ES2253211T3 - Prediccion de la cicatrizacion de heridas afectada por la diabetes. - Google Patents
Prediccion de la cicatrizacion de heridas afectada por la diabetes.Info
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Abstract
Método para determinar si un sujeto diabético es un diabético cuyas heridas cicatrizan o un diabético cuyas heridas no cicatrizan, que comprende la etapa de: comparar el nivel de un producto relacionado con óxido nítrico seleccionado del grupo que consiste en nitrato, nitrito, óxido nítrico, L-citrulina, GMPc, peroxinitrito, 3-nitrotirosina y L-dimetilarginina en una muestra del sujeto diabético con un valor umbral que discrimina entre diabéticos cuyas heridas cicatrizan y diabéticos cuyas heridas no cicatrizan, en el que si el nivel del producto relacionado con óxido nítrico está por encima del valor umbral, el sujeto es un diabético cuyas heridas cicatrizan, y si el nivel del producto relacionado con óxido nítrico está aproximadamente en o por debajo del valor umbral, el sujeto es un diabético cuyas heridas no cicatrizan.
Description
Predicción de la cicatrización de heridas
afectada por la diabetes.
La invención se refiere al área de la
cicatrización de heridas en la diabetes. En particular se refiere a
ensayos para determinar el nivel de óxido nítrico en diabéticos
cuyas heridas no cicatrizan.
La diabetes afecta a aproximadamente 15 millones
de personas en los Estados Unidos. Dentro de la población diabética
hay individuos con ulceración crónica de las extremidades inferiores
que no cicatriza, (LEU), que está asociada con una significativa
morbilidad y costes de tratamiento. La LEU crónica, que no
cicatriza, precede a aproximadamente el 85% de las amputaciones de
las extremidades inferiores (LEA) que experimentan anualmente más de
50.000 diabéticos (GE Reiber, EJ Boyko, DG Smith, en Diabetes in
America, publicación de NIH número 95-1468,
Bethesda. Md., cd. 2, 1995, págs. 409 - 428).
Esto representa más de la mitad de todos los
individuos que sufren LEA en este país. Mientras que sólo el 6% de
las hospitalizaciones de diabéticos están asociadas con la LEU, el
reembolso total del gobierno para las complicaciones de las
extremidades inferiores en diabéticos en 1992 superó los 1,5
billones de dólares, sin incluir los costes de amputación de
miembros y rehabilitación. Los factores de riesgo patofisiológicos
clínicos para la LEA incluyen neuropatía diabética, isquemia de las
extremidades inferiores, y úlceras crónicas en el pie diabético que
no cicatri-
zan.
zan.
El problema subyacente en los diabéticos con LEU
es la cicatrización de heridas afectada, que se comprende
escasamente. Mientras que la mayoría de los diabéticos muestra una
cicatrización de las heridas "normal", los que presentan LEU
crónica a menudo demuestran una disminución de la inflamación de la
herida, infecciones de heridas recurrentes, perfusión vascular
cutánea disminuida, escasa deposición de colágeno en las heridas, y
maduración de cicatrices. La deficiencia en el factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF), está asociada con la ulceración
diabética crónica, y contribuye a una cicatrización afectada (HD
Beer. MT Longaker, S Wemer, J Invest Dermatol 109, 132 (1997)). Los
ensayos clínicos que usan Regranex® han mostrado eficacia en mejorar
la cicatrización de la ulceración crónica del pie en sólo la mitad o
menos de los pacientes evaluados (DL Steed, J Vasc Surg, 21, 71
(1995)).
Las investigaciones recientes sobre el papel del
óxido nítrico (NO) en la inflamación de las heridas, reparación de
tejido, y homeostasis microvascular, ha permitido considerar al NO
como un regulador primario de la cicatrización de heridas (D
Bruch-Gerharz, T Ruzicka, V
Kolb-Bachofen. J Invest Dermatol. 110, 1 (1998); MR
Schaffer et al., Surgery 121, 513 (1997)). Se ha observado
una deficiencia sistémica del NO derivado del endotelio en todos
los diabéticos (A Veves et al., Diabetes, 47, 457 (1998); M
Huszka et al., Thrombosis Res, 86(2), 173 (1997); SB
Williams. JA Cusco, MA Roddy, MT Hohnston, MA Creager, J. Am. Col.
Cardiol., 27(3), 567 (1996)), lo que sugiere que el NO
desempeña un papel fundamental en la patogenia de LEU crónica que no
cicatriza. Consecuentemente, existe una necesidad de correlacionar
la producción de NO con la capacidad para cicatrizar heridas en los
diabéticos. Tal correlación podría permitir el desarrollo de métodos
para predecir la capacidad para cicatrizar heridas de los
diabéticos basados en su producción de NO y podría proporcionar un
indicador clínico útil que podría servir como base para elegir un
tratamiento adecuado.
Es un objeto de la invención proporcionar un
método para determinar si un sujeto diabético es un diabético cuyas
heridas cicatrizan o un diabético cuyas heridas no cicatrizan. El
método comprende las etapas de: comparar el nivel de un producto
relacionado con óxido nítrico seleccionado del grupo que consiste en
nitrato, nitrito, óxido nítrico, L-citrulina, GMPc,
peroxinitrito, 3-nitrotirosina, y
L-dimetilarginina en una muestra del sujeto
diabético con un valor umbral que discrimina entre diabéticos cuyas
heridas cicatrizan y diabéticos cuyas heridas no cicatrizan. Si el
nivel del producto relacionado con óxido nítrico está por encima del
valor umbral, entonces el sujeto es un diabético cuyas heridas
cicatrizan. Si el nivel del producto relacionado con óxido nítrico
está aproximadamente en o por debajo del valor umbral, entonces el
sujeto es un diabético cuyas heridas no cicatrizan.
La invención también se refiere a un método para
tratar a un sujeto diabético. El método comprende las etapas de:
(a) recoger una muestra del sujeto; (b) determinar el nivel de un
producto relacionado con óxido nítrico en la muestra; y (c)
comparar el nivel del producto relacionado con óxido nítrico en la
muestra con un valor umbral que discrimina entre diabéticos cuyas
heridas cicatrizan y diabéticos cuyas heridas no cicatrizan; y (d)
tratar al sujeto según si el sujeto es un diabético cuyas heridas
cicatrizan o un diabético cuyas heridas no cicatrizan.
La invención también se refiere a un método para
monitorizar la eficacia del tratamiento en un paciente diabético
cuyas heridas no cicatrizan. El método comprende las etapas de: (a)
administrar al paciente un agente terapéutico diseñado para elevar
el nivel de óxido nítrico en el paciente; (b) recoger una muestra
del sujeto; (c) determinar el nivel de un producto relacionado con
óxido nítrico seleccionado del grupo que consiste en nitrato,
nitrito, óxido nítrico, L-citrulina, GMPc,
peroxinitrito, 3-nitrotirosina, y
L-dimetilarginina en la muestra como una medida de
la eficacia del tratamiento. Estos y otros objetos de la invención
se proporcionan mediante una o más de las realizaciones descritas
más adelante.
La figura 1 presenta una representación
esquemática del papel del óxido nítrico (NO) en la regulación de la
reparación de heridas. La "señalización celular" mediada por NO
en las heridas parece que potencia la mediación inflamatoria de la
reparación, la disponibilidad de oxígeno en las heridas, y la
remodelación y maduración de la matriz en las heridas.
La figura 2 es una representación gráfica de los
niveles de nitrato en orina en ayunas (micromoles por litro) para
los controles (C), los diabéticos cicatrizados (HD), y los
diabéticos no cicatrizados (UHD) en los días 1 y 2 del estudio.
Los resultados se muestran como la media \pm
E.E., con valores P como los comparados con C (Pc) y HD (PHD) para
cada día.
La figura 3 es una representación gráfica de los
niveles de nitrato en plasma en ayunas (micromoles por litro) para
los controles (C), los diabéticos que han cicatrizado (HD), y los
diabéticos que no han cicatrizado (UHD) en los días 1 y 2 del
estudio. Los resultados se muestran como la media \pm E.E., con
valores P como los comparados con C para cada día excepto
\ddagger, que compara HD y UHD sólo para el día 2.
Los métodos de la invención están diseñados para
detectar, tratar, y monitorizar a pacientes diabéticos con una
escasa capacidad para cicatrizar heridas basados en la medida de los
productos de degradación de NO en muestras tomadas del paciente en
condiciones controladas. La invención supone que los pacientes
diabéticos representan un espectro continuo de capacidad sintética
de NO y que los diabéticos en el extremo más bajo de ese espectro
tienen la función de cicatrización de heridas afectada. El NO se
metaboliza normalmente en los productos estables nitrato y nitrito,
que pueden someterse a ensayo en orina, plasma, tejido u otras
muestras de pacientes diabéticos. El nivel de nitrato o nitrito en
una muestra puede servir como un indicador del nivel de síntesis de
NO en un paciente. Los hallazgos del inventor indican que por debajo
del nivel umbral de NO en el paciente diabético, no se consigue una
reparación de heridas normal, lo que da como resultado LEU.
El NO es un radical libre gaseoso hidrófobo,
pequeño que es un mediador fisiológico importante para funciones
autónomas tales como la vasodilatación, neurotransmisión, y
peristalsis intestinal. El NO proporciona señalización celular
mediante la activación de su molécula diana, la guanilato ciclasa,
que eleva las concentraciones intracelulares de monofosfato de
guanosina cíclico (GMPc) (JS Beckman, en Nitric Oxide, J. Lancaster,
Jr., Ed. (Academic Press, N.Y.), cap. 1). La señalización celular se
realiza sin la mediación de canales o receptores de membrana
celulares y es dependiente de la concentración de NO en el entorno
celular.
El NO tiene una semivida de aproximadamente cinco
segundos en tejidos biológicos. Se genera mediante tres isoformas
de la óxido nítrico sintasa (NOS), que metaboliza la
L-arginina y el oxígeno molecular en citrulina y
NO. Dos de las tres isoformas son sistemas de enzimas constitutivas
(NOSc) que están descritos en células neuronales (NOSn) y en
células endoteliales (NOSc) (D Bruch-Gerharz. T
Ruzicka, V Kolb-Bachofen. J Invest Dermatol. 110, 1
(1998)). Con estas isoformas, los niveles elevados de calcio
intracelular activan las enzimas a través de la calmodulina. Los
sistemas NOSc dependientes de calcio producen bajas concentraciones
(picomolar) de NO. El tercer sistema es la isoforma inducible
(NOSi) que es independiente de calcio. La expresión de NOSi se
induce mediante estímulos específicos de tejido tales como citocinas
inflamatorias o lipopolisacáridos (LPS) bacterianos. La isoforma
inducible libera NO en concentraciones mucho mayores (nanomolar) que
la NOSc y tiene potentes efectos cito-
tóxicos.
tóxicos.
Actualmente, parece que las enzimas NOSc están
implicadas en la regulación y el mantenimiento de la homeostasis de
la piel (S Moncada, A Higgs, N Eng J Med 329, 2002 (1993)). Las
enzimas NOSi parecen que están asociadas principalmente con
respuestas inflamatorias e inmunitarias que también están implicadas
en ciertas enfermedades de la piel. En los queratinocitos de piel
humana, los fibroblastos y las células endoteliales tienen tanto
las isoformas NOSc como las isoformas NOSi. El queratinocito y el
macrófago en heridas tienen la isoforma NOSi. En estudios de
cicatrización de heridas, se ha mostrado que la síntesis de NO se
produce durante periodos prolongados (10 - 14 días) después de que
se produzca la herida y parece que los macrófagos son la principal
fuente celular (MR Schaffer, U Tantry, RA vanWesep, A Barbul. J Surg
Res, 71. 25 (1997)). Como mediador de la reparación de tejidos, NO
ha demostrado que promueve la angiogénesis (A Papapetropoulos, G
Garcia-Cardena, JAA Madri, WC Sissa. J Clin Invest,
100 (12), 3131 (1997)) y la migración celular (E Noiri et
al., Am. J. Physiol. 279:C794 (1996)), aumenta la deposición de
colágeno en heridas y reticulación del colágeno (MR Schaffer, U
Tantry, SS Gross, HL Wasserburg, A Barbul. J Surg Res, 63, 237
(1996)), regula la homeostasis microvascular (vasodilatación) (D
Bruch-Gerharz, T Ruzicka, V
Kolb-Bachofen. J Invest Dermatol. 110, 1 (1998)),
inhibe la agregación plaquetaria (JS Beckman, en Nitric Oxide, J.
Lancaster, Jr., Ed. (Academic Press, N.Y.), cap. 1), inhibe la
formación de adhesiones leucocito-endotelio (AM
Lefer, DJ Lefer, Cardiovascular Res. 32, 743 (1996)), modula la
proliferación endotelial y la apoptosis (YH Shen, XL Wang, DE
Wilcken, FEBS Lett, 433(1-2), 125 (1998)),
aumenta la viabilidad de colgajos cutáneos aleatorios (SC Um et
al., Plast Reconstr Surg. 101 785 (1998); GF Pierce et
al., Proc Natl Acad Sci USA. 86, 2229 (1989)), y potencia la
inmunomodulación celular y la citotoxicidad bacteriana (JS Beckman,
en Nitric Oxide, J. Lancaster. Jr., Ed. (Academic Press, N.Y.), cap.
1).
En diabéticos, la reparación de heridas normal
puede verse comprometida significativamente. En general, durante el
proceso de cicatrización de heridas, el NO proporciona la
potenciación de la disponibilidad de oxígeno tisular, la mediación
inflamatoria de los mecanismos de reparación y el desarrollo y la
remodelación de la matriz en heridas (figura 1). La ruta metabólica
principal para el NO es para dar nitrato y nitrito, que son
metabolitos estables en tejido, plasma y orina (S Moncada, A Higgs,
N Eng J Med 329, 2002 (1993)). Estudios con indicadores en seres
humanos han demostrado que quizás el 50% del nitrato/nitrito
corporal total se origina a partir del sustrato para la síntesis de
NO, L-arginina (PM Rhodes, AM Leone, PL Francis, AD
Struthers, S Moncada, Biomed Biophys Res. Commun. 209, 590 (1995);
L. Castillo et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 193 (1993).
Aunque el nitrato y el nitrito no son medidas del NO biológicamente
activo, las muestras de plasma y orina obtenidas de sujetos tras un
periodo adecuado en ayunas, y opcionalmente tras la administración
de una dieta controlada (baja en nitrato/baja en arginina), permiten
el uso del nitrato y el nitrito como un índice de la actividad de NO
(C Baylis, P Vallance, Curr Opin Nephrol Hypertens 7, 59
(1998)).
La invención proporciona un método para
determinar si un sujeto diabético es un diabético cuyas heridas
cicatrizan o un diabético cuyas heridas no cicatrizan. Un
"diabético cuyas heridas cicatrizan" se refiere a un sujeto
diabético cuya capacidad para cicatrizar heridas es aproximadamente
la misma que la de un sujeto no diabético. Un "diabético cuyas
heridas no cicatrizan" se refiere a un sujeto diabético cuya
capacidad para cicatrizar heridas es inferior que la de un sujeto
no diabético y que se encuentra consecuentemente en riesgo de
contraer LEU. Por ejemplo, en un estudio clínico, se consideró que
los diabéticos cuyas heridas no cicatrizan eran los pacientes con
una historia de una o más úlceras de pie diabético con cicatrización
incompleta después de 20 semanas de tratamiento con Regranex® (véase
ejemplo 1). Un sujeto según la invención puede ser cualquier ser
humano o animal con un estado diabético tal como la diabetes
mellitus. Un ser humano o animal con un estado diabético es un ser
humano o animal cuya regulación de la concentración de glucosa en
plasma es defectuosa, normalmente como resultado de una producción
insuficiente de insulina o resistencia a los efectos fisiológicos
de la insulina. Por ejemplo el sujeto puede ser un paciente humano
al que un médico le diagnostica una diabetes tipo I o tipo II.
Un método para determinar si un sujeto diabético
es un diabético cuyas heridas cicatrizan o un diabético cuyas
heridas no cicatrizan comprende las etapas de determinar el nivel de
nitrato o nitrito en una muestra procedente del sujeto diabético, y
comparar el nivel de nitrato o nitrito en la muestra con un valor
umbral que discrimina entre diabéticos cuyas heridas cicatrizan y
diabéticos cuyas heridas no cicatrizan. Además de nitrito y nitrato,
otras especies moleculares relacionadas con la síntesis o la
degradación del NO (otros "productos relacionados con NO")
pueden cuantificarse en sangre, orina, tejido, u otras muestras
procedentes de un paciente. Por ejemplo, pueden determinarse los
niveles plasmáticos de L-citrulina, que es un
producto de la reacción que produce NO, o GMPc, que se produce como
resultado de la activación por NO de la guanilato ciclasa, como un
reflejo de la síntesis de NO sistémica en un paciente (FL Kiechley
T Malinski. Ann. Clin. Lab. Sci. 26, 501 (1996)). De manera similar,
puede detectarse la L-dimetilarginina, otro producto
de NOS, mediante HPLC en suero humano y usarse como índice
altamente específico de la actividad de NOS sistémica (J Meyer et
al., Anal. Biochem. 247, 11 (1997)). El NO también puede
degradarse reaccionando con un anión superóxido en plasma humano
para producir peroxinitrito, que a su vez puede producir una
variedad de radicales tales como el radical ascorbilo y el radical
albúmina-tinilo que pueden detectarse usando
espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica (EPR) (J
Vasquez-Vivar et al., Biochem. J. 314, 869
(1996)). Otro producto de peroxinitrito es
3-nitrotirosina, que puede detectarse en plasma
humano o en otros fluidos mediante cromatografía de gases junto con
espectrometría de masas (E Schwedhelm et al., Anal. Biochem.
276, 195 (1999)), HPLC en fase inversa (H Ohshima et al.,
Nitric Oxide 3, 132 (1999)), o un método ELISA usando anticuerpos
anti-nitrotirosina (JC ter Steege et al.,
Free Radic. Biol. Med. 25, 953 (1998)). A diferencia del nitrato o
del nitrito, la mayoría de estos productos no están sujetos a
interferencias por la ingesta dietética. Además, la detección in
situ del propio NO es posible con la ayuda de biosensores que
cuantifican los niveles de NO y los cambios de los niveles de NO en
respuesta a estímulos. Por ejemplo, el dominio hemo de la guanilato
ciclasa soluble, un receptor natural para NO, puede marcarse con un
colorante indicador fluorescente, y pueden determinarse los cambios
en la intensidad de fluorescencia a través de fibra óptica y puede
calibrarse para revelar los niveles de NO en cualquier localización
deseada en el cuerpo, por ejemplo, en o cerca del sitio de la herida
(SL Barker et al., Anal. Chem. 71, 2071 (1999)). Dada la
rápida descomposición del NO en los fluidos biológicos, la detección
directa de NO debe realizarse in situ en vez de algún tiempo
después de la recogida de una muestra.
La muestra puede ser cualquier muestra de fluido
o tejido obtenida del sujeto en cantidad suficiente para permitir
la determinación del nivel de nitrato, nitrito u otro producto
relacionado con NO. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra
de orina, sangre (que incluye plasma), o tejido. La muestra se
obtiene preferiblemente del sujeto después de un periodo en ayunas,
con el fin de permitir que el nivel de nitrato, nitrito u otros
productos relacionados con NO alcancen un nivel inicial estable. El
periodo en ayunas reduce la interferencia dietética y las fuentes
metabólicas de nitrato y nitrito que no están relacionadas con la
degradación del NO. Durante el periodo en ayunas, se reduce el
consumo del sujeto de todos los alimentos sólidos y líquidos desde
su de consumo promedio en al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o
100%. Preferiblemente, se reduce el consumo del sujeto de todos los
alimentos sólidos y líquidos en al menos un 90%. Más
preferiblemente, se reduce el consumo del sujeto de todos los
alimentos sólidos y líquidos en un 100%. Lo más preferido, el sujeto
no consume ningún alimento sólido o líquido durante el periodo en
ayunas. El consumo de agua del sujeto no se restringe durante el
periodo en ayunas; sin embargo en algunas realizaciones, el sujeto
tampoco consume agua durante el periodo en ayunas. El periodo en
ayunas debe ser de duración suficiente como para permitir que se
alcance un nivel inicial estable sea cual sea el parámetro que se
mide. Un nivel inicial estable es la condición en la que el
parámetro medido, por ejemplo, nitrato en orina, es reproducible
generalmente y no está sujeto a grandes fluctuaciones entre
mediciones repetidas o excesivas interferencias dietéticas,
metabólicas, u otras fuentes que no están relacionadas con el
metabolismo del NO. Preferiblemente el periodo en ayunas es de al
menos, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 20 o 24 horas. Más
preferiblemente el periodo en ayunas es de desde 4 hasta 12 horas,
o de desde 6 hasta 10 horas, o de desde 8 hasta 10 horas, o de desde
10 hasta 12 horas.
Se entiende que cualquier necesidad de ayuno
dependerá de qué producto relacionado con NO se está cuantificando,
porque algunos productos apenas se ven afectados por la dieta; otros
pueden necesitar sólo un corto ayuno. Por ejemplo, la
L-dimetilarginina plasmática (J Meyer et al.,
Anal. Biochem. 247, 11 (1997)) no se ve afectada por la dieta
mientras que las razones de nitrato/creatinina en orina no se ven
afectados por la dieta si se realiza un ayuno durante la noche antes
de la recogida de la muestra (PS Grabowski et al., Arthritis
Rheum. 39, 643 (1996)).
En algunas realizaciones, al periodo en ayunas
está precedido por un periodo durante el que se le administra al
sujeto una dieta que es lo suficientemente baja en fuentes de
nitrato o nitrito dietético como para alcanzar un valor inicial
estable de cualquiera que sea el metabolito de NO que se determinará
en la muestra. Por ejemplo, la dieta puede ser una de la que se han
eliminado todos los alimentos vegetales y conservados con nitrato o
nitrito. La dieta también puede tener un nivel reducido de
L-arginina en comparación con la dieta normal del
sujeto. Por ejemplo, una dieta proporciona un nivel de nitrato
inferior a 900 mg/kg de peso corporal/día, y un nivel de nitrito
inferior a 9 mg/kg de peso corporal/día.
El nivel de nitrato o nitrito en la muestra puede
cuantificarse mediante cualquier método conocido en la técnica que
proporcione una sensibilidad y reproducibilidad adecuadas. Por
ejemplo, la reacción de Griess es un ensayo espectrofotométrico
para nitrato que puede proporcionar una determinación sensible de
nitrato y nitrito en muestras de fluido biológico (M Marzinzig
et al., Nitric Oxide 1, 177 (1997)). Si la reacción de Griess
u otro ensayo de nitrito se realiza tanto con como sin reducción de
nitrato a nitrito, entonces los valores de nitrato pueden obtenerse
como la diferencia entre los valores de nitrito obtenidos para la
muestra reducida y para la muestra no reducida. El ensayo de Griess
puede hacerse más sensible si se obtiene un producto fluorescente,
por ejemplo, haciendo reaccionar el nitrito con
2,3-diaminonaftaleno (TP Misko et al., Anal.
Biochem. 214, 11 (1993)). También se encuentran disponibles ensayos
altamente sensibles que, en primer lugar, reducen el nitrito y el
nitrato (RS Braman y SA Hendrix, Anal. Chem. 61, 2715 (1989)) o
cualquier compuesto relacionado con NO (M Sonoda et al.,
Anal. Biochem. 247, 417 (1997)) a NO para la detección con reactivos
quimioluminiscentes específicos. Se ha descrito también una
variedad de protocolos para detectar y cuantificar los niveles de
nitrito y nitrato en fluidos biológicos mediante cromatografía
iónica (por ejemplo, SA Everett et al., J. Chromatogr. 746,
437 (1995); JM Monaghan et al., J. Chromatogr. 770, 143
(1997)), cromatografía líquida de alta resolución, (por ejemplo, M
Kelm et al., Cardiovasc. Res. 41, 765 (1999)), y
electroforesis capilar (MA Friedberg et al., J. Chromatogr.
781, 491 (1997)).
El "nivel" de nitrato, nitrito, u otro
producto relacionado con NO se refiere normalmente a la
concentración (en moles por litro, micromoles por litro, u otras
unidades adecuadas) de nitrato o nitrito en la muestra, o en la
parte fluida de la muestra. Sin embargo, también pueden utilizarse
otras unidades de medida para expresar el nivel de nitrato o
nitrito. Por ejemplo, puede usarse una cantidad absoluta (en
microgramos, miligramos, nanomoles, moles, u otras unidades
adecuadas), en particular si la cantidad hace referencia a una
cantidad constante (por ejemplo, gramos, kilogramos, mililitros,
litros o otras unidades adecuadas) de las muestras en consideración.
Pueden usarse varios kits disponibles comercialmente. Uno de tales
kits de describe en el ejemplo 2.
La muestra puede procesarse antes de la
determinación de nitrato o nitrito según se necesite mediante el
método de cuantificación, o con el fin de mejorar los resultados, o
para la conveniencia del investigador. Por ejemplo, el
procesamiento puede implicar centrifugación, filtrado u
homogeneización de la muestra. Si la muestra es sangre completa, la
sangre puede centrifugarse para eliminar las células y puede
realizarse el ensayo de nitrato o de nitrito en la fracción
plasmática o sérica. Si la muestra es tejido, el tejido puede
dispersarse u homogeneizarse mediante cualquier método conocido en
la técnica antes de la determinación de nitrato o nitrito. Puede ser
preferible eliminar las células y otros desechos mediante
centrifugación u otro método y determinar el nivel de nitrato o
nitrito usando sólo la parte fluida de la muestra, o la fracción
fluida extracelular de la muestra. También puede conservarse la
muestra para una determinación posterior, por ejemplo mediante la
congelación de muestras de orina o plasma. Cuando sea apropiado,
pueden introducirse aditivos en la muestra para conservar o mejorar
sus características para su uso en el ensayo de nitrato o
nitrito.
El valor umbral de nitrato, nitrito u otro
producto relacionado con NO puede determinarse comparando sujetos
diabéticos con capacidad para cicatrizar heridas normal o escasa,
usando el método de detección descrito anteriormente. Por ejemplo,
comparando los niveles de nitrato en orina de un grupo de diabéticos
cuyas heridas no cicatrizan con un grupo de diabéticos cuyas
heridas cicatrizan o sujetos normales, preferiblemente tras la
administración de una dieta baja en nitrato y después de un periodo
en ayunas, los niveles de nitrato de los dos grupos puede
compararse como en el ejemplo 2. Puede seleccionarse el valor umbral
de los datos obtenidos.
Por ejemplo, el umbral puede elegirse como un
valor ligeramente superior a la media del nivel de nitrato en orina
del grupo cuyas heridas no cicatrizan; el valor umbral debe elegirse
tal que los niveles de nitrato en orina de al menos el 70%, 80%,
90%, 95%, 98%, o 99% de los diabéticos cuyas heridas no cicatrizan
sometidos a ensayo se encontrarían en o por debajo del umbral. Para
pacientes humanos, el valor umbral para nitrato en orina está entre
15 y 50 micromolar. Preferiblemente, el valor umbral para nitrato en
orina está entre 20 y 45 micromolar, o entre 25 y 40 micromolar.
Más preferiblemente, el valor umbral para nitrato en orina humana
es de 20, 25, 28, 30, 32, 35, 37 ó 40 micromolar. Para pacientes
humanos, el valor umbral para nitrato en plasma está entre 2 y 20
micromolar. Preferiblemente, el valor umbral para nitrato en plasma
humano está entre 3 y 17 micromolar, o entre 4 y 16 micromolar. Más
preferiblemente, el valor umbral para nitrato en plasma humano es
de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 micromolar. Cuando se
selecciona un valor umbral de nitrato, nitrito u otro producto
relacionado con NO para su uso en un tipo dado de muestra, por
ejemplo orina o plasma humano, debe observarse que el uso de
diferentes ensayos o métodos de normalización podría cambiar los
intervalos numéricos de los proporcionados aquí.
Otra realización de la invención es un método
para tratar a un sujeto diabético. Con el fin de practicar esta
realización, se identifica en primer lugar un sujeto como o bien un
diabético cuyas heridas cicatrizan o bien un diabético cuyas
heridas no cicatrizan mediante el método descrito anteriormente, o
mediante otro método. Dado que los diabéticos cuyas heridas no
cicatrizan, tal como se identifican en la invención, padecen de
actividad de NO reducida, pueden tratarse mediante cualquier
tratamiento que esté diseñada para aumentar la producción de NO.
Tales tratamientos incluyen, pero no se limitan a, administración de
L-arginina aumentando su presencia en la dieta,
administración oral de un complemento dietético que comprende
L-arginina en cualquier forma farmacéuticamente
aceptable, o una inyección parenteral o intravenosa de una
preparación farmacéuticamente aceptable que comprende
L-arginina. La dosificación puede seleccionarse de
cualquier protocolo conocido en la técnica que está diseñado para
aumentar la producción de NO en el paciente. Un tratamiento
adicional que aumenta la producción de NO es el tratamiento con
oxígeno hiperbárico. Opcionalmente, la administración de cualquier
tratamiento diseñado para aumentar la producción de NO en un sujeto
puede combinarse con el método descrito más adelante para
monitorizar la eficacia del tratamiento aumentando los niveles de
NO en el sujeto. Si se encuentra que el sujeto es un diabético cuyas
heridas cicatrizan, el tratamiento preferido no implica un agente
terapéutico diseñado para aumentar la producción de NO en el
sujeto. En el caso de un sujeto diabético cuyas heridas cicatrizan,
puede emplearse un tipo de tratamiento diferente. Por ejemplo, la
administración de PDGF (Regranex®, o cualquier otra preparación de
PDGF) puede ser eficaz para promover la cicatrización de heridas en
un sujeto diabético cuyas heridas cicatrizan.
También puede usarse la invención para impedir
tratamientos que pueden ser desventajosos para ciertos pacientes
diabéticos. Cualquier influencia terapéutica negativa en la síntesis
de óxido nítrico o su eficacia en promover la cicatrización de
heridas puede minimizarse mediante el uso de la invención. Por
ejemplo, a menudo se administra a pacientes diabéticos con LEU
fármacos glucocorticoides por su efecto antiinflamatorio. Sin
embargo, se sabe que los glucocorticoides inhiben selectivamente la
expresión de NOSi (MW Radomski, RM Palmer, S Moncada, Proc Natl Acad
Sci USA 87, 10043 (1990)), y han mostrado que disminuyen la cantidad
de nitrito/nitrato en el fluido de la herida (AE Ulland, JD
Shearer, MD Caldwell, J Surg Res 70, 84 (1997). Para pacientes
identificados como diabéticos cuyas heridas no cicatrizan, en los
que se espera que la capacidad para sintetizar NO sea inferior en
comparación con los diabéticos cuyas heridas cicatrizan, es
indeseable el uso de esteroides que suprimirían adicionalmente los
niveles NO en el paciente. Por tanto, según una realización de la
invención, un paciente identificado como un diabético cuyas heridas
no cicatrizan no se trata con glucocorticoides u otros fármacos que
se sospecha que disminuyen los niveles de NO en el paciente.
En una realización diferente, la invención puede
usarse como un método para monitorizar la eficacia del tratamiento
de un diabético cuyas heridas no cicatrizan. En esta realización, un
paciente recibe un tratamiento que implica la administración de un
agente terapéutico diseñado para elevar el nivel de óxido nítrico en
el paciente. Ejemplos de tales agentes terapéuticos incluyen los
tratamientos con L-arginina y oxígeno hiperbárico
descritos anteriormente. Tras la administración del agente
terapéutico, se monitoriza al paciente para determinar la eficacia
del tratamiento mediante el método de detectar nitrato o nitrito en
una muestra procedente del paciente, tal como se describió
anteriormente. Si el nivel de nitrato, nitrito u otro producto
relacionado con NO en la muestra está en o por debajo del valor
umbral para determinar si el paciente es un diabético cuyas heridas
cicatrizan o cuyas heridas no cicatrizan, entonces la eficacia del
agente terapéutico es insuficiente para promover la cicatrización
de heridas. En ese caso, el tratamiento puede ajustarse
posteriormente, por ejemplo aumentando la dosis o potencia del
agente terapéutico o aumentando el periodo de exposición al agente
terapéutico. En una realización relacionada, se repite el método de
monitorizar al paciente, y se aumenta de nuevo la dosis o potencia
del agente terapéutico, o el periodo de exposición al agente
terapéutico. Preferiblemente, en esta realización el método de
monitorización y aumento, se aumenta la dosis del agente terapéutico
hasta que el nivel de nitrato o nitrito en una muestra procedente
del paciente está por encima del valor umbral. Puede desearse
mantener entonces el tratamiento en la dosis más eficaz tanto tiempo
como se necesite hasta que las heridas del paciente se hayan
curado.
La anterior descripción describe generalmente la
presente invención. Puede obtenerse una comprensión más completa
mediante la referencia a los siguientes ejemplos específicos, que se
proporcionan en el presente documento sólo con fines de ilustración
y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Para examinar la hipótesis de que los diabéticos
cuyas heridas no cicatrizan presentan una actividad de NO afectada,
el siguiente estudio de metabolitos de NO (nitrato y nitrito) en
plasma y en orina se llevó a cabo siguiendo un estudio de
cicatrización de heridas de úlceras diabéticas usando Regranex®. Los
resultados indican que la población diabética con LEU crónica que
no cicatriza está caracterizada por una excreción significativamente
inferior de nitrato en
orina.
orina.
Para el estudio clínico, se eligieron diez (10)
pacientes diabéticos sanos que presentaban una historia de una o
más úlceras de pie diabético. Todos los pacientes habían recibido
previamente tratamiento tópico de la úlcera con gel Regranex® bajo
estrecha observación clínica. La mitad de este grupo (n=5)
experimentó una cicatrización completa (diabéticos cuya herida ha
cicatrizado/HD) de la úlcera en la semana 20 de observación. La
mitad restante (n=5) de este grupo no experimentó una cicatrización
completa (diabéticos cuya herida no cicatriza/UHD) de la úlcera en
la semana 20 de observación. Tras la finalización del tratamiento
con Regranex®, los 10 sujetos diabéticos (HD y UHD) y 10 controles
no diabéticos sanos (C) se incluyeron en un análisis de
nitrato/nitrito en orina y plasma. Antes de este análisis se
seleccionó a todos los sujetos con una historia médica, un examen
físico, y análisis bioquímicos iniciales hematológicos, de suero y
de orina con el fin de eliminar sujetos con enfermedad cancerígena
activa, enfermedad reumática o de colágeno vascular, insuficiencia
renal crónica, enfermedad inflamatoria del intestino,
alcoholismo/consumo de drogas, celulitis, osteomielitis, y los que
necesitaban cirugía de revascularización. Por razones de
conformidad, se descalificó a los sujetos que se determinó que
mostraban un escaso control diabético. Adicionalmente, se
descalificó a cualquiera que estuviera recibiendo tratamiento de
radiación, corticosteroides sistémicos, y agentes inmunosupresores o
quimioterápicos. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los
participantes en el estudio.
Se llevó a los sujetos de todos los grupos al
entorno hospitalario tras un periodo en ayunas de 10 horas. Se
obtuvieron muestras de plasma y orina en ayuno de cada sujeto en su
ingreso (día 1) para proporcionar una indicación de los niveles
iniciales de nitrato y nitrito del sujeto. Adicionalmente, se obtuvo
de todos los sujetos trabajo de laboratorio rutinario que consistía
en un panel bioquímico, recuento de sangre completa, y análisis de
orina, con el ingreso en el hospital. Se confinó a los sujetos en el
entorno hospitalario durante 24 horas, tiempo durante el cual se
controlaron el nivel de actividad, la ingesta dietética y otros
factores del entorno. Se limitó a todos los sujetos a descansar en
cama con privilegios para utilizar el baño y consumieron la misma
dieta durante la hospitalización de 24 horas (2,581 Kcals; 124.2 g
de proteínas; 5,779 mg de arginina; véase la tabla 1). Se les
exigió a todos los sujetos que se abstuvieran del consumo de tabaco
y alcohol. Se eliminaron de la dieta del estudio las verduras que
normalmente tienen un contenido de nitrato más elevado procedente de
fertilizantes y alimentos conservados con nitrato y nitrito, lo que
se muestra en la tabla 1 de más adelante. Se administraron las
medicaciones iniciales concomitantes y se realizó la monitorización
de la glucemia por los sujetos diabéticos según su rutina doméstica
habitual. Se registró la medicación y la ingesta dietética así como
la diuresis y esto lo evaluó el equipo de investigación durante el
periodo de 24 horas de confinamiento. A las 9 p.m. del día de
confinamiento, se les exigió a todos los sujetos comenzar otro
periodo de ayuno de 10 horas. Antes de darles de alta del entorno
hospitalario, los sujetos proporcionaron de nuevo muestras de orina
y plasma en ayunas (día 2). Se monitorizaron diariamente los signos
vitales durante el confinamiento y se evaluó a todos los sujetos
para determinar acontecimientos adversos antes del alta. Todas las
muestra de plasma y orina obtenidas se congelaron inmediatamente a
-20ºC en una preparación para análisis de laboratorio.
\vskip1.000000\baselineskip
| Menú de la dieta de la investigación | Calorías | Proteínas (g) | Arginina (mg) |
| Desayuno | |||
| \; huevo, 1 | 77 | 6,3 | 377 |
| \; cereales, ¾ fríos | 80 | 3,0 | 240 |
| \; tostada, 1 rebanada, blanca | 61 | 2,2 | n/a |
| \; margarina, 1 cucharadita | 45 | 0 | 1 |
| \; gelatina, 1 cucharada | 50 | 0 | n/a |
| \; Zumo de naranja, 4 oz. | 55 | 0 | 112 |
| \; leche, 2%, 8 oz. | 121 | 8,1 | 294 |
| Comida | |||
| \; hamburguesa, 3,5 oz. | 274 | 26,6 | 1615 |
| \; panecillo | 122 | 4,4 | n/a |
| \; ½ tomate en rodajas | 15,5 | 8 |
| Menú de la dieta de la investigación | Calorías | Proteínas (g) | Arginina (mg) |
| Comida | |||
| \; mayonesa, 1 cucharada | 100 | 0 | 10 |
| \; patatas fritas de maíz, 1 oz. | 153 | 1,9 | 92 |
| \; taza de fruta mezclada | 80 | 0 | n/a |
| \; leche, 2%, 8 oz. | 121 | 8,1 | 294 |
| Cena | |||
| \; pechuga de pollo al horno, 3,5 oz. | 222 | 29,0 | 1811 |
| \; arroz, blanco, ½ taza | 133 | 4,9 | 342 |
| \; manzanas, en lata, ½ taza | 68 | 0 | 6 |
| \; panecillo de cena | 85 | 2,4 | n/a |
| \; margarina, 1 cucharadita | 45 | 0 | 1 |
| \; melón cantalupo en dados, ½ taza | 28 | 1,4 | n/a |
| \; pudín de dieta, ½ taza | 250 | 6,2 | n/a |
| \; leche, 2%, 8 oz. | 121,1 | 8,1 | 294 |
Se obtuvieron muestras de orina y sangre de los
sujetos diabéticos cuyas heridas cicatrizan y cuyas heridas no
cicatrizan tal como se describió en el ejemplo 1.
Las muestras de orina y plasma se sometieron a
ensayo fluorométricamente para determinar los niveles de nitrito y
nitrato usando un kit comercial (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)
según las instrucciones del fabricante. El método utilizado es el
descrito por Gilliam et al. (Anal. Biochem. 212, 359 (1993)).
Se recogió la sangre en un tubo de cristal, se centrifugó, y
recogió el plasma y se congeló hasta su ensayo. Las muestras se
descongelaron, se agitaron con vórtex y se filtraron con un filtro
de exclusión de tamaño de 10 KDa (Millipore, Bedford, MA). Para la
determinación de nitrato, se añadieron nitrato reductasa y NADP y se
dejó incubar a temperatura ambiente durante dos horas. Tras
incubación con 2,3-diaminonaftaleno seguida de la
adición de NaOH y se determinó la fluorescencia con un fluorímetro
usando excitación a 365 nm y emisión a 405 nm. La concentración de
nitrito se determinó usando el mismo método con la excepción de que
se omitieron las etapas de reducción del nitrato. Se procesó la
orina del mismo modo excepto en que se omitió la filtración. Se
ensayaron todas las muestras por triplicado. Se determinó la
concentración en las muestras de pacientes (micromoles por litro)
por comparación con disoluciones patrón de nitrato y nitrito. Se
realizó ANOVA de una vía con ensayo posterior de
Tukey-Kramer (Ludbrook, Clin. Exp. Pharmacol.
Physiol. 18, 379 (1991)) usando el software GraphPad InStat, versión
4.10 para Windows 98. Se consideraron significativos valores de P
< 0.05.
En el día 1, los niveles de nitrato en la orina
en ayunas (micromoles/l \pm E.E.) para los grupos C y HD (55,88
\pm 4,49 y 54,14 \pm 3,32, respectivamente) no fueron
significativamente diferentes (figura 2). Sin embargo, los niveles
de nitrato en la orina en ayunas (30,35 \pm 3,61) del grupo UHD
fueron significativamente inferiores a los de los grupos C (p <
0,001) o HD (p < 0,01). El día 2, los niveles de nitrato en la
orina en ayunas para los grupos C y HD fueron inferiores (42,60
\pm 1,92 y 45,57 \pm 5,10, respectivamente) pero de nuevo no
fueron significativamente diferentes. De manera similar, los niveles
de nitrato en la orina en ayunas (22,74 \pm 3,13) del grupo UHD
fueron inferiores que los valores del día 1 y fueron de nuevo
significativamente inferiores que los del grupo C (p < 0,05) o
HD (p < 0,05) [tabla 2]. El día 1 los niveles de nitrato en
plasma en ayunas (micromoles/l \pm E.E.) para el grupo C (4,80
\pm 0,85) y el grupo UHD (4,05 \pm 0,37) no fueron
significativamente diferentes (figura 3). Los del grupo HD (11,71
\pm 2,08), sin embargo, fueron superiores a los del grupo UHD
pero sólo significativamente superiores que C (p < 0,05). El día
2 los niveles de nitrato en plasma en ayunas fueron ligeramente
inferiores para los grupos C (2,92 \pm 0,37) y UHD (3,16 \pm
0,61), pero como antes estos no fueron significativamente
diferentes. Sin embargo, el grupo HD (11,94 \pm 4,46) fue ahora
significativamente superior que el grupo C (p < 0,01) o el grupo
UHD (p < 0,05). Los niveles de nitrato en plasma y orina fueron
aproximadamente 100 veces superiores que los de nitrito y
ocasionalmente fueron indetectables mediante esta metodología. Por
estas razones no se notifican los niveles de nitrito en orina y
plasma.
| Valores de nitrato en orina y plasma en ayunas | ||||||
| Día 1 | Día 2 | |||||
| C N=10 | HD N=5 | UHD N=5 | C N=10 | HD N=5 | UHD N=5 | |
| Nitrato* en orina en ayunas | 55,88 | 54,14 | 30,35 | 42,60 | 45,57 | 22,74 |
| (\mum/l) | \pm4,49 | \pm3,32 | \pm3,61 | \pm1,92 | \pm5,10 | \pm3,13 |
| P \dagger, \ddagger | \daggerNS | \dagger0,001 | \ddaggerNS | \ddagger,05 | ||
| Nitrato* en plasma en ayunas | 4,80 | 11,71 | 4,05 | 2,92 | 11,94 | 3,16 |
| (\mum/l) | \pm0,85 | \pm2,08 | \pm0,37 | \pm0,37 | \pm4,46 | \pm0,61 |
| P\dagger, \ddagger, \NAK | \dagger0,05 | \daggerNS | \ddagger0,01 | \ddaggerNS | ||
| \NAK0,05 | ||||||
| Leyenda | ||||||
| \; *Media \pm error estándar | ||||||
| \; P Valor de P | ||||||
| \; \dagger Comparado con los controles, Día 1 | ||||||
| \; \ddagger Comparado con los controles, Día 2 | ||||||
| \; \NAK Comparado con HD, Día 2 | ||||||
| \; C Grupo control | ||||||
| \; HD Diabéticos cuya herida ha cicatrizado | ||||||
| \; UHD Diabéticos cuya herida no ha cicatrizado |
Claims (24)
1. Método para determinar si un sujeto diabético
es un diabético cuyas heridas cicatrizan o un diabético cuyas
heridas no cicatrizan, que comprende la etapa de:
- comparar el nivel de un producto relacionado con óxido nítrico seleccionado del grupo que consiste en nitrato, nitrito, óxido nítrico, L-citrulina, GMPc, peroxinitrito, 3-nitrotirosina y L-dimetilarginina en una muestra del sujeto diabético con un valor umbral que discrimina entre diabéticos cuyas heridas cicatrizan y diabéticos cuyas heridas no cicatrizan, en el que si el nivel del producto relacionado con óxido nítrico está por encima del valor umbral, el sujeto es un diabético cuyas heridas cicatrizan, y si el nivel del producto relacionado con óxido nítrico está aproximadamente en o por debajo del valor umbral, el sujeto es un diabético cuyas heridas no cicatrizan.
2. Método según la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente la etapa de:
- determinar el nivel del producto relacionado con óxido nítrico en la muestra.
3. Método según la reivindicación 2, en el que la
muestra del sujeto diabético se recogió tras un periodo en ayunas de
al menos 6 horas.
4. Método según la reivindicación 3, en el que el
periodo en ayunas es de desde 6 hasta 10 horas.
5. Método según la reivindicación 3, en el que al
sujeto diabético del que se tomó la muestra se le administró durante
al menos 6 horas inmediatamente antes al periodo en ayunas una dieta
con una ingesta de nitrato inferior a 900 mg/kg de peso corporal/día
y una ingesta de nitrito inferior a 9 mg/kg de peso
corporal/día.
6. Método según la reivindicación 5, en el que la
dieta se administra a partir de un periodo de desde 6 hasta 24 horas
de duración.
7. Método según la reivindicación 1, en el que la
muestra es orina, sangre o tejido.
8. Método según la reivindicación 1, en el que el
sujeto es un ser humano.
9. Método según la reivindicación 1, en el que el
producto relacionado con óxido nítrico es nitrato o nitrito.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
la muestra es orina y el valor umbral está entre 15 y 50 micromolar
de nitrato.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
el valor umbral está entre 20 y 45 micromolar de nitrato.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
el valor umbral está entre 25 y 40 micromolar de nitrato.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
el valor umbral es aproximadamente de 35 micromolar de nitrato.
14. Método según la reivindicación 9, en el que
la muestra es sangre el valor umbral está entre 2 y 20 micromolar
de nitrato.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
el valor umbral está entre 3 y 17 micromolar de nitrato.
16. Método según la reivindicación 15, en el que
el valor umbral está entre 4 y 16 micromolar de nitrato.
17. Método según la reivindicación 16, en el que
el valor umbral es aproximadamente 5 micromolar de nitrato.
18. Método según la reivindicación 1, en el que
el producto relacionado con óxido nítrico es óxido nítrico,
L-citrulina, GMPc, peroxinitrito,
3-nitrotirosina o
L-dimetilarginina.
19. Método para monitorizar la eficacia del
tratamiento de heridas de un paciente diabético cuyas heridas no
cicatrizan, que comprende las etapas de:
- (a)
- determinar el nivel del producto relacionado con óxido nítrico seleccionado del grupo que consiste en nitrato, nitrito, óxido nítrico, L-citrulina, GMPc, peroxinitrito, 3-nitrotirosina y L-dimetilarginina en una muestra procedente de un paciente al que se le ha administrado un agente terapéutico diseñado para elevar nivel de óxido nítrico en el paciente;
- (b)
- comparar el nivel del producto relacionado con óxido nítrico con un valor umbral que discrimina entre diabéticos cuyas heridas cicatrizan y cuyas heridas no cicatrizan, en el que si el nivel del producto relacionado con óxido nítrico está por encima del valor umbral, la eficacia del tratamiento es suficiente para promover la cicatrización de heridas, y si el nivel del producto relacionado con óxido nítrico está aproximadamente en o por debajo del valor umbral, la eficacia del tratamiento es insuficiente para promover la cicatrización de heridas.
20. Método según la reivindicación 19, en el que
el producto relacionado con óxido nítrico es nitrato o nitrito.
21. Método según la reivindicación 19, en el que
el producto relacionado con óxido nítrico es óxido nítrico,
L-citrulina, GMPc, peroxinitrito,
3-nitrotirosina y
L-dimetilarginina.
22. Método según la reivindicación 19, en el que
la muestra procedente del paciente diabético se recogió tras un
periodo en ayunas de al menos 6 horas.
23. Método según la reivindicación 19, en el que
el paciente se identificó como un diabético cuyas heridas no
cicatrizan mediante el método según la reivindicación 1.
24. Método según la reivindicación 19, en el que
el agente terapéutico es L-arginina u oxígeno
hiperbárico.
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