ES2255329T3 - Metodo y composiciones para inmunizacion con el antigeno v de pseudomonas aeruginosa. - Google Patents

Abstract

El uso del antígeno PcrV en la fabricación de un medicamento o vacuna para usar en la inhibición de la infección por Pseudomonas aeruginosa.

Description

Método y composiciones para inmunización con el antígeno V de Pseudomonas aeruginosa.

Fundamentos de la invención

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno bacteriano oportunista que es capaz de causar infecciones pulmonares agudas fatales en individuos críticamente enfermos (1). La capacidad de la bacteria para dañar el epitelio pulmonar se ha relacionado con la expresión de toxinas que son directamente inyectadas en las células eucariotas mediante un mecanismo de secreción y translocación mediado de tipo III (2, 3).

Las proteínas codificadas por el aparato de secreción y translocación de tipo III de P. aeruginosa muestran una alto nivel de identidad de aminoácidos con miembros del regulón Yop de Yersinia (4-6). De todos los sistemas de tipo III descubiertos en bacterias Gram-negativas, sólo P. aeruginosa posee un homólogo al antígeno V de Yersinia, PcrV (véase 6 para una revisión de sistemas de tipo III). Las proteínas homologas al aparato de secreción y translocación están codificadas por bacterias patógenas tanto de plantas como de animales. Estos organismos incluyen patógenos humanos tales como Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, E. coli Enteropatogénico, Chlamydia spp., y patógenos de plantas tales como Xanthamonas campestris, Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora y Ralstonia solanacearum. Sin embargo, sólo P. aeruginosa y Yersinia codifican el antígeno V.

Yahr et al. (J. Bacteriology, 1997, p7165-7168) describe la secuencia del operón que codifica el PcrV y compara la secuencia con la proteína LcrV. Por tanto, la secuencia de aminoácidos de PcrV es conocida y está disponible con el número de acceso AF010149 de GenBank.

Anderson et al. (Infection and Immunity, 1996, p4580-4585) señala que el antígeno V recombinante purificado de Yersinia pestis protege a los ratones frente a las plagas neumónica y bubónica causadas por cepas de cápsula F1 positivas y negativas de Yersinia pestis.

El documento US-A-5.599.665 describe una construcción genética que contiene una región codificadora de la actividad de la exoenzima S de P. aeruginosa. Se describe que el producto proteico de la construcción puede usarse para modificar la función de la proteína RAS en carcinomas de mamíferos, usado como vacuna o usado para diagnosticar la infección por P. aeruginosa.

Compendio de la invención

La presente invención se desarrolla a partir de nuestra observación de que el antígeno V de Pseudomonas puede usarse para proteger a los animales de una infección pulmonar letal.

En una realización, la presente invención se dirige al uso del antígeno PcrV en la fabricación de un medicamento o vacuna para usar en la inhibición de la infección por Pseudomonas aeruginosa. En otra realización, la invención se dirige al uso de un ADN que codifica el antígeno PcrV en la fabricación de un medicamento o vacuna génica para usar en la inhibición de la infección por Pseudomonas aeruginosa.

En una realización preferida, el antígeno se expresa como una proteína recombinante y se usa para inmunizar pacientes de riesgo.

Preferiblemente, al paciente se le protege completamente de la infección.

La presente invención proporciona también el uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de PcrV humano o humanizado en la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento o prevención de una infección por Pseudomonas aeruginosa en el que (a) el anticuerpo se administra sistémicamente, e inhibe o previene la infección por Pseudomonas aeruginosa; o (b) el anticuerpo se administra a los pulmones como agente
terapéutico.

Es por tanto un objetivo de la presente invención proporcionar medios para inmunizar activamente y pasivamente a un paciente frente a la infección por Pseudomonas.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes para un experto en la técnica tras la revisión de la memoria descriptiva, reivindicaciones y dibujos.

Descripción de los dibujos

Las Figs. 1A y 1B son un gel teñido (Fig. 1A) y una transferencia Western (Fig. 1B) que ilustran el análisis fenotípico de PA103\DeltapcrV.

Las Figs. 2A y 2B son una gráfica (Fig. 2A) y una serie de gráficos de barras (Fig. 2B) que ilustran la supervivencia y lesión pulmonar de cepas de P. aeruginosa parentales y mutantes.

Las Figs. 3A y 3B son una gráfica (Fig. 3A) y una serie de gráficos de barras (Fig. 3B) que ilustran el efecto de la inmunización en la supervivencia, lesión pulmonar, y colonización bacteriana.

La Fig. 4 es una gráfica del número de animales que sobreviven a una prueba de provocación con 5 x 10^{5} CFU/ratón de la cepa PA103, tras la administración pasiva de IgG policlonal específico para PcrV, ExoU, PopD o IgG control de un animal no inmunizado.

La Fig. 5 es una gráfica (Fig. 5A) y una serie de gráficos de barras (Fig. 5B) que ilustran la supervivencia y protección frente a la lesión pulmonar mediante la administración concomitante de IgG frente a diferentes antígenos bacterianos y la prueba de provocación bacteriana. ANOVA de una vía para la lesión pulmonar, p=0,026, y edema pulmonar, p<0,0005.

Descripción de la invención

En la presente memoria describimos que PcrV tiene un efecto regulador novedoso sobre la expresión de los productos secretados de tipo III, está implicado en la translocación de toxinas de tipo III, y es el primer antígeno que protege frente a la lesión pulmonar inducida por la infección por P. aeruginosa. La vacunación frente a PcrV antes de la instilación por vía aérea de IgG anti-PcrV no sólo aseguró la supervivencia de los animales sometidos a la prueba de provocación, sino que también disminuyó la inflamación y lesión pulmonar causadas por la bacteria.

LcrV, o el antígeno V, es una proteína multifuncional que regula la secreción/translocación de las proteínas efectoras Yop y juega un papel extracelular en la patogénesis alterando la respuesta citoquímica del hospedante frente a la infección por Yersinia (7-11). El único homólogo conocido de este factor patogénico crítico es una proteína extracelular codificada por P. aeruginosa, denominada PcrV.

La presente invención puede usarse para moderar o inhibir una infección por Pseudomonas inmunizando a un paciente con una cantidad eficaz del antígeno PcrV. Por "cantidad eficaz" queremos decir una cantidad de antígeno PcrV eficaz para mostrar alguna moderación o inhibición de la infección por Pseudomonas, comparado con sujetos o animales control que no han sido tratados con el antígeno.

Por "moderar" queremos decir que la infección se inhibe en al menos un cincuenta por ciento, comparada con un animal no inmunizado. Preferiblemente, la infección se previene completamente. Una evaluación cuantitativa de la infección incluiría preferiblemente el examen de la cantidad de bacterias en el torrente sanguíneo o fluidos pleurales y/o un examen de los parámetros de lesión pulmonar. Por ejemplo, la ausencia de bacterias en el torrente sanguíneo o fluidos pleurales indicaría la prevención de la infección. Una reducción en los parámetros de lesión pulmonar indicaría que la infección se ha moderado.

La infección podría evaluarse cuantitativamente mediante otros indicadores clínicos varios, incluyendo la reducción de la carga bacteriana en el esputo, la sangre o fluidos pleurales, reducción en el tamaño del infiltrado, mejora de la oxigenación, reducción en la extensión de tiempo con ventilación mecánica, reducción en la fiebre y reducción en el recuento de glóbulos blancos.

Por "antígeno PcrV" queremos decir esa porción o fragmento de la proteína PcrV que es necesario para producir una respuesta inmune que previene o modera la infección. Actualmente, hemos usado la proteína PcrV completa como antígeno para inducir la protección. Sin embargo, un experto en la técnica puede elaborar un mapa y encontrar el epítope protector en la molécula. Por ejemplo, nosotros produciremos anticuerpos monoclonales y los escrutaremos para seleccionar los anticuerpos que previenen la citotoxicidad en un cultivo de tejidos. Los anticuerpos que previenen la citotoxicidad se ensayarán en el modelo de infección pulmonar aguda con relación a su protección pasiva frente a la infección. Los anticuerpos monoclonales reconocen generalmente una región pequeña de aminoácidos y cuando los aminoácidos son contiguos, el epítope puede quedar definido por tan solo 6-9 aminoácidos. Para definir el epítope, los anticuerpos monoclonales que protegen frente a la infección y citotoxicidad se ensayarán con relación a su unión a formas progresivamente más pequeñas de PcrV recombinante. (Por "PcrV recombinante" o "rPcrV" queremos decir la proteína producida a partir de un gen de PcrV que se ha colocado en un hospedante no nativo). Esto debería localizar la región. En este punto sintetizaremos químicamente tramos de aminoácidos para definir el epítope. Estos epítopes sintetizados químicamente pueden ligarse a moléculas portadoras y usarse para la inmunización para determinar si se consigue la protección. Alternativamente, podemos construir clones diferentes de PcrV, producir y purificar proteínas recombinantes, y ensayar estos antígenos en experimentos de inmunización y provocación.

Basándonos en estudios de elaboración de mapas realizados con PcrV, predecimos que el epítope se encuentra entre los aminoácidos 113 y 245.

El antígeno PcrV puede obtenerse más fácilmente por el método que nosotros usamos, un plásmido de expresión en bacterias comercialmente disponible llamado pET16b de Novagen. El gen pcrV se clonó primero del cromosoma de P. aeruginosa como parte de un operón. La región codificadora se amplificó y se insertó en dos vectores diferentes. Un vector es para la expresión en P. aeruginosa como se muestra en la Fig. 1. Éste es un vector de Herbert Schweizer (referencia 19), que nosotros modificamos para contener una secuencia promotora apropiada tal que la expresión de PcrV esté regulada de manera coordinada con el resto del aparato de suministro e intoxicación de la bacteria. El segundo plásmido, pET16b, es para los propósitos de expresión y purificación en E. coli.

La ventaja de este sistema es que no tenemos que preocuparnos de las proteínas de P. aeruginosa contaminantes, la proteína se produce en gran abundancia, y hay un proceso de purificación en un paso. En esta situación, la región codificadora de PcrV se amplifica para clonarse en el mismo marco de lectura que una cola de histidinas proporcionada en el vector pET16b. Los múltiples restos de histidina fusionados al extremo amino-terminal de PcrV permiten la cromatografía de afinidad usando una columna de níquel-NTA. Por lo tanto, un antígeno PcrV preferido es una versión recombinante de la proteína PcrV natural.

Alternativamente, se administran anticuerpos monoclonales o policlonales humanos o humanizados de PcrV para prevenir o tratar las infecciones por P. aeruginosa. En pacientes con alto riesgo de infección por P. aeruginosa, los anticuerpos podrían administrarse para la prevención de la infección. Además, los anticuerpos pueden administrarse tras el establecimiento de la infección para tratar la infección. En este caso, los anticuerpos pueden administrarse solos o en combinación con antibióticos. La administración de anticuerpos junto con antibióticos puede permitir la administración de series más cortas o dosis más bajas de antibióticos, disminuyendo de ese modo el riesgo de emergencia de organismos resistentes a antibióticos.

Nosotros consideramos al menos tres tipos de pacientes hipotéticos: (1) Un individuo sano con riesgo de lesión o quemadura grave (bombero, personal militar, policía) sería inmunizado con la vacuna por una metodología (bien inyección o intranasal) que proporcionara una protección de larga vida. Se le daría un recuerdo al ser admitido (inyección intramuscular) en el hospital tras la lesión. (2) Un paciente que está siendo sometido a ventilación mecánica. (3) Un paciente al que se le ha diagnosticado genéticamente fibrosis quística.

La inmunización puede hacerse sistémicamente o intranasalmente. La inmunización de estos individuos comenzaría preferiblemente durante los procedimientos de vacunación normales para otras enfermedades infantiles. Predeciríamos una protección de larga vida con dosis de recuerdo probablemente alrededor de las edades de 5 y 10 años.

El ADN que codifica la proteína PcrV o el complementario de este ADN puede usarse también para detectar de manera diagnóstica la infección por P. aeruginosa. Se obtendría la secuencia de ADN del antígeno PcrV en GenBank AF010149. La región codificadora de PcrV está en los nucleótidos 626-1510. Se puede elegir también usar un fragmento de esta región codificadora o el complementario de este fragmento. Una sonda satisfactoria es una que se hibride específicamente con el ADN de PcrV y no con otras regiones.

Se usaría preferiblemente una sonda de hibridación de al menos 40 nucleótidos continuos dentro de la secuencia del antígeno, o dos cebadores de al menos 25 nucleótidos continuos dentro de la secuencia. Un experto en la técnica apreciará que serían adecuadas muchas formas estándar de técnicas diagnósticas con ácidos nucleicos, por ejemplo, la hibridación de la sonda de 40 nucleótidos de cadena simple con el ADN o ARN extraído del esputo de un paciente. En otro ejemplo, el esputo del paciente se usaría como fuente de ADN o ARN bacteriano para servir como molde para la reacción de PCR o RT-PCR, respectivamente.

Se determinaría también la infección por Pseudomonas aeruginosa en un individuo poniendo en contacto una muestra obtenida del individuo con un anticuerpo específico para PcrV y correlacionando la unión intensificada del anticuerpo, comparada con una muestra control, con la infección por Pseudomonas aeruginosa en el individuo.

Alternativamente, el ADN que codifica el PcrV puede usarse como vacuna génica usando métodos de biología molecular estándar. Por ejemplo, podrían revisarse las siguientes referencias con relación a las técnicas conocidas por los expertos en la técnica: Davis, H.L. et al., "DNA vaccine for hepatitis B: Evidence for immunogenicity in chimpanzees and comparison with other vaccines", Proc. Natl. Acad. Sci. 93:7213-7218, 1996; Barry, M.A. et al., "Protection against mycoplasma infection using expression-library immunization", Nature 377:632-635, 1995; Xiang, Z.Q. et al., "Immune responses to nucleic acid vaccines to rabies virus", Virology 209:569-579, 1995. Por "cantidad eficaz" de una vacuna génica queremos decir una cantidad de vacuna eficaz para moderar o eliminar la infección por Pseudomonas o los síntomas de infección por Pseudomonas.

La proteína o antígeno podría usarse también de manera diagnóstica para detectar anticuerpos en pacientes y, por tanto, predecir el estado de infección del paciente. Se pondría en contacto preferiblemente una muestra obtenida de un individuo sospechoso de tener infección por Pseudomonas con la proteína PcrV o fragmento de la misma y se detectaría la unión proteína/anticuerpo. Se correlacionaría entonces la unión intensificada del anticuerpo (comparada con una muestra control) con la infección por Pseudomonas aeruginosa en el individuo.

Podría usarse también el anticuerpo de PcrV o fragmentos del anticuerpo de manera terapéutica. Una vez que el anticuerpo es seguro para usar en humanos, se podría: (a) administrarlo sistémicamente y (b) administrarlo a los pulmones bien como tratamiento preventivo o como terapia. Para usar el anticuerpo de PcrV en humanos, el anticuerpo preferiblemente se "humaniza". En general, una vez que se obtiene el anticuerpo monoclonal, las regiones variables de la cadena pesada y ligera se clonan. Estos fragmentos clonados se insertan seguidamente en la cadena principal de un anticuerpo humano (regiones constantes). Por tanto, podemos controlar la clase de anticuerpo (IgG, IgA, etc.), además de proporcionar la especificidad de unión.

Para usar en la presente invención, el anticuerpo de PcrV puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. Los anticuerpos pueden ser humanos o humanizados, particularmente para aplicaciones terapéuticas. Pueden usarse también fragmentos de anticuerpo o derivados, tales como un Fab, F(ab')_{2} ó Fv. Los anticuerpos de cadena simple, por ejemplo como se describe en Huston et al. (Int. Rev. Immunol. 10:195-217, 1993) pueden también encontrar uso en los métodos descritos en la presente memoria. Por "cantidad eficaz" del anticuerpo de PcrV o fragmento de anticuerpo queremos decir una cantidad suficiente para moderar o eliminar la infección por Pseudomonas o los síntomas de la infección.

Además de los anticuerpos de PcrV y fragmentos de anticuerpo, pueden diseñarse pequeñas moléculas peptidomiméticas o miméticos no peptídicos para mimetizar la acción de los anticuerpos de PcrV en la inhibición o modulación de la infección por Pseudomonas, presumiblemente interfiriendo con la acción de PcrV. Los métodos para diseñar tales moléculas miméticas pequeñas son bien conocidos (véanse, por ejemplo, Ripka y Rich, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:441-452, 1998; Huang et al., Biopolymers 43:367-382, 1997; al-Obeidi et al., Mol. Biotechnol. 9:205-223, 1998). Las pequeñas moléculas inhibidoras que se diseñan basándose en el anticuerpo de PcrV pueden escrutarse con relación a su capacidad para interferir con la interacción de la unión PcrV-anticuerpo de PcrV. Las pequeñas moléculas candidatas que muestran actividad en tal ensayo pueden optimizarse por métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo por ejemplo, ensayos de escrutinio in vitro, y ensayos in vivo adicionalmente refinados para la inhibición o modulación de la infección por Pseudomonas por cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria o como los bien conocidos en la técnica. Tales pequeñas moléculas inhibidoras de la acción de PcrV deberían ser útiles para inhibir o modular una infección por Pseudomonas.

La proteína PcrV puede usarse para identificar un receptor de PcrV que puede estar presente en las células hospedantes, particularmente en células humanas, más particularmente en células epiteliales humanas o macrófagos. La identificación de un receptor de PcrV permite el escrutinio de "bibliotecas" de moléculas pequeñas, por ejemplo "bibliotecas" combinatorias, para seleccionar candidatos que interfieran con la unión de PcrV. Tales moléculas pueden ser útiles también en un método para inhibir o modular una infección por Pseudomonas.

Nuestros primeros intentos en la identificación de receptores serán usar PcrV en experimentos de "pull-down". El PcrV se fusionará con glutatión-S-transferasa (GST) y se fijará a la matriz de una columna para la cromatografía de afinidad de extractos celulares solubilizados. Las proteínas que se unan específicamente al PcrV se eluirán y someterán a secuenciación amino-terminal para su identificación. En experimentos paralelos, el PcrV se someterá al análisis de doble híbrido en levaduras. En este caso, el PcrV se fusiona en el mismo marco de lectura con el dominio de unión a ADN de Ga14. Una vez que se obtiene el clon, se usará para transformar una cepa de levaduras hospedante adecuada. La cepa de levaduras que contiene la construcción Ga14PcrV se transformará con un banco de cADN de células Hela clonado en el mismo marco de lectura con el dominio de activación de Ga14. Los dobles transformantes que complementen la capacidad par utilizar histidina y producir beta-galactosidasa (proteínas que interaccionan con PcrV) se analizarán genéticamente y a nivel de secuencia de nucleótidos. En caso de que el receptor sea un glicolípido celular, utilizaremos una técnica de recubrimiento en la que los glicolípidos se separan por cromatografía de capa fina y seguidamente se tratan con bacterias radiomarcadas como sonda. La unión a componentes específicos se monitorizará por autorradiografía. Similarmente, las proteínas epiteliales y de macrófagos se separarán por SDS-PAGE, se transferirán a nitrocelulosa y se recubrirán con bacterias radiomarcadas o PcrV marcado. De nuevo, los componentes proteicos a los que se unen las bacterias se identifican seguidamente por autorradiografía.

Se sabe que las especies de Pseudomonas infectan un amplio espectro de hospedantes en el reino animal e incluso en el reino vegetal. Como será evidente para alguien con experiencia normal en la técnica, las composiciones y métodos descritos en la presente memoria pueden tener uso a través de una amplia variedad de organismos en la inhibición y modulación de enfermedades o afecciones que resulten de la infección por una especie de Pseudomonas. Las composiciones y métodos de la presente invención se describen en la presente memoria particularmente para su aplicación a Pseudomonas aeruginosa, pero está claramente dentro de la competencia de alguien con experiencia normal en la técnica aplicar los métodos enseñados en la presente a otras especies.

Ejemplos 1. Papel de PcrV en la Citotoxicidad

Para determinar el papel de PcrV en la regulación/secreción mediada de tipo III, construimos un alelo apolar de PcrV y usamos la construcción para reemplazar el alelo salvaje en la cepa de P. aeruginosa PA103, una cepa que es muy citotóxica in vitro (3) y causa daño del epitelio pulmonar in vivo (12, 13). La citotoxicidad y lesión pulmonar se deben a la producción de una citotoxina específica, ExoU (3).

PA103\DeltapcrV se caracterizó por la expresión de varios productos extracelulares que son secretados por el sistema de tipo III de P. aeruginosa, que incluyen la citotoxina ExoU (3), PcrV (5), y una proteína requerida para la translocación de toxinas, PopD (14). La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de sobrenadantes concentrados de los cultivos indicó que la cepa parental, PA103, se induce para la producción y secreción de las proteínas de tipo III por crecimiento en un medio que contiene un agente quelante de calcio, el ácido nitrilotriacético (NTA, del inglés "nitrilotriacetic acid") (Fig. 1). Cuando un clon de expresión que codificaba el PcrV se proporcionó en posición trans en la cepa parental, la producción de proteínas extracelulares en respuesta a la presencia o ausencia de NTA es normal. PA103\DeltapcrV muestra un fenotipo ciego para el calcio: la producción de proteínas extracelulares está fuertemente inducida tanto en presencia como en ausencia de NTA. Estos resultados sugieren que el sistema de secreción es totalmente funcional, pero está desregulado. Este fenotipo desregulado está en contraste con el fenotipo independiente de calcio publicado para una cepa deficiente en LcrV que no puede producir proteínas Yop extracelulares, crece a 37ºC a pesar de la presencia o ausencia de calcio, y muestra sólo una inducción parcial de las proteínas Yop (7). La complementación de PA103\DeltapcrV con un clon que expresa el PcrV salvaje restauró la regulación normal de la producción de proteínas extracelulares en respuesta a la inducción con NTA.

Para ensayar la contribución de PcrV a la patogénesis de P. aeruginosa, se usaron dos modelos de infección. En un modelo in vitro, la cepa parental y varias cepas derivadas mutantes se compararon con relación a su capacidad para causar citotoxicidad en un ensayo de infección de células CHO (3). Los controles negativos en este experimento incluían PA103popD: :\Omega, que se ha demostrado previamente que es defectuosa en la translocación de los determinantes de virulencia de tipo III (14) y PA103\DeltaexoU, que es no citotóxica debido a la ausencia de producción de ExoU (3, 15).

Tras una infección de 3 horas, las células CHO fueron incapaces de excluir azul tripano con la cepa salvaje y la cepa \DeltapcrV complementada con una construcción plasmídica que expresaba PcrV. La tinción no tuvo lugar cuando las células CHO se infectaron con las cepas del control negativo o con PA103\DeltapcrV (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la expresión de PcrV se requiere para la citotoxicidad. El PcrV recombinante purificado fue no citotóxico cuando se añadió de manera exógena a las células del cultivo de tejidos. Puesto que la secreción de las proteínas de tipo III requeridas para la translocación no resultaron afectadas por la supresión de PcrV (Figs. 1A y 1B), PA103\DeltapcrV resulta ser defectuosa en la translocación de ExoU.

Las Figs. 1A y 1B son un gel teñido (Fig. 1A) y una transferencia Western (Fig. 1B) que ilustran el análisis fenotípico de PA103\DeltapcrV. La cepa parental y derivados \DeltapcrV, con o sin un plásmido que expresa PcrV en trans, se pusieron a crecer en ausencia o presencia del inductor de la secreción de tipo III en P. aeruginosa, ácido nitrilotriacético (NTA). El perfil de proteínas extracelulares (Fig. 1A) se analizó en un gel de poliacrilamida (10%) con SDS teñido con azul de Coomassie. La migración de las proteínas de tipo III codificadas por P. aeruginosa se indica a la izquierda y la migración de los marcadores de peso molecular se indica a la derecha. La Fig. 1B es una transferencia Western de un gel duplicado usando anticuerpos específicos para ExoU, PcrV, y PopD y ^{125}I-Proteína A para detectar IgG unida.

Las cepas de P. aeruginosa salvaje y mutantes se ensayaron en un modelo de infección pulmonar aguda usando dosis de provocación bajas y altas de bacterias. Las medidas de supervivencia indicaron que PcrV y PopD se requerían para inducir una infección letal (Fig. 2A). En los experimentos que utilizaban tres medidas independientes de lesión pulmonar (el flujo de albúmina marcada desde los espacios aéreos del pulmón al torrente sanguíneo, el flujo de albúmina marcada desde los espacios aéreos del pulmón a los fluidos pleurales, y la proporción húmedo/seco, que mide el edema pulmonar), el grado de lesión causado por PA103\DeltapcrV, la cepa control del vector (PA103\DeltapcrVpUCP18), y PA103popD: :\Omega, no fue diferente que en los animales control no infectados (Fig. 2B). La complementación de PA103\DeltapcrV con pcrV en trans restauró los niveles de lesión pulmonar a los medidos con la cepa parental, PA103. Considerados juntos, estos datos indican que se requiere la expresión de PcrV para la virulencia de P. aeruginosa en el modelo de infección pulmonar aguda, y que parte de la función de PcrV resulta estar ligada a la capacidad de translocar las proteínas efectoras de tipo III hacia dentro de las células eucariotas.

Las Figs. 2A y 2B son una gráfica (Fig. 2A) y una serie de gráficos de barras (Fig. 2B) que ilustran la supervivencia y lesión pulmonar de cepas de P. aeruginosa parentales y mutantes. Con referencia a la Fig. 2A, los ratones se sometieron a una prueba de provocación con 5 x 10^{5} CFU de cada una de las cepas indicadas, y se monitorizó la supervivencia durante una semana. Con referencia a la Fig. 2B, la lesión pulmonar se evaluó mediante el flujo de albúmina marcada desde los espacios aéreos del pulmón a la sangre (lesión del epitelio pulmonar), al fluido pleural (fluido pleural) o midiendo la proporción húmedo/seco (edema pulmonar). Se usaron dos dosis de bacterias infecciosas, como se indica con las barras rellena y rayada. Las diferencias significativas (*p<0,001) entre los grupos control y de ensayo se determinaron mediante los tests de ANOVA de una vía y de comparación múltiple de Dunnet. Se usaron las siguientes abreviaturas: PA103, cepa salvaje parental; \DeltapcrV, PA103\DeltapcrV; \DeltapcrVpUCPpcrV, PA103\DeltapcrV complementado con un plásmido que expresa PcrV; \DeltapcrVpUCP, PA103\DeltapcrV con un control del vector; popD: :\Omega, PA103popD: :\Omega, una cepa deficiente en la translocación.

2. Inmunización con PcrV

Para determinar si la inmunización con PcrV protegía a los animales de una infección pulmonar letal, se purificaron PcrV (rPcrV) o ExoU (rExoU) recombinantes como proteínas de fusión con una cola de histidinas, y se usaron como antígenos. Los ratones se inmunizaron y subsiguientemente se sometieron a la prueba de provocación a través de sus espacios aéreos con una dosis letal de la cepa PA103. Cuando se midió la supervivencia, ambas vacunas protegían a los ratones (Fig. 3A). Cuando se evaluó el daño pulmonar, sólo los animales vacunados con PcrV tenían un daño epitelial y edema pulmonar significativamente inferior (Fig. 3B). Los animales inmunizados con la vacuna de PcrV tenían también significativamente menos bacterias en sus pulmones, sugiriendo que un bloqueo del antígeno V de Pseudomonas puede facilitar una rápida desaparición de las bacterias de los pulmones, protegiendo a los animales de una lesión epitelial grave (Fig. 3B).

Las Figs. 3A y 3B son una gráfica (Fig. 3A) y una serie de gráficos de barras (Fig. 3B) que ilustran el efecto de la inmunización en la supervivencia, lesión pulmonar, y colonización bacteriana. Con referencia a la Fig. 3A, los ratones se inmunizaron (PcrV, n=10; ExoU, n=5, control, n=10) como se ha indicado y se sometieron a la prueba de provocación con la cepa PA103 a 5 x 10^{5} CFU/animal. El porcentaje de animales supervivientes se determinó durante una semana; p<0,05 por el test de rango logarítmico de Mantel-Cox. Con referencia a la Fig. 3B, la evaluación de la lesión pulmonar y la colonización bacteriana de los animales vacunados 4 horas antes de la instilación de PA103. Lesión del epitelio pulmonar, edema pulmonar, y carga bacteriana; PcrV, n=9, ExoU, n=4; y control, n=8. El número final de bacterias en el pulmón se indica como el número en el eje Y x 10^{4} CFU. Las diferencias significativas (*) para la lesión pulmonar (p<0,01), edema pulmonar (p<0,05), y número de bacterias (p<0,05), como se determinó por el test de comparación múltiple de Dunnet. ANOVA de una vía para la lesión pulmonar, p=0,0005; edema pulmonar, p=0,0437; carga bacteriana, p=0,0075.

Para determinar si era posible una intervención terapéutica, los ratones se inmunizaron pasivamente con IgG de conejo preinmune o con IgG de conejo específica para rPcrV, rExoU, ó rPopD una hora antes de la instilación por vía aérea de PA103 a una concentración de 5 x 10^{5} CFU/ratón. Los anticuerpos de rPcrV proporcionaron una protección completa frente a una infección letal (Fig. 4). La IgG anti-rExoU proporcionó una supervivencia parcial, que fue significativamente diferente de la administración de la IgG control, aunque los animales supervivientes resultaron gravemente enfermos durante la prueba. La supervivencia no mejoró por la transferencia pasiva de anticuerpos de otra de las proteínas de translocación de tipo III, PopD. De estos resultados concluimos que los anticuerpos de PcrV son muy protectores en el modelo de infección pulmonar aguda y que PcrV puede estar expuesto en la superficie bacteriana o en una forma soluble que lo hace disponible para las interacciones anticuerpo-antígeno.

La Fig. 4 es una gráfica del número de animales que sobreviven a una prueba de provocación con 5 x 10^{5} CFU/ratón de la cepa PA103. Los animales se pretrataron con 100 \mug de IgG inmune o IgG control de un conejo no inmunizado (rPcrV, suero preinmune). N=10 para cada grupo; *p<0,05 frente al grupo control para el tratamiento con preparaciones de IgG anti-PcrV y anti-ExoU, por el test de rango logarítmico de Mantel-Cox.

Si el PcrV está accesible para su neutralización, entonces la administración concomitante del inóculo bacteriano con IgG anti-rPcrV debería proteger completamente frente a la lesión pulmonar y mortalidad. Las preparaciones de IgG se mezclaron con el inóculo (una dosis 10 veces mayor que el inóculo letal) antes de la instilación de las bacterias en el pulmón, y se midió la supervivencia. Sólo la IgG anti-rPcrV fue protectora frente a esta infección extrema (Fig. 5A). La lesión pulmonar se midió en animales infectados con la dosis letal normal de 5 x 10^{5} bacterias. El flujo de albúmina marcada de los espacios aéreos del pulmón fue sólo un 3% más que en los controles no infectados (Fig. 5B) tras la coadministración de IgG anti-rPcrV. La disminución en el flujo de proteína marcada desde el pulmón a los fluidos pleurales fue el mismo que en los controles no infectados cuando se incluyó anti-rPcrV con el inóculo. Curiosamente, el edema pulmonar, medido por la proporción húmedo/seco, se redujo significativamente por la adición bien de anti-rPcrV o anti-rPopD (Fig. 5B). Por tanto, la administración concomitante de IgG anti-rPcrV con las bacterias fue incluso más eficaz en la normalización de todos los parámetros de lesión pulmonar que la vacunación. Estos datos respaldan la accesibilidad de PcrV para la neutralización mediada por anticuerpo y documentan una disminución clínicamente relevante en la lesión pulmonar; los anticuerpos de PcrV pueden servir como reactivos terapéuticos en el tratamiento de neumonía nosocomial grave causada por Pseudomonas aeruginosa.

La Fig. 5 es una gráfica (Fig. 5A) y una serie de gráficos de barras (Fig. 5B) que ilustran la supervivencia y protección frente a la lesión pulmonar mediante la administración concomitante de IgG y la prueba de provocación bacteriana. IgG (5 \mug) se mezcló bien con 5 x 10^{6} (para los ensayos de supervivencia, n=10 por grupo), o con 5 x 10^{5} (para la medida de la lesión pulmonar, n=4 a 6 animales por grupo) de la cepa PA103 de P. aeruginosa. Esta mezcla se instiló en los pulmones y se evaluó la supervivencia (Fig. 5A) o la lesión pulmonar (Fig. 5B). Para la supervivencia, *p<0,05 frente a la IgG control para anti-PcrV, por el test de rango logarítmico de Mantel-Cox; para la lesión del epitelio pulmonar y edema pulmonar *p<0,05 frente a la IgG control, por el test de comparación múltiple de Dunnet. ANOVA de una vía para la lesión pulmonar, p=0,026, y edema pulmonar, p<0,0005.

En las infecciones agudas por P. aeruginosa, el efecto neto de la intoxicación mediada de tipo III puede ser propiciar la diseminación de la bacteria por el epitelio, conduciendo a la infección de los fluidos pleurales, bazo, hígado, y torrente sanguíneo. Las infecciones sanguíneas por P. aeruginosa, bien por neumonía aguda asociada con la ventilación o por infecciones de quemaduras, pueden resultar en una tasa de mortalidad del 40-80%, a pesar de un tratamiento agresivo con antibióticos (16). PcrV debe ser un componente del complejo de translocación de tipo III en P. aeruginosa, puesto que los mutantes deficientes en la producción de esta proteína son incapaces de intoxicar células CHO o causar lesión del epitelio pulmonar, a pesar de que son capaces de producir y secretar los efectores y proteínas de tipo III requeridos para la translocación. Al contrario que PopD, que también es necesario para la translocación, PcrV está accesible para la neutralización mediada por anticuerpo, sugiriendo que los anticuerpos pueden ser agentes terapéuticos útiles en las infecciones agudas.

3. Métodos para los Ejemplos 1 y 2

Construcción de una inserción apolar en pcrV y complementación. Un fragmento de restricción EcoRI-NsiI de 5,0 kb que codifica pcrGVHpopBD y las secuencias flanqueantes se clonó en el vector de reemplazamiento alélico pNOT19 (17). Se eliminaron dos sitios NotI (uno dentro de pcrG y uno dentro de popB) de las secuencias insertadas usando el sistema de mutagénesis Sculptor (Amersham). Se suprimió un fragmento de restricción SstI interno de pcrV, dando como resultado una supresión dentro del marco de lectura de los restos 17-221 (pNOT\DeltapcrV). Para seleccionar con relación a la integración del plásmido, se clonó un gen que codifica la resistencia a tetraciclina (Tc\Omega) en el sitio HindIII del vector (pNOT\Omega\DeltapcrV). Se añadió el casete MOB (17) como un fragmento NotI. La selección de merodiploides, la resolución de secuencias plasmídicas, y la confirmación del reemplazamiento alélico se realizó como se ha descrito previamente (18). Se usó un plásmido lanzadera (pUCP, 19) para construir un clon para complementar la supresión en pcrV. La secuencia codificadora de PcrV se amplificó y clonó bajo el control de la región promotora de ExoS (20). La trascripción de ExoS está regulada de manera coordinada con los operones que controlan la secreción y translocación de tipo III en P. aeruginosa. La secuencia de nucleótidos se confirmó para cada construcción de ADN que implicaba mutagénesis dirigida, amplificación por PCR, o supresión dentro del marco de
lectura.

SDS-PAGE y análisis por transferencia Western de productos de secreción. Se puso a crecer P. aeruginosa en condiciones inductoras (+NTA) o no inductoras (-NTA) para la expresión de los productos de secreción de tipo III (18). Los cultivos se recogieron basándose en medidas de densidad óptica a 540 nm y las fracciones sobrenadantes se concentraron por adición de una solución saturada de sulfato de amonio hasta una concentración final del 55%. Se cargó cada carril de un gel de poliacrilamida (11%) con SDS con 3 \mul de sobrenadante concentrado 20 veces y se tiñó con azul de Coomassie. Un gel idéntico se sometió al análisis por transferencia Western como se ha descrito previamente (3-5) usando un cóctel de antisueros de conejo, que reconocen específicamente ExoU, PopD, y PcrV. Se usó la Proteína A marcada con ^{125}I como reactivo secundario para identificar la IgG unida.

Modelos de infección y evaluaciones de la lesión pulmonar. Se usaron células de Ovario de Hámster Chino (CHO, del inglés "Chinese Hamster Ovary") en un modelo de infección in vitro diseñado para medir la citotoxicidad y la translocación de tipo III (21). Brevemente, se preparó un inóculo bacteriano en medio de cultivo de tejidos sin suero. Las células CHO, que se propagaron en medio que contenía suero, se lavaron e infectaron con varias cepas de P. aeruginosa, a una multiplicidad de infección de 5:1. Los cultivos se incubaron en condiciones de cultivo de tejidos durante 3 horas (37ºC, CO_{2} al 5%), se lavaron, y se tiñeron con azul tripano. La permeabilidad al colorante se determinó a partir de fotografías de contraste de fases. La infección con la cepa parental PA103, que expresa ExoU, da como resultado una tinción con azul tripano de aproximadamente el 80% de la monocapa después de 3 horas de incubación, y una destrucción completa de la monocapa a las 4-5 horas de incubación. Las infecciones de los ratones y la evaluación de la lesión pulmonar se realizaron como se ha descrito previamente (16). Brevemente, Se adquirieron ratones BALB/c libres de patógenos de 8 a 12 semanas de edad de Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) y se mantuvieron en condiciones de barrera. Los ratones se anestesiaron brevemente con Metofan inhalado (metoxifluorano, Pitman-Moore, Mundelein, IL) y se colocaron en decúbito supino, con un ángulo de aproximadamente 30º. Se instilaron 50 \mul del inóculo bacteriano lentamente en el lóbulo izquierdo usando una aguja de alimentación de animales del calibre 24 (Popper & Sons, Inc., New Hyde Park, NY) insertada en la tráquea a través de la orofaringe. Cuando se midieron las evaluaciones de la lesión pulmonar, se añadieron al instilado 0,5 \muCi de albúmina de suero humano marcada con ^{131}I (Merck-Frosst, Quebec, Canadá), 0,05 \mug de azul de Evans anhidro en ml de lactato de Ringer con albúmina de ratón al 5%. Tras 4 horas de infección, los ratones se anestesiaron, se recogió la sangre mediante una punción en la arteria carótida y se realizaron las esternotomías medias. Se recogieron los pulmones, fluidos pleurales, tráqueas, orofaringes, estómagos e hígados, y se midió la radiactividad. El porcentaje de albúmina radiactiva que dejaba los pulmones instilados y entraba en la circulación o el fluido pleural se calculó multiplicando las cuentas medidas en las muestras de sangre terminales (por ml) por el volumen de sangre (peso corporal x 0,07). Las proporciones húmedo/seco de los pulmones se determinaron añadiendo 1 ml de agua a los pulmones y homogeneizado la mezcla. Los homogeneizados se colocaron en bandejas de aluminio taradas y se secaron hasta un peso constante en un horno a 80ºC durante 3 días. Los homogeneizados de pulmón se diluyeron también secuencialmente y se dispusieron en placas de sangre de oveja en agar para la evaluación cuantitativa de las bacterias.

Producción de antisuero de conejo frente a PcrV, PopD, y ExoU. rPcrV, rPopD, y rExoU se produjeron como proteínas de fusión con una cola de histidinas en pET16b y se purificaron por cromatografía en níquel como se ha descrito previamente (22). Se inyectó por vía intradérmica (10 sitios) a los conejos 300 \mug de proteína recombinante emulsionada en coadyuvante completo de Freund, se les dio un recuerdo con antígeno en coadyuvante incompleto de Freund, y se sangraron periódicamente a intervalos de 7 días. Para la inmunización pasiva, la fracción de IgG se aisló usando cromatografía en columna con Proteína A (Pierce Chemicals, Rockford, IL). Se inyectó a los ratones 100 \mug de IgG (inyección intraperitoneal) 1 hora antes de la prueba de provocación con 5 x 10^{5} CFU de la cepa PA103. Para la inmunización activa con rPcrV y rExoU, se eliminó la endotoxina de las preparaciones de proteína por extracción con Triton X-114 al 1% (23). Después de las extracciones, se eliminó el Triton X-114 por cromatografía en Sephacryl S-200. Todas las preparaciones de vacunas contenían menos de 1 ng de endotoxina por 40 \mug de proteína recombinante, como se determinó usando un ensayo de productos de lisis de amebocitos de Limulus (BioWhittaker, Walkersville, MD). Se inyectó por vía subcutánea a los ratones BALB/c 10 \mug de proteínas recombinantes en coadyuvante completo de Freund. En el día 30, se dio un recuerdo a los ratones con 10 \mug adicionales de antígeno en coadyuvante incompleto de Freund. En el día 51, los ratones se sometieron a la prueba de provocación por instilación de P. aeruginosa en sus pulmones izquierdos.

4. Síntesis de Anticuerpos Monoclonales

Los ratones se inmunizaron con 10 \mug de PcrV recombinante purificado, libre de LPS, en coadyuvante completo de Freund y se les dio un recuerdo dos semanas después con la misma dosis de antígeno emulsionado en coadyuvante incompleto de Freund. Las inmunizaciones se realizaron por vía subcutánea. Se recogieron los bazos de los ratones una semana después de las dosis de recuerdo de PcrV en coadyuvante incompleto de Freund.

Se colocó un único bazo en 5 ml de medio de cultivo de tejidos sin suero, se cortó en trozos y se homogeneizó suavemente. Los trozos grandes de tejido se dejaron depositar en el homogeneizado y el sobrenadante, la suspensión de células únicas se separó y se sometió a centrifugación a 1200 rpm durante 10 minutos. Las células sedimentadas se resuspendieron en 10 ml de una solución para lisar los glóbulos rojos durante 5 minutos y subsiguientemente se colocaron debajo 10 ml de suero bovino fetal. El material se centrifugó a 1200 rpm durante 8 minutos, el sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron en 30 ml de medio.

Las células de bazo y células de mieloma (P3x63Ag8,653) se recogieron por centrifugación a 1200 rpm durante 10 minutos, y cada sedimento se resuspendió por separado en 10 ml de medio de cultivo de tejidos. 10^{8} células de bazo y 2 x 10^{7} células de mieloma se mezclaron y sedimentaron juntas por centrifugación a 1200 rpm durante 6 minutos. El sobrenadante se separó por aspiración y se añadió 1 ml de polietilenglicol (PEG) al 35%. Las células se resuspendieron en esta solución suavemente y se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos. En algunos experimentos se eliminó la centrifugación.

Exactamente 8 minutos después de la adición del PEG, se añadieron 25 ml de medio y las células se resuspendieron suavemente. Después de un paso de centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos, el sedimento de células se resuspendió a una densidad de 1 x 10^{6} por ml en medio condicionado al 30% y medio completo al 70% (con suero). Las células se incubaron durante una noche a 37ºC. Al día siguiente las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 200 ml de medio condicionado al 30% y medio completo al 70% con hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT).

Se añadieron aproximadamente 0,2 ml de esta suspensión de células por pocillo a diez placas de 96 pocillos (12 ml por placa de 96 pocillos). La densidad de las células remanentes se ajustó a 2,5 x 10^{5} por ml y las células se dispusieron en las placas con el formato de 96 pocillos. Las placas se escrutaron microscópicamente para seleccionar colonias únicas y los sobrenadantes se ensayaron subsiguientemente con relación a la producción de anticuerpos mediante un ensayo de inmunosorbente unido a enzima usando PcrV recombinante como el antígeno. Los clones que producían anticuerpos que reaccionaban con PcrV se pasaron a placas de cultivo más grandes y seguidamente se determinó su isotipo.

La unión de los anticuerpos se ensayó en un ensayo de inmunosorbente unido a enzima usando PcrV recombinante como el antígeno (proteína con cola de histidinas) revistiendo los pocillos. Los anticuerpos monoclonales se ensayaron también en reacciones de transferencia Western usando un sobrenadante de P. aeruginosa que contenía PcrV nativo sin la cola de histidinas.

4. Referencias

1. Wiener-Kronish, J.P., Sawa, T., Kurahashi, K., Ohara, M. y Gropper, M.A., "Pulmonary edema associated with bacterial pneumonia", Pulmonary Edema (eds. Matthay, M.A. e Ingbar, D.H.) pp. 247-267 (Marcel Dekkerp, Inc., New York, 1998).

2. Frank, D.W., "The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa", Mol. Microbiol. 26:621-629 (1997).

3. Finck-Barbançon, V. et al., "ExoU expresión by Pseudomonas aeruginosa correlates with acute cytotoxicity and epithelial injury", Mol. Microbiol. 25:547-557 (1997).

4. Yahr, T.L., Goranson, J. y Frank, D.W., "Exoenzyme S of Pseudomonas aeruginosa is secreted by a type III pathway", Mol. Microbiol. 22:991-1003 (1996).

5. Yahr, T.L., Mende-Mueller, L.M., Friese, M.B. y Frank, D.W., "Identification of type III secreted products of the Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S regulon", J. Bacteriol. 179:7165-7168 (1997).

6. Hueck, C.J., "Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants", Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:379-433 (1998).

7. Skrzypek, E. y Straley, S.C., "Differential effects of deletion in lcrV on secretion of V antigen, regulation of the low-Ca^{2+} response, and virulence of Yersinia pestis", J. Bacteriol. 177:2530-2542 (1995).

8. Nakajima, R. y Brubaker, R.R., "Association between virulence of Yersinia pestis and suppression of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha", Infect. Immun. 61:23-31 (1993).

9. Nakajima, R., Motin, V.L. y Brubaker, R.R., "Suppression of cytokines in mice by protein A-V antigen fusion peptide and restoration of synthesis by active immunization", Infect. Immun. 63:3021-3029 (1995).

10. Nedialkov, Y.A., Motin, V.L. y Brubaker, R.R., "Resistance to lipopolysaccharide mediated by the Yersinia pestis V antigen-polyhistidine fusion peptide: amplification of interleukin-10", Infect. Immun. 63:1196-1203 (1997).

11. Nilles, M.L., Fields, K.A. y Straley, S.C., "The V antigen of Yersinia pestis regulates Yop vectorial targeting as well as Yop secretion through effects on YopB and LcrG", J. Bacteriol. 180:3410-3420 (1998).

12. Kudoh, I., Wiener-Kronish, J.P., Hashimoto, S., Pittet, J.-F. y Frank, D.W., "Exoproduct secretions of Pseudomonas aeruginosa strains influence severity of alveolar epithelial injury", Am. J. Physiol. 267:L551-L556 (1994).

13. Apodaca, G. et al., "Characterization of Pseudomonas aeruginosa-induced MDCK cell injury: glycosylation-defective host cells are resistant to bacterial killing", Infect. Immun. 63:1541-1551 (1995).

14. Yahr, T.L., Vallis, A.J., Hancock, M.K., Barbieri, J.T. y Frank, D.W., "ExoY, a novel adenylate cyclase secreted by the Pseudomonas aeruginosa type III system", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, in press (1998).

15. Finck-Barbançon, V., Yahr, T.L. y Frank, D.W., "Identification and characterization of SpcU, a chaperone required for efficient secretion of the ExoU cytotoxin", J. Bacteriol., in press (1998).

16. Sawa, T., Corry, D.B., Gropper, M.A., Ohara, M., Kurahashi, K. y Wiener-Kronish, J.P., "IL-10 improves lung injury and survival in Pseudomonas aeruginosa pneumonia", J. Immunol. 159:2858-2866 (1997).

17. Schweizer, H.P., "Allelic exchange in Pseudomonas aeruginosa using novel Co1E1-type vectors and a family of cassettes containing a portable oriT and the counter-selectable Bacillus subtilis sacB marker", Mol. Microbiol. 6:1195-1204 (1992).

18. Frank, D.W., Nair, G. y Schweizer, H.P., "Construction and characterization of chromosomal insertional mutations of the Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S trans-regulatory locus", Infect. Immun. 62:554-563 (1994).

19. Schweizer, H.P., "Escherichia-Pseudomonas shuttle vectors derived from pUC18/19", Gene 97:109-112 (1991).

20. Yahr, T.L., Hovey, A.K., Kulich, S.M. y Frank, D.W., "Transcriptional analysis of the Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S structural gene", J. Bacteriol. 177:1169-1178 (1995).

21. Vallis, A.J., Yahr, T.L., Barbieri, J.T. y Frank, D.W., "Regulation of ExoS production by Pseudomonas aeruginosa in response to tissue culture conditions", Infect. Immun. Submitted.

22. Yahr, T.L., Barbieri, J.T. y Frank, D.W., "Genetic relationship between the 53- and 49-kilodalton forms of exoenzyme S from Pseudomonas aeruginosa", J. Bacteriol. 178:1412-1419 (1996).

23. Aidi, Y. y Pabst, M.J., "Removal of endotoxin from protein solutions by phase separation using Triton X-114", J. Immunol. Methods 132:191-195 (1990).

Claims (9)

1. El uso del antígeno PcrV en la fabricación de un medicamento o vacuna para usar en la inhibición de la infección por Pseudomonas aeruginosa.

2. El uso según la reivindicación 1 en el que el antígeno PcrV es la proteína PcrV recombinante.

3. El uso según la reivindicación 1 en el que el antígeno PcrV es un fragmento de la proteína PcrV, siendo dicho fragmento capaz de inducir una respuesta inmune específica frente al antígeno V.

4. El uso de un ADN que codifica el antígeno PcrV en la fabricación de un medicamento o vacuna génica para usar en la inhibición de la infección por Pseudomonas aeruginosa.

5. El uso según la reivindicación 4 en el que el ADN codifica la proteína PcrV entera.

6. El uso según la reivindicación 4 en el que el ADN codifica un fragmento de la proteína PcrV, en el que el fragmento es capaz de inducir una respuesta inmune específica frente al antígeno V.

7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la inhibición tiene lugar en un paciente humano.

8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 para el tratamiento de una infección por Pseudomonas aeruginosa en un paciente infectado por Pseudomonas aeruginosa.

9. El uso de un anticuerpo de PcrV humanizado o humano o un fragmento de anticuerpo del mismo en la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento o prevención de una infección por Pseudomonas aeruginosa en el que

(a) el anticuerpo se administra sistémicamente, e inhibe o previene la infección por Pseudomonas aeruginosa; o

(b) el anticuerpo se administra a los pulmones como un agente terapéutico.