ES2254463T3 - Secuencias de nucleotidos que codifican el gen csta de corynebacterium glutamicum. - Google Patents

Secuencias de nucleotidos que codifican el gen csta de corynebacterium glutamicum.

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ES2254463T3
ES2254463T3 ES01960554T ES01960554T ES2254463T3 ES 2254463 T3 ES2254463 T3 ES 2254463T3 ES 01960554 T ES01960554 T ES 01960554T ES 01960554 T ES01960554 T ES 01960554T ES 2254463 T3 ES2254463 T3 ES 2254463T3
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Bettina Mockel
Achim Marx
Walter Pfefferle
Mike Farwick
Thomas Hermann
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

Vector lanzadera de Escherichia coli DH5alfamcr/pEC-K18mob2cstAexp depositado como DSM 13671 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células].

Description

Secuencias de nucleótidos que codifican el gen cstA de Corynebacterium glutamicum.
Campo de la invención
La invención proporciona secuencias de nucleótidos de bacterias corineformes que codifican el gen cstA y un proceso para la preparación de aminoácidos por fermentación, en particular L-lisina, utilizando bacterias en las cuales el gen cstA está sobre-expresado.
Técnica anterior
Los L-aminoácidos, en particular L-lisina, se utilizan en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy particularmente en nutrición animal.
Es sabido que los aminoácidos se preparan por fermentación a partir de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran importancia, se están realizando constantemente trabajos para mejorar los procesos de preparación. Las mejoras en el proceso pueden estar relacionadas con medidas de fermentación, tales como, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutrientes, tal como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o el tratamiento hasta obtener la forma del producto mediante, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades intrínsecas de producción del microorganismo propiamente dicho.
Para mejorar las propiedades de producción de estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes. De este modo se obtienen cepas que son resistentes a antimetabolitos o son auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora y producen aminoácidos.
Desde hace varios años se han empleado también métodos de la técnica del DNA recombinante para mejorar la variedad de cepas de Corynebacterium que producen L-aminoácidos, por amplificación de los genes de biosíntesis de aminoácidos individuales e investigación del efecto sobre la producción de aminoácidos.
Objeto de la invención
Donde se mencionan en lo que sigue L-aminoácidos o aminoácidos esto significa uno o más aminoácidos, con inclusión de sus sales, seleccionados del grupo constituido por L- asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L- leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano y L-arginina.
Los autores de la invención se propusieron el objetivo de proporcionar nuevas medidas para la preparación mejorada de aminoácidos por fermentación, en particular L-lisina.
Sumario de la invención
Cuando se mencionan en lo que sigue lisina o L-lisina, deben entenderse por dichos términos no sólo la base sino también las sales, tales como v.g. monohidrocloruro de lisina o sulfato de lisina.
La invención describe un polinucleótido aislado a partir de bacterias corineformes, que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica el gen cstA, seleccionado del grupo constituido por
un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en la proporción de al menos 91% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2,
teniendo el polipéptido la actividad de la proteína A de privación de carbono.
La invención describe también el polinucleótido arriba mencionado, siendo éste preferiblemente un DNA que es capaz de replicación, y que comprende:
(i)
la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID No. 1, o
(ii)
al menos una secuencia que corresponde a la secuencia (i) dentro del intervalo de la degeneración del código genético, o
(iii)
al menos una secuencia que se hibrida con la secuencia complementaria a la secuencia (i) o (ii), y opcionalmente
(iv)
mutaciones de sentido de la función neutra en (i).
\newpage
La invención describe también
un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID No. 1;
un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID No. 2;
un vector que contiene el polinucleótido de acuerdo con la invención, en particular un vector lanzadera o vector plasmídico, y
bacterias corineformes que sirven como la célula hospedadora, que contienen el vector o en las cuales el gen cstA está sobre-expresado.
La invención describe también polinucleótidos que comprenden sustancialmente una secuencia polinucleotídica, que pueden obtenerse por escrutinio mediante hibridación de una genoteca correspondiente de una bacteria corineforme, que comprende el gen completo o partes del mismo, con una sonda que comprende la secuencia del polinucleótido de acuerdo con la invención conforme a SEQ ID No. 1 o un fragmento de la misma y aislamiento de la secuencia polinucleotídica mencionada.
Una realización adicional de la presente invención es un proceso para la preparación de L-lisina, en el cual se llevan a cabo los pasos siguientes:
(a)
fermentación de las bacterias corineformes que producen la L-lisina deseada que tienen ácidos desoxirribonucleicos adicionales del gen cstA, que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que es idéntica al menos en un 91% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2 y que es una proteína A de privación de carbono, o en donde las secuencias de nucleótidos que codifican la misma están intensificadas;
(b)
concentración de la L-lisina en el medio o en las células de las bacterias, y
(c)
aislamiento de la L-lisina.
Descripción detallada de la invención
Las secuencias polinucleotídicas de acuerdo con la invención son adecuadas como sondas de hibridación para RNA, cDNA y DNA, a fin de aislar, en toda su longitud, ácidos nucleicos o polinucleótidos o genes que codifican la proteína A de privación de carbono, o para aislar aquellos ácidos nucleicos o polinucleótidos o genes que tienen una alta similitud de secuencia con la del gen cstA. Aquéllas son adecuadas también para incorporación en las denominadas "redes", "microrredes", o "chips de DNA" a fin de detectar y determinar los polinucleótidos correspondientes.
Las secuencias polinucleotídicas de acuerdo con la invención son adicionalmente adecuadas como iniciadores con ayuda de los cuales puede prepararse el DNA de genes que codifican la proteína A de privación de carbono con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o iniciadores comprenden al menos 30, preferiblemente al menos 20, y de modo muy particularmente preferible al menos 15 nucleótidos sucesivos. Son también adecuados oligonucleótidos que tienen una longitud de al menos 40 ó 50 nucleótidos. Son también adecuados opcionalmente oligonucleótidos que tienen una longitud de al menos 100, 150, 200, 250 ó 300 nucleótidos.
"Aislado" significa separado de su entorno natural.
"Polinucleótido" se refiere en general a polirribonucleótidos y polidesoxirribonucleótidos, siendo posible que éstos sean RNA o DNA no modificado o RNA o DNA modificado.
Los polinucleótidos de acuerdo con la invención incluyen un polinucleótido de acuerdo con SEQ ID No. 1 o un fragmento preparado a partir del mismo y también aquéllos que son idénticos al menos en un 70% a 80%, preferiblemente al menos en un 81% a 85%, de modo particularmente preferible al menos 86% a 90%, y de modo muy particularmente preferible al menos 91%, 93%, 95%, 97% o 99% al polinucleótido de acuerdo con SEQ ID No. 1 o un fragmento preparado a partir del mismo.
El término "polipéptidos" debe entenderse con el significado de péptidos o proteínas que comprenden dos o más aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
Los polipéptidos de acuerdo con la invención incluyen un polipéptido de acuerdo con SEQ ID No. 2, en particular aquéllos que tienen la actividad biológica de la proteína A de privación del carbono, y también aquéllos que son al menos 70% a 80%, preferiblemente al menos 81% a 85%, de modo particularmente preferiblemente al menos 91%, 93%, 95%, 97% o 99% idénticos al polipéptido de acuerdo con SEQ ID No. 2 y tienen la actividad mencionada.
La invención proporciona además un proceso para la preparación de aminoácidos por fermentación, en particular L-lisina, utilizando bacterias corineformes que producen ya particularmente aminoácidos, y en las cuales las secuencias de nucleótidos que codifican el gen cstA están sobre-expresadas, en particular sobre-expresadas.
En este contexto, el término "sobre-expresión" describe el aumento en la actividad intracelular de una o más enzimas en un microorganismo que son codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por aumento del número de copias del gen o genes, utilizando un promotor potente o utilizando un gen que codifica una enzima correspondiente que tiene una actividad alta y, opcionalmente, por combinación de estas medidas.
Por las medidas de sobre-expresión, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se aumenta en general al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, hasta un máximo de 1000% o 2000%, basada en el microorganismo de partida.
Los microorganismos que proporciona la presente invención pueden preparar L-aminoácidos, en particular L-lisina, a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón, celulosa o a partir de glicerol y etanol. Aquéllos pueden ser representativos de bacterias corineformes, en particular del género Corynebacterium. De dicho género Corynebacterium, puede mencionarse en particular la especie Corynebacterium glutamicum, que es conocida entre los expertos por su capacidad para producir L-aminoácidos.
Cepas adecuadas del género Corynebacterium, en particular de la especie Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), son en particular las cepas de tipo salvaje conocidas
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
y mutantes productores de L-lisina o cepas preparadas a partir de los mismos, tales como, por ejemplo,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 y
Corynebacterium glutamicum DSM 5715.
Los autores de la invención han alcanzado éxito en el aislamiento del nuevo gen cstA de C. glutamicum que codifica la proteína A de privación del carbono.
Para aislar el gen cstA u otros genes de C. glutamicum, se prepara primeramente una genoteca de este microorganismo en Escherichia coli (E. coli). El establecimiento de genotecas se describe en libros de texto y manuales de conocimiento general. El libro de texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie [Genes y Clones, una Introducción a la Ingeniería Genética](Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990), o el manual de Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) pueden mencionarse como ejemplo. Una genoteca bien conocida es la de la cepa K-12 de E. coli W3110 establecida en vectores \lambda por Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)). Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) describen una genoteca de C. glutamicum ATCC13032, que se estableció con la ayuda del vector cósmido SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) en la cepa de K-12 de E. coli NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575).
Börmann et al., (Molecular Microbiology 6 (3), 317-326) (1992)) describen a su vez una genoteca de C. glutamicum ATCC13032 que utiliza el cósmido pHC79 (Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)).
Para preparar una genoteca de C. glutamicum en E. coli es posible también utilizar plásmidos tales como pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268). Hospedadores adecuados son, en particular, aquellas cepas de E. coli que son deficientes en restricción y recombinación. Un ejemplo de éstas es la cepa DH5amcr, que ha sido descrita por Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Los fragmentos largos de DNA clonados con la ayuda de cósmidos pueden subclonarse a su vez en los vectores usuales adecuados para secuenciación y secuenciarse después, como se describe v.g. por Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977).
Las secuencias de DNA resultantes pueden investigarse luego con algoritmos o programas de análisis de secuencias conocidos, tales como v.g. el de Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)), el de Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) o el programa GCG de Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)).
La nueva secuencia de DNA de C. glutamicum que codifica el gen cstA y que, como SEQ ID No. 1, es un constituyente de la presente invención, se ha obtenido de esta manera. La secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente se ha derivado ulteriormente de la presente secuencia de DNA por los métodos arriba descritos. La secuencia de aminoácidos resultante del producto del gen cstA se muestra en SEQ ID No. 2.
Secuencias de DNA codificantes que resultan de SEQ ID No. 1 por la degeneración del código genético son también un constituyente de la invención. Del mismo modo, secuencias de DNA que se hibridan con SEQ ID No. 1 o partes de SEQ ID No. 1 son un constituyente de la invención. Cambios conservadores de aminoácidos, tales como v.g. cambios de glicina en sustitución de alanina o de ácido aspártico en sustitución de ácido glutámico en proteínas, son adicionalmente conocidas entre los expertos como "mutaciones de sentido" que no conducen a un cambio fundamental en la actividad de la proteína, es decir son de función neutra. Se sabe también que los cambios en el término N y/o el término C de una proteína no pueden deteriorar sustancialmente o incluso pueden estabilizar la función de la misma. Información a este respecto puede ser encontrada por el experto, entre otros lugares, en Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751- 757 (1987)), en O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), en Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), en Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular. Secuencias de aminoácidos que resultan de manera correspondiente de SEQ ID No. 2 son también un constituyente de la invención.
De igual modo, secuencias de DNA que se hibridan con SEQ ID No. 1 o partes de SEQ ID No. 1 son un constituyente de la invención. Finalmente, secuencias de DNA que se preparan por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores que proceden de SEQ ID No. 1 son un constituyente de la invención. Tales oligonucleótidos tienen típicamente una longitud de al menos 15 nucleótidos.
Instrucciones para identificación de secuencias de DNA por medio de hibridación pueden ser encontradas por el experto, entre otros lugares, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991), 41: 255-260). La hibridación tiene lugar en condiciones severas, es decir que se forman únicamente híbridos en los cuales la sonda y la secuencia diana, es decir los polinucleótidos tratados con la sonda, son idénticos al menos en un 70% de identidad. Es sabido que la severidad de la hibridación, con inclusión de los pasos de lavado, está influenciada o determinada por la variación de la composición del tampón, la temperatura y la concentración de sales. La reacción de hibridación se lleva a cabo preferiblemente a una severidad relativamente baja en comparación con los pasos de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).
Para la reacción de hibridación puede emplearse, por ejemplo, un tampón 5x SSC a una temperatura de aprox. 50-68ºC. Las sondas pueden hibridarse también en este caso con polinucleótidos que tienen una identidad menor de 70% con la secuencia de la sonda. Tales híbridos son menos estables y se separan por lavado en condiciones severas. Esto puede realizarse, por ejemplo, por disminución de la concentración de sales a 2x SSC y subsiguientemente 0,5x SSC ("The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation", Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995) estableciéndose una temperatura de aprox. 50-68ºC. Opcionalmente, es posible reducir la concentración de sales a 0,1x SSC. Fragmentos de polinucleótidos que son, por ejemplo, idénticos al menos en un 70% o al menos en un 80% o al menos en un 90 a 95% a la secuencia de la sonda empleada pueden aislarse aumentando gradualmente la temperatura de hibridación en pasos de aprox. 1-2ºC. Instrucciones adicionales acerca de la hibridación pueden obtenerse en el mercado en forma de los denominados kits (v.g. DIG Easy Hyb de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, catálogo No. 1603558).
Instrucciones para la amplificación de secuencias de DNA con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden ser encontradas por el experto, entre otros lugares, en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) y en Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).
Se ha encontrado que las bacterias corineformes producen aminoácidos, en particular L-lisina, de una manera mejorada después de la sobre-expresión del gen cstA.
Para conseguir una sobre-expresión, el número de copias de los genes correspondientes puede aumentarse, o pueden mutarse el promotor y la región de regulación o el sitio de fijación de ribosoma aguas arriba del gen estructural. Las casetes de expresión que se incorporan aguas arriba del gen estructural actúan del mismo modo. Por medio de promotores inducibles, es posible adicionalmente aumentar la expresión en el curso de la producción de lisina por fermentación. La expresión se mejora asimismo por medidas para prolongar la vida del m-RNA. Adicionalmente, la actividad enzimática se incrementa también por prevención de la degradación de la proteína enzimática. Los genes o constructos de genes pueden estar presentes en plásmidos con un número variable de copias, o pueden integrarse y amplificarse en el cromosoma. Como alternativa, una sobre-expresión de los genes en cuestión puede conseguirse adicionalmente por cambio de la composición de los medios y el procedimiento de cultivo.
Instrucciones en este contexto pueden ser encontradas por el experto, entre otros lugares, en Martin et al. (Bio/
Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en la Memoria Descriptiva de la Patente Europea 0 472 869, en la Patente US 4.601.893, en Schwarzer and Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en la Memoria Descriptiva Japonesa Expuesta al Público JP-A-10-229891, en Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular.
A modo de ejemplo, el gen cstA de acuerdo con la invención se sobre-expresó con ayuda de plásmidos episómicos. Plásmidos adecuados son aquéllos que se replican en bacterias corineformes. Numerosos vectores plasmídicos conocidos, tales como v.g. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989), 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) o pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) están basados en los plásmidos crípticos pHM1519, pBL1 o pGA1. Otros vectores plasmídicos, tales como v.g. los basados en pCG4 (documento US-A 4.489.160), o pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), o pAG1 (documento US-A 5.158.891), pueden utilizarse de la misma manera.
Vectores plasmídicos que son adecuados adicionalmente son también aquéllos con ayuda de los cuales puede utilizarse el proceso de amplificación de genes por integración en el cromosoma, como ha sido descrito, por ejemplo, por Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para duplicación o amplificación del operón hom-thrB. En este método, el gen completo se clona en un vector plasmídico que puede replicarse en un hospedador (típicamente E. coli), pero no en C. glutamicum. Vectores posibles son, por ejemplo, pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob o pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, U.S.A.), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; documento US-A 5.487.993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Países Bajos; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) o pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337- 342). El vector plasmídico que contiene el gen a amplificar se transfiere luego a la cepa deseada de C. glutamicum por conjugación o transformación. El método de conjugación ha sido descrito, por ejemplo, por Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Métodos para transformación se describen, por ejemplo, por Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Después de recombinación homóloga por medio de un suceso de "cruzamiento", la cepa resultante contiene al menos dos copias del gen en cuestión.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la producción de aminoácidos, en particular L-lisina, sobre-expresar una o más enzimas del camino de biosíntesis particular, de glicólisis, de anaplerosis, del ciclo del ácido cítrico o de exportación de aminoácidos y opcionalmente proteínas reguladoras, además del gen cstA.
Así, por ejemplo, para la preparación de aminoácidos, en particular L-lisina, pueden sobreexpresarse uno o más genes seleccionados del grupo constituido por
\bullet
el gen dapA que codifica dihidropicolinato-sintasa (documento EP-B 0 197 335),
\bullet
el gen gap que codifica gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
\bullet
el gen tpi que codifica triosa-fosfato-isomerasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
\bullet
el gen pgk que codifica 3-fosfoglicerato-quinasa (Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
\bullet
el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa (Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)),
\bullet
el gen lysC que codifica una aspartato-quinasa resistente a la realimentación (No. de Acceso P26512; documento EP-B-0387527; documento EP-A-0699759),
\bullet
el gen lysE que codifica la exportación de lisina (documento DE-A-195 48 222),
\bullet
el gen zwa1 que codifica la proteína Zwa1 (documento DE: 19959328.0, DSM 13115).
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la producción de aminoácidos, en particular L-lisina, además de la sobre-expresión del gen cstA, eliminar uno o más genes seleccionados del grupo constituido por
\bullet
el gen pck que codifica fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa (documento DE 199 50 409.1; DSM 13047),
\bullet
el gen pgi que codifica glucosa-6-fosfato-isomerasa (documento US 09/396.478; DSM 12969),
\bullet
el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa (documento DE: 1995 1975.7; DSM 13114),
\bullet
el gen zwa2 que codifica la proteína Zwa2 (documento DE: 19959327.2, DSM 13113).
El término "eliminación", en este contexto, describe la eliminación de la actividad intracelular de una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo que están codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por utilización de un promotor débil o utilización de un gen o alelo que codifica una enzima correspondiente con una actividad baja o desactiva el gen o enzima correspondiente (proteína), y opcionalmente combinación de estas medidas.
Por las medidas de eliminación, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se reduce en general a 0 hasta 50%, 0 hasta 25%, 0 hasta 10% o 0 hasta 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo salva-
je.
Además de la sobre-expresión del gen cstA, puede ser ventajoso adicionalmente, para la producción de aminoácidos, en particular L-lisina, eliminar reacciones secundarias indeseables, (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (compiladores), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos preparados de acuerdo con la invención pueden cultivarse continua o discontinuamente en el proceso de lotes (cultivo por lotes) o en el proceso realimentado (proceso de alimentación) o proceso realimentado repetido (proceso de alimentación repetitiva) para el propósito de producción de aminoácidos, en particular L-lisina. Un sumario de métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto publicado por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a utilizar tiene que cumplir los requerimientos de las cepas particulares de una manera adecuada. Descripciones y medios de cultivo para diversos microorganismos se contienen en la guía "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., U.S.A., 1981).
Azúcares y carbohidratos, tales como v.g. glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y celulosa, aceites y grasas, tales como v.g., aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos, tales como v.g. ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como v.g. glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como v.g. ácido acético, pueden utilizarse como la fuente de carbono. Estas sustancias pueden utilizarse individualmente o en forma de mezclas.
Compuestos orgánicos nitrogenados, tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz, harina de semilla de soja y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, pueden utilizarse como la fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o en forma de mezclas.
Ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o hidrogenofosfato dipotásico o las sales de sodio correspondientes pueden utilizarse como la fuente de fósforo. El medio de cultivo debe comprender adicionalmente sales de metales, tales como v.g. sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente, sustancias esenciales para el crecimiento, tales como aminoácidos y vitaminas, pueden emplearse además de las sustancias arriba mencionadas. Precursores adecuados pueden añadirse además al medio de cultivo. Las sustancias de partida mencionadas pueden añadirse al cultivo en la forma de un solo lote, o pueden añadirse durante el cultivo de una manera adecuada.
Compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o amoníaco acuoso, o compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, pueden emplearse de una manera adecuada para controlar el pH del cultivo. Pueden emplearse antiespumantes, tales como p. ej. poliglicol-ésteres de ácidos grasos, para controlar la formación de espuma. Sustancias adecuadas que tienen una acción selectiva, tales como v.g. antibióticos, pueden añadirse al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos. A fin de mantener condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales como v.g. aire. La temperatura del cultivo es usualmente 20ºC a 45ºC, y preferiblemente 25ºC a 40ºC. El cultivo se continúa hasta que se ha formado un máximo del producto deseado. Este objetivo se alcanza usualmente en el transcurso de 10 horas a 160
horas.
\newpage
El análisis de lisina puede llevarse a cabo por cromatografía de intercambio iónico con derivación subsiguiente de ninhidrina, como ha sido descrito por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).
El proceso de acuerdo con la invención se utiliza para la preparación de aminoácidos por fermentación, en particular, L-lisina.
Los microorganismos siguientes han sido depositados con cultivos puros en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest:
\bullet
C. glutamicum, cepa DSM 5715/pEC-K18mob2 en fecha 20 de enero de 2000 como DSM 13245,
\bullet
Escherichia coli, DH5alfamcr/pEC-K18mob2cstAexp en fecha 22 de agosto de 2000 como DSM 13671.
La presente invención se explica con mayor detalle más adelante con ayuda de ejemplos de realización.
El aislamiento de DNA plasmídico a partir de Escherichia coli y todas las técnicas de restricción, Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se realizaron por el método de Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, U.S.A.). Métodos para transformación de Escherichia coli se describen también en este manual.
La composición de los medios nutrientes usuales, tales como medio LB o TY, puede encontrarse también en el manual de Sambrook et al.
Ejemplo 1
Preparación de una genoteca genómica de cósmidos a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Se aisló DNA cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como ha sido descrito por Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179) y se escindió parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto Sau3AI, Código no. 27-0913-02). Los fragmentos de DNA se desfosforilaron con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción de Producto SAP, Código no. 1758250). El DNA del vector cósmido SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 84:2160-2164), obtenido de Stratagene (La Jolla, U.S.A., Descripción de Producto SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Código no. 251301) se escindió con la enzima de restricción XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto XbaI, Código no. 27-0948-02) y se desfosforiló análogamente con fosfatasa alcalina de camarón.
El DNA de cósmido se escindió luego con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto BamHI, Código no. 27-0868-04). El DNA de cósmido tratado de esta manera se mezcló con el DNA ATCC13032 tratado y el lote se trató con DNA-ligasa T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto T4-DNA-Ligase, Código no. 27-0870-04). La mezcla de ligación se empaquetó luego en fagos con ayuda del Extracto de Empaquetamiento Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, U.S.A., Descripción de Producto Extracto de Empaquetamiento Gigapack II XL, Código no. 200217).
Para infección de la cepa NM554 de E. coli (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575) se recogieron las células en MgSO_{4} 10 mM y se mezclaron con una parte alícuota de la suspensión de fago. La infección y la titulación de la genoteca de cósmidos se llevaron a cabo como ha sido descrito por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), extendiéndose las células en placas sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 100 mg/l de ampicilina. Después de incubación durante una noche a 37ºC, se seleccionaron los clones recombinantes individuales.
Ejemplo 2
Aislamiento y secuenciación del gen cstA
El DNA de cósmido de una colonia individual se aisló con el Spin Miniprep Kit de Qiaprep (Producto No. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se escindió parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto Sau3AI, producto No. 27-0913-02). Los fragmentos de DNA se desfosforilaron utilizando fosfatasa alcalina de camarón (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción de Producto SAP, producto No. 1758250). Después de separación por electroforesis en gel, los fragmentos de cósmido en el intervalo de tamaño de 1500 a 2000 pb se aislaron con el Kit de Extracción en Gel QiaExII (Producto No. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania).
El DNA del vector de secuenciación PZero-1, obtenido de Invitrogen (Groningen, Países Bajos, Descripción de Producto Kit de Clonación con Ruido de Fondo Cero, Producto No. K2500-01) se escindió con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto BamHI, Producto No. 27-0868-04). La ligación de los fragmentos de cósmido en el vector de secuenciación pZero-1 se llevó a cabo como ha sido descrito por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), incubándose la mezcla de DNA durante una noche con ligasa T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania). Esta mezcla de ligación se sometió luego a electroporación (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) en la cepa DH5\alphaMCR de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649) y se extendió en placas sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 50 mg/l de zeocina.
La preparación de plásmido de los clones recombinantes se llevó a cabo con Biorobot 9600 (No. de producto 900200, Qiagen, Hilden, Alemania). La secuenciación se llevó a cabo por el método de terminación de cadenas didesoxi de Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74:5463-5467) con modificaciones de acuerdo con Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Se utilizó el "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" de PE Applied Biosystems (producto No. 403044, Weiterstadt, Alemania). La separación por electroforesis en gel y el análisis de la reacción de secuenciación se llevaron a cabo en un Gel "Rotiphoresis NF Acrylamide/Bisacrylamide" (29:1) (producto No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador "ABI Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania).
Los datos brutos de secuencia obtenidos se procesaron luego utilizando el paquete de programa Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) version 97-0. Las secuencias individuales de los derivados pZero1 se ensamblaron para dar un contigo continuo. El análisis de regiones codificantes asistido por ordenador se preparó con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231).
La secuencia de nucleótidos resultante se muestra en SEQ ID No. 1. El análisis de la secuencia de nucleótidos presentaba un marco de lectura abierta de 2316 pares de bases, que se designó gen cstA. El gen cstA codifica una proteína de 772 aminoácidos (SEQ ID No. 2).
La sección de DNA que se encontraba aguas arriba de SEQ ID NO: 1 se identificó del mismo modo, presentándose esta sección en SEQ ID No. 3. La región del gen cstA extendida por SEQ ID No. 3 se muestra en SEQ ID
No. 4.
Ejemplo 3
Preparación de un vector lanzadera pEC-K18mob2cstAexp para sobre-expresión del gen cstA en C. glutamicum 3.1 Clonación del gen cstA
A partir de la cepa ATCC 13032, se aisló DNA cromosómico por el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140:1817-1828 (1994)). Sobre la base de la secuencia del gen cstA conocida para C. glutamicum a partir del Ejemplo 2, se seleccionaron los oligonucleótidos siguientes para la reacción en cadena de la polimerasa (véase SEQ ID No. 7 y SEQ ID No. 8):
cstA-exp1:
5' CAC CCT ACT GAA CAG CTT GG 3'
cstA-exp2:
5' CAG TGC ATG AGT AAG AGC CA 3'
Los iniciadores indicados fueron sintetizados por ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Alemania) y la reacción PCR se llevó a cabo por el método PCR estándar de Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) con Pwo-Polimerasa de Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemania). Con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa, los iniciadores permiten la amplificación de un fragmento de DNA de un tamaño aproximado de 2,7 kb, que transporta el gen cstA con la región promotora potencial. La secuencia de DNA del fragmento de DNA amplificado se comprobó por secuenciación.
3.2 Preparación del vector lanzadera E. coli - C. glutamicum pEC- K18mob2
Se construyó el vector lanzadera E. coli - C. glutamicum de acuerdo con la técnica anterior. El vector contiene la región de replicación rep del plásmido pGA1 con inclusión del efector de replicación per (documento US-A-5.175.108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), el gen aph(3')-IIa que imparte resistencia a la kanamicina del transposón Tn5 (Beck et al., Gene 19, 327- 336 (1982)), la región de replicación oriV del plásmido pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)), el fragmento del gen lacZ\alpha que incluye el promotor lac y un sitio de clonación múltiple (mcs) (Norrander, J. M. et al., Gene 26, 101-106 (1983)) y la región mob del plásmido RP4 (Simon et al., Bio/Technology 1:784-791 (1983)). El vector construido se transformó en la cepa DH5\alpha de E. coli (Hanahan, en: DNA Cloning. A Practical Approach vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, U.S.A.). La selección para células portadoras de plásmido se realizó por extensión en placa del lote de transformación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), que se había complementado con 25 mg/l de kanamicina. Se aisló el DNA plasmídico de un transformante con ayuda del QIAprep Spin Miniprep Kit de Qiagen y se comprobó por restricción con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII con electroforesis subsiguiente en gel de agarosa (0,8%). El plásmido se denominó pEC-K18mob2 y se muestra en la Figura 1.
3.3 Clonación de cstA en el vector lanzadera pEC-K18mob2 de E. coli - C. glutamicum
El vector lanzadera de E. coli - C. glutamicum pEC-K18mob2 descrito en el Ejemplo 3.2 se utilizó como vector. El DNA de este plásmido se escindió completamente con la enzima de restricción Ec1136II y se desfosforiló luego con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción de Producto SAP, producto No. 1758250).
El fragmento cstA obtenido como se describe en el ejemplo 3.1 se mezcló con el vector pEC-K18mob2 preparado y el lote se trató con DNA-ligasa T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto DNA-ligasa T4, Código no. 27-0870-04). El lote de ligación se transformó en la cepa DH5\alphamcr de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649).
La selección de células portadoras de plásmido se realizó por extensión en placas del lote de transformación sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 25 mg/l de kanamicina. Después de incubación durante una noche a 37ºC, se seleccionaron los clones individuales recombinantes. Se aisló el DNA plasmídico a partir de un transformante con el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Producto No. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se escindió con las enzimas de restricción EcoRI y XbaI para comprobar el plásmido por electroforesis subsiguiente en gel de agarosa. El plásmido obtenido se denominó pEC-K18mob2cstAexp. Se representa en la Figura 2.
Ejemplo 4
Transformación de la cepa DSM 5715 con el plásmido pEC-K18mob2cstAexp
La cepa DSM 5715 se transformó con el plásmido pEC-K18mob2cstAexp utilizando el método de electroporación descrito por Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)). La selección de los transformantes tuvo lugar sobre agar LBHIS que comprendía 18,5 g/l de caldo de infusión cerebro/corazón, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de triptona Bacto, 2,5 g/l de extracto de levadura Bacto, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de agar Bacto, que se habían complementado con 25 mg/l de kanamicina. La incubación se llevó a cabo durante 2 días a 33ºC.
El DNA plasmídico se aisló de un transformante por métodos convencionales (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), se escindió con las endonucleasas de restricción EcoRI y XbaI, y el plásmido se comprobó por electroforesis subsiguiente en gel de agarosa. La cepa obtenida se denominó DSM 5715/pEC-K18mob2cstAexp.
Ejemplo 5
Preparación de lisina
La cepa de C. glutamicum DSM 5715/pEC-K18mob2cstAexp obtenida en el Ejemplo 4 se cultivó en un medio nutriente adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de lisina en el sobrenadante de
cultivo.
Para esto, la cepa se incubó primeramente en una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/l)) durante 24 horas a 33ºC. Partiendo de este cultivo de agar en placas, se sembró un precultivo (10 ml de medio en un matraz cónico de 100 ml). El medio CgIII completo se utilizó como medio para el precultivo.
Medio Cg III
NaCl 2,5 g/l
Peptona Bacto 10 g/l
Extracto de levadura Bacto 10 g/l
Glucosa (tratada en autoclave por separado) 2% (p/v)
El pH se llevó a pH 7,4.
Se añadió a esto kanamicina (25 mg/l). El precultivo se incubó durante 16 horas a 33ºC a 240 rpm en una máquina de sacudidas. Un cultivo principal se sembró a partir de este precultivo de tal modo que la DO inicial (660 nm) del cultivo principal era 0,05. Se utilizó para el cultivo principal medio MM.
\newpage
Medio MM
CSL (licor de maceración de maíz) 5 g/l
MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico) 20 g/l
Glucosa (tratada en autoclave por separado) 50 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4} 25 g/l
KH_{2}PO_{4} 0,1 g/l
MgSO_{4} * 7H_{2}O 1,0 g/l
CaCl_{2} * 2H_{2}O 10 mg/l
FeSO_{4} * 7H_{2}O 10 mg/l
MnSO_{4} * H_{2}O 5,0 mg/l
Biotina (filtrada en condiciones estériles) 0,3 mg/l
Tiamina * HCl (filtrada en condiciones estériles) 0,2 mg/l
L-leucina (filtrada en condiciones estériles) 0,1 g/l
CaCO_{3} 25 g/l
El CSL, el MOPS y la solución de sales se llevaron a pH 7 con amoníaco acuoso y se trataron en autoclave. Se añadieron luego el sustrato estéril y las soluciones de vitaminas, así como el CaCO_{3} tratado en autoclave en estado seco.
El cultivo se lleva a cabo en un volumen de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml provisto de placas de desviación. Se añadió kanamicina (25 mg/l). El cultivo se llevó a cabo a 33ºC y humedad atmosférica de 80%.
Después de 72 horas, se determinó la DO a una longitud de onda de medida de 660 nm con un instrumento Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). La cantidad de lisina formada se determinó con un analizador de aminoácidos de Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por cromatografía de intercambio iónico y derivación post-columna con detección mediante ninhidrina.
Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1
Cepa DO Lisina HCl
(660 nm) g/l
DSM5715 7,6 13,5
DSM5715/pEC-K18mob2cstAexp 12,2 16,1
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Mapa del plásmido pEC-K18mob2
Figura 2: Mapa del plásmido pEC-K18mob2cstAexp
Las abreviaturas y designaciones utilizadas tienen el significado siguiente:
Kan:
Gen de resistencia a kanamicina
cstA-exp:
Gen cstA de C. glutamicum
LacZ-alfa:
Fragmento del gen lacZ\alpha de E. coli
LacZ-alfa':
Término 5' del fragmento del gen lacZ\alpha
'LacZ-alfa:
Término 3' del fragmento del gen lacZ\alpha
per:
Gen para control del número de copias de PGA1
oriV:
Origen similar a ColE1 de pMB1
rep:
Región de replicación codificada de plásmido por el plásmido pGA1 de C. glutamicum
RP4mob:
Sitio de movilización de RP4
EcoRI:
Sitio de escisión de la enzima de restricción EcoRI
HindIII:
Sitio de escisión de la enzima de restricción HindIII
Ecl136:II:
Sitio de escisión de la enzima de restricción Ecl136II
XbaI:
Sitio de escisión de la enzima de restricción XbaI
<110> Degussa AG
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencias de nucleótidos que codifican el gen cstA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 000173 BT
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2718
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (200) .. (2515)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen cstA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
3
4
5 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 772
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glytamicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
6
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conrynebacterium glutamicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región de aguas arriba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211>2867
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conrynebacterium glutamicum 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (349) ... (2664)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cstA-Gen
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
10
11
12
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 772
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Conrynebacterium glutamicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
14
15
16
17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Corynebacterium glutamicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador cstA-exp1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caccctactg aacagcttgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador cstA-exp2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagtgcatga gtaagagcca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (10)

1. Vector lanzadera de Escherichia coli DH5alfamcr/pEC-K18mob2cstAexp depositado como DSM 13671 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células].
2. Proceso para la preparación de L-lisina, en el cual se llevan a cabo los pasos siguientes:
a)
fermentación de las bacterias corineformes que producen la L-lisina deseada que tienen ácidos desoxirribonucleicos adicionales del gen cstA, que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que es idéntica al menos en un 91% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2 y que es una proteína A de privación de carbono, o en donde las secuencias de nucleótidos que codifican la misma están sobre-expresadas;
b)
concentración de la L-lisina en el medio o en las células de las bacterias, y
c)
aislamiento de la L-lisina.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual dicha proteína tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en el cual dicho ácido nucleico tiene la secuencia nucleotídica de los nucleótidos 200 a 2515 de SEQ ID NO: 1.
5. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que se emplean bacterias en las cuales genes adicionales del camino de biosíntesis de la L-lisina está sobre-expresado adicionalmente.
6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual se emplea una cepa transformada con un vector plasmídico, y el vector plasmídico lleva la secuencia de nucleótidos que codifica el gen cstA.
7. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual la expresión del polinucleótido que codifica el gen cstA está sobre-expresado, a fin de aumentar la actividad o concentración de la 
\hbox{proteína correspondiente  al menos
en un 10%.}
8. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2 en el cual, para la preparación de L-lisina, se fermentan bacterias corineformes en las cuales está o están sobre-expresados al mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo constituido por
a)
el gen lysC que codifica una aspartato-quinasa resistente a la realimentación,
b)
el gen dapA que codifica dihidrodipicolinato-sintasa,
c)
el gen gap que codifica glicerolaldehido-3-fosfato-deshidrogenasa,
d)
el gen pgk que codifica 3-fosfoglicerato-quinasa,
e)
el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
f)
el gen tpi que codifica triosa-fosfato-isomerasa,
g)
el gen lysE que codifica una proteína de exportación de lisina, y
h)
el gen zwa1 que codifica la proteína Zwa1.
9. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2 en el cual, para la preparación de L-lisina, se fermentan bacterias corineformes en las cuales se eliminan al mismo tiempo uno o más de los genes 
\hbox{seleccionados del  grupo
constituido por}
a)
el gen pck que codifica fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa,
b)
el gen pgi que codifica glucosa-6-fosfato-isomerasa,
c)
el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa,
d)
el gen zwa2 que codifica la proteína Zwa2.
10. Proceso de acuerdo con una o más de las reivindicaciones anteriores, en el cual se emplean microorganismos de la especie Corynebacterium glutamicum.
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