés y se insertan en un vector de
transformación, posibilitan la expresión preferida de semillas de
la secuencia de nucleótidos heteróloga en las semillas de una planta
transformada de manera estable con este vector. Por "preferido de
semillas" se entiende la expresión en la semilla, incluyendo al
menos uno de embrión, grano, pericarpo, endosperma, nucelo,
aleurona, pedicelo, y similares.
Por "secuencia de nucleótidos heteróloga" se
entiende una secuencia que no es de origen natural con la secuencia
promotora. Aunque esta secuencia de nucleótidos es heteróloga a la
secuencia promotora, puede ser homologa, o nativa, o heteróloga, o
extraña, al hospedador vegetal.
Se reconoce que los promotores pueden usarse con
sus secuencias codificantes nativas para aumentar o disminuir la
expresión que provoca un cambio en el fenotipo en la semilla
transformada.
Las secuencias promotoras aisladas de la presente
invención pueden modificarse para proporcionar un intervalo de
niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Por
tanto, puede utilizarse menos de las regiones promotoras completas
y se mantiene la capacidad de dirigir la expresión preferida de
semillas. Sin embargo, se reconoce que los niveles de expresión de
ARNm pueden disminuirse con deleciones de partes de las secuencias
promotoras. Generalmente, al menos aproximadamente 20 nucleótidos de
una secuencia promotora aislada se usarán para dirigir la expresión
de una secuencia de nucleótidos.
Se reconoce que para aumentar los niveles de
transcripción, pueden utilizarse potenciadotes en combinación con
las regiones promotoras de la invención. Los potenciadotes son
secuencias de nucleótidos que funcionan para aumentar la expresión
de una región promotora. Los potenciadotes son conocidos en la
técnica e incluyen la región potenciadora de SV40, el elemento
potenciador 35S, y similares.
Las modificaciones de las secuencias promotoras
aisladas de la presente invención pueden proporcionar un intervalo
de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Por tanto,
pueden modificarse para ser promotores débiles o promotores
fuertes. Generalmente, por "promotor débil" se entiende un
promotor que dirige una expresión de una secuencia codificante aun
nivel bajo. Por "nivel bajo" se entiende niveles de
aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente 1/100.000
transcritos a aproximadamente 1/500.000 transcritos. Por el
contrario, un promotor fuerte dirige la expresión de una secuencia
codificante a un nivel alto, o a aproximadamente 1/10 transcritos a
aproximadamente 1/100 transcritos a aproximadamente 1/1.000.
Los fragmentos promotores, tales como los que se
obtienen de mutagenesis dirigida de sitio, se incluyen por las
composiciones de la presente invención.
Las variantes biológicamente activas de las
secuencias promotoras también se incluyen por el método de la
presente invención. Dichas variantes deben mantener la actividad
promotora, particularmente la capacidad de dirigir la expresión en
semilla o tejido de semilla. Las variantes biológicamente activas
incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras nativas de la
invención que tienen una o más sustituciones, deleciones o
inserciones de nucleótidos. La actividad promotora puede medirse
por análisis de transferencia de Northern, medidas de actividad
informadora cuando e usan fusiones transcripcionales, y similares.
Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (2a ed. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Los siguientes términos se usan para describir
las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o
polinucleotidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana
de comparación", (c) "porcentaje de identidad de
secuencia", y (d) "identidad sustancial".
(a) Como se usa en este documento, "secuencia
de referencia" es una secuencia definida usada como base para la
comparación de la secuencia. Una secuencia de referencia puede ser
un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por
ejemplo, como segmento de una secuencia promotora de longitud
completa, o la secuencia promotora completa.
(b) Como se usa en este documento, "ventana de
comparación", hace referencia a un segmento contiguo y
especificado de una secuencia polinucleotídica, donde la secuencia
polinucleotídica puede compararse a una secuencia de referencia y
donde la parte de la secuencia polinucleotídica en la ventana de
comparación puede comprender adicciones o deleciones (es decir,
huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no
comprende adicciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de
las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de
al menos 20 nucleótidos contiguos de longitud y opcionalmente puede
ser de 30, 40, 50, 100 o más nucleótidos contiguos de longitud. Los
especialistas en la técnica entienden que para evitar un similitud
alta a un a secuencia de referencia debido a la inclusión de huecos
en la secuencia polionucleotidica, típicamente se introduce una
penalización por hueco, y se sustrae de la cantidad de
coincidencias.
Los métodos de alineamiento de secuencias para la
comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento
óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse por el
algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970)
J. Mol. Biol. 48:443. La ejecución informatizada de este algoritmo
incluye, aunque sin limitación GAP, y BLAST, en el paquete de
software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG) (575
Science Drve, Madison, Wisconsin). Un ejemplo de la familia de
programas BLAST, que puede usarse para buscar similitud de
secuencia en bases de datos para los propósitos de esta invención,
incluye el programa BLASTN para secuencias cuestión de nucleótidos
frente al conjunto de datos de secuencia de nucleótidos. Véase,
Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular
Biology, Capítulo 19 (Greene Publishing and
Wiley-Interscience, Nueva York). El algoritmo de
alineamiento de homología BLAST es útil para comparar fragmentos de
la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de referencia con
secuencias de bases de datos públicas. Después es necesario aplicar
un método para alinear la secuencia de referencia completa con las
secuencias de la base de datos para establecer un porcentaje de
identidad (en el caso de polinucleótidos) o un porcentaje de
similitud (en el caso de polipéptidos). El algoritmo GAP es un
método similar.
GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsh (J.
Mol. Biol. 48: 443- 453, 1970) para hallar el alineamiento de dos
secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y
minimiza la cantidad de huecos. GAP considera todos los
alineamientos posibles y posiciones de hueco y crea el alineamiento
con la cantidad más grande de bases coincidentes y la menor
cantidad de huecos. Esto tiene en cuenta la provisión de una
penalización por creación de hueco y una penalización por extensión
de hueco en unidades de bases coincidentes. GAP debe tener una
ganancia de penalizaciones por creación de hueco en cantidad de
coincidencias para cada hueco que inserta. Si se elige una
penalización por extensión de hueco mayor de cero, GAP debe, además,
obtener un beneficio para cada hueco insertado de la longitud del
hueco por la penalización por extensión de hueco. Los valores de
penalización por creación de hueco y los valores de penalización por
extensión de hueco por defecto en el paquete de software de la
versión 10 de Wisconsin Genetics para secuencias proteicas son 8 y
2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos la penalización
por creación de hueco por defecto es 50 mientras que la penalización
por extensión de hueco por defecto es 3. Las penalizaciones por
creación de hueco y extensión de hueco pueden expresarse como un
número entero seleccionado entre el grupo de números enteros
compuesto por de 0 a 200. Por tanto, por ejemplo, las
penalizaciones por creación de hueco y extensión de hueco pueden ser
0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,
55, 60, 65 o superior.
GAP representa un miembro de la familia de
mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia,
pero ningún otro miembro tiene una calidad mejor. GAP muestra cuatro
tipos de mérito para alineamientos: Calidad, Proporción, Identidad,
y Similitud. La Calidad es la unidad métrica maximizada para alinear
las secuencias. La Proporción es la calidad dividida por la
cantidad de bases en el segmento más corto. El Porcentaje de
Identidad es porcentaje de los símbolos que coinciden realmente. El
Porcentaje de Similitud es el porcentaje de los símbolos que son
similares. Los símbolos que están a través de los huecos se ignoran.
Una similitud se valora cuando el valor de la matriz de valores
para un par de símbolos es mayor o igual a 0,50, el umbral de
similitud. La matriz de valores usada en la versión 10 del paquete
de software Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (véase Henikoff &
Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).
Salvo que se indique otra cosa, para propósitos
de la invención, el método preferido para determinar el porcentaje
de identidad de secuencia es por el algoritmo GAP versión 10 usando
parámetros por defecto.
(c) Como se usa en este documento, "porcentaje
de identidad de secuencia" significa el valor determinado por
comparación de dos secuencias alineadas de manera óptima sobre una
ventana de comparación, donde la parte de la secuencia
polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender
adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la
secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones)
para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se
calcula determinando la cantidad de posiciones en las que existe
una base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias para
producir la cantidad de posiciones coincidentes, dividiendo la
cantidad de posiciones coincidentes por la cantidad total de
posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el
resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de
secuencia.
(d) El termino "identidad sustancial" de
secuencias polinucleotídicas significa que un polinucleótido
comprende una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de
secuencia, preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al
menos un 90% y mucho más preferiblemente al menos un 95%, en
comparación con una secuencia de referencia usando uno de los
programas de alineamiento descritos usando parámetros
convencionales.
Otra indicación de que las secuencias de
nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas de
ácido nucleico hibridan entre sí en condiciones rigurosas.
Generalmente, las condiciones de temperatura rigurosas se
seleccionan para que sean de 5ºC a 2ºC por debajo del punto de
fusión (T_{m}) para la secuencia específica a una fuerza iónica
y pH definidos. La desnaturalización o fusión de ADN sucede sobre un
intervalo de temperatura estrecho y representa la alteración de la
doble hélice en sus cadenas simples complementarias. El proceso
habitualmente se caracteriza por la temperatura del punto medio de
transición, T_{m}, que a veces se describe como la temperatura de
fusión. Hay disponible fórmulas en la técnica para la determinación
de temperaturas de fusión. Típicamente, las condiciones de lavado
rigurosas son aquellas en las que la concentración salina es
aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es a 50, 55, ó
60ºC.
Las secuencias de nucleótidos para promotores
preferidos de semillas descritos en la presente invención, así como
variantes y fragmentos de los mismos, son útiles en la manipulación
genética de cualquier planta cuando está unido de manera operativa
a la secuencia de nucleótidos heteróloga cuya expresión se quiere
controlar para conseguir una respuesta fenotípica deseada. Por
"unido de manera operativa" se entiende que la transcripción o
traducción de la secuencia de nucleótidos heteróloga está bajo la
influencia de la secuencia promotora. De este modo, las secuencias
de nucleótidos para los promotores de la invención pueden
proporcionarse en casetes de expresión junto con secuencias de
nucleótidos heterólogas para la expresión en la planta de interés,
más particularmente en la semilla de la
planta.
planta.
Dichos casetes de expresión comprenderán una
región de inicio de la transcripción que comprende una de las
secuencias de nucleótidos promotoras de la presente invención, o
variantes o fragmentos de las mismas, unidas de manera operativa a
la secuencia de nucleótidos cuya expresión se quiere controlar por
los promotores preferidos de semillas descritos en este documento.
Dicho casete de expresión se proporciona con un pluralidad de sitios
de restricción para la inserción de la secuencia de nucleótidos a
estar bajo el control de la regulación transcripcional de las
regiones reguladoras, el casete de expresión puede contener
adicionalmente genes marcadores de selección.
El casete de expresión incluirá en dirección
5'-a-3' de la transcripción, una
región de inicio de la transcripción y la traducción, una secuencia
de nucleótidos heteróloga de interés, y una región de terminación de
la transcripción y la traducción funcional en plantas. La región de
terminación puede ser nativa para la región de inicio de la
transcripción que comprende uno de las secuencias de nucleótidos
promotoras de la presente invención, puede ser nativa para la
secuencia de ADN de interés, o puede obtenerse de otra fuente. Las
regiones de terminación adecuadas están disponibles del plásmido Ti
de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la
octopina sintasa y opalina sintasa. Véase también, Guerineau et
al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144;
Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et
al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen
et al. (1990) Plant Cell 2:
1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene
91: 151-158; Ballas et al. (1989)
Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; Joshi et
al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:
9627-9639.
El casete de expresión que comprende la secuencia
promotora de la presente invención unida de manera operativa a una
secuencia de nucleótidos heteróloga también puede contener al menos
un secuencia de nucleótidos adicional para un gen a
co-transformar en el organismo. Como alternativa, la
secuencia o secuencias adicionales pueden proporcionarse en otro
casete de expresión.
Cuando es apropiado, la secuencia de nucleótidos
heteróloga cuya expresión se quiere poner bajo el control de la
secuencia promotora de la presente invención y cualquier secuencia o
secuencias de nucleótidos adicionales puede optimizarse para la
expresión aumentada en la planta transformada. Por tanto, estas
secuencias de nucleótidos pueden sintetizarse usando codones
preferidos por las plantas para expresión mejorada. Hay métodos
disponibles en la técnica para sintetizar secuencias de nucleótidos
preferidas de plantas. Véase, por ejemplo las Patentes de Estados
Unidos Nº 5.380.831 y 5.436.391, y Murray et al. (1989)
Nucleic Acids Res. 17: 477-498, incorporado
en este documento como referencia.
Se conocen modificaciones de secuencia
adicionales para potenciar la expresión génica en un hospedador
celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican
señales de poliadenilación falsas, repeticiones tipo transposón, y
otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser nocivas para la
expresión génica. El contenido en G-C de la
secuencia de nucleótidos heteróloga puede ajustarse a niveles medios
para un hospedador celular dado, calculados por referencia a genes
conocidos expresados en la célula hospedadora. Cuando es posible,
la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias
en horquilla previstas.
Los casetes de expresión pueden contener
adicionalmente secuencias líder 5’ en la construcción del casete de
expresión. Dichas secuencias líder pueden funcionar para potenciar
la traducción. Los líderes de traducción son conocidos en la
técnica e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, el líder
de EMCV (región no codificante 5’ de la Encefalomiocarditis)
(Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad
Sci. USA 86: 6126-6130); líderes de potivirus,
por ejemplo, el líder de TEV (el Virus del Grabado del Tabaco)
(Allison et al. (1986)); el líder de MDMV (Virus del Mosaico
Enano del Maíz) (Virology 154: 9-20);
proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina humana
(BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:
90-94); el líder non traducido del ARNm de la
proteína de cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA
4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:
622-625); el líder del virus del mosaico del tabaco
(TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA,
páginas 237-256); y el líder del virus del moteado
clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology
81: 382385). Véase también Della-Cioppa et
al. (1987) Plant Physiology 84: 965-968.
También pueden utilizarse otros métodos que se sabe que potencian
la traducción y/o estabilidad del ARNm, por ejemplo, intrones, y
similares.
En aquellos casos en los que es deseable tener el
producto expresado de la secuencia de nucleótidos heteróloga
dirigida a una organela particular, particularmente el plástido,
amiloplasto o vacuola, o retículo endoplásmico, o secretado en la
superficie celular o de manera extracelular, el casete de expresión
puede comprender adicionalmente una secuencia codificante para un
péptido de tránsito. Dichos péptidos de tránsito son bien conocidos
en la técnica e incluyen, auque sin limitación, el péptido de
tránsito para la proteína vehículo de acilo, la subunidad pequeña
de la RUBISCO, EPSP sintasa vegetal, y similares.
En la preparación del casete de expresión, pueden
manipularse los diversos fragmentos de ADN, de modo que se
proporcionen secuencias de ADN en la orientación apropiada y, cuando
es apropiada, en la pauta de lectura abierta apropiada. Hacia este
fin, pueden emplearse adaptadores o enlazadores para unir los
fragmentos de ADN o pueden implicarse otras manipulaciones para
proporcionar los sitios de restricción convenientes, la retirada de
ADN superfluo, la retirada de sitios de restricción, o similares.
Para este propósito, pueden implicarse mutagénesis in vitro,
reparación de cebador, restricción, hibridación,
re-sustituciones, por ejemplo, transiciones y
transversiones.
Pueden incluirse genes informadores o genes
marcadores de selección en los casetes de expresión. Pueden
encontrarse ejemplos de genes informadores conocidos en la técnica
en, por ejemplo, Jefferson et al. (1991) en Plant
Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer
Academic Publishers), páginas 1-33; DeWet et
al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7: 725-737;
Goff et al. (1990) EMBO J. 9:
2517-2522; Kain et al. (1995)
BioTechniques 19: 650-655; y Chiu et
al. (1996) Current Biology 6:
325-330.
Los genes marcadores de selección de células o
tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia
a antibióticos o resistencia a herbicidas. Los ejemplos de genes
marcadores de selección incluyen, aunque sin limitación, genes que
codifican resistencia a cloranfenicol (Herrera Estrella et
al. (1983) EMBO J. 2: 987-992);
metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature
303: 209-213; Meijer et al. (1991) Plant
Mol. Biol. 16: 807-820); higromicina (Waldron et
al. (1985) Plant Mol. Biol. 5: 103-108;
Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:
219-227); estreptomicina (Jones et al. (1987)
Mol. Gen. Genet. 210: 86-91);
espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al.
(1996) Transgenic Res. 5: 131-137);
bleomicina (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:
171-176); sulfonamida (Guerineau et al.
(1990) Plant Mol. Biol. 15: 127-136);
bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:
419-423); glifosato (Shaw et al. (1986)
Science 233: 478-481); fosfinotricina (DeBlock et
al. (1987) EMBO J. 6: 2513-2518).
Otros genes que podría servir de utilidad en la
recuperación de sucesos transgénicos pero podría no ser necesario
en el producto final incluirían, aunque sin limitación, ejemplos
tales como GUS (glucoronidasa; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol.
Rep. 5: 387), GFP (proteína fluorescente verde; Chalfie et
al. (1994) Science 263: 802), luciferasa (Riggs et
al. (1987) Nucleic Acids Res. 15 (19): 8115; Luehrsen
et al. (1992) Methods Enzymol. 216:
397-414) y los genes del maíz que codifican
producción de antocianina (Ludwig et al. (1990) Science
247: 449).
Los protocolos de transformación, así como
protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas
pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es
decir, monocotiledónea o dicotiledónea, marcada para la
transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias de
nucleótidos en células vegetales y su posterior inserción en el
genoma vegetal incluyen microinyección (Crossway et al.
(1986) Biotechniques 4: 320-334),
electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83: 5602-5606), transformación mediada
por Agrobacterium (Townsend et al., Patente de Estados Unidos
Nº 5.563.055; Zhao et al documento WO US98/01268),
transferencia génica directa (Paszkowski et al. (1984)
EMBO J. 3: 2717-2722), y aceleración de
partículas balísticas (véase, por ejemplo, Sanford et al.,
Patente de Estados Unidos Nº 4.945.050; Tomes et al. (1995)
"Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile
Bombardment," en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture:
Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips
(Springer-Verlag, Berlín); y McCabe et al.
(1988) Biotechnology 6: 923-926). Véase
también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:
421-477; Sanford et al. (1987) Particulate
Science and Technology 5: 27-37 (cebolla);
Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:
671-674 (soja); McCabe et al. (1988)
Bio/Technology 6: 923-926 (soja); Finer y
McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:
175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor.
Appl. Genet. 96: 319-324 (soja); Datta et
al. (1990) Biotechnology 8: 736-740
(arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85: 4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988)
Biotechnology 6: 559-563 (maíz); Tomes, Patente de
Estados Unidos Nº 5.240.855; Buising et al., Patentes de
Estados Unidos Nº 5.322.783 y 5.324.646; Tomes et al. (1995)
"Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile
Bombardment," en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture:
Fundamental Methods, ed. Gamborg
(Springer-Verlag, Berlín) (maíz); Klein et
al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444
(maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:
833-839 (maíz); Hooykaas-Van
Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:
763-764; Bowen et al., Patente de Estados
Unidos Nº 5.736.369 (cereales); Bytebier et al. (1987)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349
(Liliaceas); De Wet et al. (1985) en The Experimental
Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al.
(Longman, Nueva York), páginas 197-209 (polen);
Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:
415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor.
Appl. Genet. 84: 560-566 (transformación
mediada por pelo); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell
4: 1495-1505 (electroporación); Li et
al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255
y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:
407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996)
Nature Biotechnology 14: 745-750 (maíz
mediante Agrobacterium tumefaciens).
Las células que se han transformado pueden
hacerse crecer en plantas de acuerdo con los medios convencionales.
Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell
Reports 5: 81-84. Estas plantas después pueden
hacerse crecer, y se polinizan con la misma cepa transformada o
diferentes cepas, y el se identifica híbrido resultante que tiene
la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada.
Pueden hacerse crecer dos o más generaciones para asegurar que la
expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada se
mantiene de manera estable y se hereda y después las semillas se
recogen para asegurar que se ha conseguido la expresión
constitutiva de la característica fenotípica deseada.
El casete de expresión que comprende la secuencia
promotora particular de la presente invención unida de manera
operativa a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés puede
usarse para transformar cualquier planta. De este modo, se pueden
obtener plantas, células vegetales, tejido vegetal, semilla, y
similares modificados genéticamente.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
Las regiones promotoras para los genes del maíz
Cim 1 (mensaje inducido por citoquinina) (Nº de acceso a Genbank
U03860); cZ19B1 (zeína de 19KDa del maíz) (Nº de acceso a Genbank
M12143); y mi1ps
(mio-inositol-1-fosfato
sintasa) (Nº de acceso a Genbank U32511); se aislaron de plantas
del maíz y se clonaron. Estos genes se seleccionaron como fuentes
de promotores preferidos de semillas en base a la expresión espacial
de sus productos génicos. El método para su aislamiento se describe
a continuación.
El procedimiento para el aislamiento de
promotores se describe en el Manual de Usuario para el kit Genome
Walker vendido por Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto,
California. El ADN genómico de la línea de maíz
V3-4 A63 se preparó colocando hijas de plantas de
semillero de 10 días de edad en rejillas en nitrógeno líquido, y el
ADN se preparó como se describe por Chen y Dellaporta (1994) en
The Maize Handbook, ed. Feeling and Walbot (Springer Verlag,
Berlín) con unas pocas modificaciones minoritarias. El ADN
precipitado se recuperó usando un bucle de inoculación y se
transfirió a un tubo eppendorf de 1,5 ml que contenía 500 ml de TE
(Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM). El ADN se dejó disolver a
temperatura ambiente durante 15 minutos, se extrajo con fenol y se
precipitó en 2-propanol en 700 \mul. El
precipitado se recuperó y se lavó con etanol al 70%. Después el ADN
se colocó en un tubo eppendorf limpio de 1,5 ml para que se secara
al aire y se resuspendió en 200 \mul de TE. Se añadió una ARNasa
A a 10 mg/ml y la mezcla se incubó a 37ºC durante varias horas.
Después el ADN se extrajo una vez con
fenol-cloroformo, después con cloroformo, después se
precipitó con etanol y se resuspendió en TE. Después el ADN se usó
exactamente como se describe en el Manual del Usuario de Genome
Walker (Clontech PT3042-1 versión PR68687).
Brevemente, el ADN se digirió por separado con las enzimas de
restricción DraI, EcoRV, PvuII, ScaI, y StuI, cortando todas
extremos romos. El ADN se extrajo con fenol, después con
cloroformo, después se precipitó con etanol. Los adaptadores de
Genome Walker se ligaron a los extremos del ADN restringido. El ADN
resultante se menciona como DL1-DL5,
respectivamente.
Para el aislamiento de regiones promotoras
específicas, se diseñaron dos cebadores específicos de gen no
solapantes (27-30 pb de longitud) a partir del
extremo 5’ de los genes del maíz identificados de las bases de datos
de secuencias. Los cebadores se diseñaron para amplificar la región
cadena arriba de la secuencia codificante, es decir, la región 5’
no traducida y el promotor del gen elegido. La secuencia de los
cebadores se da a continuación para cada promotor descrito. La
primera ronda de PCR se realizó en cada muestra de ADN
(DL1-5) con el cebador AR1 de Clontech y los
cebadores específicos de gen (gsp)1 con las secuencias
mostradas en SEC.ID.Nº 1, 5, u 8.
La PCR se realizó en un ciclador térmico modelo
PTC-100 con HotBonnet de MJ Research (Watertown, MA)
usando reactivos suministrados con el kit Genome Walker. Se usaron
los siguientes parámetros de ciclo: 7 ciclos de 94ºC durante 2
segundos, después 72ºC durante 3 minutos, seguido de 32 ciclos de
94ºC durante 2 segundos y 67ºC durante 3
minutos. Finalmente, las muestras se mantuvieron a 67ºC durante 4 minutos y después a 4ºC hasta su análisis adicional.
minutos. Finalmente, las muestras se mantuvieron a 67ºC durante 4 minutos y después a 4ºC hasta su análisis adicional.
Como se describe en el Manual del Usuario, el ADN
de la primera ronda de PCR después se diluyó y se usó como molde en
una segunda ronda de PCR usando el cebador AP2 Clontech y los
cebadores específicos de gen (gsp)2 con las secuencias
mostradas en SEC.ID.Nº 3, 6, ó 9.
Los parámetros de ciclo para la segunda ronda
fueron: 5 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, después 72ºC durante 3
minutos. Finalmente, las muestras se mantuvieron a 67ºC durante 4
minutos y después se mantuvieron a 4ºC. Se procesaron
aproximadamente 10 \mul de cada reacción en un gel de agarosa al
0,8%, y las bandas (habitualmente de 500 pb o más largas) se
escindieron, purificaron con el kit Sephaglas BandPrep (Pharmacia,
Piscataway, NJ) y se clonaron en el vector pCR2.1 de TOPOTA
(Invitrogen, Carlsbad, CA; www. invitrogen. com). Los clones
se secuenciaron para la verificación.
Se prepararon tres construcciones de fusión
promotor::GUS por los métodos descritos a continuación. Todos los
vectores se construyeron usando técnicas de biología molecular
convencionales (Sambrook et al., Supra). Se insertó un gen
informador y un gen marcador de selección para la expresión génica y
selección, entre los sitios de clonación múltiple del vector de
clonación pBluescript (Stratagene Inc., 11011 N. Torrey Pines Rd.,
La Jolla, CA;
www. strategene. com). El gen informador fue el gen de glucoronidasa (GUS) (Jefferson, R. A. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 8447-8451) en cuya región codificante se insertó el segundo intrón del gen ST-LS1 de la patata (Vancanneyt et al., Mol. Gen. Genet. 220: 245-250, 1990), para producir intrón-GUS, para evitar la expresión del gen en Agrobacterium (véase, Ohta, S. et al., 1990, Plant Cell Physiol. 31(6): 805-813). Las regiones promotoras respectivas se ligaron en pauta de lectura a los sitios 5’ al gen GUS. Se ligó por extremos romos un fragmento que contenía las bases 2 a 310 del terminador del gen del inhibidor de la proteinasa de la patata (pinII) (An et al., Plant Cell 1: 115-122, 1989) cadena debajo de la secuencia codificante de GUS, para crear el casete de expresión de GUS. El extremo 3’ del terminador llevaba un sitio de restricción NotI.
www. strategene. com). El gen informador fue el gen de glucoronidasa (GUS) (Jefferson, R. A. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 8447-8451) en cuya región codificante se insertó el segundo intrón del gen ST-LS1 de la patata (Vancanneyt et al., Mol. Gen. Genet. 220: 245-250, 1990), para producir intrón-GUS, para evitar la expresión del gen en Agrobacterium (véase, Ohta, S. et al., 1990, Plant Cell Physiol. 31(6): 805-813). Las regiones promotoras respectivas se ligaron en pauta de lectura a los sitios 5’ al gen GUS. Se ligó por extremos romos un fragmento que contenía las bases 2 a 310 del terminador del gen del inhibidor de la proteinasa de la patata (pinII) (An et al., Plant Cell 1: 115-122, 1989) cadena debajo de la secuencia codificante de GUS, para crear el casete de expresión de GUS. El extremo 3’ del terminador llevaba un sitio de restricción NotI.
Se construyó cZ19B1::GUS::pinII usando el
plásmido anterior digerido con NcoI, rellenado con la enzima Klenow
y después se digirió con NotI para proporcionar sitios de inserción
para el promotor. El plásmido con el promotor cZ19B1 aislado en el
vector de clonación de TOPOTA se digirió con BsaI, se rellenó con
Klenow, y se digirió con NotI. El fragmento se ligó en el casete de
expresión digerido y la subclonación exitosa se confirmó por
digestión con enzimas de restricción con EcoRI y secuenciación.
Se construyó cim1::GUS::pinII usando el casete
GUS::pinII. El casete se digirió con NcoI, se rellenó con Klenow y
se digirió otra vez con BamHI. El promotor Cim1 contenido en el
vector de clonación de TOPOTA se aisló a través de la digestión con
BssHII, se rellenó con Klenow y se digirió posteriormente de manera
doble con BamHI/PvuI. El fragmentos se ligó en el vector y se
confirmó por análisis de restricción y secuenciación.
Se preparó mi1ps::GUS::pinII usando el casete
GUS::pinII digerido con NcoI, se rellenó con Klenow, y se volvió a
digerir con XbaI. El promotor mi1ps en TOPOTA se digirió con BsmI,
se rellenó, y después se cortó con XbaI. Después el fragmento se
ligó en el vector y se confirmó por análisis de restricción y
secuenciación.
El plásmido de transformación de Agrobacterium
cim1::GUS::pinII se construyó insertando el casete de expresión de
GUS como un fragmento HindIII/NotI y el casete de expresión de BAR
como un fragmento NotI/SacI entre los bordes derecho e izquierdo de
ADN-T en pSB11 en los sitios HindIII y SacI. El
casete de GUS se insertó proximal al borde derecho de
ADN-T. El plásmido pSB11 se obtuvo de Japan Tobacco
Inc. (Tokio, Japón). La construcción de pSB11 a partir de pSB21 y
la construcción de pSB21 a partir de vectores de partida se describe
por Komari et al. (1996, Plant J. 10:
165-174). El ADN-T del plásmido se
integró en el plásmido superbinario pSB1 (Saito et al.,
documento EP 672 752 A1) por recombinación homóloga entre dos
plásmidos. El plásmido pSB1 también se obtuvo de Japan Tobacco Inc.
La cepa HB101 de E. coli que contiene los casetes de expresión se
cruzó con la cepa LBA4404 de Agrobacterium que alberga pSB1 para
crear el plásmido co-integrado en Agrobacterium
usando el método de Ditta et al., (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77: 7347-7351, 1980). La recombinación
exitosa se verificó por una digestión con la enzima de restricción
SalI del plásmido.
Agrobacterium se extrajo en estrías de un
alícuota congelada a -80ºC en una placa que contenía medio
PHI-L y se cultivó a 28ºC en oscuridad durante 3
días. El medio PHI-L comprende 25 ml/l de Solución
Madre A, 25 ml/l de Solución Madre B, 450,9 ml/l de Solución Madre
C y estreptomicina (Sigma Chemicals) añadidos a una concentración
de 50 mg/l en ddH20 estéril (solución madre A: K2HPO4 60,0 g/l,
NaH2PO4 20,0 g/l, ajuste de pH a 7,0 w/KOH y autoclavada; solución
madre B: NH4CI 20,0 g/l, MgSO4.7H2O 6,0 g/l, KCI 3,0 g/l, CaCl2
0,20 g/l, FeSO4.7H2O 50,0 mg/l, autoclavada; solución madre C:
glucosa 5,56 g/l, agar 16,67 g/l (Nº A-7049, Sigma
Chemicals, St. Louis, MO) y autoclavada).
La placa puede almacenarse a 4ºC y usarse
habitualmente durante aproximadamente 1 mes. Se picó una colonia
individual a partir de la placa maestra y se sembró en estrías en un
placa que contenía medio PHI-M [extracto de
levadura (Difco) 5,0 g/l; peptona (Difco) 10,0 g/l; NaCI 5,0 g/l;
agar (Difco) 15,0 g/l; pH 6,8, que contenía 50 mg/l de
estreptomicina] y se incubó a 28ºC en oscuridad durante 2 días.
Se añadieron cinco ml de PHI-A,
[sales básicas CHU(N6) (Sigma C-1416) 4,0
g/l, mezcla de vitamina de Eriksson (1000X,
Sigma-1511) 1,0 ml/l; tiamina.HCl 0,5 mg/l (Sigma);
ácido 2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D, Sigma) 1,5 mg/l; L-prolina
(Sigma) 0,69 g/l; sacarosa (Mallinckrodt) 68,5 g/l; glucosa
(Mallinckrodt) 36,0 g/l; [pH 5,2] para el sistema de medio básico
PHI, o PHI-I [sales MS (GIBCO BRL) 4,3 g/l; ácido
nicotínico (Sigma) 0,5 mg/l; piridoxina.HCl (Sigma) 0,5 mg/l;
tiamina.HCl 1,0 mg/l; mio-inositol (Sigma) 0,10 g/l;
casaminoácidos de ensayo de vitaminas (Disco Lab) 1,0 g/l;
2,4-D 1,5 mg/l; sacarosa 68,50 g/l; glucosa 36,0
g/l; ajuste de pH a 5,2 w/KOH y esterilizado por filtración] para
el medio combinado PHI y 5 ml de 100 mM
(3'5'-Dimetoxi-4'-hidroxiacetofenona,
Aldrich chemicals) a un tubo Falcon de 14 ml en una campana. Se
recogieron aproximadamente 3 bucles completos (tamaño de bucle de 5
mm) de Agrobacterium a partir de la placa y se suspendieron en el
tubo, después, el tuvo se agitó en vórtice para hacer una
suspensión uniforme. Un ml de la suspensión se transfirió a un tubo
de espectrofotómetro y se ajusto la OD de la suspensión de 0,72 a
550 nm añadiendo más Agrobacterium o más del mismo medio de
suspensión, para una concentración de Agrobacterium de
aproximadamente 0,5 x 109 cfu/ml a 1 x 109 cfu/ml. La suspensión
final de Agrobacterium se dividió en alícuotas en tubo de
microcentrífuga de 2 ml, conteniendo cada uno 1 ml de la
suspensión. Las suspensiones después se usaron tan pronto como fue
posible.
Se añadieron aproximadamente 2 ml del mismo medio
usado para la suspensión de Agrobacterium (aquí
PHI-A o PHI-I) en un tubo de
microcentrífuga de 2 ml. Los embriones inmaduros se aislaron de una
espiga esterilizada con una espátula estéril (Baxter Scientific
Products S1565) y se echaron gota a gota en el medio en el tubo. Se
colocó un total de 100 embriones en el tubo. El tamaño óptimo de los
embriones fue aproximadamente 1,0-1,2 mm. Después
se cerró el tapón en el tubo y se agitó con vórtice el tubo con un
Vortex Mixer (Baxter Scientific Products S8223-1)
durante 5 segundos a velocidad máxima. El medio se retiró y se
añadieron 2 ml de medio fresco y se repitió la agitación con
vórtice. Todo el medio se quitó y se añadió 1 ml de suspensión de
Agrobacterium a los embriones y el tubo se agitó con vórtice
durante 30 segundos. El tubo se dejó reposar durante 5 minutos en
la campana. La suspensión de Agrobacterium y los embriones se vertió
en una placa Petri que contenía medio PHI-B [sales
básicas CHU(N6) (Sigma C-1416) 4,0 g/l;
mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X, Sigma-1511)
1,0 ml/l; tiamina.HCl 0,5 mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l;
L-prolina 0,69 g/l; nitrato de plata 0,85 mg/l;
gelrita (Sigma) 3,0 g/l; sacarosa 30,0 g/l; acetosiringona 100 mM;
pH 5,8], para el sistema de medio básico PHI, o medio
PHI-J [sales MS 4,3 g/l; ácido nicotínico 0,50
mg/l; piridoxina HCl 0,50 mg/l; tiamina.HCl 1,0 mg/l;
mio-inositol 100,0 mg/l; 2,4-D 1,5
mg/l; sacarosa 20,0 g/l; glucosa 10,0 g/l; L-prolina
0,70 g/l; MES (Sigma) 0,50 g/l; 8,0 g/l de agar (Sigma A 7049,
purificada) y acetosiringona 100 mM con un pH final de 5,8 para el
medio combinado PHI. Cualquier embrión dejado en el tubo se
transfirió a la placa usando una espátula estéril. La suspensión de
Agrobacterium se quitó y los embriones se colocaron con el lado del
eje sobre los medios. La placa se selló con cinta de Parafilm o
cinta de Pylon Vegetative Combine (producto llamado "E.G.CUT"
está disponible en secciones de 18 mm x 50 m; Kyowa Ltd., Japón) y
se incubó en oscuridad a 23-25ºC durante
aproximadamente 3 días de co-cultivo.
Para la etapa de reposo, todos los embriones se
transfirieron a una nueva placa que contenía medio
PHI-C [sales básicas CHU (N6) (Sigma
C-1416) 4,0 g/l; Mezcla de vitaminas de Eriksson
(1000X Sigma-1511) 1,0 ml/l; tiamina.HCl 0,5 mg/l;
2,4-D 1,5 mg/l; L-prolina 0,69 g/l;
sacarosa 30,0 g/l; Tampón MES (Sigma) 0,5 g/l; agar (Sigma
A-7049, purificado) 8,0 g/l; nitrato de plata 0,85
mg/l; carbenicilina 100 mg/l; pH 5,8]. La placa se selló con cinta
de Parafilm o Pylon y se incubó en oscuridad a 28ºC durante
3-5 días.
Periodos de co-cultivo más largos
pueden compensar la ausencia de una etapa de reposo ya que la etapa
de reposo, como la etapa de co-cultivo, proporciona
un periodo de tiempo para el embrión a cultivar en ausencia de
agente selectivo. Los especialistas en la técnica pueden ensayar
fácilmente combinaciones de tiempos de co-cultivo y
reposo para optimizar o mejorar la transformación.
Para la selección, todos los embriones se
transfirieron después desde el medio PHI-C a nuevas
placas que contenían medio PHI-D, como medio de
selección, [sales básicas CHU(N6) (SIGMA
C-1416) 4,0 g/l; mezcla de vitaminas de Eriksson
(1000X, Sigma-1511) 1,0 ml/l; tiamina.HCl 0,5 mg/l;
2,4-D 1,5 mg/l; L-prolina 0,69 g/l;
sacarosa 30,0 g/l; tampón MES 0,5 g/l; agar (Sigma
A-7049, purificado) 8,0 g/l; nitrato de plata 0,85
mg/l; carbenicilina (ICN, Costa Mesa, CA) 100 mg/l; bialafos (Meiji
Seika K. K., Tokio, Japón) 1,5 mg/l para las dos primeras semanas
seguido de 3 mg/l para el testo del tiempo; pH 5,8] poniendo
aproximadamente 20 embriones en cada placa. Las placas se sellaron
como se ha descrito anteriormente y se incubaron en oscuridad a 28ºC
para las dos primeras semanas de selección. Los embriones se
transfirieron a medio de selección fresco a intervalos de dos
semanas. El tejido se subcultivo transfiriéndolo a medio de
selección fresco durante un total de 2 meses. Los callos
resistentes a herbicida después se "desarrollaron a granel"
haciéndolos crecer en el mismo medio durante otras dos semanas
hasta que el diámetro de los callos fue aproximadamente
1,5-2 cm.
Para la regeneración, los callos después se
cultivaron en medio PHI-E [sales MS 4,3 g/l;
mio-inositol 0,1 g/l; ácido nicotínico 0,5 mg/l,
tiamina.HCl 0,1 mg/l, Piridoxina.HCl 0,5 mg/l, Glicina 2,0 mg/l,
Zeatina 0,5 mg/l, sacarosa 60,0 g/l, Agar (Sigma,
A-7049) 8,0 g/l, Ácido indolacético (IAA, Sigma) 1,0
mg/l, Ácido abscísico (ABA, Sigma) 0,1 mM, Bialafos 3 mg/l,
carbenicilina 100 mg/l ajustado a pH 5,6] en oscuridad a 28ºC
durante 1-3 semanas para permitir que los embriones
somáticos maduraran. Los callos después se cultivaron en medio
PHI-F (sales MS 4,3 g/l;
mio-inositol 0,1 g/l; Tiamina.HCl 0,1 mg/l,
Piridoxina.HCl 0,5 mg/l, Glicina 2,0 mg/l, ácido nicotínico 0,5
mg/l; sacarosa 40,0 g/l; gelrita 1,5 g/l; pH 5,6] a 25ºC en un
programa de luz solar de 16 horas de luz (270 uE
m-2seg-1) y 8 horas de oscuridad
hasta que se desarrollaron los brotes y raíces. Cada plántula
pequeña después se transfirió a un tubo de 25x150 que contenía
PHI-F y crecieron en las mismas condiciones durante
aproximadamente otra semana. Los sucesos GUS+ se determinan en la
fase de callo o en la fase de planta regenerada.
Para Hi-II un protocolo
optimizado preferido fue 0,5 x 109 cfu/ml de Agrobacterium, una
etapa de reposo de 3-5 días, y sin AgNO3 en el
medio de infección (medio PHI-A).
Se realizó hibridación in situ usando el
protocolo de Jackson, D.P. (1991) In situ Hybridization in
Plants, Molecular Plant Pathology: A Practical
Approach, D.J. Bowles, S. J. Gurr, and M. McPherson, eds. Oxford
University Press, Inglaterra, páginas 63-74. Se
usaron tanto una sonda con sentido como antisentido correspondientes
a la proteína del ADNc de Cim1. Las sondas se marcaron de manera no
isotópica con digoxigenina y se incubaron con diversas secciones de
los granos de maíz de 5 DAP (días después de la polinización) que se
habían fijado y embebido. Después de un lavado extensivo para
retirar la sonda no unida, las secciones se incubaron con fosfatasa
alcalina anti-digoxigenina para detectar áreas de
hibridación de la sonda. Para Cim1, el ARNm se detectó
específicamente con una sonda antisentido y se restringió al tejido
del callo. Esta sonda de control del sentido no hibridó.
El ARN total (10 g) se fraccionó por tamaño en un
gel de formaldehídoagarosa al 1% y se transfirió a una membrana de
nitrocelulosa. Las membranas se hibridaron en condiciones rigurosas
con sondas marcadas con 32P que representan los fragmentos de ADNc
de los diversos genes. Después de un lavado extensivo para retirar
la sonda no unida, las membranas se expusieron en una película de
rayos X. Las muestras de ARN se obtuvieron de los tejidos
vegetativos así como de granos de maíz en desarrollo.
El patrón de expresión de Cim1 no demostró
expresión en tejidos vegetativos o en el embrión aislado o
endosperma de granos en desarrollo. Cim1 se expresó
predominantemente en el grano completo temprano (5 DAP). El gen para
mi1ps se expresó predominantemente en el embrión de granos en
desarrollo (13-40 DAP) mientras que cZ19B1 se
expresó en el endosperma del desarrollo medio-tardío
de los granos (13-40 DAP). Ni mi1ps ni cZ19B1 se
expresaron en tejidos vegetativos.
<110> Pioneer Hi-Bred
International, Inc.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Promotores Preferidos de Semillas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 0869-PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/097.233
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
20-08-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1609
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotores
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(1609)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgatggca atgaagcagg tcaaga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggaagccat gccggaagcc aggttaga
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 921
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotores
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(922)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatattttgcc ttccttatgc tcccttggtc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttctgcaag tgctgctacg gcgaccaagc c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 991
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotores
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(991)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
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<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctcgacgc ggaagctctc gatgaa
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcttgcct ttcctcccct cttttc
\hfill26
Claims (16)
1. Un promotor aislado que es capaz de
dirigir la transcripción de un modo preferido de semillas, donde
dicho promotor comprende
(a) la secuencia de nucleótidos expuesta en
SEC.ID.Nº 1 ó 7; o
(b) una secuencia que tiene al menos un 60% de
identidad de secuencia con SEC.ID.Nº 1 ó 7, donde el% de identidad
de secuencia con SEC.ID.Nº 1 ó 7, se basa en la secuencia completa
de SEC.ID.Nº 1 ó 7 y se determina por análisis con GAP versión 10
usando parámetros por defecto; o
(c) una secuencia que hibrida con SEC.ID.Nº 7, en
condiciones rigurosas; o
(d) un ácido nucleico complementario a un ácido
nucleico de (a), (b) o (c).
2. Un casete de expresión que comprende
un promotor de acuerdo con la reivindicación 1 y una secuencia de
nucleótidos unida de manera operativa a dicho promotor.
3. Un vector de transformación que
comprende un casete de expresión de acuerdo con la reivindicación
2.
4. Una planta transformada de manera
estable con un casete de expresión de acuerdo con la reivindicación
2.
5. La planta de la reivindicación 4,
donde dicha planta es una monocotiledónea.
6. La planta de la reivindicación 5,
donde dicha monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo, o
centeno.
7. La planta de la reivindicación 4,
donde dicha planta es una dicotiledónea.
8. Semilla de la planta de una cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 7, que contiene dicho casete de
expresión de acuerdo con la reivindicación 2.
9. Un método para expresar de manera
selectiva una secuencia de nucleótidos en una semilla vegetal,
comprendiendo dicho método transformar una célula vegetal con un
vector de transformación de acuerdo con la reivindicación 3.
10. El método de la reivindicación 9, que
comprende adicionalmente regenerar una planta transformada de
manera estable a partir de dicha célula vegetal transformada; donde
la expresión de una secuencia de nucleótidos bajo el control de un
promotor de acuerdo con al reivindicación 1, altera el fenotipo de
dicha semilla vegetal.
11. El método de la reivindicación 9 ó 10,
donde dicha secuencia de nucleótidos heteróloga codifica un gen
implicado en la síntesis de ácidos grasos.
12. El método de la reivindicación 9 ó 10,
donde dicha secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una
proteína que tienen un contenido de aminoácidos potenciado, en el
sentido en que la proteína tiene una distribución de aminoácidos
que mejora el valor nutricional de la semilla.
13. Una célula vegetal transformada de
manera estable con un casete de expresión de acuerdo con la
reivindicación 2.
14. La célula vegetal de la reivindicación
13, donde dicha célula vegetal es de una planta monocotiledónea.
15. La célula vegetal de la reivindicación
14, donde dicha planta es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo, o
centeno.
16. La célula vegetal de la reivindicación
13, donde dicha célula vegetal es de una planta dicotiledónea.
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| US7211711B2 (en) * | 1999-03-25 | 2007-05-01 | Arborgen, Llc | Compositions and methods for the modification of gene expression |
| US7518034B2 (en) * | 1999-03-25 | 2009-04-14 | Arborgen Llc | Compositions and methods for the modification of gene expression |
| US6784346B1 (en) * | 1999-03-29 | 2004-08-31 | The Regents Of The University Of California | Value-added traits in grain and seed transformed with thioredoxin |
| US7531723B2 (en) | 1999-04-16 | 2009-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Modulation of cytokinin activity in plants |
| CA2375071A1 (en) * | 1999-05-26 | 2000-12-07 | National Research Council Of Canada | Method for reducing phytate in canola meal using genetic manipulation involving myo-inositol 1-phosphate synthase gene |
| US7148064B1 (en) | 1999-05-26 | 2006-12-12 | National Research Council Of Canada | Method for reducing phytate in canola meal using genetic manipulation involving myo-inositol 1-phospathe synthase gene |
| WO2000078984A2 (en) | 1999-06-21 | 2000-12-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Enhanced floral sink strength and increased stability of seed set in plants |
| AU6947700A (en) * | 1999-09-01 | 2001-03-26 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory sequences for selective control of gene expression |
| US6403862B1 (en) | 1999-09-24 | 2002-06-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Seed-preferred promoter from maize |
| US6407315B1 (en) | 1999-11-02 | 2002-06-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Seed-preferred promoter from barley |
| JP2004508803A (ja) * | 1999-12-02 | 2004-03-25 | ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー | トウモロコシのｍｉｐシンターゼプロモーター |
| CA2412942A1 (en) * | 2000-06-20 | 2001-12-27 | Genesis Research & Development Corporation Limited | Nucleic acid sequences and methods for the modification of plant gene expression |
| JP2004512020A (ja) | 2000-06-23 | 2004-04-22 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 組換え構築物ならびにこれを遺伝子発現を減少させる際に用いる方法 |
| US20070192900A1 (en) * | 2006-02-14 | 2007-08-16 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Production of beta-glucosidase, hemicellulase and ligninase in E1 and FLC-cellulase-transgenic plants |
| WO2005012515A2 (en) | 2003-04-29 | 2005-02-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel glyphosate-n-acetyltransferase (gat) genes |
| US7122658B1 (en) * | 2000-11-22 | 2006-10-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Seed-preferred regulatory elements and uses thereof |
| WO2003000863A2 (en) | 2001-06-22 | 2003-01-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Defensin polynucleotides and methods of use |
| AU2002331897A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Phytate polynucleotides and methods of use |
| DE60330653D1 (de) * | 2002-03-13 | 2010-02-04 | Pioneer Hi Bred Int | Beim frühen blütenstand bevorzugte regulationselemente und verwendungen davon |
| EP1570064A4 (en) * | 2002-11-06 | 2006-04-19 | Pioneer Hi Bred Int | AUXIN-SUPPRESSED, INACTIVE-CONNECTED PROMOTER AND USES THEREOF |
| US7365186B2 (en) * | 2002-11-22 | 2008-04-29 | Arborgen, Llc | Vascular-preferred promoter sequences and uses thereof |
| WO2004069086A2 (de) * | 2003-02-05 | 2004-08-19 | Benjamin Hurni | Zusammensetzung für die verbesserung der qualität von fellen und haaren und für die bekämpfung von darmparasiten bei tieren, insbesondere bei schafen |
| BRPI0409178A (pt) * | 2003-04-04 | 2006-05-02 | Pioneer Hi Bred Int | método para produzir plantas transgênicas e para modular a atividade de citocina em plantas, plantas transgênicas, dna recombinate, promotor e cassete de expressão |
| BRPI0411874A (pt) | 2003-06-23 | 2006-08-08 | Pionner Hi Bred International | potencial de staygreen controlado em plantas por gene simples obtido por engenharia genética |
| US20050120415A1 (en) | 2003-10-09 | 2005-06-02 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Gene silencing |
| US20070169227A1 (en) | 2003-12-16 | 2007-07-19 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Dominant Gene Suppression Transgenes and Methods of Using Same |
| ES2339559T3 (es) | 2003-12-16 | 2010-05-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Transgenes de supresion de gen dominante y metodos de uso de los mismos. |
| AR047658A1 (es) | 2004-02-03 | 2006-02-01 | Cargill Inc | Concentrado de proteinas y corriente acuosa con carbohidratos hidrosolubles |
| CN101124323A (zh) | 2004-06-30 | 2008-02-13 | 先锋高级育种国际公司 | 保护植物免受致病真菌侵害的方法 |
| BR122015026849C8 (pt) | 2004-07-02 | 2017-06-20 | Du Pont | cassete de expressão, microorganismo transformado, método para indução de resistência a patógeno de planta em uma planta, composição anti-patogênica e método para proteção de uma planta contra um patógeno de planta |
| EP1831376A1 (en) | 2004-12-28 | 2007-09-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Improved grain quality through altered expression of seed proteins |
| CN101356279A (zh) | 2005-11-10 | 2009-01-28 | 先锋高级育种国际公司 | Dof(具有一指的dna结合)序列和使用方法 |
| US20070199096A1 (en) | 2005-11-14 | 2007-08-23 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Compositions and Methods for Altering Alpha- and Beta-Tocotrienol Content |
| EP2333088B1 (en) | 2006-05-16 | 2013-08-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Antifungal polypeptides |
| US20070271629A1 (en) | 2006-05-17 | 2007-11-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Artificial plant minichromosomes |
| EP2121938A2 (en) | 2006-10-05 | 2009-11-25 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Maize microrna sequences |
| EP2167666A2 (en) | 2007-06-29 | 2010-03-31 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Methods for altering the genome of a monocot plant cell |
| CN101932712B (zh) | 2007-11-20 | 2014-05-14 | 先锋国际良种公司 | 用于改善植物应激耐性的玉米乙烯信号转导基因及其调节 |
| EP2559766B1 (en) | 2007-12-13 | 2017-10-18 | Philip Morris Products S.A. | Plants modified for reduced cadmium transport, derivative products, and related methods |
| US8115055B2 (en) | 2007-12-18 | 2012-02-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Down-regulation of gene expression using artificial microRNAs |
| US8937217B2 (en) | 2007-12-18 | 2015-01-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Down-regulation of gene expression using artificial microRNAs |
| CA2743707A1 (en) | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for enhanced yield by targeted expression of knotted1 |
| CN102395674B (zh) | 2009-04-14 | 2015-07-29 | 先锋国际良种公司 | 调节acc合酶改善低氮条件下的植物产量 |
| EP2504441B1 (en) | 2009-11-23 | 2020-07-22 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Sucrose transporter genes for increasing plant seed lipids |
| WO2011082310A2 (en) | 2009-12-30 | 2011-07-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for targeted polynucleotide modification |
| AU2010339404B2 (en) | 2009-12-30 | 2016-01-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for the introduction and regulated expression of genes in plants |
| CA2788198C (en) | 2010-01-26 | 2021-01-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Hppd-inhibitor herbicide tolerance |
| JP2013521003A (ja) | 2010-03-09 | 2013-06-10 | ネステク ソシエテ アノニム | コーヒーにおけるガラクトマンナン含有量の調整 |
| MX2012012672A (es) | 2010-05-06 | 2012-12-17 | Du Pont | Gen y proteina acc sintasa 3 de maiz y sus usos. |
| BR112012032907A2 (pt) | 2010-06-25 | 2017-06-13 | Du Pont | métodos para selecionar e identificar uma planta de mais e planta de mais |
| BR112013003223A2 (pt) | 2010-08-23 | 2016-06-07 | Pioneer Hi Bred Int | "polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, célula hospedeira, micro-organismo, planta ou parte de planta, método de obtenção de uma planta transformada, composição antipatogênica, método para proteger uma planta contra um patógeno ou uso de um polinucleotídeo isolado" |
| MX2013007532A (es) | 2010-12-28 | 2013-09-16 | Pioneer Hi Bred Int | Nuevo gen de bacillus thuringiensis con actividad contra el orden lepidoptera. |
| US8878007B2 (en) | 2011-03-10 | 2014-11-04 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| CA2831144A1 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for producing a complex transgenic trait locus |
| EP2794887A2 (en) | 2011-03-30 | 2014-10-29 | Universidad Nacional Autonoma De Mexico | Mutant bacillus thuringiensis cry genes and methods of use |
| US9062317B2 (en) | 2011-05-09 | 2015-06-23 | E I Du Pont De Nemours And Company | Methods and compositions for silencing gene families using artificial microRNAs |
| US9150625B2 (en) | 2011-05-23 | 2015-10-06 | E I Du Pont De Nemours And Company | Chloroplast transit peptides and methods of their use |
| CA2844470A1 (en) | 2011-06-21 | 2013-05-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for producing male sterile plants |
| EP2739739A1 (en) | 2011-08-03 | 2014-06-11 | E. I. Du Pont de Nemours and Company | Methods and compositions for targeted integration in a plant |
| BR112014004812A2 (pt) | 2011-08-31 | 2018-10-23 | Du Pont | métodos para regenerar uma planta e para produzir uma planta transformada |
| CA2850390A1 (en) | 2011-10-28 | 2013-05-02 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Methods and compositions for silencing genes using artificial micrornas |
| WO2013103366A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | A method to screen plants for genetic elements inducing parthenogenesis in plants |
| BR112014018009A2 (pt) | 2012-01-23 | 2018-06-26 | Du Pont | sequência de ácido nucleico isolada, construção recombinante, célula vegetal, método para reduzir a expressão de pelo menos um gene biossintético de ácido graxo vegetal, método para reduzir a expressão de dois ou mais genes biossintéticos de ácido graxo vegetal e planta ou semente transgênica |
| AR089793A1 (es) | 2012-01-27 | 2014-09-17 | Du Pont | Metodos y composiciones para generar locus de rasgos transgenicos complejos |
| CN104703998B (zh) | 2012-03-13 | 2020-08-21 | 先锋国际良种公司 | 植物中雄性育性的遗传减少 |
| WO2013138309A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
| BR112014031260A2 (pt) | 2012-06-15 | 2019-08-20 | Du Pont | métodos e composições que envolvem variantes de als com preferência de substrato nativo |
| US20150240253A1 (en) | 2012-08-30 | 2015-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Long intergenic non-coding rnas in maize |
| CN104812901B (zh) | 2012-09-13 | 2018-08-10 | 美国印第安纳大学研究和技术公司 | 赋予植物抗病性的组合物和系统及其使用方法 |
| CN104884625A (zh) | 2012-10-15 | 2015-09-02 | 先锋国际良种公司 | 增强cry内毒素的活性的方法和组合物 |
| CA2890160A1 (en) | 2012-10-31 | 2014-05-08 | Cellectis | Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants |
| US20140123339A1 (en) | 2012-10-31 | 2014-05-01 | Pioneer Hi Bred International Inc | Transformed Plants Having Increased Beta-Carotene Levels, Increased Half-Life and Bioavailability and Methods of Producing Such |
| US20140173775A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for producing and selecting transgenic plants |
| WO2014164775A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions to improve the spread of chemical signals in plants |
| CA2905399A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions employing a sulfonylurea-dependent stabilization domain |
| US9803214B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-10-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Breeding pair of wheat plants comprising an MS45 promoter inverted repeat that confers male sterility and a construct that restores fertility |
| BR112015023268A2 (pt) | 2013-03-13 | 2018-05-02 | Du Pont | método para reduzir a expressão, construto de dna, método de obtenção de célula vegetal, método de obtenção de planta transgênica ou uma parte de planta |
| US9416368B2 (en) | 2013-03-13 | 2016-08-16 | E I Du Pont De Nemours And Company | Identification of P. pachyrhizi protein effectors and their use in producing Asian soybean rust (ASR) resistant plants |
| US20160024513A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-01-28 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof |
| CA2901316A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Phi-4 polypeptides and methods for their use |
| WO2014143996A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides |
| EP3030072B1 (en) | 2013-08-08 | 2020-03-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal polypeptides having broad spectrum activity and uses thereof |
| BR112016003225B1 (pt) | 2013-08-16 | 2022-10-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Polipeptídeo pip-47, polipeptídeo pip-47 quimérico, composição, proteína de fusão, método para controlar uma população de inseto-praga, método para inibir o crescimento ou matar um inseto-praga, construto de dna, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, método de obtenção de uma planta transgênica e método para controlar infestação de inseto |
| CN120574876A (zh) | 2013-08-22 | 2025-09-02 | 纳幕尔杜邦公司 | 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法 |
| BR122020001770B1 (pt) | 2013-09-13 | 2022-11-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto |
| CN106536545B (zh) | 2014-02-07 | 2026-03-03 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| BR112016018103B1 (pt) | 2014-02-07 | 2024-01-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Polipeptídeo e seu uso, polinucleotídeo, composição, proteína de fusão, método para controlar uma população, método para inibir o crescimento, método para controlar a infestação, método para obtenção de uma planta ou célula vegetal, construto |
| WO2016000237A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Pioneer Overseas Corporation | Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes |
| US10676754B2 (en) | 2014-07-11 | 2020-06-09 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide |
| MX2017002930A (es) | 2014-09-12 | 2017-06-06 | Du Pont | Generacion de sitios de integracion especifica de sitio para loci de rasgos complejos en maiz y soja, y metodos de uso. |
| CN107072165B (zh) | 2014-09-26 | 2021-05-28 | 先锋国际良种公司 | 小麦Ms1多核苷酸、多肽以及使用方法 |
| CN114736275A (zh) | 2014-10-16 | 2022-07-12 | 先锋国际良种公司 | 具有改进的活性谱的杀昆虫多肽及其用途 |
| UA124757C2 (uk) | 2014-10-16 | 2021-11-17 | Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. | Інсектицидний поліпептид проти лускокрилого або твердокрилого шкідника та його застосування |
| CN113372421B (zh) | 2014-10-16 | 2024-08-06 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| JP6823593B2 (ja) | 2014-11-06 | 2021-02-03 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ | Ｒｎａ誘導型エンドヌクレアーゼの細胞へのペプチド媒介輸送 |
| WO2016100309A1 (en) | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Restoration of male fertility in wheat |
| CN107438617A (zh) | 2014-12-22 | 2017-12-05 | 农业生物群落股份有限公司 | 杀虫基因和使用方法 |
| CN114075267B (zh) | 2015-01-15 | 2025-03-18 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| WO2016137774A1 (en) | 2015-02-25 | 2016-09-01 | Pioneer Hi-Bred International Inc | Composition and methods for regulated expression of a guide rna/cas endonuclease complex |
| CA2977026A1 (en) | 2015-03-11 | 2016-09-15 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Insecticidal combinations of pip-72 and methods of use |
| EP4118955A1 (en) | 2015-03-19 | 2023-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions for accelerated trait introgression |
| EP3283504A1 (en) | 2015-04-17 | 2018-02-21 | Agbiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
| CN114644689A (zh) | 2015-04-22 | 2022-06-21 | 农业生物群落股份有限公司 | 杀虫基因和使用方法 |
| AR105418A1 (es) | 2015-05-11 | 2017-10-04 | Two Blades Found | Polinucleótidos y métodos para transferir resistencia a la roya asiática del poroto de soja |
| AU2016263026A1 (en) | 2015-05-15 | 2017-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Guide RNA/Cas endonuclease systems |
| CA2985198A1 (en) | 2015-05-19 | 2016-11-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| US10364439B2 (en) | 2015-06-03 | 2019-07-30 | AgBiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
| RU2021100887A (ru) | 2015-06-22 | 2021-03-16 | Агбайоми, Инк. | Пестицидные гены и способы применения |
| BR112018002535A2 (pt) | 2015-08-06 | 2018-09-25 | Du Pont | polipeptídeo inseticida recombinante, polinucleotídeo recombinante, construto de dna, planta transgênica ou célula de planta, composição, proteína de fusão, método para controlar uma praga, método para inibir crescimento ou para exterminar uma população de pragas ou uma praga e uso do polipeptídeo |
| WO2017035278A1 (en) | 2015-08-24 | 2017-03-02 | Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. | Polynucleotide nanoparticles for the modulation of gene expression and uses thereof |
| DK3341483T3 (da) | 2015-08-28 | 2020-03-16 | Pioneer Hi Bred Int | Ochrobactrum-medieret transformation af planter |
| BR112018008134A2 (pt) | 2015-10-20 | 2018-11-06 | Pioneer Hi Bred Int | método para restaurar a função de um produto gênico não funcional no genoma de uma célula, método para editar uma sequência nucleotídica no genoma de uma célula, planta ou planta de progênie, método para editar uma sequência nucleotídica no genoma de uma célula sem o uso de um molde polinucleotídico de modificação e método para entregar um complexo de rna guia/endonuclease cas numa célula |
| WO2017079026A1 (en) | 2015-11-06 | 2017-05-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Generation of complex trait loci in soybean and methods of use |
| CN108575091A (zh) | 2015-12-18 | 2018-09-25 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| RU2746927C2 (ru) | 2015-12-22 | 2021-04-22 | Агбайоми, Инк. | Пестицидные гены и способы использования |
| US9896696B2 (en) | 2016-02-15 | 2018-02-20 | Benson Hill Biosystems, Inc. | Compositions and methods for modifying genomes |
| EP3426778A1 (en) | 2016-03-11 | 2019-01-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel cas9 systems and methods of use |
| EP3426780A1 (en) | 2016-03-11 | 2019-01-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel cas9 systems and methods of use |
| WO2017155715A1 (en) | 2016-03-11 | 2017-09-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel cas9 systems and methods of use |
| RU2018137045A (ru) | 2016-04-14 | 2020-05-14 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные полипептиды, обладающие улучшенным спектром активности, и пути их применения |
| EP3445861B1 (en) | 2016-04-19 | 2021-12-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof |
| CA3018384A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| MX2018014993A (es) | 2016-06-14 | 2019-09-06 | Pioneer Hi Bred Int | Uso de endonucleasa cpf1 para modificaciones de genoma de planta. |
| CN109661458B (zh) | 2016-06-16 | 2023-05-09 | 纽希得营养澳大利亚私人有限公司 | 近交转基因油菜品系ns-b50027-4及其种子 |
| CA3022858A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| EP3472281A4 (en) | 2016-06-16 | 2020-02-19 | Nuseed Pty Ltd | ELITE EVENT RAPS NS-B50027-4 |
| WO2017222773A1 (en) | 2016-06-20 | 2017-12-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel cas systems and methods of use |
| EP3478052B1 (en) | 2016-07-01 | 2021-08-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| WO2018013333A1 (en) | 2016-07-12 | 2018-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| EP3510159B1 (en) | 2016-09-06 | 2023-03-01 | AgBiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
| EP3535285B1 (en) | 2016-11-01 | 2022-04-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| BR112019012339A2 (pt) | 2016-12-14 | 2019-11-26 | Pioneer Hi Bred Int | polipeptídeo inseticida recombinante, composição, construto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, método para inibir o crescimento ou extermínio de uma praga de inseto ou população de praga, polipeptídeo ipd093 quimérico e proteína de fusão |
| US11213028B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-01-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| US10793610B2 (en) | 2017-01-30 | 2020-10-06 | AgBiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
| WO2018148001A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Pioneer Hi-Bred International Inc | Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
| US11046973B2 (en) | 2017-04-11 | 2021-06-29 | AgBiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
| WO2018197520A1 (en) | 2017-04-24 | 2018-11-01 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Methods and compositions of anti-crispr proteins for use in plants |
| US20200407737A1 (en) | 2017-05-03 | 2020-12-31 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Use of crispr-cas endonucleases for plant genome engineering |
| RU2019140646A (ru) | 2017-05-11 | 2021-06-11 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
| CN110914438A (zh) | 2017-05-26 | 2020-03-24 | 先锋国际良种公司 | 具有改善的活性谱的杀昆虫多肽及其用途 |
| WO2019027861A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | R. J. Reynolds Tobacco Company | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EDITING VIRUS-BASED GENES IN PLANTS |
| EP4230642A2 (en) | 2017-08-03 | 2023-08-23 | Agbiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
| EP3665279B1 (en) | 2017-08-09 | 2023-07-19 | Benson Hill, Inc. | Compositions and methods for modifying genomes |
| US11649465B2 (en) | 2017-09-11 | 2023-05-16 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Methods and compositions for increasing expression of genes of interest in a plant by co-expression with p21 |
| CN111465321B (zh) | 2017-10-13 | 2022-12-06 | 先锋国际良种公司 | 用于植物细胞的细胞重编程的系统和方法 |
| EP4122947A1 (en) | 2017-12-19 | 2023-01-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal polypeptides and uses thereof |
| EP3728606A1 (en) | 2017-12-22 | 2020-10-28 | Agbiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
| WO2019157522A1 (en) | 2018-02-12 | 2019-08-15 | Curators Of The University Of Missouri | Small auxin upregulated (saur) gene for the improvement of plant root system architecture, waterlogging tolerance, drought resistance and yield |
| AR114124A1 (es) | 2018-02-15 | 2020-07-22 | Monsanto Technology Llc | Composiciones y métodos para mejorar el rendimiento de cultivos a través de apilamiento de rasgos |
| WO2019165168A1 (en) | 2018-02-23 | 2019-08-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel cas9 orthologs |
| EP3759489A1 (en) | 2018-03-02 | 2021-01-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant health assay |
| US11332752B2 (en) | 2018-03-12 | 2022-05-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Use of morphogenic factors for the improvement of gene editing |
| CA3092078A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| AU2019234562B2 (en) | 2018-03-14 | 2024-08-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| CN112218952A (zh) | 2018-04-20 | 2021-01-12 | 农业生物群落股份有限公司 | 杀虫基因及使用方法 |
| WO2020046701A1 (en) | 2018-08-29 | 2020-03-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| WO2020123887A2 (en) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel crispr-cas systems for genome editing |
| BR112021020770A2 (pt) | 2019-04-18 | 2022-01-04 | Pioneer Hi Bred Int | Fatores de embriogênese para reprogramação celular de uma célula vegetal |
| MX2022002642A (es) | 2019-09-05 | 2022-06-14 | Benson Hill Inc | Composiciones y metodos para modificar genomas. |
| US20230091338A1 (en) | 2020-02-24 | 2023-03-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Intra-genomic homologous recombination |
| US20230263121A1 (en) | 2020-03-31 | 2023-08-24 | Elo Life Systems | Modulation of endogenous mogroside pathway genes in watermelon and other cucurbits |
| BR112022027035A2 (pt) | 2020-07-14 | 2023-04-11 | Pioneer Hi Bred Int | Proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas |
| CA3189779A1 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Compositions and methods for enhancing resistance to northern leaf blight in maize |
| US20240060079A1 (en) | 2020-10-23 | 2024-02-22 | Elo Life Systems | Methods for producing vanilla plants with improved flavor and agronomic production |
| CA3198940A1 (en) | 2020-11-24 | 2022-06-02 | Rebekah Deter Kelly | Pesticidal genes and methods of use |
| US20240141311A1 (en) | 2021-04-22 | 2024-05-02 | North Carolina State University | Compositions and methods for generating male sterile plants |
| BR112023023044A2 (pt) | 2021-05-06 | 2024-01-23 | Agbiome Inc | Genes pesticidas e métodos de uso |
| EP4444890A1 (en) | 2021-12-07 | 2024-10-16 | Agbiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
| EP4453199A1 (en) | 2021-12-21 | 2024-10-30 | Benson Hill, Inc. | Compositions and methods for modifying genomes |
| CN118843637A (zh) | 2022-02-11 | 2024-10-25 | 东北农业大学 | 用于增加植物中蛋白质和/或油含量和改变油特性的方法和组合物 |
| WO2024044596A1 (en) | 2022-08-23 | 2024-02-29 | AgBiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
| AR131334A1 (es) | 2022-12-13 | 2025-03-12 | Ag Biome Inc | Genes plaguicidas y métodos de uso |
| AU2024239266A1 (en) | 2023-03-20 | 2025-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Cas polypeptides with altered pam recognition |
| WO2025052302A1 (en) | 2023-09-05 | 2025-03-13 | Mazen Animal Health, Inc. | Methods and compositions for the production of mannanase in plants |
| WO2025074304A1 (en) | 2023-10-03 | 2025-04-10 | Mazen Animal Health, Inc. | Compositions and methods for in planta production of a porcine circovirus vaccine |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5420034A (en) * | 1986-07-31 | 1995-05-30 | Calgene, Inc. | Seed-specific transcriptional regulation |
| US4885357A (en) * | 1985-06-12 | 1989-12-05 | Lubrizol Genetics Inc. | Modified zein proteins containing lysine |
| CA1341467C (en) * | 1988-07-29 | 2004-12-07 | John C. Rogers | Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue |
| AU7583691A (en) * | 1990-03-05 | 1991-10-10 | Upjohn Company, The | Protein expression via seed specific regulatory sequences |
| CA2106960C (en) * | 1991-04-09 | 2005-03-08 | Jacqueline De Silva | Plant promoter involved in controlling lipid biosynthesis in seeds |
| US6326527B1 (en) * | 1993-08-25 | 2001-12-04 | Dekalb Genetics Corporation | Method for altering the nutritional content of plant seed |
| AU5732298A (en) * | 1997-01-07 | 1998-08-03 | Calgene, Inc. | Plant expansin promoter sequences |
-
1999
- 1999-08-17 AT AT99941191T patent/ATE309362T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-08-17 DE DE69928264T patent/DE69928264T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-17 CA CA002332628A patent/CA2332628C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-17 WO PCT/US1999/018628 patent/WO2000011177A1/en not_active Ceased
- 1999-08-17 EP EP99941191A patent/EP1104469B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-17 AU AU54890/99A patent/AU5489099A/en not_active Abandoned
- 1999-08-17 ES ES99941191T patent/ES2252964T3/es not_active Expired - Lifetime
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| DE69928264T2 (de) | 2006-07-13 |
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| CA2332628A1 (en) | 2000-03-02 |
| US6225529B1 (en) | 2001-05-01 |
| EP1104469A1 (en) | 2001-06-06 |
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