ES2252982T3

ES2252982T3 - Metodos inmunoterapeuticos que utilizan epitopos de wt-1 y gata-1.

Info

Publication number: ES2252982T3
Application number: ES99952682T
Authority: ES
Inventors: Hans Josef Dept. of Immunology STAUSS; Liquan Dept. of Immunology GAO
Original assignee: Ganymed Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: Ganymed Pharmaceuticals GmbH
Priority date: 1998-11-02
Filing date: 1999-11-02
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2019-11-02
Also published as: AU6479799A; CA2348956A1; EP1619202A3; NZ511454A; EP1127068A1; EP1619202B1; DE69939406D1; CA2773380A1; DE69929533T2; CY1105597T1; EP1127068B1; AU770752B2; US7326767B1; JP2003500004A; US20140199762A1; WO2000026249A1; DK1127068T3; ATE405587T1; US8529904B2; JP2012183067A

Abstract

Péptido con un peso molecular de 5.000 o inferior que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL o que comprende una secuencia de aminoácidos, en la que uno o ambos de los aminoácidos en las posiciones 2 y 9 de la secuencia RMFPNAPYL se sustituyen por otro aminoácido natural, en la que dicha sustitución no anula la unión a HLA-A0201.

Description

Métodos inmunoterapéuticos que utilizan epítopos de WT-1 y GATA-1.

La presente invención se refiere a moléculas y células de inmunoterapia para su utilización en inmunoterapia. En particular, la presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer incluyendo la leucemia.

Existen pruebas de que los linfocitos T citotóxicos antitumorales (CTL) desempeñan una función importante in vivo. Los CTL reactivos del tumor se ha demostrado que median en la regresión tumoral en modelos animales (Kast et al. (1989) Cell 59, 603-614) y en el hombre (Kawakami et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6458-6462). Como en todos los tipos de terapia antitumoral, un problema que necesita resolverse es que la terapia debe destruir o inactivar las células tumorales diana hasta un punto útil pero que la terapia no debe destruir o inactivar las células no tumorales hasta un punto perjudicial. En otras palabras, es deseable que la terapia sea selectiva para las células tumorales hasta un punto beneficioso.

La mayor parte del trabajo actual en inmunoterapia del cáncer hace uso del hecho de que determinados tumores expresan polipéptidos que no son expresados en el tejido no tumoral equivalente o hacen uso del hecho de que el tumor expresa una forma mutante de un polipéptido que no se expresa en el tejido no tumoral. Sin embargo, no siempre es posible identificar los polipéptidos en un tumor que está comprendido en esta categoría y por eso han sido identificados otros polipéptidos diana que pueden formar la base de un método inmunoterapéutico.

El trabajo en pacientes con melanoma ha demostrado que los péptido-epítopos reconocidos por los CTL reactivos con el melanoma proceden frecuentemente de los antígenos de diferenciación específica del tejido. El reconocimiento de los antígenos de diferenciación que se expresan en tejidos normales parece violar las normas de tolerancia inmunológica; sin embargo, el reconocimiento por los CTL de los antígenos de diferenciación asociados al melanoma podría explicarse por el hecho de que normalmente sólo son expresados en los melanocitos que existen en número relativamente pequeño en las zonas inmunológicamente privilegiadas, no pudiendo por lo tanto demostrar tolerancia. Existen pruebas también de que los antígenos de diferenciación específica para la próstata pueden servir como dianas para los CTL contra los tumores de la próstata. Actualmente se desconoce en qué medida los factores de transcripción regulados desde el punto de vista del desarrollo pueden servir como dianas para los CTL contra los tumores que expresan de forma aberrante estos factores.

En los adultos, la expresión de WT1, factor de transcripción embrionario, se ha observado en los podocitos renales, en los testículos, en el ovario, en las células mioepiteliales del pecho y en algunas células madre CD34^{+} en la médula ósea. Se observó expresión aberrante en el cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma y leucemia incluyendo CML y AML (véase, por ejemplo, Menssen et al. (1995) Leukaemia 9, 1060-1067; Inoue et al. (1997) Blood 89, 1405-1412; Inoue et al. (1996) Blood 88, 2267-2278; Inoue et al. (1998) Blood 91, 2969-2976; Menssen et al. (1997) Int. J. Cancer 70, 518-523; Menssen et al. (1995) Leukemia 9, 1060-1067; Ogawa et al. (1998) Transplant 21, 527-527; Rodeck et al. (1994) Int. J. Cancer 59, 78-82; Silberstein et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8132-8137; Tamaki et al. (1996) Blood 88, 4396-4398; y Viel et al. (1994) Int. J. Cancer 57, 515-521).

La patente U.S. nº 5.726.288 se refiere a la localización y caracterización del gen del tumor de Wilms. Se dan a conocer cuatro secuencias de aminoácidos (SEC. ID nº 2, nº 4, nº 5 y nº 6) que contienen la secuencia RMFPNAPYL o CMTWMNQMNL, pero no existe descripción de los péptidos que corresponden a estas secuencias o a su utilización en inmunoterapia.

Utilizando un método no convencional que emplea CTL alo-MHC-restringido, los autores han identificado sorprendentemente epítopos peptídicos en la proteína WT-1 que puede ser presentada por las moléculas HLA-A0201 de clase I y desplegada en la superficie de las células tumorales que expresan endógenamente esta proteína. Se utilizaron pacientes que responden de forma negativa a HLA-A0201 como fuente de CTL específica para los péptidos presentados por la molécula HLA-A0201 de clase I y este método permite la identificación de los péptidos presentados por HLA-A0201 independiente de la posible tolerancia de los CTL antólogos.

HLA-A0201 es el haplotipo de HLA-A más frecuente.

Para evitar dudas, los términos HLA y MHC se utilizan indistintamente en esta memoria.

Un primer aspecto de la invención proporciona un péptido con un peso molecular de 5.000 o menos que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL o que comprende una secuencia de aminoácidos, en la que uno o ambos de los aminoácidos en las posiciones 2 y 9 de la secuencia RMFPNAPYL se sustituyen por otro aminoácido natural, en la que dicha sustitución no anula la unión a HLA-A0201.

El término "péptido" hace referencia no solamente a las moléculas en la que los restos de aminoácidos están unidos por enlaces (-CO-NH-) peptídicos sino también las moléculas en las que el enlace peptídico está invertido. Dichos peptidomiméticos retroinversos pueden prepararse utilizando los métodos conocidos en la materia, por ejemplo tales como los descritos en Mézière et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Este método implica la preparación de pseudopéptidos que contienen cambios que implican al eje central, y no a la orientación de las cadenas laterales. Mézière et al. (1997) demuestra que, por lo menos para las respuestas de MHC de clase II y de las células T cooperadoras, estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos retroinversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces CO-NH peptídicos, son mucho más resistentes a la proteólisis.

Asimismo, el enlace peptídico puede ser distribuido en el conjunto siempre que se utilice un grupo enlazador apropiado que conserva el espaciado entre los átomos C\alpha de los restos de aminoácido; se prefiere particularmente que el grupo enlazador tenga sustancialmente la misma distribución de cargas y sustancialmente la misma planariedad de un enlace peptídico.

Se apreciará que el péptido pueda bloquearse de forma conveniente en su terminal N o C a fin de ayudar a reducir la sensibilidad a la digestión exoproteolítica.

Uno o dos de los restos de aminoácidos de los aminoácidos en las posiciones 2 y 9 de la secuencia RMFPNAPYL puede ser sustituido por la cadena lateral de otro aminoácido natural de modo que el péptido sea capaz todavía de unirse a una molécula HLA-A0201 sustancialmente de la misma forma que un péptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos dada. Por ejemplo, un péptido puede modificarse para que por lo menos mantenga, si no mejora, la capacidad para interactuar con una unión a HLA-A0201 y de modo que por lo menos mantenga, si no mejora, la capacidad para generar CTL activados que pueden reconocer y destruir las células que expresan de manera aberrante un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL (por ejemplo, WT1). Las posiciones 2 y 9 de un nonámero que se une a HLA-A2 son típicamente restos del anclaje. Las modificaciones de estos y otros restos implicados en la unión HLA-A2 pueden potenciar la unión sin alterar el reconocimiento de los CTL (por ejemplo, véase Tourdot et al. (1997) J. Immunol. 159, 2391-2398).

Estos restos de aminoácidos que no son esenciales para interactuar con el receptor de las células T pueden modificarse por sustitución con otro aminoácido cuya incorporación no afecte sustancialmente la reactividad de las células T y no elimine la unión al MHC apropiado.

El péptido de la invención puede ser un oligopéptido o polipéptido. Típicamente, el péptido de la invención es el que, si se expresa en una célula que presenta el antígeno, puede ser procesado de modo que se produzca un fragmento que es capaz de unirse a una molécula de MHC apropiada y puede ser presentado por una célula adecuada y producir una respuesta a las células T adecuada. Se apreciará que un fragmento producido a partir del péptido pueda ser también un péptido de la invención. El péptido de la invención contiene además convenientemente una parte que comunica alguna propiedad deseable. Por ejemplo, la parte adicional puede incluir un epítopo de células T adicional (ya sea o no procedente del mismo polipéptido como la primera parte que contiene el epítopo de células T) o puede incluir una proteína o péptido transportador. Por lo tanto, en una forma de realización el péptido de la invención es una proteína WT-1 humana truncada o una proteína de fusión de un fragmento de proteína WT-1 y otra fracción del polipéptido siempre que la fracción de WT-1 humana incluya la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

En una forma de realización particularmente preferida, el péptido de la invención comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL y por lo menos un epítopo de células T adicional en la que el epítopo de células T adicional es capaz de facilitar la producción de una respuesta de las células T dirigida al tipo de tumor que expresa WT-1 de forma aberrante. Por lo tanto, los péptidos de la invención comprenden los denominados polipéptidos de "cuentas engarzadas" que pueden ser utilizados como vacunas.

Se apreciará a partir de lo siguiente que en algunas aplicaciones los péptidos de la invención puedan utilizarse directamente (es decir, que no se produzcan por expresión de un polinucleótido en una célula del paciente o en una célula administrada a un paciente); en dichas aplicaciones es preferible que el péptido tenga menos de 100
restos.

Es preferible que los péptidos de la invención puedan unirse a HLA-A0201; sin embargo, los péptidos pueden también unirse a otros tipos de HLA así como a HLA-A0201. Se prefiere particularmente que los péptidos se unan selectivamente a HLA-A0201.

Los péptidos de la invención son particularmente útiles en los métodos inmunoterapéuticos para dirigir y destruir células que expresan de forma aberrante el polipéptido WT1 (producto génico del tumor de Wilms). La secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL se encuentra en los restos 126-134 de WT1. La secuencia de aminoácidos de WT-1 se proporciona en Gessler et al. (1990) Nature 343, 774-778.

Es preferible que los péptidos de la invención sean los que se unen a HLA-A0201 y cuando estén unidos de este modo el complejo HLA-A0201-péptido, cuando está presente en la superficie de una célula adecuada que presenta el antígeno es capaz de obtener la producción de un CTL que reconoce una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende la secuencia RMFPNAPYL de aminoácidos, tal como el polipéptido WT1.

El polipéptido WT1 se expresa de forma aberrante en las leucemias, cáncer de mama, melanoma y cáncer de ovario.

En "expresado de forma aberrante" se incluye el significado de que el polipéptido está sobreexpresado en comparación con los niveles normales de expresión o que el gen es imperceptible en el tejido del que procede el tumor pero se expresa en el tumor. "Sobreexpresado" significa que el polipéptido está presente en un nivel por lo menos de 1,2 \times el presente en el tejido normal; preferentemente por lo menos 2 \times y más preferentemente por lo menos 5 \times o 10 \times el nivel presente en el tejido normal.

Es bien conocido que una longitud óptima para un péptido que se une a una molécula HLA es aproximadamente de 8 a 12 aminoácidos, preferentemente 9 aminoácidos.

El péptido particularmente preferido de la invención es el que está constituido por la secuencia RMFPNAPYL de aminoácidos.

Si un péptido mayor a aproximadamente 12 restos de aminoácidos se utiliza directamente para unirse a una molécula MHC, es preferible que los restos que flanquean la zona central de unión a HLA son los que no afectan sustancialmente la capacidad del péptido para unirse a la molécula MHC o para presentar el péptido al CTL. Sin embargo, se apreciará que puedan utilizarse péptidos mayores, específicamente cuando son codificados por un polinucleótido, ya que estos péptidos mayores pueden ser fragmentados por células adecuadas que presentan el antígeno.

Los péptidos (por lo menos los que contienen enlaces peptídicos entre los restos de aminoácidos) pueden sintetizarse por el modo Fmoc-poliamida de la síntesis peptídica en fase sólida como describen Lu et al. (1981) J. Org. Chem. 46, 3433 y las referencias en la presente memoria. La protección del grupo N-amino temporal es proporcionada por el grupo 9-fluorenilmetoloxicarbonilo (Fmoc). La escisión repetida de este grupo protector lábil muy básico se efectúa utilizando piperidina al 20% en N,N-dimetilformamida. Dichos grupos funcionales de la cadena lateral pueden estar protegidos en forma de sus éteres butílicos (en el caso de serina, treonina y tirosina), ésteres butílicos (en el caso del ácido glutámico y ácido aspártico), derivados de butiloxicarbonilo (en el caso de lisina e histidina), derivados de tritilo (en el caso de cisteína) y derivado de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo (en el caso de la arginina). Cuando la glutamina o la aspargina son los restos C-terminales, se hace uso del grupo 4,4'-dimetoxibenzhidrilo para la protección de los grupos funcionales amido en la cadena lateral. El soporte en fase sólida está basado en un polímero de polidimetil-acrilamida constituido por los tres monómeros dimetilacrilamida (monómero del eje central), bisacriloiletilendiamina (reticulador) y éster metílico de acriloilsarcosina (agente de funcionalización). El agente ligado escisionable péptido a resina utilizado es el derivado del ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético ácido lábil. Todos los derivados de aminoácidos se añaden como sus derivados de anhídrido simétricos preformados con la excepción de asparagina y glutamina, que se añaden utilizando un procedimiento de acoplamiento mediado por N,N-diciclohexil-carbodiimida/1-hidroxibenzotriazol invertido. Todo el acoplamiento y las reacciones de desprotección se controlan utilizando procedimientos de prueba con ninhidrina, trinitrobenceno, ácido sulfónico o isotina. Una vez terminada la síntesis, los péptidos se escinden del soporte de resina con la eliminación simultánea de los grupos protectores de la cadena lateral mediante tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% que contiene una mezcla antioxidante al 50%. Los antioxidantes comúnmente utilizados son etanoditiol, fenol, anisol y agua, dependiendo la selección exacta de los aminoácidos constituyentes del péptido que se sintetiza. El ácido trifluoroacético se elimina mediante evaporación al vacío, con disgregación ulterior con éter dietílico que da el péptido en bruto. Cualquier antioxidante presente se elimina mediante un procedimiento de extracción sencillo el cual en la liofilización de la fase acuosa da el péptido en bruto exento de antioxidantes. Los reactivos para la síntesis del péptido están disponibles generalmente en Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd., Nottingham NG7 2QJ, UK. La purificación puede efectuarse mediante una técnica, o una combinación de técnicas tales como la cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico y (principalmente) la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa. El análisis de los péptidos puede realizarse utilizando cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa y análisis de aminoácidos después de la hidrólisis ácida y mediante análisis espectrométrico de masas con bombardeo con átomos rápidos (FAB).

Un aspecto adicional de la invención proporciona un polinucleótido que codifica un péptido de la invención. El polinucleótido puede ser ADN o ARN o puede o no contener intrones siempre que codifique el péptido. Desde luego, únicamente los péptidos que contienen restos de aminoácidos naturales unidos por enlaces peptídicos naturales son los codificables por un polinucleótido.

Un aspecto adicional todavía de la invención proporciona un vector de expresión capaz de expresar un péptido según la invención.

Se ha desarrollado una variedad de métodos para ligar operativamente polinucleótidos, especialmente ADN, a vectores por ejemplo mediante terminales adherentes complementarios. Por ejemplo, pueden añadirse segmentos de homopolímero complementarios al segmento de ADN que debe insertarse al ADN del vector. El vector y el segmento del ADN se unen a continuación mediante enlace de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.

Los enlazadores sintéticos que contienen una o más secuencias de restricción proporcionan un método alternativo de unión del segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN, generado por digestión con endonucleasa de restricción tal como se describió al principio, se trata con T4 ADN polimerasa de bacteriófago o ADN polimerasa I de E. coli, enzimas que eliminan los terminales de una sola cadena en 3' salientes con sus actividades 3'-5'-exonucleolíticas y rellenan en los terminales en 3' intermedios con sus actividades polimerizantes.

La combinación de estas actividades genera por consiguiente segmentos de ADN truncados. Los segmentos truncados se incuban a continuación con un gran exceso molar de moléculas enlazadoras en presencia de una enzima que puede catalizar la ligadura de las moléculas de ADN truncadas, tal como la T4 ADN ligasa de bacteriófago. Por lo tanto, los productos de la reacción son los segmentos de ADN que llevan secuencia de enlazador polimérico en sus extremos. Estas secuencias de ADN se escinden a continuación con la enzima de restricción apropiada y se ligan a un vector de expresión que ha sido escindido con una enzima que produce terminales compatibles con los del segmento de ADN.

Los enlazadores sintéticos que contienen una variedad de secuencias de endonucleasa de restricción están disponibles en el mercado a través de numerosos distribuidores incluyendo International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USA.

Una manera deseable de modificar el ADN que codifica el polipéptido de la invención consiste en utilizar la reacción en cadena de polimerasa como describe Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491. Este método puede utilizarse para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo por modificación genética en las zonas de restricción adecuadas o puede utilizarse para modificar el ADN de otras maneras útiles conocidas en la técnica.

En este método el ADN que se debe ampliar enzimáticamente está flanqueado por dos cebadores específicos que se incorporan en el ADN ampliado. Dichos cebadores específicos pueden contener secuencias de reconocimiento de la endonucleasa de restricción que pueden utilizarse para la clonación en vectores de expresión que utilizan métodos conocidos en la técnica.

El ADN (o en el caso de los vectores retrovíricos, el ARN) se expresa a continuación en un anfitrión adecuado para producir un péptido de la invención. Por lo tanto, el ADN que codifica el péptido de la invención puede utilizarse según las técnicas conocidas, modificado de manera apropiada a la vista de lo dado a conocer contenido en la presente memoria, para construir un vector de expresión, que se utiliza a continuación para transformar una célula huésped apropiada para la expresión y producción del péptido de la invención. Dichas técnicas incluyen las dadas a conocer en las patentes U.S. nº 4.440.859 concedida el 3 de abril de 1984 a Rutter et al., nº 4.530.901 concedida el 23 de julio de 1985 a Weissman, nº 4.582.800 concedida el 15 de abril de 1986 a Crowl, nº 4.677.063 concedida el 30 de junio de 1987 a Mark et al., nº 4.678.751 concedida el 7 de julio de 1987 a Goeddel, nº 4.704.362 concedida el 3 de noviembre de 1987 a Itakura et al., nº 4.710.463 concedida el 1 de diciembre de 1987 a Murray, nº 4.757.006 concedida el 12 de julio de 1988 a Toole, Jr. et al., nº 4.766.075 concedida el 23 de agosto de 1988 a Goeddel et al., y nº 4.810.648 concedida el 7 de marzo de 1989 a Stalker.

El ADN (o en el caso de vectores retrovíricos, el ARN) que codifica el péptido de la invención puede unirse a una amplia variedad de otras secuencias de ADN para la introducción en un anfitrión apropiado. El ADN compañero dependerá de la naturaleza del anfitrión, de la manera de la introducción del ADN en el anfitrión y de si se desea el mantenimiento episómico o la integración.

Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión, tal como un plásmido, en la orientación apropiada y el marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN puede unirse a las secuencias de nucleótidos de control reguladoras de la transcripción y de la traducción apropiadas reconocidas por el anfitrión deseado, aunque dichos controles están generalmente disponibles en el vector de expresión. El vector se introduce a continuación en el anfitrión mediante técnicas normalizadas. Generalmente, no todos los anfitriones serán transformados por el vector. Por consiguiente, será necesario seleccionarlos para las células huésped transformadas. Una técnica de selección conlleva la incorporación en el vector de expresión de una secuencia de ADN, con algunos elementos de control necesarios, que codifica una característica seleccionable en la célula transformada, tal como la resistencia al antibiótico. Como alternativa, el gen para dicha característica seleccionable puede estar en otro vector, que se utiliza para transformar conjuntamente la célula huésped deseada.

Las células huésped que han sido transformadas por el ADN recombinante de la invención se cultivan a continuación durante un tiempo suficiente y en condiciones apropiadas conocidas por los expertos en la materia a la vista de las enseñanzas dadas a conocer en la presente memoria que permiten la expresión del péptido, que puede recuperarse a continuación.

Se conocen muchos sistemas de expresión, incluyendo bacterias (por ejemplo E. coli y Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae), hongos filamentosos (por ejemplo Aspergillus), células de vegetales, células de animales y células de insectos.

Los vectores comprenden específicamente un replicón procariótico, tal como el ColE1 ori, para la propagación en un procariota, incluso si el vector que debe utilizarse para la expresión en otros tipos de células no procarióticas. Los vectores pueden también incluir un activador apropiado tal como un activador procariótico capaz de dirigir la expresión (transcripción y traducción) de los genes en una célula huésped bacteriana, tal como E. coli, transformada con éste.

Un activador es un elemento de control de la expresión formado por una secuencia de ADN que permite que se produzca la unión de la ARN polimerasa y la transcripción. Se proporcionan secuencias de activador compatibles con los anfitriones bacterianos a título de ejemplo específicamente en vectores de plásmido que contienen secuencias de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención.

Los plásmidos de vector procariótico típicos son pUC18, pUC19 pBR322 y pBR329 disponible en Biorad Laboratories, (Richmond, CA, USA) y pTrc99A y pKK223-3 disponible en Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.

Un plásmido de vector de célula de mamífero típico es el pSVL disponible en Pharmacia, Piscataway, NJ, USA. Este vector utiliza el activador tardío SV40 para dirigir la expresión de genes clonados, obteniéndose el nivel de expresión mayor en las células que producen el antígeno T, tales como las células COS-1.

Un ejemplo de un vector de expresión de mamífero inducible es pMSG, también disponible en Pharmacia. Este vector utiliza el activador inducible por glucocorticoides de la repetición del terminal largo del virus del tumor de mama de ratón para dirigir la expresión del gen clonado.

Los vectores del plásmido de levadura útiles son pRS403-406 y pRS413-416 y están generalmente disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrantes de levadura (Ylp) e incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos de centrómero de levadura (Ycp).

Otros vectores y sistemas de expresión son bien conocidos en la técnica para su utilización con una variedad de células huésped.

La presente invención también se refiere a una célula huésped transformada con un montaje del vector de polinucleótido de la presente invención. La célula huésped puede ser procariótica o eucariótica. Las células bacterianas pueden ser células huésped procarióticas preferidas en algunas circunstancias y normalmente son una cepa de E. coli tal como, por ejemplo, las cepas DH5 de E. coli disponibles en Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA y RR1 disponible en la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, USA (nº ATCC 31343). Las células huésped eucarióticas preferidas comprenden células de levaduras, de insectos y de mamíferos, preferentemente células de vertebrados tales como las de las líneas celulares fibroblásticas y renales de ratón, rata, mono o humanas. Las células huésped de levaduras comprenden YPH499, YPH500 e YPH501 que están generalmente disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Las células huésped de mamífero preferidas comprenden las células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles en la ATCC como CCL61, células NIH/3T3 embrionarias de ratón NIH Swiss disponibles en la ATCC como CRL 1658, células COS-1 procedentes del riñón de mono disponibles en la ATCC como CRL 1650 y células 293 que son células de riñón embrionarias humanas. Las células de insecto preferidas son las células Sf9 que pueden ser transfectadas con vectores de expresión de
baculovirus.

La transformación de células huésped apropiadas con un montaje de ADN de la presente invención se realiza mediante métodos bien conocidos que normalmente dependen del tipo de vector utilizado. Con relación a la transformación de las células huésped procarióticas, véase, por ejemplo, Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. La transformación de las células de levadura está descrita en Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. El método de Beggs (1978) Nature 275, 104-109 es también útil. Con relación a las células de vertebrados, los reactivos útiles en la transfectación de dichas células, por ejemplo fosfato de calcio y DEAE-dextrano o formulaciones de liposoma, están disponibles en Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA.

La electroporación es también útil para transformar y/o transfectar las células y es bien conocida en la materia para la transformación de células de levadura, células bacterianas, células de insectos y células de invertebrados.

Por ejemplo, muchas especies bacterianas pueden transformarse mediante los métodos descritos en Luchansky et al. (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646. El número mayor de transformantes se recupera continuamente después de la electroporación de la mezcla de ADN y células en suspensión en 2,5 \times PEB utilizando 6.250 V por cm a 25 \muFD.

Los métodos para la transformación de la levadura por electroporación se dan a conocer en Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 1982.

Las células transformadas con éxito, es decir, las células que contienen un montaje de ADN de la presente invención, pueden identificarse mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de un montaje de expresión de la presente invención pueden desarrollarse para producir el péptido de la invención. Las células pueden recogerse y lisarse y examinar la presencia de ADN en su contenido de ADN utilizando un método tal como el descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 o Berent et al. (1985) Biotech. 3, 208. Como alternativa, la presencia de la proteína en el sobrenadante puede detectarse utilizando anticuerpos como se describe a
continuación.

Además para analizar directamente la presencia del ADN recombinante, la transformación con éxito puede confirmarse por métodos inmunológicos bien conocidos cuando el ADN recombinante es capaz de dirigir la expresión de la proteína. Por ejemplo, las células transformadas con éxito con un vector de expresión producen proteínas que presentan antigenicidad apropiada. Las muestras de células sospechosas de estar transformadas se recogen y se analizan las proteínas utilizando anticuerpos adecuados.

Por lo tanto, además de las propias células huésped transformadas, la presente invención contempla también un cultivo de esas células, preferentemente un cultivo monoclonal (clonalmente homogéneo) o un cultivo procedente de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente.

Se apreciará que determinadas células huésped de la invención sean útiles para la preparación de los péptidos de la invención, por ejemplo células bacterianas, de levadura y de insectos. Sin embargo, otras células huésped pueden ser útiles en determinados métodos terapéuticos. Por ejemplo, las células presentadoras del antígeno, tales como las células dendríticas, pueden utilizarse provechosamente para expresar los péptidos de la invención de modo que pueden cargarse en las moléculas MHC apropiadas.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método de producción de un péptido de la invención, comprendiendo el método el cultivo de las células huésped que contienen un polinucleótido o vector de expresión que codifica el péptido y obteniendo el péptido a partir de la célula huésped o del medio de cultivo.

Los aspectos adicionales de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y un péptido según la invención o un polinucleótido o vector de expresión que codifica dicho péptido. La formulación farmacéutica se prepara en una forma adecuada para la administración a un paciente y está esterilizada y exenta de pirógenos. Aún aspectos adicionales de la invención proporcionan un péptido según la invención o polinucleótidos o vectores de expresión que codifican dicho péptido para su utilización en medicina. Los péptidos, polipéptidos o vectores de expresión se envasan y se presentan para su utilización en medicina.

La composición farmacéutica o el envase y la presentación, pueden estar en cualquier forma adecuada. Está previsto que las formas adecuadas sean para inyección intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección intradérmica (i.d.), inyección intraperitoneal (i.p.) e inyección intramuscular (i.m.).

Las formas preferidas de inyección de péptidos son s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v.

Las formas preferidas de inyección de ADN son i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v.

Pueden administrarse dosis comprendidas entre 1 y 500 mg de péptido o de ADN.

La composición farmacéutica de la invención puede constituir una vacuna contra el tumor o contra el cáncer. Puede administrarse directamente en el paciente, en el órgano afectado o de forma generalizada o aplicarse ex vivo a las células procedentes del paciente o a una línea celular humana que se administre posteriormente al paciente o utilizarse in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunitarias procedentes del paciente, que se vuelen a administrar a continuación al paciente. Si se administra el ácido nucleico a las células in vitro, puede ser útil para las células que estén transfectadas a fin de expresar conjuntamente las citocinas de estimulación inmunitaria, tal como la interleucina-2. El péptido puede estar sustancialmente puro o combinado con un adyuvante de estimulación inmunitaria tal como Detox o utilizarse en combinación con citocinas estimulantes inmunitarias o administrarse con un sistema de administración adecuado, por ejemplo liposomas. El péptido puede también conjugarse con un excipiente adecuado tal como la hemocianina de la lapa californiana (KLH) o manano (véase el documento WO 95/18145 y Longenecker et al. (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690, 276-291). El péptido puede también estar marcado o ser una proteína de fusión o una molécula híbrida. Es de esperar que los péptidos de la invención estimulen a CD8 CTL. Sin embargo, la estimulación es más eficaz en presencia de la ayuda proporcionada por las células T de CD4. Por lo tanto, el compañero de fusión o las secciones de una molécula híbrida proporcionan de forma adecuada epítopos que estimulan las células T de CD4. Los epítopos que estimulan CD4 son bien conocidos en la técnica e incluyen los identificados en la vacuna contra el tétanos. El polinucleótido puede estar sustancialmente puro o contenido en un vector adecuado o en un sistema de administración. Los vectores y los sistemas de administración adecuados comprenden los víricos, tales como los sistemas a base de adenovirus, virus de vacunas, retrovirus, herpes virus, virus adenoasociado o híbridos que contienen elementos de más de un virus. Los sistemas de administración no víricos comprenden lípidos catiónicos y polímeros catiónicos como es bien conocido en la técnica de administración del ADN. Puede utilizarse también la administración física tal como mediante un "cañón génico". El péptido o el péptido codificado por el ácido nucleico puede ser una proteína de fusión, por ejemplo con un epítopo de la vacuna contra el tétanos que estimula las células T de CD4.

Para su utilización en una vacuna contra el cáncer el péptido puede ser cualquier péptido adecuado. En particular, puede ser un péptido nonámero adecuado o un péptido heptámero u octámero o decámero adecuado. Péptidos mayores pueden ser también adecuados, pero se prefieren los péptidos nonámero o decámero.

Propiamente, cualquier ácido nucleico administrado al paciente está esterilizado y exento de pirógenos. El ADN desprotegido puede administrarse por vía intramuscular, intradérmica o subcutánea. Los péptidos pueden administrarse por vía intramuscular, intradérmica o subcutánea.

La vacunación produce respuestas a CTL estimuladas por células especializadas presentadoras de antígeno; una vez los CTL están cebados, pueden ser una ventaja en la mejora de la expresión de MHC en las células tumorales.

Puede ser también útil dirigir la vacuna a poblaciones de células específicas, por ejemplo células que presentan el antígeno, por el sitio de inyección, utilización de vectores de direccionamiento y sistemas de administración o purificación selectiva de dicha población celular del paciente y administración ex vivo del péptido o del ácido nucleico (por ejemplo las células dendríticas pueden ser clasificadas como se describe en Zhou et al. (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al. (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651). Por ejemplo, los vectores de direccionamiento pueden comprender un activador tisular o específico del tumor que dirige la expresión del antígeno a un lugar
adecuado.

Los pacientes a los que se administra la terapia, pueden tener sus tumores tipificados para sobreexpresión o expresión anormal (ambas son expresiones aberrantes) de WT1.

Un aspecto adicional de la invención proporciona por consiguiente una vacuna eficaz contra el cáncer o contra células cancerosas o tumorales, que comprende una cantidad eficaz de un péptido de la invención o que comprende un ácido nucleico que codifica dicho péptido.

Se prefiere particularmente que la vacuna sea una vacuna de ácido nucleico. Es conocido que la inoculación con una vacuna de ácido nucleico, tal como una vacuna de ADN, que codifica un polipéptido conduce a una respuesta a linfocitos T.

De forma conveniente, la vacuna de ácido nucleico puede comprender cualquier medio de administración de ácido nucleico adecuado. El ácido nucleico, preferentemente el ADN, puede estar desprotegido (es decir sin sustancialmente otros componentes que deben administrarse) o puede estar administrado en un liposoma o como parte de un sistema de administración de vector vírico.

Se cree que la absorción del ácido nucleico y la expresión del polipéptido codificado por las células dendríticas puede ser el mecanismo de cebado de la respuesta inmunitaria; sin embargo, las células dendríticas pueden no estar transfectadas pero son todavía importantes ya que pueden recoger el péptido expresado procedente de las células transfectadas en el tejido.

Es preferible que la vacuna, tal como la vacuna de ADN, se administre en el músculo. Es preferible que la vacuna se administre en la piel.

La vacuna de ácido nucleico puede administrarse sin adyuvante. La vacuna de ácido nucleico puede administrarse también con un adyuvante tal como BCG o alúmina. Otros adyuvantes adecuados comprenden estimulante QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA) que procede de la saponina, extractos micobacterianos y miméticos de la pared celular de bacterias sintéticas y adyuvantes farmacéuticos tal como Detox de Ribi. Quil A, puede utilizarse también otro adyuvante derivado de la saponina (Superfos, Dinamarca). Es preferible que la vacuna de ácido nucleico se administre sin adyuvante.

También pueden ser útiles otros adyuvantes tal como el de Freund. Puede ser útil también administrar el péptido conjugado con hemocianina de lapa californiana, preferiblemente también con un adyuvante.

La terapia del cáncer para la inmunización mediada por polinucleótidos está descrita en Conry et al. (1996) Seminars in Oncology 23, 135-147; Condon et al. (1996) Nature Medicine 2, 1122-1127; Gong et al. (1997) Nature Medicine 3, 558-561; Zhai et al. (1996) J. Immunol. 156, 700-710; Graham et al. (1996) Int. J. Cancer 65, 664-670; y Burchell et al. (1996) págs. 309-313 en: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al. (eds.), John Libbey Eurotext.

Un aspecto adicional todavía de la presente invención proporciona la utilización de un péptido de la invención o de un polinucleótido o un vector de expresión que codifica dicho péptido, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en un paciente en el que las células cancerosas expresan de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

Por lo tanto, el medicamento es útil para tratar cánceres que expresen de manera aberrante WT1.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados in vitro, comprendiendo el método poner en contacto in vitro los CTL con las moléculas MHC de clase I humanas cargadas con el antígeno expresadas en la superficie de una célula presentadora del antígeno adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar, de manera específica un antígeno, en el que el antígeno es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL o que comprende una secuencia de aminoácidos, en la que uno o ambos aminoácidos en las posiciones 2 y 9 de la secuencia RMFPNAPYL están sustituidos por otro aminoácido natural, en la que dicha sustitución no suprime la unión a HLA-A0201, siempre que el péptido no sea el polipéptido WT-1 humano completo.

Los CTL son propiamente células CD8^{+} pero pueden ser células CD4^{+}. Las moléculas MHC de clase I pueden expresarse en la superficie de cualquier célula adecuada y es preferible que la célula sea la que expresa de forma natural las moléculas MHC de clase I (en cuyo caso la célula está transfectada para expresar dicha molécula) o, si lo hace, es deficiente en el tratamiento del antígeno o en la serie de reacciones que presentan el antígeno. De este modo, es posible que la célula que expresa la molécula MHC de clase I esté sustancialmente cebada por completo con un antígeno peptídico seleccionado antes de activar el CTL.

La célula que presenta el antígeno (o célula estimulante) posee específicamente una molécula MHC de clase I en su superficie y preferentemente es sustancialmente incapaz de cargar por sí misma dicha molécula MHC de clase I con el antígeno seleccionado. Como se describe con más detalle a continuación, la molécula MHC de clase I puede cargarse fácilmente con el antígeno seleccionado in vitro.

Dicha célula presentadora del antígeno es convenientemente una célula de mamífero deficiente en la expresión de un transportador de péptido de modo que, cuando por lo menos parte de dicha molécula seleccionada es un péptido, no está cargado en dicha molécula MHC de clase I.

Preferentemente la célula de mamífero carece o posee un nivel reducido o tiene una función reducida del transportador de péptidos TAP. Las células adecuadas que carecen del transportador de péptidos TAP comprenden las células T2, RMA-S y Drosophila. TAP es el transportador asociado al tratamiento del antígeno.

Por lo tanto, convenientemente la célula es una célula de insecto tal como una célula de Drosophila.

La línea celular T2 defectuosa que carga el péptido humano está disponible en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA con el nº de catálogo CRL 1992; la línea 2 de Schneider de la línea celular de Drosophila está disponible en la ATCC con el nº de catálogo CRL 19863; la línea celular RMA-S de ratón está descrita en Karre y Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162, 1745.

En una forma de realización preferida la célula estimulante es una célula huésped (tal como una célula T2, RMA-S o de Drosophila) transfectada con una molécula de ácido nucleico capaz de expresar dicha molécula MHC de clase I. Aunque las células T2 y RMA-S expresan antes de la transfección las moléculas HLA de clase I no están cargadas con un péptido.

Las células de mamífero pueden transfectarse por métodos bien conocidos en la materia. Las células de Drosophila pueden transfectarse, como se describe en Jackson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 12117.

Convenientemente dicha célula huésped antes de la transfección no expresa sustancialmente ninguna molécula MHC de clase I.

Es preferible también que la célula estimulante exprese una molécula importante para la estimulación conjunta de células T tales como cualquiera de entre B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA 3.

Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas moléculas MHC de clase I, y de moléculas coestimulantes, están disponibles al público en el GenBank y en las bases de datos EMBL.

Se prefiere particularmente que sustancialmente todas las moléculas MHC de clase I expresadas en la superficie de dicha célula estimulante sean del mismo tipo.

Las HLA de clase I en el hombre, y sistemas equivalentes en otros animales, son genéticamente muy complejas. Por ejemplo, existen por lo menos 110 alelos del locus de HLA-B y por lo menos 90 alelos del locus de HLA-A. Aunque cualquier molécula HLA de clase I (o equivalente) es útil en este aspecto de la invención, es preferible que la célula estimulante presente por lo menos parte de la molécula seleccionada en una molécula HLA de clase I que aparece con una frecuencia razonablemente alta en la población humana. Es bien conocido que la frecuencia de los alelos de HLA de clase I varía entre diferentes grupos étnicos tales como el caucásico, africano, chino, etcétera. Por lo menos en cuanto a la población caucásica se refiere es preferible que la molécula HLA de clase I esté codificada por un alelo HLA-A2, un alelo HLA-A1, un alelo HLA-A3 o un alelo HLA-B27. Se prefiere particularmente el
HLA-A2.

En una forma de realización adicional, las combinaciones de las moléculas HLA pueden también utilizarse. Por ejemplo, una combinación de HLA-A2 y HLA-A3 abarca el 74% de la población caucásica.

La utilización de vacunas de poliepítopo recombinante para la administración de epítopos de CD8 CTL múltiples se describe en Thomson et al. (1996) J. Immunol. 157, 822-826 y el documento WO 96/03144. Dichas vacunas de "bolitas engarzadas" son específicamente vacunas de ADN.

Un método conveniente de activación de CTL (células CD8^{+}) se describe en el documento WO 93/17095. El método del documento WO 93/17095 produce CTL contra los péptidos presentados por moléculas HLA de clase I isogenéticas (es decir autólogas).

Pueden utilizarse otros numerosos métodos para generar CTL in vitro. Por ejemplo, los métodos descritos en Peoples et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 432-436 y Kawakami et al. (1992) J. Immunol. 148, 638-643 utilizan linfocitos autólogos de infiltración en el tumor para la generación de CTL. Plebanski et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25, 1783-1787 hace uso de linfocitos autólogos de la sangre periférica (PLB) para la preparación de CTL. Jochmus et al. (1997) J. Gen. Virol. 78, 1689-1695 describe la producción de CTL autólogos empleando células dendríticas pulsantes con péptido o polipéptido o por infección con virus recombinante.

Hill et al. (1995) J. Exp. Med. 181, 2221-2228 y Jerome et al. (1993) J. Immunol. 151, 1654-1662 hace uso de las células B para la producción de CTL antólogo. Además, para la preparación de CTL autólogos pueden utilizarse macrófagos pulsados con péptido o polipéptido, o infectados con virus recombinante.

Las células isogenéticas pueden utilizarse también para la preparación de CTL y este método está descrito con detalle en el documento WO 97/26328. Por ejemplo, además de las células de Drosophila y de las células T2, pueden utilizarse otras células para presentar antígenos tales como las células CHO, las células de insectos infectados con baculovirus, bacterias, levaduras, células diana infectadas con vacunas. Además pueden utilizarse virus vegetales (véase, por ejemplo, Porta et al. (1994) Virology 202, 449-955 que describe el desarrollo del virus del mosaico de la cowpea como un sistema de alto rendimiento para la presentación de péptido extraños).

Es preferible que las células isogenéticas se utilicen en la preparación de CTL de modo que los CTL estén alo-MHC-restringidos con respecto a los péptidos de la invención. Se prefiere particularmente que los CTL sean de un paciente que responde negativamente a HLA-A0201 y que el péptido sea presentado por una molécula HLA-A0201 de clase I por la célula que presenta el antígeno.

Los péptidos aplicados exógenamente pueden estar ligados a un péptido tat de VIH para dirigirlos a la serie de reacciones de MHC de clase I para la presentación por CTL (véase, por ejemplo, Kim et al. (1997) J. Immunol. 159, 1666-1668).

Los CTL activados que se dirigen contra los péptidos de la invención son útiles en terapia. Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención proporciona CTL activados que pueden obtenerse por los métodos anteriores de la invención que reconocen selectivamente una célula que expresa de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL en la que dichos CTL activados reconocen dicha célula uniéndose a la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

Los CTL son útiles en un método de destrucción de células diana en un paciente cuyas células diana expresan de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL en el que se administra al paciente un número eficaz de CTL activados.

Los CTL que deben administrarse al paciente pueden proceder del paciente y activarse como se describió anteriormente (es decir, son CTL autólogos). Como alternativa, los CTL no proceden del paciente pero son de otro individuo. Desde luego, es preferible que el individuo sea un individuo sano. "Individuo sano" significa que el individuo goza generalmente de buena salud, preferentemente posee un sistema inmunitario competente y, más preferentemente, no padece ninguna enfermedad que pueda probarse y detectarse fácilmente. En esta forma de realización, los CTL proceden de un individuo cuyas moléculas HLA de clase I son incompatibles con las del paciente. Por lo tanto, es preferible que los CTL sean alo-restringidos. El tratamiento con CTL alo-restringidos se describe en la primera solicitud de patente WO 97/26328 del solicitante.

Los CTL activados contienen un receptor de células T (TCR) que está implicado en el reconocimiento de las células que expresan el polipéptido aberrante. Es útil que el ADNc que codifica el TCR esté clonado en el CTL activado y transferido al CTL adicional para su expresión.

Los TCR de los clones de CTL de la invención (ya sean alo-restringidos y auto-restringidos) específicos para los péptidos de la invención están clonados. La utilización de TCR en los clones de CTL se determina utilizando (i) anticuerpos monoclonales específicos de la zona variable de TCR y (ii) PCR a TA con cebadores específicos de las familias de genes V\alpha y V\beta. Se prepara un banco de ADNc a partir de poli-A ARNm extraído de los clones de CTL. Se utilizan cebadores específicos para el fragmento C-terminal de las cadenas \alpha y \beta de TCR y para la porción N-terminal de los segmentos V\alpha y \beta identificados. El ADNc completo para la cadena \alpha y \beta de TCR se amplía con una ADN polimerasa de alta fidelidad y los productos ampliados se clonan en un vector de clonación adecuado. Los genes con cadenas \alpha y \beta clonadas pueden montarse en un TCR de una sola cadena por el método descrito por Chung et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658. En este montaje de una sola cadena el segmento V\alphaJ es seguido por el segmento V\betaDJ, seguido por el segmento C\beta, seguido por la transmembrana y el segmento citoplásmico de la cadena \zeta de CD3. Este TCR de una sola cadena se inserta a continuación en un vector de expresión retrovírico (puede utilizarse un panel de vectores basado en su capacidad para infectar linfocitos T de CD8^{+} humanos maduros y mediar en la expresión génica: el sistema Kat del vector retrovírico es la posibilidad preferida (véase Finer et al. (1994) Blood 83, 43). Se utilizan retrovirus anfótropos de título elevado para infectar linfocitos T de CD8^{+} purificados aislados de la sangre periférica siguiendo un protocolo publicado por Roberts et al. (1994) Blood 84, 2878-2889. Se utilizan anticuerpos anti-CD3 para desencadenar la proliferación de linfocitos T de CD8^{+} purificados, que facilita la integración retrovírica y la expresión estable de los TCR con una sola cadena. La eficacia de la transducción retrovírica se determina por tinción de los linfocitos T de CD8^{+} infectados con anticuerpos específicos de los TCR con una sola cadena. El análisis in vitro de los linfocitos T de CD8^{+} transducidos demuestra que presentan la misma destrucción específica del tumor observada con el clon de CTL alo-restringido del cual se clonaron originalmente las cadenas de TCR. Las poblaciones de linfocitos T de CD8^{+} transducidos con especificidad esperada pueden utilizarse para la inmunoterapia de adopción de los pacientes con tumor. Los pacientes pueden tratarse con CTL transducidos, autólogos entre 10^{8} y 10^{11} (más probablemente 10^{9} y 10^{10}).

Otros sistemas adecuados para introducir los genes en CTL se describen en Moritz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4318-4322, Eshhar et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720-724 y Hwu et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 y también describen la transfección de CTL.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención proporciona un TCR que reconoce una célula que expresa de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL, pudiendo obtenerse el TCR a partir del linfocito T citotóxico (CTL) de la invención, en el que dicho TCR reconoce dicha célula por la unión a la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

Pueden prepararse moléculas operativamente equivalentes a los TCR. Éstas incluyen cualquier molécula que sea operativamente equivalente a un TCR que pueda realizar la misma función que un TCR. En particular, dichas moléculas incluyen los TCR de una sola cadena con tres dominios modificados genéticamente como las preparadas por el método descrito por Chung et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658 y citado anteriormente.

La invención comprende también un polinucleótido que codifica el TCR y un vector de expresión que codifica el TCR. Los vectores de expresión que son adecuados para expresar el TCR de la invención incluyen los descritos anteriormente en relación con la expresión de los péptidos de la invención. Es preferible, sin embargo, que los vectores de expresión sean los que puede expresar el TCR en un CTL después de su transfección.

Además otro aspecto de la invención proporciona la utilización del linfocito T citotóxico según la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en un paciente, en la cual las células cancerosas expresan de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

Además otro aspecto de la invención proporciona la utilización de linfocitos T citotóxicos (CTL) de un paciente que comprende un polinucleótido que codifica el TCR según la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en un paciente, en la cual las células cancerosas expresan de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

Además otro aspecto de la invención proporciona la utilización de células dendríticas de un paciente para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en dicho paciente en la que las células cancerosas expresan de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL, en la que dichas
células dendríticas se han puesto en contacto con el péptido, polinucleótido o vector de expresión según la invención.

Propiamente, las células dendríticas son células dendríticas autólogas que se pulsan con el péptido. La terapia de células T que utiliza células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos procedentes de un antígeno asociado al tumor se dan a conocer en Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380 y Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278.

El polinucleótido es preferentemente capaz de transducir la célula dendrítica produciendo de este modo la presentación de un péptido y la inducción de inmunidad.

En la práctica, el polinucleótido puede estar comprendido en un polinucleótido vírico o en un virus. Por ejemplo, se ha demostrado que las células dendríticas transducidas por adenovirus producen inmunidad antitumoral específica del antígeno en relación con MUC1 (véase Gong et al. (1997) Gene Ther. 4, 1023-1028). Asimismo, pueden utilizarse sistemas basados en adenovirus (véase, por ejemplo, Wan et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); pueden utilizarse sistemas retrovíricos (Specht et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 y Szabolcs et al. (1997) Blood 90, 2160-2167); puede utilizarse también transferencia mediada por partículas a las células dendríticas (Tuting et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707); y puede utilizarse también ARN (Ashley et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1177-1182).

Se prefiere particularmente que los pacientes que son tratados de acuerdo con la invención presenten el haplotipo de HLA-A0201. Por lo tanto, en una forma de realización preferida el haplotipo de HLA del paciente se determina antes del tratamiento. El haplotipado de HLA puede realizarse utilizando un método adecuado; dichos métodos son bien conocidos en la técnica.

A continuación se describe la invención con más detalle haciendo referencia a las Figuras y Ejemplos siguientes en los cuales:

La Figura 1 presenta la actividad destructora de CTL anti-WT126-34. T2 es una línea celular humana con anomalía de carga de péptido que está disponible en la ATCC con el nº de catálogo CRL 1992. Se cargan con el péptido WT126-34 (RMFPNAPYL) (T2 + WT12) o con el péptido de referencia E7 (TLGIVCPI) que es un péptido de unión de HLA-A2 inapropiado (T2 + E7).

K562 es una línea celular leucémica y K562-A2 es la línea celular leucémica de K562 transfectada con HLA-A0201. La relación E:T es la relación de efector:célula diana. La lisis específica (%) se mide en un análisis CTL normalizado tal como el descrito en Sadovnikova & Stauss (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13114-13118.

La Figura 2 presenta la actividad destructora de CTL anti-huWT126-34. Leuk-697, MV441 y BV173 son líneas celulares de leucemia. P12 representa el péptido WT126-34 (RMFPNAPYL).

La Figura 3 presenta la especificidad de CTL alo-restringido generada contra el péptido P126 procedente de WT1. Se aislaron CTL limitando la clonación con dilución de los cultivos en masa de linfocitos T de donantes de HLA-A0201^{-} estimulados con células estimulantes HLA-A0201^{+} recubiertas con péptido P126. (A) líneas de CTL aisladas destruyeron con las células diana T2 deficientes en TAP recubiertas con el péptido P126 inmunizante pero no las células T2 recubiertas con el péptido de referencia E7 que se une a HLA-A0201. (B) Experimentos de valoración de péptidos que demuestran que 3 líneas CTL anti-P126 eran de gran avidez reconociendo la concentración picomolar baja de P126 y 3 líneas de CTL eran de poca avidez ya que se requirió concentración nanomolar de P126 para el reconocimiento de la célula diana. Las células T2 recubiertas con las concentraciones indicadas de P126 se utilizaron como dianas de CTL. Se utilizaron CTL de gran avidez para todos los experimentos ulteriores porque los CTL de gran avidez no reconocían las células diana que expresan a WT1 de forma endógena. (C) los CTL de gran avidez destruyen las líneas celulares leucémicas con HLA-A0201^{+} de BV173, 697 pero no la HLA-A0201^{+}, células C1R-A_{2B} B-linfoides transformadas con EBV. El recubrimiento de C1R-A2 con P126 produjo una destrucción eficaz de CTL. La línea celular K562 de leucemia con HLA-A0201^{-} no se destruye mediante los CTL a menos que se transfecte con el gen HLA-A0201.

La Figura 4 presenta el ARN de WT1 y la expresión proteica en las líneas celulares leucémicas y en poblaciones de células CD34^{+} y CD34^{+} recién aisladas de pacientes con leucemia y donantes normales. (A) PCR a TA para medir ARN de WT1 en líneas celulares leucémicas y en la línea celular C1R-A2 de la línea celular de B-linfoide. Las mismas líneas celulares se utilizaron como dianas de CTL en la Figura 3C. El producto ampliado de WT1 es de 482 bp. El ARN del alojamiento que conserva el gen ABL se amplió para indicar la cantidad de ARN en cada muestra. El producto de ABL es de 385 bp de longitud. (B) PCR a TA para medir la expresión del ARN de WT1 en poblaciones celulares de CD34^{+} y CD34^{-} procedentes de 4 pacientes de CML y 3 donantes normales. La línea celular leucémica BV173 sirvió como referencia positiva para la expresión de WT1. Se obtuvieron resultados similares con muestras procedentes de otros 6 pacientes de CML. (C) Transferencia Western para medir la expresión de la proteína WT1 en líneas celulares de leucemia y en poblaciones celulares de CD34^{+} y CD34^{-} purificadas procedentes de 2 pacientes con CML y de 2 donantes normales. Como indicador para controlar la cantidad de proteína presente en cada muestra se utilizó la expresión del alojamiento que conserva la proteína actina. La proteína WT1 de aproximadamente 54 kDa de tamaño y la proteína actina aproximadamente 42 kDa.

La Figura 5 es un análisis de la destrucción mediada por CTL y de la inhibición de la formación de colonias de poblaciones celulares de CD34^{+} procedentes de pacientes leucémicos y de donantes normales (A) Experimento representativo que presenta el nivel de destrucción por los CTL anti-P126 contra poblaciones celulares purificadas de CD34^{+} y CD34^{-} aisladas de pacientes con CML que eran células HLA-A0201^{+} o A0201^{-}. Las células CD34^{-}/A0201^{+} no fueron reconocidas por los CTL a menos que estuvieran recubiertas con el péptido P126. La línea celular leucémica BV173 y las células T2 deficientes en TAP recubiertas con P126 o el péptido E7 de referencia se utilizaron como referencias positivas y negativas en todos los experimentos. (B) Promedio del nivel de destrucción específica de CTL de células CD34^{+} purificadas procedentes de 11 pacientes diferentes con CML de HLA-A0201^{+} y de 6 donantes normales. El nivel de destrucción de las células CD34^{-} purificadas procedentes de pacientes con CML y contra las células de referencia positivas BV173 se muestra también. La figura presenta el nivel medio y la desviación estándar de destrucción específica de CTL (C) Experimento representativo que presenta el nivel de destrucción por CTL anti-p126 de poblaciones celulares purificadas de CD34^{+} y CD34^{-} aisladas de pacientes normales con HLA-A0201^{+}. No se detectó destrucción alguna de CTL a menos que las células diana estuvieran recubiertas con el péptido P126. (D) Inhibición de la formación de colonias mediada por CTL por las células CD34^{+} purificadas cultivadas durante 4 horas con CTL en una proporción celular efector/diana de 10:1. Se cultivaron células CD34^{+} de referencia no tratadas en las mismas condiciones sin CTL. Las células de referencia tratadas y no tratadas con CTL se colocaron a continuación en placas en metilcelulosa y tras 14 días, se hizo el recuento de CFU-GM. Se muestra el porcentaje de CFU-GM después del tratamiento con CTL utilizando el CFU-GM observado en las referencias no tratadas como 100% de referencia. La figura presenta la media y la desviación estándar de experimentos independientes con células CD34^{+} de 9 pacientes diferentes con CML de HLA-A0201^{+}, 7 donantes normales diferentes y con células CD34^{+} de 5 pacientes diferentes con CML de HLA-A0201^{-}. (E) Formación de colonias por células CML A0201^{+}/CD34^{+} que se trataron o no durante 4 horas con CTL específico de P126 de gran avidez (línea 81) o con CTL de poca avidez (línea 85) antes de la colocación en placas. Se muestran los CFU-GM y BFU-E que utilizan el número de colonias observados en las referencias sin tratar como referencia al 100%. (F) Experimento de competición con diana fría. Se muestra la destrucción por CTL anti-P126 contra las dianas CD34^{+} marcadas con cromo procedentes de un paciente de CML con A0201^{+} en ausencia o presencia de un exceso de 30 veces de BV173 frío y dianas C1R-A2. Para comparación se muestra la destrucción de BV173 marcado con cromo y C1R-A2.

Ejemplo 1 La identificación de HLA-A0201 presentó epítopos de CTL en WT-1

Se analizaron ocho péptidos de WT-1 con motivos de unión HLA-A2 y se observó que dos eran epítopos naturales de CTL.

Se utilizó el siguiente método: i) análisis de péptidos sintéticos en los ensayos de unión de HLA-A0201; iii) utilización de péptidos de unión a HLA-A0201 para estimular las respuestas a CTL de individuos negativos a HLA-A0201; iv) prueba de CTL específicos del péptido contra las células tumorales que expresan WT-1 endógenamente.

Ensayo de unión al péptido: Se incubaron 5 \times 10^{5} células T2 durante la noche (o/n) en placas de 96 pocillos en 100 ml de medio RPMI 1640 con FCS a ebullición al 5% (para destruir las proteasas) y concentraciones variables de péptidos sintéticos. Los pocillos que contenían las células T2 sin péptidos o los péptidos de fijación a A2 conocidos se utilizaron como referencias negativas y positivas, respectivamente. Después de incubación de las células durante la noche se lavaron y se tiñeron por inmunofluorescencia indirecta para HLA-A2 de superficie con anticuerpos HB54 y HB117 monoclonales específicos de A2 (American Type Culture Collection, ATCC). Se realizó análisis FACS en el citómetro de flujo Coulter Corporation (Haiteah, Florida).

Generación de líneas y clones de CTL alo-restringidos: Se utilizaron como agentes de respuesta concentrados en líneas con capa leucocítica negativa HLA-A2. Cada pocillo de una placa de 24 pocillos recibió 2 \times 10^{6} PBMC separado de Ficoll y 2 \times 10^{5} células estimulantes. Se prepararon las células estimulantes por incubación durante la noche de células T2 en péptido 100 \muM en RPMI con FCS a ebullición al 5%. El día 5 se recogieron las células T y se colocaron en medio reciente de células T a una densidad de 5 \times 10^{5} por pocillo en una placa de 24 pocillos con adición de 2 \times 10^{6} PBMC irradiadas autólogas como nutrientes, 2 \times 10^{5} células T2 irradiadas recubiertas de péptido o células C1R-A2, péptido 500 nM y sobrenadante del cultivo QS4120 al 10% para suprimir las excrecencias de las células T de CD4. Se alimentaron los cultivos cada 2 semanas utilizando líneas celulares positivas HLA-A2 recubiertas con el péptido inmunizante como estimulantes. Los cultivos en masa se clonaron en medio de células T a una densidad de 1, 10 y 30 células por pocillo. Se añadieron a cada pocillo 10^{4} células T2 recubiertas con péptido, 2 \times 10^{5} nutrientes negativos a HLA-A2 y 2 U de IL-2. Los CTL obtenidos de los microcultivos se sembraron a razón de una célula por pocillo y además se denominaron clones si el porcentaje de pocillos desarrollando células no excedía del 30%.

Ensayos con CTL: Se incubaron 10^{6} células T2 durante 1 h. en 20 \mul de medio de análisis (RPMI 1640 con FCS inactivado térmicamente al 5%) con péptido sintético 100 \muM a 37ºC. Las células recubiertas y no recubiertas de péptido se marcaron con ^{51}Cr durante 1 hora más, se lavaron y se añadieron a diluciones al doble en serie de células de efector en placas de 96 pocillos con fondo redondo para obtener un volumen total de 200 \mul/pocillo. Se analizó la presencia de 30 células K562 frías en las líneas en masa de CTL por célula diana marcada con ^{51}Cr para reducir la destrucción del fondo producida por las células NK. Para analizar la sensibilidad de las diluciones en serie de péptidos de clones de células T en medio de análisis se realizaron en placas de 96 pocillos. Se añadieron 5 \times 10^{3} linfocitos T2 marcados con ^{51}Cr a cada pocillo para obtener un volumen total de 100 \mul y se incubaron durante 1 h. Se añadieron células de efector en una relación E:T suficiente para la destrucción máxima de CTL. Las placas de ensayo se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% y después de 4 h. se recogieron 100 \mul sobrenadante de cada pocillo y se hizo el recuento utilizando un contador Gamma de Wallac. Se calculó la lisis específica mediante la ecuación (liberación experimental-liberación espontánea)/(liberación máxima-liberación espontánea) \times 100%.

Resultados

En la proteína de WT-1 se identificaron dos epítopos del péptido reconocido por CTL expresados en las células tumorales que expresan WT-1:

WT126-34:RMFPNAPYL

WT235-43:CMTWNQMNL

Éstos son péptidos de 9 aminoácidos de longitud y probablemente son para representar el epítopo mínimo requerido para el reconocimiento eficaz por CTL.

La actividad destructora de CTL contra el WT126-34 se presenta en la tabla siguiente:

Célula diana	Expresión de HLA-A0201	Expresión de WT-1	Destrucción por
			CTL anti-WT126-34
Línea celular de leucemia BV173	sí	sí	sí
Línea celular de leucemia Leuk-697	sí	sí	sí
Línea celular de leucemia MV441	no	sí	no
Línea celular de leucemia K562	no	sí	no
Línea celular de leucemia K562
transfectada con HLA-A0201	sí	sí	sí
Células leucémicas CD34^{+} recién
aisladas de pacientes positivos a
A0201	sí	sí	sí

(Continuación)

Célula diana	Expresión de HLA-A0201	Expresión de WT-1	Destrucción por
			CTL anti-WT126-34
Células leucémicas CD34^{+} recién
aisladas de pacientes negativos a
A0201	no	sí	no
Línea celular MDA-MB231 de
cáncer de mama	sí	sí	sí
Línea celular C1R-A2	sí	no	no
Células transformadas con EBV de
pacientes positivos a A0201	sí	no	no

Los datos de la tabla ilustran que CTL contra el péptido WT126-34 destruye las células tumorales que expresan WT-1 y HLA-A0201. Las células linfoblastoides B negativas a WT-1 no se destruyen. Las figuras 1 y 2 presentan experimentos representativos que ilustran la actividad destructora de CTL anti-WT126-34.

El conjunto de datos obtenido con CTL anti-WT235-43 no es tan extenso como los datos obtenidos con CTL de WT126-34. Es evidente, sin embargo, que CTL anti-WT235-43 destruyen las células tumorales positivas a HLA-A0201 que expresan a WT-1 endógenamente.

Conclusión

Se han identificado epítopos del péptido reconocido por CTL en WT-1. Estos epítopos se presentan en las células tumorales que expresan de manera aberrante estas proteínas. La expresión fisiológica de WT-1 está limitada a un número relativamente pequeño de células normales. Por lo tanto, es posible que los CTL autólogos presenten tolerancia limitada a estas proteínas y que los epítopos de CTL identificados pueden utilizarse para la vacunación contra los tumores con expresión de WT-1 aberrante y en otros métodos inmunoterapéuticos.

Ejemplo 2 Producción de linfocitos citotóxicos (CTL) activados utilizando moléculas de clase I y el antígeno del péptido WT1 RMFPNAPYL y su administración

Los linfocitos T citotóxicos (CTL) activados se producen utilizando moléculas HLA-A2 de clase I y el péptido nonámero de WT1: RMFPNAPYL.

El método descrito en la solicitud de patente PCT WO 93/17095 se utiliza para preparar los CTL. Se utilizan células de Drosophila para presentar el antígeno del péptido a CTL. La molécula HLA-A2 se expresa en las células de Drosophila.

El péptido se sintetiza en un sintetizador de Applied Biosystems, ABI 431A (Foster City, CA, USA) y purificado posteriormente por HPLC.

Como se describe con detalle en el documento WO 93/17095, a fin de optimizar las condiciones in vitro para la generación de células T citotóxicos, el cultivo de células de estimulante se mantiene en un medio apropiado. Las células de estimulante son células de Drosophila tal como se describe en el documento WO 93/17095, que se mantienen preferentemente en medio exento de suero (p. ej., Excell 400).

Antes de la incubación de las células de estimulante con las células que deben activarse, p. ej. las células CD8 precursoras, se añade una cantidad de péptido antigénico al cultivo de células de estimulante, en cantidad suficiente para que llegue a cargarse en las moléculas humanas de clase I que deben expresarse en la superficie de las células de estimulante. Una cantidad suficiente de péptido es una cantidad, aproximadamente 200, y preferentemente 200 o más, que permita que se carguen las moléculas MHC de clase I humanas con el péptido que debe expresarse en la superficie de cada célula de estimulante. Las células de estimulante se incuban específicamente con >20 \mug/ml de
péptido.

Las células CD8 restantes o precursoras se incuban a continuación en cultivo con las células estimulantes apropiadas durante un periodo de tiempo suficiente para activar las células CD8. Las células CD8 serán activadas por lo tanto de manera específica para el antígeno. La relación de las células CD8 (efectoras) restantes o precursoras de las células estimulantes puede variar de un paciente a otro y además puede depender de variables tal como la susceptibilidad de los linfocitos del paciente a las condiciones del cultivo. La relación linfocito:célula estimulante (célula de Drosophila) está comprendida de manera característica en el intervalo entre aproximadamente 30:1 y 300:1. Por ejemplo, 3 \times 10^{7} PBL humano y 1 \times 10^{6} células de Drosophila vivas se mezclan y se mantienen en 20 ml de medio de cultivo RPMI 1640.

El cultivo efector/estimulante se mantiene durante un periodo tan largo como sea necesario para estimular un número terapéuticamente utilizable o eficaz de células CD8. El tiempo óptimo está comprendido específicamente entre aproximadamente uno y cinco días, con una "meseta", es decir un nivel de activación de CD8 específico "máximo", observándose generalmente tras cinco días de cultivo. La activación in vitro de las células CD8 se detecta específicamente dentro de un breve periodo de tiempo tras la transfección de una línea celular. La expresión temporal en una línea celular transfectada capaz de activar las células CD8 es detectable dentro de las 48 horas de la transfección. Esto indica claramente que los cultivos estables o transitorios de las células transformadas que expresan moléculas MHC de clase I humanas son eficaces para la activación de las células CD8.

Las células CD8 activadas pueden separarse eficazmente de las células estimulantes (Drosophila) utilizando anticuerpos monoclonales específicos para las células estimulantes, para los péptidos cargados en las células estimulantes o para las células CD8 (o un segmento de las mismas) para unir su ligando complementario apropiado. Las moléculas marcadas con anticuerpo se extraen a continuación de la mezcla de células estimulantes y efectoras por métodos de inmunoprecipitación o inmunoanálisis.

Las cantidades eficaces y citotóxicas de las células CD8 activadas utilizadas para seres humanos adultos pueden variar entre las utilizaciones in vitro e in vivo, así como con la cantidad y el tipo de células que son el destino último de estas células destructoras, entre aproximadamente 1 \times 10^{6} y 1 \times 10^{12} CTL activados.

Las células CD8 activadas se recogen del cultivo de células de Drosophila antes de la administración de las células CD8 al individuo que se está tratando. Es importante observar, sin embargo, que a diferencia de otras modalidades de tratamiento presentes y propuestas, el método descrito en este Ejemplo utiliza un sistema de cultivo celular (es decir, células de Drosophila) que no son tumorígenas. Por consiguiente, si no se consigue la separación completa de las células de Drosophila y de las células CD8 activadas, no existe peligro inherente conocido que deba asociarse con la administración de un número pequeño de células de Drosophila, mientras que la administración de células activadoras del tumor de mamífero puede ser arriesgado.

Se utilizan métodos de reintroducción de componentes celulares tales como los ejemplificados en la patente U.S. nº 4.844.893 de Honsik et al. y en la patente U.S. nº 4.690.915 de Rosenberg. Por ejemplo, la administración de células CD8 activadas por infusión intravenosa es apropiada.

Ejemplo 3 Células dendríticas pulsadas con el péptido WT1 CMTWNQMNL para el tratamiento del cáncer de mama (descrito solamente a título comparativo)

El carcinoma de mama es potencialmente curable sólo cuando está localizado con certeza. El problema más frecuente es la presentación tardía con metástasis abierta o, más frecuentemente, el desarrollo de metástasis generalizada después de la curación local aparente. El carcinoma de mama metastásico es muy quimiosensible y la quimioterapia eficaz produce rutinariamente la remisión de la enfermedad, permitiendo el retraso del comienzo de la enfermedad secundaria o la mejora de los síntomas de la enfermedad extensiva.

Este tipo de inmunoterapia se basa en la propuesta de que el crecimiento y la diseminación del tumor refleja una insuficiencia de la vigilancia inmunológica, debida a la reducción en la presentación del antígeno por las células neoplásicas o debida a la disminución generalizada de la inmunidad del paciente. Esta es la prueba de que ambos mecanismos tienen lugar en el carcinoma de mama y en particular que existen deficiencias importantes en la función de la célula dendrítica (DC) (Gabrilovich et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3, 483-490). Las respuestas de las células T citotóxicas se demuestran in vitro para los péptidos inmunógenos tal como el péptido WT1 CMTWNQMNL. La DC son células especializadas que procesan y presentan el antígeno que son críticas para el desarrollo de la inmunidad de las células T restringida por MHC primarias. Se originan a partir de un precursor de CD34^{+} en la médula ósea, pero también pueden proceder de un producto intermedio CD14^{+} de la unidad formadora de colonias posterior en la sangre periférica. Las DC migran a las zonas periféricas en la piel, mucosa, bazo y timo. Han sido implicadas en varios procesos clínicamente importantes, que comprenden el rechazo del alotransplante, trastornos atópicos, autoinmunidad e inmunidad antitumoral.

El paciente está tipificado como HLA-A2.

Las DC se cultivan ex vivo a partir de células madre CD34^{+} o monocitos de sangre periférica CD14^{+} utilizando citocinas, principalmente GM-CSF, IL-4 y TNF\alpha. Las DC de ambas procedencias son inmunocompetentes y pueden tomar exógenamente el antígeno presentado, procesarlo y a continuación presentarlo a los linfocitos T citotóxicos (Grabbe et al. (1995) Immunology Today 16, 117-121; Girolomoni & Ricciardi-Castagnoli (1997) Immunology Today 18, 102-104). Estudios recientes han demostrado que las DC pueden transferir la inmunidad tumoral específica del antígeno generada in vivo (Kwak et al. (1995) Lancet 345, 1016-1020) y que las DC autólogas pulsadas con antígeno tumoral ex vivo pueden producir un efecto antitumoral que se puede medir (Hsu et al. (1996) Nature Medicine 2,
52-58). Las DC pueden ser pulsadas eficazmente utilizando un lisado de membrana de tumor en bruto, péptidos purificados o fragmentos de péptido.

WT1 es un polipéptido expresado por los cánceres de mama.

La hemocianina de la lapa californiana (KLH) es una proteína inmunógena que se utiliza como referencia positiva inocua para la inmunocompetencia del paciente en estudios similares a éste (Hsu et al. (1996) Nature Medicine 2,

\hbox{52-58).}

La viabilidad de la utilización de células dendríticas autólogas expandidas ex vivo procedentes de pacientes con carcinoma de mama recurrente, cargadas con una preparación purificada del péptido WT1 CMTWNQMNL y reinfundidas como inmunoterapia adoptiva, se demuestra de la manera siguiente.

El trabajo descrito constituye la metodología óptima para la generación de DC autólogas por expansión ex vivo en la sangre periférica de pacientes con carcinoma de mama recurrente; evalúa la viabilidad de la carga de DC con el péptido WT1 exógeno; examina la tolerancia aguda y la toxicidad de la reinfusión autóloga; examina una respuesta inmunitaria al péptido WT1 o a desarrollos de KLH; y examina el efecto en el conjunto del tumor
mensurable.

La inmunoterapia adoptiva es probablemente la más eficaz para probar en el control o eliminación de la enfermedad residual mínima mejor que en la reducción de la enfermedad en conjunto. Es concebible que la inmunoterapia pueda aumentar temporalmente las dimensiones de la enfermedad en conjunto debido a la afluencia de linfocitos T citotóxicos. La extensión y volumen de la enfermedad se controlará siguiendo la terapia pero no se utiliza como un punto final formal. Se hace el seguimiento de los pacientes de manera rutinaria a largo plazo para asegurar que no se manifiesta ningún caso adverso a largo plazo.

Cultivo de células dendríticas de voluntarios normales

Se adhieren monocitos de sangre periférica CD14^{+} a matraces de cultivo tisular y se cultivan en presencia de suero AB al 1%, GM-CSF (400 ng/ml) e IL-4 (400 UI/ml) durante 7 días. Esto proporciona células con morfología de DC y una media del 49% con el marcador CD1a^{+} que es indicador de la forma inmadura de la DC capaz de coger y presentar el antígeno. Estas células se maduran a continuación en células CD83^{+} mediante la adición de TNF\alpha (15 ng/ml), lo que permite que las DC presenten el antígeno a las células T citotóxicas. El 7% de las células se convierte en CD83^{+} en 1 día, pero por lo menos 3 días son necesarios para un efecto máximo. Es posible que el medio acondicionado con monocitos pueda sustituir el suero AB al 1%.

Cultivo de células dendríticas procedente de pacientes con carcinoma de mama recurrente

Las DC se generan en 6 pacientes con enfermedad metastásica recurrente, tanto antes como después de la quimioterapia de rescate (un total de 12 muestras de sangre periférica, cada una de 50 ml).

Estudio clínico

Los pacientes donan una sola unidad de sangre autóloga según un protocolo normalizado. Un médico del servicio de transfusiones de sangre evalúa a los pacientes antes de la donación. Se identifican los marcadores de virus de rutina (VIH, VBH, VCH y sífilis) en las donaciones autólogas de la misma manera que en las donaciones isogeneicas y los pacientes dan su autorización para esto después de asesoramiento apropiado si desean participar. Esta precaución protege al personal clínico y del laboratorio de la infección potencial y del suministro de sangre rutinario de la posibilidad de contaminación cruzada. La sangre es introducida en la bolsa cuadrada habitual. Esto permite la separación automática de los glóbulos rojos, la capa leucocítica y el plasma. Las capas leucocíticas proporcionan aproximadamente
670 \times 10^{6} leucocitos mononucleares que dan aproximadamente 47 \times 10^{6} DC utilizando las técnicas actuales. Se utiliza un intervalo de dosificación de 8-128 \times 10^{6} DC por paciente. Los monocitos de la sangre periférica se dividen en 2 alícuotas y se pulsan con péptido WT1 y KLH entre los días 1 y 10. Se utilizan las condiciones del cultivo exento de suero o plasma autólogo con preferencia al suero AB isogénico. Las DC cultivadas se agrupan, se lavan y se vuelven a poner en suspensión en 100 ml de solución salina antes de la infusión durante 1 hora. El concentrado de glóbulos rojos autólogo no se retorna al paciente excepto para una indicación clínica normal. Los métodos del cultivo de DC ex vivo se realizan siguiendo buenas prácticas de preparación.

Los pacientes que donaron las muestras de sangre inicial, por esta vez, habrán recibido quimioterapia de rescate y pueden o no estar en remisión clínica. Los demás pacientes con enfermedad metastásica recidiva reciben tratamiento antes de recibir quimioterapia. Existen dos regímenes de tratamiento:

(1) recaída metastásica, terapia normal seguida de inmunoterapia de adopción;

(2) recaída metastásica, inmunoterapia de adopción seguida de terapia normal.

\newpage

Los criterios para incluir los pacientes en el tratamiento son:

: Pacientes con recaída localizada o carcinoma de mama metastásico.

: Tratamiento previo con quimioterapia citotóxica o terapia hormonal.

: Enfermedad evaluable (criterios UICC).

: Supervivencia prevista que sea >12 semanas.

: Criterios a cumplir para la donación de sangre autóloga (incluyendo Hgb>120 g/I)

: Autorización por escrito.

: Edad entre 18 años y 70 años.

Los criterios para excluir a los pacientes del tratamiento son:

: Embarazo.

: Metástasis del SNC.

: Metástasis anterior o simultánea.

: Imposibilitado para dar autorización por escrito.

: Autorización rechazada.

: Edad <18 años o >70 años.

La infusión del producto se realiza bajo la supervisión directa de un médico experimentado en una sala de una unidad ambulatoria donde si se requiere están disponibles instalaciones de cuidados de reanimación y de apoyo.

Ejemplo 4 Eliminación selectiva de células precursoras CD34^{+} leucémicas por linfocitos T citotóxicos específicos para WT1

Se caracterizan neoplasias malignas hematológicas, tal como la leucemia mieloide aguda y crónica, mediante la transformación maligna de células precursoras CD34^{+} inmaduras. La transformación está asociada a la expresión elevada del factor de transcripción WT1. En este punto se demuestra que WT1 puede servir como diana para CTL con especificidad exquisita para las células leucémicas precursoras. Los CTL restringidos para HLA-A0201 específicos para WT1 destruyen las líneas celulares de leucemia e inhiben la formación de colonias por las células precursoras de CD34^{+} transformadas aisladas de pacientes de CML, mientras que la formación de colonias por las células precursoras de CD34^{+} normales está inafectada.

Por lo tanto, el factor de transcripción WT1 específico del tejido es una diana ideal para el purgado mediado por CTL de las células leucémicas precursoras in vitro y para la terapia específica del antígeno de leucemia y otros cánceres que expresan WT1 in vivo.

Las células del sistema hematopoyético proceden de las células madre (HSC) capaces de autorrenovación y diferenciación. Los experimentos de trasplante en seres humanos y en ratones han demostrado que las poblaciones de células CD34^{+} contienen HSC capaz de reconstruir las estirpes eritroide, mieloide y linfoide en receptores de quimioterapia mielosupresora^{1}. Además, las HSC capaces de reconstituir los anfitriones murinos se demostraron recientemente en una población rara de células de médula ósea CD34^{-}/lin^{-2}.

Existen pruebas fehacientes de que los casos de transformación crítica en CML y AML afectan las células precursoras CD34^{+} inmaduras. Como la mayoría de los blastocitos leucémicos presentan capacidad proliferante limitada, la enfermedad maligna debe ser mantenida por una subpoblación de células leucémicas precursoras con amplias capacidades proliferantes y de autorrenovación^{3,4}. Los estudios de trasplante con células purificadas procedentes de pacientes de AML demuestran que únicamente las células CD34^{+} fueron capaces de iniciar la leucemia en receptores murinos inmunodeficientes^{5}. Asimismo, las células CD34^{+} purificadas de pacientes de CML iniciaron eficazmente la leucemia en receptores murinos^{6,7}.

Los escenarios moleculares que conducen a la proliferación incontrolada de células precursoras no se entienden en su totalidad. Aunque las proteínas de fusión BCR/ABL asociadas a la transposición cromosómica t(9;22) es la marca de CML, los transcritos BCR/ABL pueden también encontrarse en individuos sanos lo que indica que se necesitan factores adicionales para desarrollar la leucemia^{8}. El factor de transcripción WT1 es una proteína experimental que contribuye a la leucemogenia. Este factor de transcripción se expresa normalmente en células precursoras CD34^{+} inmaduras y la diferenciación está asociada a la regulación por disminución de WT1^{9,10}. Se han observado niveles elevados de expresión WT1 en células mononucleares no separadas y en células CD34^{+} purificadas procedentes de pacientes de AML y CML^{11,12}. Los estudios in vitro demuestran que el aumento de la expresión de WT1 puede bloquear la diferenciación normal y el aumento de la proliferación de las células precursoras hematopoyéticas proporcionar una explicación para el potencial de WT1 para contribuir a la leucemogenia^{13,14}.

Los resultados de un estudio reciente sugirieron que los linfocitos T específicos de las células precursoras CD34^{+} son críticamente importantes en la mediación de los efectos antileucémicos en pacientes de CML^{15}. En este estudio se explora la posibilidad de aprovechar WT1 como una molécula diana para dirigir los linfocitos T citotóxicos contra las células leucémicas precursoras. Se demostró la hipótesis de que CML, pero no las células precursoras CD34^{+} normales expresan suficiente proteína WT1 para desencadenar el ataque de CTL.

Métodos

Líneas celulares: Se creó la línea celular K562 a partir del derrame pleural de una paciente hembra de CML en crisis por blastocitos^{16}. Se creó la línea celular de BV173 procedente de la sangre periférica de un paciente de CML masculino en crisis por blastocitos^{17}. Se creó la línea celular 697 procedente de la médula ósea de un muchacho de 12 años con leucemia linfoblástica aguda^{18}. La línea celular C1R es una línea celular linfoblastoide transformada por EBV negativa a HLA-A0201^{19}. La línea celular T2 ha sido seleccionada por la pérdida de los genes que codifican TAP (transportador asociado al tratamiento de antígenos), produciendo la carga ineficaz de las moléculas HLA de clase I con péptidos endógenos^{20}. Como consecuencia, las moléculas HLA-A0201 de los linfocitos T2 pueden cargarse eficazmente con péptidos exógenos. Las células de Drosophila transfectadas con HLA-A0201, microglobulina \beta-2 humana, B7.1 e ICAM-1 fueron una donación gentil del Dr. M. Jackson.

Péptidos sintéticos: Un péptido procedente del antígeno 1 P126 (RMFPNAPYL) tumoral de Wilms humano y un péptido de unión a HLA-A0201 de referencia procedente de la proteína E7 de papilomavirus humano tipo 16 fueron sintetizados por el laboratorio central de síntesis de péptidos del Imperial College Medical School, utilizando la química del fluorenilmetoxicarbonilo. Se evaluó la calidad de los péptidos por análisis HPLC y se observó el peso molecular esperado utilizando espectrometría de masas de desorbción por láser asistida por la matriz. Los péptidos se disolvieron en PBS (pH 7,4) para dar una concentración de 2 mM y se almacenaron a -20ºC.

Generación de líneas de CTL alo-HLA-restringidas. Se separaron las PBMC de los concentrados de capas leucocíticas utilizando centrifugación con gradiente de Ficoll y se tiñeron con anticuerpos monoclonales HB54 (anti-HLA-A2, B17) y HB117 (anti-HLA-A2, A28). Se utilizaron PBMC negativos a A2 como materiales de respuesta. Se utilizaron como estimulantes iniciales células de Drosophila recubiertas con péptido transfectado con HLA-A0201, \beta2-microglobulina humana, B7. e ICAM-1. Se produjeron células de Drosophila en CuSO_{4} 100 mM durante 48 horas lavadas tres veces con medio y cargadas con péptido a una concentración de 100 \muM durante 4 horas. Cada pocillo de una placa de 24 pocillos recibió 2 \times 10^{6} PBMC con respuesta y 2 \times 10^{5} células estimulantes en 2 ml de medio de células T. El día 5 se recogieron las células T y se colocaron en placas en medio reciente de linfocitos T a una densidad de 5 \times 10^{5} por pocillo con adición de 2 \times 10^{6} PBMC irradiadas autólogas como nutrientes, 2 \times 10^{5} células T2 recubiertos con péptido irradiado, sobrenadante de cultivo QS4120 al 10% (conteniendo anticuerpos anti-CD4) y 10 U/ml de hu-rIL-2 (Boehringer). Los cultivos se volvieron a estimular semanalmente utilizando células T2 recubiertas con el péptido inmunizante como estimulantes. Después de 2 a 3 ciclos de estimulación los cultivos en conjunto se clonaron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1, 10 y 30 células por pocillo. Se añadieron a cada pocillo 10^{4} células T2 recubiertas con péptido, 2 \times 10^{5} nutrientes PBMC negativos a HLA-A2 y 2 U/ml de IL-2. Se determinó la citotoxicidad de cada pocillo frente a las células T2 diana recubiertas con el péptido inmunizante o un péptido de unión a HLA-A0201 de referencia. Se propagaron los microcultivos específicos de péptidos y se volvieron a estimular semanalmente en placas de 24 pocillos añadiendo 2 \times 10^{6} nutrientes, 2 \times 10^{5} células estimulantes y 10 U/ml de IL-2. La línea 77 de células T (véase la figura 3B) se mantuvo durante 1 año en cultivo y sirvió como fuente de CTL para la mayoría de los experimentos en este estudio. Ya que esta línea estaba constituida por células T CD4^{+} y CD8^{+}, se utilizaron subclones de CD8^{+} para demostrar que la actividad de destrucción específica está medida por CTL de CD8^{+}. A diferencia de la línea 77 precursora, la vida in vitro de los subclones de CD8^{+} estaba limitada a unos pocos meses.

Análisis de CTL: Los análisis de CTL se realizaron como se describe. En resumen, se incubaron 10^{6} células T2 durante 1 h en 200 \mul de medio de análisis (RPMI 1640 con FCS inactivado térmicamente al 5%) con péptido sintético 100 \muM a 37ºC. Las células T2 recubiertas con péptidos o las células tumorales se marcaron con ^{51}Cr durante 1 h, se lavaron y se añadieron a diluciones por duplicado en serie o células efectoras en placas de 96 pocillos de fondo redondo para obtener un volumen total de 200 \mul/pocillo. Las placas de análisis se incubaron durante 4 h a 37ºC, CO_{2} al 5%. Se recogió 100 \mul de sobrenadante y se hizo el recuento utilizando un contador Gamma de Wallac. Se calculó la lisis específica mediante la ecuación (liberación experimental-liberación espontánea)/liberación máxima-liberación espontánea)\times100%.

Purificación de células CD34^{+} hematopoyéticas: Como fuente de células CD34^{+} normales se utilizó la médula ósea humana de donantes adultos sanos (n=5), productos de leucocitaféresis procedentes de células madre movilizadas de pacientes con tumor sólido en remisión de la enfermedad (n=2) y sangre del cordón umbilical (n=1). Las muestras de sangre del cordón umbilical se extrajeron de la placenta desechada y de los tejidos umbilicales mediante drenado de la sangre en tubos esterilizados de recogida. Se obtuvo la autorización por escrito de los donantes o de los padres, según proceda, para la utilización de estas células. Como fuente de células CD34^{+} leucémicas, se extrajo sangre periférica de pacientes de CML en fase crónica y no tratada con interferón desde por lo menos hace tres meses.

Las muestras se diluyeron 1:2 en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y enriquecida para las células mononucleares mediante centrifugación de gradiente de densidad (1,077 g/ml de Lymphoprep, Nycomed, UK) y la fracción mononuclear recuperada se sometió a selección de microbolas magnéticas para el aislamiento de la fracción CD34^{+} utilizando el sistema Minimacs y siguiendo las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, UK). La pureza de la población celular osciló entre el 80 y el 95% estimado por análisis FACS utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón de ficoeritrina (PE) de CD34 anti-humano (Becton Dickinson).

Extracción de ARN y PCR a TA. Se aisló el ARN total de 10^{6} células según el protocolo B para ARNzolTM (AMS Bio, UK). Se realizó la síntesis del ADNc del sedimento del ARN total en 40 \mul de reacción. El sedimento de ARN disuelto se incubó en primer lugar con 2 \mug de oligo-dT 12-18 cebador (Life Technologies, Escocia) a 65ºC durante 10 min., seguido de 1 h. de incubación a 42ºC con una mezcla de 50 U de transcriptasa inversa del virus de leucemia murina (MuLV), ditiotreitol 10 mM, dNTP 1 mM (Boehringer Mannheim, UK), 40 U de inhibidor de RNasa (Promega, UK). Se utilizaron cinco \mul de preparación de ADNc para la ampliación por PCR en un volumen de 50 \mul de mezcla de reacción final que contenía 2,5 U de Taq ADN polimerasa (Qiagen, UK), dNTP 1 mM, 20 OD/ml de cebador. La ampliación de la zona de codificación de WT1 humano se consiguió utilizando cebadores de cadena transcrita situados en el exón 7 (21-mero 5'-ggc atc tga gac cag tga gaa -3') y cebadores de cadena complementaria en el exón 10 (22-mero 5'- gag agt cag act tga aag cag t-3'). El tamaño esperado para el producto de PCR WT1 es de 482 bp. Se verificó la integridad del ARN mediante la ampliación del gen c-abl humano en cada muestra utilizando cebadores que se extienden sobre el intrón: 22-mero de cadena transcrita 5'- ccc aac ctt ttc gtt gca ctg t-3': 22-mero de cadena complementaria 5'- cgg ctc tcg gag gag acg atg a-3'. El tamaño esperado del producto de PCR c-ABL es de 385 bp. Se realizó la PCR con comienzo caliente durante 35 ciclos con un ciclador térmico (Techne Genios, Cambridge) en las siguientes condiciones (las mismas para la ampliación de ABL y WT1): desnaturalización a 95ºC durante 1 min., hibridación del cebador a 56ºC durante 1 min. y alargamiento de la cadena a 72ºC durante 1 min. La ciclación se inició mediante una etapa de desnaturalización de 5 min. a 95ºC para inactivar térmicamente la transcriptasa inversa y se terminó mediante una ampliación final de 10 min. a 72ºC. Todas las PCR a RT se realizaron por lo menos dos veces y se incluyeron en cada experimento la referencia negativa (sin ADNc) y la referencia positiva (ADNc de la línea celular BV173 que expresa a WT1). Se realizó la electroforesis de los productos de PCR a través de geles de agarosa al 1,5%.

Análisis de transferencia Western: Se lavaron células CD34^{+} (2 \times 10^{5} células) separadas en PBS y se lisaron en tampón Laemmli. El lisado celular se fraccionó mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de SDS al 12% y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Amersham, UK) mediante transferencia en húmedo. La membrana se bloqueó a continuación en PBS que contenía Tween 20 al 0,01% y leche en polvo desnatada al 5% durante 1 h. a temperatura ambiente y se incubó en primer lugar con anticuerpo policlonal C19 de WT-1 antihumano de conejo (Santa Cruz CA, 1:200 en bloqueante) durante la noche a 4ºC y a continuación con suero policlonal de antiactina de conejo (Sigma UK, 1:500 en bloqueante) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se reveló la señal incubando la membrana con anticuerpo anticonejo porcino conjugado con peroxidasa de rábano picante (DAKO UK, 1:1000) y reacción de ECL (Amersham UK) según las instrucciones del fabricante.

Análisis del precursor (análisis CFU): Se realizaron análisis por CFU colocando en placas 1.000 a 3.000 células CD34^{+} en medio de metilcelulosa enriquecido con los siguientes factores de crecimiento humano recombinantes (Stem Cell Technologies): factor de célula madre (50 ng/ml de SCF), interleucina-3 (20 ng/ml de IL-3), interleucina-6 (20 ng/ml de IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (20 ng/ml de GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). Los cultivos se incubaron durante 14 días a 37ºC en atmósfera humidificada en CO_{2} al 5% para permitir el desarrollo de unidades de granulocito macrófago formadoras de colonias (CFU-GM).

Resultados

Generación de CTL específicos de WT-1: La expresión del factor de transcripción de WT1 en adultos es detectable en los podocitos renales, células testiculares de Sertoli, células granulosas del ovario y células CD34^{+} de la médula ósea^{21}. Para evitar la tolerancia inmunológica posible a WT1 se utilizó un método descrito anteriormente de generación de CTL específico para el péptido procedente de donantes incompatibles a MHC. Este método es adecuado para la generación de CTL contra cualquier proteína sobreexpresada en células tumorales, independiente de la tolerancia inmunológica^{22,23}. Se seleccionó como diana de CTL un epítopo P126 del péptido (RMFPNAPYL) procedente de WT1 de 9 aminoácidos de longitud. Este péptido se une a las moléculas HLA-A0201 de clase I (véase el Ejemplo 1), el alelo de clase I más frecuente hallado en individuos caucásicos. Se cultivaron in vitro linfocitos que responden procedentes de donantes de HLA-A0201^{-} con células estimulantes de HLA-A0201^{+} que presentan el péptido P126, y se utilizaron cultivos de dilución limitativos para aislar las líneas CTL específicas para el péptido. Los experimentos con células T diana recubiertas con péptidos demostraron que los CTL eran muy específicos para el péptido P126 (Figura 3A). La valoración del péptido indicó que los CTL podrían dividirse en líneas de gran avidez capaces de reconocer concentraciones bajas picomolares de péptidos y en líneas de poca avidez de reconocer concentraciones bajas nanomolares de péptidos (Figura 3B). Se seleccionaron líneas de CTL de gran avidez para experimentos adicionales.

Líneas celulares de leucemia destructoras de CTL específicas para WT1: El análisis de un panel de líneas celulares de leucemia puso de manifiesto que los CTL específicos para P126 destruían las células BV173 y 697 de HLA-A0201^{+} (Figura 3C). La línea celular K562 de leucemia HLA-A0201^{-} se destruyó solamente después de la transfección con HLA-A0201. En cambio, la línea celular C1R-A2 B transformada por EBV de HLA-A0201^{+} no se destruyó, a no ser que las células estuvieran recubiertas con péptidos P126 (Figura 3C; resultados similares se observaron con otras células transformadas por EBV). La expresión de WT1 en las células diana CTL se analizó en el contexto del ARN y de las proteínas. Se demostró por PCR a TA que las líneas celulares de leucemia, pero no las células C1R-A2 transformadas por EBV, expresaban el ARN de WT1 (Figura 4A). Resultados similares se obtuvieron mediante la transferencia Western demostrando que la proteína WT1 se expresaba solamente en las células de leucemia pero no en C1R-A2 (Fig. 4C). A la vez, los datos indicaron que los CTL reconocían las líneas celulares de leucemia de A0201^{+} y que la destrucción de los CTL se correlacionaba con la expresión de WT1.

Los CTL específicos para WT1 destruyen las células CD34^{+} leucémicas recientes: Se separaron células mononucleares procedentes de la sangre periférica de pacientes de CML en fase crónica en poblaciones de CD34^{+} inmadura y CD34^{-} madura. Como era de esperar, las células aisladas de pacientes con HLA-A0201^{-} no fueron reconocidas por los CTL específicos para P126 (Figura 5A). Cuando se analizaron las células procedentes de pacientes de CML con HLA-A0201^{+}, los CTL reconocieron de manera selectiva la población de células CD34^{+} mientras que no se observó la destrucción de la población CD34^{-} más madura (Figura 5A). La falta de destrucción de las células CD34^{-} fue debido muy probablemente a la insuficiente expresión del péptido diana derivado de WT1, ya que el recubrimiento de estas células con el péptido P126 exógeno produjo la destrucción de CTL (Figura 5A). El análisis por PCR a TA puso de manifiesto la fuerte expresión del ARN de WT1 en las células CD34^{+} y la baja expresión en las células CD34^{-} (Figura 4B). La expresión de la proteína WT1 detectable por transferencia Western estaba restringida a CD34^{+} y ninguna proteína fue detectable en las células CD34^{-} (Figura 4C). Ambos análisis por PCR a TA y transferencia Western demostraron variación en el nivel de la expresión de WT1 en las poblaciones de células CD34^{+} leucémicas. Por lo tanto, se exploró si la variación observada en el nivel de expresión de WT1 producía una variación en el nivel de destrucción de CTL. Sin embargo, el análisis de 11 pacientes de CML diferentes demostró que los CTL se lisaban continuamente aproximadamente el 20% (5% de SD) de la población de CD34^{+} (Figura 5B). Estos resultados plantean la posibilidad de que la expresión de WT1 esté restringida a una subpoblación de aproximadamente el 20% de las células CD34^{+} y que el nivel de expresión en los 11 pacientes de CML era suficiente para volver sensible a la mayoría de estas células a la destrucción por CTL. Por lo tanto, se exploró si la subpoblación reconocida por los CTL incluía las células precursoras clonógenas que pueden dar lugar a las colonias de la estirpe granulocito/macrófago. De hecho, cuando las poblaciones CD34^{+} aisladas de los 9 pacientes con CML se trataron con CTL específicos para P126 esto produjo el 80 al 100% de inhibición de la formación de colonias (Figura 5D). Esto indicaba que la mayoría de las células precursoras formadoras de colonia eran eliminadas por los CTL específicos para P126. Las colonias "fugitivas" observadas en las muestras tratadas con CTL fueron pequeñas en comparación con las colonias en las muestras sin tratar. Esto es coherente con la posibilidad de que las colonias "fugitivas" procedían de las células precursoras que habían iniciado ya la diferenciación hacia la estirpe granulocito/mieloide que está asociada con la regulación por disminución de la expresión de WT1. Dichos precursores parcialmente diferenciados pueden escapar del reconocimiento por los CTL específicos para WT1 y el pequeño tamaño de las colonias observadas en el análisis por CFU puede reflejar el tamaño reducido de la serie clonal de estos precursores.

Es importante que la formación de las colonias por las células CD34^{+} procedentes de pacientes de CML con HLA-A0201^{-} no se afectó, lo que indica que la eliminación de los precursores con la actividad formadora de colonias era independiente del reconocimiento del antígeno restringido por HLA por los CTL.

Por último, se exploró si los CTL discriminaban entre las células precursoras de CD34^{+} leucémicas y normales. Las células CD34^{+} normales se aislaron de la médula ósea, de la sangre periférica o de la sangre del cordón umbilical de donantes con HLA-A0201^{+} y se utilizó como dianas de CTL. Independientemente de la fuente de células CD34^{+}, los CTL anti-P126 no inhibían la formación de colonias por estas células (Figura 5D). Además, las células CD34^{+} normales no se destruyeron cuando se utilizaron como dianas en análisis de citotoxicidad (Figuras 5B y C). La destrucción de CTL selectiva de células CD34^{+} leucémicas frente a normales puede explicarse mediante las diferencias en la expresión de WT1. La expresión de ARN de WT1 fue mayor en las células CD34^{+} leucémicas comparada con las normales (Figura 4B) y el análisis por transferencia Western detectó la proteína WT1 solamente en las poblaciones de células CD34^{+} leucémicas pero no en las normales (Figura 4C).

La infusión de linfocitos donantes (DLI) a pacientes en recaída después del trasplante de células madre alogeneicas anterior puede engendrar fuertes efectos de trasplante contra leucemia (GVL)^{24,25}. Un estudio reciente demostró que la remisión completa en los pacientes de CML que experimentan DLI estaba asociado a un aumento de frecuencia de las células T que reconocen las células precursoras CD34^{+} leucémicas^{15}. En cambio, el reconocimiento por células T de las células CD34^{-} más maduras en pacientes de CML no estaba asociado con la respuesta clínica favorable. Esto sugirió que los linfocitos T con especificidad para las células precursoras de CML de CD34^{+} eran críticamente importantes en la mediación de los efectos antileucémicos in vivo. Sin embargo, no existe actualmente ninguna información referente a la naturaleza de antígenos diana que puedan dirigir las respuestas de células T selectivamente contra las células precursoras CD34^{+} leucémicas.

A fin de identificar dichos antígenos se utilizó el método de CTL alo-restringido que, independientemente de la tolerancia inmunológica, es adecuado para producir CTL contra cualquier proteína que se exprese en concentraciones elevadas en las células transformadas^{22,23,26}. Dado que la activación de la función del efector citotóxico es un fenómeno umbral, es posible seleccionar los CTL que se activan únicamente por niveles elevados de proteína diana en las células transformadas pero no mediante niveles fisiológicos de proteína en células normales^{23}.

Existen pruebas de la sobreexpresión de WT1 en las células CD34^{+} leucémicas^{12}. La expresión elevada del WT1 puede contribuir a la transformación^{13,14}. La expresión normal de WT1 está restringida a un número pequeño de células en la vida postnatal^{21}. Además de en la leucemia, la expresión elevada de WT1 se ha observado también en el carcinoma de las células renales, cáncer de ovario, cáncer de mama avanzado y en el melanoma^{27-30}. Por consiguiente, los CTL que reconocen de manera selectiva las células malignas que sobreexpresan WT1 son reactivos inestimables para la terapia específica del antígeno de la leucemia así como otras enfermedades malignas más frecuentes. Además, la fuga tumoral por regulación por disminución de la expresión de WT1 es probable que ocurra si se necesita la sobreexpresión para mantener el fenotipo transformado^{31-33}.

Los CTL alo-restringidos descritos en la presente memoria fueron aislados de donantes de HLA-A0201^{-} y eran específicos de las células precursoras leucémicas que presentan el péptido P126 derivado de WT1 en el contexto de las moléculas HLA-A0201 de clase I. El péptido P126 es muy inmunógeno ya que la estimulación in vitro de los linfocitos de diferentes donantes de HLA-A0201^{-} produjo constantemente CTL restringidos por HLA-A0201, específicos para el péptido. Por consiguiente, los CTL específicos para P126 son reactivos nuevos para la terapia específica para el antígeno de los pacientes de leucemia con HLA-A0201^{+} que se someten a trasplante de células madre procedentes de donantes que presentan un locus incompatible con HLA que implica el alelo HLA-A0201. Un locus HLA incompatible es clínicamente aceptable como se demostró en un estudio reciente que presenta el pronóstico comparable en los pacientes de leucemia que reciben trasplantes de un locus incompatible y donantes no relacionados de HLA compatible^{34}. Por lo tanto, un trasplante de un locus incompatible proporciona un marco ideal para la terapia específica para el antígeno con CTL alo-restringidos procedentes del donante. El protocolo de estimulación in vitro descrito en la presente memoria en combinación con la selección de CTL apropiados mediante tinción con tetrámeros de HLA-A0201 que contienen péptidos P126 permitirá el aislamiento rápido de los CTL específicos para P126 para la terapia de adopción.

Además, es posible que WT1 pueda aprovecharse para la terapia específica para el antígeno en el marco autólogo. Esto está apoyado por la observación de que los CTL específicos para P126 pueden aislarse de donantes de HLA-A0201^{+}. Como la expresión de WT1 en los adultos está restringida a un número de células relativamente pequeño (p. ej. las células CD34^{+} de la médula ósea, podocitos renales, células testiculares de Sertoli y células granulosas del ovario) la tolerancia de los linfocitos T autólogos a WT1 es probablemente incompleta. Por consiguiente, puede ser posible aprovechar el epítopo P126 identificado para el diseño de preparaciones de vacuna anti-WT1 orientadas a estimular las respuestas de CTL contra la leucemia y otras enfermedades malignas con expresión elevada de WT1 tal como el carcinoma de las células renales, cáncer de ovario, melanoma y cáncer de mama.

Además de la terapia in vivo, los CTL específicos para WT1 proporcionan una herramienta para el purgado in vitro de las células de médula ósea autólogas recogidas de pacientes de leucemia. Los CTL eliminaron los precursores leucémicos de la estirpe granulocito/macrófago (Figura 5D) y también los precursores de la estirpe eritroide (no mostrada). En cambio, los CTL no reconocieron los precursores normales de las tres estirpes. La eliminación selectiva de las células precursoras CD34^{+} transformadas debería reducir el riesgo de reinfusión de las células precursoras leucémicas, superando de este modo una limitación mayor del trasplante de células madre autólogo^{35}.

Hasta la fecha, los antígenos con histocompatibilidad menor específica del tejido y los antígenos específicos de la estirpe, tal como la proteinasa 3, se han estudiado como dianas potenciales para los CTL reactivos a la leucemia^{36-39}. El factor de transcripción de WT1 es el primer antígeno diana capaz de dirigir las respuestas a CTL selectivamente contra células precursoras leucémicas.

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Claims

1. Péptido con un peso molecular de 5.000 o inferior que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL o que comprende una secuencia de aminoácidos, en la que uno o ambos de los aminoácidos en las posiciones 2 y 9 de la secuencia RMFPNAPYL se sustituyen por otro aminoácido natural, en la que dicha sustitución no anula la unión a HLA-A0201.

2. Péptido según la reivindicación 1, en el que cuando está unido a HLA-A0201 el HLA-A0201 con enlace peptídico es capaz de obtener la producción de un linfocito T citotóxico (CTL) que reconoce una célula que expresa de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos dada.

3. Péptido según la reivindicación 1 ó 2, en el que el péptido incluye enlaces no peptídicos.

4. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, constituido por la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

5. Polinucleótido que codifica el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4.

6. Polinucleótido según la reivindicación 5 que es el ADN.

7. Vector de expresión que codifica el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4.

8. Célula huésped que comprende el polinucleótido según la reivindicación 5 ó 6 o el vector de expresión según la reivindicación 7.

9. Método para la producción de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, comprendiendo el método cultivar la célula huésped según la reivindicación 8 y obtener el péptido de la célula huésped o de su medio de cultivo.

10. Composición farmacéutica que comprende el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el polinucleótido según la reivindicación 5 ó 6, o el vector de expresión según la reivindicación 7 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10, que es una vacuna contra el cáncer.

12. Utilización del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, del polinucleótido según la reivindicación 5 ó 6, o del vector de expresión según la reivindicación 7 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en un paciente en el que las células de cáncer expresan de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

13. Método para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados in vitro, comprendiendo el método poner en contacto in vitro los CTL con las moléculas MHC de clase I humanas cargadas con el antígeno expresadas sobre la superficie de una célula presentadora del antígeno adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar, de manera específica un antígeno, dichos CTL en el que el antígeno es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL o que comprende una secuencia de aminoácidos, en la que uno o ambos aminoácidos en las posiciones 2 y 9 de la secuencia RMFPNAPYL están sustituidos por otro aminoácido natural, en el que dicha sustitución no suprime la unión a HLA-A0201, siempre que el péptido no sea el polipéptido WT-1 humano
intacto.

14. Método según la reivindicación 13, en el que el CTL y la célula presentadora del antígeno son alogenicos con respecto a la molécula MHC que se une al péptido de clase I.

15. Método según la reivindicación 13, en el que el CTL y la célula presentadora del antígeno son singeneicos (auto-restringidos) con respecto a la molécula MHC que se une al péptido de clase I.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que se carga el antígeno sobre las moléculas MHC de clase I expresadas sobre la superficie de una célula presentadora del antígeno adecuada poniendo en contacto una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora del antígeno, en el que antes de poner en contacto las moléculas MHC de clase I de la célula presentadora del antígeno están sustancialmente desocupadas y después del contacto las moléculas MHC de clase I están sustancialmente totalmente ocupadas.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la célula presentadora del antígeno comprende un vector de expresión que codifica un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL o que comprende una secuencia de aminoácidos, en la que uno o ambos aminoácidos en las posiciones 2 y 9 de la secuencia RMFPNAPYL están sustituidos por otro aminoácido natural, en la que dicha sustitución no suprime la unión a HLA-A0201, siempre que el péptido no sea el polipéptido WT-1 humano completo.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que la molécula MHC de clase I es la HLA-A0201.

19. Linfocito T citotóxico (CTL) activado que se puede obtener por el método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18 que reconoce selectivamente un célula que expresa de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL, en la que dicho CTL activado reconoce dicha célula uniéndose a la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

20. Receptor de células T (TCR) que reconoce una célula que expresa de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL, pudiendo obtenerse el TCR a partir del linfocito T citotóxico (CTL) según la reivindicación 19, en el que dicho TCR reconoce dicha célula uniéndose a la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

21. Polinucleótido que codifica un receptor de células T (TCR) según la reivindicación 20.

22. Vector de expresión que codifica un receptor de células T (TCR) según la reivindicación 20.

23. Utilización del linfocito T citotóxico según la reivindicación 19 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en un paciente, en el que las células de cáncer expresan de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

24. Utilización de linfocitos T citotóxicos (CTL) de un paciente que comprende un polinucleótido que codifica el TCR según la reivindicación 20 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en dicho paciente, en el que las células de cáncer expresan de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL.

25. Utilización de células dendríticas de un paciente en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en dicho paciente en la que las células cancerosas expresan de manera aberrante un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL, en la que dichas células dendríticas se han puesto en contacto in vitro con el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, con el polinucleótido según la reivindicación 5 ó 6 o con el vector de expresión según la reivindicación 7.