ES2254564T3 - Uso de antagonistas de factor de inhibicion de la leucemia. - Google Patents

Abstract

Utilización de un antagonista del factor inhibidor de la leucemia (LIF), que es un anticuerpo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que padece de una insuficiencia cardiaca para impedir la aparición de o disminuir la hipertrofia.

Description

Uso de antagonistas de factor de inhibición de la leucemia.

Campo de la invención

Esta solicitud se refiere a un procedimiento para modular la función cardiaca en el tratamiento de los trastornos del corazón.

Antecedentes de la invención

La insuficiencia cardiaca afecta aproximadamente a tres millones de americanos, lo que equivale a 400.000 casos cada año. Se trata en la actualidad de una de las principales causas diagnósticas de admisión hospitalaria en los Estados Unidos de América. Los últimos avances en el tratamiento de los trastornos cardiacos agudos, incluyendo el infarto de miocardio, han puesto de manifiesto la existencia de una población de pacientes en expansión que eventualmente desarrollará una insuficiencia cardiaca crónica.

La terapia actual de la insuficiencia cardiaca utiliza principalmente inhibidores de la enzima conversora de la angiotensina (ACE) y diuréticos. Al prolongar la supervivencia una vez instaurada la insuficiencia cardiaca, los inhibidores de ACE parece que aminoran la progresión hacia un estado final de insuficiencia cardiaca y un número importante de pacientes con inhibidores de ACE presentan una insuficiencia cardiaca funcional de clase III. Además, los inhibidores ACE son incapaces de mitigar los síntomas en más del 60% de pacientes con insuficiencia cardiaca y reducen la mortalidad de la insuficiencia cardiaca en aproximadamente sólo un 15-20%. El trasplante de corazón está limitado por la disponibilidad de los donantes de corazón. Además, con la excepción de la digoxina, la administración crónica de agentes inotrópicos positivos no ha resultado sólo en un fármaco útil sino que se ha visto acompañada de efectos adversos, por ejemplo un aumento de arritmias, muerte súbita, u otros efectos adversos relacionados con la supervivencia. Estas deficiencias en la actual terapia sugieren la necesidad de aproximaciones terapéuticas
adicionales.

Numerosos resultados sugieren que la patología de la hipertrofia del músculo cardiaco en el asentamiento de la insuficiencia cardiaca puede ser mortífera. Dicha hipertrofia cardiaca se caracteriza por la dilatación de la cámara ventricular, un aumento de la tonicidad/tensión, un aumento de la longitud versus la amplitud de las células del músculo cardiaco y una disminución de la función y ejecución cardiacas. De hecho, los efectos de los inhibidores de ACE se han propuesto no sólo para descargar el corazón, sino también para inhibir la respuesta hipertrófica patológica que presuntamente se ha asociado al sistema de renina-angiotensina localizado dentro del miocardio.

A nivel celular, el corazón funciona como un sincitio de miocitos rodeado de células de soporte denominadas no-miocitos. Mientras que los no-miocitos son principalmente células de fibroblastos/células mesenquimales, también se incluyen células del músculo liso y células endoteliales. Aunque los miocitos aportan la mayor parte de la masa miocárdica adulta, representan tan sólo un 30% aproximado del total de células presentes en el corazón. Debido a su estrecha relación con los miocitos cardiacos in vivo, los no-miocitos son capaces de influenciar el crecimiento de miocitos y/o su desarrollo. Esta interacción puede llevarse a cabo directamente a través del contacto célula-célula o indirectamente mediante la producción de un factor paracrino. Dicha asociación in vitro es importante ya que tanto los no-miocitos como la matriz extracelular con la que interactúan están aumentados en la hipertrofia miocárdica y en la respuesta a una lesión y al infarto. Estos cambios están asociados con una función miocárdica anómala.

Los miocitos cardiacos dejan de dividirse poco después del nacimiento. Un crecimiento adicional tiene lugar en el proceso hipertrófico en células individuales. Se han desarrollado modelos de cultivo celular de la hipertrofia de miocitos para entender mejor los mecanismos de la hipertrofia de los miocitos cardiacos. Simpson y col., Circ. Res., 51:787-801 (1982); Chien y col., FASEB J., 5:3037- 3046 (1991). La mayoría de los estudios con miocitos cardiacos en cultivo se han diseñado para minimizar la contaminación por los no-miocitos. Véase, por ejemplo, Simpson y Savion, Cir. Cres., 50:101-116 (1982): Libby, J. Mol. Cell. Cardiol., 16:803-811 (1984); Iwaki y col., J. Biol. Chem., 265:13809-13817 (1990).

La hipertrofia de los miocitos adultos del ventrículo cardiacos es una respuesta a diversas condiciones que conducen a una sobrecarga crónica. Esta respuesta se caracteriza por un aumento en el tamaño de la célula de miocito y en el contenido de las proteínas contráctiles sin la concomitante división celular, y en la activación de genes embrionales, incluyendo el gen del péptido natriurético atrial (ANP) Chien y col., supra. La hipertrofia de miocitos adultos es inicialmente beneficiosa como una respuesta a corto plazo frente a la función cardiaca alterada al permitir una disminución de la carga sobre las fibras musculares individuales. Sin embargo, con una sobrecarga a largo plazo, las células hipertrofiadas acaban por deteriorarse y mueren. Katz, Heart Failure, en Katz AM, ed., Physiology of the Heart (New York: Raven Press, 1992) pp. 638- 68.

Las células endoteliales, las células del músculo liso y las células de fibroblastos/células mesenquimales se hallan en estrecho contacto con los miocitos en el corazón. Nag, Cytobios, 28:41-61 (1980). En los estudios in vitro se ha indicado que los factores paracrinos producidos por estas células de soporte no-miocitos pueden estar implicados en el desarrollo de la hipertrofia. La identificación de dichos factores continúa siendo un reto principal en la biología y medicina. Chien y col., Science, 260:916-917 (1993). Véase también Chien y col., Annu Rev. Physiol., S5:77-95 (1993), respecto a la utilización de un sistema de ensayo in vitro para la hipertrofia de células del miocardio con el fin de aislar y caracterizar nuevas actividades que puedan mediar dicha importante respuesta fisiológica.

Se han desarrollado modelos de cultivo celular para el estudio de la hipertrofia y sus causas. Así, por ejemplo, las células madre embrionales de ratón totipotentes se diferencian en cuerpos embrioides quísticos multicelulares cuando se cultivan en ausencia de una capa nodriza de fibroblastos o mediante eliminación del factor inhibidor de leucemia (LIF). Robbins y col., J. Biol. Chem., 265:11905- 11909 (1990). Ya que dichos cuerpos embrioides expresan y liberan marcadores cardiacos específicos (Robbins y col., supra; Doetschman y col., J. Embryol. Exp. Morphol., 87:27-45 [1985]; Miller-Hance y col., J. Biol. Chem., 268:25244-25252 [1993]), deben de servir como una fuente valiosa de factores que pueden inducir una respuesta hipertrófica in vitro. Chien, Science, supra; Miller-Hance y col., supra.

Además, Long y col., Cell Reg., 2:1081-1095 (1991), descubrieron que los no- miocitos cardiacos cultivados de rata neonata, que en un principio eran de tipo fibroblasto, producían una proteína no identificada que también inducía la hipertrofia de miocitos cardiacos in vitro. Este factor unido a la Sepharose-heparina, que presentaba un peso molecular aparente de 45 a 50 KD, fue incapaz de estimular la hidrólisis del fosfoinositol. Los experimentos con el antisuero neutralizante contra el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de necrosis tumoral alfa, los factores de crecimiento de fibroblastos acídicos y básicos y el factor del crecimiento transformante-beta 1, eliminaron dichos factores de crecimiento como candidatos posibles.

Se ha demostrado que la endotelina afecta a las células del corazón tanto in vivo como in vitro. En el endotelio in vivo está presente en el miocardio atrial y en el ventricular tanto en corazones sanos como en enfermos, e incrementa la actividad inotrópica miocárdica, la proliferación del músculo liso vascular y la vasoconstricción coronaria. Wei y col., Circulation, 89: 1580-1586 (1994). La endotelina in vivo estimula múltiples vías de señalización celular en miocitos cardiacos adultos en cultivo. Hilal-Danden y col., Mol. Pharm., 45:1183-1190 (1994); Jones y col., Am. J. Physiol., (Heart Circ. Physiol. 32) 263:H1447-H1454 [1992]). Diversos investigadores han demostrado que la endotelina-1, de la cual se sabe se produce en las células endoteliales, induce la hipertrofia de los miocitos cardiacos in vitro. Shubeita y col., J. Biol. Chem., 265:20555-20562 (1990); Ito y col., Circ. Res., 69: 209-215 (1991); Suzuki y col., J. Cardiovasc., Pharmacol., 17 supl. 7: S182-S186 (1991). Véase también la patente americana U.S. 5.344.644 publicada el 6 de Septiembre de 1994.

El LIF, también conocido como el factor inhibidor de leucocitos, el factor inductor de la diferenciación (DIF, factor-D), el factor estimulador de hepatocitos (HSF-II, HDF-III), y el inhibidor LPL derivado del melanoma (MLPL), dependiendo de su actividad o efecto particular (Hilton y col., J. Cell Biochem, 46:21-26 [1991]), también ha sido identificado como el factor de diferenciación neuronal (CDF) derivado de cultivos celulares de corazón de rata neonata con miocitos y no-miocitos. Yammamori y col., Science, 246:1412-1416 (1989). Además, el LIF se ha hallado que es útil para la protección, inhibición y prevención de los efectos deletéreos de las especies de oxígeno reactivas, así como en la prevención del infarto de miocardio y en la protección de tejidos isquémicos. Patente americana U.S. 5.370.870. Por último, el LIF y la cardiotrofina-1 (CT-1), otro miembro de la familia de las proteínas que se unen a los receptores GH/citoquina, muestran la mayor actividad hipertrófica de esta familia de proteínas en los miocitos cardiacos de rata neonata en cultivo, y además inducen una morfología similar. Pennica y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1142-1146 (1995).

Resumen de la invención

En la presente invención se demuestra que los no-miocitos producen factores hipertróficos identificados como el LIF y la endotelina. Según ello, la invención proporciona una utilización de un antagonista del factor inhibidor de la leucemia (LIF), que es un anticuerpo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que sufre una insuficiencia cardiaca experimental, con el fin de prevenir o disminuir la hipertrofia.

Descripción resumida de las Figuras

La Figura 1 describe el efecto del medio condicionado de células no-miocitos (NCM) de ratas neonatas sobre el tamaño de los miocitos cardiacos de ratas neonatas en cultivo, expresado como el valor de hipertrofia, y la producción de ANP. Los miocitos se trataron con NCM durante 48 horas. El medio de cultivo se analizó para ANP (Fig. 1B) y las células se tiñeron con cristal violeta y se puntuó su hipertrofia (Fig. 1A). A los controles no tratados se les dio un valor de 3 y a las células con máxima hipertrofia de 7. Los resultados representan la media y el error estándar de tres experimentos realizados dos veces y por duplicado.

La Figura 2 describe la aparición a diferentes tiempos de la actividad hipertrófica en NCM cardiacos de rata neonata. Se cultivaron no-miocitos cardiacos de rata neonata de primer pasaje en medio con suero al 10% durante 5 días, luego se lavaron dos veces en medio sin suero. El medio de ensayo se añadió y se recogieron alícuotas después del cultivo durante los tiempos indicados. Los resultados representan la media y el error estándar de tres experimentos realizados dos veces y por duplicado.

La Figura 3 muestra el efecto de BQ-123, del anticuerpo monoclonal LIF (Mab) D62.3.2 y de su combinación sobre la hipertrofia de miocitos inducida por NCM cardiacos de rata neonata. Los miocitos se trataron con NCM (círculos rellenos), NCM y 100 \mumol/l de BQ-123 (círculos vacíos), NCM y 50 \mug/ml de Mab de LIF D62.3.2 (cuadrados vacíos), NCM y 100 \mumol/l de BQ-123 y 50 \mug/ml de Mab de LIF D62.3.2 (triángulos vacíos). El medio de cultivo se ensayó para ANP (Fig. 3B) y se tiñeron las células y se valoró su hipertrofia (Fig. 3A). Los resultados en la Fig. 3A representan la media y el error estándar de tres experimentos realizados dos veces y por duplicado. El valor de p <0,05 mediante el análisis de co-varianza. Los resultados en la Fig. 3B representan un experimento realizado dos veces y por triplicado.

La Figura 4 muestra el efecto de BQ-123 sobre la hipertrofia de miocitos cardiacos inducida por la endotelina-1, LIF de ratón, la fenilefrina y CT-1. Los miocitos cardiacos de rata cultivados se trataron con BQ-123 a 0 \mumol/l (círculos rellenos), 100 \muml/l (círculos vacíos), 10 \mumol/l (cuadrados vacíos) y 1 \mumol/l (triángulos vacíos) en presencia de endotelina-1 (a), LIF de ratón (b), fenilefrina (c), y CT-1 (d). Los resultados representan la media y el error estándar de tres experimentos realizados dos veces y por duplicado.

La Figura 5 muestra el efecto de Mab de LIF D62.3.2 sobre la hipertrofia de miocitos cardiacos inducida por endotelina-1, LIF de ratón, fenilefrina, y CT-1. Los miocitos de rata cardiaca neonata cultivados se trataron con
Mab de LIF D62.3.2 a 0 \mug/ml (círculos rellenos), 50 \mug/ml (círculos abiertos), 5 \mug/ml (cuadrados vacíos) y
0,5 \mug/ml (triángulos vacíos) en presencia de endotelina-1 (a), LIF de ratón (b), fenilefrina (d) y CT-1 (e). Los resultados representan la media y el error estándar de tres experimentos realizados dos veces y por duplicado.

La Figura 6 muestra el efecto de LIF y de la endotelina sobre la hipertrofia de miocitos cardiacos de rata neonata y la producción de ANP. Los miocitos se trataron con LIF de ratón (círculos vacíos), endotelina-1 (círculos rellenos) y una combinación de LIF de ratón y endotelina-1 (triángulos rellenos). El medio de ensayo se ensayó para ANP (Fig. 6A) y los miocitos se tiñeron con cristal violeta y se valoró el tamaño celular (Fig. 6B). Los resultados representan la media y el error estándar de tres experimentos realizados dos veces y por duplicado. La concentración de la combinación de LIF y de endotelina se determinó añadiendo las concentraciones de cada agente.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Por lo general, las siguientes palabras o frases tienen la definición indicada cuando se utilizan en la descripción, ejemplos y reivindicaciones:

"Antagonista LIF" tal como se utiliza aquí hace referencia a cualquier molécula que bloquee o evite la interacción entre LIF y sus receptores respectivos. Dichos antagonistas logran este efecto de formas diversas. Por ejemplo, una clase de antagonistas se unirá a LIF con afinidad y especificidad suficientes para neutralizar LIF de modo que no tenga ningún efecto sobre sus receptores respectivos. Se incluyen dentro de este grupo de antagonistas los anticuerpos. Otra clase de antagonistas son las moléculas basadas en una interacción entre LIF y sus respectivos receptores. Dichas moléculas incluyen fragmentos del receptor LIF o de moléculas bio-orgánicas pequeñas, p.ej., los péptidomiméticos, que impedirán la interacción entre el receptor respectivo y LIF. El LIF se describe por ejemplo, en Metelf, Growth Factors, 7:169-173 (1992) y Kurzrock y col., Endocrine Reviews, 12:208-217 (1991). La activación del receptor LIF ha demostrado que estimula las tirosinas quinasas intracelulares. Kishimoto y col., Science, 258:593-597 (1992). Diversos laboratorios han mostrado que los fibroblastos en cultivo pueden producir LIF (Ellas y col., Am. J. Physiol. (Lung Cell Mol. Physiol 10), 266: L426-435 [1994]; Lorenzo y col., Clin. Immunol Immunopath., 70:260-265 [1994]; Hamilton y col., J. Immunol., 150:1496-1502 [1993]).

El antagonista de LIF influencia el crecimiento cardiaco o la actividad hipertrófica, cuantificada por ejemplo por la liberación de péptido natriurético atrial (ANP) o por el ensayo de hipertrofia de miocitos descrito aquí utilizando un medio y una densidad de siembra específicos, y preferentemente utilizando la tinción de cristal violeta para la lectura. La función deseada de un antagonista es proporcionar el resultado deseado en una situación de equilibrio entre el crecimiento y la reducción del tejido muscular cardiaco.

El antagonista es un anticuerpo, con las propiedades deseadas de unión a LIF y con la facultad de evitar su interacción con su receptor respectivo. Dichos anticuerpos se generan preferentemente contra LIF-humano recombinante que son neutralizantes contra la hipertrofia inducida tanto por LIF humano como de ratón, pero no contra la hipertrofia inducida por el CT-1, ni la endotelina ni la fenilefrina. Por ejemplo, en el ejemplo de más abajo, se identificaron tres anticuerpos monoclonales que cumplían dichos criterios, cada uno de los cuales reconoce un determinante antigénico distinto sobre el LIF humano recombinante. Todos estos tres anticuerpos neutralizaron la hipertrofia de miocitos inducida por el LIF de ratón y el humano y dos de ellos fueron equipotentes en la inhibición de la hipertrofia inducida por NCM. Uno o más de estos anticuerpos se describen en la patente internacional WO 93/23556, publicada el 25 de Noviembre de 1993; Kim y col., J. Immunol. Meth., 156:9-17 (1992); y Alphonso y col., J. Leukocyte Biology (Abstracts del 28th National Meeting of the Society for Leukocyte Biology, vol., 0, nº SP.2 (1991) (NY, NY, p. 49) (Mabs D4.16.9, D25.1.4 y D62.3.2).

Los "anticuerpos" (Abs) y las "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan una especificidad de unión con un antígeno específico, las inmunoglobulina incluyen tanto anticuerpos y otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos de la última clase son, por ejemplo, producidos a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles superiores por los miclomas.

Los "anticuerpos y las inmunoglobulinas" son generalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulina distintos. Cada cadena pesada o ligera tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por cierto número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de cadena pesada. Los residuos aminoacídicos particulares se cree que forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Clothia y col., J. Mol. Biol., 186:631-663 [10985]; Novotny y haber, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:4592-4596 (1985)).

El término "variable" hace referencia al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpo y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo determinado por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de pesada. Las regiones más conservadas de las porciones de los dominios variables se denominan la región de entramado (FR). Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan una configuración de hoja-\beta, conectadas por tres CDRs, que forman bucles conectores, y en algunos casos forman parte de la estructura en hoja-\beta. Las CDRs en cada una de las cadenas se mantienen unidas en proximidad estrecha por las regiones FR y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión antigénico de los anticuerpos (véase Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fith Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo con un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión antigénico y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar rápidamente. El tratamiento con pepsina rinde un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación antigénica y es todavía capaz de unirse al antígeno.

"Fv" es el fragmento mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y unión al antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena ligera y una cadena pesada, asociados no covalentemente. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDRs confieren especificidad de unión antigénica con el anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda sólo tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad inferior que todo el sitio de unión.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi-terminal del dominio pesado CHI incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación para Fab', en la que los residuos de cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpo se producen originalmente como parejas de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplantes químicos de fragmentos de anti-
cuerpo.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden corresponder a uno de los dos tipos claramente distintos denominados Kappa (\kappa) y lambda (\lambda), según las secuencias aminoacídicas de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia aminoacídica del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden distribuirse en diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE,
IgG e IgM y algunas de éstas pueden subdividirse en subclases (isotipos), p.ej., IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1 e IgA-2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu, respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de clases diferentes de inmunoglobulinas son bien conocidas en la materia.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y abarca específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos antagonistas) y las composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí hace referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto en posibles mutaciones que ocurren de forma natural y que pueden estar presentes en cantidades mínimas. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos al estar dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes distintos (epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un sólo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que se sintetizan mediante el cultivo de hibridomas, por lo que no se contaminen por otras inmuno-
globulinas.

Los anticuerpos monoclonales incluyen aquí anticuerpos híbridos y anticuerpos recombinantes producidos por el ayuste de un dominio variable (incluyendo el hipervariable) de un anticuerpo anti-LIF con un dominio constante (p.ej., anticuerpos "humanizados"), o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente del origen o la clase de inmunoglobulina o la denominación de subclase, así como fragmentos de anticuerpo (p.ej., Fab, F(ab')2 y Fv), siempre que presenten la actividad biológica deseada. [Véase, p.ej., Cabilly y col., patente americana U.S. 4.816.567; Mage y Lamoy, en Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].

El término modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como el obtenido de una población esencialmente homogénea de anticuerpos, y no debe considerarse que sea necesaria la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpo monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden producirse por el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o pueden producirse mediante procedimientos del DNA recombinantes (Cabilly y col., supra).

Los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente "anticuerpos quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que el conjunto de cadena ligera/pesada es idéntica con u homóloga con las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que las cadenas restantes son idénticas u homólogas con las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (Cabilly y col., supra; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no-humanos (p.ej., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de lo mismo (como los Fv, Fab, Fab', F(ab')2, u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no-humana. En la mayoría de los casos, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del recipiente se reemplazan por residuos de CDR de especies no-humanas (anticuerpo donante) como el ratón, rata, o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de entramado Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no-humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se hallan ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR ni enlas secuencias de entramado importadas. Estas modificaciones se realizan para ajustar y optimizar la realización del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá esencialmente todos o al menos uno, generalmente dos, dominios variables, en los que todas o esencialmente todas las regiones CDR corresponden con las de una inmunoglobulina no-humana y todas o esencialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también de forma óptima al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), generalmente la de una inmunoglobulina. Para detalles adicionales, véase Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann y col., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

El término "no-inmunogénico en el hombre" significa que tras el contacto del polipéptido en un vehículo aceptable farmacéuticamente y en una cantidad efectiva terapéuticamente con el tejido adecuado de un humano, no se demuestra ningún estado de sensibilidad o resistencia hacia el polipéptido después de una segunda administración del polipéptido al cabo de un tiempo de latencia adecuado (p.ej., de 8 a 14 días).

La "insuficiencia cardiaca" hace referencia a una anomalía de la función cardiaca en la que el corazón no bombea sangre a la velocidad necesaria para los requerimientos metabólicos de los tejidos. La insuficiencia cardiaco puede estar causada por diversos factores, incluyendo las formas isquémicas, congénitas, reumáticas o idiopáticas.

El término "tratamiento" hace referencia al tratamiento terapéutico y a las medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o aminorar (reducir) la aparición de hipertrofia. Aquellos que necesitan de un tratamiento incluyen los que ya presentan el trastorno como los propensos a desarrollarlo o aquellos en quienes se ha de prevenir dicho trastorno. La hipertrofia puede originarse por diversas causas, incluyendo las idiopáticas, cardiotróficas o las miotróficas, o como un resultado de la isquemia o daños isquémicos como el infarto de miocardio. Por lo general, el tratamiento se realiza para parar o aminorar la progresión de la hipertrofia especialmente después de la lesión cardiaca, por ejemplo después de una isquemia. Preferentemente, para el tratamiento de los infartos de miocardio, se proporciona inmediatamente el o los agentes después del infarto de miocardio para prevenir o disminuir la hipertrofia.

La administración "crónica" hace referencia a la administración del o los agentes de modo continuo en oposición al modo agudo, para mantener el efecto anti-hipertrófico inicial durante un periodo de tiempo largo.

El término "mamífero", a propósito del tratamiento, hace referencia a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo el hombre, los animales domésticos y de granja, los del zoológico, o las mascotas, como los perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero aquí es el hombre.

Tal como se utiliza aquí, "inhibidor de ACE" hace referencia a los fármacos inhibidores de la enzima conversora de la angiotensina que impiden la conversión de la angiotensina I a la II. Los inhibidores de ACE pueden ser beneficiosos para la insuficiencia cardiaca congestiva al reducir la resistencia vascular sistémica y aliviar la congestión circulatoria. Los inhibidores de ACE incluyen pero no se limitan a los designados por las marcas Accupril® (quinapril), Altace® (ramipril), Capoten® (captopril), Lotensin® (benazepril), Monopril® (fosinopril), Prinivil® (lisinopril), Vasotec® (enalapril) y Zestril® (lisinopril). Un ejemplo del inhibidor de ACE es que se vende bajo la marca Capoten®. Referido en la forma genérica como captopril, este inhibidor de ACE se designa químicamente como 1-[(2S)-3-mercapto-2-metilpropionil]-L- prolina.

II. Modos para la práctica de la invención

La invención constituye un procedimiento para el tratamiento de un mamífero con una insuficiencia cardiaca, a quien se le administra de forma crónica una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de LIF.

Los componentes adicionales opcionales incluyen un inhibidor de la cardiotrofina como por ejemplo un antagonista de CT-1, un inhibidor de ACE, como el captopril, y/o la hormona de crecimiento humana y/o el IGF-I en el caso de una insuficiencia cardiaca congestiva, u otro factor anti-hipertrófico o miocardiotrófico en el caso de otros tipos de insuficiencia cardiaca o trastorno cardiaco.

1. Preparación e identificación de antagonistas A. Preparación de anticuerpos (i) Materiales de partida y procedimientos

Las inmunoglobulinas (Ig) y ciertas variantes de lo mismo son conocidas y muchas de ellas se han preparado mediante el cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, véase la patente americana U.S. 4.745.055; la patente europea EP 256.654; la patente europea EP 120.694; la patente europea EP 120.023; la patente europea EP 255.694; la patente europea EP 266.663; la patente internacional WO 88/03559; Faulkner y col., Nature, 298:286 (1982); Morrison, J. Immun., 123:793 (1979); Koehler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2197 (1980); Raso y col., Cancer Res., 41:2073 (1981); Morrison y col., Ann. Rev. Immunol., 2:239 (1984); Morrison, Science, 229:1202 (1985); y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984). Las cadenas de inmunoglobulinas barajadas son también conocidas. Véase, por ejemplo, la patente americana U.S. 4.444.878; la patente internacional WO 88/03565; y la patente europea EP 68.763 y las referencias citadas aquí. La porción de inmunoglobulina en las quimeras de la presente invención puede obtenerse a partir de los subtipos IgG1-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferentemente de IgG-1 o IgG-3.

(ii) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales contra LIF se producen generalmente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de LIF y un adyuvante. Puede ser útil conjugar LIF o un fragmento que contenga la secuencia aminoacídica diana con una proteína que sea inmunogénica en las especies a inmunizar, p.ej., la hemocianina de la lapa, la seroalbúmina, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de la tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o un agente derivante, por ejemplo, el éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de cisteína). La N- hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina), el glutaraldehído, el anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N-CaNR, en donde R y R^{1} son grupos alquilo dis-
tintos.

Los animales se inmunizaron contra el polipéptido o el fragmento de LIF, los conjugados inmunogénicos o los derivados mediante combinación de 1 mg o 1 mg del péptido o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes más tarde, los animales se re-estimularon con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en sitios múltiples. Al cabo de 7 a 14 días más tarde, los animales se sangraron y se analizó el suero para la titulación del anticuerpo contra LIF o un fragmento de lo mismo. Los animales se re-estimularon hasta alcanzar niveles de titulación en la meseta de la curva de titulación. Preferentemente, el animal se re-estimuló con el conjugado del mismo LIF o un fragmento de éste, pero conjugado con una proteína distinta y/o a través de un reactivo de unión distinto. Los conjugados también se pueden realizar en el cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También, los agentes agregantes como el alumbre son adecuados para estimular la respuesta inmune.

(iii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la populación son idénticos excepto por mutaciones posibles que suceden de forma natural y que pueden estar presentes en cantidades mínimas. Por ello, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no pertenece a una mezcla de anticuerpos discretos.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales utilizados para la práctica de la presente invención pueden generarse utilizando el procedimiento del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o pueden realizarse mediante procedimientos dl DNA recombinante (Cabilly y col., supra).

En el procedimiento del hibridoma, un ratón u otro animal huésped adecuado, como un hámster, se inmuniza tal como se ha descrito anteriormente para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al LIF o a un fragmento de éste utilizado en la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuación, se fusionan los linfocitos con las células de mieloma utilizando un agente fusionante adecuado, como el polietilén glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 [Academic Press, 1986).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células del mieloma parental, no fusionadas. Por ejemplo, si las células del mieloma parental carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HPGRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá por lo general hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de las células deficientes en
HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan de forma eficiente, soportan un nivel de producción elevado y estable del anticuerpo por las células productoras del anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las murinas, como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 disponibles por el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland
USA.

El medio de cultivo en los que las células de hibridomas crecen se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra LIF. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridomas se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980).

En primer lugar, se identifican las células de hibridomas que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, y a continuación se pueden subclonar los clones mediante procedimientos de dilución limitada y crecer mediante procedimientos estándares (Goding, supra). Un medio de cultivo adecuado para dicho propósito incluye, por ejemplo, el D-MEM o el RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecerse in vitro como tumores de ascitas en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascítico, o del suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales como por ejemplo, la proteína A-Sepharose, la cromatografía en hidroxiapatita, la electroforesis en gel, la diálisis, o la cromatografía de afinidad.

El DNA que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se aisló fácilmente y secuenció utilizando procedimientos convencionales (p.ej., utilizando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridomas de la invención sirven como una fuente preferida para dicho DNA. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en vectores de expresión, que a continuación se transfectarán en células huésped como las células E. coli, células COS de simio, las células de ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma que de otra manera no producen proteína inmunoglobulínica, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinante. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias del DNA que codifica el anticuerpo incluyen Skerra y col., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) y Plückthum, Immunol. Reys., 130:151-188
(1992).

El DNA también puede modificarse, por ejemplo, mediante sustitución de la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homólogas (Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984), o mediante unión covalente con toda la secuencia codificante de la inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no-inmunoglobulínico. De esta manera, los anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" se preparan con la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-LIF o anti-endotelina.

De forma característica, los polipéptidos no-inumnoglobulínicos se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación antigénica de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprenda un sitio de combinación antigénica que tenga la especificidad para un LIF y otros sitio de combinación antigénica con la especificidad por un antígeno distinto.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también se pueden preparar in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de unión cruzada. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden generarse utilizando una reacción de intercambio de disulfuros o mediante la formación de un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato.

(iv) Anticuerpos humanizados

Los procedimientos para la humanización de anticuerpos no-humanizados son bien conocidos en la materia. Por lo general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos a partir de una fuente no-humana. Estos residuos aminoacídicos no-humanos se refieren a menudo como residuos "de importación", que típicamente se toman de un dominio variable "de importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y col., (Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science 239, 1534-1536 (1988), mediante sustitución de CDRs de roedores o las secuencias CDRs en lugar de las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Según ello, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly y col., supra), en donde menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizar en la realización de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el procedimiento denominado "del mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se rastrea contra toda la librería de secuencias de dominio variables humanas. Se acepta como secuencia de entramado humana (FR) para el anticuerpo humanizado la secuencia humana más cercana a la de roedor (Sims y col., J. Immunol., 151:2296 [1993]; Clothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 [1987]). Otro procedimiento utiliza una región de entramado particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma región de entramado puede utilizarse para diferentes anticuerpos humanizados (Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 [1982]; Presta y col., J. Immunol., 151:2623 [1993]).

Es además importante que los anticuerpos se humanicen con retención de una alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son bien conocidos por los expertos en la materia. Están disponibles programas informáticos que muestran y expresan estructuras tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas figuras permite el análisis de la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De este modo, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de secuencias consenso y de importación, a fin de alcanzar las características deseadas del anticuerpo, como una afinidad aumentada por el o los antígenos diana. Por lo general, los residuos CDR están directa y más esencialmente implicados en influenciar la unión al antígeno.

(v) Anticuerpos humanos

Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse por el procedimiento del hibridoma. Las líneas celulares de miclomas humanos y de heteromielomas ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito, por ejemplo, por Kozbor, J. Immunol., 133, 3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner y col., J. Immunol., 147:86-95 (1991).

Actualmente es posible producir animales transgénicos (p.ej., ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y en mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición total de la producción endógena. La transferencia de una serie de genes de inmunoglobulina en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos después del estímulo antigénico. Véase, p.ej., Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y col., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immuno, 7:33 (1993).

Alternativamente, la tecnología de expresión en fagos (McCafferty y col., Nature, 348:552-553 [190]) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, de repertorios de genes de dominios variables de inmunoglobulinas (V) de donantes no-inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominios V de anticuerpos se clonan en la misma pauta de lectura en un gen mayor o menor de proteínas de la cubierta de un bacteriófago filamentoso, como el M13 o el fd, y se expresan como fragmentos de anticuerpo funcional en la superficie de la partícula fágica. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de DNA de cadena sencilla del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gen que codifica las el anticuerpo que presenta dichas propiedades. En consecuencia, el fago mimetiza alguna de estas propiedades de la célula B. La expresión en fagos puede realizarse de diversas formas; para una revisión véase, p.ej., Johnson y Chiswell, Curr. Op. Struct. Biol., 3.564-571 (1993). Se pueden utilizarse diversos segmentos de genes V para la expresión en fagos. Clackson y col., Nature, 352.624-628 (1991) utilizaron una pequeña librería combinatorial de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados con hapteno-2-feniloxazol-5-uno y aislaron una serie de anticuerpos. Un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados puede construirse y es posible aislar los anticuerpos contra diversos antígenos (incluyendo los auto-antígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), o Griffith y col., EMBO J., 12:725- 734 (1993).

En una respuesta inmune natural, los genes de anticuerpos acumulan mutaciones a una tasa elevada (hipermutación somática). Algunos de estos cambios introducidos conferirán una mayor afinidad, y las células B que expresen en la superficie inmunoglobulina de alta afinidad se replicarán preferentemente y diferenciarán durante los siguientes estímulos antigénicos. Este proceso natural puede ser simulado utilizando la técnica conocida como "barajamiento de cadenas" (Marks y col., Bio/Technology, 10:779-793 (1992)). En este procedimiento, la afinidad de anticuerpos humanos "primarios" obtenidos por expresión en fagos puede mejorarse mediante reemplazamiento secuencial de genes de la región V de cadena ligera y pesada con los repertorios de variantes naturales (repertorios) de genes de dominios V obtenidos de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el rango nM. Una estrategia para realizar repertorios muy amplios de anticuerpos de fagos se ha descrito por Waterhouse y col., Nucl. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993).

El barajamiento de cadenas puede también utilizarse para derivar anticuerpos humanos de anticuerpos de roedor, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares con el anticuerpo de roedor inicial. Según este procedimiento, que también es referido como "impronta epitópica", el gen de dominio V de cadena ligera o pesada de los anticuerpos de roedor obtenido mediante la técnica de expresión en fagos se reemplaza por un repertorio de genes de dominio V humanos, creando quimeras roedor-humanas. La selección sobre el antígeno da como resultado en el aislamiento de dominios V humanos capaces de restaurar un sitio de unión antigénica funcional, es decir, el epitopo dirige (imprinta) la elección de la pareja. Cuando el proceso se repite con el fin de reemplazar el dominio V de roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase la PCT Wo 93/06213, publicada el 1 de Abril de 1993). Al contrario que la humanización tradicional de anticuerpos de roedor por injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, sin residuos de la región de entramado o de la CDR de origen de roedor.

(vi) Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferentemente los anticuerpos humanos o humanizados que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos distintos. En el caso presente, una de las especificidades es para el LIF, la otra para una endotelina. Los procedimientos para generar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la materia.

Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadenas pesada-ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen especicificidades distintas (Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 [1983]). Debido a la reordenación aleatoria de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo distintas, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, requiere bastante tiempo, y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se describen en la patente internacional WO 93/08829 publicada el 13 de Mayo de 1993 y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con una aproximación distinta y más preferida, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente se realiza con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de la bisagra y las regiones CH2 y CH3. Es preferible tener la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobluina, se insertan en vectores de expresión por separado, y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones en donde se utilizan proporciones desiguales de los tres polipéptidos en la construcción para proporcionar un rendimiento máximo. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o para las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la producción de al menos dos cadenas polipeptídicas en iguales proporciones dé como resultado rendimientos elevados, o cuando las proporciones no sean importantes. En una realización preferida de esta aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y una pareja de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (lo que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado procedente de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, al igual que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una vía de separación fácil.

Para detalles adicionales sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

(vii) Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados se hallan también dentro del ámbito de la invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune contra células no deseadas (patente americana U.S. 4.676.980), y para el tratamiento de la infección por VIH (patente internacional WO 91/00360; patente internacional WO 92/00373; y patente europea EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden generarse utilizando cualquier procedimiento de unión adecuado. Los agentes de unión adecuados son bien conocidos en la materia, y se describen en la patente americana U.S. 4.676.980, junto con diversas técnicas de unión.

B. Purificación de antagonistas

Las técnicas utilizadas para la separación de antagonista(s) de las impurezas dependen del tipo de partículas antagonistas que se utilice. Estos procedimientos pueden incluir, por ejemplo, una o más etapas seleccionadas de entre la cromatografía de afinidad, el fraccionamiento en columna de intercambio iónico (p.ej., sobre matrices de DEAE o que contengan grupos carboximetil o sulfopropil), cromatografía en Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lentejas de lectina-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Eter Toyopearl, Butil Toyopearl, Fenil Toyopearl, o proteína A-Sepharose, cromatografía de SDS- PAGE, cromatografía de sílice, cromatoenfoque, HPLC de fase inversa (p.ej., gel de sílice con grupos alifáticos añadidos), filtración en gel utilizando p.ej., cribado molecular con Sephadex o cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía en columnas que se unen selectivamente al antagonista de LIF o al antagonista de la endotelina, y precipitación con etanol o sulfato amónico. Se puede incluir un inhibidor de proteasas en cualquiera de las etapas para inhibir la proteolisis. Ejemplos de inhibidores de proteasas adecuados incluyen el fluoruro de fenilmetilsulfonil (PMSF), la leupeptina, la pepstatina, la aprotinina, 4-(2-aminoetil)- bencenosulfonil fluoruro hidrocloruro-bestatin, quimostatina y la benzamidina.

D. Ensayo de hipertrofia

Preferentemente, se utiliza un ensayo miniaturizado para analizar la actividad inhibidora de la hipertrofia de los posibles antagonistas. En este ensayo, el medio que se utiliza permite la supervivencia a una densidad de siembra en placa baja sin suero. Sembrando las placas directamente en este medio, se eliminan las etapas de lavado de modo que se eliminan menos células. La densidad de siembra en la placa es importante, cuanto menor es la densidad menor es la supervivencia; a mayor densidad, los miocitos inician la auto-inducción de la hipertrofia. Las etapas implicadas son:

(a) siembra en placas de 96 pocillos con una suspensión de miocitos a una densidad celular de aproximadamente 7,5x10^{4} células por ml en medio D-MEM/F12 suplementado con al menos insulina, transferrina y aprotinina;

(b) cultivo de las células en presencia de LIF;

(c) adición de la sustancia a ser analizada (el antagonista posible de LIF);

(d) cultivo de las células con la sustancia; y

(e) cuantificación de la hipertrofia.

El medio puede suplementarse con elementos adicionales como el EGF que aseguren una viabilidad mayor de las células, aunque dichos suplementos no son esenciales. El medio D-MEM/F12 está disponible en GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, y consiste en uno de los siguientes medios:

\vskip1.000000\baselineskip

Componente	11320	11321	11330	11331	12400	12500
	1xlíquido	1xlíquido	1xlíquido	1xlíquido	polvo	polvo
	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)
Aminoácidos
L-alanina	4,45	4,45	4,45	4,45	4,45	4,45
L-Arginina-HCl	147,50	147,50	147,50	147,50	147,50	147,50
L-Asparagina.H_{2}O	7,50	7,50	7,50	7,50	7,50	7,50
Acido L-aspártico	6,65	6,65	6,65	6,65	6,65	6,65
L-Cisteína.HCl-H_{2}O	17,56	17,56	17,56	17,56	17,56	17,56

(Continuación)

Componente	11320	11321	11330	11331	12400	12500
	1xlíquido	1xlíquido	1xlíquido	1xlíquido	polvo	polvo
	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)
L-Cisteína.2HCl	31,29	31,29	31,29	31,29	31,29	31,29
Ácido L-Glutámico	7,35	7,35	7,35	7,35	7,35	7,35
L-Glutamina	365,055	365,055	365,055	365,055	365,055	365,055
Glicina	18,75	18,75	18,75	18,75	18,75	18,75
L-Histidina.HCl.H_{2}O	31,48	31,48	31,48	31,48	31,48	31,48
L-Isoleucina	54,47	54,47	54,47	54,47	54,47	54,47
L-Leucina	59,05	59,05	59,05	59,05	59,05	59,05
L-Lisina.HCl	91,25	91,25	91,25	91,25	91,25	91,25
L-Metionina	17,24	17,24	17,24	17,24	17,24	17,24
L-Fenilalanina	35,48	35,48	35,48	35,48	35,48	35,48
L-Prolina	17,25	17,25	17,25	17,25	17,25	17,25
L-Serina	26,25	26,25	26,25	26,25	26,25	26,25
L-Treonina	53,45	53,45	53,45	53,45	53,45	53,45
L-Triptófano	9,02	9,02	9,02	9,02	9,02	9,02
L-Tirosina.2Na.2H_{2}O	55,79	55,79	55,79	55,79	55,79	55,79
L-Valina	52,85	52,85	52,85	52,85	52,85	52,85
Sales inorgánicas
Anhídrido CaCl_{2}	116,60	116,60	116,60	116,60	116,60	116,60
CuSO_{4}.5H_{2}O	0,0013	0,0013	0,0013	0,0013	0,0013	0,0013
Fe(NO_{3})_{3}.9H_{2}O	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
FeSO_{4}.7H_{2}O	0,417	0,417	0,417	0,417	0,417	0,417
KCl	311,80	311,80	311,80	311,80	311,80	311,80
MgCl_{2}	28,64	28,64	28,64	28,64	28,64	28,64
MgSO_{4}	48,84	48,84	48,84	48,84	48,84	48,84
NaCl	6999,50	6999,50	6999,50	6999,50	6999,50	6999,50
NaHCO_{3}	2438,00	2438,00	2438,00	2438,00	- -	- -
NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O	62,50	62,50	62,50	- -	62,50	62,50
Na_{2}HPO_{4}	71,02	71,02	71,02	- -	71,02	71,02
ZnSO_{4}.7H_{2}O	0,432	0,432	0,432	0,432	0,432	0,432

(Continuación)

Componente	11320	11321	11330	11331	12400	12500
	1xlíquido	1xlíquido	1xlíquido	1xlíquido	polvo	polvo
	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)	(mg/l)
Otros componentes
D-Glucosa	3151,00	3151,00	3151,00	3151,00	3151,00	3151,00
HEPES	- -	- -	3574,50	3574,50	3574,50	- -
Na-Hipoxantina	2,39	2,39	2,39	2,39	2,39	2,39
Ácido linoléico	0,042	0,042	0,042	0,042	0,042	0,042
Ácido lipoico	0,105	0,105	0,105	0,105	0,105	0,105
Rojo de Fenol	8,10	8,10	8,10	8,10	8,10	8,10
Putrescina.2H_{2}O	0,081	0,081	0,081	0,081	0,081	0,081
Piruvato sódico	55,00	55,00	55,00	55,00	55,00	55,00
Vitaminas
Biotina	0,0035	0,0035	0,0035	0,0035	0,0035	0,0035
D-Ca pantotenato	2,24	2,24	2,24	2,24	2,24	2,24
Cloruro de colina	8,98	8,98	8,98	8,98	8,98	8,98
Ácido fólico	2,65	2,65	2,65	2,65	2,65	2,65
Inositol	12,60	12,60	12,60	12,60	12,60	12,60
Niacinamida	2,02	2,02	2,02	2,02	2,02	2,02
Piridoxal.HCl	2,00	- -	2,00	- -	2,00	2,00
Piridoxina.HCl	0,031	0,031	0,031	0,031	0,031	0,031
Riboflavina	0,219	0,219	0,219	0,219	0,219	0,219
Tiamina.HCl	2,17	2,17	2,17	2,17	2,17	2,17
Timidina	0,365	0,365	0,365	0,365	0,365	0,365
Vitamina B_{12}	0,68	0,68	0,68	0,68	0,68	0,68

Los ensayos de hipertrofia preferidos comprenden:

(a) pre-recubrimiento de las placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con un medio que contenga suero de ternera, preferentemente medio D-MEM/F-12 con suero fetal de ternera al 4%, en donde los pocillos se incuban con el medio durante aproximadamente 8 horas a aproximadamente 37ºC;

(b) eliminación del medio;

(c) siembra de una suspensión de miocitos en el interior de los 60 pocillos a 7,5 x 10^{4} células por ml en medio
D-MEM/F-12 suplementado con insulina, transferrina y aprotinina;

(d) cultivo de los miocitos durante al menos 24 horas en presencia de LIF;

(e) adición de la sustancia a analizar;

(f) cultivo de las células con las sustancia a analizar (preferentemente durante aproximadamente 24-72 h, más preferentemente durante aproximadamente 48 horas); y

(g) evaluación de la hipertrofia, preferentemente con tinción de cristal violeta y examen al microscopio.

Preferentemente el medio utilizado en la etapa (c) es un medio sin suero que también contiene penicilina/estrepto-
micina (pen/estrep) y glutamina. Más preferentemente, el medio contiene 100 ml de D-MEM/F-12, 100 \mul de transferrina (10 mg/ml), 20 \mul de insulina (5 mg/ml), 50 \mul de aprotinina (2 mg/ml), 1 ml de pen/estrep (JRH Biosciences, No. 59602-77P) y 1 ml de L-glutamina (200 mM).

Otro procedimiento para el ensayo de la hipertrofia implica la cuantificación de la liberación del péptido natriurético atrial (ANP) mediante un ensayo que determina la competición por la unión de ANP-I^{125} de rata por una proteína de fusión de receptor del ANP A-IgG. El procedimiento adecuado para utilizar es similar al utilizado para determinar GP130 utilizando una proteína de fusión CD4-IgG descrita por Chamow y col., Biochemistry, 29:9885-9891 (1990).

2. Composiciones terapéuticas y administración de antagonistas

Parece ser que los antagonistas de LIF pueden tener una utilidad como fármacos para el tratamiento in vivo de mamíferos (p.ej., animales o humanos) que sufren de una insuficiencia cardiaca, con el fin de impedir o disminuir los efectos hipertróficos. Por ejemplo, el antagonista de LIF puede ser de utilidad en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva en los casos en donde los inhibidores de ACE no puedan utilizarse o no sean efectivos.

Las formulaciones terapéuticas de antagonista(s) para el tratamiento de trastornos del corazón se preparan para su almacenamiento mezclando el o los antagonistas con el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes, o estabilizantes opcionales, aceptables fisiológicamente (Remington Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., Oslo, A., Ed., [1980]), en la forma de una pasta liofilizada o de soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizantes aceptables, no son tóxicos para el receptor a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen los tampones como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; los polipéptidos de bajo peso molecular (menos de unos 10 residuos); las proteínas, como la seroalbúmina, la gelatina, o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; los aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparraguina, la arginina o la lisina; los monosacáridos, los disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa, o la dextrina; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol; los iones formadores de sales como el sodio; y/o los tensioactivos no iónicos como el Tween, el Plurónics, o el polietilén glicol (PEG).

Los antagonistas también se unen de forma adecuada con uno de los diversos polímeros no proteicos existentes, p.ej., polietilén glicol, polipropilén glicol, o polioxialquilenos, en la forma establecida en las patentes americanas U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

Los antagonistas a utilizar en la administración in vivo deben ser estériles. Ello se logra fácilmente mediante filtración a través de una membrana de filtración estéril, antes o después de la liofilización y reconstitución. Los antagonistas se almacenarán generalmente en la forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas de antagonistas se colocan generalmente en un recipiente con un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa con un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica.

La administración de los antagonistas se realiza de forma crónica utilizando, por ejemplo, una de las siguientes vías: inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, o vías intralesionales, por vía oral si se utiliza una molécula pequeña activa oralmente, o utilizando sistemas de liberación prolongada como el indicado más abajo. Los antagonistas se administran de forma continua por infusión o inyección periódica de bolo si la velocidad de aclaramiento es suficientemente baja, o mediante administración en la circulación sanguínea o linfa. El modo de administración preferido es el directo al corazón, con el fin de dirigir la molécula a la fuente y minimizar los efectos secundarios de los antagonistas.

Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la proteína, matrices que presentan formas determinadas según el artículo; p.ej., películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen los poliésteres, los hidrogeles (p.ej., poli(2-hidroximetilmetacrilato), tal como se describe por Langer y col., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [10981] y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982] o poli(vinilacohol)), poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919, patente europea EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman y col., Biopolymers, 22:547-556 [1983]), acetato de vinilo no degradable (Langer y col., supra), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico como el Lupron Depol® (microsferas inyectables compuestas de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de Leuprolide), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (patente europea EP 133.988).

Los antagonistas también pueden aprisionarse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-[metilmetacilato], respectivamente), en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microsferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Mientras que polímeros como el acetato de etilén-vinilo y ácido-glicólico capaces de liberar moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden concebir estrategias racionales para la estabilización de la proteína dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación fuera la formación de un enlace S-S intermolecular a través del intercambio de tio-disulfuro, se puede lograr la estabilización modificando residuos sulfidrilos, liofilizando a partir de soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matriz con polímeros específicos.

Las composiciones antagonistas de liberación prolongada también incluyen antagonistas retenidos en liposomas. Los liposomas que contienen antagonistas se preparan mediante procedimientos bien conocidos: DE 3.218.121;
Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77:4030-4030 (1980); patente europea EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; patente europea EP 143.949; patente europea EP 142.641; patente japonesa JP 60007934, patentes U.S. 4.485.045 y 4.544.545; y patente europea EP 102.324. Generalmente los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (de aproximadamente 200-800 Angstroms) en los que el contenido lipídico es superior a aproximadamente 30 mol. % de colesterol, la proporción seleccionada se ajusta a la terapia de antagonistas óptima. Un ejemplo específico de una formulación de liberación prolongada adecuada se halla en la patente europea EP 647.449.

Una cantidad efectiva de antagonista(s) a utilizar en la terapia dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y de la condición del paciente. Según ello, el terapeuta deberá titular la dosis y modificar la vía de administración con el fin de obtener un efecto terapéutico óptimo. Una dosis típica de antagonista de LIF utilizada sola puede variar desde aproximadamente 1 \mug/Kg hasta 100 mg/Kg de peso corporal del paciente o más diarios, dependiendo de los anteriores factores mencionados, preferentemente de aproximadamente 10 \mug/Kg/día a
10 mg/Kg/día.

Si dos antagonistas se administran juntos, no tienen porque administrarse por la misma vía, ni tampoco en la misma formulación. Sin embargo, pueden combinarse en una formulación si fuera conveniente. Ambos antagonistas pueden administrarse al paciente, cada uno en cantidades efectivas, o cada uno en cantidades que sean sub-óptimas pero que combinadas sean efectivas. Preferentemente, dichas cantidades son de aproximadamente 10 \mug/Kg/día a 10 mg/kg/día para cada uno. La administración para ambos antagonistas se realiza mediante inyección utilizando, p.ej., medios intravenosos o subcutáneos, dependiendo del tipo de antagonistas utilizados. Típicamente, el clínico administrará el o los antagonistas hasta alcanzar la dosis que logre el efecto deseado para el tratamiento del trastorno cardiaco. Por ejemplo, la cantidad debería ser aquella que disminuya la hipertrofia, aumente la contractilidad ventricular y disminuya la resistencia vascular periférica o mejore o trate las condiciones de importancia similar en pacientes con insuficiencia cardiaca, obteniéndose en consecuencia el resultado deseado en el equilibrio continuo entre crecimiento y disminución del tejido muscular cardiaco. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante ensayos convencionales.

Los dos tipos de antagonistas, si se utilizan juntos, pueden formularse juntos en un vehículo adecuado para formar una composición farmacéutica que preferentemente no contenga células. En una realización, el tampón utilizado para la formulación dependerá de que la composición se utilice inmediatamente tras la mezcla o se almacene para su uso posterior, ya que un almacenamiento a largo plazo puede acarrear problemas de estabilidad como solubilidad y agregación que pueden estar causados por un cambio de pH. La preparación final puede ser un líquido estable o un sólido liofilizado.

Opcionalmente, el o los antagonistas se combinan con o se administran junto con otros agentes para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva, incluyendo los inhibidores de ACE, inhibidores de CT-1m hGH y/o IGF-1.

Las cantidades efectivas de dichos agentes, si se utilizan, estarán bajo la discreción del médico o veterinario. Tanto la administración de la dosis como su ajuste se llevan a cabo para lograr una mejor gestión de la insuficiencia cardiaca, e idealmente se tiene en consideración la utilización de diuréticos o digitalis, y de condiciones tales como la hipotensión y la insuficiencia renal. La dosis dependerá además de factores como el tipo de fármaco utilizado y del paciente específico a tratar. Por lo general, la cantidad utilizada será la misma dosis que la utilizada si el fármaco se administrase sin el antagonista; sin embargo, dosis inferiores pueden utilizarse dependiendo de factores como la presencia de efectos secundarios, la condición del paciente a tratar, del tipo de paciente y del tipo de antagonista y fármaco, siempre que la cantidad total de agentes proporcione una dosis efectiva para la condición a tratar.

Así, por ejemplo, en el caso de inhibidores de ACE, una primera dosis a probar es de 5 mg, la cual se puede incrementar de hasta 10-20 mg diarios, dependiendo de la tolerancia del paciente. Otro ejemplo, es el captopril que se administra inicialmente por vía oral a pacientes humanos en una dosis inicial a probar de 6,25 mg y la dosis se escala, según la tolerancia del paciente, a 25 mg dos veces al día (BID) o tres veces al día (TID) y puede titularse a
50 mg BID o TID. El nivel de tolerancia se estima determinando si la disminución en la presión sanguínea se acompaña por signos de hipotensión. Si fuera indicado, la dosis puede aumentarse hasta 100 mg de BID o TID. El captopril se produce para la administración como un ingrediente activo, en combinación con hidroclorotiazida y como un núcleo estabilizado por pH con una liberación entérica o retardada recubierto con captopril hasta que se alcanza el colon. El captopril está disponible para la administración en tabletas o en forma de cápsulas. Una discusión de la dosificación, administración, indicaciones y contraindicaciones asociadas con captopril y otros inhibidores de ACE pueden hallarse en Physicians Desk Reference, Medical Economics Data Production Co., Montvale, NJ. 2314-2320 (1994).

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no como una limitación.

Ejemplo 1

1. Materiales y métodos A. Materiales

La colagenasa CLS2 fue de Worthington (Freehold NJ) y el Percoll^{TM} de Pharmacia Biotech AB (Upsala, Suecia). El medio de cultivo y los suplementos fueron de Gibco BRL (Grand Island, NY). La aprotinina y el cristal violeta de Sigma, St. Louis, MO. La albúmina sérica bovina (BSA) se ICN Biomedicals (Aurora, IL). Las placas de 96 pocillos Falcon de Beckton Dickinson (Oxnard, CA) y los portaobjetos con cámaras de Lab TekTM (Naperville, IL). La endotelina-1 humana/porcina de American Peptides (Sunnyvale, CA). El LIF humano y de ratón se produjo de forma recombinante. Véase Rose y Todaro, patente internacional WO 93/05169 y Kim y col., supra. El LIF murino recombinante utilizado aquí procedía de Genzyme, Mass; los anticuerpos monoclonales anti-LIF humano se obtuvieron tal como se describe por Kim y col., supra, y la patente internacional WO 93/23556, supra. El BQ-123 se obtuvo tal como se describió por Ihara y col., Life Science, supra; JP 51-94254A, supra; Webb y col., supra); y el ANP y la proteína de fusión ANP-receptor IgG se obtuvieron tal como se describe por Chamow y col., supra.

B. Cultivo de miocitos y ensayo de hipertrofia

Los miocitos ventriculares cardiacos de neonatos se cultivaron en placas de 96 pocillos, tal como se describe por Pennica y col., supra. En resumen, los miocitos se aislaron de ratas Sprague-Dawley de un día de edad mediante una serie de digestiones con colagenasa seguido por una purificación en gradiente de Percoll^{TM}, Iwaki y coll., J Biol Chem., 265:13809-13817 (1990). Se recogieron los miocitos, que sedimentan en la banda de la interfase inferior del gradiente, se lavaron dos veces, y se resuspendieron en medio D-MEM/F-12 con suero de ternera fetal al 15% (v/v). Las células se diluyeron en medio D-MEM/F12 sin suero suplementado con 10 \mug/ml de transferrina, 1 \mug/ml de insulina, 1 \mug/ml de aprotinina, L-glutamina 2 mM, 10 U/ml de penicilina G y 100 \mug/ml de estreptomicina (medio de ensayo) a una densidad final de 7,5x104 células por ml. La concentración final de suero de este medio de ensayo con las células fue < 0,1%. Los miocitos se sembraron en placas a 200 \mul por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano, que previamente se habían recubierto con medio D-MEM/F12 con suero fetal de ternera al 4% (v/v) durante 8 horas a 37ºC. Al cabo de 24 horas a 37ºC en CO_{2} al 5%, se añadieron las sustancias a analizar. Después de 48 horas, se fijaron las células y se tiñeron con cristal violeta en metanol y formaldehido, y se evaluó la hipertrofia en una escala del 1 al 7 al microscopio. Las células no tratadas se utilizaron como control negativo y se evaluaron en una escala del 1 al 7. Las células no tratadas se utilizaron como controles negativos y se les dio un valor de 3. Los efectos tóxicos se valoraron en una escala del 0 al 2. El control positivo en los ensayos fue la fenilefrina a 100 \mumol/l, que se
valoró con un 7.

C. Cultivo de no-miocitos

La banda en la interfase superior del gradiente estaba enriquecida en no- miocitos según el proceso descrito anteriormente. Estas células se recogieron, se lavaron dos veces y se resuspendieron en medio D-MEM/F12 con suero fetal de ternera al 10% (30 ml/50 corazones) y se sembraron en frascos T75 (2/50 corazones). Al cabo de una hora a 37ºC en CO2 al 5%, se cambió el medio de los frascos de cultivo. Al cabo de 4 días en cultivo, las células se tripsinizaron y re-sembraron a 4x105 células por ml en frascos T25 (5 ml/frasco). La mayoría de miocitos contaminantes se eliminaron mediante este procedimiento. Después de 5 días en cultivo, las células se lavaron dos veces en medio D-MEM/F12 sin suero, y se añadió el medio condicionante (medio de ensayo con BSA 1 mg/ml). El medio condicionado se eliminó al cabo de 24 horas, se centrifugó para eliminar las células y los restos celulares y se guardó a 4ºC.

D. Cuantificaciones de ANP

Las concentraciones de ANP de rata se determinaron mediante competición por la unión de ANP-I^{125} de rata con una proteína de fusión receptor ANP A-IgG. Chamow y col., supra.

E. Cuantificaciones de la endotelina

Las concentraciones de la endotelina se determinaron con el sistema de ensayo de la Endotelina 1,2 (altamente sensible) de Amersham (Amersham, Arlington Heights, IL).

F. Cuantificaciones de LIF

El ELISA sándwich de LIF se realizó tal como se describió por Kim y col., supra, con las modificaciones siguientes. Después de recubrir las placas de microtitulación durante toda la noche con Mab D4.16.9 (contra LIF humano), se bloquearon con BSA al 0,5% (p/v) y se lavaron, los estándares de LIF murinos y las muestras se añadieron y se incubaron las placas durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, se añadió Mab D62.3.2 biotinilado (con Pierce ImmunoPute^{TM} Sulfo-NHS-biotin^{TM}) (contra LIF humano) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron, se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN), y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se añadió el sustrato de peroxidasa TMB (tetrametilbenzidina) (Kirkegaard y Perry, Gaithsburg MD). El revelado de color se paró a los 10 minutos mediante adición de H_{3}PO_{4}. Se determinó la absorbancia a 450 nm con un lector de placas de microtitulación. Se estimó la concentración de LIF de rata en el NCM mediante comparación con una curva estándar de LIF murina.

G. Inmunocitoquímica

Los miocitos se sembraron en portaobjetos de cámara de vidrio Lab Tek^{TM} de 4 cámaras, recubiertas durante 8 horas con suero de ternera fetal al 4% (v/v) en medio D-MEM/F12 y se cultivaron durante 24 horas. Se expusieron a las sustancias a analizar durante 48 horas y luego se lavaron 3X en tampón fosfato sódico (PBS) y se fijaron en etanol al 95% (v/v) durante 15 minutos. Los portaobjetos se lavaron 3X en PBS con tensioactivo Tween-20^{TM} al 0,1% (v/v), se bloquearon durante 30 minutos con BSA al 1% (p/v) en PBS con tensioactivo Tween-20^{TM} al 0,1% (v/v), y se incubaron con phallacidin conjugado con el reactivo de marca BODIPY FL^{TM} (10 \mug/ml en BSA al 1% en PBS) (Molecular Probes, Eugene OR) durante 40 minutos para teñir la f-actina presente en las fibras contráctiles. Las preparaciones se lavaron a continuación 3X con PBS en tensioactivo Tween-20^{TM} al 0,1% (v/v). Las imágenes de las células teñidas con phallacidin se obtuvieron con el microscopio confocal de rastreo láser Ultima^{TM} (Meridian Instruments, Okemos, MI). Se utilizó un objetivo de inmersión A 1.4 NA 60X^{TM} acoplado con una excitación de
4800 nm, y la fluorescencia resultante se cuantificó mediante un filtro de paso de 525 nm. Los resultados se recogieron a una resolución horizontal y vertical de 0,2 \mum y una resolución de z de 0,5 \mum. Cada punto se determinó como un promedio de 200 medidas. Las imágenes finales se construyeron con un algoritmo de proyección de fluorescencia máxima comprimiendo el múltiplo z o las imágenes en profundidad en una sola representación bidimensional.

Los no-miocitos se sembraron en preparaciones de cámaras de vidrio Lab Tek^{TM} de 4 cámaras, se cultivaron durante 5 días, se lavaron 3X en PBS y se fijaron con etanol al 95% durante 15 minutos. Las preparaciones se lavaron 3X en PBS, se bloquearon durante 30 minutos con BSA al 1% en PBS con tensioactivo Triton-X-100 al 0,1% (v/v) y se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios durante 2 horas: (1) anti-tropomiosina monoclonal (sarcomérico) (Sigma, St. Louis. MO) 1:50 para teñir miocitos, (2) anti-actina alfa de músculo liso (Sigma) a 1:2.500 para tinción de células de tipo fibroblastos, y (3) anti- factor Von Willebrand humano de conejo (DAKO, Carpenteria, CA) 1:500 para tinción de células endoteliales. Al cabo de 3 lavados con PBS, las preparaciones se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados con fluoresceína (Sigma) a 1:200 durante 45 minutos y se lavaron 3X con PBS.

2. Resultados A. Producción de actividad hipertrófica mediante cultivo de no-miocitos cardiacos

Después de la exposición con NCM al 50% (v/v) durante 48 horas, los miocitos ventriculares de rata neonata se agrandaron (valor de hipertrofia 7) comparados con las células no tratadas (valor de hipertrofia 3), con una mayor organización de las fibras contráctiles. El aumento en el tamaño de las células de miocitos, expresado como valor de hipertrofia, es dependiente de la dosis (Fig. 1A) y se acompaña por un aumento de la producción de ANP (Fig. 1B). La actividad hipertrófica en el NCM aumenta rápidamente hasta las 5 horas, alcanzado el pico máximo a las 24 h (Fig. 2). Para una actividad máxima se requiere una densidad de siembra de 0,2 a 0,4 millones de células por ml.

B. Inhibición de la actividad de hipertrofia en medio condicionado de los no-miocitos por el bloqueante del receptor de la endotelina y el anticuerpo monoclonal de LIF

El bloqueante del receptor de la endotelina A, BQ-123, y un Mab contra LIF humano recombinante (Mab D62.3.2) inhibieron parcialmente cada uno la actividad hipertrófica del NCM. Cuando se añadieron juntos, la actividad se bloqueó casi completamente (Fig. 3). El BQ-123 y el LIF Mab pareció que eran inhibidores específicos. BQ-123 bloqueó sólo la actividad hipertrófica inducida por la endotelina-1, pero no CT-1, LIF de ratón (mLIF), o fenilefrina (Fig. 4). El Mab de LIF fue parcialmente neutralizante de la actividad inducida por mLIF y no afectó la actividad inducida por la endotelina-1, CT-1, o fenilefrina (Fig. 5). BQ-123 y el Mab de LIF por ellos mismos no tuvieron efecto sobre la morfología de los miocitos.

La presencia de endotelina y LIF en el NCM se confirmó mediante inmunoensayo. Se cuantificó la endotelina (endotelina-1 y -2 y la endotelina grande) en NCM mediante radioinmunoensayo y se promedió 229\pm10 pmol/l en tres preparaciones. La concentración de LIF en el NCM se estimó utilizando un ELISA sándwich con dos anticuerpos monoclonales anti-LIF humano y de ratón como el estándar. El valor obtenido para la concentración de LIF utilizando esta técnica fue de 190+50 pmol/l en tres preparaciones.

C. Efecto de LIF purificado y endotelina sobre la hipertrofia de miocitos cardiacos in vitro

Se observó una morfología característica de los miocitos al cabo de 48 horas de exposición a concentraciones máxima de mLIF y endotelina-1 y con la combinación de los dos agentes. Las células expuestas a LIF tendieron a proyectar prolongaciones de tipo dendrítico. Los expuestos a la endotelina fueron más compactos y no mostraron proyecciones de tipo dendrítico. La exposición a la combinación de factores dio como resultado un fenotipo híbrido con una pérdida de proyecciones de tipo dendrítico y un aumento en el tamaño que simula la morfología resultante del tratamiento con fenilefrina y NCM.

La organización de las fibras contráctiles se observó en los miocitos que se habían teñido con phallacidin fluorescente para visualizar la f-actina. En los controles no tratados, las fibras eran cortas y estaban desorganizadas comparadas con las de miocitos hipertrofiados. En las células tratadas con endotelina, las fibras no estaban organizadas en paralelo, presentaban una apariencia enredada sin presentar un bandeado prominente. En los miocitos tratados con mLIF, la combinación de mLIF y la endotelina, y fenilefrina, las fibras estaban organizadas en disposiciones en paralelo mostrando un bandeado prominente correspondiente con las unidades sarcoméricas. En las células tratadas con mLIF, las fibras contráctiles se extendían hasta los extremos de las proyecciones de tipo dendrítico. Los resultados de la Figura 6 indican que LIF y la endotelina fueron aditivos con respecto a la producción de ANP (Fig. 6A) y con respecto al tamaño de las células, expresado como un valor de hipertrofia (Fig. 6B).

D. Identidad de los no-miocitos

Los estudios de inmunocitoquímica mostraron que la mayoría de los no-miocitos cardiacos cultivados se teñían con el anticuerpo contra la actina de músculo liso y presentaban un patrón de fibra de estrés. La expresión de la alfa-actina de músculo liso se observó en fibroblastos en cultivo derivados de tejido cardiaco de rata neonata. Brouty-Boye y col., In Vitro Cell Dev. Biol., 28A:293-296 (1992). Los miocitos en su estudio también expresaron esta isoforma de actina y pudieron distinguirse de los fibroblastos por el patrón de tinción: fibras de estrés para fibroblastos versus un patrón estriado para miocitos. Un patrón de tinción de fibras de estrés similar fue publicado por Long y col., supra, respecto a no-miocitos cardiacos. Menos del 1% de los no-miocitos correspondieron a células endoteliales (analizados con un anticuerpo contra el Factor de von Willebrand) y los miocitos (analizados con un anticuerpo contra la tropomiosina sarcomérica). La tinción fue negativa en las preparaciones cuando se omitió el anticuerpo primario.

Los reactivos utilizados en este ejemplo para bloquear la actividad hipertrófica inducida por la endotelina y el LIF fue específica. BQ-123 bloqueó únicamente la actividad hipertrófica inducida por la endotelina-1, pero no por CT-1, ni el LIF de ratón, ni la fenilefrina. El radioinmunoensayo para la endotelina, que cuantifica la endotelina-1 y -2 y la endotelina grande, confirmaron los resultados bloqueantes del receptor para la presencia de endotelina en el NCM.

El anticuerpo monoclonal LIF utilizado en este ejemplo, generado contra el LIF humano recombinante, mostró actividad neutralizante contra la hipertrofia inducida por el LIF humano y de ratón, pero no contra la hipertrofia inducida por el CT-1, endotelina, o fenilefrina. Cuatro anticuerpos monoclonales estaban disponibles (Mabs D3.14.1, D4.16.9, D25.1.4 y D62.3.2, depositados en el American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Maryland, el 23 de Junio de 1992 y asignados con los números de acceso del ATCC, HB 11076, HB 11077 y HB 11074 y HB 11075, respectivamente), cada uno de ellos reconocen un epitopo distinto en el LIF humano recombinante. Tres de ellos (Mabs D4.16.9, D25.1.4 y D26.3.2) neutralizaron la hipertrofia de miocitos inducida por LIF humana y de ratón, y dos (Mabs D25.1.4 y D62.3.2) fueron equipotentes en la inhibición de la hipertrofia inducida por NCM. Mab D3.14.1 no neutralizó la capacidad del LIF humano o de ratón para inducir la hipertrofia de miocitos. Utilizando un ELISA sándwich con dos de los anticuerpos monoclonales que neutralizaban la actividad hipertrófica inducida por LIF de ratón y humano, y el LIF de ratón como un estándar, se realizó una aproximación de la concentración de LIF de rata en NCM. La secuencia aminoacídica del LIF de rata es 92% similar a la del LIF de ratón. Gough y col., Growth Factors, 7:175-179 (1992).

En este sistema de cultivo, ni el LIF purificado ni la endotelina sola fueron capaces de inducir una respuesta hipertrófica máxima respecto al tamaño de los miocitos y a la producción de ANP, incluso a concentraciones nanomolares. Además, cada agente indujo una morfología característica que fue distinta de la inducida por la fenilefrina. Sin embargo, cuando el LIF y la endotelina se combinaron, se indujo una hipertrofia máxima en los miocitos que recordaba a los tratados con NCM por su tamaño celular, morfología y organización de fibras contráctiles. Los miocitos tratados con NCM y BQ123 se parecían a los tratados con LIF purificado, como se esperaría si se bloqueara la actividad de la endotelina. Los miocitos tratados con NCM y Mab LIF recordaron a los tratados con endotelina-1 purificada, como se esperaría si se bloqueara la actividad de LIF.

Las respuestas inducidas por el LIF y la endotelina fueron aditivas respecto al tamaño celular y a la formación de ANP.

Los estudios de inmunofluorescencia indican que los cultivos de no-miocitos en este ejemplo contenían principalmente células de tipo fibroblasto (que se tiñen con los anticuerpos contra la actina del músculo liso) con menos del 1% de células endoteliales y miocitos.

En resumen, el LIF y la endotelina se identificaron como los factores responsables de la mayor parte de la actividad hipertrófica en los miocitos cardiacos de rata neonata cultivados en NCM. La presencia de endotelina y LIF se confirmó mediante inmunoensayo y se halló en el intervalo de 200 pmol/l. El LIF purificado y la endotelina indujeron respuestas hipertróficas parciales con morfologías características para cada molécula, y ningún factor por separado fomentó la respuesta hipertrófica máxima observada con la combinación. La respuesta a la combinación de ambos agentes fue aditiva respecto al tamaño de los miocitos, la morfología, la producción de ANP y la organización de fibras contráctiles.

Claims (4)

1. Utilización de un antagonista del factor inhibidor de la leucemia (LIF), que es un anticuerpo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que padece de una insuficiencia cardiaca para impedir la aparición de o disminuir la hipertrofia.

2. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma depositadas en el American Type Culture Collection, con el número de acceso ATCC HB 11077, HB 11074 y HB 11075.

4. Utilización de la reivindicación 3, en donde el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridomas depositadas en el American Type Culture Collection con el número de acceso del ATCC HB11074 y HB 11075.