ES2255482T3 - Procedimientos para el analisis de la activacion funcional de leucocitos, plaquetas y otras celulas. - Google Patents
Procedimientos para el analisis de la activacion funcional de leucocitos, plaquetas y otras celulas.Info
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Abstract
Procedimiento in vitro para el estudio de la activación funcional de leucocitos y de otras células cuya activación producida in vivo puede ser medida ex vivo o inducida in vitro, con base en la estabilización de las proteínas de la membrana citoplasmática y su detección utilizando técnicas citométricas cuantitativas en ausencia de manipulación adicional de la muestra que incluye las etapas de: a) incubar secuencialmente una muestra no manipulada con un inhibidor o mezcla de inhibidores específicos de una proteasa, y una mezcla de anticuerpos monoclonales conjugados directamente con fluorocromos; b) medir las emisiones fluorescentes utilizando citometría cuantitativa, de los fluorocromos enlazados a las células a través de los anticuerpos; c) analizar los resultados obtenidos utilizando una aproximación analítica multiparamétrica para la identificación de las subpoblaciones de células de interés, y dentro de ellas identificar aquellas células que expresan a las proteínas estabilizadas de lamembrana, cuantificando su expresión en forma objetiva con base en la intensidad de la fluorescencia detectada.
Description
Procedimiento para el análisis de la activación
funcional de leucocitos, plaquetas y otras células.
La invención está principalmente relacionada,
aunque no exclusivamente, con un procedimiento para la
cuantificación específica, sensible, económica y rápida de la
expresión acumulativa de proteínas que son usualmente expresadas en
forma transitoria en la membrana citoplasmática y reflejan un estado
específico funcionalmente activado en respuesta a los estímulos que
han actuado in vivo y pueden ser medidos ex vivo o han
sido administraos en vitro, a través del uso de compuestos
capaces de inhibir selectivamente la escisión y la secreción de las
proteínas de la membrana citoplasmática al medio extracelular sin
afectar la funcionalidad de la célula. La invención puede ser
utilizada tanto con células normales como con patológicas presentes
en muestras homogéneas o heterogéneas de células para cualquier
propósito que requiera ya sea el análisis de la expresión de las
proteínas de la membrana asociadas con la activación funcional de la
célula o la estabilización de las proteínas de la membrana,
particularmente para propósitos de hacer seguimiento al diagnóstico,
al pronóstico y al tratamiento.
Actualmente se sabe bien que cualquier proceso
funcional que tenga lugar a nivel celular únicamente, se refleja
entre otras manifestaciones, por medio de la existencia de cambios
en la expresión de diferentes proteínas celulares. Entre estas
modificaciones, son particularmente relevantes aquellos cambios en
la expresión de las proteínas de la membrana, donde ellas actúan
como receptores y ligandos para la transmisión de señales de célula
a célula y de proteína extracelular a célula. Frecuentemente, una
vez que la proteína ha jugado su papel en la membrana celular o,
algunas veces inmediatamente después de que una proteína ha
alcanzado la membrana citoplasmática de las células que la han
producido, estas proteínas son escindidas y dejan la membrana
celular hacia el medio extracelular por medio de la actividad de
proteasas y especialmente proteasas de la membrana que actúan
específicamente sobre las células donde ellas se expresan. Así, la
expresión de estas proteínas de la membrana ocurre frecuentemente en
forma transitoria por períodos de tiempo variable, dependiendo su
expresión no solamente de la velocidad en su producción sino también
sobre la velocidad a la cual son escindidas de la membrana celular y
secretadas al medio extracelular.
Desde hace mucho tiempo se sabe que la relevancia
potencial de la medición de estas proteínas de la membrana como
marcadores de activación funcional en diferentes tipos de células,
es alta. Sin embargo, ya que su expresión sobre la superficie
celular es transitoria, los análisis de sus niveles sobre la
membrana citoplasmática no han sido utilizados rutinariamente.
Alternativamente, las mediciones de estas proteínas han sido
realizadas en tres niveles diferentes: 1) cuantificación de la
proteína secretada al medio extracelular (proteína soluble), 2)
evaluación cualitativa (presencia/ausencia) de la expresión de la
proteína sobre la membrana citoplasmática y, 3) la evaluación
combinada de ambas formas de la proteína. Sin embargo, tales
determinaciones no proporcionan una información específica y/o
sensible acerca de la producción de estas proteínas en células
individuales. Debido a esto, más recientemente se han desarrollado
métodos que permiten la cuantificación de la producción total de
proteínas específicas durante un período específico de tiempo a
nivel celular individual. Para tal propósito, los compuestos
químicos que inducen un bloqueo del transporte intracelular de
vesículas de secreción tales como brefeldina A o monensina, han sido
utilizados para inducir la acumulación intracelular de proteínas
producidas en respuesta a estímulos específicos que pueden ocurrir
in vivo o ser administrados in vitro. El uso, en este
grupo posterior de técnicas, de agentes que bloquean el transporte y
la secreción extracelular de proteínas en una forma no específica a
nivel del citoplasma tiene desventajas principales: 1) su uso puede
estar asociado con cambios no deseados en otras funciones celulares,
2) el uso de esta metodología no bloquearía la liberación fuera de
la célula de aquellas moléculas de la proteína que habían alcanzado
la membrana celular antes de la administración del agente bloqueador
y, 3) para la detección de las proteínas de interés a nivel de la
célula individual, se requiere del uso de soluciones de fijación y
permeabilización, que disminuyen la sensibilidad del método para la
detección de la proteína y representa una limitación para su
análisis cuantitativo
objetivo.
objetivo.
Hasta ahora, no se ha descrito un procedimiento
que, con la manipulación de una muestra mínima, permita el análisis
funcional de activación de las células individuales, con base en la
estabilización y tanto el análisis cuantitativo como el acumulativo
de los niveles de proteínas en la membrana cuya expresión sobre la
superficie de la célula es usualmente transitoria.
Remold-O'Donnell y colaboradores
(J Immunol 152, 3595-3605, 1994) han mostrado la
posibilidad de la disminución asociada con la activación de la
inhibición de la expresión constitucional de CD43 sobre los
neutrófilos aislados de muestras de sangre periférica). Estos
autores indican que tal disminución es debida a la inhibición de una
proteasa que ellos llaman cd43’asa pero fallaron en identificarla.
Más recientemente Remold-O'Donnell y colaboradores
(Blood 85, 337-342, 1995) muestran que las
sustancias utilizadas para prevenir la disminución en la expresión
de CD43 inducen importantes cambios funcionales en las funciones del
neutrófilo tales como fagocitosis y en la forma del neutrófilo
indicando que se ha producido un efecto inhibitorio no
específico.
Por lo tanto, un éxito de esta invención consiste
en proponer una solución para el estudio de la activación funcional
de leucocitos, plaquetas y otras células ya sea producidas in
vivo y susceptibles de ser analizadas ex vivo o
inducidas in vitro, con base en la estabilización de
proteínas de la membrana citoplasmática y su detección en muestras
no manipuladas utilizando técnicas citométricas cuantitativas.
En forma similar, otro propósito de esta
invención consiste en conocer la cinética de la actividad de las
proteasas que participan en el procesamiento, corte y liberación
fuera de la membrana celular, de las proteínas que se encuentran
asociadas a procesos de activación funcional de leucocitos,
plaquetas y otras células, que pueden ser medidas ex vivo o
después de haber sido inducidas in vitro.
Más específicamente y de acuerdo con lo descrito
anteriormente, el procedimiento in vitro de esta invención
para el estudio de la activación funcional de leucocitos, y de otras
células, cuya activación producida in vivo puede ser medida
ex vivo o inducida in vitro, con base en la
estabilización de las proteínas de la membrana citoplasmática que
tienen una expresión transitoria sobre la superficie de la célula, y
su detección utilizando técnicas citométricas cuantitativas, en
ausencia de manipulación adicional de la muestra, comprende las
etapas de:
- a)
- incubar secuencialmente una muestra no manipulada con un inhibidor o mezcla de inhibidores específicos de una proteasa, y una mezcla de anticuerpos monoclonales conjugados directamente con fluorocromos;
- b)
- medir las emisiones fluorescentes utilizando citometría cuantitativa, de los fluorocromos enlazados a las células a través de los anticuerpos;
- c)
- analizar los resultados obtenidos utilizando una aproximación analítica multiparamétrica para la identificación de las subpoblaciones de células de interés, y dentro de ellas identificar aquellas células que expresan a las proteínas estabilizadas de la membrana, cuantificando su expresión en forma objetiva con base en la intensidad de la fluorescencia detectada.
Después de obtener la muestra en presencia de los
inhibidores de proteasa mencionados antes, el uso de procedimientos
para la estimulación in vitro de la activación funcional de
las células, las coloraciones con anticuerpos, el ajuste y la
calibración del citómetro se realizan de acuerdo a métodos
ampliamente descritos que son recomendados para el análisis
cuantitativo de la expresión de proteína sobre la membrana celular.
Para la selección de los subconjuntos específicos de células
presentes en la muestra en la cual se desea llevar a cabo la
determinación, se utilizarán anticuerpos que identifican
específicamente a aquellas células y que permiten su discriminación
de otros subtipos de células presentes en la muestra, evitando así
una manipulación adicional de la muestra.
Para el análisis de resultados así como para la
cuantificación exacta y precisa de la expresión de cada proteína de
interés, pueden utilizarse diferentes programas de software entre
los cuales es especialmente útil el software
PAINT-A-GATE PRO TM. Durante el
análisis, aparte de la negatividad/positividad para cada coloración
con anticuerpo, se usarán uno o más subconjuntos específicos de
células, intensidad de fluorescencia expresada en unidades objetivas
incluyendo la media de la mediana y valores de dispersión.
La invención puede ser utilizada tanto con
muestras normales como con muestras patológicas de humanos o de
animales, vegetales, bacterias y otros microorganismos, medidos
ex vivo, almacenados o tratados in vitro, para todos
los propósitos en los cuales se requiere el análisis tanto del
estatus como de las capacidades de activación funcional de
leucocitos, plaquetas u otras células.
Como puede decirse de lo que se ha descrito
anteriormente, los compuestos de estabilización (inhibidores de
proteasa), los anticuerpos y/o los fluorocromos pueden variar
dependiendo principalmente del tipo de proteínas, funciones y/o de
los tipos de células para el estudio, o dependiendo del tipo de
muestra utilizada. Tal inhibidor de proteasa es un anticuerpo
monoclonal, un aminoácido o un producto derivado de aminoácido o un
péptido.
Además, se entiende que en esta invención están
incluidas variaciones en las cuales el número anticuerpos utilizado
en combinación con un fluorocromo es mayor a uno, y aquellas
modificaciones de la técnica en las cuales se utilizan anticuerpos
monoclonales conjugados con más de un fluorocromo. Pueden utilizarse
una o más reservas de anticuerpos monoclonales conjugados con el
mismo fluorocromo y dirigidos a una o más subpoblaciones diferentes
de células, estando cada una de las reservas utilizadas de
anticuerpos conjugadas con fluorocromos diferentes.
Los fluorocromos utilizados son cualquier
combinación de fluorocromos técnicamente compatibles.
Finalmente, se entiende que en esta invención
están incluidas aquellas variaciones en las cuales, después de
incubar la muestra con los anticuerpos en presencia de sustancias
estabilizantes, éstas pueden ser removidas con el propósito de
explorar las cinéticas de acción de estas proteasas que participan
en el procesamiento, corte, y liberación al exterior de la célula de
las proteínas de la membrana asociadas al proceso de activación
funcional de leucocitos, plaquetas y otras células que pueden ser
medidas ex vivo directamente después que fueron obtenidas, o
después de ser inducidas in vitro.
Además, en esta invención, aparte de la
coloración de las subpoblaciones de células y de las proteínas
estabilizadas bajo estudio, puede realizarse también la medición de
otros marcadores de superficie incluidas oncoproteínas y proteínas
relacionadas con el ciclo celular, apoptosis o activación celular y
diferenciación.
Con el propósito de explorar tales cinéticas de
acción de las proteasas involucradas en el procesamiento, corte y
liberación al exterior de la célula de aquellas proteínas de la
membrana que están asociadas con los procesos de activación
funcional producida in vivo que puede ser medida ex
vivo o inducida in vitro de leucocitos, plaquetas y otras
células, después de realizar la incubación de la muestra con los
anticuerpos en presencia de las sustancias de estabilización, éstas
pueden ser o bien removidas después o reversados sus efectos.
Dentro de esta invención optimizamos
significativamente el estudio de la activación funcional de
leucocitos, plaquetas y otras células en muestras biológicas cuya
activación in vivo puede ser medida ex vivo o después
de estimulación in vitro, permitiendo también el análisis de
las cinéticas de acción de las proteasas de la membrana.
Debe considerarse también que la posibilidad de
estabilizar a las proteínas de la membrana cuya expresión en la
superficie de la célula es transitoria o aún registrada durante
períodos muy cortos de tiempo, proporciona información detallada
sobre el estatus de la activación funcional de las células
analizadas que es muy interesante conocer en forma sistemática, como
su localización y utilidad en diferentes situaciones así como en
condiciones normales y patológicas.
La invención puede ser utilizada para la
identificación de células, con base en la presencia o la ausencia de
coloración para uno o diferentes anticuerpos o combinaciones
anticuerpos utilizadas o basadas en la intensidad de fluorescencia
obtenida de ellos.
La invención será ilustrada por medio de tres
ejemplos que no limitan su área de aplicación, como sigue:
Se obtuvo sangre periférica (PB) en dos
diferentes tubos de 10 voluntarios sanos. Un tubo contenía heparina
y el segundo tubo contenía heparina y un inhibidor de la TACE
metaloproteasa responsable del procesamiento y liberación del factor
de necrosis tumoral (TNF) alfa del exterior de la membrana
citoplasmática de la célula al medio extracelular. El análisis de la
expresión del TNF-\alpha sobre la membrana
citoplasmática fue realizado después de inducir su producción por
parte de las células T y las células asesinas naturales (NK) con
ésteres forbol (PMA) y ionomicina, utilizando una técnica directa de
inmunofluorescencia analizada por medio de citometría de flujo.
Veinte \muL de PB fueron tomados de cada uno de
los dos tubos y colocados en tubos separados que habían sido
marcados claramente por adelantado. A cada uno de estos dos tubos se
les añadieron 80 \muL de medio de cultivo celular RPMI 1640
suplementado con suero bovino fetal al 10% y glutamina al 1%.
Después se añadieron 25 \muL de una solución contenía PMA más
ionomicina (concentración final de 25 ng/mL y 1 \mug/mL,
respectivamente); después de agitar los tubos en un vórtice, fueron
incubados durante 2 horas a 37°C en un atmósfera humidificada que
contenía 5% de CO_{2}. Después de esta incubación, la muestra fue
dividida en dos partes idénticas que fueron colocadas en dos tubos
diferentes (50 \muL/tubo). A uno de estos tubos se le añadieron 20
\muL de cada uno de los siguientes anticuerpos monoclonales
conjugados con fluorocromos (isotiocianato de
fluoresceína-FTIC, ficoeritrina-PE,
PE/cianina 5 PE/Cy5 y aloficocianina APC): CD3 (leu
4)-FITC /
anti-TNF\alpha-PE /
CD56-PECy5 / CD45-APC. La
especificidad y fuente de los anticuerpos monoclonales fue la
siguiente:
- 1)
- Leu-4-FITC (CD3): marcador de células pan-T (Becton Dickinson, San José, CA, Estados Unidos.
- 2)
- 6401.1111-PE (anti-TNF\alpha): identifica al factor de necrosis tumoral (Becton Dickinson).
- 3)
- NKI-nbl-1-PECy5 (CD56): marcador que identifica a las células NK y a una subpoblación de células T (Caltag Laboratories, San Francisco, CA, Estados Unidos).
- 4)
- HI30-APC (CD45): marcador pan-leucocito (Caltag Laboratories).
Al otro tubo, utilizado como control de isotipo,
se le añadieron los mismos anticuerpos monoclonales excepto por el
anticuerpo contra TNF-\alpha que fue reemplazado
por un anticuerpo monoclonal de ratón del mismo isotipo que el
reactivo anti-TNF-\alpha (también
conjugado con PE) y dirigido contra una proteína que no se expresa
sobre células de PB humana. Ambos tubos fueron agitados suavemente
en vórtice e incubados durante 10-15 minutos a
temperatura ambiente, en la oscuridad. Inmediatamente después de
este período de incubación, se añadieron a cada tubo 2 mL de la
solución de lisado QUICKLYSIS (Cytognos, Salamanca, España), seguido
por 4-5 segundos de agitación con vórtice. Después,
las células fueron incubadas por un período adicional de 10 minutos
en la oscuridad (temperatura ambiente). Después de este período, se
midieron las manchas de fluorescencia en un citómetro de flujo.
Todas las mediciones fueron realizadas en un
citómetro de flujo FACS-Calibur (Becton Dickinson)
equipado con dos láseres sintonizados en 488 nm y 650 nm,
respectivamente. La puesta en marcha y la calibración del
instrumento se llevaron a cabo utilizando el programa del software
AUTOCOMP (Becton Dickinson) y microperlas CALIBRITE (Becton
Dickinson). Para la adquisición de datos se utilizó el programa del
software CellQuest (Becton Dickinson), estando la información
exclusivamente almacenada en células positivas CD45. Después de
almacenar la información sobre las manchas fluorescentes realizadas
sobre muestras de PB, se adquirió la información sobre la
fluorescencia de una mezcla de 6 subpoblaciones diferentes de
microperlas, cada una coloreada con una cantidad diferente bien
conocida de moléculas de PE (microperlas QUANTIBRITE, Becton
Dickinson). Para su medición, se diluyeron las subpoblaciones de
microperlas en 2 mL de solución QUICLYSIS.
El análisis de datos se llevó a cabo utilizando
el programa del software
PAINT-A-GATE PRO (Becton Dickinson)
usando la posibilidad de adquirir una transformación logarítmica del
parámetro para disipar la luz de costado (SSC) con el propósito de
obtener una mejor separación entre los diferentes tipos de células
positivas CD45 presentes en las muestras de PB.
La expresión de TNF\alpha sobre la membrana
citoplasmática de cada célula fue analizada específicamente para
células T (CD45^{++} / CD3^{+}) y células NK (CD45^{++} /
CD3^{-} / CD56^{+}), estando registrada la información numérica
sobre el porcentaje de la superficie de las células positivas
TNF\alpha y la intensidad de la expresión de TNF\alpha entre
las subpoblaciones de células positivas (media, mediana y
coeficiente de variación) en canales de fluorescencia relativa
(unidades arbitrarias en escala de 0 a 10.000). Con el propósito de
poder comparar los resultados de los experimentos realizados ya sea
en días diferentes o en laboratorios diferentes, se utilizaron
microperlas QUANTIBRITE como un estándar para convertir la
intensidad de la fluorescencia expresada en unidades arbitrarias
(canales de fluorescencia) en el número de moléculas equivalentes de
ficoeritrina soluble (MESF).
La muestra de PB fue obtenida por medio de
punción venosa a 10 voluntarios sanos y cada muestra fue colocada
en dos tubos. Un tubo contenía heparina y el segundo tubo contenía
heparina y un inhibidor de la TACE metaloproteasa responsable del
procesamiento y la liberación.
Para procesar y liberar a la
L-selectina (CD62L) de la membrana citoplasmática de
los leucocitos al medio extracelular. Los análisis de la expresión
de CD62L de la membrana citoplasmática fueron realizados utilizando
una técnica de inmunofluorescencia directa analizada por medio de
citometría de flujo.
Cien \muL de PB de cada tubo fueron colocados
en dos tubos separados de polipropileno que habían sido marcados
claramente por adelantado. A cada uno de estos dos tubos se les
añadieron 80 \muL de medio de cultivo celular RPMI 1640
suplementado con suero bovino fetal al 10% y glutamina al 1%.
Después se añadieron 25 \muL de una solución contenía PMA más
ionomicina (concentración final de 25 ng/mL y 1 \mug/mL,
respectivamente); después de agitar los tubos en un vórtice, fueron
incubados durante 2 horas a 37°C en un atmósfera humidificada que
contenía 5% de CO_{2}. Después de esta incubación, la muestra fue
dividida en dos partes idénticas que fueron colocadas en dos tubos
diferentes (50 \muL/tubo). A uno de estos tubos se le añadieron
20 \muL de cada uno de los siguientes anticuerpos monoclonales
conjugados con fluorocromos (isotiocianato de
fluoresceína-FTIC, ficoeritrina-PE,
PE/cianina 5 PE/Cy5 y aloficocianina APC): CD14-FITC
/ CD62L-PE / CD45-PECy5. La
especificidad y fuente de los anticuerpos monoclonales fue la
siguiente:
- 1.-
- LeuM3-FITC (CD14): marcador monocítico (Becton Dickinson).
- 2.-
- Leu-8-PE - (CD62L): molécula de adhesión (L-selectina) expresada por leucocitos (Becton Dickinson).
- 3.-
- HI30-PECy5 (CD45): marcador pan-leucocito (Caltag Laboratories).
Al otro tubo, utilizado como control de isotipo,
se le añadieron los mismos anticuerpos monoclonales excepto por
aquel anticuerpo contra CD62L que fue reemplazado por un anticuerpo
monoclonal de ratón del mismo isotipo que el reactivo CD62L (también
conjugado con PE) y dirigido contra una proteína que no se expresa
sobre células de PB humana. Ambos tubos fueron agitados suavemente
en vórtice e incubados durante 10-15 minutos a
temperatura ambiente, en la oscuridad. Inmediatamente después de
este período de incubación, se añadieron a cada tubo 2 mL de la
solución de lisado QUICKLYSIS (Cytognos, Salamanca, España), seguido
por 4-5 segundos de agitación con vórtice. Después,
las células fueron incubadas por un período adicional de 10 minutos
en la oscuridad (temperatura ambiente). Después de este período, se
midieron las manchas de fluorescencia en un citómetro de flujo.
Todas las mediciones fueron realizadas en un
citómetro de flujo FACS-Calibur (Becton Dickinson)
equipado con dos láseres sintonizados en 488 nm y 650 nm,
respectivamente. La puesta en marcha y la calibración del
instrumento se llevaron a cabo utilizando el programa del software
AUTOCOMP (Becton Dickinson) y microperlas CALIBRITE (Becton
Dickinson). Para la adquisición de datos se utilizó el programa del
software CellQuest (Becton Dickinson), estando la información
exclusivamente almacenada en células positivas CD45. Después de
almacenar la información sobre las manchas fluorescentes realizadas
sobre muestras de PB, se adquirió la información sobre la
fluorescencia de una mezcla de 6 subpoblaciones diferentes de
microperlas, cada una coloreada con una cantidad diferente bien
conocida de moléculas de PE (microperlas QUANTIBRITE, Becton
Dickinson). Para su medición, se diluyeron las subpoblaciones de
microperlas en 2 mL de solución QUICLYSIS.
El análisis de datos se llevó a cabo utilizando
el programa del software
PAINT-A-GATE PRO (Becton Dickinson)
usando la posibilidad de adquirir una transformación logarítmica del
parámetro para disipar la luz de costado (SSC) con el propósito de
obtener una mejor separación entre los diferentes tipos de células
positivas CD45 presentes en las muestras de PB.
La expresión de CD62L sobre la membrana
citoplasmática de cada célula fue analizada específicamente para
neutrófilos (CD45^{+} con SSC alto), basófilos (CD45^{+} con SSC
bajo), monocitos (CD45^{++}, CD14^{+} con SSC intermedio) y
linfocitos (CD45^{++} con SSC bajo), estando registrada la
información numérica sobre el porcentaje de la superficie de las
células positivas CD62L y la intensidad de la expresión de CD62L
entre las subpoblaciones de células positivas (media, mediana y
coeficiente de variación) en canales de fluorescencia relativa
(unidades arbitrarias en escala de 0 a 10.000). Con el propósito de
poder comparar los resultados de los experimentos realizados ya sea
en días diferentes o en laboratorios diferentes, se utilizaron
microperlas QUANTIBRITE como un estándar para convertir la
intensidad de la fluorescencia expresada en unidades arbitrarias
(canales de fluorescencia) en el número de moléculas equivalentes de
ficoeritrina soluble (MESF).
Se obtuvo sangre periférica (PB) en dos
diferentes tubos de 6 voluntarios sanos. Un tubo contenía heparina
y el segundo tubo contenía heparina y un inhibidor de la TACE
metaloproteasa responsable del procesamiento y liberación del factor
de necrosis tumoral (TNF) alfa del exterior de la membrana
citoplasmática de la célula al medio extracelular. El análisis de la
expresión del TNF-\alpha sobre la membrana
citoplasmática fue realizado después de inducir su producción por
parte de los monocitos y de las células dendríticas con
lipopolisacárido (LPS) y \alpha-interferón
(\alpha-IFN) utilizando una técnica directa de
inmunofluorescencia analizada por medio de citometría de flujo.
Veinte \muL de PB fueron tomados de cada uno de
los dos tubos y colocados en tubos separados que habían sido
marcados claramente por adelantado. A cada uno de estos dos tubos se
les añadieron 80 \muL de medio de cultivo celular RPMI 1640
suplementado con suero bovino fetal al 10% y glutamina al 1%.
Después se añadieron a cada tubo 10 \muL de una solución contenía
LPS (concentración final de 10 ng/mL); después de agitar los tubos
en un vórtice, fueron incubados durante 4 horas a 37°C en un
atmósfera humidificada que contenía 5% de CO_{2}. Después de esta
incubación, la muestra fue dividida en dos partes idénticas que
fueron colocadas en dos tubos diferentes (50 \muL/tubo). A uno de
estos tubos se le añadieron 20 \muL de cada uno de los siguientes
anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos (isotiocianato
de fluoresceína-FTIC,
ficoeritrina-PE, proteína peridín
clorofílica-PerCP y APC):
CD3-CD19-CD56-CD14-FITC
/ anti-TNF\alpha-PE /
HLADR-PerCP / CD45-APC. La
especificidad y fuente de los anticuerpos monoclonales fue la
siguiente:
- 1.-
- Leu 4-FITC (CD3): marcador de células pan-T (Becton Dickinson)
- 2.-
- C5.9-FITC (CD56): molécula de adhesión neural presente en células NK y una subpoblación de células T (Imico, Madrid, España).
- 3.-
- Leu 12-FITC (CD19): marcador de células pan-B (Becton Dickinson)
- 4.-
- Leu M3-FITC (CD14): marcador presente sobre monocitos maduros (Becton Dickinson)
- 5.-
- 6401.1111-PE (anti-TNF\alpha): identifica al factor \alpha de necrosis tumoral (Becton Dickinson)
- 6.-
- L243-PerCP (HLADR): marcador presente sobre células que presentan antígeno; subtipo de molécula HLA clase II (Becton Dickinson)
- 7.-
- HI30-APC (CD45): marcador pan-leucocito (Caltag Laboratories)
Al otro tubo, utilizado como control de isotipo,
se le añadieron los mismos anticuerpos monoclonales excepto por el
anticuerpo contra TNF-\alpha que fue reemplazado
por un anticuerpo monoclonal de ratón del mismo isotipo que el
reactivo anti-TNF-\alpha (también
conjugado con PE) y dirigido contra una proteína que no se expresa
sobre células de PB humana. Ambos tubos fueron agitados suavemente
en vórtice e incubados durante 10-15 minutos a
temperatura ambiente, en la oscuridad. Inmediatamente después de
este período de incubación, se añadieron a cada tubo 2 mL de la
solución de lisado QUICKLYSIS. Se añadieron 0,5 ml de solución
salina de búfer de fosfato (PBS) a cada tubo y luego éstos fueron
agitados en un vórtice por 4-5 segundos. Después de
este período, se llevaron a cabo las mediciones de las manchas
fluorescentes en un citómetro de flujo.
Todas las mediciones fueron realizadas en un
citómetro de flujo FACS-Calibur (Becton Dickinson)
equipado con dos láseres sintonizados en 488 nm y 650 nm,
respectivamente. La puesta en marcha y la calibración del
instrumento se llevaron a cabo utilizando el programa del software
AUTOCOMP (Becton Dickinson) y microperlas CALIBRITE (Becton
Dickinson). Para la adquisición de datos se utilizó el programa del
software CellQuest (Becton Dickinson), estando la información
exclusivamente almacenada en células positivas CD45. Después de
almacenar la información sobre las manchas fluorescentes realizadas
sobre muestras de PB, se adquirió la información sobre la
fluorescencia de una mezcla de 6 subpoblaciones diferentes de
microperlas, cada una coloreada con una cantidad diferente bien
conocida de moléculas de PE (microperlas QUICKCAL, Flow Cytometry
Standards Corporation, San Juan, Puerto Rico). Para su medición, se
diluyeron las subpoblaciones de microperlas en 0,5 ml de solución
PBS.
El análisis de datos se llevó a cabo utilizando
el programa del software
PAINT-A-GATE PRO (Becton Dickinson)
usando la posibilidad de adquirir una transformación logarítmica del
parámetro para disipar la luz de costado (SSC) con el propósito de
obtener una mejor separación entre los diferentes tipos de células
positivas CD45 presentes en las muestras de PB.
La expresión de TNF\alpha sobre la membrana
citoplasmática de cada célula fue analizada específicamente para
células dendríticas (CD45^{+} / CD3^{-} / CD19^{-} /
CD14^{-} / CD56^{-} / HLADR^{+}) y monocitos
(CD45^{+}/CD14^{+}), estando registrada la información numérica
sobre el porcentaje de la superficie de las células positivas
TNF\alpha y la intensidad de la expresión de TNF\alpha entre las
subpoblaciones de células positivas (media, mediana y coeficiente de
variación) en canales de fluorescencia relativa (unidades
arbitrarias en escala de 0 a 10.000). Con el propósito de poder
comparar los resultados de los experimentos realizados ya sea en
días diferentes o en laboratorios diferentes, se utilizaron
microperlas QUICKCAL (Flow Cytometry Standards Corporation) como un
estándar para convertir la intensidad de la fluorescencia expresada
en unidades arbitrarias (canales de fluorescencia) en el número de
moléculas equivalentes de ficoeritrina soluble (MESF).
Claims (9)
1. Procedimiento in vitro para el estudio
de la activación funcional de leucocitos y de otras células cuya
activación producida in vivo puede ser medida ex vivo
o inducida in vitro, con base en la estabilización de las
proteínas de la membrana citoplasmática y su detección utilizando
técnicas citométricas cuantitativas en ausencia de manipulación
adicional de la muestra que incluye las etapas de:
- a)
- incubar secuencialmente una muestra no manipulada con un inhibidor o mezcla de inhibidores específicos de una proteasa, y una mezcla de anticuerpos monoclonales conjugados directamente con fluorocromos;
- b)
- medir las emisiones fluorescentes utilizando citometría cuantitativa, de los fluorocromos enlazados a las células a través de los anticuerpos;
- c)
- analizar los resultados obtenidos utilizando una aproximación analítica multiparamétrica para la identificación de las subpoblaciones de células de interés, y dentro de ellas identificar aquellas células que expresan a las proteínas estabilizadas de la membrana, cuantificando su expresión en forma objetiva con base en la intensidad de la fluorescencia detectada.
2. Procedimiento, de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (a) se
utilizan las muestras normales o patológicas obtenidas in
vivo, almacenadas o tratadas ex vivo.
3. Procedimiento, de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque dichos inhibidores de
proteasa, los anticuerpos o los fluorocromos utilizados y su número
pueden variar dependiendo de las proteínas, funciones y/o tipos de
células bajo estudio o de tipo de muestra utilizado.
4. Procedimiento, de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de
proteasa es un anticuerpo monoclonal, un aminoácido, un producto
derivado de un aminoácido o un péptido.
5. Procedimiento, de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque cualquier combinación
de fluorocromos que sea técnicamente compatible puede ser
utilizada.
6. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque una reserva o
más de una reserva de anticuerpos monoclonales conjugada con el
mismo fluorocromo y dirigida contra una o más subpoblaciones de
células diferentes puede ser utilizada, siempre que cada reserva
utilizada de anticuerpos esté conjugada con un fluorocromo
diferente.
7. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 5, en el cual además de la coloración de las
subpoblaciones de células y de las proteínas estabilizadas bajo
estudio, también son identificados otros marcadores de membrana
incluidas oncoproteínas y proteínas asociadas con el ciclo celular,
apoptosis o activación y diferenciación celular.
8. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 6 en el cual, después de realizar la incubación
de la muestra con anticuerpos en presencia de sustancias de
estabilización, éstos pueden ser removidos con el propósito de
explorar las cinéticas de acción de las proteasas involucradas en el
procesamiento, corte y liberación al medio extracelular de aquellas
proteínas de la membrana asociadas con la activación funcional de
leucocitos, plaquetas y otras células, cuya activación in
vivo puede ser medida ex vivo o después de estimulación
in vitro.
9. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 7 en el cual la identificación de células se
basa en la presencia o ausencia de coloración para uno o varios de
los anticuerpos utilizados, así como en la intensidad de positividad
para esos anticuerpos.
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