ES2255169T3

ES2255169T3 - Articulo revestido de polimero y su utilizacion.

Info

Publication number: ES2255169T3
Application number: ES98932673T
Authority: ES
Inventors: Steinar Hagen; Rune Ringberg; Geir Fonnum
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences Corp
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-22
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2018-06-22
Also published as: US6420028B1; JP4156675B2; DE69832502T2; JP2002507934A; WO1998058734A1; EP1015107B1; SE9702427D0; EP1015107A1; DE69832502D1; ATE310578T1

Abstract

Un artículo polimérico revestido caracterizado por estar el revestimiento covalentemente unido a la superficie del polímero por medio de los dobles enlaces del polímero, teniendo dicho artículo la estructura: P-L-CH-CH2-Y(R2)p | X(R1)P donde a) P constituye un polímero básico y otros grupos -L-CH(-X(R1)p)-CH2(-Y(R2)p); b) L es un anillo de benceno; c) X e Y son independientemente seleccionados entre halógenos, en particular Br, y N, S y O; d) R1 es hidrógeno, un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico o acilo, tal como alquilo C1-C10 o acilo C1-C18 o R2, cuando X es N, O o S; e) R2 es hidrógeno; alquilo lineal, ramificado o cíclico, tal como alquilo C1- C18, -R3(-NH2)q, alquilarilo o arilalquilo en donde la parte alquilo puede contener de 1 a 18 átomos de carbono; -R3(-NH- CR4=O)q, -CR4=O o grupos polialquiloxi inferiores que pueden haber sido terminalmente acilados o alquilados; f) p es un número entero de 0 a 3, con la condición de que, cuando X sea halógeno, p sea igual a 0, de que,cuando X sea O, p sea igual a 1, de que, cuando X sea S, p sea igual a 1 ó 2 y de que, cuando X sea N, p sea igual a 1, 2 ó 3, y con la condición también de que, para p igual a 2 ó 3, los dos o tres grupos R2 puedan ser idénticos o diferentes; g) R3 es un alquilo lineal, cíclico o ramificado, -O-alquilo, hidroxialquilo o fenilalquilo, con hasta 18 átomos de carbono en la parte alquilo; y R4 es un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico, tal como alquilo C1-C18; h) q es un número entero >0, que representa que uno o más hidrógenos en R3 pueden haber sido substituidos con un grupo amino primario (-NH2) respectivo o un grupo -NH-CR4=O respectivo.

Description

Artículo revestido de polímero y su utilización.

Campo técnico y técnica anterior

La presente invención se relaciona con artículos poliméricos revestidos y con procedimientos para su producción y con el uso del artículo como medio de cromatografía. Específicamente, la invención se relaciona con artículos revestidos con el revestimiento covalentemente unido a la superficie del polímero mediante dobles enlaces pendientes de la superficie del polímero. Un ejemplo de grupos pendientes son los grupos vinilo residuales que quedan tras la polimerización de monómeros vinílicos, tales como monómeros de divinilbenceno.

En el contexto de la presente invención, el término "revestido"/"revestimiento" significa que los grupos alqueno pendientes sobre la superficie han sido derivatizados para introducir nuevas funcionalidades, que pueden ser adaptadas a dos usos específicos del artículo (soporte cromatográfico y soporte para la síntesis de oligopéptidos y oligonucleótidos). "Capa" tiene, pues, un significado algo diferente en comparación con revestimiento en el sentido de la adsorción física y de la estabilización por entrecruzamiento de una capa adsorbida (capa) en la capa y/o en la superficie original.

La fase estacionaria (soporte, matriz) en cromatografía líquida está compuesta por una matriz porosa y está más comúnmente en forma de perlas. Se usa una amplia variedad de materiales para matrices de cromatografía, tanto materiales inorgánicos como orgánicos. Las demandas sobre la matriz son varias. Debe ser suficientemente estable química y físicamente y poder soportar condiciones extremas de pH. La matriz debe ser rígida para permitir altas velocidades de flujo en columnas empaquetadas con partículas de pequeños diámetros. También ha de ser posible producir partículas con un amplio margen de porosidades.

Las características superficiales de la matriz son importantes. Introduciendo nuevas estructuras químicas en la superficie de la matriz, es posible diseñar fases estacionarias que interaccionan más o menos específicamente con una molécula particular. En la separación cromatográfica de proteínas en solución acuosa, la matriz es normalmente hidrofílica. En la cromatografía de fase invertida ("RPC") para la separación de péptidos o de proteínas, se han usado geles de sílice como medio de cromatografía. Los geles de sílice son lo suficientemente rígidos como para soportar altas velocidades de flujo y se dispone de diferentes hidrofobicidades (C4, C8, C18). Sin embargo, los geles de sílice no son estables por encima de pH 8,0 y por ello no pueden ser limpiados usando álcali. En lugar de ello, es habitual usar matrices rígidas de polímeros orgánicos, v.g., polimetacrilato o poliestireno/poliestireno-divinilbenceno. Las partículas de poliestireno-divinilbenceno son hidrofóbicas en soluciones acuosas y se tienen que usar grandes cantidades de solventes orgánicos para eluir las moléculas absorbidas. La selectividad es también limitada. Debido al hecho de que sólo hay una pequeña variación en la hidrofobicidad de estas partículas, su uso es limitado. Por el contrario, la razón de hidrofobicidad/hidrofilicidad de las partículas de sílice puede variar por reacciones químicas. Existe una gran variedad en la química disponible para la modificación de la superficie de la sílice hidrofílica. Para aumentar las posibilidades de utilización de partículas de poliestireno-divinilbenceno y otros polímeros hidrofóbicos, se reconoce que la superficie de las partículas debe ser modificada para ser más hidrofílica antes de poderlas usar como medio de separación cromatográfica. Se han sugerido diferentes métodos para la hidrofilización de la superficie de partículas basadas en polímeros hidrofóbicos.

WO 91/11241 se relaciona con un método de producción de un revestimiento hidrofílico sobre una superficie hidrofóbica mediante el cual se adsorbe un compuesto que tiene un dominio hidrofóbico y uno hidrofílico sobre la superficie. Los inconvenientes de este método son varios. El polímero que se ha de adsorber tiene un alto peso molecular y, por lo tanto, el polímero no se distribuirá uniformemente en todos los poros. El control de la distribución del tamaño de poros se pierde entonces y algunos poros pueden incluso no quedar revestidos en absoluto. Como el revestimiento polimérico sólo se adsorbe, puede soltarse de la superficie al contactar con solventes no polares. Por lo tanto, el revestimiento debe ser entrecruzado.

WO 95/23022 describe un método de unión covalente de un revestimiento hidrofílico sobre una superficie hidrofóbica. Se injerta un revestimiento polimérico insaturado en la superficie a través de los grupos insaturados que se hallan sobre la superficie. También con este método existe el mismo problema de la obtención del revestimiento uniformemente distribuido sobre la superficie porosa de la matriz.

Se han revisado diversos usos de grupos vinilo pendientes en polímeros de vinilbenceno durante el año de prioridad por parte de Hubbard y col. (Reactive Functional Polymers 36 (1998), 1-16 y 17-30). El uso de grupos vinilo pendientes para inmovilizar un catalizador sobre una resina de poliestireno macroporosa ha sido descrito por Faber y col. (Reactive Polymers 11 (1989), 117-126). La modificación de soportes cromatográficos basados en vinilbenceno por rutas distintas de la que transcurre a través de vinilos residuales ha sido descrita por Sun y col. (J. Chromatog. 522 (1990), 95-105). Moberg y col. (Reactive Polymers 15 (1991), 25-35) han descrito aún otra ruta.

Objetivos de la invención

El objeto de la presente invención es obtener artículos poliméricos revestidos mejorados y métodos mejorados de revestimiento de un artículo polimérico para cambiar las características superficiales del artículo sin los inconvenientes de los métodos conocidos.

Otro objeto de la invención es producir partículas poliméricas con características superficiales adecuadas para uso cromatográfico.

Es otro objeto de la invención proporcionar un revestimiento que puede ser derivatizado para producir una amplia gama de grupos funcionales diferentes para uso en diferentes tipos de cromatografía. La intención es poder conseguir una gran variedad tanto en hidrofobicidad/hidrofilicidad como en selectividad y reducir la cantidad de solvente usado en la elución.

Las demandas sobre soportes para uso en la síntesis de oligonucleótidos y oligopéptidos con respecto al equilibrio entre hidrofobicidad e hidrofilicidad son menos críticas que para las matrices cromatográficas, aunque sigue siendo importante mantener poros abiertos para mantener una alta capacidad de un soporte poroso dado. El objeto primario en este aspecto de la invención es proporcionar una forma simple y bien definida de introducir un asidero en forma de un grupo amino primario o secundario en un soporte polimérico basado en un polímero hidrofóbico.

La invención

Se consiguen los objetos de la invención mediante los artículos poliméricos y los métodos definidos en las reivindicaciones. Según la invención, se obtiene un artículo polimérico revestido, cuyo articulo se caracteriza por unirse el revestimiento covalentemente a la superficie del polímero por dobles enlaces del polímero. El artículo tiene la estructura:

P --- L ---

\delm{C}{\delm{\para}{X(R _{1} ) _{P} }}

H --- CH_{2} --- Y(R_{2})_{p}

donde

: P comprende la estructura polimérica básica del artículo antes del revestimiento y otros grupos

-L-CH(-X(R_{1})_{p})-CH_{2}(-Y(R_{2})_{p});

: L es un anillo de benceno;

: X e Y son independientemente seleccionados entre halógenos, en particular Br, y N, S y O; R_{1} es hidrógeno, un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico o acilo, tal como alquilo C_{1}-C_{10} o acilo C_{1}-C_{18} o R_{2}, cuando X es N, O o S;

: R_{2} es hidrógeno; alquilo lineal, ramificado o cíclico, tal como alquilo C_{1}-C_{18}, -R_{3}(-NH_{2})_{q}, alquilarilo o arilalquilo en donde la parte alquilo puede contener de 1 a 18 átomos de carbono; -R_{3}(-NH-CR_{4}-O)_{q}, -CR_{4}=O o grupos polialquiloxi inferiores que pueden haber sido terminalmente acilados o alquilados (v.g., -((CH_{2})_{n}-O)_{n'}OR', donde n es un número entero de 2, 3 ó 4 y n' es un número entero de 2 a 100, y un H en CH_{2} puede haber sido substituido con metilo, y R' puede ser cualquiera de los grupos R_{1} expresamente mencionados;

: p = 0 cuando Y = Br; p puede ser 1 cuando Y = O o S; p puede ser 2 cuando Y = N o S; p puede ser 3 para Y = N. En caso de haber más de un R_{2}, pueden ser idénticos o diferentes;

: R_{3} es un alquilo lineal, cíclico o ramificado, -O-alquilo, hidroxialquilo o fenilalquilo, con hasta 18 átomos de carbono en la parte alquilo;

: R_{4} es un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico, tal como alquilo C_{1}-C_{18};

: q representa que uno o más (1, 2, 3, 4, etc., es decir, 1-poli) hidrógenos en un grupo alquilo básico R_{3} pueden ser substituidos con un grupo amino primario (-NH_{2}) respectivo o un grupo -NH-CR_{4}=O respectivo.

En los grupos alquilo y acilo antes mencionados, uno o más hidrógenos pueden estar eventualmente substituidos con un grupo amino o hidroxi o alcoxi y las cadenas de carbonos pueden ser eventualmente rotas en una o más localizaciones por un oxígeno éter o un nitrógeno amino, siendo la condición que haya a lo sumo un átomo seleccionado entre oxígeno y nitrógeno que se una a uno y el mismo átomo de carbono hibridado a sp^{3}. Entre los grupos alquilo particularmente interesantes con cadenas hidrocarbonadas rotas, se pueden mencionar los que tienen unidades repetitivas de óxido de alquileno, tales como -CH_{2}CH_{2}-O-, -CH_{2}CH_{2}CH_{2}-O-, -CH_{2}CH(CH_{3})-O-, etc.

Según otro aspecto de al invención, se facilita un método de producción de un artículo polimérico revestido, caracterizado por derivatizar dobles enlaces unidos a la estructura básica del polímero (P) del artículo a través del grupo L.

\newpage

Según aún otro aspecto de la invención, se usa un artículo polimérico revestido según la invención como medio cromatográfico o como soporte para la síntesis en fase sólida de un oligopéptido o de un oligonucleótido.

Con la presente invención, es posible aplicar un revestimiento a cualquier artículo polimérico que tenga dobles enlaces sobre la superficie y modificar así la superficie de un modo predeterminado. Preferiblemente, el método es usado para fabricar medios cromatográficos. Se vio que se puede sintetizar una amplia gama de medios cromatográficos introduciendo diferentes estructuras químicas sobre una superficie polimérica porosa. Se puede introducir una cantidad controlada de un grupo y/o carga deseados sobre la superficie. Con el método según la invención, el revestimiento, incluyendo el grupo y/o carga deseados, es uniformemente esparcido sobre la superficie también en los poros y la distribución del tamaño de poro se mantiene entonces intacta. Además, se puede variar la distribución del tamaño de poro variando la longitud de los grupos introducidos sobre la superficie. El método es adecuado para la producción de medios para cromatografía de fase invertida ("RPC") con el mismo rendimiento que los medios de sílice, pero sin los inconvenientes de la sílice. Se preparan nuevos medios de RPC introduciendo grupos polares que contienen grupos alquilo o amida largos próximos a la superficie. Variando la longitud de las cadenas de alquilo y amida, se pueden sintetizar diferentes matrices con diversas hidrofobicidades y distribuciones de tamaño de poro. También se pueden introducir grupos amino primarios y secundarios que son esenciales para el uso de soporte en la síntesis de oligonucleótidos.

Según la invención, el doble enlace de un grupo pendiente se transforma en una halohidrina o un haluro vicinal, es decir, -CHX_{1}-CHY_{1}-, donde al menos uno de X_{1} e Y_{1} es un substituyente seleccionado entre halógenos, en particular bromo, y el grupo restante de X_{1} e Y_{1} es hidroxi o alcoxi, o en un epóxido o en análogos nitrogenados o azufrados correspondientes.

Se puede introducir el halógeno por adición de ciertos compuestos que contienen halógeno, siendo el halógeno preferido el bromo, en los dobles enlaces presentes en la superficie del polímero. Se puede introducir el bromo por métodos conocidos, tales como reacción con Br_{2} en un solvente adecuado, o con N-Br-succinimida en un solvente adecuado. La síntesis será ahora ilustrada discutiendo la reacción con bromo. Ésta no excluye el uso de otros halógenos, tales como cloro y yodo, que con frecuencia experimentan reacciones análogas.

Preferiblemente, en la primera etapa del método un compuesto polimérico con uno o más dobles enlaces (P-L-CH=CH_{2}, teniendo P y L el mismo significado que antes) reacciona con Br_{2} en una solución que contiene R_{1}OH o una mezcla de H_{2}O y un solvente orgánico soluble en H_{2}O, mediante lo cual se obtiene un artículo polimérico revestido que tiene la estructura

(1)P --- L ---

\delm{C}{\delm{\para}{OR _{1} }}

H --- CH_{2} --- Br

o una mezcla de las estructuras:

(1) y

(2)P --- L ---

\delm{C}{\delm{\para}{Br}}

H --- CH_{2} --- Br

donde

R_{1} es hidrógeno o un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico que contiene átomos de oxígeno como se ha definido antes. Particularmente, R_{1} puede ser hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{10}.

Como se ha indicado antes, el método según la invención puede ser usado sobre superficies poliméricas con dobles enlaces libres sobre la superficie. Como tal polímero, se pueden mencionar polímeros de compuestos aromáticos que contienen grupos vinílicos. Los compuestos aromáticos pueden ser monofuncionales, di- o polifuncionales. El polímero debe tener una cantidad suficiente de grupos di- o polivinílicos para dar lugar a una estructura entrecruzada. Como compuestos aromáticos adecuados, se pueden mencionar, por ejemplo, estireno, divinilbenceno, vinilbenceno, cloruro de vinilbencilo, etilvinilbenceno, acetoxivinilbenceno y otros derivados de vinilbenceno. En una realización preferida, la estructura polimérica básica es un polímero entrecruzado de estireno, divinilbenceno y etilvinilbenceno o un polímero de divinilbenceno y etilvinilbenceno. Los grupos pendientes son entonces grupos benceno resultantes de grupos vinilo que no se han entrecruzado. La estructura puede ser descrita como sigue:

1

Los dobles enlaces libres de los grupos vinilo sobre la superficie del polímero son usados para la reacción con bromo.

En realizaciones preferidas de la invención, los artículos revestidos son partículas. Preferiblemente, las partículas revestidas son preparadas revistiendo partículas no revestidas con un diámetro de 1-200 mm, preferiblemente de 3-50 mm. El área superficial de las partícula no revestidas se encuentra en el margen de 1-1.000 m^{2}/g y los volúmenes de poro adecuados son de 0,1-3,0 ml/g. El contenido de grupos vinilo residuales en las parlas es normalmente de 0,3-7,7 mmol/g y debe ser preferiblemente de 0,3-3 mmol/g, más preferiblemente de 1-2 mmol/g.

En la primera etapa de la invención, el artículo polimérico no revestido contacta con bromo disuelto en el mismo solvente. Con frecuencia, el artículo polimérico está en forma de partículas que, con fines de revestimiento, están suspendidas en el mismo solvente que el bromo. En la reacción con el bromo, la elección del solvente es importante para el resultado de la reacción. La reacción con bromo puede dar lugar a un monobromuro o a un dibromuro o a una mezcla de éstos, como se ha descrito antes. Normalmente, se obtiene una mezcla con un contenido variable de mono- y dibromuro. Este contenido depende del solvente usado en el proceso. Es sabido que la bromación en solventes no polares, como el tetraclorometano, da lugar a un alto contenido de dibromuro. En solventes polares, como los alcoholes inferiores, es decir, alcoholes C_{1}-C_{10} lineales o ramificados, se obtiene un alto contenido del monobromuro. Sin embargo, en agua, la cantidad de dibromuro conseguida es alta debido al hecho de que el bromo es parcialmente soluble en agua. Si se mezcla agua con un solvente orgánico soluble en agua y en el que se disuelve el bromo, entonces se obtiene el monobromuro en gran medida. Con grupos alquilo más largos, los alcoholes se vuelven más no polares y entonces aumenta la cantidad de dibromuro. En general, puede decirse que, si la polaridad, expresada por la constante dieléctrica \varepsilon, para los solventes o mezclas de solventes es baja, se obtendrá un alto contenido de dibromuro. Si \varepsilon es alta, la producción del monobromuro se verá favorecida. En la presente invención, se prefiere una elevada cantidad del monobromuro. Entonces, se prefiere una \varepsilon de entre 6 y hasta aproximadamente 78. Los solventes adecuados para la invención son alcoholes C_{1}-C_{10} tales como metanol, etanol, 1-propanol, 1-butanol y 1-hexanol. Si se usa una mezcla de agua y un solvente orgánico, se sugieren solventes como el tetrahidrofurano y los alcoholes inferiores. En este último caso, R_{1} en la fórmula anterior será H. Existen muchos informes sobre la reacción de bromación de grupos vinilo. Se pueden citar las siguientes referencias: Yates, K., McDonald, R.S. y Shapiro, S.A. (1973): J. Org. Chem. 38, 2465; J.H. Rolston y K. Yates (1969): J. Am. Chem. Soc. 91, 1469; R.C. Fahey (1989): Topics in stereochemistry, Wiley, New York, pp. 280-286.

La reacción con bromo es adecuadamente conducida a una temperatura de entre -20 y 50ºC, preferiblemente de entre 0 y 20ºC. La cantidad de bromo usada es adecuadamente de 0,1 a 10 moles de bromo/mol de vinilo, preferiblemente de 0,5 a 2 moles de bromo/mol de vinilo. La cantidad de monobromuro obtenida es también dependiente de la concentración de bromo. Se pueden usar concentraciones de 0,05-0,5 moles/l de solvente, preferiblemente de 0,1-0,2 moles/l.

En la siguiente etapa de la invención, los artículos bromados de la invención reaccionan con un compuesto Y(R_{2})_{p},
mediante lo cual se obtiene un artículo polimérico revestido que tiene la estructura

\vskip1.000000\baselineskip

(3)P --- L ---

\delm{C}{\delm{\para}{OR _{1} }}

H --- CH_{2} --- Y(R_{2})_{p}

\newpage

o una mezcla de las estructuras (3) y

(2)P --- L ---

\delm{C}{\delm{\para}{Y(R _{2} ) _{p} }}

H --- CH_{2} --- Y(R_{2})_{p}

donde

Y = N, S u O y R_{2}, R_{3} y p tienen el mismo significado que antes.

El compuesto Y(R_{2})_{p} puede ser seleccionado entre el grupo: amoníaco, mono-, di- o polialquilaminas, mono-, di- o polialquilalcoholes y mono-, di- o polialquiltioles, siendo el grupo amina, alcohol o tiol, respectivamente, un grupo primario. El grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y la longitud del grupo alquilo es preferiblemente no mayor de C_{18} para cumplir con los requerimientos de solubilidad para los solventes preferidos. Cuanto más largo sea el grupo alquilo, más hidrofóbico será el medio cromatográfico. Grupos alquilo más largos darán también lugar a una reducción de los poros de pequeño tamaño (< 50 \ring{A} de diámetro) del artículo polimérico.

En la segunda etapa, se mezcla una suspensión acuosa de los artículos bromados con, v.g., la amina. Es también posible usar una mezcla de agua y un alcohol inferior, como el metanol o el etanol, como medio de suspensión. La temperatura de reacción es adecuadamente de 50 a 100ºC y el tiempo de reacción es de aproximadamente 24 h.

Si los artículos bromados reaccionan con amoníaco o con una amina primaria (mono, di o poli), se obtienen artículos poliméricos revestidos que tienen la estructura:

(5)P --- L ---

\delm{C}{\delm{\para}{OR _{1} }}

H --- CH_{2} --- NH --- R_{2}

o una mezcla de: estructuras (5) o una mezcla de estructuras: (5) o

(6)P --- L ---

\delm{C}{\delm{\para}{NH --- R _{2} }}

H --- CH_{2} --- NH --- R_{2}

o la estructura:

(16)P --- L ---

\delm{C}{\delm{\para}{OR _{1} }}

H --- CH_{2} --- NH --- R_{3} --- (NH_{2})_{q}

o una mezcla de estructuras: (16) y

(17)P --- L ---

\delm{C}{\delm{\para}{NH --- R _{3}  ---
(NH _{2} ) _{q} }}

H --- CH_{2} --- NH --- R_{3} --- (NH_{2})_{q}

donde R_{1}, R_{2}, R_{3} y q tienen el mismo significado que antes. Estos compuestos pueden reaccionar además con un cloruro de ácido, un anhídrido de ácido o isocianato:

(7)R_{4} ---

\uelm{C}{\uelm{\para}{Z}}

= O

(8)R_{4}-N=C=O

o mediante lo cual se obtiene un artículo polimérico revestido que tiene la estructura

2

o una mezcla de las estructuras: (9) y

3

o que tiene la estructura:

4

o una mezcla de las estructuras: (11) y

5

o un artículo polimérico revestido que tiene la estructura:

6

o una mezcla de las estructuras: (18) y

7

o la estructura:

8

\newpage

o una mezcla de estructuras: (20) y

9

donde R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} y q tienen el mismo significado que antes y Z es halógeno, tal como cloruro.

La reacción de los substituyentes amina con un cloruro de ácido, un anhídrido de ácido o isocianato es conducida en un solvente orgánico libre de agua, tal como acetona, u otra cetona industrial adecuada. El solvente no debe contener grupos capaces de reaccionar con el cloruro/anhídrido de ácido o isocianato. Es posible usar agua si se mantiene la temperatura por debajo de 15ºC. Durante esta reacción, se produce HCl si se usa un cloruro de ácido. El HCl puede ser neutralizado con una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina. La reacción es llevada a cabo a una temperatura de 20-50ºC y el tiempo de reacción es adecuadamente de 1-3 h.

Como alternativa a esta última etapa de reacción y si el substituyente R_{1} es H, tanto el substituyente amina como el grupo hidroxilo de las fórmulas 5, 6, 16 y 17 pueden reaccionar con un cloruro de ácido, un anhídrido o un isocianato, mediante lo cual se obtiene un artículo polimérico revestido que tiene la estructura:

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10

\vskip1.000000\baselineskip

o una mezcla de la estructura: (14) y (10) o que tiene la estructura:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

o una mezcla de estructuras: (15) y (12) o que tiene la estructura:

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12

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o una mezcla de estructuras: (23) y (19), o que tiene la estructura:

\vskip1.000000\baselineskip

13

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o que tiene una mezcla de las estructuras: (24) y (21).

Los dobles enlaces de los grupos pendientes pueden también ser convertidos en grupos epóxido o en correspondientes análogos azufrados o aminados por técnicas bien conocidas en este campo. Para halohidrinas o dihaluros vicinales, un ajuste apropiado del pH puede dar lugar a epóxidos; haciéndolo en presencia de los compuestos azufrados y aminados apropiados, se formará el análogo azufrado y nitrógeno respectivo. Estos anillos de tres miembros tendrán predisposición entonces a sufrir ataque nucleofílico por los mismos compuestos que se han señalado anteriormente para halohidrinas y dihaluros vicinales. Los productos resultantes pueden aún ser derivatizados, también como se ha señalado anteriormente. Una alternativa para obtener epóxidos es hacer reaccionar el doble enlace con un compuesto peroxi.

Además, los grupos introducidos (capa) pueden ser aún derivatizados, por ejemplo, para introducir grupos cargados tales como -SO_{3}^{-} (sulfonato), -PO_{3}^{2-} (fosfonato), -O-PO_{3}^{2-} (fosfato), grupos amonio cargados (grupos amonio primarios, secundarios, terciarios y cuaternarios) (las valencias libres se unen a carbono saturado o insaturado).

Los artículos poliméricos revestidos pueden ser usados como medios cromatográficos de diferentes tipos. Variando el grado de halogenación, por ejemplo de bromación, el tipo y la cantidad de, por ejemplo, la amina y el tipo y la cantidad del haluro de ácido, tal como cloruro de ácido, o del isocianato, es posible fabricar partículas con una gran variedad de características superficiales. Así, con la invención es posible confeccionar las características superficiales para las diferentes moléculas que se han de separar cromatográficamente. Según una realización preferida de la invención, los artículos revestidos se usan como medios de RPC.

La introducción de grupos amino primarios o secundarios permitirá usar el artículo de la invención en la síntesis de fase sólida de oligonucleótidos y oligopéptidos.

La invención será ahora ilustrada mediante los siguientes ejemplos, que, sin embargo, no pretenden limitar la invención. Con partes y porcentaje, se quiere decir partes en peso y porcentaje en peso si no se indica en contrario explícitamente.

En las reacciones, se usan partículas de divinilbenceno. Las partículas tienen las siguientes características: Tamaño de partícula: 15 mm; área superficial: 714 m^{2}/g; tamaño de poro: 2,2 ml/g; 1,5 mmol de grupos vinilo/g. Partiendo de estas partículas, se sintetizaron once partículas revestidas diferentes para RPC variando la longitud de las cadenas de alquilo y de amida. Las partículas revestidas fueron estudiadas en cuanto a la separación de péptidos y comparadas con la partícula no revestida y con una partícula de sílice convencional, Kromasil™ C18 (de Eka Nobel AB).

Parte experimental Ejemplo 1

Se lavaron 100 g de partículas de divinilbenceno en etanol (cantidad de substancia seca 10,6%) con etanol y se añadieron a un reactor y se enfriaron a 15ºC. Se disolvieron 25,50 g de bromo (1,60 mmol/g de partículas) en 400 g de etanol y se añadieron en porciones a lo largo de un período de tiempo de 15 minutos. Se lavaron las partículas con etanol después de dos horas.

Ejemplo 2

Se añadieron 31,18 g de hexilamina a 199,90 g de suspensión acuosa (contenido seco: 20,0 g) de las partículas bromadas del ejemplo 1. Se inició el calentamiento a 90ºC al mismo tiempo. Después de 24 horas, se añadieron 300 ml de etanol m/10% de isopropanol durante un período de 10 minutos. Se agitó la suspensión durante 25 minutos y se filtró luego y se lavó con 0,8 l de agua, 1,6 l de NaOH 0,1 M y 2,0 l de agua.

Ejemplo 3

Se añadieron 43,51 g de hexadecilamina a 120,0 g de suspensión acuosa (contenido seco: 12,0 g) de las partículas bromadas del ejemplo 1. Se inició el calentamiento a 90ºC al mismo tiempo. Después de 24 horas, se añadieron 180 ml de etanol m/10% de isopropanol durante un período de 10 minutos. Se agitó la suspensión durante 25 minutos y se filtró luego y se lavó con 0,4 l de etanol m/10% de isopropanol, 0,48 l de agua, 1,0 l de NaOH 0,1 M y 1,2 l de agua.

Ejemplo 4

Se añadieron 7,5 ml de cloruro de lauroílo y 0,95 ml de diisopropiletilamina a 90,13 g de suspensión (contenido seco: 9,0 g) de las partículas del ejemplo 2 en acetona seca a temperatura ambiente. Después de 2 horas, se filtró la suspensión y se lavó con 360 ml de acetona y 360 ml de etanol.

Ejemplo 5

Se añadieron 4,35 ml de cloruro de capriloílo y 0,95 ml de diisopropiletilamina a 90,0 g de suspensión (contenido seco: 9,0 g) de las partículas del ejemplo 2 en acetona seca a temperatura ambiente. Después de 2 horas, se filtró la suspensión y se lavó con 360 ml de acetona y 360 ml de etanol.

Ejemplo 6

Se añadieron 4,25 ml de cloruro de lauroílo y 0,55 ml de diisopropiletilamina a 51,0 g de suspensión (contenido seco: 5,10 g) de las partículas del ejemplo 3 en acetona seca a temperatura ambiente. Después de 2 horas, se filtró la suspensión y se lavó con 200 ml de acetona y 200 ml de etanol.

Ejemplo 7

Se añadieron 2,45 ml de cloruro de capriloílo y 0,55 ml de diisopropiletilamina a 50,96 g de suspensión (contenido seco: 5,10 g) de las partículas del ejemplo 3 en acetona seca a temperatura ambiente. Después de 2 horas, se filtró la suspensión y se lavó con 200 ml de acetona y 200 ml de etanol.

Ejemplo 8

Se añadieron 16,65 g de 1,3-diaminopropano (15 mmol/g de partículas) a 15 g de las partículas del ejemplo 1 en agua (149,5 g de suspensión). Se calentó la mezcla a 90ºC durante 25 horas y 40 minutos y se lavó después con agua, NaOH (0,5 M), agua, etanol al 20% y acetona.

Ejemplo 9

Se lavaron 6,00 g de las partículas aminadas del ejemplo 8 con acetona seca. Se añadieron cloruro de capriloílo (9,18 g, 9,4 mmol/g de partículas) y N-etildiisopropilamina (1,10 g, 1,4 mmol/g de partículas) a 60 g de suspensión de acetona. Después de dos horas a temperatura ambiente, se lavaron las partículas con acetona y etanol.

Ejemplo 10

Se añadieron 33,37 g de 2,2-etilendioxidi-etilamina (15 mmol/g de partículas) a 15 g de las partículas del ejemplo 1 en agua (150,20 g de suspensión). Se calentó la mezcla a 90ºC. Después de 24 horas, se lavaron las partículas con agua, NaOH (0,5 M), agua y acetona.

Ejemplo 11

Se añadieron 26,38 g de hexanodiamina (15 mmol/g de partículas) a 15 g de las partículas del ejemplo 1 en agua (149,97 g de suspensión). Se calentó la mezcla a 90ºC. Después de 24 horas, se lavaron las partículas con agua, NaOH (0,5 M), agua y acetona.

Ejemplo 12

Se lavaron 6,00 g de las partículas aminadas del ejemplo 8 con acetona seca. Se añadieron 9,55 g (7,3 mmol/g de partículas) de cloruro de lauroílo y 1,11 g (1,4 mmol/g de partículas) de N-etildiisopropilamina a 60 g de suspensión en acetona. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron las partículas con acetona y etanol.

Ejemplo 13

Se lavaron 6,00 g de las partículas aminadas del ejemplo 10 con acetona seca. Se añadieron 9,21 g (7,0 mmol/g de partículas) de cloruro de lauroílo y 1,11 g (1,4 mmol/g de partículas) de N-etildiisopropilamina a 60 g de suspensión de acetona. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron las partículas con acetona y etanol.

Ejemplo 14

Se lavaron 6,00 g de las partículas aminadas del ejemplo 10 con acetona seca. Se añadieron 5,68 g (5,8 mmol/g de partículas) de cloruro de capriloílo y 1,10 g (1,4 mmol/g de partículas) de N-etilisopropilamina a 60 g de suspensión de acetona. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron las partículas con acetona y etanol.

Ejemplo 15

Se lavaron 6,00 g de las partículas aminadas del ejemplo 11 con acetona seca. Se añadieron 9,20 g (7,0 mmol/g de partículas) de cloruro de lauroílo y 1,10 g (1,4 mmol/g de partículas) de N-etildiisopropilamina a 60 g de suspensión de acetona. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron las partículas con acetona y etanol.

Ejemplo 16

Se lavaron 6,00 g de las partículas aminadas del ejemplo 11 con acetona seca. Se añadieron 5,65 g (5,8 mmol/g de partículas) de cloruro de capriloílo y 1,10 g (1,4 mmol/g de partículas) de N-etilisopropilamina a 60 g de suspensión de acetona. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron las partículas con acetona y etanol.

Ejemplo 17

Se añadieron 10 g de las partículas porosas en metanol (contenido seco 12,4%) a un reactor y se enfriaron a 15ºC. Se añadieron 2,53 g de bromo (1,58 mmol/g de partículas) en porciones con una jeringa de vidrio a lo largo de 15 minutos. Se lavaron las partículas con metanol.

Ejemplo 18

Se añadieron 15,93 g de hexilamina (17 mmol/g de partículas) a 9,14 g de las partículas del ejemplo 17 en agua (91,0 g de suspensión). Se calentó la mezcla a 90ºC durante 24 horas y se lavó luego con agua, hidróxido de sodio (0,5 M), agua, metanol y acetona.

Ejemplo 19

Se lavaron 7,00 g de las partículas aminadas del ejemplo 18 con acetona. Se añadieron 5,18 g (3,5 mmol/g de partículas) de isocianato de dodecilo a 62 g de suspensión en acetona de las partículas y se calentó primeramente a 30ºC durante 1 hora 35 minutos y luego a 50ºC durante 1 hora. Se lavaron las partículas con acetona y etanol.

Se usaron las partículas finales obtenidas en pruebas de cromatografía por separación de péptidos correspondiente:

Ejemplo 20 Separación de péptidos I

Una mezcla de péptidos consistía en (Ile^{7})-Angiotensina III, (Val^{4})-Angiotensina III, Angiotensina III y Angiotensina I.

\vskip1.000000\baselineskip

Muestra:	0,125 mg/ml de Ile^{7}-Angiotensina III
	0,125 mg/ml de Val^{4}-Angiotensina III
	0,125 mg/ml de Angiotensina III
	0,125 mg/ml de Angiotensina I

\vskip1.000000\baselineskip

Se disuelven los péptidos en Solución A.

Solución A: Ácido trifluoroacético ("TFA") al 0,1% en agua, se disuelve 1 ml de TFA en 1.000 ml de agua desionizada.

Solución B: Se disolvieron acetonitrilo 60%/ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%, 600 ml de acetonitrilo en 400 ml de agua desionizada y 1 ml de TFA.

\vskip1.000000\baselineskip

Gradiente:	0-2 vol. col. de B al 15%
	2-22 vol. col. de B al 15-65%
	22-25 vol. col. de B al 65%
	25-27% vol. col. de B al 15%

Volumen de inyección: 25 \mul.

Velocidad lineal: 300 cm/h.

Detector: UV 214 nm, 0,2 UA.

Péptidos	Secuencia	Proveedor
(Ile^{7})-Angiotensina III	Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile	Sigma A-0911
(Val^{4})-Angiotensina III	Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe	Sigma A-6277
Angiotensina III	Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe	Sigma A-0903
Angiotensina I	Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu	Sigma A-9650

Separación de péptidos II

Las angiotensinas estaban todas positivamente cargadas a este pH y se aplicaron como una mezcla. Se determinaron el tiempo de retención (t_{R}), el factor de capacidad (k) y la selectividad (factor de separación \alpha).

Columna:	Columna de vidrio Pharmacia HR 5/5 (vol.: 1 ml).
Fase móvil A:	TFA al 0,1%.
Fase móvil B:	TFA al 0,1%/acetonitrilo al 60%.
Gradiente:	9-39% de acetonitrilo en 20 minutos.
Inyección:	25 \mul de 0,5 mg/ml de mezcla de angiotensina.
Velocidad de flujo:	5 cm/min. (1 ml/min.).
Detector:	214 nm, 0,2 UA.
Sistema:	FPLC® (Sistema cromatográfico de Pharmacia Biotech).

Antes de aplicar la muestra, se realizó un gradiente en cada columna y se equilibraron las columnas con 10 volúmenes de columna de fase móvil B al 15% (9% acetonitrilo).

Separación de péptidos III

Las angiotensinas se separaron debido a sus diferencias en hidrofobicidad en un gradiente ascendente de acetonitrilo.

En las tablas siguientes y en los cromatogramas se presentan los resultados.

El tiempo de retención t_{R} es el tiempo entre el inicio de la elución y la emergencia del pico máximo. En la tabla 1 se presenta el tiempo de retención. El volumen de retención V_{R} es el volumen correspondiente de fase móvil entre el inicio de la elución y la emergencia del pico.

El factor de separación \alpha es la medida de lo bien que se separan dos picos. Viene dado por la razón de los factores de capacidad de los dos picos (k_{2}/k_{1}). En la tabla 2 se presenta el factor de separación.

TABLA 1

Medios	t_{R} Ile^{7}	t_{R} Val^{4}	t_{R} AIIII	t_{R} AI	Aminas	Cloruro de ácido/isocianato
Ejemplo 4	7,6	8,11	9,23	11,12	Hexilamina	Cloruro de lauroílo
Ejemplo 5	7,1	7,79	8,87	10,62	Hexilamina	Cloruro de capriloílo
Ejemplo 6	7,83	8,35	9,51	11,45	Hexadecilamina	Cloruro de lauroílo
Ejemplo 7	7,53	8,07	9,2	11,08	Hexadecilamina	Cloruro de capriloílo
Ejemplo 8	5,1	5,99	7,14	9,12	1,3-Diamino-propano	Cloruro de capriloílo
Ejemplo 9	5,82	6,48	7,7	9,65	1,3-Diamino-propano	Cloruro de lauroílo

TABLA 1 (continuación)

Medios	t_{R} Ile^{7}	t_{R} Val^{4}	t_{R} AIIII	t_{R} AI	Aminas	Cloruro de ácido/isocianato
Ejemplo 13	4,94	5,82	7,16	9,42	2,2-Etilendioxidietildiamina	Cloruro de lauroílo
Ejemplo 14	3,88	5,1	6,58	8,78	2,2-Etilendioxidietildiamina	Cloruro de capriloílo
Ejemplo 15	6,02	6,68	7,98	10,15	1,6-Diamino-hexano	Cloruro de lauroílo
Ejemplo 16	5,52	6,35	7,61	9,62	1,6-Diamino-hexano	Cloruro de capriloílo
Ejemplo 19	6,99	7,59	8,74	10,58	Hexilamina	Isocianato de dodecilo
Sin modificar	9,16	9,91	11	12,69	Ninguna	Ninguno
Kromasil C18	10,68	10,95	12,07	13,49	Ninguna	Ninguno

TABLA 2

Medios	\alphaIle^{7}-Val^{4}	\alphaVal^{4}-AIII	\alphaAIII-AI
Ejemplo 4	1,07	1,14	1,20
Ejemplo 5	1,10	1,14	1,20
Ejemplo 6	1,07	1,19	1,20
Ejemplo 7	1,07	1,14	1,20
Ejemplo 9	1,17	1,19	1,28
Ejemplo 12	1,11	1,19	1,25
Ejemplo 13	1,18	1,23	1,32
Ejemplo 14	1,31	1,29	1,33
Ejemplo 15	1,11	1,19	1,27
Ejemplo 16	1,15	1,20	1,26
Ejemplo 19	1,09	1,15	1,21
Sin modificar	1,08	1,11	1,15
Kromasil C18	1,03	1,10	1,12

Los medios modificados son todos más hidrofílicos que los medios sin modificar y también más hidrofílicos que los medios de sílice usados como comparación. Los tiempos de retención se relacionan con la polaridad de los medios sintetizados. Cuanto menores sean los tiempos de retención, menor será la concentración de la muestra en la fase estacionaria y más polar será la superficie. Los medios sintetizados usando cloruro de lauroílo tienen tiempos de retención superiores a aquéllos en los que se usó cloruro de capriloílo. Los medios más polares eran medios preparados con diaminas y cloruro de capriloílo según el ejemplo 9 y el ejemplo 14. Esto es evidente por la tabla 1, donde los valores de t_{R} son los más bajos para el ejemplo 9 y el 14. Según esto, los picos en los cromatogramas aparecen primeramente en el ejemplo 9 y 14. Como puede verse por los cromatogramas, todos los picos para los ejemplos según la invención aparecen antes que los picos para el medio no modificado y para el medio de sílice, lo que indica que las partículas según la invención son más hidrofílicas. Así, las modificaciones superficiales según la invención tienen un efecto pronunciado sobre la concentración de acetonitrilo usada para la elución. Una menor cantidad del acetonitrilo usado para la elución da lugar a grandes ahorros en el coste de solventes orgánicos.

La diferencia en los factores de selectividad muestra que la separación entre los péptidos puede ser fácilmente cambiada por las modificaciones superficiales de tal forma que se puede optimizar un problema de separación mediante pequeños cambios en el método de producción.

Los medios sintetizados a partir de aminas monosubstituidas tienen menores factores de separación que los sintetizados a partir de aminas disubstituidas. Los medios diamino separaban la (Ile^{7})-Angiotensina III y la (Val^{4})-Angiotensina III mucho mejor y daban una mayor variación en la separación que los medios basados en monoaminas.

Los medios según el ejemplo 9 y el 14 tienen también el mayor factor de separación para la (Ile^{7})-Angiotensina III y la (Val^{4})-Angiotensina III, lo que resulta evidente por la tabla 2 y el pico de separación en los cromatogramas. En general, puede verse por los cromatogramas que la separación con los medios según la invención es mucho mejor que con el medio no modificado o el medio de sílice. Kromasil no separa los péptidos apropiadamente, ya que los picos no se separan.

Durante el año de prioridad, hemos mostrado que los revestimientos en los cuales los grupos alquilo de R_{1} y/o R_{2} son unidades repetitivas de grupos alqueniloxi inferiores, tales como -CH_{2}CH_{2}-O-, -CH_{2}CH_{2}CH_{2}-O- y -CH_{2}CH_{2}(CH_{3})-O-, y tienen pesos moleculares de hasta al menos 5.000 daltons funcionarán en aplicaciones cromatográficas.

Durante el año de prioridad, hemos introducido también grupos amino para hacer que las perlas resulten adecuadas para la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida.

: Adición de bromo: Se lavaron 10 gramos de hielo con 300 ml de tampón acetato de sodio 0,5 M, pH 5. Se transfirieron 62 g de partículas de poli(divinilbenceno-etilvinilbenceno) en tampón acetato de sodio, pH 5,0, a un reactor de 100 ml. Se ajustó la temperatura a 15ºC. Se disolvieron luego 2,40 g de bromo (1:1 mmol de bromo/mmol de vinilo) en 65 g de tampón acetato de sodio, pH 5, y se añadieron al reactor. Después de 5 minutos, se lavaron las partículas con 500 ml de agua.

: Reacción con amoníaco: Se transfirieron 10 g de partículas a un reactor de 100 ml con 54,4 g de solución de amoníaco al 25%. Se aumentó la temperatura a 60ºC y se agitó la suspensión mecánicamente a 300 rpm. Después de 16 horas, se lavó la mezcla con 700 ml de agua y 300 ml de etanol al 20%. Amina: 0,30 mmol de amina/g de partículas.

Se vio que el contenido en amina era de 0,30 mmol/gramo de partículas por titulación de la sal de amina del ácido clorhídrico con nitrato de plata.

Las partículas aminadas así obtenidas han sido usadas con éxito en la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida por métodos convencionales.

Claims

1. Un artículo polimérico revestido caracterizado por estar el revestimiento covalentemente unido a la superficie del polímero por medio de los dobles enlaces del polímero, teniendo dicho artículo la estructura:

P --- L ---

\delm{C}{\delm{\para}{X(R _{1} ) _{P} }}

H --- CH_{2} --- Y(R_{2})_{p}

donde

a): P constituye un polímero básico y otros grupos

-L-CH(-X(R_{1})_{p})-CH_{2}(-Y(R_{2})_{p});

b): L es un anillo de benceno;

c): X e Y son independientemente seleccionados entre halógenos, en particular Br, y N, S y O;

d): R_{1} es hidrógeno, un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico o acilo, tal como alquilo C_{1}-C_{10} o acilo C_{1}-C_{18} o R_{2}, cuando X es N, O o S;

e): R_{2} es hidrógeno; alquilo lineal, ramificado o cíclico, tal como alquilo C_{1}-C_{18}, -R_{3}(-NH_{2})_{q}, alquilarilo o arilalquilo en donde la parte alquilo puede contener de 1 a 18 átomos de carbono; -R_{3}(-NH-CR_{4}=O)_{q}, -CR_{4}=O o grupos polialquiloxi inferiores que pueden haber sido terminalmente acilados o alquilados;

f): p es un número entero de 0 a 3, con la condición de que, cuando X sea halógeno, p sea igual a 0, de que, cuando X sea O, p sea igual a 1, de que, cuando X sea S, p sea igual a 1 ó 2 y de que, cuando X sea N, p sea igual a 1, 2 ó 3, y con la condición también de que, para p igual a 2 ó 3, los dos o tres grupos R_{2} puedan ser idénticos o diferentes;

g): R_{3} es un alquilo lineal, cíclico o ramificado, -O-alquilo, hidroxialquilo o fenilalquilo, con hasta 18 átomos de carbono en la parte alquilo; y R_{4} es un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico, tal como alquilo C_{1}-C_{18};

h): q es un número entero >0, que representa que uno o más hidrógenos en R_{3} pueden haber sido substituidos con un grupo amino primario (-NH_{2}) respectivo o un grupo -NH-CR_{4}=O respectivo.

2. Un artículo polimérico revestido según la reivindicación 1, caracterizado por estar el artículo en forma de partículas con un diámetro de 3 a 100 \mum.

3. El uso del artículo polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 como medio de separación cromatográfico.

4. El uso del artículo polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y que exhibe grupos amino primarios o secundarios como soporte sólido en síntesis de oligonucleótidos en fase sólida.

5. Uso del artículo polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 como medio de cromatografía de fase invertida.