ES2254977T3

ES2254977T3 - Ensayo de fosfomidasas.

Info

Publication number: ES2254977T3
Application number: ES03770968T
Authority: ES
Inventors: Roland Kellner; Ansgar Wegener
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2002-11-09
Filing date: 2003-10-10
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2023-10-10
Also published as: DE60302764T2; US7348160B2; ATE312941T1; EP1468108A1; DE60302764D1; WO2004044233A1; US20050124023A1; EP1468108B1; AU2003280359A1

Abstract

Uso de al menos uno de los sustratos seleccionados del grupo consistente en FDP, DDAO, DiFMUP, fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97 para la caracterización y determinación cualitativa y/o cuantitativa de la actividad de una fosfoamidasa mediante la detección de la hidrólisis de enlaces fosfoéster (P-O).

Description

Ensayo de fosfoamidasas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de compuestos y a métodos para la detección, caracterización y determinación cualitativa y/o cuantitativa de la actividad de fosfoamidasas o fosfoamidasas proteicas específicas para hidrolizar enlaces fosfoamida (P-N) de aminoácidos básicos N-fosforilados tales como fosfolisina, fosfoarginina y fosfohistidina o de péptidos que comprenden dichos aminoácidos fosforilados.

Antecedentes de la invención

La comunicación entre células individuales en organismos multicelulares es esencial para la regulación y coordinación de procesos celulares complejos tales como crecimiento, diferenciación, migración y apoptosis. Las redes de transducción de señales que median dichos mecanismos biológicos utilizan la fosforilación de proteínas reversible como una herramienta fundamental. De acuerdo con una estimación modesta, alrededor de un tercio de las proteínas conocidas pueden ser fosforiladas en eucariotas. En las pasadas décadas se reveló que una multitud de ciclos reguladores están interconectados íntimamente a través de sustratos de solapamiento y la regulación mutua de quinasas y fosfatasas por vía de fosforilación/desfosforilación por otras quinasas y fosfatasas, respectivamente (Cohen, P. (2000) Trends Biochem. Sci. 25, 596-601). La desregulación de la desfosforilación enzimática causará importantes malfunciones que serán por tanto causantes de enfermedades.

Las fosfatasas proteicas quedan agrupadas de acuerdo con su actividad sobre los diversos fosfo-aminoácidos, concretamente sobre los aminoácidos fosforilados más prominentes: serina (Ser), treonina (Thr) y tirosina (Tyr). Sin embargo, es necesario considerar otros aminoácidos como fosfo-derivados relevantes, concretamente histidina (His), lisina (Lys), cisteína (Cys), ácido aspártico (Asp) y ácido glutámico (Glu). La clasificación sistemática de quinasas concierne a la naturaleza de los aminoácidos aceptadores de fosfato, por ejemplo de si se forma un fosfato éster, tioéster, fosfoamidato o fosfato carboxilato anhídrido (Matthews, H.R. & Chan, K. (2001) Methods Mol. Biol. 124: 171-182).

Una exposición general acerca de la fosfoamidasa de clase enzimática puede encontrarse en la página de Internet (<URL: http.brenda.uni.koeln.de/php/result_flat.php3?ecno=3.9.1.1.), en donde se muestra la actividad y especificidad de fosfoamidasas que abarcan diferentes especies junto con citas bibliográficas.

Los fosfo-aminoácidos His, Asp, Glu, Lys y Cys muestran distintas propiedades químicas tales como labilidad por ácidos e inversión fisiológica más rápida que se emplean comúnmente para la caracterización (Sickmann, A. & Meyer, H.E. (2001) Proteomics 1, 200-206). Hasta ahora, los fosfo-aminoácidos menos abundantes aparecieron predominantemente en procesos celulares de bacterias, plantas (Chang, C. & Meyerowitz, E.M. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4129-4133) y eucariotas inferiores (Huang, J.M. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 9023-9031). Debido a sus enlaces fosfato de alta energía, los mismos se emplean en reacciones de fosfotransferencia rápida, tal como el sistema de dos componentes y la señalización de fosfo-transmisión (West, A.H. & Stock, A.M. (2001) Trenes Biochem. Sci. 26, 369-376).

Más recientemente, se identificó que la fosforilación de histidina contribuía a procesos reguladores en vertebrados, tal como la estimulación de plaquetas humanas (Crovello, C.S. et al. (1995) Cell 82, 279-286) o la función reguladora de anexina I (Muimo, R. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 36632-36636). Otro ejemplo bien establecido es la fosforilación reguladora de ATP-citrato liasa por el nucleósido difosfato quinasa (NDPK) (Wagner, P.D. & Vu, N.D. (1995) J. Biol. Chem. 270, 21758-21764). Sin embargo, raramente se describen fosfoamidasas proteicas que actúan específicamente sobre fosfo-amidatos en proteínas tales como proteínas fosforiladas de histidina. La primera evidencia de dicha actividad de tipo fosfoamidasa se comprobó como una función adicional de PP1 y PP2A cuando actúan sobre P-His histona 4 (Kim, Y. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 18513-18518; Kim, Y. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1268, 221-228). Aunque se sabe que el fosfato de histidina está presente en mamíferos (Crovello, C.S. et al. (1995) Cell, 82, 279-286), no ha sido posible hasta la fecha identificar cualquiera de las correspondientes quinasas o de las fosfoamidasas relevantes. Una proteína con actividad de fosfoamidasa específica asignada, que reconoce entre otros sustratos P-His-NDPK pero que no hidroliza sustratos O-fosforilados, fue aislada a partir de hígado bovino pero no se ha publicado ninguna identidad de secuencias (Hiraishi, H. et al. (1999) J. Biochem. (Tokyo) 126, 368-374). Además, se ha descrito una fosfoamidasa de 17-kDa que es específica únicamente para Arg fosforilada y que está libre de la actividad que hidroliza compuestos O-fosforilados (Kuba, M. et al. (1992) Eur. J. Biochem. 208, 747-752; Yokohama, K., et al. (1993) J. Biochem. 113, 236-240; Kumon, A. et al. (1996) J. Biochem. 119, 719-724).

Una fosfoamidasa proteica específica para hidrolizar residuos de histidina N-fosforilada en péptidos o proteínas y que no tiene actividad para hidrolizar péptidos o proteínas O-fosforilados es PHP1 (WO 00/52175; Ek, P. et al (2002) Eur. J. Biochem. 269, 5016-5023).

Al objeto de entender el papel fisiológico de las fosfoamidasas y ser capaces de interaccionar con situaciones pato-fisiológicas, es importante identificar de manera inequívoca la especificidad por sustratos enzimáticos de una fosfoamidasa y desarrollar herramientas para interferir por medio de una inhibición o activación de la enzima.

Dentro del significado de la presente invención, el término "fosfoamidasa" define una enzima que hidroliza enlacea fosfoamida (P-N) de aminoácidos básicos fosforilados tales como P-His, P-Lys, P-Arg, o de péptidos o proteínas que comprenden estos aminoácidos fosforilados y que está desprovista de actividad hidrolizante de proteínas o péptidos O-fosforiladas. Ejemplos de dichas fosfoamidasas dentro del significado de la presente invención se describen en Hiraishi, H. et al. (1999) J. Biochem. (Tokyo) 126, 368-374, Kuba, M. et al. (1992) Eur. J. Biochem. 208, 747-752 y WO 00/52175.

Dentro del significado de la presente invención, el término "fosfoamidasa proteica" describe una fosfoamidasa que hidroliza enlaces fosfoamida (P-N) de aminoácidos básicos fosforilados, tales como P-His, P-Lys o P-Arg, únicamente dentro de péptidos o proteínas y que está desprovista de actividad hidrolizante de proteínas o péptidos O-fosforiladas. Un ejemplo de dicha fosfoamidasa proteica dentro del significado de la presente invención es la fosfoamidasa proteica específica a histidina-fosfato PHP1 descrita en WO 00/52175.

Dentro del significado de la presente invención, el término "histidina-fosfoamidasa proteica" define una fosfoamidasa proteica específica para hidrolizar histidina fosforilada dentro de péptidos o proteínas. Un ejemplo dentro del significado de la presente invención es PHP1 descrita en WO 00/52175.

Dentro del significado de la presente invención, el término "fosfatasa" define una enzima que hidroliza enlaces fosfoéster (P-O) de aminoácidos fosforilados tales como P-Thr, P-Ser o P-Tyr, o de péptidos o proteínas que comprenden estos aminoácidos fosforilados. Estas enzimas pueden tener además una actividad de fosfoamidasa.

Dentro del significado de la presente invención, el término "fosfatasa proteica" define una fosfatasa que hidroliza enlaces fosfoéster (P-O) de aminoácidos fosforilados, tales como P-Thr, P-Ser o P-Tyr, únicamente dentro de péptidos o proteínas. Estas enzimas pueden tener además una actividad de fosfoamidasa. Ejemplos de fosfatasas proteicas dentro del significado de la presente invención son PP1, PP2A y PP2C (Kim, Y. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 18513-18518).

Dentro del significado de la presente invención, el término "actividad de fosfoamidasa" define la hidrolización de un enlace fosfoamida independientemente de si es hidrolizado por una fosfoamidasa o por una fosfatasa.

Dentro del significado de la presente invención, el término "actividad de una fosfoamidasa" define la hidrolización de un enlace fosfoamida por una fosfoamidasa, fosfoamidasa proteica o histidina fosfoamidasa proteica que está desprovista de una actividad hidrolizante de enlaces fosfoéster (P-O) de proteínas o péptidos fosforiladas.

Existe cierta bibliografía sobre métodos bioquímicos adecuados para la detección de la desfosforilación de fosfohistidina. Por ejemplo, el método con verde malaquita (Ohmori, H. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 7625-7627; Ohmori, H. et al. (1994) J. Biochem. 116, 380-385) ha sido empleado para identificar actividad de fosfoamidasa para 6-fosfolisina y 3-fosfohistidina. El P_{i} liberado fue analizado por adición sucesiva de verde malaquita y ácido cítrico. La absorbancia del complejo fosfato/molibdato fue medida a 630 nm (Kuba, M. et al. (1992) Eur. J. Biochem. 208, 747-752). Sin embargo, este ensayo puede interferir fuertemente con la labilidad ácida de sustratos fisiológicos de fosfoamidasa. La 6-fosfolisina, la 3-fosfohistidina y los correspondientes aminoácidos desfosforilados se han identificado mediante electrofóresis de capa fina sobre celulosa y tinción con ninhidrina o reactivo de Rosenberg.

Empleando histona histidina-fosforilada H4 marcada con ^{32}P, se ha demostrado que las fosfatasas proteicas PP1, PP2A y PP2C tienen una actividad de fosfoamidasa proteica para histidina además de su actividad de Ser-, Thr- o Tyr-fosfatasa (Kim, Y. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 18513-18518; Matthews, H.R. & MacKintosh, C. (1995) FEBS Lett. 364, 51-54; Kim, Y. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1268, 221-228). La actividad de fosfoamidasa para histidina fue detectada por incubación de [^{32}P]histona 4 con fosfatasa y posterior electrofóresis en acrilamida de la mezcla de reacción y autorradiografía del gel. Para el análisis cuantitativo, se separó el ^{32}P_{i} liberado de la [^{32}P]histona 4 por ultracentrifugado y el resto del fosfato unido a histona fue cuantificado por conteo de centelleo
líquido.

Otro ensayo respecto a la actividad de una His-fosfoamidasa proteica ha sido descrito en WO 00/52175 empleando como sustrato CheA histidina fosforilada marcada con ^{32}P. La CheA es una histidina autoquinasa bacteriana recombinante (Bilwes, A.M. et al. (1999) Cell, 96, 131-134). El fosfato libre ha sido identificado por cromatografía de capa fina por vía de molibdato amónico o por autorradiografía, respectivamente.

Otra posibilidad de detectar fosfato inorgánico ha sido descrita en WO 95/02825 y Brune et al. 1994 (Biochemistry (1994) 33, 8262-8271). Este ensayo está basado en el cambio rápido de las características de fluorescencia de MDCC-PBP, que es la proteína de unión a fosfato de E. coli (PBP) marcada con N-[2-(1-maleimidil)etil]-7-(dietilamino)cumarin-3-carboxamida (MDCC), un marcador fluorescente detectable.

Sin embargo, debido a que los métodos mencionados anteriormente no pueden ser empleados en un ensayo continuo, o bien son de larga duración y/o generan residuo radiactivo, los mismos no se pueden aplicar bien en pruebas HTS (Evaluación de Alto Rendimiento). Por tanto, existe la necesidad de disponer de otros ensayos de fosfoamidasas proteicas y fosfoamidasas que puedan ser realizados fácilmente y que puedan aplicarse en pruebas HTS.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al uso de los compuestos FDP (difosfato de fluoresceína), DDAO (9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetil-acridin-2-ona-7-il)fosfato), DiFMUP (fosfato de 6,8-difluor-4-metilum-beliferilo), fosfato ELF®39
(2-(2'-fosfofenil)-4-(3H)-quinazolinona) y fosfato ELF®97 (2-(5'-cloro-2'-fosfofenil)-6-cloro-4-(3H)-quina-
zolinona) (compuestos todos ellos suministrados por Molecular probes, Inc., Eugene Oreg.), para la detección, caracterización y determinación cualitativa y/o cuantitativa de la actividad de fosfoamidasas o fosfoamidasas proteicas independientemente de la disponibilidad de un sustrato fisiológico, el cual suele ser desconocido para nuevas enzimas. Dichos compuestos son de interés con respecto a caracterizar el papel fisiológico de fosfoamidasas o
fosfoamidasas proteicas y a identificar de manera inequívoca su especificidad por el sustrato enzimático, así
como con respecto al desarrollo de herramientas para interferir por medio de una inhibición o activación de la
enzima.

En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para la identificación de una sustancia de ensayo como un inhibidor o activador de fosfoamidasas y/o fosfoamidasas proteicas. Dicho método puede comprender las etapas de:

a): establecer una muestra que comprende la fosfoamidasa o fosfoamidasa proteica y una sustancia de ensayo,

b): administrar FDP, DDA, DiFMUP, fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97 a la muestra,

c): detectar la señal producida por el sustrato y

d): identificar la sustancia de ensayo como un activador o inhibidor de la fosfoamidasa o fosfoamidasa proteica a través de la comparación de la señal producida en la muestra que comprende la sustancia de ensayo con la señal producida en una muestra de control que no comprende sustancia de ensayo.

Otra modalidad de la invención consiste en proporcionar métodos para la detección de fosfoamidasas en geles naturales, geles SDS o transferencias de los mismos por incubación de los geles o transferencias con fosfato ELF®39 y/o fosfato ELF®97 después de la electrofóresis y detección de la fluorescencia producida por los sustratos después de la reacción con las enzimas, por ejemplo, mediante un iluminador UV de sobremesa estándar.

Por otro lado, la presente invención proporciona métodos para identificar inhibidores o activadores específicos para una fosfoamidasa distinta en una muestra que comprende otras fosfoamidasas o fosfatasas por incubación de
los geles o transferencias después de la electrofóresis con la sustancia a ensayar y posteriormente con fosfato
ELF®39 y/o fosfato ELF®97. La especificidad del inhibidor se puede determinar comparando las señales
producidas en el gel incubado con la sustancia de ensayo con las señales en un gel de control sin sustancia de
ensayo.

Otros objetos de la presente invención resultarán evidentes para el experto en la materia en base a la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Dependencia del pH de las velocidades de reacción iniciales de la conversión de sustratos fluorogénicos y cromogénicos por PHP1.

Figura 2: Medición de resolución en el tiempo de fosfato liberado a partir de fosfopéptidos por fosfatasa alcalina (AP) (diagrama de la izquierda) y PHP1 (diagrama de la derecha). La señal de fluorescencia se convierte en concentración de sustrato empleando un factor de normalización derivado de la curva de valoración estándar de fosfato inorgánico con proteína de unión a fosfato fluorescente.

Figura 3: Detección de la actividad de fosfatasa empleando el ensayo con verde malaquita para la reacción de LAR-PTP (diagrama de la izquierda ) y de PHP1 (diagrama de la derecha) con fosfopéptidos.

Figura 4: Análisis espectrométrico de masas del producto de reacción de la incubación de fosfopéptidos con fosfatasas/fosfoamidasas individuales. La pérdida de masa de 80 Da indica la escisión enzimática de fosfato del péptido pS por \lambdaPP y AP.

Figura 5: Análisis espectrométrico de masas del producto de reacción de la incubación de fosfopéptidos con fosfatasas/fosfoamidasas individuales. La pérdida de masa de 80 Da indica la escisión enzimática de fosfato del péptido pT por \lambdaPP y AP.

Figura 6: Análisis espectrométrico de masas del producto de reacción de la incubación de fosfopéptidos con fosfatasas/fosfoamidasas individuales. La pérdida de masa de 80 Da indica la escisión enzimática de fosfato del péptido pY1 por Lar-PTP y AP.

Figura 7: Análisis cinético de la conversión de DiFMUP por PHP1:

a): Incremento de fluorescencia debido a la desfosforilación de DiFMUP en diversas concentraciones de sustrato (en \muM). El incremento de la señal de fluorescencia inicial se debe a la fluorescencia de fondo del sustrato sin reaccionar.

b): Correlación de la fluorescencia relativa con la concentración de sustrato totalmente convertido para fines de cuantificación.

c): Gráfico de Leneweaver-Burk de las velocidades iniciales invertidas versus concentración invertida de DiFMUP con ajuste lineal.

d): Gráfico de Michaelis-Menten de las velocidades de reacción iniciales versus la concentración de sustrato. La correlación lineal no permite el ajuste no lineal de la curva que se deriva del parámetro de Michaelis-Menten.

Figura 8: Análisis cinético de la conversión de FDP por PHP1:

a): Incremento de fluorescencia debido a la desfosforilación de FDP en diversas concentraciones de sustrato (en \muM). El incremento de la señal de fluorescencia inicial se debe a la fluorescencia de fondo del sustrato sin reaccionar.

c): Gráfico de Leneweaver-Burk de las velocidades iniciales invertidas versus concentración invertida de FDP con ajuste lineal.

d): Gráfico de Michaelis-Menten de las velocidades de reacción iniciales versus la concentración de sustrato. La correlación hiperbólica permite el ajuste no lineal de la curva que se deriva del parámetro de Michaelis-Menten.

Figura 9: Gráfico de la concentración de inhibidor versus la lectura de DiFMUP después de un tiempo de reacción de 5 minutos a una concentración de PHP1 de 0,1 \muM.

Figura 10: Transferencia de manchas con dilución en serie de PHP1 (5 \mug, 2,5 \mug, 1,3 \mug, 0,6 \mug, 0,3 \mug, 0,15 \mug, 0,08 \mug, 0,04 \mug) y Lar-PTP (1 \mug, 0,5 \mug, 0,25 \mug, 0,13 \mug, 0,06 \mug, 0,03 \mug, 0,015 \mug, 0,08 \mug).

Figura 11:

a): Imagen de SDS-PAGEs después de la separación de I) AP, II) PHP1 y III) Lar-PTP (cada una 5 \mug) y posterior renaturalización e impregnación con sustratos fluorogénicos (fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97). El primer carril fue cargado con marcador de proteínas pre-teñido que exhibe auto-fluorescencia.

b): Imagen de transferencias de tipo Western correspondientes a los SDS-PAGEs mostrados en la figura 8a) después de la separación de a) AP, b) PHP1 y c) Lar-PTP (cada una 5 \mug) y posterior renaturalización e impregnación con sustratos fluorogénicos (fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97). El primer carril se cargó con marcador de proteínas pre-teñido que exhibe auto-fluorescencia.

Descripción detallada de la invención

En general, los ensayos para la determinación de la actividad de fosfatasa proteica están basados frecuentemente en la determinación del fosfato inorgánico liberado de los sustratos cromogénicos o fluorogénicos.

Varias fosfatasas reconocen ésteres mono- o difosfato de pequeños compuestos fluoróforos o cromóforos como sustratos artificiales, escinden los enlaces éster fosfato y con ello liberan el fluoróforo o cromóforo respectivamente. Estos sustratos tienen un fluoróforo o cromóforo con mitades hidroxilo en común que forman un enlace éster con un grupo fosfato. Los mismos se emplean frecuentemente en ensayos de fosfatasas, por ejemplo para fosfatasa alcalina (AP) o PP2A. La actividad de fosfatasas es seguida por la mayor respuesta de fluorescencia o absorción del producto de reacción. Debido a diferentes propiedades químicas tal como el valor pKa del éster fosfato, los sustratos DiFMUP (fosfato de 6,8-difluor-4-metilum-beliferilo) (Gee, K.R. et al. (1999) Anal. Biochem. 273, 41-48), MUP (fosfato de 4-metilumbeliferilo) (Anthony, F.A. et al. (1986) Anal. Biochem. 155, 103-107; Rietz, B. & Guilbault, G.G. (1975) Clin. Chem. 21, 1791-1794), DDAO (9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetil-acridin-2-ona-7-il)fosfato) (Leira, F. et al. (2000) Toxicon 38, 1833-1844), FDP (difosfato de fluoresceína) (Huang, Z. et al. (1999) J. Biomol. Screen. 4, 327-334), pNPP (fosfato de para-nitrofenol) y DCAP (Osawa, S. et al. (1995) Clin. Chem. 41, 200-203) son compatibles con una amplia variedad de fosfatasas.

La histidina fosfoamidasa proteica PHP1 no hidroliza enlaces fosfoéster (P-O) de proteínas o péptidos fosforiladas (véase figuras 2-6) ni acepta el éster fosfato pNPP, un sustrato comúnmente empleado de fosfatasas tal como PP2A y fosfatasa ácida. También MUP, un sustrato de AP, PP1, PP2A y fosfatasa ácida no es aceptado como sustrato por PHP1 (véase figura 1). Por tanto, resultó ser sorprendente que PHP1 acepte DiFMUP, un derivado fluorado de MUP, FDP, DDAO, fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97 (véase figuras 1 y 7 a 11) como sustratos aunque estos compuestos sean ésteres fosfato así como pNPP y MUP.

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Por ejemplo, la figura 2 (diagrama de la izquierda) muestra la reactividad de AP con los sustratos comúnmente empleados y comercialmente disponibles para fosfatasas proteicas, pY1 (Secuencia: RRLIEDAEpYAARG), pY2 (Secuencia: TSTEPQpYQPGENL), pS (Secuencia: RRApSVA) y pT (Secuencia: KRpTIRR). Para la detección del fosfato liberado de los péptidos, ha sido empleado el ensayo de MDCC-PBP como se describe en los ejemplos. Los péptidos de fosfo-tirosina pY1 y pY2 son desfosforilados por AP con una velocidad (pmolPi/min) de 11 para pY1 y de alrededor de 12 para pY2 y una actividad específica (nmol/min*mg) de alrededor de 33 para pY1 y de alrededor de 36 para pY2. En un grado más pequeño, el péptido de fosfo-serina pS es desfosforilado con una velocidad de 3 y una actividad específica de 9. El péptido de fosfo-treonina pT no es desfosforilado por AP.

Como se muestra en la figura 3 (diagrama de la izquierda), la tirosina-fosfatasa proteica LAR (LAR-PTP) desfosforila el péptido de fosfo-tirosina pero no el péptido de fosfo-serina ni el péptido de fosfo-treonina. En estos experimentos, se ha utilizado en ensayo con verde malaquita, como se describe en los ejemplos, para la detección del fosfato liberado de los péptidos. En fuerte contraste, empleando PHP1 como enzima (figuras 2 y 3, diagramas de la derecha), la actividad desfosforilante no excede del valor testigo aunque la concentración de enzima fue 30 veces mayor que la de AP y 40 veces mayor que la de LAR-PTP.

Estos resultados fueron verificados mediante el uso de espectrometría de masas (véase figuras 4-6), la cual es una herramienta poderosa para la identificación de biopolímeros a través de sus masas individuales. Los sustratos de fosfo-péptidos tienen masas de 700-1.500 Da y perderán 80 Da tras la escisión del grupo fosfato. Esta diferencia de masa es fácilmente detectada con una alta precisión en un espectrómetro MALDI-TOF. Además, es un hecho bien aceptado que los péptidos desfosforilados son detectados en los espectrómetros de masas más fácilmente que sus contrapartidas fosforiladas (Sickmann, A. & Meyer, HE (2001) Proteomics 1, 200-206). Por tanto, podrá detectarse incluso una pequeña fracción de péptidos convertidos en el caso de que el sustrato sea aceptado por la respectiva fosfatasa. Otra ventaja de este método es que se controla directamente la naturaleza de la entidad del sustrato. Incluso la desfosforilación inducida por MALDI puede distinguirse fácilmente de la desfosforilación enzimática en el caso de residuos de fosfo-serina y -treonina, ya que la primera producirá diferencias de masa de 98 Da en lugar de \Deltam = 80 Da en el último caso.

El análisis espectrométrico de masas demuestra que el péptido pS fue reconocido como sustrato de fosfatasa por \lambdaPP y AP pero no por Lar-PTP no por PHP1 (figura 4). Después de la incubación con cualquiera de \lambdaPP o AP llega a desfosforilarse una fracción principal dentro del tiempo de reacción y se puede detectar una especie con una masa reducida en 80 Da correspondiente al péptido desfosforilado. El péptido pS incubado con Lar-PTP o con PHP1 no se escinde en absoluto. El análisis espectrométrico de masas demuestra que el péptido pT fue reconocido como sustrato de fosfatasa únicamente por \lambdaPP pero no por Lar-PTP ni por PHP1 o AP (figura 5). Después de la incubación con \lambdaPP llega a desfosforilarse una fracción importante dentro del tiempo de reacción y se puede detectar una especie con una masa reducida en 80 Da correspondiente al péptido desfosforilado. El péptido pT incubado con Lar-PTP, AP o PHP1 no cambia en absoluto.

En contraste con los residuos de fosfo-serina y -treonina, el péptido de fosfo-tirosina exhibe una fracción importante de especies desfosforiladas incluso en la muestra de control. El origen de esta especie sigue siendo incierto, ya que la fosfo-tirosina puede eliminar ácido fosfórico bajo condiciones MALDI que representaría una pérdida de \Deltam = 80 Da. Esto es esencialmente la misma diferencia de masa observada después de la escisión enzimática.

El análisis espectrométrico de masas demuestra que el péptido pY fue reconocido como sustrato de fosfatasa por Lar-PTP y AP pero no por \lambdaPP ni por PHP1 (figura 6). Después de la incubación con cualquiera de Lar-PTP o AP, el péptido llega a desfosforilarse por completo dentro del tiempo de reacción y se puede detectar una especie con una masa reducida en 80 Da correspondiente al péptido desfosforilado. El péptido pT incubado con \lambdaPP o PHP1 no cambia en absoluto en comparación con la muestra de control.

En resumen, en ninguna de las mezclas de reacción fue aceptado un fosfo-péptido como un sustrato para PHP1 sino en realidad para las otras fosfatasas ensayadas con las especificidades esperadas para el sustrato.

Como resultado del hallazgo de que los compuestos DFP, DDAO, DiFMUP, fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97 son sustratos para fosfoamidasas y fosfoamidasas proteicas del tipo PHP1, la presente invención proporciona ensayos enzimáticos continuos fácilmente realizables para la determinación de fosfoamidasas y fosfoamidasas proteicas.

Debido a que es bien conocido que el uso de fosfo-fluoróforos del tipo DiFMUP, MUP, DDAO o FDP como sustratos de fosfatasas presenta ciertas limitaciones como consecuencia de la compatibilidad de los valores pKa del sustrato con el valor óptimo de pH de la respectiva fosfatasa, ha de determinarse la dependencia del pH de la reactividad de PHP1 hacia los referidos sustratos fluorogénicos. Como se muestra en la figura 1, el pH es variado desde pH = 5-9 en etapas de 0,5 unidades de pH. Con el fin de evitar efectos indeseados de aplanamiento de la fluorescencia como consecuencia de una alta absorción por el producto de reacción que se acumula, la velocidad de reacción inicial se utiliza como una medida relativa de la dependencia del pH de la reactividad de PHP1 hacia el sustrato seleccionado. Este enfoque proporciona resultados razonables para MUP, DiFMUP y FDP pero no para DDAO incluso a una dilución de 25 \muM. Esto último, por tanto, puede proporcionar una alta sensibilidad para la detección de trazas de actividad de fosfatasa, pero no puede ser óptimo para utilizarse como un sustrato por encima de bajas concentraciones en \muM, por ejemplo, para estudios de cinética enzimática.

A partir de este experimento, llega a ser evidente una selectividad clara por el sustrato de PHP1 hacia los ésteres fosfato DiFMUP, DDAO, FDP empleados como sustratos. Como se ha indicado anteriormente, el sustrato de fosfatasa artificial más profusamente utilizado con pNPP de amplia capacidad de aplicación, así como el sustrato típico de fosfatasa alcalina MUP, no son reconocidos ni procesados pro PHP1 en cualquier valor pH. Las curvas de valoración de los otros sustratos muestran formas muy distintas que pueden reflejar tanto la dependencia del pH de la reacción enzimática como las propiedades químicas, tal como el grado de protonación de los fluoróforos. Los tres sustratos DiFMUP, FDP y DDAO muestran todos ellos velocidades de inversión en incremento medidas en sus longitudes de onda de emisión estándar cuando el pH se cambia desde valor ácido a valor neutro con un máximo en pH = 6,5-7. Se sabe que el pH óptimo para PHP1 se encuentra en un pH de alrededor de 6, pero un efecto de superposición debido a la protonación del fluoróforo y cambio de las propiedades espectrales resulta obvio a partir de un cambio de color de todas las muestras en medio ácido. Si bien DiFMUP revela un descenso en la velocidad de inversión en medios más alcalinos, la inversión de DDAO permanece relativamente constante y la curva para FDP exhibe un segundo máximo distinto. La causa de estas últimas observaciones puede proceder de dos poblaciones de FDP mono y doblemente desfosforilado con propiedades espectrales individuales o del reconocimiento del sustrato por
PHP1.

En otros experimentos, se han determinado los valores K_{M} de la reacción de PHP1 con DiFMUP y FDP (véase figuras 7 y 8). Los valores K_{M} para DiFMUP y FDP pueden ser aproximados registrando la velocidad de reacción inicial en función de la concentración de sustrato, tal como se observa por el incremento de la fluorescencia relativa en los respectivos máximos de emisión de fluorescencia tras la adición de PHP1. La velocidad de reacción de la conversión de DiFMUP y FDP por PHP1 depende claramente de la concentración de sustrato. A partir de los experimentos de valoración con sustrato totalmente convertido llega a ponerse de manifiesto que se presenta una saturación de señal dentro del intervalo de bajos valores de \muM, en particular para el derivado de fluoresceína FDP. Este efecto limita el intervalo de variación de sustrato. Para concentraciones de FDP >20 \muM, el enfriamiento rápido de la señal perturba las mediciones de la velocidad de la reacción de manera perjudicial. Sin embargo, el análisis de datos empleando un ajuste no lineal de curvas con una función hiperbólica permite deducir una constante de Michaelis de K_{M} \approx 20 \muM con una alta inseguridad. Las mediciones para DiFMUP quedan limitadas a concentraciones por debajo de 500 \muM. A pesar de este mayor intervalo para la variación del sustrato no pudo observarse saturación en la velocidad de reacción inicial ya que la correlación entre las velocidades y la concentración de sustrato siguió siendo lineal. A partir del gráfico de Lineweaver-Burk podría estimarse que el valor K_{M} excedía de 1 mM. Por la bibliografía al respecto se conocen valores K_{M} de 20 \muM, por ejemplo para la reacción enzimática de tirosina fosfatasa de células T sobre DiFMUP (Kerby, M. et al. (2001) Electrophoresis 22, 3916-3923). El mayor valor para la reacción de PHP1 sobre DiFMUP podría reflejar la aceptación de sustrato menos exacta por PHP1 para sustratos de éster fosfato. A este respecto, FDP no es comparable a DiFMUP ya que porta dos grupos fosfato y esto mejorará con seguridad la interacción con el sustrato
enzimático.

Con el fin de ensayar si los sustratos de fosfoamidasa y fosfoamidasa proteica de la presente invención son o no adecuados para la identificación de inhibidores o activadores de estas proteínas, se determinó la actividad de PHP1 con el sustrato DiFMUP en presencia de biperoxo-(bipiridina)-oxovanadato [(bp)V(bipy)], un inhibidor bien caracterizado de fosfo-tirosina fosfatasa proteica (figura 9). La concentración de inhibidor varió de 0,01 a 30 \muM, la concentración de enzima se mantuvo en 0,1 \muM y la concentración de sustrato en 50 \muM. Después de incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente, se detectó la fluorescencia en 450 nm tras la excitación a 360 nm. El ensayo proporcionó una inhibición de la actividad de PHP1 para (bp)V(bipy), reproducible y claramente dependiente de la dosis. De manera sorprendente, el compuesto (bp)V(bipy) activó la actividad de PHP1 en concentraciones equimolares en un factor de dos y mostró un efecto inhibidor solo por encima de 10 \muM.

A partir de estos experimentos llega a ser evidente que los sustratos de fosfoamidasa y fosfoamidasa proteica FDP, DDAO, DiFMUP, fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97 son adecuados para la identificación de inhibidores o activadores de dichas enzimas. Estos sustratos permiten la ejecución de ensayos enzimáticos fácilmente realizables, ahorradores de tiempo y no generadores de residuos radioactivos, aplicables también en pruebas HTS.

Los compuestos fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97 son sustratos fluorogénicos para fosfatasas alcalinas destinadas a aplicarse en inmuno-transferencias y tinturas histológicas de actividad enzimática. Estos sustratos presentan las propiedades para convertirse en un precipitado insoluble fuertemente fluorescente tras la escisión de fosfato en el lugar específico de actividad de fosfatasa. Normalmente, la AP es detectada por la conversión del sustrato debido a la alta actividad específica en comparación con otras fosfatasas y a una amplia especificidad de esta enzima por el sustrato.

De manera sorprendente, PHP1 reconoce ambos sustratos fluorogénicos fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97 como sustratos. La figura 10 muestra una transferencia de manchas de una dilución en serie de PHP1 y LAR-PTP después de la posterior incubación con la solución de sustrato de fosfato ELF®97.

Como queda demostrado en la figura 10, PHP1 muestra una señal distinta en cantidades enzimáticas por debajo de 100 ng incluso aunque se utilice un medio de detección relativamente insensible. La producción del precipitado fluorescente en el lado de la actividad de fosfoamidasa permite en principio cualquier tipo de resolución espacial, pero no proporciona ninguna guía con respecto a la naturaleza de la fosfoamidasa. La combinación de la separación de proteínas por SDS-PAGE, elecrofóresis en gel natural, electrofóresis 2D o focalización isoeléctrica con la enzima puede soslayar este problema. Generalmente, la actividad enzimática se detecta después de electrofóresis por extracción de la enzima de la matriz de poliacrilamida o por conversión de sustratos que han sido copolimerizados en la matriz de poliacrilamida o que han migrado conjuntamente al gel con la muestra de enzima. La impregnación del gel con pequeños sustratos artificiales proporciona una alternativa que ya está siendo utilizada pero con el frecuente inconveniente de que dichos sustratos retienen un reverso soluble y difuso del gel a la solución en bruto una vez que se convierten los mismos. El fosfato ELF®39 y el fosfato ELF®97 representan sustratos únicos que cambian no solo las propiedades espectrales sino también su solubilidad y, por tanto, permanecen dentro del gel en donde está situada la fosfatasa o fosfoamidasa. Un hecho importante es que las fosfoamidasas han de ser renaturalizadas al menos para la parte del dominio catalítico después de haberse realizado SDS-PAGE o electrofóresis 2D
desnaturalizante.

En los experimentos presentados en las figuras 11a) y 11b), han sido separadas muestras de a) AP, b) PHP1 y c) Lar-PTP (cada una 5 \mug) sobre 10% NOVEX® NuPAGE®. Tanto la SDS-PAGE como las transferencias de tipo western demuestran que PHP1 experimentó la renaturalización después de la separación y fue capaz de convertir los sustratos fluorogénicos fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97 a los precipitados fluorescentes deseados. Estos precipitados se acumulan en el lugar de la banda de proteína de PHP1 en el SDS Page, con el peso molecular aparente esperado de 14 kDa (estimado a partir del marcador de la proteína y contra-tinción con azul de coomassie).

Con estos sustratos también es posible determinar si un cierto inhibidor o activador actúa de forma específica solo sobre una fosfoamidasa o fosfatasa en una muestra que comprende otras fosfoamidasas o fosfatasas o si el inhibidor o activador inhibe o activa varias fosfoamidasas o fosfatasas. Para ello, una muestra que comprende varias fosfoamidasas y/o fosfatasas se separa, por ejemplo, por electrofóresis en gel natural. A continuación, el gel se equilibra en una primera etapa con el inhibidor o activador y, en la segunda etapa, con el fosfato ELF®39 y/o fosfato ELF®97. La especificidad del inhibidor o activador se puede determinar comparando la señal producida en el gel incubado con el inhibidor o activador con las señales en un gel de control sin la sustancia de ensayo. Por ejemplo, si la muestra separada por electrofóresis en gel contiene cinco fosfatasas o fosfoamidasas diferentes que reaccionan con fosfato ELF®39 y/o fosfato ELF®97, el gel mostrará cinco manchas resultantes de la desfosforilación del sustrato. Si se incuba un segundo gel con un inhibidor específico para solo una de las fosfatasas o fosfoamidasas, la posterior incubación con fosfato ELF®39 y/o fosfato ELF®97 se traducirá solo en cuatro manchas. Comparando el gel que no contiene inhibidor con el gel incubado con el inhibidor, se puede evaluar la especificidad del inhibidor. Si en lugar de un gel natural se emplea un gel SDS o IEF, ha de asegurarse que las proteínas de interés hayan sido renatura-
lizadas.

Ejemplos Análisis de la actividad de fosfatasa/fosfoamidasa

Con el fin de evaluar la especificidad en sustrato de PHP1 hacia otras secuencias de péptidos fosforilados, se han seleccionados fosfo-péptidos sintéticos como sustratos artificiales. Estos péptidos comercialmente disponibles (Upstate Inc., Waltham, MA) son sustratos comúnmente utilizados para fosfatasas proteicas que desfosforilan fosfo-serina, fosfo-treonina o fosfo-tirosina con las respectivas sensibilidades:

Nombre	Tipo de fosfopéptido	Secuencia	Fuente
pY1	fosfopéptido de tirosina	RRLIEDAEpYAARG	Upstate Inc., Waltham, MA
pY2	fosfopéptido de tirosina	TSTEPQpYQPGENL	Upstate Inc., Waltham, MA
PS	fosfopéptido de serina	RRApSVA	Upstate Inc., Waltham, MA
PT	fosfopéptido de treonina	KRpTIRR	Upstate Inc., Waltham, MA

Las fosfatasas empleadas para estudios comparativos de reconocimiento del sustrato son LAR-PTP (tirosina fosfatasa LAR, recombinante), \lambda-PP (fosfatasa proteica lambda, recombinante) y AP (fosfatasa alcalina, intestino bovino).

Las concentraciones de enzima son ajustadas individualmente para cada disposición experimental de manera que las reacciones enzimáticas puedan ser controladas según un régimen lineal en la escala de tiempo de segundos a minutos.

a) Ensayo MDCC-PBP

En una primera serie de experimentos, se compara la reacción de fosfatasa de PHP1 con la de fosfatasa alcalina empleando como sustratos los fosfopéptidos antes mencionados. Con el fin de seguir la reacción de forma continua, se detecta la entidad fosfato que fue escindida por la fosfatasa empleando la proteína de unión a fosfato marcada con cumarilo MDCC-PBP (WO 95/02825; Brune et al. (1994) Biochemistry 33, 8262-8271) que es suministrada por el Medical Research Council, London, UK. En una primera etapa, ha de determinarse el nivel basal de fosfato libre en soluciones de fosfo-péptido 40 \muM (en tampón de ensayo: 25 mM Hepes pH 7,0, 1 mM MgCl_{2}, 20 mM NaCl, 0,01 mg/ml BSA) por valoración versus una solución de proteína de unión a fosfato 4 \muM. Ninguna de las soluciones de péptidos excedió de 0,5 moles% de fosfato libre/péptido. La reacción de fosfatasa/fosfoamidasa fue realizada mezclando 50 \mul de solución de péptido (concentración final 20 \muM) con 50 \mul de dilución con MDCC-PBP 6 \muM en tampón de ensayo en microplacas blancas a temperatura ambiente y por último añadiendo 50 \mul de la solución de fosfatasa o fosfoamidasa. La concentración final de las enzimas en la solución de ensayo es de 0,035 \muM para EP y de 1 \muM para PHP1. Se mide el incremento de fluorescencia (Ex 425 nm; Em 465 nm) con resolución en el tiempo empleando un lector de microplacas estándar.

b) Ensayo con verde malaquita

La reacción enzimática de Lar-tirosina fosfatasa proteica hacia los fosfopéptidos es comparada con la de PHP1 empleando el ensayo clásico con fosfato de malaquita. El fosfato inorgánico escindido del sustrato péptido es detectado como un co-complejo verde con molibdato y colorante de malaquita. La reacción de fosfatasa es realizada mezclando 950 \mul de solución de péptido (concentración final 50 \muM) con 50 \mul de solución de fosfatasa/fosfoamidasa, habiendo sido preparadas ambas soluciones madre en tampón de ensayo estándar (25 mM Hepes pH 7,0, 1 mM MgCl_{2}, 20 mM NaCl, 0,01 mg/ml BSA). La concentración final de las enzimas en la solución de ensayo es de 0,025 \muM para Lar-PTP y 1 \muM para PHP1. Después de intervalos de tiempo discretos se mezcló una muestra de 50 \mul de cada mezcla de reacción con la solución de detección de molibdato/malaquita (BIOMOL) y se incubó a temperatura ambiente. La liberación de fosfato fue identificada por el incremento de absorción en 630 nm.

Ensayos de dependencia del pH de PHP1

La mezcla de reacción fue preparada diluyendo el sustrato de la solución madre 10 mM en DMSO en el tampón de reacción acuoso consistente en 25 mM de sustancia tampón, 20 mM NaCl, 1 mM MgCl_{2}, 0,1 mg/ml BSA para proporcionar una concentración final de 100 \muM para MUP y DiFMUP o 25 \muM para DDAO y FDP, respectivamente. Como sustancia tampón se utilizó MES/NaOH para valores pH de 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, mientras que se utilizó Tris/HCl para valores pH de 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0. Para iniciar la reacción se añadió PHP1 a partir de una pre-dilución en el respectivo tampón de reacción para proporcionar una concentración final de 0,1 \muM. La reacción fue controlada registrando el incremento de fluorescencia relativa en los respectivos máximos de emisión de fluorescencia (lector de microplacas Fluoromax Gemini XL).

Análisis cinético de la conversión de FDP y DiFMUP por PHP1

La mezcla de reacción se prepara diluyendo el sustrato a partir de una solución madre 10 mM en DMSO en el tampón de reacción acuoso estándar (25 mM HEPES pH = 7,0, 20 mM NaCl, 1 mM MgCl_{2}, 0,01 mg/ml BSA) para proporcionar una concentración final de 1-400 \muM. Para iniciar la reacción, se añadió PHP1 a partir de una solución madre a una concentración final de 0,1 \muM. La reacción fue controlada registrando el incremento de fluorescencia relativa en los respectivos máximos de emisión de fluorescencia en un espectrómetro de fluorescencia SLM. Para poder realizar la cuantificación, la señal de fluorescencia fue normalizada empleando una curva estándar registrada para una dilución en serie de DiFMUP y FDP totalmente desfosforiladas, respectivamente. Todos los registros fueron realizados en el mismo voltaje PM y tiempo de integración con corrección respecto a la ganancia de señal relativa.

Análisis espectrométrico de masas de la actividad enzimática hacia péptidos fosforilados sintéticos

La disposición experimental es como sigue: el sustrato de fosfo-péptidos se diluye a partir de soluciones madre a concentraciones de 50 \muM y se mezcla con la fosfatasa individual para proporcionar concentraciones de enzima finales de 1 \muM PHP1, 0,05 \muM Lar-PTP, 0,05 \muM \lambdaPP y 0,05 \muM AP. La mezcla se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente y por último se salpica en volúmenes de 0,5 \mul sobre una diana de MALDI. Muy poco después, se añadió la solución de matriz de ácido alfa-hidroxi-cinámico y se dejaron secar las gotitas. La espectrometría de masas fue realizada en un espectrómetro MALDI-TOF en el modo reflectivo con extracción retardada.

Ensayos de evaluación respecto a inhibidores o activadores de fosfoamidasas proteicas y fosfoamidasas

Las mezclas de reacción para la evaluación de inhibidores fueron preparadas mediante dilución en serie dos veces del inhibidor bpV(bipy) (Alexis Biochemicals San Diego) comenzando a 60 \muM en 50 \mul del tampón de ensayo consistente en 25 mM Hepes pH = 7, 20 mM NaCl, 1 mM MgCl_{2}, 0,01 mg/ml BSA. En la siguiente etapa, se añadieron 50 \mul de una solución de 0,3 \muM PHP1 en tampón de ensayo a cada uno de los pocillos y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Con el fin de iniciar la reacción, se añadió rápidamente a todos los pocillos una pre-dilución de 50 \muM DiFMUP-sustrato en tampón de ensayo. La reacción fue controlada registrando el incremento de fluorescencia relativa en los respectivos máximos de emisión de fluorescencia (lector de microplacas Fluoromax Gemini XL). La actividad relativa se calculó empleando el RFU derivado de una reacción de control sin inhibidor.

Detección de fosfoamidasas proteicas y fosfoamidasas en transferencias y geles

Para demostrar la utilidad del fosfato ELF®39 y del fosfato ELF®97 para la detección de fosfoamidasas proteicas y fosfoamidasas, se diluyen PHP1 y LAR-PTP en serie en un factor de 2 con tampón de ensayo (25 mM HEPES pH 7,0, 20 mM NaCl, 1 mM MgCl_{2}, 0,1 mg/ml BSA) y se salpican 10 \mul de cada dilución sobre una membrana de nitrocelulosa. Después de un lavado breve (alrededor de 5 minutos) en tampón de ensayo, la membrana se cubrió con una solución del respectivo sustrato (dilución 1:20 de la solución madre suministrada) en tampón de ensayo y se incubó durante al menos 1 hora o hasta que se había desarrollado una señal estable. La fluorescencia es detectada en un iluminador UV de sobremesa estándar (longitud de onda de excitación normalmente 254 nm o 300-370 nm) o, para una mayor selectividad de la señal, mediante sistemas de formación de imágenes fluorescentes equipados con fuentes de luz de excitación y fibras ópticas de paso estrecho que permiten compaginar de forma óptima las propiedades espectrales de ELF®39 y ELF®97. Para la detección de fosfoamidasa proteica en geles SDS, se separan AP, PHP1 y Lar-PTP (cada una 5 \mug) en un sistema de BisTris/gel MES NuPAGE® al 10% (Invitrogen®). La preparación de la muestra se realizó añadiendo tampón de muestra SDS NuPAGE® (Invitrogen®) a las soluciones enzimáticas y procediendo a la carga inmediata sobre el gel esencialmente sin calentamiento previo. Después de la separación, el gel fue utilizado directamente para la detección o bien transferido sobre membrana de nitrocelulosa empleando tampón de transferencia NuPAGE® (Invitrogen®) esencialmente sin metanol. Los geles y transferencias se lavaron entonces tres veces en salina tamponada con Tris, 1 mM MgCl_{2}, agitando suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente y posterior incubación con una solución del respectivo sustrato (dilución 1:20 de la solución madre suministrada) en tampón de ensayo (25 mM HEPES pH 7,0, 20 mM NaCl, 1 mM MgCl_{2}, 0,1 mg/ml BSA). Después de la incubación durante al menos 1 hora, la señal de fluorescencia fue detectada como se ha descrito anteriormente.

Claims

1. Uso de al menos uno de los sustratos seleccionados del grupo consistente en FDP, DDAO, DiFMUP, fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97 para la caracterización y determinación cualitativa y/o cuantitativa de la actividad de una fosfoamidasa mediante la detección de la hidrólisis de enlaces fosfoéster (P-O).

2. Uso según la reivindicación 1, en donde la fosfoamidasa es una fosfoamidasa proteica.

3. Uso según la reivindicación 2, en donde la fosfoamidasa proteica es una fosfoamidasa proteica de histidina.

4. Uso según la reivindicación 3, en donde la fosfoamidasa proteica de histidina es PHP1.

5. Método para la identificación de un inhibidor o activador de una fosfoamidasa, que comprende las etapas de:

a): establecer una muestra que comprende una fosfoamidasa y una sustancia de ensayo,

b): administrar a la muestra un sustrato seleccionado del grupo consistente en FDP, DDA, DiFMUP, fosfato ELF®39 y fosfato ELF®97,

c): detectar la señal producida por la hidrólisis de los enlaces fosfoéster (P-O) del sustrato, y

d): identificar la sustancia de ensayo como un activador o inhibidor de la fosfoamidasa a través de la comparación de la señal producida en la muestra que comprende la sustancia de ensayo con la señal producida en una muestra de control que no comprende sustancia de ensayo.

6. Método para la identificación de la actividad de una fosfoamidasa en un gel de electrofóresis o sobre una membrana de transferencia, que comprende las etapas de:

a): separar una muestra que comprende una fosfoamidasa en un gel,

b): si es necesario, renaturalizar la fosfoamidasa,

c): incubar el gel o la membrana de transferencia resultante de la transferencia del gel con fosfato ELF®39 y/o fosfato ELF®97 como sustrato, y

d): detectar la señal producida por la hidrólisis de los enlaces fosfoéster (P-O) del sustrato.

7. Método según la reivindicación 6 para la determinación de la especificidad de un inhibidor o activador para una cierta fosfoamidasa o fosfatasa, que comprende las etapas de:

a): separar una muestra que comprende varias fosfoamidasas en un gel,

b): si es necesario, renaturalizar la fosfoamidasa,

c): incubar el gel o la membrana de transferencia resultante de la transferencia del gel con el inhibidor o activador y posteriormente con fosfato ELF®39 y/o fosfato ELF®97 como sustrato, y

d): determinar la especificidad del inhibidor o activador comparando la señal producida en el gel o membrana de transferencia incubado con el inhibidor o activador con la señal producida en un gel o membrana de transferencia de control que no se ha incubado con el inhibidor o activador.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la fosfoamidasa es una fosfoamidasa proteica.

9. Método según la reivindicación 8, en donde la fosfoamidasa proteica es una fosfoamidasa proteica de histidina.

10. Método según la reivindicación 9, en donde la fosfoamidasa proteica de histidina es PHP1.