ES2255174T3 - Produccion de lineas de celulas germinales embrionarias (eg) aviares por cultivo prolongado de pgc, y uso de las mismas para clonacion y quimerizacion. - Google Patents

Abstract

Un método de cultivo que permite la producción de células germinales embrionarias (EG) aviares, que comprende las siguientes etapas: (i) aislar células germinales primordiales (PGC) a partir de un ave deseada; (ii)cultivar dichas células germinales primordiales en un medio de cultivo que contiene al menos los siguiente factores de crecimiento en cantidades suficientes para mantener dichas PGC durante períodos prolongados en cultivo tisular: (1) factor inhibidor de leucemia (LIF), (2) factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), (3) factor de células madre (SCF), y (4) factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), durante un período de tiempo prolongado suficiente para producir un cultivo con un aspecto de tipo multicapa compacta; y (iii) identificar las células germinales embrionarias contenidas en las mismas.

Description

Producción de líneas de células germinales embrionarias (EG) aviares por cultivo prolongado de PGC, y uso de las mismas para clonación y quimerización.

Campo de la invención

La presente invención proporciona un nuevo método para mantener células germinales de primordio aviar (PGC), en particular PGC de pollo, durante períodos prolongados en cultivos tisulares que tienen como resultado la producción de células germinales embrionarias (EG). Estas células EG pueden usarse para la inserción de secuencias de ADN deseadas, por ejemplo, genes humanos. Estas células EG y las células EG transgénicas obtenidas a partir de las mismas pueden usarse para producir aves quiméricas, en particular pollos quiméricos, y para clonación.

Antecedentes de la invención

En los últimos años, muchas investigaciones se han centrado en la producción de animales quiméricos, clonados y transgénicos.

En particular, la modificación del genoma de especies animales de granja es un área que se ha perseguido activamente, con grados variables de éxito, durante las últimas dos décadas. Por ejemplo, esta investigación se ha centrado en la generación de cerdos, vacas y pollos transgénicos. Hasta la fecha, la mayor parte de los animales transgénicos disponibles se han generado por microinyección directa de embriones monocelulares con construcciones de ADN que llevan el gen de interés. Sin embargo, aunque las técnicas de microinyección han sido satisfactorias, estos métodos presentan inconvenientes ya que son costosos y a menudo tienen una baja eficacia.

Recientemente, el éxito de la tecnología de células madre embrionarias (ES) para la producción de ratones "knock-out" ha llevado a la realización de investigaciones centradas en el desarrollo de sistemas de cultivo tisulares para células ES y células germinales de primordio (PGC) en especies de animales de granja. La capacidad de mantener células ES indiferenciadas en cultivo continuo permite la transfección in vitro de estas células e idealmente la selección de células transfectadas que contienen un gen deseado antes de su transferencia a la masa celular interna de un embrión en desarrollo para generar animales quiméricos. Idealmente, al menos algunos de los animales quiméricos resultantes podrán segregar la construcción de ADN a través de la línea germinal y, por lo tanto, producir descendencia transgénica. Sin embargo, hasta la fecha, sólo se han conseguido integraciones dirigidas (con especificidad de sitio) en ratones. Actualmente, la capacidad de realizar integraciones de ADN dirigidas en otras especies animales está limitada. Sin embargo, se están realizando trabajos en esta dirección y el objetivo se conseguirá
pronto.

En particular, se ha dirigido una investigación considerable hacia la mejora del genoma de especies del género Gallinacea, y de los pollos en particular, debido a la considerable importancia económica de estos animales. Hace tres años se publicó una revisión bastante completa del estado de la investigación dirigida a la generación de pollos transgénicos (Sang, Trends in Biotech., 12: 415-420 (1994)). Como se describe en este documento, hay básicamente dos rutas alternativas bajo investigación para producir pollos transgénicos. Estos métodos pueden distinguirse basándose en el momento en el que se realiza la manipulación del genoma, es decir, antes de la puesta o después de la puesta. El último método incluye la transferencia de células ES y PGC donadoras a embriones receptores. Además, en las dos rutas, la mayor parte del trabajo se ha realizado infectando las células donadoras con vectores retrovirales que contienen un gen de interés.

La primera estrategia, que comprende la manipulación del genoma antes de la puesta, ha producido resultados mixtos y/o ineficaces. Por ejemplo, la infección de oocitos en el ovario (Shuman y Shoffner, Poultry Sci., 65: 1437-1494 (1986)) y la preincubación de esperma con ADN plasmídico (Gruenbaum et al., J. Cell. Biochem Supp., 15: 194 (1991)) fueron ineficaces y no se han repetido. Además, se ha demostrado la transfección de espermatozoides con una construcción plasmídica por lipofección (Squires y Drake, Anim. Biotech., 4: 71-78 1993). Sin embargo, no se informó sobre la transmisión de líneas germinales.

Además, se ha notificado que la microinyección directa de ADN en el disco germinal seguida de cultivo de embriones produce un 0,1% de aves quiméricas transgénicas vivas (Sang, W., Trends in Biotech., 12: 415-42 (1994)), transmitiendo un ave el transgén al 3,4% de su descendencia (Love et al., Bio/Technology, 12: 60-63 (1994)). Naito et al (J. Reprod. Fertil., 102: 321-325 (1994)) realizó esta misma estrategia. Sin embargo, de forma similar, en este documento no se notificó ninguna transmisión del transgén en líneas germinales.

La segunda estrategia, que comprende la manipulación del genoma después de la puesta, ha tenido mejores resultados. Las aves quiméricas, generadas por inyección de huevos puestos con vectores retrovirales competentes para la replicación ha demostrado transmisión en la línea germinal en un 1% y 11% de su descendencia (Salter et al., en Manipulation of the Avian Genome, Etches, RJ et al., eds. páginas 138-150 CRC Press (1993)). Se han obtenido resultados más alentadores usando vectores retrovirales con defectos en la replicación e inyección en huevos puestos, que generaron un 8% de aves quiméricas del sexo masculino que transmitían el vector a su descendencia a una frecuencia del 2 al 8% (Bosselman et al., Science, 243: 535-535 (1989)).

Sin embargo, la inyección de huevos puestos con construcciones plasmídicas en presencia de reactivos que se sabe que promueven la transfección no ha podido producir construcciones integradas de forma estable ni aves transgénicas (Rosenblum y Cheng, J. Cell Biochem Supp., 15E 208 (1991)). En general, el uso de vectores retrovirales para la generación de pollos transgénicos no está extendido debido a los inconvenientes significativos asociados con estos vectores. Estos inconvenientes incluyen las limitaciones sobre el tamaño del inserto de clonación que puede introducirse de forma estable y el inconveniente potencial más serio de la posible inducción de sucesos de recombinación con loci virales endógenos o con otros virus de leucosis aviar.

Un problema significativo asociado con todos estos métodos es el hecho de que los sistemas de cultivo a largo plazo para células ES y PGC de pollo ha sido relativamente difícil de establecer. Según el conocimiento de los inventores, se cree que el mayor período de tiempo durante el cual se han cultivado PGC aviares con la producción satisfactoria de aves quiméricas es menor de 5 días.

Los métodos de cultivo de PGC previos han incluido el uso de factores de crecimiento, en particular LIF o IGF. Sin embargo, como se indica, estos métodos no han podido proporcionar períodos de cultivo prolongados, un asunto importante, ya que facilitaría la producción de PGC transgénicas.

Sin embargo, independientemente de los problemas para conseguir el cultivo a largo plazo, se han usado tanto células ES como PGC con éxito para generar quimeras por infección de estas células con vectores retrovirales competentes e incompetentes para la replicación. Además, como se ha descrito anteriormente, se han inyectado células blastodérmicas obtenidas recientemente en embriones receptores, dando como resultado aves con gónadas quiméricas (Carsience et al., Devel., 117: 669-675 1993)). Las células blastodérmicas pueden transfectarse eficazmente por lipofección y después transferirse a embriones receptores. Sin embargo, no se ha notificado la transmisión en la línea germinal de células transfectadas.

Además, Pain et al., Devel., 122: 2329-2398 (1996), han demostrado recientemente la presencia de supuestas células ES de pollo obtenidas a partir de células blastodérmicas. Además informaron sobre el mantenimiento de estas células en cultivos durante 35 pases sin pérdida del fenotipo ES (definido por anticuerpos monoclonales contra células ES de ratón). (Id.) Estas células aparentemente se desarrollan para dar PGC tras la transferencia a embriones aviares donde colonizan las gónadas. Sin embargo, no establecieron definitivamente que estas células efectivamente eran células ES.

La reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales contra ES de ratón con células ES de pollo podría abogar a favor de la conservación de receptores de células ES a través de las especies. Además, el hecho de que estos investigadores también pudieran generar dos pollos quiméricos con inyecciones de cultivos de células blastodérmicas de 7 días podría sugerir de forma argumentable la presencia de células ES en su sistema. Sin embargo, estos investigadores no descartaron la posibilidad de que en su sistema de cultivo complejo estuvieran presentes PGC. De esta manera, este sistema de cultivo de ES a largo plazo debería ensayarse adicionalmente con respecto a la pluripotencia y la transmisión en la línea germinal (Id.)

Una ruta alternativa para la producción de células ES comprende PGC. Se han desarrollado procedimientos para el aislamiento y transferencia de PGC desde embriones donadores a embriones receptores y han generado satisfactoriamente pollos quiméricos con transmisión en la línea germinal del genotipo del donador (Vick et al., London Ser. B., 251: 179-182 (1993), Tajima et al., Theriogenology, 40: 509-519 (1993)). Además, se han crioconservado PGC y posteriormente se han descongelado para generar aves quiméricas (Naito et al., J. Reprod. Fertil., 102: 321-325 (1994)). Sin embargo, este sistema requiere mucha mano de obra y sólo produce, en promedio, de 50 a 80 PGC por embrión. También se ha notificado la infección de PGC con vectores retrovirales. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha conseguido el crecimiento de PGC en cultivo durante períodos prolongados para facilitar la selección de PGC transfectadas.

De esta manera, basándose en lo anterior, es evidente que una necesidad significativa en la técnica comprende métodos mejorados para cultivar PGC. Además, otra necesidad significativa comprende nuevos métodos para producir células madre embrionarias (ES) o células germinales embrionarias (EG) aviares debido a su aplicación en la producción de aves clonadas y para la producción de aves quiméricas, y formas transgénicas de las mis-
mas.

Objetos de la invención

Es un objeto de la invención solucionar los problemas de la técnica anterior.

Es un objeto más específico de la invención proporcionar un nuevo método para cultivar células germinales de primordio (PGC) aviar durante períodos prolongados en cultivos tisulares que produzca líneas de células germinales (EG) embrionarias.

Por consiguiente, la invención proporciona un método de cultivo que proporciona la producción de células germinales embrionarias (EG) aviares que comprende las siguientes etapas:

\newpage

(i) aislar células germinales primordiales (PGC) a partir de un ave deseada;

(ii) cultivar dichas células germinales primordiales en un medio de cultivo que contiene al menos los siguientes factores de crecimiento contenidos en cantidades suficientes para mantener dichas PGC durante periodos prolongados en cultivos tisulares:

(1)

factor inhibidor de leucemia (LIF),

(2)

factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF),

(3)

factor de células madre (SCF), y

(4)

factor de crecimiento semejante a insulina (IGF),

durante un período de tiempo prolongado suficiente para producir un cultivo con un aspecto de multicapa com-
pacta; y

(iii) identificar las células germinales embrionarias contenidas en el cultivo. La invención también proporciona una línea de células EG aviares obtenidas por el método de la invención.

Es un objeto incluso más específico de la invención proporcionar un nuevo método para cultivar células germinales primordiales (PGC) de especies del género Gallinacea, especialmente de pollo o pavo, durante períodos prolongados en cultivos tisulares para producir líneas de células germinales embrionarias (EG).

Es otro objeto de la invención usar células germinales embrionarias aviares que se han obtenido por cultivo de PGC durante períodos prolongados en cultivos tisulares para la producción de aves quiméricas, preferiblemente aves de corral, y más preferiblemente pollos.

Por consiguiente, la invención también proporciona un método para producir aves quiméricas que comprende:

(i) aislar células germinales primordiales (PGC) a partir de un ave;

(ii) mantener dichas PGC en un medio de cultivo tisular que contiene al menos los siguientes factores de crecimiento:

(1)

factor inhibidor de leucemia (LIF),

(2)

factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF),

(3)

factor de células madre (SCF), y

(4)

factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), durante un tiempo suficiente para producir células germinales embrionarias (EG);

(iii) transferir dichas células EG a un embrión aviar receptor; y

(iv) seleccionar las aves quiméricas que tienen el fenotipo de PGC deseado.

Es otro objeto de la invención introducir secuencias de ácido nucleico deseadas en células germinales embrionarias aviares que se han obtenido por cultivo de células germinales de primordio aviar durante períodos prolongados en cultivos tisulares.

Es otro objeto de la invención usar células germinales aviares, que se han producido por cultivo de células germinales primordiales en cultivo durante períodos prolongados, en las que se ha introducido una secuencia de ácido nucleico deseada, para la producción de aves quiméricas transgénicas, preferiblemente pollos quiméricos transgénicos.

Es otro objeto de la invención usar las aves quiméricas transgénicas resultantes, preferiblemente gallináceas y más preferiblemente pollos o pavos, para la producción de proteínas heterólogas codificadas por una secuencia de ácido nucleico contenida en las células introducidas, preferiblemente por recuperación de estas proteínas a partir de los huevos de estas aves quiméricas transgénicas, en particular pollos quiméricos transgénicos y su descendencia. Como alternativa, estas proteínas se pueden recuperar a partir de las aves quiméricas transgénicas directamente, por ejemplo, a partir del sistema circulatorio (sangre o linfa) u otros tejidos o fluidos corporales.

Es otro objeto de la invención usar células germinales aviares, preferiblemente células germinales embrionarias de pollo obtenidas por cultivo prolongado de celulares germinales de primordio aviar, para clonación de aves, por ejemplo, pollos clonados (que pueden ser transgénicos).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Tinción con anticuerpo EMA-1 en células ES de ratón. Los paneles A y B indican dos cultivos diferentes. A1 y B1 - imágenes teñidas con DAPI de agrupamientos de células ES de ratón. A2 y B2 - Imágenes de contraste de fase de agrupamientos de células ES de ratón. A3 y B3 - Señal FITC positiva en células ES de ratón.

Figura 2. Tinción con anticuerpo EMA-1 en cultivos de PGC de 98 días. Los paneles A y B indican dos agrupamientos diferentes. A1 y B1 - Imágenes teñidas con DAPI de agrupamientos de PGC de 98 días. A2 y B2 - Imágenes de contraste de fase de los agrupamientos de PGC. A3 y B3 - Señal FITC positiva en PGC.

Figura 3. Tinción con anticuerpo EMA-1 en PGC de pollo recién recogidas. Los paneles A y B indican dos tratamientos diferentes. A1 y B1 - Imágenes teñidas con DAPI de PGC recientes. A2 y B2 - señal FITC positiva en PGC. Obsérvense las cabezas de flecha en las PGC teñidas con DAPI en A1 que corresponden a las PGC que muestran una señal FITC positiva en A2.

Figura 4. Tinción con anticuerpo EMA-1 en fibroblastos primarios de pollo. Los paneles A y B indican dos cultivos diferentes. A1 y B1 - Imágenes teñidas con DAPI de fibroblastos de pollo. A2 y B2 - Imágenes de contraste de fase de fibroblastos de pollo. A3 y B3 - Imágenes FITC de fibroblastos de pollo (negativo).

Figura 5. Tinción con anticuerpo MC-480 en células ES de ratón. Los paneles A y B indican dos cultivos diferentes. A1 y B1 - Imágenes teñidas con DAPI de agrupamientos de células ES. A2 y B2 - Imágenes de contraste de fase de células ES de ratón. A3 y B3 - Señal FITC positiva en células ES de ratón.

Figura 6. Tinción con anticuerpo MC-480 en un tratamiento de un cultivo de PGC de 98 días. A1 - Imagen teñida con DAPI de agrupamiento de PGC de 98 días. A2 - Imagen de contraste de fase del agrupamiento de PGC. A3 - Señal FITC positiva en PGC de 98 días.

Figura 7. Tinción con anticuerpo MC-480 en PGC de pollo recién recogidas. Los paneles A y B indican dos tratamientos diferentes. A1 y B1 - PGC recientes teñidas con DAPI. A2 y B2 - Señal FITC positiva en PGC. Véanse las cabezas de flecha en PGC teñidas con DAPI en A1 que corresponden a señales FITC positivas en A2.

Figura 8. Tinción con anticuerpo MC-480 en fibroblastos primarios de pollo. Los paneles A y B indican dos cultivos diferentes. A1 y B1 - Imágenes teñidas con DAPI de fibroblastos de pollo. A2 y B2 - Imágenes de contraste de fase de fibroblastos de pollo. A3 y B3 - Imágenes FITC en fibroblastos de pollo (negativo).

Breve descripción de la invención

Como se ha descrito, la presente invención proporciona un nuevo método para mantener células germinales de primordio (PGC) aviar (por ejemplo, de pollo) en cultivo tisular durante períodos prolongados, es decir, durante al menos 14 días, más preferiblemente al menos 25 días e idealmente durante un período de tiempo indefinido. Ahora se pueden realizar 4 meses de cultivo continuo y aproximadamente 32 pases de células.

Antes de la presente invención, no se había notificado ningún método para mantener PGC aviares en cultivo tisular que permitiera su mantenimiento durante periodos de más de aproximadamente 5 días (como se demuestra por su capacidad de producir aves quiméricas). Los presentes inventores sorprendentemente han descubierto, por medio de una experimentación juiciosa, que el uso de un medio de cultivo que contiene al menos los siguientes factores de crecimiento: factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de células madre (SCF) y factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), permite mantener células germinales de primordio aviar, específicamente células germinales de primordio de pollo y que estas células proliferen durante períodos prolongados, es decir, de al menos 14 días, y durante un período sustancialmente mayor en cultivo tisular. Además, se ha demostrado que estas PGC son útiles para la generación de pollos quiméricos.

Estas PGC son útiles para la producción de PGC aviares transgénicas que pueden usarse para producir aves quiméricas transgénicas. Es de esperar que estas aves quiméricas transgénicas sean útiles para recuperar proteínas heterólogas, que preferiblemente se pueden recuperar directamente a partir de los huevos de estas aves transgénicas quiméricas, o de tejidos y otros fluidos corporales. Por ejemplo, estas aves pueden usarse para la producción y recuperación de proteínas terapéuticas y otros polipéptidos.

Sin embargo, la base de esta invención es la observación adicional de que estas PGC, después de un cultivo prolongado, es decir, aproximadamente después de 25 días, se des-diferencian, y aparentemente dan como resultado la producción de células germinales embrionarias (EG).

Específicamente, después de 25 días, las PGC cultivadas (grupos) forman monocapas celulares que se extienden rápidamente que tienen una base adherente plana. Sobre su superficie hay células "de tipo PGC" más sueltas. Además, algunas de estas células presentan tinción PAS positiva. Además, las células teñidas con DiI obtenidas a partir de estas monocapas, tras la transferencia a embriones aviares receptores, se localizan en las gónadas. Además, teóricamente estas monocapas de células pueden someterse a pases indefinidos.

También se observó que después de aproximadamente 3 a 5 pases, algunas células ralentizan su papel de proliferación y adquieren un aspecto parecido al de los fibroblastos. Sin embargo, algunas líneas celulares se han sometido a pases múltiples veces y siguen desarrollándose sin ningún signo de diferenciación, incluso después de 4 meses en cultivo tisular continuo. También se observó que, según aumenta el número de células en estas colonias celulares, la monocapa de células se vuelve más "compacta", dando el aspecto de colonias celulares de múltiples capas.

Como se describe más adelante, se han obtenido dos líneas celulares, una de las cuales es positiva para fosfatasa alcalina y aparentemente no está diferenciada. Además, expresa otros marcadores característicos de tipos celulares pluripotentes y totipotentes. De esta manera, se cree que esta línea celular es una línea de células germinales embrionarias. De esta manera, esta invención se basa en el descubrimiento de que las PGC pueden des-diferenciarse en cultivo para producir células EG.

Como se describe más adelante, éste es un descubrimiento muy significativo ya que estas células pueden usarse para clonación de aves, y para producir aves quiméricas. Además, estas células germinales embrionarias pueden usarse para estudiar la diferenciación de líneas de células embrionarias aviares in vitro. Además, estas células pueden volverse transgénicas (por medio de la introducción de una secuencia de ácido nucleico deseada) y usarse para obtener aves quiméricas transgénicas o clonadas, preferiblemente del género Gallinacea, y más preferiblemente pollos o
pavos.

Descripción detallada de la invención

De esta manera, la presente invención soluciona los problemas asociados con los métodos de cultivo previos de PGC aviares que no permitían mantener dichas PGC en cultivo tisular durante períodos mayores de aproximadamente 5 días. Como se describe con detalle más adelante, los presentes inventores sorprendentemente han descubierto que pueden mantenerse PGC aviares, preferiblemente PGC de gallináceas y más preferiblemente PGC de pollo, en cultivo tisular durante períodos prolongados, al menos durante 14 días, más preferiblemente al menos durante 25 días y preferiblemente durante períodos mayores, por medio del uso de medios de cultivo que contienen al menos los siguientes cuatro factores de crecimiento:

factor inhibidor de leucemia (LIF),

factor de células madre (SCF), factor de crecimiento semejante a insulina (IGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF).

En general, este método de cultivo comprende las siguientes etapas:

(i) aislar PGC a partir de embriones aviares en la Fase XII a XIV donadores;

(ii) cultivar dichas PCG aviares aisladas en un medio de cultivo que contiene cantidades relativas de LIF, bFGF, SCF e IGF eficaces para promover su proliferación, durante un período prolongado, es decir, típicamente después de al menos 28 días en cultivo tisular para producir células EG. Además, como se describe más adelante, la presente invención se basa en el descubrimiento de que estas PGC, después de cultivarse en este medio durante períodos prolongados, en promedio aproximadamente durante 25 días, aparentemente se des-diferencian para producir células germinales embrionarias aviares. A este respecto, se ha notificado previamente que las PGC de ratón mantenidas en monocapas de células de alimentación STO en presencia de LIF y bFGF dieron como resultado células que se parecían a células madre embrionarias (Resnick et al, Nature, 359: 550-551, 1992; Matsui et al, Cell, 70:841-843, 1992). Resnick et al (Id.) sugirieron el nombre de células germinales embrionarias (EG) para este tipo de células, para hacer referencia a que procedían de PGC in vitro, aunque no estaba claro en ese momento si las células EG eran significativamente diferentes de las células ES tradicionales.

Desde entonces se ha demostrado, al menos con líneas de células embrionarias de ratón, que las células EG difieren de las células ES en el estado de metilación de ciertos genes (Labosky et al., Development, 120: 3197-3204, 1994; Piedra hita et al., Biology of Reproduction, 58: 1321-1329, 1998). Sin embargo, al igual que las células ES, se ha demostrado que las células EG se diferencian extensivamente en cultivo y contribuyen a quimeras cuando se inyectan en blastocistos del hospedador, demostrando de esta manera su naturaleza pluripotente y totipotente. Sigue sin demostrarse si las células EG y ES aviares también tendrán diferencias en la metilación de genes. Aunque no se desea limitarse a esta hipótesis, se cree que las células de la presente invención son células EG porque proceden de PGC y no del blastodermo como las células ES.

El hecho de que estas células sean aparentemente células germinales embrionarias se confirma por diversos ensayos. En particular, las células de tejidos son positivas para fosfatasa alcalina (Pain et al, Development, 122: 2339-2342, 1996), y para los antígenos 1 y 3 específicos de ratón (basándose en la reactividad con anticuerpos monoclonales específicos para SSEA-1 y para SSEA-3). Éstos son marcadores de células pluripotentes y totipotentes. De esta manera, las células madre pluripotentes y totipotentes aviares (por ejemplo, de pollo) y de ratón aparentemente comparten epítopos relacionados, característicos de su estado indiferenciado. De esta manera, estos anticuerpos son útiles para seleccionar células germinales embrionarias aviares que aparecen en colonias celulares producidas tras el cultivo prolongado de PGC aviares usando el presente sistema de cultivo.

La totipotencia y pluripotencia de estas células ES se puede confirmar por transferencia a embriones de pollo en la fase X (como se describe por Etches et al, Poultry Science, 72: 882-887, 1993). Esto proporcionará pruebas de que estas células EG aviares pueden producir diferentes tejidos característicos de diferentes fases del desarrollo (pluripotentes) así como migrar a las gónadas, demostrando las transmisión en la línea germinal. Por lo tanto, después de la transferencia, estas células EG producirían aves quiméricas somáticas y en la línea germinal.

En la bibliografía se han presentado métodos para el aislamiento de células germinales primordiales procedentes de embriones aviares donadores y estos métodos pueden realizarse por un especialista en la técnica. (Véase, por ejemplo, el documento JP 924997 publicado el 7 de septiembre, 1993, Pub. Nº 05-227947, Chang et al., Cell Biol. Int., 19 (2): 143-149 (1992); Naito et al., Mol. Reprod. Devel., 39: 153-161 (1994); Yasuda et al., J. Reprod. Fert., 96: 521-528 (1992); y Chang et al., Cell Biol. Int. Reporter, 16 (9): 853-857 (1992), incorporándose todos estos documentos como referencia en su totalidad en el presente documento).

Los presentes inventores eligieron aislar PGC aviares a partir de huevos de gallina que se habían incubado durante aproximadamente 53 horas (fase 12-14 del desarrollo embrionario), retirar los embriones de los mismos, recoger sangre embrionaria de la aorta dorsal y transferirla a un medio de cultivo de células adecuado (medio M199). Después, estas PGC se purificaron por centrifugación en densidad de Ficoll y se resuspendieron en 10 \mul del medio de cultivo de la presente invención que contenía factor de crecimiento. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, se conocen otros métodos para aislar PGC y pueden usarse de forma alternativa.

Después, las PGC aisladas se cuentan y se separan manualmente (por ejemplo, usando una pipeta). Posteriormente, las PGC recogidas a partir de estos embriones aviares diferentes se reúnen (para aumentar el número de PGC) y se incuban en el medio que contiene factor de crecimiento de la presente invención.

Este medio de cultivo, denominado más adelante medio "completo" contiene el LIF, bFGF, SCF e IGF así como otros sustituyentes incluidos típicamente en medios de células madre embrionarias y PGC. Más específicamente, el medio "completo" de la presente invención preferiblemente comprenderá \alpha-MEM, un medio de crecimiento de células disponible en el mercado bien conocido al que se le han añadido los cuatro factores de crecimiento anteriores y que además incluye suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, antibiótico/antimitótico al 0,48%, 2-\beta mercaptoetanol 132 \muM, 1 U/\mul de LIF, 0,40 pg/\mul de bFGF, 60 pg/\mul de IGF-I y 80 pg/\mul de SCF.

Basándose en los experimentos realizados hasta la fecha, se cree que corresponden a las concentraciones mínimas de estos factores de crecimiento. Sin embargo, como se describe más adelante, las cantidades de estos factores de crecimiento se han doblado, manteniéndose de forma satisfactoria las PGC en cultivo tisular. De esta manera, se sabe que las cantidades respectivas de estos factores de crecimiento pueden aumentarse sin efectos adversos. Sin embargo, pueden variar incluso estas cantidades mínimas, por ejemplo, si se cultivan PGC de otras aves.

Como se ha indicado, los presentes inventores usaron como medio base \alpha-MEM, un medio de cultivo tisular disponible en el mercado bien conocido. Sin embargo, es de esperar que este medio pueda sustituirse por otros medios, siempre que también estén presentes estos cuatro factores de crecimiento esenciales. Los solicitantes particularmente contemplan la modificación del presente "medio completo" para eliminar el suero bovino fetal, a causa de su composición indefinida y variable.

Una ventaja particular de la presente invención es el hecho de que las células EG pueden mantenerse en ausencia de una capa de alimentación, que proporciona colonias más puras y una preparación más limpia cuando se producen animales quiméricos o clonados. La mayor pureza de la preparación de células EG a su vez da como resultado una mayor probabilidad de éxito en la producción de animales quiméricos y clonados. Sin embargo, la presente invención también puede realizarse con una capa de alimentación siempre que estas células se transfecten con genes que codifican los factores de crecimiento descritos, eliminando de esta manera la necesidad de añadir de forma exógena estos factores durante el cultivo. Esencialmente, las células proporcionarán una fuente continua de estos factores de crecimiento. (Esto se conseguirá poniendo estos genes de factor de crecimiento bajo el control de un promotor fuerte constitutivo y también secuencias que facilitan su secreción, haciendo de esta manera que estos factores de crecimiento estén disponibles para las PGC cultivadas.)

Como se ha indicado, las cantidades de estos factores se refieren a cantidades relativas eficaces para permitir el cultivo prolongado de PGC aviares, preferiblemente PGC de gallináceas y más preferiblemente PGC de pollo o pavo, durante períodos prolongados en cultivo tisular. En la presente invención, esto se refiere además a cantidades que dan como resultado la des-diferenciación de las PGC cultivadas en células EG.

Preferiblemente, las cantidades relativas de estos factores de crecimiento estarán dentro de los siguientes intervalos:

LIF, de 1 U/\mul a 100 U/\mul, más preferiblemente de 1 a 10 U/\mul y aún más preferiblemente de 1 a 5 U/\mul;

IGF-I, de 0,60 pg/\mul a 60,00 pg/\mul, más preferiblemente de 0,60 pg/\mul a 6,0 pg/\mul en peso y aún más preferiblemente de 0,60 pg/\mul a 1,0 pg/\mul;

SCF, de 80 pg/\mul a 8000 pg/\mul en peso, más preferiblemente de 80 pg/\mul a 800 pg/\mul y aún más preferiblemente de 80 pg/\mul a 160 pg/\mul en peso; y

bFGF, de 0,40 pg/\mul a 40 pg/\mul, más preferiblemente de 0,40 pg/\mul a 4,0 pg/\mul en peso y aún más preferiblemente de 0,40 pg/\mul a 0,80 pg/\mul.

En los intervalos indicados anteriormente, los intervalos superiores no son críticos para la invención y se dictan en gran medida por el coste (dado el gasto significativo asociado con la fabricación de factores de crecimiento).

Sin embargo, es de esperar que estos intervalos preferidos puedan variar, por ejemplo, si el \alpha-MEM se sustituye por otro medio de crecimiento y si se cultivan otros tipos de PGC aviares.

Como se ha descrito, estas PGC pueden mantenerse durante períodos prolongados en cultivo con la producción satisfactoria de aves quiméricas. Hasta la fecha, las células se han mantenido en cultivo tisular durante un período de hasta aproximadamente 4 meses, sin efectos adversos aparentes. Además, en células cultivadas durante un período de hasta 25 días se ha ensayado la capacidad de colonizar eficazmente gónadas embrionarias aviares y de producir aves quiméricas. Sin embargo, es de esperar que estas células puedan cultivarse indefinidamente, con la retención de la capacidad de producir aves quiméricas.

En la técnica se conocen métodos para usar PGC para producir quimeras como se demuestra por la técnica anterior descrita previamente en este documento. Preferiblemente, se transferirán células EG a embriones aviares receptores de acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo que se presenta más adelante. Posteriormente, la producción satisfactoria de quimeras se evalúa basándose en la migración y colonización de las PGC en las gónadas, la retención del fenotipo de PGC o evaluando la presencia de PGC del donador en las gónadas después de la eclosión y reproducción.

En el presente ejemplo, los inventores seleccionaron genotipos que se siguen fácilmente que afectan a la coloración. (Las aves donadoras eran de tipo broiler blancas y las aves receptoras eran aves de plumas negras, respectivamente, con genotipos potenciales específicos.) Las supuestas quimeras eran de plumas negras y producían descendencia negra/blanca cuando se emparejaban con aves de plumas negras. Por lo tanto, las quimeras satisfactorias se demostraban basándose en la producción de aves que contenían plumas negras/blancas.

En una segunda estrategia se usaron aves Bar Rock como receptores, y se usaron aves de plumas blancas como donadores. Las supuestas aves quiméricas se demostraron basándose en la producción de una descendencia con plumas blancas que tenían algunas plumas rayadas.

Sin embargo, el presente método debe ser aplicable para introducir cualquier rasgo deseado por quimerización. Por supuesto, esto dependerá de las propiedades genotípicas de las PGC transferidas.

Como se ha descrito, una aplicación significativa de las PGC de la presente invención, que pueden mantenerse en cultivo durante largos períodos, es para la producción de aves quiméricas. Esto se conseguirá introduciendo una secuencia de ADN deseada en las PGC cultivadas. Se conocen medios para introducir ADN en células receptoras e incluyen lipofección, transfección, microinyección, transformación, técnicas de microproyectiles, etc. En particular, los presentes inventores inicialmente eligieron introducir un vector que contenía un gen indicador por lipofección. Sin embargo, aunque se produjeron PGC transfectadas de forma transitoria, aún no se ha aislado una línea celular transfectada estable. Sin embargo, es de esperar que esto pueda conseguirse por técnicas conocidas usando las PGC de la presente invención.

Preferiblemente, se introducirá un ADN que codifique un gen deseado, por ejemplo, un polipéptido terapéutico, factor de crecimiento, enzima, etc., bajo el control regulador de secuencias operables en aves. Preferiblemente, estas secuencias reguladoras serán de origen eucariota, más preferiblemente aviares, por ejemplo, secuencias reguladoras de pollo. En la técnica se conocen promotores operables en células aviares, por ejemplo, derivados de genes o virus de aves.

Inicialmente, una línea celular estable que produce la proteína deseada se aislará y usará para la producción de quimeras. Además, es deseable que el ADN introducido contenga un ADN marcador, cuya expresión se detecta fácilmente, para identificar más fácilmente las células que contienen el ADN insertado. Estos marcadores seleccionables son bien conocidos e incluyen la \beta-lactamasa, \beta-galactosidasa, neomicina fosfotransferasa, etc.

La inyección de las PGC transgénicas resultantes en embriones aviares entonces dará como resultado la producción de aves quiméricas transgénicas. Preferiblemente, la proteína deseada después se recuperará a partir de los huevos, fluidos corporales, etc. de estas aves transgénicas, proporcionando de esta manera un suministro continuo de la proteína.

Como se ha descrito, la presente invención implica la producción de células EG a partir de PGC que se han cultivado como se ha descrito anteriormente.

Estas células EG se identificarán basándose en su expresión de antígenos o marcadores "ES" característicos, en particular fosfatasa alcalina y antígenos embrionarios con especificidad de fase. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos monoclonales específicos para SSEA-1 y SSEA-3 para identificar células pluripotentes y totipotentes en PGC que se han cultivado durante períodos prolongados, típicamente al menos 25 días en cultivo tisular. Por ejemplo, MC-480 es un anticuerpo monoclonal específico para el antígeno SSEA-1 (Solter y Knowles (1978)).

Además, otro anticuerpo monoclonal, EMA-1 es específico para PGC de ratón y pollo y por lo tanto debe permitir la identificación de cultivos de PGC que retienen epítopos específicos de PGC. (Este anticuerpo se une a epítopos específicos expresados en células germinales primordiales tanto de ratón como de pollo.) Por lo tanto, EMA-1 debe ser útil para la caracterización adicional de células EG aviares genéricamente, ya que estos epítopos se conservan aparentemente en especies muy diferentes (aves y mamíferos).

Como se ha descrito, la totipotencia y pluripotencia de estas células EG puede ensayarse por transferencia a embriones aviares, por ejemplo, por transferencia a embriones de pollo en la fase X como se describe por Etches et al, Poultry Science, 72: 882-889, 1993 y a embriones en la fase XII-XIV como se ha descrito anteriormente. Esto proporcionará pruebas experimentales de que estas células EG se diferencian en diferentes tipos de tejidos (pluripotentes) encontrados en embriones en desarrollo y también que migran satisfactoriamente y colonizan las gónadas (demuestra que estas células se transmitirán a la línea germinal). Por lo tanto, estas células darán como resultado aves quiméricas somáticas y de línea germinal, por ejemplo, pollos quiméricos.

Generación de pollos transgénicos

El desarrollo de un sistema de cultivo para mantener la proliferación de PGC y permitir adicionalmente su des-diferenciación en células EG aumenta la capacidad de transfectar células con construcciones de vectores de ADN que llevan genes exógenos para la producción sistémica de proteínas extrañas en pollos. De manera similar, será posible la generación de pollos transgénicos con localización dirigida (recombinación homóloga) también conocidos como "knock-outs" y "knock-ins", ya que el método facilita la selección y proliferación de células EG después de la transfección.

Uso de células EG para clonación de pollos

Ya se ha conseguido la clonación de mamíferos. La clonación de aves puede realizarse usando células PGC y EG y células embrionarias posiblemente diferenciadas (fibroblastos embrionarios de pollo, CEF). Esto puede conseguirse del siguiente modo:

1. Se producirán quimeras de pollo por irradiación gamma de huevos recién puestos de modo que las células del embrión se vean comprometidas. Esto vendrá seguido de microinyección de células EG clonadas en cantidades aproximadamente equivalentes a la cantidad de células contenidas en el blastodermo comprometido. El nivel óptimo de irradiación gamma y la cantidad de células inyectadas puede determinarse fácilmente de acuerdo con las enseñanzas de la técnica (Carsience et al., Development (1993) 117: 659-675; Etches et al., Poultry Sci. (1993) 73: 882-889.)

2. Se generarán clones de pollo a partir de huevos no fertilizados recién puestos, por extracción del oocito no fertilizado seguido de irradiación gamma, estimulación eléctrica del oocito, inyección y fusión de una EG, PGC o CEF. Después de la fusión, el oocito se transferirá a una placa petri que contiene medio de cultivo embrionario (Ono et al, Devel. Biol., 161: 126-130, 1994), o se volverá a injertar en un huevo no fertilizado.

Ejemplo

En los experimentos descritos a continuación se usaron los siguientes materiales y métodos.

Materiales y métodos Anticuerpos Monoclonales

Los anticuerpos primarios EMA-1 y MC-480 (anticuerpo anti-SSEA-1) se obtuvieron en el Developmental Studies Hubridoma Bank (DSHB), The University de Iowa.

Anticuerpo EMA-1

El anticuerpo monoclonal EMA-1 es un marcador de la superficie celular específico para células germinales de primordio de ratón (PGC), desarrollado por Hahnel y Eddy (1986). Este reactivo se desarrolló contra a los marcadores de la superficie celular de células de carcinoma embrionario (EC) de ratón Nulli SCCI. El anticuerpo se preparó fusionando células de mieloma NS-1 con células del bazo de ratones C57BI/6J inmunizados con células EC Nulli SCCI. En anticuerpo monoclonal EMA-1 es de isotipo IgM (Addendum Nº 1). El antígeno reconocido por el anticuerpo es una glicoproteína de la superficie celular. La expresión del antígeno EMA-1 en PGC de ratón se restringe a los días 8-13 en un embrión de ratón en desarrollo. EMA-1 reacciona con la mayoría, pero no con todas las células pluripotentes en los embriones en sus primeras fases del desarrollo (Hahnel y Eddy, 1987). De acuerdo con Hahnel y Eddy (1986), las PGC son las únicas células que se tiñen fuertemente con EMA-1 en las regiones caudales de embriones de 9,5 a 11 días. Mostró reactividad con PGC en las crestas urogenitales de la región media caudal de secciones de embriones de 13 días de edad de ratón macho. No mostró reactividad con PGC en secciones de embrión de ratón de 14 días de edad. EMA-1 se une a la periferia y a un gránulo citoplasmático presente en PGC. El antígeno que lleva el determinante EMA-1 en las células Nulli es insensible al tratamiento con EDTA y con tripsina.

Anticuerpo MC-480 (Anti-SSEA-1)

El anticuerpo monoclonal MC-480 reconoce un antígeno SSEA-1 embrionario de ratón específico de fase. El anticuerpo es de isótopo IgM, descrito por Solter y Knowles (1978). El antígeno SSEA-1 de la superficie celular identificado por este anticuerpo está compuesto por un epítopo de carbohidrato sobre glicolípidos y glicoproteínas que implican el grupo sanguíneo de tipo 2 fucosilado (Addendum Nº 2). El anticuerpo se desarrolló por la fusión de células de mieloma de ratón con células de bazo de ratón inmunizado con células de teratocarcinoma F9. La especificidad de este anticuerpo se ensayó en una serie de líneas celulares de ratón y humano usando radioinmunoensayo (RIA). El anticuerpo reaccionó con células de teratocarcinoma de ratón y dos líneas de células derivadas de teratocarcinoma humano (Solter y Knowles, 1978). Todas las líneas celulares diferenciadas obtenidas de los mismos tumores y las líneas de células madre de teratocarcinoma fueron negativas para el antígeno. El sobrenadante del hibridoma se ensayó adicionalmente en embriones de ratón. El anticuerpo no mostró reactividad con huevos no fertilizados, cigotos y embriones en fase de 2 a 4 células. El anticuerpo se une con una eficacia en aumento a embriones en fase tardía de 8 células y mórulas. La cantidad de unión disminuyó en blastocistos. Los ensayos que usan lisis dependiente del complemento mostraron una tendencia similar. No se observó lisis de los embriones antes de la fase de 8 células. Se observó una lisis moderada de embriones de 8 células (10-20%) mientras que las mórulas, los blastocistos y las masas de células internas se lisaron con alta eficacia (Solter y Knowles, 1978). También fueron similares los resultados con ensayos con inmunofluorescencia indirecta, donde los huevos no fertilizados, cigotos y embriones en fase 2 y 4 fueron negativos. La mayoría de las masa celulares internas (ICM) cultivadas in vitro hasta 3 días fueron positivas para el antígeno. El ectodermo expuesto retirando la capa exterior del endodermo de ICM que había crecido in vitro siempre fue completamente positivo. Solter y Knowles (1978) sostuvieron que probablemente se sinteticen o activen varias glicosiltransferasas específicas de fase y se presenten en las superficies celulares durante las primeras fases de preimplantación y desarrollo embrionario.

Animales

Se han usado pollos de tipo broiler blancos (E/E y I/I) como donantes de PGC para desarrollar el sistema de cultivo de PGC de larga duración. Se usaron dos tipos de aves como embriones receptores, una línea de pollo de pluma negra dominante (E/- y i/i) y una línea Bar Rock (E/E y i/i). Las aves negras dominantes inyectadas con PGC de tipo broiler blanco (WB) se denominan como E/-(WB) y las aves Bar Rock inyectadas con PGC de tipo broiler blanco se denominan BR (WB) .

Extracción de PGC

Se seleccionaron embriones en fase 12 a 14 para la extracción de PGC. Se recogieron PGC de la aorta dorsal con una micropipeta fina como describe Naito et al., Mol Reprod. Dev., 37:167-171 (1994). Se combinaron PGC de 20 embriones en solución de Hanks' suplementada con suero bovino fetal al 10% y concentrada por centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll (Naito et al., Mol. Reprod. Dev., 39:153-171, 1994). Se contaron y distribuyeron las PGC en gotas de 10 \mul de medio de cultivo (DMEM, que contenía diferentes cantidades de factores de crecimiento) a aproximadamente 100 a 600 PGC por gota. Las gotas de cultivo se recubrieron con aceite mineral ligero estéril.

Inyección de PGC en embriones receptores

Como embriones receptores se usaron embriones en fase 13-14. Después de colocar el huevo en una superficie apropiada, se dejó un tiempo para que el embrión en desarrollo se colocara por sí mismo en la parte superior del huevo en reposo. Se hizo una abertura pequeña de 10 milímetros o menos ("ventana") en la cáscara con un fórceps fino. El embrión se llevó cerca de la superficie añadiendo una mezcla de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con antibióticos al 4%. Después de que se acomodara el embrión para visualizar su corazón, podía identificarse fácilmente la aorta dorsal y/o la vena marginal. Se tomaron 200 PGC del donante en 2 \mul de medio que contenía azul de triptano al 0,04% en una micropipeta. Se inyectaron PGC en la aorta dorsal del embrión receptor. El azul de triptano, un colocarte celular inerte, permitió la visualización de la suspensión de PGC cuando se estaba suministrando. Después de la inyección, se cerró la abertura de la cáscara del huevo con cinta quirúrgica y se reforzó con parafina. Los huevos se mantuvieron durante 24 horas en vigilancia en una incubadora de CO_{2} humidificada y se transfirieron después a una incubadora regular hasta la eclosión del huevo.

Tinción fluorescente viable de PGC

Para evaluar el éxito de las transferencias y/o la capacidad de las PGC de migrar a las gónadas, se tiñeron las PGC con tinción fluorescente DiI. Los embriones se recogieron después de 24 horas de transferencia, se colocaron en una placa petri y se observaron en un microscopio invertido equipado para el análisis epi-fluorescente.

Condiciones de cultivo de PGC

Se han ensayado varias concentraciones de factor inhibidor de leucemia humana (Lif), factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (b-FGF), factor de crecimiento semejante a insulina humano (IGF) y factor de células madre humano (SCF). Del mismo modo, se ensayaron capas alimentadas con fibroblastos de pollo tratados con mitomicina y células de STO de ratón.

Medio de cultivo celular de larga duración de PGC

El medio de cultivo celular completo está hecho de \alpha-MEM, suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, antibiótico-antimicótico al 0,56%, 2-\beta mercaptoetanol 34,56 mM, 0,00625 U/\mul de factor inhibidor de leucemia (LIF), 0,25 pg/\mul del factor de crecimiento de fibroblastos básico (b-FGF), 0,5625 pg/\mul de factor de crecimiento semejante a insulina (IGF) y 4,0 pg/\mul de factor de células madre (SCF). Se realizaron cambios en el medio un día sí y otro no retirando 5 \mul de medio y añadiendo 5 \mul de nuevo medio 2X. Se supone que en este último, los factores de crecimiento serán inestables después de algún período de cultivo continuo. Sin embargo, el resultado global es que la concentración de factores de crecimiento se dobla. Por lo tanto, el medio final contiene ahora las siguiente concentraciones de factores de crecimiento:

0,0125 U/\mul de factor inhibidor de leucemia (LIF), 0,5 pg/\mul de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), 1,125 pg/\mul de factor de crecimiento semejante a insulina (IGF) y 8,0 pg/\mul de factor de células madre (SCF). El intervalo de concentración de factor de crecimiento descrito en este documento promueve el mantenimiento y la proliferación de PGC en cultivo continuo. Sin embargo, las PGC sobreviven y proliferan mejor en el extremo mas alto de las concentraciones de factor de crecimiento descritas.

Usando estas condiciones de cultivo, las PGC forman grupos de células grandes, densos, poco adherentes (algunos de los grupos tienen varios cientos de células en ellos) de 3 a 4 días después de la recogida. Al final de 7 días, los grupos empiezan a tener grandes cantidades de células muertas y desechos celulares rodeándolos. Los grupos de PGC sobreviven hasta 4 semanas antes de que lleguen a ser monocapas celulares. En las semanas 1, 2 y 3, los grupos se han disociado, teñido con un colorante vital DiI y transferido en embriones receptores. En tres momentos puntuales se encontraron células en las gónadas de algunos de los embriones receptores. La cantidad de células y la cantidad de embriones que muestran PGC teñidas en las gónadas fue inversamente proporcional a la edad del cultivo de PGC.

Procedimiento de ensayo con anticuerpos y crecimiento de líneas celulares de control

Se sembraron células en capa con suministro de STO irradiadas con radiación gamma (8000 rads) (American Type Culture Collection, Nº de Cat. 1503-CRL) en portaobjetos de cámaras con 4 pocillos a aproximadamente una confluencia del 70 al 80% en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM); SIGMA, Nº de Cat. D-5523). Las células ES de ratón, usadas como controles experimentales positivos, se sembraron en las capas de células de suministro STO de 8 a 10 horas después.

Se preparó medio completo DMEM suplementando el medio base a una concentración final a 4,5 g/l de glucosa (SIGMA, Nº de Cat. G-7021), 1,5 g/l de bicarbonato sódico (SIGMA, Nº de Cat. S-4019), piruvato sódico 1 mM (GIBCO, Nº de Cat. 11360-070), 2\beta-mercaptoetanol 0,1 mM (GIBCO, Nº de Cat. 21985-023) suero bovino fetal al 10% (Hyclone, Nº de Cat. SH30070-03) y antibiótico/antimitótico al 1% (SIGMA, Nº de Cat. A-7292).

Como controles negativos se usaron fibroblastos de pollos sembrados en portaobjetos de cámara de 4 pocillos en medio completo DMEM. Las células se incubaron durante 3 días a 37ºC y CO_{2} al 6%, después de lo cual las células ES de ratón formaron colonias visibles. El medio se decantó, se aclaró en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y las células se fijaron en paraformaldehído al 4% frío (SIGMA, Nº de Cat. P-6148) durante 15 minutos a 4ºC.

Se transfirieron grupos de células de cultivos de PGC de pollo de 98 días de edad in vitro a portaobjetos de cámara de 4 pocillos y se fijaron en paraformaldehído al 4% frío, mientras que las PGC de pollo recientes se fijaron en portaobjetos de vidrio normales. Se realizó un bloqueo durante 30 minutos usando reactivo de bloqueo (1 mg/ml de albúmina de suero bovino en PBS, Fisher, Nº de Cat. BP1605-100).

Los anticuerpos se diluyeron a una proporción de 5 \mug/ml en el reactivo de bloqueo, se aplicaron 200 \mul sobre los portaobjetos respectivos y se incubaron durante 18 horas durante una noche a 4ºC. Las células se aclararon una vez en PBS frío. En cada portaobjetos se aplicaron doscientos microlitros del anticuerpo secundario (IgM de cabra anti-ratón purificada por afinidad conjugada con fluoresceína, Jackson laboratories, Cat. 9115-015-020), a una proporción de 5 \mug/ml en reactivo de bloqueo, y se incubó durante un período adicional de una hora a 37ºC. Los portaobjetos se lavaron tres veces durante 5 minutos cada uno en citrato salino sódico 4X (SSC) que contenía Tween-20 al 0,1% (Fisher, Nº de Cat. BP337-100) a 37ºC. Las células se tiñeron durante 10 minutos a temperatura ambiente en SSC 2X que contenía 400 ng/l de DAPI (SIGMA, Nº de Cat. D-9542), se aclararon durante 3 minutos en SSC 2X que contenía Tween-20 al 0,05% y se montaron en agente contra la pérdida de tinción DABCO (SIGMA, Cat D-2522).

Los portaobjetos se observaron en un fotomicroscopio Nikon Eclipse E800 equipado con óptica de campo claro, de DIC, de fase y fluorescente incluyendo una iluminación epifluorescente con lámpara de mercurio de 100 vatios con filtros de excitación/barrera convencionales. Las células se observaron bajo los ajustes de filtro apropiados para detectar señales FITC y núcleos teñidos con DAPI. También se obtuvieron imágenes de contraste de fases de las células. Se capturaron imágenes digitalizadas usando una cámara CCD refrigerada con líquido CoolCam (Cool Camera Company, Decatur, GA) usando el software Image-Pro® Plus versión 3.0 (Media Cybernetics, Silver Springs, NM) y se almacenaron en una unidad Iomega® ZIP®. Las imágenes se procesaron usando el software Photoshop® 4.0 (Adobe) y se imprimieron en papel de calidad fotográfica brillante usando la impresora Epson Stylus-800.

Transferencia de PGC a embriones receptores

Para la transferencia de PGC, el huevo receptor se colocó de manera horizontal en un ambiente de disección. Se perforó un pequeño agujero en el espacio con aire del huevo para disminuir la presión interna del huevo y evitar la salida de material del interior del huevo. Se abrió una ventana de 10 mm en la superficie ventral del huevo y se inyectó aproximadamente 1 ml de PBS con antibiótico/antimitótico al 4% a través del agujero para hacer subir al embrión hasta que estuvo casi al mismo nivel de la ventana de la cáscara del huevo. Para inyectar las PGC, se biseló una pipeta de 30 \mum y después se tiró de ella usando una microforja para formar una punta fina con bordes pulidos. Se cogieron manualmente doscientas PGC por transferencia de embrión, disociadas como se describe más adelante, usando un pipeta de aguja (Needle-pipette) y un tubo de succión. Antes de la transferencia, y mientras estaban en la pipeta, las PGC se mezclaron con una solución al 0,04% de tinte azul de triptano. El volumen de inyección total por embrión fue 2 \mul. Para la etapa final, el embrión receptor se colocó para que descubriera una parte de la vena marginal. La pipeta de aguja con las PGC se insertó y se expulsaron cuidadosamente los contenidos. La pipeta de aguja se mantuvo en el lugar durante unos pocos segundos y después se retiró. Los huevos receptores se precintaron con 2 capas de cinta quirúrgica seguido de un recubrimiento de cera de parafina del área completa. Los huevos receptores después se volvieron a colocar en una incubadora de rotación y se incubaron hasta la eclosión del
huevo.

Evaluación de fenotipo de PGC

Las PGC de pollo son positivas para tinción con ácido de Schiff peryódico (PAS) y, según se afirma, son positivas para fosfata alcalina. Sin embargo, no hay pruebas convincentes de que las PGC de pollo sean positivas para esto último. En ausencia de un método con marcador enzimático o molecular alternativo para caracterizar las PGC de pollo, se evaluó su fenotipo transfiriendo células a embriones receptores y evaluando su presencia en las gónadas del embrión en desarrollo. Este método requiere cultivar las PGC en 100 \mug/ml de DiI en un medio \alpha-MEM y aclararlas antes de transferirlas a embriones receptores. Se retiraron embriones receptores veinticuatro horas después de la transferencia y se colocaron en un microscopio invertido. Las células marcadas con DiI en las gónadas se interpretaron como una migración de PGC satisfactoria a las gónadas y confirmación de la retención de características de las PGC. Se aplicó un segundo método para evaluar la retención del fenotipo de PGC dejando que los embriones receptores salieran de huevo y después evaluando la presencia de PGC donantes en sus gónadas después de reproducirse.

Estrategia de reproducción para la evaluación de PGC

Se siguieron dos estrategias de reproducción. La primera estrategia usó aves de plumas negras receptoras con los posibles genotipos i/i, E/E, s/s, b/b y aves de tipo broiler con plumas blancas con genotipo I/I, E/E, S/S, B/B. Para demostrar que los animales receptores eran quiméricos, es decir, para poder decir que contienen sus propias PGC y PGC de donantes en sus gónadas, se cruzaron con aves de plumas negras puras. Si la descendencia resultante era toda de plumas negras, entonces se suponía que el animal no era quimérico. Sin embargo, si algún individuo de la descendencia era de plumas blancas con algunas zonas de plumas negras, entonces el animal receptor sería quimérico. Para la segunda estrategia de reproducción, se usaron aves Bar Rock como embriones receptores mientras que los donadores seguían siendo aves de tipo broiler con plumas blancas. En este último caso, cuando se cruzaron aves supuestamente quiméricas con Bar Rocks puras, la presencia de descendencia con plumas blancas con algunas plumas a rayas identificaría un ave quimérica positiva. Se obtuvo una descendencia de cincuenta de cada ave supuestamente quimérica antes de decidir su estado quimérico.

Ensayos de la descendencia

Cuando se cruzaron aves supuestamente quiméricas E/-(WB) con aves WB, se produjeron pollos blancos puros cuando procedían de un PGC donante (WB) y, pollos con plumas blancas con manchas negras cuando procedían de la PGC (E/-). De manera similar, cuando se cruzaban aves BR(WB) con WB, se produjeron pollos blancos puros cuando procedían de una PGC donante (WB) y pollos blancos con manchas negras cuando procedían de PGC (BR). También se hicieron cruces entre aves supuestamente quiméricas BR. Para esto último, se produjeron pollos blancos cuando sucedió una fertilización entre dos PGC (WB) y el resultado de la fertilización con dos PGC (BR) fueron pollos negros. El intermedio de pollo blanco con plumas con manchas negras sólo sucedió cuando se fertilizó una PGC (BR) por una PGC (WB).

Cultivos de larga duración mas allá de 25 días (Células EG)

Después de 25 días de cultivos continuos, los grupos de PGC forman rápidamente monocapas que proliferan rápidamente. Estas monocapas de células tienen una base adherente plana y grupos y cadenas más sueltas de células de tipo PGC en la superficie superior. Algunos conjuntos de estas monocapas de células siguen siendo PAS positivas. Se han transferido células teñidas con DiI obtenidas a partir de estas monocapas a embriones receptores. Algunos embriones han mostrado pocas células localizadas en sus gónadas. Se han pasado sucesivamente monocapas celulares. Generalmente estas células son capaces de experimentar de 3 a 5 pases antes de que comiencen a ralentizar su proliferación, envejezcan y lleguen a tener un aspecto de fibroblasto. Hay varias líneas celulares que han experimentado múltiples pases y continúan prosperando sin diferenciación aparente durante aproximadamente cuatro meses en cultivo continuo.

Se han congelado dos líneas celulares obtenidas a partir de monocapas, P102896 y P110596. La primera no mostró diferenciación aparente y era marginalmente positiva para la fosfatasa alcalina mientras que la última mostró una morfología de célula neuronal y era fuertemente positiva para la fosfatasa alcalina. Como se ha analizado anteriormente, las caracterizaciones adicionales de monocapas de PGC como se ha descrito en este documento (específicamente las supuestas células EG) confirmará adicionalmente su totipotencia y pluripotencia.

Resumen de los resultados

Se generaron pollos quiméricos a partir de PGC recientes y crioconservadas. Veinticinco (74%) de los 34 supuestos pollos quiméricos, producidos por transferencias por PGC recientes, demostraron ser animales quiméricos verdaderos después del ensayo de la descendencia. Treinta (88%) de las 34 supuestas aves quiméricas, producidas con PGC crioconservadas, demostraron ser pollos quiméricos verdaderos. En todos los casos, se produjeron al menos 40 descendientes y la cantidad de PGC donantes que se fertilizaron por ave quimérica varió del 1,4% al 100%, variando la mayoría entre el 30% y el 60%. Suponiendo que esto último sea un reflejo de la cantidad de PGC que migraron a las gónadas después de la inyección, entonces el intervalo de éxito por inyección fue variado. Sin embargo, podría haber otros mecanismos que pudieran estar afectando a la cantidad de PGC que llegan a establecerse en la gónada del receptor. Dichos mecanismos no se evaluaron en este estudio. Además, en promedio, no se observó ninguna alternación significativa de la proporción de sexos en la descendencia de las aves quiméricas.

Condiciones de cultivo de PGC

Ninguna de las capas de suministro celular evaluadas en este estudio mejoraron las condiciones de cultivo de larga duración de las PGC. Ninguno de los factores de crecimiento solo, en cualquiera de las concentraciones estudiadas, fue capaz de mantener las PGC in vitro sin diferenciación. También se ensayaron las combinaciones de dos y tres factores de crecimiento con poco éxito. En base a estos resultados, parece ser que todos los factores descritos anteriormente (LIF, BFGF, IGF y SCF) son necesarios para el cultivo de larga duración de PGC. En base a la tinción con DiI de PGC, se observó que, en estas condiciones de cultivo, las PGC que se originan a partir de cultivos continuos de 14 días de edad migran a las gónadas de embriones receptores después de la inyección. También se transfirieron PGC que se habían mantenido en cultivo durante 25 días a tres embriones receptores que se llevaron hasta la eclosión del huevo. Se determinó que uno de estos embriones era quimérico en base a los resultados de ensayo de la
descendencia.

Fenotipo de PGC en condiciones de cultivo de larga duración

Después de la recogida, se reconocieron las PGC por su tamaño y por la presencia de gotitas lipídicas en su membrana y citoplasma. Aproximadamente 48 horas después de la recogida, las PGC se agruparon entre sí y comenzaron a dividirse como fue evidente por el crecimiento en el tamaño del grupo y la cantidad de células observadas después de la disociación con tripsina del grupo. Solo las PGC que formaban grupos sobrevivían, todas las demás murieron. Generalmente, un cultivo que comienza con 100 PGC terminará con una media de 600 a 800 PGC en 7 días. Claramente, algunas PGC se dividen, aunque no a una proporción eficaz, sin embargo, como se indicaba anteriormente, estas PGC mantienen su capacidad de migrar a las gónadas.

Cultivos de larga duración más allá de 25 días

Después de 25 días de cultivos continuos, los grupos de PGC forman rápidamente monocapas en propagación. Éstas monocapas de células tienen una base adherente plana y grupos y cadenas más sueltas de células tipo PGC en la superficie superior. Algunos trozos de estas monocapas de células permanecen positivas para PAS. Se han transferido células teñidas con DiI obtenidas a partir de estas monocapas a embriones receptores. Algunos embriones han mostrado pocas células localizadas en sus gónadas. Las monocapas celulares se han pasado de manera satisfactoria. Generalmente, estas células son capaces de experimentar de 3 a 5 pases antes de que comiencen a ralentizar su proliferación, envejecer y llegar a tener un aspecto de fibroblasto. Hay unas pocas líneas celulares que han sufrido múltiples pases y continúan prosperando sin diferenciación aparente durante aproximadamente cuatro meses en cultivo
continuo.

Se han congelado dos líneas celulares en particular obtenidas a partir de monocapas y se denominan P102896 y P110596, aunque se han establecido muchas líneas celulares que tienen características similares. La primera no mostró diferenciación aparente y fue marginalmente positiva para la fosfata alcalina, mientras que la última mostró morfología de célula neural y era fuertemente positiva para la fosfatasa de alcalina.

En particular, se ha demostrado que las PGC cultivadas usando los cuatro factores de crecimiento anteriores durante al menos 25 días pueden colonizar de manera satisfactoria las gónadas y producir pollos quiméricos. Además, se han mantenido células PGC en cultivo durante hasta cuatro meses. Estos cultivos parece que aún comprenden células que tienen el fenotipo de PGC deseado en base a los resultados de los ensayos descritos en este documento. Aunque estas células no se ensayaron con respecto a su capacidad de producir aves quiméricas, en base a su aspecto, se espera que sean útiles para lo mismo.

Detección de anticuerpos EMA-1 y MC-480 en PGC de pollo en cultivo de larga duración

Se ensayaron los anticuerpos monoclonales EMA-1 y MC-480 en células ES de ratón (controles positivos), PGC de pollo que estaban en cultivo durante 98 días, PGC de pollo recién recogidas, y fibroblastos de pollo (controles negativos).

El anticuerpo EMA-1 se unió con alta afinidad a las células ES de ratón (Figura 1), a células de cultivos de PGC de 98 días de edad (Figura 2) y a la mayoría de las PGC de pollo recién obtenidas (Figura 3). EMA-1 no se unió a fibroblastos de pollo (Figura 4). Estos resultados están de acuerdo con los de Hahnel y Eddy (1987) que informaron que este anticuerpo detectaba marcadores de la superficie celular que están presentes en la mayoría de las células embrionarias de ratón pluripotentes así como PGC. También informaron que EMA-1 mostraba células positivas de manera recurrente a lo largo del epitelio del tracto urogenital de tejidos adultos así como en embriones en las primeras fases del desarrollo. No informaron sobre la detección de este epítopo en ningún otro tejido adulto. Es posible que el anticuerpo detecte el epítopo en el puente urogenital adulto gracias a la presencia de células germinales. Pain et al (1996) informó sobre el uso de EMA-1 para identificar células ES de pollo en cultivo. Sugirió que epítopo EMA-1 puede ser un marcador útil para identificar células madre embrionarias no diferenciadas. En estos experimentos, EMA-1 dio señales positivas muy fuertes en cultivos de PGC de pollo de 98 días de edad comparables a las células ES de ratón, así como en PGC recientes. Sin embargo, este anticuerpo no diferencia entre fenotipos de células PGC y ES; simplemente indica el potencial de pluripotencia y totipotencia. Esto sugiere que las PGC en cultivos de larga duración permanecen como PGC o se des-diferencian para dar células EG pluripotentes.

El anticuerpo MC-480 reaccionó fuertemente con antígenos de la superficie celular en células EG de ratón (Figura 5) y PGC de 98 días de edad de cultivo (Figura 6). Muy pocas PGC recientes fueron positivas al antígeno (Figura 7), mientras que los fibroblastos de pollo siempre fueron negativos (Figura 8). Estos resultados sugieren que las PGC en cultivo in vitro de larga duración se des-diferencian en células EG pluripotentes. El hecho de que algunas de las PGC recientes dieran señales positivas con el anticuerpo indica que algunas PGC recientes aún retienen algunos de los antígenos ES durante su período de migración a las gónadas embrionarias. Estos antígenos pueden perderse posteriormente. Sin embargo, también es posible que las PGC que muestran el antígeno EG en sus superficies finalmente lleguen a sobrevivir mejor en los cultivos de larga duración de los presentes solicitantes. Los dos resultados considerados juntos sugieren que las PGC en estos cultivos de larga duración se des-diferencian hasta llegar a ser células madre pluripotentes. Este descubrimiento es similar al que indica que PGC de ratón se des-diferencian en cultivo y llegan a ser células EG (Matsui et al, 1992).

Estos resultados indican que el medio de cultivo de PGC de pollo de la presente invención influye en la des-diferenciación de PGC de pollo en células EG. Ésta es una etapa importante en la producción de células de pollo pluripotentes útiles para la generación eficaz de animales transgénicos y clonación de aves.

Transfección de PGC

Se ha usado la lipofección de un vector que contiene el gen informador de la proteína verde fluorescente para la transfección de PGC. De media, se transfectaron de manera transitoria 1/50 PGC, sin embargo, aún no se ha desarrollado una línea de células transfectadas estable.

En resumen, estos resultados indican que las PGC pueden mantenerse durante períodos prolongados y usarse satisfactoriamente para la producción de aves quiméricas. Otros cambios adicionales en las concentraciones de factores de crecimiento y el uso de otros factores de crecimiento puede optimizar adicionalmente las condiciones de cultivo. Para que sea útil, un sistema de cultivo de PGC debe permitir la transfección y selección de PGC manteniendo la capacidad de PGC de migrar a las gónadas. Además, estos resultados indican que las PGC aviares (por ejemplo, de pollo) revierten al fenotipo de célula EG, como sucede con las PGC de ratón (Matsui et al., Cell, 70:841-847, 1992). Por lo tanto, la inyección de células EG dispersadas en blastodermos receptores debe posibilitar la generación de pollos quiméricos y transgénicos. Además, estas células son potencialmente útiles para producir líneas de células EG transgénicas que pueden usarse para producir aves quiméricas transgénicas y clonadas.

Claims (23)

1. Un método de cultivo que permite la producción de células germinales embrionarias (EG) aviares, que comprende las siguientes etapas:

(i) aislar células germinales primordiales (PGC) a partir de un ave deseada;

(ii) cultivar dichas células germinales primordiales en un medio de cultivo que contiene al menos los siguiente factores de crecimiento en cantidades suficientes para mantener dichas PGC durante períodos prolongados en cultivo tisular:

(1)

factor inhibidor de leucemia (LIF),

(2)

factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF),

(3)

factor de células madre (SCF), y

(4)

factor de crecimiento semejante a insulina (IGF),

durante un período de tiempo prolongado suficiente para producir un cultivo con un aspecto de tipo multicapa compacta; y

(iii) identificar las células germinales embrionarias contenidas en las mismas.

2. El método de la reivindicación 1, en el que las cantidades mínimas de dichos factores de crecimiento son:

(1)

LIF (0,00625 U/\mul),

(2)

bFGF (0,25 pg/\mul),

(3)

IGF (0,5625 pg/\mul), y

(4)

SCF (4,0 pg/\mul).

3. El método de la reivindicación 2, en el que las cantidades máximas de dichos factores de crecimiento varían de aproximadamente dos veces a cien veces dichas cantidades mínimas.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dichas PGC aviares se obtienen a partir de un ave del género Gallinacea.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dichas PGC son PGC de pollo o PGC de pavo.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dichas PGC se mantienen en cultivo durante al menos 25 días.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dichas PGC se mantienen en cultivo durante más de 25 días.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dichas PGC se mantienen en cultivo durante al menos 4 meses.

9. El método de la reivindicación 1, en el que las células EG aviares se identifican en base a su expresión de antígeno 1 específico de fase de ratón y/o reactividad con el anticuerpo monoclonal EMA-1 o MC-480.

10. El método de la reivindicación 9, en el que el fenotipo EG de dichas células se confirma adicionalmente por transferencia de dichas células a un embrión de ave adecuado.

11. El método de la reivindicación 10, en el que dicho embrión es un embrión de pollo en fase X.

12. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:

(iv)

transfectar o transformar las células EG resultantes con una secuencia de ácido nucleico deseada.

13. El método de la reivindicación 12, en el que dicha secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido terapéutico.

14. Un método para producir aves quiméricas que comprende:

(i) aislar células germinales primordiales (PGC) a partir de un ave;

(ii) mantener dichas PGC en un medio de cultivo tisular que contiene al menos los siguiente factores de creci-
miento:

(1)

factor inhibidor de leucemia (LIF),

(2)

factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF),

(3)

factor de células madre (SCF), y

(4)

factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), durante un tiempo suficiente para producir células germinales embrionarias (EG);

(iii) transferir dichas células EG a un embrión de ave receptor; y

(iv) seleccionar aves quiméricas que tienen el fenotipo PGC deseado.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dichas PGC proceden de embriones de ave del género Gallinacea.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dichos embriones de ave son embriones de pavo o de pollo.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dichas células EG se transfectan o transforman con una secuencia de ácido nucleico deseada antes de la transferencia a un embrión de ave receptor.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicha secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido terapéutico.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, que incluye adicionalmente purificar dicho polipéptido terapéutico a partir de los huevos de las aves quiméricas producidas de acuerdo con la etapa (iv), o a partir del sistema circulatorio sistémico, fluidos corporales o tejidos.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que las PGC se inyectan en la aorta dorsal de un embrión de ave receptor o en blastodermos receptores.

21. Una línea EG de aves obtenida por el método de cultivo de la reivindicación 1.

22. La línea celular de la reivindicación 21, que es una línea de células EG de pollo o de pavo.

23. La línea celular de la reivindicación 21, que contiene una secuencia de ácido nucleico finsertada.