ES2252965T3 - Procedimiento para la obtencion de alginatos altamemte purificados. - Google Patents
Procedimiento para la obtencion de alginatos altamemte purificados.Info
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Abstract
Procedimiento para la obtención de una composición de alginato altamente purificado a base de una mezcla polimérica de ácido manurónico y ácido gulurónico, en el cual el peso molecular medio de la mezcla polimérica es mayor de 350 kD, con las etapas siguientes: a) Extraer el material a base de algas en una solución con un formador de complejos, b) Sedimentar los componentes celulares y las partículas con un aglutinante poroso c) Filtrar la solución d) Precipitar el alginato de la solución y e) Recoger y deshidratar el alginato precipitado, después de lo cual se repiten las etapas a) hasta e) al menos una vez, y f) Disolver el alginato y obtener al menos otro precipitado del alginato.
Description
Procedimiento para la obtención de alginatos
altamente purificados.
La presente invención se refiere a la obtención
de alginatos altamente purificados, en particular, a algas pardas,
y a los alginatos fabricados con este procedimiento con un elevado
grado de polimerización.
Los alginatos poseen numerosas aplicaciones en el
campo de la tecnología de los alimentos (por ejemplo, Askar en
"Alimenta", Bd. 21, 1982, pág 165 ff.) y en la técnica textil,
y cada día más en farmacia, medicina, bioquímica y biotecnología.
Los alginatos que se obtienen a partir de las plantas de algas
siguiendo el método conocido hasta el momento (revisión por ejemplo
en D.J. McHugh: "Production and Utilization of Products from
Comercial Seaweets" en "FAO Fisheries Technical Papers",
Bd. 288, 1987, cap.2) se caracterizan por las oscilaciones de la
composición y de la estructura así como por las impurezas. De ello
resulta que se extraiga el alginato bruto de la biomasa, que se
obtiene de las poblaciones salvajes. Las poblaciones de algas que
crecen especialmente en las aguas costeras están expuestas a
numerosas influencias geográficas, estacionales y materiales
(contaminación atmosférica). A ello se debe que en las cosechas se
recojan las algas conjuntamente con sustancias extrañas y sean
sometidas a un tratamiento químico para su conservación o
decoloración (por ejemplo, con formalina y/o hipocloruro).
Los alginatos brutos disponibles hasta el momento
son por tanto polímeros mixtos de estructura variable con
impurezas, entre los que figuran especialmente sustancias químicas
tóxicas. Puesto que en la técnica textil y de los alimentos existen
muchos intereses en las propiedades de los alginatos para formar
geles, se han desarrollado procedimientos para la limpieza y
purificación de los alginatos brutos, tal como se explica a
continuación, únicamente para fines
biológico-medicinales.
Los métodos para la limpieza de alginatos (por
ejemplo, como los que se disponen en la empresa Keltone LV o Kelco
Nutrasweet) se han descrito, por ejemplo, en DE-OS 4
204 012, US-A 5 429 821 (o bien
USA-A 5 656 468) y en la publicación de P. De Vos
el al. en "Diabetología" (Bd. 40, 1997, s. 262 ff). Estos
métodos poseen en general los inconvenientes de un gasto elevado de
energía (usos de una electroforesis, secado por congelación o
centrifugación, calentamiento o ebullición), de una elevada carga
ambiental (utilización de ácidos como el HCl, H_{2}SO_{4},
disolventes que no se desintegran desde el punto de vista biológico
como el CHCl_{3} o los iones de metales pesados como, por
ejemplo, el bario, plomo o cadmio) y de una limitación del peso
molecular medio a obtener del material final purificado. Otros
inconvenientes del método actual se deducen de las siguientes
aclaraciones:
En el conocido método de la DE-OS
42 04 012, una solución de alginato bruto se expone a un tratamiento
con un formador de complejos, a una extracción de ácidos a elevadas
temperaturas (alrededor de 70ºC), a un lavado, a un tratamiento con
alcohol concentrado (aprox. del 80%) y a otro tratamiento con un
formador de complejos. A continuación se realiza un proceso de
diálisis y un secado por congelación (o bien electroforesis o
centrifugación) para obtener el alginato purificado. Este método
tiene grandes inconvenientes debido al elevado gasto energético, al
gran número de etapas del proceso, al empleo de materiales tóxicos
(por ejemplo, bario como formador de complejos) y a la limitación a
alginatos (< 500kD). No obstante, un problema especial es que el
efecto de limpieza de este procedimiento está limitado.
En la DE-OS 42 04 012, los
alginatos purificados se conocen ciertamente como sustancias libres
de mitógenos, sin embargo esto únicamente bajo la hipótesis de una
libertad de mitógenos, suponiendo que en ensayos en animales
anteriormente definidos no se observen reacciones de inflamación, ni
una pasividad de otros componentes que se mantienen en el alginato
altamente purificado. Sin embargo se ha demostrado que los ensayos
en animales desarrollados a finales de los años 80 e implementados
en la DE-OS 42 04 012 no son adecuados para detectar
una libertad de mitógenos que cumple con, por ejemplo, los
requisitos de las modernas aplicaciones biomedicinales, por
ejemplo, la técnica de implantación. Así se realizaron los ensayos
en animales en el método de limpieza actual con las llamadas ratas
de Lewis. Mientras tanto se había podido detectar a través de G.
Klöck y cols. en "Biomaterials" (Bd. 18, 1997, pag. 707 ff) y
a través de P. Gröhn (Dissertation Universität Würzburg, 1998), que
las ratas de Lewis poseen una sensibilidad relativamente baja frente
a las sustancias mitógenas. Las cápsulas de alginato implantadas,
que no desencadenaban ninguna reacción de inflamación en las ratas
de Lewis después de tres semanas, conducían por ejemplo en las
llamadas ratas BB-OK ("Bio Breeding/Ottawa
Karlsburg") a reacciones de inflamación. De lo que se deduce que
las sustancias libres de mitógenos conocidas por la
DE-OS 42 04 012 realmente no pueden ser
consideradas como altamente purificadas y se emplean únicamente de
forma limitada debido a la reducida biocompatibilidad en las
aplicaciones biomedicinales.
En el método de purificación conocido de
US-A 5.429.821 o bien US-A 5.656.468
se realiza asimismo una precipitación ácida. Se requieren de nuevo
unas etapas de proceso a elevada temperatura y para la obtención
definitiva de alginatos una centrifugación, una electroforesis o un
secado por congelación. Los alginatos obtenidos según este
procedimiento se limitan a pesos moleculares inferiores a 200 kD. Se
realiza un secado a 80ºC, en el cual pueden formarse sustancias
derivadas del secado en la mezcla polimérica debido a cambios en la
estructura y en las
sustancias.
sustancias.
Un problema determinado lo representa la
limitación a pesos moleculares relativamente bajos. Así, por
ejemplo, de "Immobilized Enzymes" de J. Chivata (A Halsted
Press Book, John Wiley & Sons, 1978) se sabe que la biotoxicidad
de los materiales disminuye con el aumento del peso molecular.
En definitiva, el procedimiento mencionado según
P. de Vos et al. se caracteriza por numerosas etapas, que
incluyen una precipitación ácida, el empleo de sustancias químicas
tóxicas (cloroformo), el uso de etanol altamente concentrado
(aprox. del 70%) y la utilización de una centrifugación,
electroforesis o secado por congelación.
De la
WO-A-93/24077 se conocen asimismo
materiales de revestimiento a base de alginatos. El método aquí
expuesto trata de alginatos que se obtienen en el comercio. Este
preparado de alginatos se trata con un formador de complejos para
separar los iones metálicos bivalentes. El tratamiento siguiente con
carbón activo absorbe los polifenoles todavía existentes con las
proteínas ligadas a ellos y las unidades de fucosa. Tras el
tratamiento con carbón activo precipita el alginato de la solución,
se lava y luego se filtra para separar otras impurezas. El peso
molecular de estos alginatos se localiza en la región inferior, es
decir, en la zona de 2 hasta 300 kD.
Los alginatos ricos en ácido manurónico se
conocen de Biomaterials, Tomo 8, 1997, páginas 707 hasta 713. Este
alginato ex extraído de las algas pardas y luego es purificado. El
proceso de purificación o limpieza se basa en la extracción de
perlas de alginato reticuladas con iones de Ba^{2+} (fabricadas a
partir de un extracto de algina bruto tratado con carbón) con
ácidos débiles, citrato y etanol. A continuación, se dializa, y
entonces el alginato se precipita con etanol.
La WO-A-93/16111
informa sobre una sustancia libre de mitógenos, que presenta la
mezcla polimérica de un 10 hasta un 90% en moles de ácido
gulurónico y el resto hasta el 100% en ácido manurónico, y que posee
un peso molecular de 10 hasta 500 kD.
La US-A-5.459.054
informa sobre un alginato purificado con un contenido elevado en
ácido gulurónico, que está libre de compuestos similares al fenol y
endotoxinas.
La US-A-5.622.718
informa sobre alginatos con un peso molecular medio superior a 350
kD con una proporción determinada de ácido manurónico respecto a
ácido gulurónico.
La EP-A-366 868
informa sobre la fabricación de alginatos, en los cuales el cociente
de ácido manurónico respecto a ácido gulurónico se sitúa entre 7:3
y 3:7.
Otro inconveniente de todo el proceso de limpieza
reside en su limitación a la limpieza de alginatos disponibles en
el comercio. Los métodos no se pueden utilizar sobre material fresco
o bien biomasa cultivada. Además los procedimientos no son
practicables en caso de una aplicación muy técnica debido a las
engorrosas instrucciones de los mismos, al gasto energético y al
empleo de sustancias químicas tóxicas.
El cometido de la invención consiste en averiguar
un procedimiento para obtener alginatos altamente purificados, con
el cual se eviten los inconvenientes del método de limpieza actual y
se consiga la fabricación de un alginato altamente puro, en
particular a una gran escala técnica. La invención se refiere
también a un alginato, en particular a un alginato que se ha
fabricado conforme a la invención y tiene un elevado peso molecular
o una elevada viscosidad con respecto a los alginatos usuales.
Este cometido se resuelve mediante un
procedimiento o bien una composición de alginato con las
características conforme a las reivindicaciones 1 o 14. Las formas
de ejecución preferidas y los usos de la invención se deducen de
las reivindicaciones dependientes.
Por un alginato altamente puro se entiende aquí
una composición de alginato que se fabrica de un modo reproducible,
que posee unos parámetros de viscosidad y/o peso molecular
predeterminados y una elevada esterilidad, pureza y
biocompatibilidad. La última característica se refiere, por
ejemplo, a que con los alginatos altamente puros conforme a la
invención en ratas BB/OK autoinmunodiabéticas incluso después de una
implantación de varias semanas, no se desencadena ninguna o bien
una reacción mínima de cuerpos extraños.
A diferencia de los métodos de purificación
usuales, que en conjunto se adaptan a los alginatos brutos
disponibles en el comercio, los cuales sin embargo equivalen a
mezclas de distintos materiales a base de algas debido a la
influencia de materiales extraños y por tanto básicamente no pueden
dar un alginato altamente purificado según la invención, se habla
de una fabricación o bien obtención de alginato que preferiblemente
procede de un material a base de algas frescas limpio o bien de un
material a base de algas secadas como material de partida. En
particular se ha previsto que inicialmente se trate el material a
base de algas en presencia de formadores de complejos, es decir con
un aglutinante en forma de un granulado o bien un material poroso
comparable, de forma que se sedimenten los componentes celulares y
las partículas. Después de una filtración se lleva a cabo una
etapa de precipitación, preferiblemente insuflando al mismo tiempo
un gas portador, y bajo este efecto el alginato precipitado queda
suspendido en la solución. Esta espuma (que flota)no es
necesaria obligatoriamente. El alginato precipitado puede ser
separado de la solución de otra manera (por ejemplo, mediante un
proceso de decantación). El alginato obtenido de esta forma puede
ser retirado de la superficie de la solución o bien se puede
obtener como residuo después de la decantación y puede ser
deshidratado al aire o con un filtro-prensa. Según
la aplicación, este proceso de limpieza o bien las etapas de este
proceso de limpieza se llevan a cabo una o varias veces. Tras la
última limpieza, se realiza un lavado definitivo y un secado
al aire.
al aire.
Este modo de proceder tiene las ventajas
siguientes. En la obtención de alginatos se renuncia completamente
a sustancias químicas tóxicas y condiciones de alta temperatura. Las
etapas individuales del proceso se basan en técnicas conocidas y de
fácil dominio, cuya combinación conforme a la invención las hace
especialmente preferidas en cuanto a los costes del proceso, el
gasto de material y la velocidad del proceso. Por primera vez y
contrariamente a todos los ensayos de limpieza habituales se
consigue una biocompatibilidad del material del alginato obtenido,
de manera que se amplia su campo de aplicación en particular en
biología y medicina. El producto fabricado conforme a la invención
y biocompatible se basa exclusivamente en alginato. El alginato
está libre de aditivos, como por ejemplo, de inmunosupresores o
sustancias inmunoestimulantes o bien de fenoles o compuestos
similares al fenol, y puede emplearse directamente en este
estado.
Las etapas del proceso pueden realizarse sin
problemas a pequeña escala, por ejemplo en el lugar de los cultivos
de algas, o bien también a gran escala desde el punto de vista
técnico. Controlando la reacción de precipitación se excluyen las
impurezas mediante Fucoidano, de manera que la pureza de los
alginatos obtenidos mejora en comparación con la de los alginatos
corrientes.
El tratamiento inmediato de las algas tiene una
serie de ventajas. En primer lugar se pueden evitar por completo
los inconvenientes en el cultivo de algas corriente, que se dan
debido a la descomposición y putrefacción en el lugar del cultivo.
En segundo lugar, las algas cultivadas pueden separarse según los
órganos o trozos de tejidos, previamente a que se realice la
obtención de alginatos. Puesto que los distintos tejidos de algas
se diferencian por las distintas proporciones de ácido manurónico y
ácido gulurónico monoméricos, pudiendo fabricarse alginatos
altamente purificados con una composición determinada de
manurona-gulurona. Todo ello sirve para la elección
de determinados trozos de tejido con el fin de obtener un peso
molecular determinado. Pueden obtenerse composiciones de alginato
conforme a la invención con un peso molecular superior a 1.000 kD.
Finalmente, el método conforme a la invención sale sin unas etapas
de centrifugación costosas, por lo que se simplifica de nuevo su
aplicación. La obtención de diferentes tipos de alginatos altamente
purificados (por ejemplo, alginato rico en guluronato o manuronato)
puede realizarse mediante la obtención precisa de determinadas
especies de algas (Laminarales, Ectocarpales, Fucales y
otras especies de algas que contienen otros alginatos), que se
diferencian por la estructura química del correspondiente alginato.
En la selección específica de órganos se separan filoides,
cauloides y rizoides de algas y se tratan por separado. Esta
diferenciación puede perfeccionarse todavía más, de manera que se
obtenga por separado cada uno de los tejidos de los distintos
órganos y el alginato de estos tejidos.
La invención se adapta especialmente a la
obtención de alginatos de un material a base de algas frescas o
secadas (en particular algas pardas). Sin embargo, también es
posible purificar los alginatos brutos disponibles en el comercio
con el método conforme a la invención o bien combinar el método
conforme a la invención con determinadas etapas de lavado o
separación (por ejemplo, centrifugación), que ya son conocidas por
los habituales procedimientos de purificación.
Las ventajas de la invención son el resultado de
que el alginato altamente puro se obtenga directamente de las
plantas de algas mediante el control de las etapas del proceso. Se
evitarán sustancias químicas tóxicas (en particular disolventes),
de manera que es posible un empleo sin más con fines farmacéuticos.
El espumado del alginato precipitado representa un método de
separación simple y que no requiere apenas energía.
Según una forma de ejecución preferida de la
invención se llevarán a cabo las siguientes etapas del proceso en
primer lugar en el material a base de algas frescas o en el material
a base de algas secadas y seguidamente se repetirá parcialmente en
alginato altamente purificado, obtenido en la primera o en
posteriores etapas del proceso. El material a base de algas o bien
alginato comercial se denomina a continuación material de
partida.
Según la invención, el material de partida se
extrae en primer lugar en presencia de formadores de complejos, si
fuera preciso en una solución de sosa (ver luego, ejemplo 1). A
continuación, se produce la sedimentación de los componentes
celulares y partículas presentes en la solución mediante la adición
de un granulado y si fuera preciso mediante la adición de
intercambiadores de iones (como, por ejemplo, amberlita) y luego se
filtra la solución. La sedimentación puede realizarse
alternativamente utilizando electrografito (por ejemplo, en forma
de bolitas). Para ello se agita el electrografito en la solución y
se carga mediante un flujo de corriente entre dos electrodos
sumergidos en la solución. Las bolitas de electrografito cargadas
indican una acumulación de impurezas, que engloban los
correspondientes componentes celulares y partículas extrañas. La
sedimentación se emplea preferiblemente en la limpieza de material
a base de alginato comercial, pero puede suprimirse del todo
dependiendo de la aplicación (ver luego, ejemplo 2). Le etapa de
filtrado puede englobar un filtrado múltiple con un tamaño de
poros, entre 15 \mum hasta 0,1 \mum que disminuye según las
etapas. De la solución filtrada se precipita el alginado mediante
un medio de precipitación adecuado. La precipitación se realiza
preferiblemente con un alcohol (por ejemplo, etanol). Pero también
puede emplearse un ácido o un medio precipitante adecuado. La
concentración de alcohol se elige entre un 10% y un 50%,
preferiblemente entre un 30% y un 50%. En este margen de
concentración las impurezas se mantienen en solución debido a
polisacáridos activos inmunológicamente, como por ejemplo, el
Fucoidano y pueden separarse del alginato. En caso de emplear
concentraciones de alcohol superiores como, por ejemplo, en el
procedimiento según De Vos et al., estos polisacáridos no
deseados no se podrán separar. Durante la precipitación se hace
pasar un gas impulsor (por ejemplo, aire) por la solución. El
alginato precipitado es impulsado hacia arriba debido al aire
insuflado y puede ser extraído fácilmente en la superficie de la
solución con un dispositivo apropiado (por ejemplo, red, malla,
criba o cedazo o similares). Seguidamente se deshidrata el alginato
recogido con un
filtro-prensa.
filtro-prensa.
Las mencionadas etapas del proceso se repiten
según su empleo de un modo total, parcial, o de forma parcialmente
modificada. Tras la última etapa del proceso se lava el alginato
altamente purificado en etanol y si fuera preciso en agua y se seca
al aire a temperatura ambiente.
El alginato purificado posee, dependiendo del
material de partida, una proporción de monómeros de ácido manurónico
y gulurónico del orden de 0,1-9 (lo que corresponde
al 1% hasta el 90% de ácido manurónico) y un peso molecular medio
de aprox. 10 kD hasta más de 1000 kD. El alginato implantado en una
rata BB/OK autoinmunodiabética, purificado de este modo, no
desencadena después de un periodo de implantación de 3 semanas
ninguna o bien una reacción de cuerpos extraños muy débil, tal como
se explica detalladamente.
El procedimiento descrito para la obtención de
alginatos puede ser modificado en lo que se refiere al medio de
precipitación, la elección de medio de sedimentación, la elección
del gas impulsor inerte, el proceso de precipitación y/o el proceso
de recogida del alginato precipitado. En lugar del kieselgur o
tierra de diatomeas o diatomita empleado para la sedimentación
puede emplearse también cualquier otro material absorbente como
electrografito, granulados, celulosa, materiales porosos para el
reciclado en forma de polvo o de partículas. También es posible
emplear una herramienta de agitación recubierta de un material
absorbente para la sedimentación.
El objetivo de la invención es también un
alginato altamente purificado, que conste de una proporción en
particular del 70% de ácido manurónico y ácido gulurónico como
mezcla polimérica, y que presente las características definidas en
la reivindicación 14.
Los alginatos fabricados según la invención se
caracterizan por unas propiedades características de la materia
debido a su extrema pureza y con motivo de la excelente extracción
en un proceso conforme a la invención, que no se dan en los
alginatos corrientes. Estas propiedades de la materia incluyen tanto
parámetros característicos, que son medibles directamente como
propiedades del alginato (por ejemplo, viscosidad), como también
parámetros, que como propiedades de las impurezas eliminadas
conforme a la invención, cuya ausencia total o bien mínimamente
perceptible aparición se atribuyen a la elevada pureza del alginato
conforme a la invención (por ejemplo, propiedades de fluorescencia
de las impurezas, desencadenamiento de reacciones inmunológicas en
ensayos animales y en cultivos celulares, etc.).
Los alginatos fabricados conforme a la invención
se caracterizan por una viscosidad elevada. Una solución acuosa de
un alginato conforme a la invención con una concentración del 0,1%
posee una viscosidad del orden de 10 hasta 15 mPa.s. Esto
representa un valor considerablemente elevado frente a la viscosidad
de las soluciones de alginato corrientes de concentración similar
(aprox. 1 hasta 5 mPa s). Para soluciones del 0,5% de alginatos
fabricados conforme a la invención, se da una viscosidad de 280 mPa
s. La viscosidad de las soluciones de alginato se determina con un
viscosímetro a bolas rodantes (tipo:AMV-200, Antón
Para KG, Graz, Austria). A partir de los valores de viscosidad se
determina el peso molecular por medio del procedimiento según
Huggins ("J.Am.Chem.Soc.", tomo 64, 1942, pág. 2716 ff.) y
Kramer ("Ing.Eng.Chem.", tomo 30, 1938, pág. 1200 ff.). Se
obtienen pesos moleculares medios de alginatos fabricados conforme a
la invención superiores a 350 kD.
Los alginatos fabricados conforme a la invención
están libres de fenoles y de compuestos similares al fenol, en
particular de polifenoles, que se componen de floroglucinol y
compuestos a base de proteínas fenólicas. Para una longitud de onda
de excitación de 366 nm, los alginatos fabricados conforme a la
invención no poseen ninguna emisión de fluorescencia, si se tiene
en cuenta una fluorescencia de disolvente (bandas Raman del agua) a
418 nm en un margen espectral de 380 a 550 nm. La libertad del fenol
y del polifenol de los alginatos fabricados conforme a la invención
se obtiene también de ensayos de color utilizando el reactivo de
Folin-Denis o bien con dimetoxibenzaldehido (DMBA).
Los alginatos fabricados conforme a la invención no poseen ninguna
extinción en este ensayo de color, visto desde la absorción del
disolvente.
Los alginatos fabricados conforme a la invención
están prácticamente libres de sustancias (por ejemplo, proteínas),
que absorben a una longitud de onda de 350 nm. La libertad de las
proteínas se muestra de nuevo en una medición de la fluorescencia
con una longitud de onda de excitación de 270 nm, que no da ninguna
emisión de fluorescencia en un margen espectral de 300 hasta 500
nm, visto desde la fluorescencia del disolvente. La libertad
proteínica de los alginatos fabricados conforme a la invención se
muestra también con la detección proteínica fotométrica según
Bradford ("Anal. Biochem.", Bd. 72, 1976, s. 248 ff.).
Los alginatos fabricados conforme a la invención
están también libres de endotoxinas. Las endotoxinas son impurezas,
que pueden desencadenarse en una implantación de una inmunorreacción
del receptor, que aparecen en los extractos de algas corrientes
procedentes de las paredes celulares de la flora concomitante
bacteriana de los alginatos. Las soluciones de alginato conforme a
la invención (concentración: 0,25%) poseen un contenido en
endotoxinas inferior a 14,5 unidades de endotoxinas por mililitro de
solución de alginato (proceso de medida: determinación cuantitativa
de endotoxinas con el test del lisado de amebocitos de Limulus).
Los alginatos fabricados conforme a la invención
son biocompatibles en presencia de extractos de alginato
corrientes, siempre que este venga indicado por los ensayos en ratas
BB/OK y los tests XTT y MM que se explican a continuación.
Las aplicaciones preferidas de un alginato de
este tipo altamente purificado son la cirugía de transplantes, en
la cual células vivas encerradas en una cápsula de alginato son
implantadas en un cuerpo de un ser vivo sin que se produzcan
reacciones inmunológicas. El alginato altamente purificado puede ser
empleado incluso en los sectores de tecnología textil o de
alimentos para incrementar la tolerancia de determinados alimentos
o sustancias. Se destaca que el método conforme a la invención que
se acaba de explicar es también adecuado para la fabricación de
alginato altamente purificado con un peso molecular bajo hasta de
1000 kD.
Otras ventajas y características de la invención
se han descrito a continuación haciendo especial referencia a las
figuras adjuntas.
Figura 1 una visión de corte de un cabezal de
tobera para la fabricación de cápsulas de alginato,
Figura 2 Espectros de fluorescencia para la
demostración de la libertad del fenol de alginatos fabricados
conforme a la invención
Figura 3 Espectros de fluorescencia para la
demostración de la libertad proteínica de alginatos fabricados
conforme a la invención, y
Figura 4 Resultados de un ensayo de estimulación
de linfocitos para la demostración de la libertad inmunógena de
alginatos fabricados conforme a la invención.
A continuación se han descrito configuraciones
concretas del modo de proceder aclarado en general con anterioridad
en ejemplos. Se hace referencia sin limitación alguna a la limpieza
o utilización de material de alginato a base de algas pardas. En
lugar de algas pardas pueden emplearse en general todas las algas de
agua dulce o agua salada que contienen alginatos. La limpieza del
material a base de alginato de otras algas se realiza del modo
corres-
pondiente.
pondiente.
El material de partida incluye (1) algas pardas
frescas, (2) algas pardas secadas o bien (3) alginato comercial.
Como material fresco(1) se emplean las algas pardas
cultivadas en la naturaleza o en un espacio de cultivo o en un
invernadero o bien trozos de algas pardas de estadios de desarrollo
anteriores del ciclo de vida de las algas o bien el correspondiente
material a base de algas cultivado en un bioreactor homogéneo. El
material secado(2) consta de algas pardas secadas, que se
obtienen según estas alternativas.
En el primer ejemplo se hace referencia a 80 g de
algas secas y seguidamente hidratadas (agua). En el alginato
comercial, cuyo peso en seco es solamente alrededor del 1% del peso
fresco, se emplea menos peso seco. El material seco (por ejemplo,
Laminarales, Fucales) según(2) o (3) se lava según la
cantidad inicial durante varias horas en agua caliente. Esto puede
durar al menos 3 hasta 4 horas por ejemplo, en caso de agua
corriente con una temperatura de 40ºC, por lo que el agua se hace
fluir o se cambia varias veces. Al utilizar agua mas fría puede
alargarse la hidratación. La hidratación se realiza preferiblemente
de manera que el material se cuelga en un recipiente permeable al
agua (por ejemplo, saco permeable al agua) en agua corriente que
circula. En la hidratación en agua estancada el material es
hidratado por ejemplo, para un peso seco de partida de
aproximadamente 80 g de algas secas (lo que corresponde al 10% del
peso fresco de aprox. 800 g) en 3 hasta 6 l de agua. Tras la
hidratación se realiza de forma análoga el modo de proceder para los
tres tipos mencionados de material de partida (1) hasta (3).
El material se suspende en unos 5,7 l de una
solución 25 mM de EDTA (agua destilada o agua desmineralizada) (o
bien en el caso de alginato comercial(3) se disuelve). La
acción de la solución de ácido tetraetilendiamínico se produce
durante un mínimo de 10 horas. El periodo de actividad puede
acortarse si la suspensión se agita. Con mayor tiempo de acción
mejora el rendimiento de alginato purificado. En una suspensión no
agitada puede preverse por ejemplo un tiempo de acción de varios
días.
A continuación se añaden agitando un 5% de
Na_{2}CO_{3} y EDTA como sustancias sólidas. La cantidad de
EDTA se elige de manera que se forma una solución 50 mM de EDTA. La
suspensión se agita hasta que se forma una solución homogénea
(finamente dispersa). Este estado se consigue en particular cuando
en la solución únicamente son visibles algunos trozos de
componentes celulares. A continuación, se añaden unos 34 g de tierra
de diatomeas agitando y la solución se agita durante un mínimo de 2
días. De un modo alternativo es posible añadir la tierra de
diatomeas junto con Na_{2}CO_{3} y EDTA mientras se agita. Puede
preverse según la aplicación (en particular dependiendo del
material de algas pardas empleado) la adición de material de
intercambio iónico y al mismo tempo la tierra de diatomeas o el
electrografito. Por ejemplo, es posible añadir 34,2 g de amberlita
como intercambiador iónico, que previamente ha sido sometido a una
purificación. Esta purificación o limpieza sirve para eliminar las
sustancias toxicas y engloba una hidratación en agua corriente
(duración aproximada 3 horas).
Después del tratamiento con tierra de diatomeas
el volumen de la solución se diluye con agua desmineralizada a 22,8
l, para reducir la viscosidad. La dilución se elige en general de
manera que la solución seguidamente se puede filtrar. La adición de
agua depende por tanto y muy en particular del material de algas
pardas empleado. Tras la dilución y después de una corta agitación
se deja reposar la solución durante al menos 10 horas, para que se
puedan sedimentar los componentes sólidos. El tiempo puede ser
incluso del orden de días. El sobrenadante se decanta y se filtra.
La filtración se realiza en varias etapas, por lo que se emplea
primero un filtro de profundidad con un tamaño de poro de 15 \mum
y luego un filtro con un tamaño de poro de 0,1 \mum.
A continuación, sigue un proceso de adición de
sal al filtrado. Se prefiere la adición de KCl, pero según la
aplicación se pueden emplear otras sales. Se añade tanto KCl como
sustancia sólida, obteniéndose una solución de KCl 0,13M.
Seguidamente tiene lugar una precipitación de
etanol. La cantidad de aditivo de etanol depende de la cantidad de
Fucoidano que exista en el material. En la primera precipitación del
etanol la concentración final de etanol no debería exceder el 40%
en presencia de Fucoidano, puesto que el Fucoidano también
precipitaría. En el ejemplo dado se añaden aproximadamente 12 l de
etanol del 99%, de manera que la concentración final se elige
dependiendo del tipo de precipitado del alginato. Variando la
concentración de etanol puede conseguirse que el alginato precipite
en forma de hilos o de algodón. A ser posible se persigue una
precipitación de este tipo para que el alginato pueda ser reciclado
o emulsionado tal como se explica a continuación.
En lugar de etanol puede añadirse como mínimo
otro alcohol (por ejemplo, isopropanol) o bien un ácido de
precipitación, de manera que la concentración se rija por los
mencionados criterios.
Durante la precipitación se hace pasar un gas
impulsor por la solución (por ejemplo, aire). El alginato
precipitado es impulsado hacia arriba durante la precipitación, es
decir, mientras se forma, debido al aire insuflado y puede ser
recogido de la solución fácilmente con un dispositivo adecuado (por
ejemplo, red, criba o similar). El alginato precipitado puede ser
recogido, incluso sin la adición del gas impulsor, mediante el
decantado o la agitación con un dispositivo agitador, que queda
adherido al alginato precipitado. Seguidamente el alginato recogido
se deshidrata con un filtro-prensa para eliminar al
menos parcialmente el agua del material fuertemente
higroscópico.
Las etapas del proceso realizadas hasta aquí se
repiten según su aplicación, de un modo total o parcial o bien
parcialmente modificando las condiciones. Luego se realiza un
posterior tratamiento del alginato precipitado tal como se indica a
continuación.
El alginato precipitado se disuelve en 11,4 l de
una solución de EDTA 10 mM y de KCl 0,5M. La disolución se lleva a
cabo agitando, hasta que se forma una solución homogénea. A
continuación se realiza una segunda precipitación con
aproximadamente 10 l de una solución de etanol del 99% con la
entrada del gas impulsor. En estas condiciones, la concentración de
alcohol en la solución total es aproximadamente del 44%. En esta
segunda precipitación puede elegirse una concentración de alcohol o
de ácido mas elevada, puesto que el Fucoidano(ver antes) ya
se ha separado. En general, la concentración del medio precipitante
se ajusta de manera que se impulsa la formación de alginato
filiforme o en forma de algodón. En el caso de una concentración de
alcohol no optima, el alginato aparece en forma de gelatina y no
puede flotar ( flotar por la acción del gas impulsor).
Seguidamente el alginato precipitado se
deshidrata de nuevo mediante un filtro-prensa y se
lava varias veces con una cantidad 10 veces mayor de una solución
de etanol del 70%. A continuación, el material se seca a temperatura
ambiente. El secado puede realizarse en unas condiciones estériles
dependiendo de su empleo. Se ha previsto que después del lavado con
etanol se lave el material varias veces con agua desmineralizada o
bien se dialice frente a agua desmineralizada para eliminar las
trazas residuales de las sustancias concomitantes.
El numero de precipitaciones realizadas conforme
a la invención se rige según las impurezas o bien los productos
tóxicos secundarios que existen en el material de partida.
La tolerancia tisular del alginato obtenido según
el ejemplo se analiza del modo siguiente. Se realizan experimentos
de implantación con ratas BB /OK propensas a diabetes(edad
200 + 25 dias ), normoglucémicas (6,1 + glucosa plasmática 0,4 mM).
Estas ratas poseen una sensibilidad considerablemente mayor contra
las impurezas en los alginatos que la de las ratas de Lewis
anteriormente mencionadas.
Las cápsulas de
Ba^{2+}-alginato han sido fabricadas a partir de
alginato altamente purificado según el modo de proceder que
corresponde al descrito en DE-OS 42 04 012 A1. Las
cápsulas de alginato poseen un diámetro medio de 200 \mum hasta
400 \mum. La implantación se realizaba bajo la cápsula renal de
las ratas BB/OK. Los animales receptores se mantenían
normoglucémicos y no mostraban ninguna perdida de peso corporal. Al
cabo de tres semanas se sacrificaban los animales, se extraían los
riñones y se fijaban en una solución de Bouin. A la incrustación en
parafina seguía la preparación de trozos de 7 \mum. Cada trozo 20
de dos individuos independientes se sometía a un examen
histológico.
El resultado de la investigación para distintas
muestras en comparación con el alginato bruto se resume en la tabla
siguiente:
Resultado para dos muestras independientes:
| Muestra | Ratas # | Evaluación histológica (fibrosa) | Contenido en endotoxinas de una solución |
| de alginato del 0,25% | |||
| S1 | V159 | (+) | 1 EU/ml |
| V161 | + | ||
| S2 | V454 | 0 | 3,5 EU/ml |
| Alginato bruto | V12 | ++++ | >1000 EU/ml |
| (Leyenda:0 : ninguna reacción, (+):reacción muy débil, +:reacción débil, ++++: fibrosa muy fuerte). |
Se demuestra que la implantación con alginato
fabricado conforme a la invención no desencadena ninguna o bien
solamente una reacción muy débil, mientras que en la implantación
con el alginato bruto que se comercializa aparece una fibrosa muy
rígida.
El contenido en endotoxinas, que es
característico de un ataque bacteriano potencial, muestra en el caso
de alginatos altamente purificados unos valores casi despreciables,
mientras que el valor comparativo del alginato bruto comercial es
aproximadamente cientos de veces mayor.
En un alginato altamente purificado fabricado
conforme a la invención se constataba que utilizando el método de
ensayo siguiente no aparecía ninguna impureza de sustancias toxicas.
Los métodos de ensayo engloban en particular un método
espectroscópico de fluorescencia y un ensayo de la actividad de las
endotoxinas o de los mitógenos, como los que han descrito G. Klock
y cols. en "Appl. Microbiol. Biotechnology" (tomo 40, 1994,
pagina 638 ff) y en "Biomaterials" (tomo 18, 1997, pagina 707),
un método espectroscópico de RMN, la determinación del potencial
antioxidante del alginato altamente purificado mediante el calculo
de la reacción de adición de HOCl y sobre la determinación de la
actividad oxidativa de granulocitos neutrófilos con la ayuda de la
quimioluminiscencia (ver K. Arnold en "Tratados de la Academia
Sajona de las ciencias a Leipzig", tomo 58, 1997, borrador 5) y
el método de la "Free Flow Electrophoresis" como se ha descrito
por U. Zimmermann y cols. en "Electroforesis" (tomo 13, 1992,
pagina 269). Una impureza toxica no se ha determinado con este
método.
Según el método que se indica en la publicación
anteriormente mencionada de G. Klock y cols.(1997) se averiguaba
además la relación de ácido manurónico respecto a ácido gulurónico
con ayuda de la denominada "Circular
Dichroismus-Spectroscopy" o bien con la
espectroscopia de IR. Además se averiguaba también el peso molecular
respecto a la determinación de la viscosidad.
Las cápsulas de alginato reticuladas con
Ba^{2+} poseen una elasticidad sorprendente, como se ha podido
detectar con ayuda de las mediciones de la compresión.
En el segundo ejemplo se hace referencia a 10 g
de algas secas. Para unas cantidades iniciales superiores se
calculan de forma lineal las magnitudes cuantitativas que se indican
a continuación. A diferencia del ejemplo 1 la obtención o limpieza
de alginato se realiza preferiblemente sin una hidratación o
inflamación. El material inicial seco se añade muchas veces
directamente a una solución de EDTA. La solución de EDTA posee una
concentración del orden de 10 hasta 50 mM. La suspensión se agita
durante 24 horas y a continuación se tamiza para separar el
material sólido. Otra ventaja del modo de proceder explicado en el
segundo ejemplo consiste en que se reduce el consumo de EDTA y
también el empleo de alcohol.
Puede preverse que a la suspensión se añada
además carbón activo durante el tratamiento con EDTA. La masa de
carbón activo añadida es preferiblemente de un 10 hasta un 200% la
de la masa seca de algas obtenida.
A continuación se realiza directamente una
filtración de la suspensión sin una etapa especial de sedimentación.
La filtración se lleva a cabo en dos etapas, donde inicialmente se
emplea un filtro de profundidad o bien un pre-filro
con un tamaño de poro de 15 \mum y seguidamente un filtro con un
tamaño de poro de 0,2 \mum.
Después de añadir sal al filtrado como en el
ejemplo 1 (por ejemplo, formación de una solución de KCl 0,13 M) se
producen varias precipitaciones del etanol. Para la primera
precipitación se añade etanol del 99% (desnaturalizado con
acetona), de manera que se obtiene una concentración final del
etanol en la solución total del 37,5%. El producto precipitado se
recoge y se añade a una solución de KCl 0,5M (sin EDTA). El volumen
de la solución de KCl se ajusta a una tercera parte del volumen de
solución antes de la precipitación.
Para la segunda precipitación se emplea de nuevo
etanol del 99% (desnaturalizado con acetona), de manera que aquí se
obtiene una concentración final del etanol en la solución total del
44%. El producto precipitado se recoge y se coloca en agua
bidestilada con un volumen correspondiente al volumen de la solución
de KCl después de la primera precipitación.
Antes de la tercera precipitación se puede
efectuar una diálisis del producto precipitado obtenido en la
segunda precipitación. La diálisis, que no es ninguna
característica del proceso obligatoria, se realiza durante 3 días
con 3 cambios de agua al día. Para la tercera precipitación se añade
de nuevo etanol del 99% (desnaturalizado con acetona) para el
ajuste de una concentración final de etanol en la solución total del
50%. El producto precipitado se recoge y se seca.
A continuación se describe un ejemplo para la
cirugía de transplantes, es decir la microcapsulación de las islas
de Langerhans.
Las islas de Langerhans aisladas se suspendían en
una solución de NaCl del 0,9% y del 0,5% de alginato purificado.
Esta suspensión pasaba a ser de finas gotitas por medio de una
tobera de pulverización 10 visualizada en la figura 1. La tobera
tiene un tubo hueco 20 (tobera interior) interno desplazable con una
conexión (diámetro interior 350 \mum o bien 2 mm), un tubo hueco
central 30 (tobera central) con un diámetro de 1 mm o bien 3,5 mm y
un canal exterior 40, que desemboca en un cabezal de enfoque del
aire ajustable 50. Estos elementos se montan en un cabezal de la
tobera 60, en el cual se encuentran la conexión de aire a presión y
otras conexiones.
La suspensión de las islas en alginato es
comprimida por el canal central de la tobera. A través del canal
circundante se aplica una solución del 0,5 hasta el 2% de alginato
en solución de sal común al 0,9%. Con las gotas que se forman a la
entrada de la tobera la solución de alginato externa (0,5 hasta 2%)
rodea de este modo las islas suspendidas en la solución de alginato
del 0,5%. A través del tercer canal exterior se hace pasar aire
comprimido que corta las gotas por la abertura de la tobera. El aire
comprimido se ha ajustado a 30 hasta 40 mbar (7 hasta 8 l/min). Las
gotas de alginato 70 se gelificaban en 40 ml de solución reticulante
con BaCl_{2} 20 mM e histidina 5 mM. La solución reticulante se
ajusta con NaCl a una concentración fisiológica (290 mOsmol). Las
cápsulas se lavaban entonces tres veces con suero fisiológico
isotónico.
Con el alginato fabricado conforme a la invención
se pueden fabricar revestimientos para tejidos alógenos y
xenógenos, en particular tejidos endocrinos.
Los alginatos fabricados conforme a la invención
no contienen ninguna impureza perturbadora a base de fenoles,
polifenoles y otros compuestos fenólicos. Esta libertad del fenol
significa que las impurezas mencionadas no están contenidas o bien
están en una cantidad mínima en los alginatos, de manera que las
aplicaciones en biología y medicina, en particular las aplicaciones
anteriormente mencionadas, no se ven alteradas por reacciones
inmunológicas o similares. La libertad del fenol se detecta con un
análisis fluorimétrico, descrito por G. Skajk-Braek
y cols. (ver "Biotechnology and Bioengineering", tomo 33, 1989,
pág. 90 ff.). La medición de la fluorescencia se realiza con un
espectrómetro LS50 (Perkin-Elmer, Beaconsfield).
Para una longitud de onda de excitación de 366 nm se dan los
espectros de fluorescencia de las muestras de solución visualizados
en la figura 2, durante la limpieza según el ejemplo 2. Antes y
después de la filtración inicial la solución de alginato presenta
una fluorescencia fuerte en un intervalo entre 380 y 550 nm
(espectros superiores). Después de las etapas de filtración y de
precipitación la fluorescencia se reduce considerablemente. La
concentración de la solución final es aproximadamente del
0,2-0,3%. Queda únicamente un máximo de
fluorescencia a 418 nm, que equivale a la fluorescencia del
disolvente. En un alginato purificado conforme a la invención, la
fluorescencia de los fenoles y compuestos fenólicos se reduce a
menos del 10% frente a la solución de alginato no purificada.
La figura 2 indica que el contenido en fenoles en
el transcurso del método conforme a la invención disminuye
drásticamente y el alginato purificado presenta una emisión que está
solo mínimamente por encima del valor del agua altamente pura.
La libertad de las proteínas de los alginatos
fabricados conforme a la invención es detectada fluorimétricamente
como en el análisis según 1. La figura 3 indica que para una
longitud de onda de excitación de 270 nm se mide antes de la
purificación una emisión fuerte entre 300 y 500 nm. Esta emisión cae
en el transcurso de la purificación a un valor por debajo del 20%
de la fluorescencia de la solución de alginato no purificada.
Después de la última precipitación, la fluorescencia ya no es
detectable o es insignificante.
\newpage
La detección de Folien-Denis
colorea todos los compuestos que contienen fenol. Los alginatos
fabricados conforme a la invención no presentan ninguna extinción
en esta detección. La detección de Folin-Denis se
lleva a cabo en las condiciones siguientes:
La solución de alginato que se va a analizar (0,5
ml) se mezcla con 1 ml de metanol para la extracción. La muestra se
coloca después de una agitación intensiva durante aproximadamente 8
horas en la nevera. El alginato precipitado se centrífuga. Se
añaden 10 \mul del sobrenadante a 40 \mul de reactivo de
Folin-Denis (Fluka, Deisenhofen, Alemania), 80
\mul de Na_{2}CO_{3} 1M y 120 \mul de H_{2}O (se mantiene
esta secuencia). Tras agitar intensivamente, se realiza el cambio
de color en un baño de agua a 50ºC durante 30 min. Se efectúa la
medición de la densidad óptica con ayuda de un fotómetro a una
longitud de onda de 650 nm (o bien 725 nm).
Incluso al añadir dimetoxibenzaldehido (DMBA) los
alginatos fabricados conforme a la invención no presentan ninguna
reacción de color fotométrica evaluable. Este ensayo se efectuaba en
las condiciones siguientes: La solución de alginato que se va a
analizar (0,5 ml) se mezcla con 1 ml de metanol para la extracción.
La muestra se colocaba en la nevera durante aproximadamente 8 horas
después de una agitación fuerte. El alginato precipitado se
centrífuga. A continuación se realiza la adición de 10 \mul de
sobrenadante a la solución de DMBA, que se preparaba del modo
siguiente: 2 g de DMBA (Fluka, Deisenhofen, Alemania) se disuelven
en 100 ml de ácido acético. 16 ml de HCl (37%) se enrasan con
acético hasta 100 ml. Ambas soluciones se mezclan poco antes de su
empleo 1:1 respecto al reactivo de trabajo.
La medición de la densidad óptica se realiza con
ayuda de un fotómetro a una longitud de onda de 490 nm (ó 510 nm)
frente a una serie de calibración de floroglucinol (Sigma,
Deisenhofen, Alemania).
La detección de proteínas según Bradford (ver
"Anal. Biochem.", tomo 72, 1976, pag. 248 ff.) se basa en el
hecho de que el colorante Coomassie brilliant blue se enlaza de un
modo muy específico a las proteínas, por lo que se produce un
viraje de color de ojo a azul. La intensidad de la coloración azul
se correlaciona de forma lineal con la cantidad de proteína y se
puede cuantificar fotométricamente. Con este método las proteínas
son detectables hasta la región inferior de los \mug. Se analizan
10 \mul de una solución de alginato del 0,5%. Como sustancia de
detección de la solución de alginato que contiene colorante se
empleaba el llamado reactivo de Bradford (fabricante Sigma,
Steinheim, Alemania). Tras un periodo de incubación de 10 minutos se
medía fotométricamente la absorción de la muestra a 570 nm
empleando un dispositivo "Thermomex Microplate Reader"
(Fabricante de dispositivos moleculares, Manlow Park, USA). En la
solución de alginato conforme a la invención no se ha hallado con
este método ninguna proteína.
La biocompatibilidad de los alginatos purificados
conforme a la invención puede visualizarse con la prueba siguiente.
Las células viva, como los linfocitos de ratón o los fibroblastos se
mantienen en un cultivo con los alginatos durante algunos días. Los
alginatos presentan un efecto inmunógeno por el que se estimulan o
inhiben las células (para poder explicar el efecto de la
estimulación pueden añadirse al cultivo estimulantes adicionales,
por ejemplo, LPS o PHA ). La actividad metabólica incrementada en
los linfocitos y reducida en los fibroblastos puede ser
cuantificada fotométricamente y visualizada a base de la reacción de
un colorante (XTT ó MTT) a través de la dehidrogenasa mitocondrial.
En el caso de alginatos purificados conforme a la invención la
reacción del colorante es apenas detectable (ver figura 4), mientras
que al contrario de los alginatos comerciales en los que se detecta
una fuerte reacción del colorante. La figura 4 muestra los
resultados del ensayo de color para distintas fórmulas de LPS.
El cultivo de las células se realizaba en las
siguientes condiciones. La suspensión de células de linfocitos
(1*10^{6} células /ml en Complete Growth Médium) se mezcla con
distintas concentraciones de lipopolisacáridos (LPS, concentración
final: 0,01 \mug/ml) y solución de alginato (concentración final:
0,05%) y se cultiva durante 3 días con un 5% de CO_{2} a 37ºC.
Luego la suspensión se incuba con una solución de sal de tetrazolio
(XTT ó MTT) durante otras 6 horas. Se realiza la medición de la
densidad óptica a 450 nm (medición de referencia a 650 nm).
Tal como se ha descrito en el ejemplo 1, la
biocompatibilidad de los alginatos fabricados conforme a la
invención puede ser visualizada incluso a través de ensayos in
vivo en ratas BB/OK, cuyo sistema inmunitario presente una
elevada actividad de macrófagos. El alginato purificado conforme a
la invención que ha sido implantado en forma de cápsula en los
riñones de las ratas de acuerdo con las etapas descritas, no produce
ninguna fibrosis después de un periodo de incubación de 3
semanas.
La biocompatibilidad de los alginatos purificados
conforme a la invención puede ser visualizada con el ensayo
siguiente. Las células vivas, como los linfocitos humanos o de ratón
se mantienen durante algunos días con los alginatos en un cultivo.
Si los alginatos presentan un efecto inmunógeno, las células
reaccionan con una superficie de membrana fuertemente intensificada
(incremento de Mikrovilli) (para aclarar este efecto pueden
añadirse al cultivo estimulantes adicionales, por ejemplo, LPS ó
PHA). Dicho incremento puede averiguarse por un incremento en la
capacidad específica de la membrana C_{m}. La rotación eléctrica
de las células bajo la acción de campos eléctricos muy frecuentes,
permite detectar estos cambios de membrana de linfocitos al nivel
de la célula individual. En los alginatos purificados conforme a la
invención no se puede medir ningún incremento de la capacidad
específica de la membrana, mientras que en los alginatos comerciales
se detecta un incremento de este valor.
Las mediciones se realizaban en las condiciones
siguientes. La suspensión celular de linfocitos (1*10^{6}
células/ml en Complete Growth médium) se mezclaba con una solución
de alginato (concentración final: 0,05%) y se cultivaba durante 3
días con 5% de CO_{2} a 37ºC. Luego se lavaba la suspensión 2
veces en solución de inositol isoosmolar (290 mOSm/kg), y
seguidamente se volvía a suspender. Se realiza la determinación de
la frecuencia característica (máxima) de la rotación anticampo por
medio del método de compensación para distintas capacidades
conductoras (10, 25, 40 \muS/cm, ajustadas con
HEPES-KOS pH 7,2). Con ayuda de una regresión lineal
delas frecuencias características normalizadas con el radio
celular, aplicadas frente a la capacidad conductora externa, puede
determinarse el parámetro eléctrico (capacidad y capacidad
conductora) de la membrana plasmática. Los parámetros eléctricos de
las células cultivadas en presencia de los alginatos fabricados
conforme a la invención se mantienen inalterados, mientras que las
células cultivadas con alginatos comerciales presentan un
incremento de la capacidad de la membrana del orden del 10 hasta del
50%.
La biocompatibilidad de los alginatos purificados
conforme a la invención puede visualizarse también con el ensayo
siguiente. Las células vivas, como los linfocitos humanos o los
linfocitos de ratón se mantienen durante unos días en cultivo con
los alginatos. Los alginatos presentan un efecto inmunógeno, y
aumentan el tamaño de las células y aumenta el número de células
(para aclarar este efecto, pueden añadirse estimulantes adicionales,
por ejemplo, LPS o PHA al cultivo). El tamaño de las células y el
número de células puede ser averiguad con ayuda del CASY1 Cell
Analyzer (Modelo TTC, Schärfe Technology, Reutlingen, Alemania), que
trabaja según el principio de Coulter. Dicho aparato permite el
registro rápido, exacto (tamaño, distribución de tamaños y número
de células) de varios miles de células por medida. Con los alginatos
purificados conforme a la invención no se puede medir ningún
incremento celular significativo y ningún aumento del número de
células tras la incubación, mientras que con los alginatos
comerciales se detecta un claro incremento celular (alrededor del
50%) y un número de células elevado (35 hasta 50%).
Las mediciones se realizaban en las condiciones
siguientes. La suspensión de linfocitos (1*10^{6} células/ml en
Complete Growth Médium) se mezcla con una solución de alginato
(concentración final: 0,05%) y se cultiva durante 3 días con 5% de
CO_{2} a 37ºC. Luego una parte alícuota (100 \mul) centrifugada
y absorbida en Inosit (o bien PBS) de la suspensión de linfocitos
bien resuspendida se lava dos veces en solución de inositol
isoosmolar (290 mOsm/kg) y se absorbe en 10 ml de PBS (solución
salina tamponada con fosfato) y seguidamente se mide en CASY1. De
los histogramas de CASY puede calcularse la parte de células
grandes, estimuladas de toda la población celular.
Claims (17)
1. Procedimiento para la obtención de una
composición de alginato altamente purificado a base de una mezcla
polimérica de ácido manurónico y ácido gulurónico, en el cual el
peso molecular medio de la mezcla polimérica es mayor de 350 kD,
con las etapas siguientes:
- a)
- Extraer el material a base de algas en una solución con un formador de complejos,
- b)
- Sedimentar los componentes celulares y las partículas con un aglutinante poroso
- c)
- Filtrar la solución
- d)
- Precipitar el alginato de la solución y
- e)
- Recoger y deshidratar el alginato precipitado, después de lo cual se repiten las etapas a) hasta e) al menos una vez, y
- f)
- Disolver el alginato y obtener al menos otro precipitado del alginato.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
en el cual para la extracción se emplea ácido
etilendiamintetracético como formador de complejos.
3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
en el cual la extracción se realiza en una solución de sosa
4. Procedimiento conforme a la reivindicación 2 ó
3, en el cual para extraer la solución se emplea carbón activo.
5. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
en el cual la sedimentación se realiza con un granulado poroso a
base de tierra de diatomeas, celulosa o materiales de reciclaje de
sustancias brutas.
6. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el filtrado se realiza con
filtros de profundidad de un tamaño de poro determinado.
7. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el precipitado de alginato
se realiza con etanol.
8. Procedimiento conforme a la reivindicación 7,
en el que el contenido en etanol se elige en un intervalo del
10-50%.
9. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones anteriores, en el cual la recogida de alginato
precipitado se realiza por la espumación de la solución, mediante el
decantado de la solución o bien agitando la solución con un
dispositivo de agitación y recogida.
10. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el deshidratado del
alginato se realiza a temperatura ambiente.
11. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones anteriores, en el cual se emplea como material de
algas el material a base de algas frescas que existe en la
naturaleza o bien el material a base de algas frescas cultivado en
un bioreactor o en un depósito o bien el material a base de algas de
células de algas fusionadas o regeneradas.
12. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones anteriores, en el cual se emplean determinados
trozos de tejidos o de órganos de algas o bien trozos de algas o
determinados trozos de tejidos o de órganos de algas o trozos de
algas de determinados estadios del ciclo de desarrollo de las algas,
como material a base de algas.
13. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones anteriores, en el cual como material a base de
algas se emplean algas pardas o bien algas de agua dulce o de agua
salada que producen alginatos.
14. Composición de alginatos fabricada conforme a
un procedimiento según las reivindicaciones 1 hasta 13, que se
caracteriza porque a la mezcla polimérica se añade una
relación de ácido manurónico respecto a ácido gulurónico del orden
del 1% hasta el 90%,
la composición de alginato en solución acuosa con
una concentración del 0,1% que posee una viscosidad del orden de 10
hasta 15 mPa.s,
la composición de alginato en solución acuosa con
una concentración del 0,5% que posee una viscosidad del orden de
250 hasta 300 mPa.s,
\newpage
la composición de alginato en solución acuosa que
en una iluminación con una longitud de onda de excitación de 366 nm
en el margen espectral de 380 hasta 550 nm, no presenta emisión de
fluorescencia,
la composición de alginato que para un ensayo de
color con el reactivo de Folin-Denis o con
dimetoxibenzaldehido no presenta ninguna coloración,
la composición de alginato en una solución acuosa
para la iluminación con una longitud de onda de excitación de 270
nm en un margen espectral de 300 hasta 500 nm no presenta ninguna
emisión de fluorescencia,
la composición de alginato que no contiene
ninguna proteína detectable con la detección fotométrica de
proteínas según Bradford,
la composición de alginato en la implantación en
los riñones de ratas BB/OK no desencadena ninguna reacción
inmunológica significativa y
la composición de alginato después del empleo del
ensayo XTT/MTT o del método de rotación celular o bien de una
determinación eléctrica del número de células o del tamaño celular
no conduce a ninguna activación detectable de linfocitos.
15. Utilización de una composición de alginato
conforme a la reivindicación 14 para la fabricación de cápsulas o
envueltas de alginato para la cirugía de transplantes y para otras
aplicaciones medicinales y para la industria alimenticia.
16. Utilización de una composición de alginato
conforme a la reivindicación 14 para la fabricación de cápsulas o
envueltas de alginato para tejidos alógenos o xenógenos.
17. Utilización de una composición de alginato
conforme a la reivindicación 14 para la fabricación de cápsulas o
envueltas de alginato para las islas de Langerhans, tejidos de
glándulas tiroideas, tejido endocrino o células tratadas con
dopamina.
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