ES2255502T3 - Polipeptidos vgf y metodos para tratar transtornos relacionados con vgf. - Google Patents
Polipeptidos vgf y metodos para tratar transtornos relacionados con vgf.Info
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Abstract
Un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ. ID. NO: 2. La invención también se refiere a un polipéptido aislado que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, teniendo el fragmento una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2. La invención se refiere además a un polipéptido aislado que comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) La secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una substitución de aminoácido conservativa, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2, (b) la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una inserción de aminoácido, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2, (c) la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una deleción de aminoácido, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2, (d) la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, que tiene al menos un truncación C-terminal y/o N-terminal, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2, y (e) la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en substituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos, truncación carboxi-terminal, y truncación amino-terminal, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2.
Description
Polipéptidos VGF y métodos para tratar trastornos
relacionados con VGF.
Esta invención se refiere a polipéptidos VGF
novedosos y agentes de unión selectivos. La invención se refiere
también a células huésped y métodos para producir polipéptidos VGF.
La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas VGF y
métodos para el diagnóstico, tratamiento, mejoramiento, y/o
prevención de enfermedades, cuadros, y trastornos asociados con
polipéptidos VGF.
El VGF es un polipéptido secretado que se
encuentra en neuronas y células endocrinas, Canu y otro(s),
1997, Genomics, 45: 443-48. El VGF es
encontrado en el hipotálamo, y es regulado en el cerebro por
actividad eléctrica, lesión, y el reloj circadiano. Se ha demostrado
que el hipotálamo desempeña un rol importante en la regulación del
consumo de alimentos y la producción de energía, y se ha demostrado
que el daño en el hipotálamo afecta tanto al apetito como al peso
corporal. Schwartz y otro(s), Am. J. Physiol., 269:
949-57. Se ha encontrado también que el VGF juega un
papel en el metabolismo.
Son conocidas las secuencias de nucleótidos y
aminoácidos de VGF de ser humano y de la rata, y muestran una
elevada homología entre sí. Canu y otro(s, supra. El
gen de VGF, que ha sido identificado originalmente como un fragmento
de ADNc de 2,7 kb, es trascripto en subpoblaciones de neuronas y
células endocrinas in vitro por neurotrofinas.
La obesidad y la anorexia son perturbaciones de
la homeostasis de la energía, que resultan de desequilibrios entre
consumo y gasto de energía. Existe una necesidad de tratamiento
efectivo de estos cuadros. Existe también una necesidad de
tratamiento efectivo de caquexia, esterilidad, cuadros
hipermetabólicos, hiperactividad, hipoactividad, hiperproducción de
insulina, y cuadros y trastornos relacionados.
La presente invención se refiere a un polipéptido
aislado que comprende la secuencia de aminoácidos como se presenta
en la SEQ ID NO: 2.
La invención también se refiere a un polipéptido
aislado que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos
como se presenta en la SEQ ID NO: 2, teniendo el fragmento una
actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2.
La invención se refiere además a un polipéptido
aislado que comprende la secuencia seleccionada del grupo que
consiste en:
- (a)
- La secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una substitución de aminoácido conservativa, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2,
- (b)
- la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una inserción de aminoácido, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2,
- (c)
- la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una deleción de aminoácido, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2,
- (d)
- la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, que tiene al menos un truncación C-terminal y/o N-terminal, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2, y
- (e)
- la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en substituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos, truncación carboxi-terminal, y truncación amino-terminal, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2.
También se proveen polipéptidos de fusión que
comprenden al menos un polipéptido como se ha descripto fusionado a
una secuencia de aminoácidos heteróloga.
También se refiere la presente invención a
agentes de unión selectivos, tales como anticuerpos, capaces de
unirse específicamente a al menos un polipéptido que comprende la
secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2.
La presente invención se refiere además a agentes
de unión selectivos capaces de unirse específicamente a un fragmento
de al menos un polipéptido que comprende un fragmento de la
secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, o una
variante del mismo de existencia natural.
Los agentes de unión selectivos de la presente
invención pueden ser anticuerpos, o fragmentos de los mismos,
incluyendo, pero sin limitarse a: anticuerpos murinos, anticuerpos
humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos policlonales,
anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos
injertados con CDR, anticuerpos antiidiotípicos, y fragmentos de
región variable (tales como Fab o un fragmento de Fab'). Los agentes
de unión selectivos de la presente invención incluyen agentes de
unión selectivos o fragmentos de los mismos que tienen al menos una
región determinante de complementariedad con especificad para un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se
presenta en la SEQ ID NO: 2.
Los agentes de unión selectivos de la invención
pueden estar ligados opcionalmente a un rótulo detectable.
También se incluyen agentes de unión selectivos
que son capaces de antagonizar la actividad biológica de VGF.
Un agente de unión selectivo preferido, o
fragmento del mismo, es capaz de unirse específicamente a un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se
presenta en la SEQ ID NO: 2, o un fragmento de la misma.
La presente invención también proporciona
composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos o
agentes de unión selectivos de la invención y uno o más agentes de
formulación farmacéuticamente aceptables, las que están también
incluidos en la invención. El agente de formulación puede ser un
vehículo, adyuvante, solubilizante, o antioxidante, adecuados. Los
polipéptidos VGF o agentes de unión selectivos pueden estar
covalentemente modificados con un polímero soluble en agua, tal como
polietilenglicol y dextrano. Las composiciones farmacéuticas de la
presente invención se emplean para proporcionar cantidades
terapéuticamente efectivas de los polipéptidos VGF o agentes de
unión selectivos de la presente invención. La presente invención
también proporciona métodos para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de enfermedades, cuadros, o trastornos
relacionados con VGF.
La presente invención también proporciona métodos
para tratar, prevenir, o mejorar una enfermedad, cuadro, o trastorno
relacionados con VGF que comprende administrar a un paciente una
cantidad efectiva de de los polipéptidos VGF o agentes de unión
selectivos de la invención. Enfermedades, cuadros, y trastornos
relacionados con VGF incluyen obesidad, esterilidad, caquexia,
desórdenes de la alimentación, complejo relacionado con SIDA,
cuadros hipermetabólicos, hiperactividad, hipoactividad, e
hiperproducción de insulina. Los trastornos de alimentación
relacionados con VGF incluyen bulimia y anorexia nerviosa. Se
apreciará que los métodos de la presente invención también se
refieren a la administración de combinaciones de los polipéptidos
VGF o agentes de unión selectivos de la presente invención.
También se proporcionan métodos para diagnosticar
una enfermedad, cuadro, o trastorno relacionados con VGF, o una
susceptibilidad a una enfermedad, cuadro, o trastorno relacionados
con VGF, en un animal que comprende determinar la presencia o
magnitud de expresión de un polipéptido VGF y diagnosticar la
enfermedad, cuadro, o trastorno relacionados con VGF, o la
susceptibilidad a una enfermedad, cuadro, o trastorno relacionados
con VGF, en base a la presencia o magnitud de expresión del
polipéptido VGF. En métodos preferidos para diagnosticar una
enfermedad, cuadro, o trastorno relacionados con VGF, o una
susceptibilidad a una enfermedad, cuadro, o trastorno relacionados
con VGF, el animal es un mamífero. En métodos aún más preferidos en
animal es un ser humano.
La presente invención también proporciona un
método para probar moléculas de ensayo para identificar una molécula
de ensayo que se une a un polipéptido VGF. El método comprende poner
en contacto un polipéptido VGF con una molécula de ensayo y
determinar la extensión de la unión de las moléculas de ensayo a los
polipéptidos. El método comprende además determinar si tales
moléculas de ensayo son agonistas o antagonistas de un polipéptido
VGF. La presente invención proporciona además un método para
analizar el impacto de moléculas sobre la expresión de polipéptido
VGF o sobre la actividad de polipéptido VGF.
Estos y otros objetos de la invención se pondrán
de manifiesto después de considerar la memoria descriptiva como un
todo.
Las reivindicaciones se refieren a SEQ ID NO: 2;
la referencia a otros SEQ ID NO's son para ayudar a la comprensión y
a la ejecución de la invención reivindicada.
La Figura 1 ilustra el peso corporal de ratones
knockout de VGF después de la administración de
VGF-1a (SEQ ID NO: 2). La administración de
VGF-1a se suspendió en el día 5 (como lo indica la
flecha),
La Figura 2 ilustra los niveles de título de
anticuerpos de un conejo inyectado con VGF-1 (SEQ
ID NO: 1); calculado a 1:100 para dilución en serie de 2x, y
La Figura 3 ilustra los niveles de título de
anticuerpos de un conejo inyectado con VGF-2 (SEQ
ID NO: 4); calculado a 1:100 para dilución en serie de 2x, y
Los encabezamientos de sección empleados aquí
cumplen una función de organización y no deben ser interpretados
como limitando el sujeto temático descripto. Todas las referencias
citadas en esta solicitud son expresamente incorporadas a la
presente como referencia.
El término "polipéptido VGF" se refiere a un
polipéptido que comprende cualquiera de las secuencias de
aminoácidos como se presentan en la Tabla 1, y polipéptidos
relacionados descriptos en la presente. Los polipéptidos
relacionados incluyen fragmentos, ortólogos, variantes y derivados
de polipéptido VGF, que posean al menos una característica de
cualquiera de los polipéptidos de VGF como se presentan en las SEQ
ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID
NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, o SEQ ID NO:10. Los
polipéptidos VGF pueden ser polipéptidos maduros, como se definen
aquí, y pueden tener o no un residuo de metionina
amino-terminal, dependiendo del método mediante el
cual los mismos son preparados.
| Polipéptidos VGF | Secuencia de amino ácido (SED ID) |
| VGF-1 | AQEEADAEERRLQEQEELENYIEHVLLHRP (SEQ ID NO: 1) |
| VGF-1a | AQEEADAEE (SEQ ID NO: 2) |
| VGF-1b | LQEQEELENYIEHVLLHRP (SEQ ID NO: 3) |
| VGF-2 | LEGSFLGGSEAGERLLQQGLAQVEA (SEQ ID NO: 4) |
| VGF-3 | SQEEAPGH (SEQ ID NO: 5) |
| VGF-4 | HFHHALPPARHHPDLEAQA (SEQ ID NO: 6) |
| VGF-5 | QAEATRQAAAQEERLADLASDLLLQYLLQGGARQRDLGGRGLQETQQERENEREEE |
| AEQE (SEQ ID NO: 7) | |
| VGF-6 | GGGEDEVGEEDEEAAEAEAEAEEAERARQNALLFAEEEDGEAGAED (SED ID NO: 8) |
| VGF-7 | DAEGTEEGGEEDDDDEEMDPQTIDSLIELSTKLHPADDVVSIIEEVEE (SEQ ID NO: 9) |
| VGF-8 | NAPPEPVPPPRAAPAPTHVRSPQPPPPAPARDELPDWNEVLPPWDREEDEVFPPGPYH |
| PFPNYIRPRTLQPPASS (SEQ ID NO: 10) |
El término "fragmento de polipéptido VGF" se
refiere a un polipéptido que comprende una truncación de
amino-término y/o una truncación de
carboxi-término de cualquiera de los polipéptidos
presentados en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4,
SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, o
SEQ ID NO:10. El término "fragmento de polipéptido VGF" hace
referencia también a truncaciones amonio-terminales
y/o carboxi-terminales de ortólogos, variantes, o
derivados de polipéptidos VGF. Los fragmentos de polipéptido VGF
pueden resultar de splicing de ARN alternativo o de actividad de
proteasa in vivo. Tales fragmentos de polipéptido VGF pueden
comprender opcionalmente un residuo de metionina
amino-terminal. Se apreciará que tales fragmentos
pueden ser utilizados, por ejemplo, para generar anticuerpos a los
polipéptidos VGF.
El término "ortólogo de polipéptido VGF" se
refiere a un polipéptido de otras especies que corresponden a
cualquiera de los polipéptidos VGF presentados en SEQ ID NO:1, SEQ
ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID
NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, o SEQ ID NO:10. Por ejemplo, los
polipéptidos VGF de ratón y de humano son considerados ortólogos
entre sí.
El término "variantes de polipéptido VGF" se
refiere a polipéptidos VGF que comprenden secuencias de aminoácidos
que tienen una o más substituciones de secuencias de aminoácidos
(conservativas, no conservativas, o combinación de las mismas),
deleciones (tales como deleciones internas y/o fragmentos de
polipéptido VGF), y/o adiciones (tales como adiciones internas y/o
polipéptidos de fusión VGF) en comparación con cualquiera de los
polipéptidos presentados en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3,
SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ
ID NO:9, o SEQ ID NO:10. Las variantes pueden darse naturalmente
(por ejemplo, variantes alélicas de polipéptidos VGF u ortólogos de
polipéptidos VGF) o pueden ser artificialmente construidas.
El término "derivados de polipéptido VGF" se
refiere a cualquiera de los polipéptidos presentados en SEQ ID NO:1,
SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ
ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, o SEQ ID NO:10, o fragmentos,
ortólogos, o variantes de polipéptido VGF, tal como se definieron
aquí, que puedan haber sido químicamente modificados. Las
modificaciones químicas pueden ser, por ejemplo, por acoplamiento
covalente de uno o más polímeros, incluyendo, pero sin limitarse a,
polímeros solubles en agua, carbohidratos con unión en N o con unión
en O, azúcares, y fosfatos. Los derivados de polipéptido VGF está
modificados de manera tal que difieran de los polipéptidos VGF de
origen natural, ya sea en el tipo o en la ubicación de las moléculas
acopladas al polipéptido. Los derivados de polipéptido VGF incluyen
además polipéptidos de VGF que tienen una deleción de uno o más
grupos químicos naturalmente acoplados al polipéptido de VGF.
El término "polipéptido VGF maduro" se
refiere a un polipéptido VGF al que le falta una secuencia líder. Un
polipéptido VGF maduro puede también incluir otras modificaciones
tales como procesamiento proteolítico del
amino-término (con o sin una secuencia líder) y/o
del carboxi-término, escisión de un polipéptido más
pequeño de un precursor más grande, glisosilación con unión en N y/o
con unión en O, y similares.
El término "polipéptido de fusión de VGF" se
refiere a una fusión de uno o más aminoácidos (tal como un péptido o
polipéptido heterólogos) en el amino- o
carboxi-término de un fragmento, ortólogo,
variantes, o derivado de polipéptido VGF.
El término "polipéptidos VGF biológicamente
activos" se refiere a polipéptidos VGF que tienen al menos una
característica de actividad del polipéptido que comprende la
secuencia de aminoácidos como se presenta en cualquiera de SEQ ID
NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID
NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, o SEQ ID NO:10. Además,
un polipéptido VGF puede ser activo como un inmunogen, es decir, el
polipéptido VGF contiene al menos un epítopo al cual pueden ser
atraídos los anticuerpos.
El término "polipéptido aislado" se refiere
a un polipéptido de la presente invención que (1) ha sido separado
de al menos aproximadamente 50 por ciento de polinucleótidos,
lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales el mismo
es encontrado naturalmente cuando es aislado de la célula de origen,
(2) no está unido (por interacción covalente o no covalente) a todo
o a una porción de un polipéptido al cual el "polipéptido
aislado" está unido en la naturaleza, (3) está unido
operativamente (por interacción covalente o no covalente) a un
polipéptido con el cual no está unido en la naturaleza, o (4) no se
presenta en la naturaleza. Preferentemente el polipéptido aislado
está substancialmente exento de cualesquiera otros polipéptidos
contaminantes u otros contaminantes que se encuentran en su entorno
natural que interferirían con su uso terapéutico, de diagnóstico,
profiláctico, o de investigación.
El término "vector" se emplea para referirse
a cualquier molécula (es decir, ácido nucleico, plásmido, o virus)
utilizado para transferir información de codificación a una célula
huésped.
El término "vector de expresión" se refiere
a un vector que es adecuado para transformación de una célula
huésped y contiene secuencias de ácidos nucleicos que dirigen y/o
controlan la expresión de secuencias de ácidos nucleicos heterólogas
insertadas. La expresión incluye, pero sin limitarse a, procesos
tales como transcripción, traducción, y splicing de ARN, si están
presentes intrones.
El término "célula huésped" se emplea para
hacer referencia a una célula que ha sido transformada, o es capaz
de ser transformada, con una secuencia de ácido nucleico y luego de
expresar un gen seleccionado de interés. El término incluye la
progenie de la célula madre, sea o no sea idéntica la progenie en
morfología o en estructura genética al progenitor original, en tanto
esté presente el gen seleccionado.
El término "identidad", como es conocido en
la especialidad, se refiere a una relación entre las secuencias de
dos o más moléculas de polipéptido o dos o más moléculas de ácido
nucleico, según se determina por comparación de las secuencias. En
la especialidad, "identidad" significa también el grado de
afinidad de secuencia entre moléculas de polipéptido o de ácido
nucleico, según sea el caso, como se determina por la coincidencia
entre cordones de dos o más secuencias de nucleótido o de dos o más
aminoácidos. "Identidad" mide el porcentaje de coincidencias
idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con
alineamientos de brecha ["gap"] (si los hubiera) determinado
por un modelo matemático o programa de computadora particulares (es
decir, "algoritmo").
El término "similitud", es un concepto
relacionado, pero a diferencia de "identidad", "similitud"
hace referencia a una medida de afinidad que incluye tanto
coincidencias idénticas como coincidencias de substitución
conservativa. Si dos secuencias de polipéptido tienen, por ejemplo,
10/20 aminoácidos idénticos, y el resto son todas substituciones no
conservativas, entonces la identidad porcentual y similitud serían
ambas de 50%. Si en el mismo ejemplo, existen cinco posiciones más
donde están presenten substituciones conservativas, entonces el
porcentaje de identidad queda en 50%, pero el porcentaje de
similitud sería de 75% (15/20). Por consiguiente, en casos en los
que existen substituciones conservativas, la similitud porcentual
entre dos polipéptidos será mayor que la identidad porcentual entre
estos dos polímeros.
El término "secuencia de ácido nucleico" o
"molécula de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN
o ARN. El término abarca moléculas formadas por cualquiera de los
análogos de base conocidos de ADN y ARN tales como, pero sin estar
limitados a, 4-acetilcitosina,
8-hidroxi-N6-metiladenosina,
aziridinil-citosina, pseudoisocitosina,
5-(carboxihidroxilmetil)uracilo,
5-fluoruracilo, 5-bromouracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo,
5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,
inosina, N6-isopentenil-adenina,
1-metiladenina,
1-metilpseudouracilo,
1-metilguanina, 1-metilinosina,.
2,2-dimetil-guanina,
2-metiladenina, 2-metilguanina,
3-metilcitosina, 5-metilcitosina,
N6-metil-adenosina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo,
beta-D-manosil-queosina,
5'-metoxicarbonil-metiluracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
éster metílico del ácido
uracil-5-oxiacético, ácido
uracil-5-oxiacético, oxibutoxosima,
pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, éster metílico del ácido
N-uracil-5-oxiacético,
ácido
N-uracil-5-oxiacético,
pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y
2,6-diaminopurina.
El término "de origen natural" o
"nativo" cuando se emplea en conexión con materiales biológicos
tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células
huésped, y similares, se refiere a materiales que se encuentran en
la naturaleza y no son manipulados por el hombre. De manera similar,
"de origen no natural" o "no nativo" tal como se los
emplea aquí, se refieren a materiales que no se encuentran en la
naturaleza, o que han sido estructuralmente modificados o
sintetizados por el hombre.
El término "unido operativamente" tal como
se lo utiliza aquí, hace referencia a una disposición de secuencias
de flanqueo en donde las secuencias de flanqueo así descriptas están
configuradas o ensambladas de modo tal de que cumplan con su función
usual. Por consiguiente, una secuencia de flanqueo unida
operativamente a una secuencia de codificación puede tener la
capacidad de llevar a cabo la replicación, la transcripción y/o
traducción de la secuencia de codificación. Por ejemplo, una
secuencia de codificación, está operativamente unida a un promotor
cuando el promotor tiene la capacidad de dirigir la transcripción de
dicha secuencia de codificación. No es necesario que una secuencia
de flanqueo sea contigua con la secuencia de codificación, siempre
que funcione correctamente. Por lo tanto, por ejemplo, pueden estar
presentes secuencias intervinientes no traducidas pero transcriptas
entre una secuencia de promotor y la secuencia de codificación,
pudiendo todavía ser considerada la secuencia de promotor "unida
operativamente" a la secuencia de codificación.
El término "cantidad efectiva" y "cantidad
terapéuticamente efectiva" se refiere en cada caso a la cantidad
de un polipéptido VGF utilizada para sustentar un nivel observable
de una o más actividades biológicas de los polipéptidos VGF como se
han descripto aquí.
El término "vehículo farmacéuticamente
aceptable" o "vehículo fisiológicamente aceptable" tal como
se lo emplea aquí hace referencia a uno o más materiales de
formulación adecuados para lograr o intensificar la transferencia
del polipéptido VGF o agentes de unión selectivos respecto de VGF
como una composición farmacéutica.
El término "agente de unión selectivo" se
refiere a una molécula o moléculas que tienen especificidad para un
polipéptido VGF. Tal como se los emplea aquí, los términos
"específico" y "especificad" se refieren a la capacidad de
los agentes de unión selectivos a unirse a polipéptidos VGF y de no
unirse a polipéptidos que no son VGF. Se apreciará, sin embargo, que
los agentes de unión selectivos, pueden también acoplarse a
ortólogos de VGF.
El término "transducción" se emplea para
hacer referencia a la transferencia de genes desde una bacteria a
otra, usualmente mediante un fago. "Transducción" se refiere
también a la adquisición y transferencia de secuencias celulares
eucarióticas por medio de virus.
El término "transfección" es utilizado para
hacer referencia a la incorporación de ADN extraño o exógeno por
parte de una célula huésped, habiendo sido "transfectada" una
célula cuando el ADN exógeno ha sido introducido dentro de la
membrana celular. Son bien conocidas en la especialidad una
pluralidad de técnicas de transfección y se dan a conocer en la
presente. Véase, por ejemplo, Graham y otro(s), 1973,
Virology, 52: 456; Sambrook y otro(s), Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories,
1989), Davis y otro(s), Basic Methods in Molecular
Biology (Elsevier, 1986); y Chu y otro(s), 1981,
Gene, 13: 167. Tales técnicas pueden ser utilizadas para
introducir una o más porciones de ADN exógeno en células huésped
adecuadas.
El término "transformación" tal como es
empleado aquí se refiere a un cambio en algunas de las
características genéticas de la célula, y una célula ha sido
transformada cuando ha sido modificada para que contenga un nuevo
ADN. Por ejemplo, una célula es transformada en el caso de que esté
genéticamente modificada respecto de su estado nativo. A
continuación de la transfección o transducción, el ADN transformante
puede recombinarse con aquél de la célula por integración física en
un cromosoma de la célula, puede ser mantenido transitoriamente como
un elemento episomal sin ser replicado, o puede replicarse
independientemente como un plásmido. Se considera que una célula ha
sido transformada de modo estable cuando el ADN es replicado con la
división de la célula.
Las modificaciones conservativas a la secuencia
de aminoácidos de un polipéptido VGF producirá un polipéptido que
tiene características funcionales y químicas similares a aquéllas
del polipéptido VGF. Por el contrario, se pueden lograr
modificaciones substanciales en las características funcionales y/o
químicas de los polipéptidos VGF mediante la selección de
substituciones en la secuencia de aminoácidos del polipéptido VGF
que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento
de (a) la estructura del armazón molecular en el área de
substitución, por ejemplo, como una conformación laminar o
helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio
diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral.
Por ejemplo, una "substitución de aminoácido
conservativa" puede implicar una substitución de un residuo de
aminoácido nativo por un residuo normativo de modo tal de que exista
poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo de
aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el
polipéptido puede ser también substituido con alanina, como ha sido
descripto previamente en el caso de "mutagénesis de escaneo de
alanina".
Las substituciones de aminoácidos conservativas
abarcan también residuos de aminoácido que no se presentan
naturalmente que son incorporados típicamente por síntesis de
péptidos química en vez de síntesis en sistemas biológicos. Estos
incluyen peptidomiméticos, y otras formas revertidas o invertidas de
porciones de aminoácido.
Los residuos que se presentan naturalmente pueden
ser divididos en clases en base a propiedades de cadena lateral
comunes:
1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu.
Ile;
2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr;
3) ácidos: Asp. Glu;
4) básicos: Asn, Gln, Hls, Lys, Arg;
5) residuos que influencian la orientación de
cadena: Gly, Pro; y
6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Por ejemplo, las substituciones no conservativas
pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases
por un miembro de otra clase. Tales residuos substituidos pueden ser
introducidos en regiones de un polipéptido de VGF que son homólogas
con otros ortólogos de polipéptido VGF, o en las regiones no
homólogas de la molécula.
Al efectuar tales cambios, puede ser considerado
el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido le ha
sido asignado un índice hidropático sobre la base de su
hidrofobicidad y características de carga. Los índices hidropáticos
son: isoleucina (+ 4,5); valina (+ 4,2); leucina (+3,8);
fenilalanina (+ 2,8); cisterna/cistina (+ 2,5); metionina (+ 1,9);
alanina (+ 1,8); glicina (- 0,4); treonina (- 0,7); serina (- 0,8):
triptofano (- 0,9); tirosina (- 1,3); prolina (- 1,6); histidina (-
3,2); glutamato (- 0,4); glutamina (- 3,5); aspartato (- 3,5);
asparagina (- 3,5); lisina (- 3,9); y arginina (- 4,5).
La importancia del índice de hidropatía de los
aminoácidos en conferir función biológica interactiva sobre una
proteína es generalmente comprendida en la especialidad (Kyte y
otro(s), 1962, J. Mol. Biol., 157:
105-31). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser
substituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o puntaje de
hidropatía similar y continúan reteniendo una actividad biológica
similar. Al realizar cambios en base al índice de hidropatía, es
preferida la substitución de aminoácidos cuyos índices de hidropatía
se encuentran dentro de \pm 2, siendo particularmente preferidos
aquéllos que se encuentran dentro de \pm 1, y son aún más
particularmente preferidos aquéllos dentro de \pm 0,5.
En la especialidad es también comprendido que la
substitución de aminoácidos similares puede ser realizada
efectivamente sobre la base de la hidrofobicidad, particularmente en
los casos en que la proteína o péptido equivalentes desde un punto
de vista biológico y funcional creados por este medio están
destinados a ser utilizados en realizaciones inmunológicas, como es
el presente caso. La máxima hidrofobicidad promedio local de una
proteína, como está determinada por la hidrofobicidad de sus
aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y
antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la
proteína.
Los siguientes valores de hidrofobicidad han sido
asignados a estos residuos de aminoácidos: arginina (+ 3,0); lisina
(+ 3,0); aspartato (+ 3,0); glutamato (+ 3,0 \pm1); serina (+
0,3); asparagina (+ 0,2); glutamina (+ 0,2); glicina (0); treonina
(-0,4); prolina (- 0,5 \pm1); alanina (- 0,5); histidina (- 0,5);
cisterna (- 1,0); metionina (- 1,3); valina (- 1,5); leucina (-
1,8); isoleucina (-1,6); tirosina (- 2,3); fenilalanina (- 2,5); y
triptofano (- 3,4). Al realizar cambios basados en valores de
hidrofobicidad similares, se prefiere la substitución de aminoácidos
cuyos valores de hidrofobicidad se encuentran dentro de \pm 2,
siendo particularmente preferidos aquéllos que se encuentran dentro
de \pm 1, y son aún más particularmente preferidos aquéllos dentro
de \pm 0,5. Se pueden también identificar epítopos procedentes de
secuencias de aminoácidos primarios sobre la base de la
hidrofobicidad. A estas regiones se hace referencia también como
"regiones nucleares epitópicas".
Las substituciones de aminoácido deseadas (ya
sean conservativas o no conservativas) puede ser determinadas por
aquéllos con conocimientos en la especialidad en el momento que
tales substituciones son deseadas. Por ejemplo, las substituciones
de aminoácidos pueden ser empleadas para identificar residuos
importantes del polipéptido VGF, o para incrementar o reducir la
afinidad de los polipéptidos VGF descriptos en la presente. En la
Tabla II se exponen substituciones de aminoácidos ilustrativas.
| Substituciones de aminoácidos | ||
| Residuos originales | Substituciones ilustrativas | Substituciones preferidas |
| Ala | Val, Leu, Ile | Val |
| Arg | Lys, Gln, Asn | Lys |
| Asn | Gln | Gln |
| Asp | Glu | Glu |
| Cys | Ser, Ala | Ser |
| Gln | Asn | Asn |
| Glu | Asp | Asp |
| Gly | Pro, Ala | Ala |
| His | Asn, Gln, Lys, Arg | Arg |
| Ile | Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina | Leu |
| Leu | Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe | Ile |
| Lys | Arg, ácido 1,4-diamino-butírico, Gln, Asn | Arg |
| Met | Leu, Phe, Ile | Leu |
| Phe | Leu, Val, Ile, Ala, Tyr | Leu |
| Pro | Ala | Gly |
| Ser | Thr, Ala, Cys | Thr |
| Thr | Ser | Ser |
| Trp | Tyr, Phe | Tyr |
| Tyr | Tyr, Phe, Thr, Ser | Phe |
| Val | Ile, Met, Leu, Phe, Ala, norleucina | Leu |
Un profesional con experiencia será capaz de
determinar variantes adecuadas de polipéptido VGF utilizando
técnicas bien conocidas. Para identificar áreas apropiadas de la
molécula que puedan ser cambiadas sin destruir la actividad
biológica, una persona con conocimientos en la especialidad puede
seleccionar áreas específicas que no se pensaba que eran importantes
a los fines de la actividad. Por ejemplo, cuando son conocidos
polipéptidos con actividades similares que provienen de las mismas
especies o de otras especies, una persona con conocimientos en la
especialidad puede comparar la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido VGF con tales polipéptidos similares. Can tal
comparación, se pueden identificar residuos y porciones de las
moléculas que son conservadas entres polipéptidos similares. Se
apreciará que sería menos probable que los cambios en áreas de la
molécula de VGF que no son conservadas entre polipéptidos similares.
Se apreciará que cambios en áreas de la molécula de VGF que no son
conservadas respecto de tales polipéptidos similares sería mucho
menos probable que afecten adversamente la actividad biológica y/o
la estructura de un polipéptido VGF. Una persona con conocimientos
en la especialidad sabría también que, incluso en regiones
relativamente conservadas, uno puede sustituir aminoácidos
químicamente similares por los residuos que se presentan
naturalmente reteniendo a la vez actividad (substituciones de
aminoácidos conservativas). Por consiguiente, incluso áreas que
pueden ser importantes para la actividad biológica o para la
estructura pueden ser sometidas a substituciones de aminoácidos
conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar
adversamente la estructura de polipéptido.
Adicionalmente, una persona con conocimientos en
la especialidad puede reconsiderar estudios de función de estructura
que identifican residuos en polipéptidos similares que son
importantes para la actividad y estructura. En vista de tal
comparación, se puede predecir la importancia de residuos de
aminoácidos en un polipéptido VGF que corresponde a residuos de
aminoácido que son importantes para la actividad o estructura en
polipéptidos similares. Una persona con conocimientos en la
especialidad puede optar por substituciones de aminoácidos
químicamente similares para tales residuos de aminoácidos
importantes predichos de polipéptidos VGF.
Una persona con conocimientos en la especialidad
puede también analizar la estructura tridimensional y la secuencia
de aminoácidos en relación con la estructura en polipéptidos
similares. En vista de tal información, una persona con
conocimientos en la especialidad puede predecir el alineamiento de
residuos de aminoácidos del polipéptido de VGF con respecto a su
estructura tridimensional. Una persona con conocimientos en la
especialidad puede optar por no hacer cambios radicales a los
residuos de aminoácido que se predijo que estarían sobre la
superficie de la proteína, debido a que tales residuos pueden estar
involucrados en importantes interacciones con otras moléculas.
Además, una persona con conocimientos en la especialidad puede
generar variantes de prueba que contengan una única substitución de
aminoácido en cada residuo de aminoácido. Las variantes podrían ser
rastreadas utilizando ensayos de actividad conocidos por aquéllos
con experiencia en la especialidad. Tales variantes podrían ser
utilizadas para reunir información acerca de variantes adecuadas.
Por ejemplo, si se descubre que un cambio a un residuo de aminoácido
en particular da como resultado actividad destruida, o
indeseablemente reducida, o inadecuada, las variantes con tal cambio
deberían ser evitadas. En otras palabras, en base a la información a
la información reunida de tales experimentos de rutina, una persona
con conocimientos en la especialidad puede determinar fácilmente los
aminoácidos en el caso de los cuales deberán ser evitadas otras
substituciones, ya sea solas, o en combinación con otras
mutaciones.
Una variedad de publicaciones científicas han
sido dedicadas a la predicción de estructura secundaria. Véase
Moult, 1996, Curr. Opin. Biotechnol., 7:
422-27; Chou y otro(s), 1974,
Biochemistry, 13: 222-45; Chou y
otro(s), 1974, Biochemistry, 113:
211-22; Chou y otro(s), 1978, Adv.
Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-48;
Chou y otro(s), 1978, Ann. Rev. Biochem., 47:
251-276; y Chou y otro(s), 1979, Biophys.
J, 26: 367-84. Además, se pueden obtener
actualmente programas de computadora para ayudar en la predicción de
estructura secundaria. Un método para predecir estructura secundaria
se basa en el modelado por homología. Por ejemplo, dos polipéptidos
o proteínas que tienen una identidad de secuencia de más de 30%, o
similitud mayor de 40%, presentan a menudo topologías de estructura
similares. El desarrollo reciente de la base de datos estructural de
proteínas (PDB) ha proporcionado mayor posibilidad de predicción de
estructura secundaria, incluyendo el número potencial de pliegues
dentro de la estructura de un polipéptido o proteína. Véase Holm y
otro(s), 1999, Nucleic Acids Res., 27:
244-47. Se ha sugerido que existe un número limitado
de pliegues en un polipéptido o proteína dados y que una vez que se
ha resuelto un número crítico de estructuras, la predicción
estructural se hará muchísimo más sencilla (Brenner y
otro(s), 1997, Curr. Opin. Struct. Biol., 7:
369-76).
Métodos adicionales para predecir estructura
secundaria incluyen "enhebrado" ["threading"] (Jones,
1997, Curr. Opin. Struct. Biol., 7: 377-87;
Sippi y otro(s), 1996, Structure, 4:
15-19); "análisis de perfil" (Bowie y
otro(s), 1991, Science, 253: 164-70;
Gribskov y otro(s), 1990, Methods Enzymol., 183:
146-59; Gribskov y otro(s), 1987, Proc.
Nat. Acad. Sci. U.S.A., 84: 4355-58); y
"enlace evolutivo" (véase Holm y otro(s), supra;
y Brenner y otro(s), supra).
Las variantes de polipéptido VGF preferidas
incluyen variantes de glicosilación en las cuales el número y/o el
tipo de sitios de glicosilación han sido alterados en comparación
con la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos VGF de la
presente invención. En una realización, las variantes de polipéptido
VGF comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación
con unión en N que la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos
VGF de la presente invención. Un sitio de glicosilación con unión en
N se caracteriza por la secuencia
Asn-X-Ser o
Asn-X-Thr, en donde el residuo de
aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de
aminoácido excepto prolina. La substitución de residuos de
aminoácidos para generar esta secuencia proporciona un nuevo sitio
potencial para la adición de una cadena de carbohidrato con unión en
N. Alternativamente, las substituciones que eliminan esta secuencia
eliminarán una cadena de carbohidrato con unión en N existente.
También se proporciona un reordenamiento de cadenas de carbohidrato
con unión en N en donde uno o más sitios de glicosilación con
enlace en N (típicamente aquéllos que son de existencia natural) son
eliminados y son creados uno o más sitios con enlace en N nuevos.
Variantes adicionales preferidas de VGF incluyen variantes de
cisteína, en donde uno o más residuos de cisteína son delecionados o
substituidos con otro aminoácido (por ejemplo, serina) en
comparación con la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos VGF
de la presente invención. Las variantes de cisteína son útiles
cuando los polipéptidos VGF deben ser replegados para obtener una
conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento
de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína poseen
generalmente menos residuos de cisteína que la proteína nativa, y
típicamente tienen un número par para minimizar las interacciones
que resultan de las cisternas no
apareadas.
apareadas.
Además, los polipéptidos pueden estar fusionados
a un polipéptido homólogo para formar un homodímero o a un
polipéptido heterólogo para formar un heterodímero. Los péptidos y
polipéptidos heterólogos incluyen, pero sin estar limitados a: un
epítopo para prever la detección y/o aislamiento de un polipéptido
VGF de fusión; una proteína de receptor transmembranal o una porción
de la misma, tal como un dominio extracelular o un dominio
transmembranal e intracelular; un ligando o una porción del mismo
que se una a una proteína de receptor transmembranal; una enzima o
porción de la misma que sea catalíticamente activa, un polipéptido o
péptido que promueva la oligomerización, tal como un dominio de
"cierre de cremallera" ["zipper"] de leucina; un
polipéptido o péptido que aumente la estabilidad, tal como una
región constante de inmunoglobulina; y un polipéptido que tenga una
actividad terapéutica diferente de los polipéptidos VGF de la
presente invención.
Las fusiones pueden ser llevadas a cabo ya sea en
el amino-término o en el
carboxi-término de un polipéptido VGF. Las fusiones
pueden ser directas sin molécula de linker o adaptador o puede tener
lugar a través de una molécula de linker o adaptador. Una molécula
de linker o adaptador puede ser uno o más residuos de aminoácidos,
típicamente de desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50
residuos de aminoácidos. Una molécula de linker o adaptador puede
ser también diseñada con un sitio de escisión para una endonucleasa
de restricción de ADN o para una proteasa previendo la separación de
las partes fusionadas. Se apreciará que una vez construidos, los
polipéptidos de fusión pueden ser derivatizados de acuerdo con los
métodos descriptos en la presente.
En otra realización de la invención, un
polipéptido VGF es fusionado a uno o más dominios de una región Fc
de IgC humano. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente
independientes, un dominio variable conocido como "Fab", que se
une con antígeno, y un dominio constante conocido como "Fc",
que está involucrado en funciones de efector tales como activación
de complemento y ataque a células fagocíticas. Una Fc tiene una vida
media en suero larga, mientras que la Fab es de vida corta. Capon y
otro(s), 1989, Nature, 337: 525-31.
Cuando es construido conjuntamente con una proteína terapéutica, un
dominio de Fc puede proporcionar vida media más larga e incorporar
funciones tales como unión a receptor de Fc, unión a proteína A,
fijación de complemento, y probablemente incluso transferencia
placentaria. La Tabla III resume el uso de ciertas fusiones de Fc
conocidas en la especialidad.
\vskip1.000000\baselineskip
| Fusión de Fc con proteínas terapéuticas | |||
| Forma de Fc | Acompañante | Implicaciones terapéuticas | Referencia |
| de fusión | |||
| IgC1 | N-término de | Enfermedad de Hodgkin; | Patente Estadounidense Nº 5,480,981 |
| CD30-L | linfoma anaplásico; | ||
| leucemia de células T. | |||
| Fc\gamma2a murino | IL-10 | Antiinflamatorio; | Zheng y otro(s), 1995, J. Immunol., |
| rechazo de transplante. | 154: 5590-600 | ||
| IgCI | Receptor de | Shock séptico | Fisher y otro(s), N. Engl. J. Med., 334: |
| TNF | 1697-1702; Van Zee y otro(s), 1996, | ||
| J. Immunol., 156: 2221-30 | |||
| Ig3, IgA, IgM o IgE | Receptor de | Inflamación, | Patente Estadounidense Nº 5,808,029 |
| (excluyendo el | TNF | Trastornos autoinmunes | |
| primer dominio) | |||
| IgC1 | Receptor de | SIDA | Capon y otro(s), 1989, Nature, 337: |
| CD4 | 525-31 | ||
| IgC1, IgC3 | N-término de | Anticáncer; Antiviral | Harvill y otro(s), 1995, Immunotech. |
| IL-2 | 1: 95-105 | ||
| IgG1 | C-término de | Osteoartritis, | WO 97/23614 |
| OPG | Densidad ósea. | ||
| IgG1 | N-término de | Anti-obesidad | PCT/US 97/23183, presentada el 11 de |
| leptina | diciembre de 1997 | ||
| Ig C\gamma1 humano | CTLA-4 | Trastornos autoinmunes | Linsley, 1991, J. Exp. Med., 174: 561-89 |
En un ejemplo, una región de bisagra, de CH2, y
de CH3 de IgG humano, pueden fusionarse a ya sea el
amino-término o el carboxi-término
de los polipéptidos VGF utilizando métodos conocidos por el
profesional con experiencia. El polipéptido VGF de fusión resultante
puede ser purificado mediante el uso de una columna de afinidad de
proteína A. Se ha encontrado que los péptidos y proteínas fusionados
a una región Fc exhiben una vida media in vivo
substancialmente mayor que el homólogo sin fusionar. También, una
fusión a una región Fc permite la dimerización/multimerización del
polipéptido de fusión. La región Fc puede ser una región Fc que se
presenta naturalmente o puede estar alterada para mejorar ciertas
cualidades, tales como cualidades terapéuticas, tiempo de
circulación, o agregación reducida.
La identidad y similitud de polipéptidos
relacionados puede ser fácilmente calculada por métodos conocidos.
Tales métodos incluyen, pero sin estar limitados a, aquéllos
descriptos en Computational Molecular Biology (A. M. Lesk,
editor, Oxford University Press, 1988); Biocomputing: Informatics
and Genome Projects (D. W. Smith, editor, Academic Press, 1993);
Computer Análisis of Sequence Data (Parte 1, A. M. Griffin,
editor, Humana Press, 1994), G. von Heinle, Sequence Analysis in
Molecular Biology (Academic Press, 1987); Sequence Analysis
Primer (M. Gribskov y J. Devereaux, editores, M. Stockton Press,
1991); y Carillo y otro(s), 1988, SIAM J. Applied
Math.,
48: 1073.
48: 1073.
Los métodos preferidos para determinar la
identidad y/o similitud están diseñados para proporcionar el máximo
ajuste entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar
identidad y/o similitud se describen en programas de computación de
disponibilidad pública. Métodos de programa de computación
preferidos para determinar identidad y similitud entre dos
secuencias incluyen, pero sin estar limitados a, el paquete de
programa GCG, incluyendo GAP (Devereaux y otro(s), 1984,
Nucleic Acids Res., 12: 387; Genetics Computer Group,
University of Wisconsin, Madison, WI); BLASTP, y FASTA (Altschul y
otro(s), 1990, J. Mol. Biol., 215:
403-10). El programa BLASTX está a disposición del
público en el Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI) y
otras fuentes (Altschul y otro(s), BLAST Manual (NCB
NLM N1H, Bethesda, MD); Altschul y otro(s), 1980,
supra). Puede ser empleado también el bien conocido algoritmo
de Smith Watennan para determinar identidad.
Ciertos esquemas de alineamiento para alinear dos
secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado la coincidencia
de solo una corta región de dos secuencias, y esta pequeña región
alineada puede tener identidad de secuencia muy alta aun cuando no
exista ninguna relación significativa entre las dos secuencias de
longitud completa. En concordancia, en una realización preferida, el
método de alineación seleccionada (programa GAP) dará como resultado
un alineamiento que abarca al menos 50 aminoácidos contiguos de los
polipéptidos reivindicados.
Por ejemplo, utilizando el algoritmo de
computadora GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin,
Madison, WI), se alinean dos polipéptidos para los cuales se ha de
determinar la identidad de secuencia porcentual hasta obtener una
coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (la "amplitud
de coincidencia" ["matched span"], según es determinada por
el algoritmo). Se emplean en conjunción con el algoritmo una
penalización de la apertura de gap ["gap opening penalty"] (que
se calcula como 3 veces la diagonal promedio; siendo la "diagonal
promedio" el promedio de la diagonal de la matriz de comparación
que se está usando, la diagonal es el puntaje o número asignado a
cada coincidencia de aminoácido perfecta por la matriz de
comparación particular) y una penalización de extensión de gap
["gap extensión penalty"] (que es usualmente 0,1 vez la
penalización de la apertura de gap), así como también una matriz de
comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62. Es utilizada también una
matriz de comparación patrón por el algoritmo (véase Dayhoff y
otro(s), 5 Atlas of Protein Sequence and Structure
(suplemento 3, 1978) (matriz de comparación PAM 250); Henikoff y
otro(s), 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:
10915-19 (matriz de comparación BLOSUM 62).
Parámetros preferidos para comparación de
secuencia de polipéptidos incluyen los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol.
Biol., 48: 443-53;
matriz de comparación: BLOSUM 62 (Henikoff y
otro(s), supra);
penalización de gap: 12;
penalización de longitud de gap: 4;
umbral de similitud: 0.
El programa GAP es útil con los parámetros
anteriores. Los parámetros mencionados con anterioridad son los
parámetros de default para comparaciones de polipéptidos
(conjuntamente con no penalización para gaps finales) utilizando el
algoritmo GAP.
Pueden utilizarse otros algoritmos,
penalizaciones de la apertura de gap, penalizaciones de extensión de
gap, matrices de comparación, y umbrales de similitud ilustrativos,
incluyendo aquéllos expuestos en el Manual de Programa, Paquete
Wisconsin, Versión 9, septiembre de 1997. Las elecciones
particulares a ser realizadas resultarán obvias para aquéllos con
experiencia en la especialidad y dependerán de la comparación
específica que se vaya a realizar, tal como proteína respecto de
proteína, proteína respecto de ADN, y adicionalmente, si la
comparación es entre pares determinados de secuencias (en cuyo caso
son preferidos generalmente GAP o BestFit) o entre una secuencia y
una gran base de datos de secuencias (en cuyo caso se prefieren
FASTA o BLASTA).
Las moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido VGF puede ser obtenida fácilmente de una variedad de
maneras que incluyen, sin limitación, síntesis química, rastreo de
ADNc o bibliotecas genómicas, rastreo de bibliotecas de expresión,
y/o amplificación por PCR de ADNc.
Los métodos de ADN recombinante empleados en la
presente son generalmente aquéllos expuestos en Sambrook y
otro(s), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989) y Current Protocols in
Molecular Biology (Ausubel y otro(s), editores, Green
Publishers Inc. y Wiley and Sons, 1994).
Las moléculas de ácido nucleico que codifican la
secuencia de aminoácidos de polipéptidos VGF pueden ser
identificados por clonación de expresión que emplea la detección de
clones positivos en base a una propiedad de la proteína expresada.
Típicamente, las bibliotecas de ácido nucleico se rastrean mediante
la unión de un anticuerpo u otro acompañante de unión (por ejemplo,
receptor o ligando) a proteínas clonadas que son expresadas y
expuestas en una superficie de célula huésped. El anticuerpo o
acompañante de unión es modificado con un rótulo detectable para
identificar aquellas células que expresan el clon deseado.
Las técnicas de expresión recombinante llevadas a
cabo de acuerdo con las descripciones expuestas anteriormente pueden
ser continuadas para producir estos polinucleótidos y para expresar
los polipéptidos codificados. Por ejemplo, mediante la inserción de
una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido VGF en un vector apropiado; una
persona con conocimientos en la especialidad puede producir
fácilmente grandes cantidades de la secuencia de nucleótidos
deseada. Las secuencias pueden ser utilizadas entonces para generar
sondas de detección o cebadores de amplificación. Alternativamente,
un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido VGF puede ser insertado en un vector de expresión.
Mediante la introducción del vector de expresión en un huésped
apropiado, puede ser producido el polipéptido VGF codificado en
grandes cantidades.
Otro método para la obtención de una secuencia de
ácido nucleico adecuado es la reacción en cadena de polimerasa
(PCR). En este método, el ADNc es preparado a partir de
poli(A)+ARN o ARN total utilizando la enzima transcriptasa
inversa. Se agregan entonces dos cebadores al ADNc, típicamente
complementarios respecto de dos regiones separadas de ADNc que
codifican la secuencia de aminoácidos de un polipéptido VGF,
conjuntamente con una polimerasa tal como Taq polimerasa, y la
polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores.
Otros medios para la preparación de una molécula
de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido VGF es la síntesis química empleando métodos bien
conocidos por el profesional experimentado tales como aquéllos
descriptos en Engels y otro(s), 1989, Angew. Chem. Intl.
Ed. 28: 716-34. Estos métodos incluyen, entre
otros, el método de fosfotriéster, de fosforamidita, y de
H-fosfonato para la síntesis de ácido nucleico. Un
método preferido para tal síntesis química es la síntesis sobre
soporte de polímero utilizando química de fosforamidita standard.
Típicamente, el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido VGF será de una longitud de varios centenares de
nucleótidos. Los ácidos nucleicos de más de aproximadamente 100
nucleótidos pueden ser sintetizados en forma de varios fragmentos
utilizando estos métodos. Los fragmentos pueden ser luego ligados
entre sí para formar la secuencia de nucleótidos de longitud
completa de un gen de VGF. Usualmente, el fragmento de ADN que
codifica el amino-término del polipéptido tendrá un
ATG, que codifica un residuo de metionina. Esta metionina puede o no
estar presente en la forma madura del polipéptido VGF, dependiendo
de si el polipéptido producido en la célula huésped está diseñado
para ser secretado de aquella célula. Otros métodos conocidos por el
profesional experimentado pueden ser asimismo utilizados.
En ciertas realizaciones, variantes de ácido
nucleico contienen codones que han sido alterados para lograr
expresión óptima de un polipéptido VGF en una célula huésped dada.
Las alteraciones particulares de codones dependerán del polipéptido
VGF y de la célula huésped seleccionada para expresión. Tal
"optimización de codón" puede ser llevada a cabo mediante una
variedad de métodos, por ejemplo, mediante selección de codones que
son preferidos para empleo en genes altamente expresados en una
célula huésped dada. Pueden ser utilizados algoritmos de computadora
que incorporan tablas de frecuencia de codón tales como
"Eco_high.Cod" para preferencia de codón de genes bacterianos
altamente expresados y son provistos por el Paquete de la
Universidad de Wisconsin Versión 9.0 (Genetics Computer Group,
Madison, WI). Otras tablas de frecuencia de codón útiles incluyen
"Celegans_high.cod", "Celegans_low.cod",
"Drosophila_high.cod", "Human_high.cod",
"Maize_high.cod", y "Yeast_high.cod".
En algunos casos, puede ser deseable preparar
moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de polipéptidos
VGF. Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes pueden
ser producidas utilizando mutagénesis dirigida a sitio. La
amplificación por PCR, u otros métodos apropiados, donde el/los
cebador(es) tiene(n) las mutaciones deseadas (véase
Sambrook y otro(s), supra, y Ausubel y otro(s),
supra, para descripciones de técnicas de mutagénesis). La
síntesis química que utilizan métodos descriptos por Engels y
otro(s), supra, pueden también ser utilizados para
preparar tales variantes. Otros métodos conocidos por el profesional
experimentado pueden ser también usados.
Una molécula de ácido nucleico que codifica la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido VGF es insertada en un
vector de expresión adecuado utilizando técnicas de ligado
corrientes. El vector es elegido típicamente para que sea funcional
en la célula huésped particular (es decir, el vector es compatible
con la maquinaria de la célula huésped de modo tal que pueda tener
lugar la amplificación del gen y/o expresión del gen). Una molécula
de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido VGF puede ser amplificada/expresada en células huésped
procarióticas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o
eucarióticas. La selección de la célula huésped dependerá en parte
de si un polipéptido VGF debe ser modificado
post-translacionalmente (por ejemplo, glicosilado
y/o fosforilado). Si ese es el caso, son preferibles las células
huésped de levadura, de insecto, o de mamífero. Para una reseña de
vectores de expresión, véase Meth. Enz., volumen 185 (D. V.
Goeddel, editor, Academia Press, 1990).
Típicamente, vectores de expresión utilizados en
cualquiera de las células huésped contendrán secuencias para el
mantenimiento de plásmidos y para clonación y expresión de
secuencias de nucleótidos exógenas. Tales secuencias, a las que se
conoce colectivamente como "secuencias de flanqueo", incluirán
típicamente en ciertas realizaciones una o más de las siguientes
secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias
intensificadoras, un origen de replicación, una secuencia de
terminación de transcripción, una secuencia de intrón completa que
contiene un sitio de empalme de donor y aceptor, una secuencia de
codificación de una secuencia líder para secreción de polipéptido,
un sitio de unión de ribosoma, una secuencia de poliadenilación,
una región de polilinker para la inserción del ácido nucleico que
codifica al polipéptido a ser expresado, y un elemento de marcador
seleccionable. Cada una de estas secuencias es tratada más
adelante.
Opcionalmente, el vector puede contener un
secuencia de codificación de "tag", es decir, una molécula de
oligonucleótido ubicada en el 5'- o 3'-extremo de la
secuencia de codificación de polipéptido VGF; la secuencia de
oligonucleótido codifica poliHis (tal como hexaHis), u otro
"tag" tal como FLAG, HA (virus de la gripe de hemaglutinina), o
myc para los cuales existen anticuerpos obtenibles
comercialmente. Este tag está típicamente fusionado al polipéptido
después de expresión del polipéptido, y puede servir como un medio
para purificación de afinidad del polipéptido VGF procedente de la
célula huésped. La purificación de afinidad puede ser realizada, por
ejemplo, por cromatografía de columna utilizando anticuerpos contra
el tag como una matriz de afinidad. Opcionalmente, el tag puede ser
eliminado subsecuentemente del polipéptido VGF purificado por
diversos medios tales como utilizando ciertas peptidasas para
escisión.
Las secuencias de flanqueo pueden ser homólogas
(es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped),
heterólogas (es decir, de especies distintas de la especie o cepa de
la célula huésped), híbrida (es decir, una combinación de secuencias
de flanqueo procedentes de más de una fuente), o sintéticas, o las
secuencias de flanqueo pueden ser secuencias nativas que funcionan
normalmente para regular la expresión de polipéptido VGF. Como tal,
la fuente de una secuencia de flanqueo puede ser cualquier organismo
procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o
invertebrado, o cualquier vegetal, con la condición de que la
secuencia de flanqueo sea funcional en, y pueda ser activada por, la
maquinaria de la célula huésped.
Se pueden obtener secuencias de flanqueo útiles
por cualquiera de diversos métodos bien conocidos en la
especialidad. Las secuencias de flanqueo útiles en la presente
-distintas a las secuencias de flanqueo del gen de VGF- habrán sido
previamente identificadas por mapeo y/o por digestión con
endonucleasa de restricción y puede ser de este modo aislada de la
fuente de tejido apropiada usando las endonucleasas de restricción
adecuadas. En algunos casos, toda la secuencia de nucleótidos de una
secuencia de flanqueo puede ser conocida. En este caso, la secuencia
de flanqueo puede ser sintetizada empleando los métodos descriptos
en la presente para la síntesis o clonación de ácido nucleico.
En el caso de que solo una porción de la
secuencia de flanqueo sea conocida, la misma puede obtenerse
utilizando PCR y/o por rastreo de una biblioteca genómica con un
oligonucleótido y/o fragmento de secuencia de flanqueo adecuados
procedente de la misma u otra especie. En el caso de que la
secuencia de flanqueo no sea conocida, puede aislarse un fragmento
de ADN que contiene una secuencia de flanqueo a partir de un trozo
de ADN más grande que puede contener, por ejemplo, una secuencia de
codificación o incluso otro gen o genes. El aislamiento se puede
lograr por digestión con endonucleasa de restricción para producir
el fragmento de ADN apropiado seguida de aislamiento utilizando
purificación con gel de agarosa, cromatografía con columna Qiagen®
(Chatsworth, CA), u otros métodos conocidos por el profesional
experimentado. La selección de enzimas adecuadas para lograr este
propósito será perfectamente obvia para alguien con conocimientos
corrientes en la especialidad.
Un origen de replicación es típicamente una parte
de aquellos vectores de expresión procarióticos adquiridos
comercialmente y el origen ayuda en la amplificación del vector en
una célula huésped. Puede ser importante la amplificación del vector
hasta un cierto número de copias, en algunos casos, para la
expresión óptima de un polipéptido VGF. Si el vector de elección no
contiene un origen de sitio de replicación, se puede sintetizar
químicamente uno en base a una secuencia conocida, y ser ligado al
vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322
(New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de
las bacterias gramnegativas y diversos orígenes (por ejemplo, SV40,
polioma, adenovirus, virus de estomatitus vesicular (VSV), o
papilomavirus tales como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores
en células de mamífero. Generalmente, el origen del componente de
replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos
(por ejemplo, el origen SV40 es utilizado a menudo solo porque
contiene el promotor temprano).
Una secuencia de terminación de transcripción
está típicamente ubicada a 3' del extremo de una región de
codificación de un polipéptido y sirve para terminar la
transcripción. Usualmente, una secuencia de terminación de
transcripción en células procarióticas es un fragmento rico en
G-C seguido de una secuencia de
poli-T. Si bien la secuencia es fácilmente clonada a
partir de un biblioteca o incluso adquirida comercialmente como
parte de un vector, puede ser también fácilmente sintetizada
empleando métodos para síntesis de ácidos nucleicos tales como
aquéllos descriptos en la presente,
Un elemento de gen marcador seleccionable
codifica una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento
de un célula huésped desarrollada en un medio de cultivo. Los genes
marcadores de selección típicos codifican proteína que (a) confieren
resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo,
amplicilina, tetraciclina, o canamicina para células huésped
procarióticas, (b) complementa deficiencias auxotróficas de la
célula, o (c) suministran nutrientes críticos no obtenibles del
medio complejo. Marcadores seleccionables preferidos son el gen de
resistencia a la canamicina, el gen de resistencia a la amplicilina,
y el gen de resistencia a la tetraciclina. Puede ser también
utilizado un gen de resistencia a la neomicina para selección en
células huésped procarióticas y eucarióticas.
Pueden emplearse otros genes de selección para
amplificar el gen que será expresado. La amplificación es el proceso
en el cual los genes que se encuentran en mayor demanda para la
producción de una proteína crítica para el crecimiento son
reiterados en tándem dentro de los cromosomas de generaciones
sucesivas de células recombinantes. Ejemplos de marcadores
seleccionables adecuados para células de mamíferos incluyen
dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidin quinasa. Los
transformantes de células de mamífero son puestos bajo presión de
selección en donde solo los transformantes se adaptan
excepcionalmente a sobrevivir en virtud del gen de selección
presente en el vector. La presión de selección es impuesta
cultivando las células transformadas bajo condiciones en las cuales
la concentración de agente de selección en el medio es cambiado
sucesivamente, conduciendo con ello a la amplificación de tanto el
gen de selección como el ADN que codifica un polipéptido VGF. Como
un resultado, las cantidades incrementadas de polipéptido VGF son
sintetizadas a partir del ADN amplificado.
Un sitio de unión de ribosoma es necesario
usualmente para la iniciación de la traducción de ARNm y está
caracterizado por una secuencia de Shine-Dalgamo
(procariotas) o una secuencia de Kozak (eucariotas). El elemento
esta ubicado típicamente a 3' respecto del promotor y a 5' respecto
de la secuencia de codificación de un polipéptido VGF a ser
expresado. Las secuencias de Shine-Dalgamo es
variada, pero es típicamente una polipurina (es decir, que tiene un
elevado contenido de A-G). Han sido identificadas
muchas secuencias de Shine-Dalgamo, cada una de las
cuales puede ser fácilmente sintetizada utilizando métodos expuestos
en la presente y utilizados en un vector procariótico.
Una secuencia líder, o de señal, puede ser
utilizada para dirigir un polipéptido VGF hacia fuera de la célula
huésped. Típicamente, una secuencia de nucleótido que codifica la
secuencia de señal esta ubicada en la región de codificación de la
molécula de ácido nucleico de VGF, o directamente en el extremo 5'
de la región de codificación del polipéptido VGF. Han sido
identificadas muchas secuencias de señal, y cualquiera de aquéllas
que sean funcionales en la célula huésped elegida pueden ser usadas
en conjunción con una molécula de ácido nucleico de VGF. Por
consiguiente, una secuencia de señal puede ser homóloga (de origen
natural) o heteróloga respecto de la molécula de ácido nucleico de
VGF. Adicionalmente, una secuencia de señal puede ser sintetizada
químicamente empleando métodos descriptos aquí. En la mayoría de los
casos, la secreción de un polipéptido VGF desde la célula huésped a
través de la presencia de un péptido dará como resultado la
eliminación del péptido de la señal del polipéptido VGF secretado.
La secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede
ser una parte de molécula de ácido nucleico de VGF que está
insertada en el vector.
Una secuencia de nucleótido que codifique una
secuencia de señal de polipéptido VGF nativa puede ser acoplada a
una región de codificación de polipéptido VGF o una secuencia de
nucleótido que codifique una secuencia de señal de polipéptido VGF
heteróloga puede ser acoplada a una región de codificación de
polipéptido VGF. La secuencia de señal heteróloga seleccionada
debería ser una que sea reconocida y procesada, es decir, escindida
por una peptidasa de señal, por la célula huésped. En el caso de
células procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de
señal de polipéptido VGF nativa, la secuencia de señal es
substituida por una secuencia de señal procariótica seleccionada,
por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, o
líderes de enterotoxina II estables al calor. En el caso de
secreción de levadura, la secuencia de señal de polipéptido VGF
nativa puede ser substituida por la invertasa de levadura, factor
alfa, o líderes de fosfatasa ácida. En expresión de célula de
mamíferos la secuencia de señal nativa es satisfactoria, aunque
pueden ser adecuadas otras secuencias de señal de mamíferos.
En algunos casos, tales como cuando se desea
glicosilación en un sistema de expresión de célula huésped
procariótica, se pueden manipular las diversas presecuencias para
mejorar la glicosilación o rendimiento. Por ejemplo, se puede
alterar el sitio de escisión de peptidasa de un péptido de señal
particular, o adicionar pro-secuencias, que pueden
también afectar la glicosilación. El producto de proteína final
puede tener, en la posición -1 (respecto del primer aminoácido de
la proteína madura), uno o más aminoácidos adicionales incidentes a
la expresión, que pueden no haber sido totalmente eliminados. Por
ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos
residuos de aminoácido encontrados en el sitio de escisión de
peptidasa, acoplados al amino-término.
Alternativamente, el uso de algunos sitios de escisión de enzima
puede dar como resultado una forma ligeramente truncada del
polipéptido VGF, si la enzima corta tal área dentro del polipéptido
maduro.
En muchos casos, la transcripción de una molécula
de ácido nucleico es incrementada por la presencia de uno o más
intrones en el vector; esto es particularmente cierto en el caso de
que un polipéptido sea producido en células huésped eucarióticas,
especialmente células huésped de mamífero. Los intrones empleados
pueden darse naturalmente dentro del gen de VGF especialmente en los
casos en que el gen usado sea una secuencia genómica de longitud
completa o un fragmento de la misma. Cuando el intrón no se da
naturalmente dentro del gen (tal como es el caso en la mayoría de
los ADNc's), el intrón puede ser obtenido de otra fuente. La
posición del intrón con respecto a las secuencias de flanqueo y al
gen de VGF es generalmente importante, debido a que el intrón debe
ser transcripto para que sea efectivo. Así, cuando una molécula de
ADNc de VGF está siendo transcripta, la posición preferida para el
intrón es de 3' respecto del sitio de comienzo de la transcripción y
de 5' respecto de la secuencia de terminación de transcripción de
poli-A. Preferentemente, el intrón o intrones
estarán ubicados sobre un lado o el otro (es decir, 5' ó 3') del
ADNc de modo tal que no interrumpa las secuencias de codificación.
Puede ser usado cualquier intrón procedente de cualquier fuente,
incluyendo organismos virales, procarióticos y eucarióticos (vegetal
o animal), con la condición de que sea compatible con la célula
huésped dentro de la cual está insertado. También se incluyen aquí
intrones sintéticos. Opcionalmente, más de un intrón puede ser
utilizado en el vector.
Los vectores de expresión y clonación contendrán
típicamente un promotor que sea reconocido por el organismo huésped
y esté unido operativamente con la molécula que codifica al
polipéptido VGF. Los promotores son secuencias no transcriptas
ubicadas corriente arriba (es decir, 5') respecto del codón de
inicio de un gen estructural (generalmente dentro de
aproximadamente 100 a 1000 pb) que controla la transcripción del gen
estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de
dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los
promotores inducibles inician niveles mayores de transcripción de
ADN bajo su control en respuesta a algunos cambios en las
condiciones de cultivo, tales como la presencia o ausencia de un
nutriente o un cambio de temperatura. Los promotores constitutivos,
por otra parte, inician producción de producto de gen continua, es
decir, existe poco o ningún control sobre la expresión de gen. Es
bien conocido un gran número de promotores, reconocidos por una
variedad de células huéspedes potenciales. Un promotor adecuado está
vinculado operativamente con el ADN que codifica al polipéptido VGF
eliminando al promotor del ADN de fuente por digestión con enzima de
restricción e insertando la secuencia de promotor deseada en el
vector. La secuencia de promotor de VGF nativa puede ser utilizada
para dirigir la amplificación y/o la expresión de una molécula de
ácido nucleico de VGF. Se prefiere un promotor heterólogo, sin
embargo, si permite mayor transcripción y mayores rendimientos de
la proteína expresada en comparación con el promotor nativo, y si es
compatible con el sistema de célula huésped que ha sido seleccionado
para uso.
Promotores adecuados para uso con huéspedes
procarióticos incluyen sistemas de promotor de
beta-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina; un
sistema de promotor de triptofano (trp); y promotores híbridos tales
como el promotor tac. Otros promotores bacterianos conocidos son
también adecuados. Sus secuencias han sido publicadas, haciendo
posible con ello que alguien con conocimientos en la especialidad
las acople a la secuencia de ADN deseada, utilizando linkers o
adaptadores según se requiera para proporcionar cualesquiera sitios
útiles de restricción.
Promotores adecuados para uso con huéspedes de
levadura son bien conocidos en la especialidad. Los intensificadores
de levadura son usados ventajosamente con promotores de levadura.
Promotores adecuados para uso con células huéspedes de mamíferos son
bien conocidos en la especialidad e incluyen, pero sin estar
limitados a, aquéllos obtenidos a partir de los genomas de virus
tales como virus de polioma, virus de fowlpox, adenovirus (tal como
adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar,
citomegalovirus, retrovirus, virus de hepatitis B y del modo más
preferido virus Simian 40 (SV40). Otros promotores de mamíferos
adecuados incluyen promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo,
promotores de choque térmico y el promotor de actina.
Promotores adicionales que pueden ser de interés
en el control de expresión de gen de VGF incluyen, pero sin estar
limitados a: la región de promotor temprana de SV40 (Bemoist y
Chambon, 1981, Nature, 290: 304-10); el
promotor CMV; el promotor contenido en la repetición de 3' terminal
largo de virus de sarcoma de Rous (Yamamoto y otro(s), 1980,
Cell, 22: 787-97); el promotor de timidin
quinasa del herpes (Wagner y otro(s), 1981, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 78: 1444-45); las secuencias
regulatorias del gen de metalotionina (Brinster y otro(s),
1982, Nature, 298: 39-42); vectores de
expresión procarióticos tales como el promotor de
beta-lactamasa (Villa-Kamaroff y
otro(s), 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:
3727-31); o el promotor de tac (DeBoer y
otro(s), 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:
21-25). También de interés son las siguientes
regiones de control transcripcionales de animal, que exhiben
especificidad de tejido y han sido utilizadas en animales
transgénicos: la región de control del gen de elastasa I que es
activa en las células acinares pancreáticas (Swift y
otro(s), 1984, Cell, 38: 639-46; Omitz
y otro(s), 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol., 50: 399-409 (1986); MacDonald, 1987,
Hepatology, 7: 425-515); la región de control
del gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas
(Hanahan, 1985, Nature, 315: 115-22); la
región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en
células linfoides (Grosschedl y otro(s), 1984, Cell,
38: 647-58: Adames y otro(s), 1985,
Nature, 318: 533-38; Alexander y
otro(s), 1987, Mol. Cell. Biol., 7:
1436-44); la región de control de virus de tumor
mamario de ratón que es activo en células testiculares, mamarias,
linfoides y mastocitos (Leder y otro(s), 1986, Cell,
45: 485-95); la región de control del gen de
albúmina que es activa en el hígado (Pinkart y otro(s), 1987,
Genes and Devel, 1: 288-76); la región de
control del gen de
alfa-feto-proteína que es activa en
el hígado (Krumlauf y otro(s), 1985, Mol. Cell. Biol.,
5: 1639-48; Hammer y otro(s), 1987,
Science, 235: 53-58); la región de control
del gen de alfa 1-antitripsina que es activa en el
hígado (Kelsey y otro(s), 1987, Genes and Devel, 1:
161-71); la región de control del gen de
beta-globina que es activa en células mieloides
(Mogram y otro(s), 1985, Nature, 315:
338-40; Kollias y otro(s), 1986, Cell,
46: 89-94); la región de control del gen de proteína
básica de mielina que es activa en células de oligodendrocitos en
el cerebro (Readhead y otro(s), 1987, Cell, 48:
703-12); la región de control del gen de cadena
ligera de miosina 2 que es activa en musculatura esqueletal (Sani,
1985, Nature, 314: 283-88); y la región de
control del gen de hormona de liberación gonadotrópica que es activa
en el hipotálamo (Mason y otro(s), 1986, Science,
234: 1372-78).
Puede ser insertada en el vector una secuencia
intensificadora para incrementar la transcripción en eucariotas
superiores de un ADN que codifica un polipéptido VGF.
Intensificadores son elementos de ADN cis-actuantes,
usualmente de aproximadamente 10-300 pb de
longitud, que actúan sobre el promotor para incrementar la
transcripción. Los intensificadores son relativamente independientes
de la orientación y de la posición. Han sido halladas en 5' y 3'
respecto de la unidad de transcripción. Son conocidas diversas
secuencias de intensificación disponibles de genes de mamíferos (por
ejemplo, globina, elastasa, albúmina,
alfa-feto-proteína, e insulina).
Típicamente, sin embargo, se usará un intensificador procedente de
un virus. El intensificador de SV40, el intensificador de promotor
temprano de citomegalovirus, el intensificador de polioma, y los
intensificadores de adenovirus son elementos de intensificación
ilustrativos para la activación de promotores eucarióticos. Si bien
un intensificador puede ser empalmado dentro un vector en una
posición 5' ó 3' respecto de una molécula de ácido nucleico de VGF,
está ubicada típicamente en el sitio 5' desde el promotor.
Los vectores de expresión pueden ser construidos
a partir de un vector inicial tal como un vector disponible en el
mercado. Tales vectores pueden o no contener todas las secuencias de
flanqueo deseadas. En los casos de que una o más de las secuencias
de flanqueo descriptas aquí no estén ya presentes en el vector, las
mismas pueden ser obtenidas individualmente y ligadas al vector. Los
métodos empleados para la obtención de cada una de las secuencias
de flanqueo son bien conocidos por aquéllos con experiencia en la
especialidad.
Vectores preferidos son aquéllos que son
compatibles con células huésped bacterianas, de insectos, y de
mamíferos. Tales vectores incluyen, entre otros, pCR11, pCR3, y
pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla,
CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA),
pETL (BlueBacil, Invitrogen), pDSR-alfa (Publicación
PCT Nº 90/14653) y pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand
Island, NY).
Vectores adicionales adecuados incluyen, pero sin
estar limitados a, cósmicos, plásmidos, o virus modificados, pero se
apreciará que el sistema de vector debe ser compatible con la célula
huésped seleccionada. Tales vectores incluyen, pero sin estar
limitados a, plásmidos tales como derivados de plásmido Bluescript®
(un fagémido a base de CoIE1 con un elevado número de copias,
Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), plásmidos de clonación de
PCR diseñados para clonar productos de PCR amplificados por Taq (por
ejemplo, TOPO® TA Cloning® Kit, derivados de plásmido PCR2.1®,
Invitrogen, Carlsbad, CA), y vectores de mamíferos, de levadura o
virales tales como sistema de expresión de baculovirus (derivados de
plásmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA).
Después de que el vector haya sido construido y
de que una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido
VGF haya sido ionsertada en el sitio apropiado del vector, el vector
completo puede ser insertado en una célula huésped adecuada a los
fines de amplificación y/o de la expresión de polipéptido. La
transformación de un vector de expresión para un polipéptido VGF en
una célula huésped seleccionada puede lograrse mediante métodos bien
conocidos incluyendo métodos tales como transfección, infección,
cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección,
método de DEAE-dextrano, u otras técnicas
conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo
de célula huésped a ser usada. Estos métodos y otros métodos
adecuados son bien conocidos por el profesional experimentado, y se
exponen, por ejemplo, en Sammbrook y otro(s),
supra.
Las células huésped pueden ser células huésped
procarióticas (tales como E. coli) o células huésped
eucarióticas (tales como una célula de levadura, de insecto, o de
vertebrado). La célula huésped, cuando es cultivada en condiciones
apropiadas, sintetiza un polipéptido VGF que puede ser recolectado
seguidamente del medio de cultivo (si la célula huésped lo segrega
dentro del medio) o directamente de la célula huésped que la
produce (si no es secretado). La selección de una célula huésped
apropiada dependerá de varios factores, tales como niveles de
expresión deseados, modificaciones de polipéptido que son deseables
o necesarias para la actividad (tal como glicosilación o
fosforilación) y facilidad de plegado en una molécula biológicamente
activa.
Son conocidas en la especialidad una pluralidad
de células huésped adecuadas y muchas se pueden obtener en la
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. Como ejemplos
se pueden citar, sin estar limitados a, células de mamíferos, tales
como células de ovario de hámsteres de la China (CHO), células CHO
DHFR(-) (Urlaub y otro(s), 1980, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 97: 4216-20); células de riñón embrionario
humano (HEK) 283 ó 283T, o células 3T3. La selección de células
huésped de mamífero adecuadas y de métodos para transformación,
cultivo, amplificación, rastreo, producción de producto, y
purificación son conocidos en la especialidad. Otras líneas
celulares de mamíferos son las líneas celulares de mono
COS-1 y COS-7, y la línea celular
CV-1. Otras células huéspedes de mamífero
ilustrativas incluyen líneas celulares de primates y líneas
celulares de roedores, incluyendo líneas celulares transformadas.
Células normales diploides, cepas de células derivadas de cultivo
in vitro de tejido primario, así como también explantes
primarios, son también adecuadas. Las células candidato pueden ser
genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden
contener un gen de selección de actuación dominante. Otras líneas de
células de mamíferos adecuadas incluyen, pero sin estar limitadas a,
células de neuroblastoma de ratón N2A, HeLa, células
L-829, líneas 3T3 derivadas de ratones suizos,
Balb-c o NH, líneas celulares de hámster BHK o HaK.
Cada una de estas líneas celulares es conocida por y están al
alcance de aquéllos con conocimientos en la especialidad de la
expresión de proteínas.
Igualmente útiles como células huésped adecuadas
son células bacterianas. Por ejemplo, son bien conocidas las
diversas cepas de E. Coli (por ejemplo, HB101, DH5\alpha,
DH10, y MC1061) como células huésped en el campo de la
biotecnología. Pueden también emplearse en este método varias cepas
de B. subtilis, Pseudomonas spp., otros Bacilus spp.,
Streptomyces spp., y similares.
Muchas cepas de células de levadura conocidas por
aquéllos con experiencia en la especialidad se encuentran también a
disposición como células huésped para la expresión de polipéptidos
VGF. Células de levadura preferidas incluyen, por ejemplo,
Saccharomyces cerevisae y Pichia pastoris.
Adicionalmente, en el caso de que se desee, se
pueden utilizar sistemas celulares de insectos para la expresión de
polipéptidos VGF. Tales sistemas se describen, por ejemplo, en Kitts
y otro(s), 1983, Biotechniques, 14:
810-17; Lucklow, 1983, Curr. Opin.
Biotechnol., 4: 564-72; y Lucklow y
otro(s), 1993, J. Virol., 76: 4566-79.
Células de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5
(Invitrogen).
Se pueden emplear también células de animales
transgénicos para expresar polipéptidos VGF glicosilados. Por
ejemplo, se puede usar una célula de animal transgénico productor de
leche (una vaca o cabra, por ejemplo) y obtener el polipéptido
presente glicosilado en la leche animal. Se pueden emplear también
vegetales para producir polipéptido VGF, sin embargo, en general, la
glicosilación que tiene lugar en plantas es diferente de aquélla
producida en células de mamíferos, y puede dar como resultado un
producto glicosilado que no adecuado para uso terapéutico
humano.
Las células huésped que comprenden un vector de
expresión de polipéptido VGF pueden ser cultivadas utilizando medios
de cultivo corrientes bien conocidos por el profesional
experimentado. Los medios contendrán usualmente todos los nutrientes
necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células.
Medios adecuados para cultivar células de E. coli incluyen,
por ejemplo, Caldo Luria (LB) y/o Caldo Terrific (TB). Medios
adecuados para el cultivo de células eucarióticas incluyen medio del
Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), medio esencial mínimo
(MEM) y/o medio Eagle de Dulbecco modificado (DMEM), todos los
cuales pueden ser suplementados con suero y/o factores de
crecimiento según sea necesario para la línea celular particular que
se está cultivando. Un medio adecuado para cultivos de insecto es
medio de Grace suplementado con yeastolate, hidrolisado de
lactoalbúmina, y/o suero de ternero fetal según sea necesario.
Típicamente, se agrega un antibiótico u otro
compuesto útil para el crecimiento selectivo de células
transfectadas o transformadas como un suplemento a los medios. El
compuesto a ser utilizado será dictado por el elemento de marcación
seleccionable presente en el plásmido con el cual se transformó la
célula huésped. Por ejemplo, en el caso de que el elemento de
marcación seleccionable sea resistencia a la canamicina, el
compuesto adicionado al medio de cultivo será canamicina. Otros
compuestos para crecimiento selectivo incluyen amplicilina,
tetraciclina, y neomicina.
La cantidad de un polipéptido de VGF producida
por una célula huésped puede ser evaluada utilizando métodos
standard conocidos en la especialidad. Tales métodos incluyen, sin
limitación, análisis de Western blot, electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no
desnaturalizante, separación por cromatografía líquida de alto
rendimiento (HPLC), inmunoprecipitación, y/o ensayos de actividad
tales como ensayos de desplazamiento en gel de unión de ADN.
Si un polipéptido VGF ha sido diseñado para ser
secretado de las células huésped, la mayoría del polipéptido puede
ser encontrado en el medio de cultivo celular. Si, empero, el
polipéptido VGF no es secretado de las células huésped, éste estará
presente en el citoplasma y/o en el núcleo (en el caso de células
huésped eucarióticas) o en el citosol (en el caso de células huésped
bacterianas gramnegativas).
En el caso de un polipéptido VGF situado en el
citoplasma y/o núcleo de la célula huésped (en el caso de células
huésped eucarióticas) o en el citosol (en el caso de células huésped
bacterianas gramnegativas), el material intracelular (incluyendo
cuerpos de inclusión en el caso de bacterias gramnegativas) puede
ser extraído de la célula huésped empleando cualquier técnica
convencional bien conocida por el profesional experimentado. Por
ejemplo, las células huésped pueden ser lisadas para liberar los
contenidos del periplasma/citoplasma por prensa francesa,
homogeneización, y/o sonicación seguida de centrifugación.
Si un polipéptido de VGF ha formado cuerpos de
inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión pueden a menudo
unirse a la membrana celular interior y/o exterior y de este modo se
encontrarán principalmente en el material de pelletizado después de
la centrifugación. El material pelletizado puede ser tratado
entonces a extremos de pH o con un agente caotrópico como un
detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea, o derivados de
urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH
alcalino o tris carboxietil fosfina a pH ácido para liberar,
separar, y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido VGF
solubilizado puede ser entonces analizado utilizando electroforesis
en gel, inmunoprecipitación, o similares. Si se desea aislar la
proteína de VGF, el aislamiento puede ser llevado a cabo uti-
lizando métodos corrientes tales como aquéllos descriptos aquí y en Marston y otro(s), 1990, Meth. Enz., 182: 264-75.
lizando métodos corrientes tales como aquéllos descriptos aquí y en Marston y otro(s), 1990, Meth. Enz., 182: 264-75.
En algunos casos, un polipéptido VGF puede no ser
biológicamente activo después del aislamiento. Pueden emplearse
diversos métodos para "replegar" o llevar el polipéptido a su
estructura terciaria y generar enlaces de disulfuro para restaurar
la actividad biológica. Tales métodos incluyen la exposición del
polipéptido solubilizado a un pH usualmente por encima de 7 y en
presencia de una concentración particular de un caótropo. La
selección de caótropo es muy similar a las opciones utilizadas para
la solubilización del cuerpo de inclusión, pero usualmente el
caótropo es usado a una concentración más baja y no es
necesariamente el mismo caótropo utilizado para la solubilización.
En la mayoría de los casos la solución de replegado/oxidación
contendrá también un agente reductor o el agente reductor más su
forma oxidada en una relación específica para generar un potencial
redox particular para dar lugar a que tenga lugar una reorganización
de disulfuro en la formación de los puentes de cisterna de la
proteína. Algunas de las parejas redox comúnmente usadas incluyen
cisterna/cistamina, glutationa (GHS)/ditiobis GSH, cloruro cúprico,
ditiotreitol (DTT)/ditiano DTT, y
2,2-mercaptoetanol
(bME)/ditio-b(ME). En muchos casos, puede
emplearse un cosolvente o puede ser requerido para aumentar la
eficiencia del replegado, y los reactivos más comunes usados para
este propósito incluye glicerina, polietilenglicol de diversos pesos
moleculares, arginina, y similares.
Si los cuerpos de inclusión no están formados
hasta un grado significativo después de la expresión de un
polipéptido VGF, entonces el polipéptido se encontrará
principalmente en el sobrenadante después de centrifugación del
producto de homogenización celular. El polipéptido puede ser aislado
posteriormente del sobrenadante utilizando métodos tales como
aquéllos descriptos aquí.
La purificación de un polipéptido VGF a partir de
la solución puede ser llevada a cabo empleando una variedad de
técnicas. Si el polipéptido ha sido sintetizado de modo tal de que
contenga un tag tal como hexahistidina (polipéptido VGF/hexaHis) u
otro péptido pequeño tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven,
CT) o myc (Invitrogen, Carlsbad, CA) tanto en su
carboxi-término como en su
amino-término. Éste puede ser purificado en un
proceso de una etapa haciendo pasar la solución a través de una
columna de afinidad en donde la matriz de columna tiene una alta
afinidad por el tag.
Por ejemplo, la polihistidina se une con gran
afinidad y especificad al níquel. De este modo, puede ser utilizada
una columna de afinidad de níquel (tal como columna de níquel
Qiagen®) para la purificación del polipéptido VGF/poliHis. Véase,
por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, \NAK
10.11.8 (Ausubel y otro(s), editores, Green Publishers Inc.,
y Wiley and Sons, 1993).
Adicionalmente, los polipéptidos VGF pueden ser
purificados a través del uso de un anticuerpo monoclonal que sea
capaz de reconocer específicamente y unirse a un polipéptido
VGF.
En situaciones en las cuales es preferible
purificar parcial o completamente un polipéptido VGF de modo que
esté parcial o substancialmente libre de contaminantes, pueden
emplearse métodos corrientes conocidos por aquéllos con experiencia
en la especialidad. Tales métodos incluyen, por ejemplo, sin
limitación, separación por electroforesis seguida de electroelución,
diversos tipos de cromatografía (afinidad, inmunoafinidad, tamiz
molecular, e intercambio iónico), HPLC, y enfocado isoeléctrico
preparativo (máquina/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific, San
Francisco, CA). En algunos casos, se pueden combinar dos o más
técnicas de purificación para alcanzar mayor pureza.
Los polipéptidos VGF pueden ser preparados
también por métodos de síntesis química (tales como síntesis química
de péptidos en fase sólida) utilizando técnicas conocidas en la
especialidad tales como aquéllas expuestas por Merrifield y
otro(s), 1963, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149; Houghten
y otro(s), 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:
5132); y Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis
(Pierce Chemical Co., 1984). Tales polipéptidos pueden sintetizarse
con o sin una metionina en el amino-término. Los
polipéptidos VGF sintetizados químicamente pueden ser oxidados
empleando métodos expuestos en estas referencias para formar puentes
de disulfuro. Es de esperar que los polipéptidos VGF sintetizados
químicamente tengan actividad biológica comparable a la
correspondiente a los polipéptidos VGF producidos en forma
recombinante o purificados a partir de fuentes naturales, y de este
modo pueden ser utilizado de mono intercambiable con un polipéptido
recombinante o natural.
Otro medio de obtención de polipéptido VGF es a
través de la purificación de muestras biológicas tales como tejidos
y/o fluidos de fuente en los cuales se encuentra naturalmente
polipéptido VGF. Tal purificación puede ser llevada a cabo
utilizando métodos para purificación de proteínas según se describe
en la presente. La presencia del polipéptido VGF durante la
purificación puede ser monitoreada, por ejemplo, utilizando un
anticuerpo preparado contra polipéptido producido de modo
recombinante o fragmentos de péptido del mismo.
Se conocen en la especialidad una variedad de
métodos adicionales para la producción de polipéptidos, y los
métodos pueden ser utilizados para producir polipéptidos que tienen
especificidad para polipéptidos VGF. Véase, por ejemplo, Roberts y
otro(s), 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:
12297-303), que describe la producción de proteínas
de fusión entre un ARNm y su péptido codificado. Véase también,
Roberts, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol., 3:
268-73.
Las Patentes Estadounidenses Nos. 5,763,192;
5,814,476; 5,723,323; y 5,817,483 describen procesos para la
producción de péptidos o polipéptidos. Esto es llevado a cabo
produciendo genes estocásticos o fragmentos de los mismos, e
introduciendo luego estos genes en células huésped que producen una
o más proteínas codificadas por los genes estocásticos. Las células
huésped son luego rastreadas para identificar aquellos clones que
producen péptidos o polipéptidos que tienen la actividad
deseada.
Otro método para la producción de péptidos o
polipéptidos se describe en PCT/US 98/20094 (WO 99/15650) presentada
por Athersys, Inc. Conocido como "activación al azar de expresión
de gen para descubrimiento de gen" (RAGE-GO), el
proceso involucra la activación de expresión de un gen endógeno o
sobreexpresión de un gen por métodos de recombinación in
situ. Por ejemplo, la expresión de un gen endógeno es activada o
incrementada por integración de una secuencia reguladora en una
célula diana que es capaz de activar la expresión del gen por medio
de recombinación no homóloga o ilegítima. El ADN diana es
primeramente sometido a radiación, e insertado un promotor genético.
El promotor eventualmente localiza una interrupción en el frente de
un gen, iniciando la transcripción del gen. Esto da como resultado
la expresión del péptido o polipéptido deseados.
Se apreciará que estos métodos pueden ser también
utilizados para crear bibliotecas de expresión de proteínas
integrales similares a IL-17, que pueden ser usadas
subsecuentemente para el rastreo fenotípico de alta producción en
una variedad de ensayos, tales como ensayos bioquímicos, ensayos
celulares, y ensayos de organismo completo (por ejemplo, planta,
ratón, etc.).
Aquéllos con conocimientos en la especialidad
apreciarán que las moléculas de polipéptido VGF descriptas aquí
pueden ser producidas por recombinación u otros medios.
El término "agente de unión selectivo" se
refiere a una molécula que tiene especificidad por uno o más
polipéptidos VGF. Agentes de unión selectivos adecuados incluyen,
pero sin estar limitados a, anticuerpos y derivados de los mismos,
polipéptidos, y moléculas pequeñas. Los agentes de unión selectivos
adecuados son preparados utilizando métodos conocidos en la
especialidad. Un agente de unión selectivo de polipéptido VGF de la
presente invención es capaz de unirse a cierta porción del
polipéptido VGF, inhibiendo con ello la unión del polipéptido a un
receptor de polipéptido VGF.
El término "antígeno" se refiere a una
molécula o a una porción de una molécula capaz de ser unida por un
agente de unión selectivo y capaz adicionalmente de ser utilizado en
un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo
de dicho antígeno. Un antígeno pude tener uno o más epítopos.
El término "epítopo" se refiere a aquella
porción de cualquier molécula capaz de ser reconocida por y unida
por un agente de unión selectivo en una o más regiones de unión de
antígeno del agente de unión. Los epítopos consisten usualmente en
agrupamientos de moléculas superficiales químicamente activos tales
como cadenas laterales de aminoácidos o de azúcares que tienen
características estructurales tridimensionales específicas así como
también características de carga específicas. El término "epítopo
de inhibición" y "epítopo de neutralización" se refieren a
un epítopo que, cuando es unido por un agente de unión selectivo, da
como resultado una pérdida de actividad biológica de la molécula que
contiene al epítopo, in vivo, in vitro, o in
situ, de modo más preferido, in vivo, incluyendo la unión
de un polipéptido VGF a un receptor de polipéptido VGF.
Tal como es empleado en la presente, el término
"región de unión a antígeno" se refiere a una porción del
agente de unión selectivo que contiene los residuos de aminoácido
que interactúan con un antígeno y le concede al agente de unión su
especificidad y afinidad por el antígeno. Preferentemente, la región
de unión a antígeno será de origen murino. En otra realización, la
región de unión a antígeno puede derivarse de otras especies
animales, en particular roedores tales como conejo, rata, o hámster.
Por ejemplo, la región de unión a antígeno del agente de unión
selectivo de la presente invención es preferentemente derivada de un
anticuerpo no humano específico para polipéptido VGF humano. Fuentes
preferidas para el ADN que codifica tal anticuerpo no humano
incluyen líneas celulares que producen anticuerpos, tales como
líneas celulares híbridas comúnmente conocidas como hibridomas.
Los agentes de unión selectivos tales como
anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen con polipéptidos
VGF se encuentran dentro de los alcances de la presente invención.
Los anticuerpos pueden ser policlonales, incluyendo policlonal
monoespecífico, monoclonal, recombinante, quimérico, humanizado, tal
como injertado con CDR, humano, de cadena simple, y/o biespecífico;
así como también fragmentos, variantes, o derivados de los mismos.
Los fragmentos de anticuerpos incluyen aquellas porciones del
anticuerpo que se unen a un epítopo sobre el polipéptido VGF.
Ejemplos de tales fragmentos incluyen fragmentos de Fab o
F(ab') generados por escisión enzimática de anticuerpos de
longitud completa. Otros fragmentos de unión incluyen aquéllos
generados por técnicas de ADN recombinante, tales como la expresión
de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de ácido
nucleico que codifican regiones variables de anticuerpos.
Los anticuerpos policlonales son poblaciones
heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de
animales inmunizados con un antígeno. Un antígeno es una molécula o
una porción de una molécula capaz de ser encontrada por un
anticuerpo que es adicionalmente capaz de inducir a un animal a
producir anticuerpos capaces de unirse con un epítopo de ese
antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos. La reacción
específica a la que se alude más arriba pretende indicar que el
antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su
anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos
con pueden ser convocados por otros antí-
genos.
genos.
Los anticuerpos policlonales dirigidos hacia un
polipéptido VGF son producidos generalmente en animales (por
ejemplo, conejos o ratones) por medio de múltiples inyecciones
subcutáneas o intraperitoneales de polipéptido VGF y un adyuvante.
Puede ser útil conjugar un polipéptido VGF con una proteína
portadora que sea inmunogénica en las especies a ser inmunizadas,
tal como hemocianina de lapa californiana (keyhole limpet), suero,
albúmina, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja.
También se pueden utilizar agentes agregantes tales como alumbre
para intensificar la respuesta inmune. Después de la inmunización,
los animales son sangrados y el suero es ensayado para determinar el
título de anticuerpo anti-VGF.
Los anticuerpos monoclonales contienen una
población substancialmente homogénea de anticuerpos específicos a
antígenos, población que contiene sitios de unión con epítopos
substancialmente similares. Tales anticuerpos pueden ser de
cualquier clase de inmuglobulina incluyendo IgC, IgM, IgE, IgA, GILD
y cualquier subclase de los mismos. Un hibridoma que produce un
anticuerpo monoclonal de la presente invención puede ser cultivado
in vitro, in situ, o in vivo. La producción de
títulos elevados in vivo o in situ es un método
preferido de producción.
Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia
polipéptidos VGF son producidos empleando cualquier método que
contemple la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas
celulares continuas en cultivo. Ejemplos de métodos adecuados para
la preparación de anticuerpos monoclonales incluyen los métodos de
hibridoma de Kohler y otro(s), 1975, Nature, 256:
495-97 y el método de hibridoma humano de célula B
(Kozbor, 1984, J. Immunol., 133: 3041); Brodeur y
otro(s), Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987).
También la invención proporciona líneas celulares de hibridoma que
producen anticuerpos monoclonales reactivos con polipéptidos
VGF.
Agentes de unión selectivos
anti-VGF preferidos incluyen anticuerpos
monoclonales que inhibirán competitivamente in vivo la unión
a un polipéptido VGF humano o a un anticuerpo que tenga
substancialmente las mismas características de unión específicas,
así como a fragmentos y regiones de los mismos. Métodos preferidos
para la determinación de especificidad y afinidad de anticuerpos
monoclonales por inhibición competitiva pueden encontrarse en Harlow
y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratories, 1989); Current Protocols in Immunology
(Colligan y otro(s), editores, Greene Publishing Asoc. y
Wiley Interscience, 1993); y Muller, 1988, Meth. Enzymol.,
92: 589-601.
Los anticuerpos monoclonales de la invención
pueden ser modificados para uso como productos terapéuticos. Una
realización es un anticuerpo "quimérico" en el cual una porción
de la cadena pesada (H) y/o liviana (L) es idéntica con u homóloga a
una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una
especie particular o que pertenece a una clase o subclase de
anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s)
cadena(s) es/son idéntica(s) con u homóloga(s)
a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra
especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo.
También incluidos se encuentran fragmentos de tales anticuerpos, en
tanto los mismos exhiban la deseada actividad biológica. Véanse la
Patente Estadounidense Nº 4,816,567; Morrison y otro(s),
1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:
6851-55.
Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su
preparación son conocidos en la especialidad. Véanse Cabilly y
otro(s), 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A:, 81:
3273-77; Morrison y otro(s), 1984, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 6851-55. Boulianne
y otro(s), 1984, Nature, 312: 643-46;
Neuberger y otro(s), 1985, Nature, 314:
268-70; Liu y otro(s), 1987, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 84: 3439-43 y Harlow y Lane,
supra.
Tal como se lo emplea aquí, el término
"anticuerpo quimérico" incluye inmunoglobulinas monovalentes,
divalentes o polivalentes. Un anticuerpo quimérico monovalente es un
dímero (HL) formado por una cadena H quimérica asociada a través de
puentes de disulfuro con una cadena L quimérica. Un anticuerpo
quimérico divalente es un tetrámero (H_{2}L_{2}) formado por
dos dímeros HL asociados a través de al menos un puente de
disulfuro. Un anticuerpo polivalente quimérico puede ser producido
también, por ejemplo, empleando una región de C_{H} que se agrega
(por ejemplo, a partir de una cadena IgM H o cadena \mu).
Los anticuerpos quiméricos de la presente
invención pueden comprender cadenas de inmunoglobulina H y/o L
individuales. Una cadena H quimérica preferida comprende una región
de unión a antígeno derivada de la cadena H de un anticuerpo no
humano específico para polipéptido VGF que está unida a al menos una
porción de una región C de cadena H humana (C_{H}), tal como
CH_{1} o CH_{2}. Una cadena L quimérica preferida comprende una
región de unión a antígeno derivada de la cadena L de un anticuerpo
no humano específico para polipéptido VGF que está unida a al menos
una porción de una región C de cadena L humana (C_{L}).
Agentes de unión selectivos que tienen cadenas H
y cadenas L quiméricas de la misma o diferente especificidad de
unión de región variable pueden prepararse también por asociación
apropiada de las cadenas de polipéptidos individuales, de acuerdo
con métodos conocidos en la especialidad. Véase, por ejemplo,
Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y
otro(s), editores, Green Publishers Inc. y Wiley and Sons,
1994) y Harlow y otro(s), supra. Utilizando este
enfoque, las células huésped que expresan cadenas H quiméricas (o
sus derivados) son cultivadas por separado de las células huésped
que expresan cadenas L quiméricas (o sus derivados), y las cadenas
de inmunoglobulina se recuperan por separado y son entonces
asociadas. Alternativamente, las células huésped pueden ser
co-cultivadas, permitiendo que las cadenas se
asocien espontáneamente en el medio de cultivo, a lo que le sigue la
recuperación de la inmuglobulina ensamblada.
La invención también se refiere a
"derivados" de agentes de unión selectivos, tales como
anticuerpos, fragmentos, regiones, o derivados de los mismos,
término que incluye aquellas proteínas codificadas por genes
truncados o modificados para producir especies moleculares que se
asemejan funcionalmente a fragmentos de inmunoglobulina. Las
modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, adición de
secuencias genéticas que codifican proteínas citotóxicas tal como
toxinas vegetales o bacterianas. Los fragmentos y derivados pueden
ser producidos a partir de cualquier de la células huésped de esta
invención. Alternativamente, los agentes de unión selectivos
anti-VGF tales como anticuerpos, fragmentos y
regiones de los mismos pueden ser unidos a proteínas o compuestos
citotóxicos in vitro, para proporcionar anticuerpos
anti-VGF citotóxicos que matarían selectivamente las
células que tienen receptores de polipéptido VGF.
Fragmentos adecuados incluyen, por ejemplo, Fab,
Fab', F(ab')_{2} y Fv. Estos fragmentos carecen del
fragmento Fc de un anticuerpo intacto, salen más rápidamente de la
circulación, y pueden tener menos unión no específica a tejidos que
un anticuerpo intacto. Véase Wahl y otro(s), 1983, J.
Nucl. Med., 24: 316-25. Estos fragmentos son
producidos a partir de anticuerpos intactos utilizando métodos bien
conocidos en la especialidad, por ejemplo, mediante escisión
proteolítica con enzimas tales como papaína (para producir
fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos
F(ab')_{2}). La identificación de estas regiones y/o
epítopos de unión a antígenos reconocidos por anticuerpos
monoclonales de la presente invención proporciona la información
necesaria para generar anticuerpos monoclonales adicionales con
características similares de unión y utilidad terapéutica o de
diagnóstico que son paralelas a realizaciones de esta solicitud.
En otra realización, un anticuerpo monoclonal de
la invención es un anticuerpo "humanizado". Métodos para la
humanización de anticuerpos no humanos son bien conocidos en la
especialidad. Véase las Patentes Estadounidenses Nos. 5,585,089 y
5,693,762. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más
residuos de aminoácido introducidos en él de una fuente que no es
humana. La humanización puede llevarse a cabo, por ejemplo,
utilizando métodos descriptos en la especialidad (Jones y
otro(s), 1986, Nature, 321: 522-25;
Riechmann y otro(s), 1998, Nature, 332:
323-27; Verhoeyen y otro(s), 1988,
Science, 239: 1534-36), por substitución de
al menos una porción de una región determinante de complementariedad
de roedor (CDR) para las regiones correspondientes de un anticuerpo
humano.
Dentro de los alcances de la presente invención
se encuentran comprendidas técnicas para la creación de versiones de
ADN recombinante de las regiones de unión a antígeno de moléculas de
anticuerpo (es decir, fragmentos de región Fab o variables) que
evitan la generación de anticuerpos monoclonales. En esta técnica,
son extraídas moléculas de ARN mensajero específicas para
anticuerpos de células del sistema inmune tomadas de un animal
inmunizado y transcriptas en ADNc. El ADNc es luego clonado en un
sistema de expresión bacteriano. Un ejemplo de tal técnica adecuada
para la práctica de esta invención emplea un sistema de vector
lambda de bacteriófago que tiene una secuencia líder que hace que la
proteína Fab expresada migre hacia el espacio periplasmático (entre
la membrana celular y la pared celular bacterianas) o sea secretada.
Se puede generar rápidamente y rastrear gran cantidad de fragmentos
de Fab funcionales para aquéllos que se unen con el antígeno. Tales
moléculas de unión a VGF (fragmentos de Fab con especificidad para
polipéptidos VGF) están encuadrados dentro del término
"anticuerpo" tal como es utilizado en la presente.
También se encuentran dentro de los alcances de
la invención técnicas desarrolladas para la producción de
anticuerpos quiméricos por splicing de genes a partir de una
molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno
apropiada conjuntamente con genes de una molécula de anticuerpo
humano de actividad biológica apropiada (tal como la capacidad de
activar complemento humano y mediar ADCC), Morrison y
otro(s), 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:
6851-55; Neuberger y otro(s), 1984,
Nature, 312: 604-08. Agentes de unión
selectivos tales como anticuerpos producidos por esta técnica se
encuentran dentro de los alcances de la invención.
Se apreciará que la invención no está limitada a
anticuerpos monoclonales de ratón o rata, de hecho, pueden
utilizarse anticuerpos humanos. Tales anticuerpos pueden ser
obtenidos utilizando hibridoma humana. Véase Cote y otro(s),
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77, (1985), Son por
lo tanto abarcados por la invención anticuerpos completamente
humanos que se unen a polipéptidos VGF. Tales anticuerpos son
producidos por inmunización con un antígeno de VGF (opcionalmente
conjugado con un portador) de animales transgénicos (por ejemplo,
ratones) capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en
ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Véase, por
ejemplo, Jakobovits y otro(s), 1993, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 90: 2551-55; Jakobovits y
otro(s), 1993, Nature, 362: 255-58;
Bruggeman y otro(s), 1993, Year in Immuno., 7:
33-40.
Un anticuerpo antiidiotípico
(Anti-id) es un anticuerpo que reconoce
determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión de
antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo anti-id
puede ser preparado inmunizando un animal de la misma especie y tipo
genético (por ejemplo, cepa de ratón) que la fuente del anticuerpo
monoclonal con el anticuerpo monoclonal para el cual está siendo
preparado un anti-id. El animal inmunizado
reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del
anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo para estos
determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-id).
Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense Nº 4,699,880. El
anticuerpo anti-id puede también ser usado como un
"inmunogen" para inducir una respuesta inmune en aún otro
animal, produciendo un así denominado anticuerpo
anti-anti-id. El
anti-anti-id puede ser
epitópicamente idéntico al anticuerpo monoclonal original que induce
el anti-id. De este modo, utilizando anticuerpos
para los determinantes idiotípicos de un anticuerpo monoclonal, es
posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de
idéntica especificidad.
También abarcados por la invención se encuentran
anticuerpos que se unen a polipéptidos VGF. Utilizando animales
transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir un
repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de
inmunoglobulina endógena tales anticuerpos son producidos por
inmunización con un antígeno de polipéptido VGF (es decir, que tiene
al menos 6 aminoácidos contiguos), opcionalmente conjugados con un
portador. Véase, por ejemplo, Jakobovits y otro(s), 1993,
Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 2551-55;
Jakobovits y otro(s), 1993, Nature, 362:
255-58; Bruggeman y otro(s), 1993, Year in
Immuno., 7: 33. En un método, tales animales transgénicos son
producidos incapacitando los loci endógenos que codifican las
cadenas de inmunoglobulina pesada y liviana en el mismo, e
insertando loci que codifican proteínas de cadena pesada y
liviana humanas en el genoma del mismo. Animales parcialmente
modificados, es decir aquéllos que tienen menos que el complemento
completo de modificaciones, son luego cruzados para obtener un
animal que tenga todas las modificaciones del sistema inmune
deseado. Cuando es administrado un inmunogen, estos animales
transgénicos producen anticuerpos con secuencias de aminoácidos
humanas (en vez de, por ejemplo, murinos), incluyendo regiones
variables que son inmunoespecíficos para estos antígenos. Véase
Solicitudes PCT Nos. PCT/US 96/05928 y PCT/US 93/06926. Se describen
métodos adicionales en la Patente Estadounidense Nº 5,545,807;
Solicitudes PCT Nos. PCT/US 91/1245 y PCT/G 1389101207, y en las
publicaciones EP Nos. 546073B1 y 546073A1. Los anticuerpos humanos
pueden ser producidos también por la expresión de ADN recombinante
en células huésped o por expresión en células de hibridoma como se
ha descripto en la presente.
En una realización alternativa, se pueden
producir también anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de
exposición de fagos (Hoogenboom y otro(s), 1991, J. Mol.
Biol., 227: 381; Marks y otro(s), 1991, J. Mol.
Biol., 222: 581). Estos procesos imitan la selección inmune a
través de la exhibición de repertorios de anticuerpos sobre la
superficie de bacteriófagos filamentosos, y selección subsiguiente
de fago por medio de su unión a un antígeno de elección. Una técnica
tal se describe en la Solicitud PCT Nº PCT/US 98/17364, que
describe el aislamiento de alta afinidad y anticuerpos agonísticos
funcionales para receptores MPL y msk utilizando tal planteo.
Los anticuerpos quiméricos, injertados con CRD, y
humanizados son producidos típicamente por métodos recombinantes.
Son introducidos ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos en
células huésped y expresados utilizando materiales y procedimientos
descriptos en la presente y conocidos en la especialidad. En una
realización preferida, los anticuerpos son producidos en células
huésped de mamíferos, tales como células CHO. Anticuerpos
monoclonales (es decir, humanos) puede ser producidos mediante la
expresión de ADN recombinante en células huésped o mediante la
expresión en células de hibridoma según se describe en la
presente.
Los anticuerpos anti-VGF de la
invención pueden ser empleados en cualquier método de ensayo
conocido, tales como ensayos de unión competitivos, ensayos de
sándwich directos o indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación
(Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147:
158 (CRC Press, Inc., 1987) para la detección y cuantificación de
polipéptidos VGF. Los anticuerpos se unirán a polipéptidos VGF con
una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que está
siendo empleado.
Para aplicaciones de diagnóstico, en ciertas
realizaciones, los anticuerpos de VGF puede ser rotulados con una
porción detectable. La porción detectable puede ser cualquiera que
sea capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal
detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un
radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S,
^{125}I, ^{99}Tc, ^{111}In, o ^{67}Ga; un compuesto
fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, o luciferina; o una enzima, tal como
fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, o
peroxidasa de rábano picante (Bayer y otro(s), 1990, Meth.
Enz., 184: 138-63).
Los ensayos de unión competitivos se basan en la
habilidad de un patrón rotulado (por ejemplo, un polipéptido VGF, o
una porción inmunológicamente reactiva del mismo) para competir con
el analito de muestra de prueba (un polipéptido VGF) para unirse con
una cantidad limitada de anticuerpo anti-VGF. La
cantidad de un polipéptido VGF en la muestra de prueba es
inversamente proporcional a la cantidad de patrón que se une a los
anticuerpos. Para facilitar la determinación la cantidad de patrón
que se une, los anticuerpos son típicamente insolubilizados antes o
después de la competición, de modo que el patrón y el analito que
están unidos a los anticuerpos pueden ser separados convenientemente
del patrón y del analito que permanecen sin unirse.
Los ensayos de sándwich implican típicamente el
uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción
inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteína a ser detectada
y/o cuantificada. En un ensayo de sándwich, el analito de muestra de
prueba está unido típicamente por un primer anticuerpo que está
inmovilizado sobre un soporte sólido, y después de lo cual un
segundo anticuerpo se une al analito, formando así un complejo
tripartito insoluble. Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense Nº
4,376,110. El segundo anticuerpo puede estar el mismo rotulado con
una porción detectable (ensayos de sándwich directos) o puede ser
medido empleando un anticuerpo anti-inmunoglobulina
que está rotulado con una porción detectable (ensayos de sándwich
indirectos). Por ejemplo, un tipo de ensayo de sándwich es un ensayo
inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA), en cuyo caso la porción
detectable es una enzima.
Los agentes de unión selectivos, incluyendo
anticuerpos anti-VGF, son también útiles para la
generación de imágenes in vivo. Un anticuerpo rotulado con
una porción detectable puede ser administrado a un animal,
preferentemente dentro del torrente sanguíneo, y se puede ensayar la
presencia y ubicación del anticuerpo rotulado en el huésped. En
anticuerpo puede ser rotulado con cualquier porción que sea
detectable en un animal, ya sea por resonancia magnética nuclear,
por radiología, o por cualquier otro medio de detección conocido en
la especialidad.
Los agentes de unión selectivos de la invención,
incluyendo anticuerpos, pueden ser utilizados como agentes
terapéuticos. Estos agentes terapéuticos son generalmente agonistas
o antagonistas, en el sentido de que ellos tanto refuerzan como
reducen, respectivamente, al menos una de las actividades biológicas
de un polipéptido VGF. En una realización, los anticuerpos
antagonistas de la invención son anticuerpos o fragmentos de unión
de los mismos que son capaces de unirse específicamente a un
polipéptido VGF y que son capaces de inhibir o eliminar la actividad
funcional de un polipéptido VGF in vivo o in vitro. En
realizaciones preferidas, el agente de unión selectivo, por
ejemplo, un anticuerpo antagonista, inhibirá la actividad funcional
de un polipéptido VGF en al menos aproximadamente 50%, y
preferentemente en al menos aproximadamente 80%. En otra
realización, el agente de unión selectivo puede ser un anticuerpo
anti-polipéptido VGF que es capaz de interactuar
con un acompañante de unión de polipéptido VGF (un ligando o
receptor) inhibiendo o eliminando de tal modo la actividad del
polipéptido VGF in vivo o in vitro. Los agentes de
unión selectivos, incluyendo anticuerpos
anti-polipéptido VGF agonistas y antagonistas, son
identificados mediante ensayos de rastreo que son bien conocidos en
la especialidad.
La invención también se refiere a un kit que
comprende agentes de unión selectivos a VGF (tales como anticuerpos)
y otros reactivos útiles para la detección de niveles de polipéptido
VGF en muestras biológicas. Tales reactivos pueden incluir un rótulo
detectable, suero de bloqueo, muestras de control positivas y
negativas, y reactivos de detección.
Derivados químicamente modificados de
polipéptidos VGF pueden ser preparados por alguien con conocimientos
en la especialidad, dadas las manifestaciones descriptas en la
presente. Los derivados de polipéptido VGF son modificados de una
manera que es diferente - ya sea en el tipo o en la ubicación de la
molécula naturalmente acoplada al polipéptido. Los derivados pueden
incluir moléculas formadas por la deleción de uno más grupos
químicos naturalmente acoplados. Los polipéptidos VGF pueden ser
modificados por el acoplamiento covalente de uno o más polímeros.
Por ejemplo, el polímero seleccionado es típicamente soluble en agua
de modo que la proteína a la cual está acoplado no precipite en un
entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. Incluida dentro del
ámbito de los polímeros adecuados se encuentra una mezcla de
polímeros. Preferentemente, a los fines del uso terapéutico de la
preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente
aceptable.
Cada uno de los polímeros puede ser de cualquier
peso molecular y pueden ser ramificados o sin ramificar. Cada uno de
los polímeros tienen típicamente un peso molecular promedio de entre
aproximadamente 2 kDs y aproximadamente 100 kDs (el término
"aproximadamente" indica que en preparaciones de un polímero
soluble en agua, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que
el peso molecular establecido). El peso molecular promedio de cada
polímero es preferentemente de entre aproximadamente 5 kDs y
aproximadamente 50 kDs, de modo más preferido de entre
aproximadamente 12 kDs y aproximadamente 40 kDs y del modo más
preferido de entre aproximadamente 20 kDs y aproximadamente 35
kDs.
Polímeros solubles en agua o mezclas de los
mismos incluyen, pero sin estar limitados a, carbohidratos con
enlace en N o con enlace en O, azúcares, fosfatos, polietilenglicol
(PEG) (incluyendo las formas de PEG que han sido utilizadas para
derivatizar proteínas, incluyendo mono-alcoxi
(C_{1}-C_{10})-, o
ariloxi-polietilenglicol),
monometoxi-polietilenglicol, dextrano (tal como
dextrano de bajo peso molecular de, por ejemplo, aproximadamente 6
kD), celulosa, u otro polímero a base de carbohidrato,
poli-(N-vinil pirrolidona) polietilenglicol,
homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de
propileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo,
glicerina), y alcohol polivinílico. También comprendidas por la
presente invención se encuentran moléculas reticuladas bifuncionales
que pueden ser empleadas para preparar multímeros de polipéptido VGF
acoplados covalentemente.
En general, la derivatización química puede ser
llevada a cabo en cualquier condición adecuada utilizada para hacer
reaccionar una proteína con una molécula de polímero activada. Los
métodos para la preparación de derivados químicos de polipéptidos
comprenderán generalmente las etapas de: (a) hacer reaccionar el
polipéptido con la molécula de polímero activada (tal como un éster
o aldehído reactivos derivados de la molécula de polímero) en
condiciones en las cuales el polipéptido de VGF se acopla a una o
más moléculas de polímero, y (b) obtener los productos de reacción.
Las condiciones de reacción óptimas serán determinadas en base a
parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto
más grande es la relación de moléculas de polímero respecto de la
proteína, mayor es el porcentaje de moléculas de polímero acopladas.
En una realización, el derivado de polipéptido VGF puede tener una
porción de molécula de polímero sola en el
amino-término. Véase, por ejemplo, Patente
Estadounidense Nº 5,234,784.
La pegilación de un polipéptido puede ser llevada
a cabo específicamente empleando cualesquiera reacciones de
pegilación conocidas en la especialidad. Tales reacciones se
describen, por ejemplo, en las siguientes referencias: Francis y
otro(s), 1992, Focus on Growth Factors, 3:
4-10; Publicaciones EP Nos. 154316 y 401384; y
Patente Estadounidense Nº 4,179,337. Por ejemplo, la pegilación
puede ser llevada a cabo por medio de una reacción de acilación o
una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol
reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) como se
describe en la presente. En el caso de las reacciones de acilación,
un polímero elegido tendrá un grupo de éster reactivo solo. En el
caso de alquilación por reducción, un polímero elegido tendrá un
grupo de aldehído reactivo solo. Un aldehído reactivo es, por
ejemplo, polietilenglicol propionaldehido, que es estable en agua, o
mono-derivados de alcoxilo
(C_{1}-C_{10}) o ariloxilo de los mismos (Véase
la Patente Estadounidense Nº 5,252,714).
En otra realización, el polipéptido VGF puede
estar acoplado químicamente a biotina. Luego se deja que las
moléculas de polipéptido VGF/biotina se unan a avidina, dando como
resultado moléculas tetravalentes de avidina/biotina/polipéptido
VGF. Los polipéptidos VGF pueden ser también acoplados
covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y los
conjugados resultantes precipitados con anti-DNP- o
anti-TNP-IgM para formar conjugados
decaméricos con una valencia de 10.
Generalmente, los cuadros que pueden ser
aliviados o modulados mediante la administración de los derivados de
polipéptido VGF de la presente incluyen aquéllos descriptos aquí en
el caso de los polipéptidos VGF. Sin embargo, los derivados de
polipéptido VGF dados a conocer aquí pueden tener actividades
adicionales, actividad biológica reforzada o reducida, u otras
características, tales como vida media mayor o menor, en comparación
con las moléculas no derivatizadas.
En algunas situaciones, puede ser deseable
identificar moléculas que sean moduladoras, es decir, agonistas o
antagonistas, de la actividad del polipéptido VGF. Moléculas
naturales o sintéticas que modulan al polipéptido VGF pueden ser
identificadas utilizando uno o más ensayos de rastreo, tales como
aquéllos descriptos aquí. Tales moléculas pueden ser administradas
ya sea de una manera ex vivo o bien de una manera in
vivo por inyección, o mediante administración oral, dispositivo
de implantación, o similares.
"Molécula de prueba" se refiere a una
molécula que está en evaluación para determinar la capacidad de
modular (es decir, incrementar o disminuir) la actividad de un
polipéptido VGF. Más comúnmente, una molécula de prueba interactuará
directamente con un polipéptido VGF. Sin embargo, se contempla
también que una molécula de prueba module también la actividad de
polipéptido VGF indirectamente, tal como afectando la expresión del
gen de VGF, o mediante la unión a un acompañante de unión de
polipéptido VGF (por ejemplo, receptor o ligando). En una
realización, una molécula de ensayo se unirá a un polipéptido VGF
con una afinidad constante de al menos aproximadamente 10^{-6} M,
preferentemente de aproximadamente 10^{-8} M, de modo más
preferido de aproximadamente 10^{-9} M, y de modo aún más
preferido de aproximadamente 10^{-10} M.
Un agonista o antagonista de polipéptido VGF
puede ser una proteína, péptido, carbohidrato, lípido, o molécula de
peso molecular pequeño que interactúa con polipéptido VGF para
regular su actividad. Moléculas que regulan la expresión de
polipéptido VGF incluyen ácidos nucleicos que son complementarios
respecto de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido VGF, o
son complementarios respecto de ácidos nucleicos que dirigen o
controlan la expresión de polipéptido VGF, y que actúan como
reguladores anti-sentido de la expresión.
Una vez que se ha identificado que la molécula de
prueba interactúa con un polipéptido VGF, la molécula puede ser
evaluada ulteriormente para determinar su capacidad para incrementar
o reducir la actividad del polipéptido VGF. La medición de la
interacción de una molécula de prueba con polipéptido VGF puede ser
llevada a cabo en diversos formatos, incluyendo ensayos de unión en
base a células, ensayos de unión de membrana, ensayos de fase de
solución, e inmunoensayos. En general, una molécula de prueba es
incubada con un polipéptido VGF durante un período de tiempo
especificado, y la actividad del polipéptido VGF es determinada
mediante uno o más ensayos para la medición de actividad
biológica.
La interacción de las moléculas de prueba con
polipéptidos VGF puede también ser ensayada directamente utilizando
anticuerpos policlonales o monoclonales en un inmunoensayo.
Alternativamente, las formas modificadas de polipéptidos VGF que
contienen tags de epítopos según se ha descripto aquí pueden ser
utilizados en solución e inmunoensayos.
En el caso de que los polipéptidos VGF exhiban
actividad biológica a través de una interacción con un acompañante
de unión (por ejemplo, un receptor o ligando), pueden emplearse una
variedad de ensayos in vitro para medir la unión de un
polipéptido VGF al correspondiente acompañante de unión (tal como un
agente de unión selectivo, receptor, o ligando). Estos ensayos
pueden ser usados para rastrear moléculas de prueba para determinar
su capacidad para incrementar o disminuir la tasa y/o la extensión
de unión de un polipéptido VGF con su acompañante de unión. En un
ensayo, un polipéptido VGF es inmovilizado en los receptáculos de
una placa de microtitulación. El acompañante de unión de polipéptido
VGF radiorotulado (por ejemplo, acompañante de unión de polipéptido
VGF yodado) y una molécula de prueba puede ser entonces agregados ya
sea de a uno por vez (en cualquier orden) o simultáneamente a los
receptáculos. Después de incubación, los receptáculos pueden ser
lavados y sometidos a un conteo para medir la radioactividad,
utilizando un contador de centelleo, para determinar la extensión
con la cual el acompañante de unión se unió con el polipéptido VGF.
Típicamente, una molécula será ensayada en toda una gama de
concentraciones, y puede emplearse una serie de receptáculos de
control que carecen de uno o más elementos de los ensayos de prueba
para lograr exactitud en la evaluación de los resultados. Una
alternativa a este método implica revertir las "posiciones" de
las proteínas, es decir, inmovilizar al acompañante de unión del
polipéptido VGF a los receptáculos de la placa de microtitulación,
incubar con la molécula de prueba y polipéptido VGF radiorotulado, y
determinar la extensión de la unión del polipéptido VGF. Véase, por
ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 18
(Ausubel y otro(s), editores, Green Publishers Inc. y Wiley
and Sons, 1995).
Como una alternativa al radiorotulado, un
polipéptido VGF o su acompañante de unión puede ser conjugado a
biotina, y la presencia de proteína biotinilada puede ser detectada
empleando estreptavidina unida a una enzima, tal como peroxidasa de
rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (AP), que pueden ser
detectadas colorimétricamente, o por etiquetamiento fluorescente de
estreptavidina. Un anticuerpo dirigido a un polipéptido VGF o a un
acompañante de unión de polipéptido VGF, y que está conjugado con
biotina, puede también ser utilizado con la finalidad de detectar la
incubación siguiente del complejo con estreptavidina unida a enzima
acoplada a AP o HRP.
Un polipéptido VGF o un acompañante de unión de
polipéptido VGF pueden ser también inmovilizados mediante
acoplamiento a glóbulos de azarosa, glóbulos acrílicos, u otros
tipos de substratos de fase sólida inertes. El complejo de
proteína-substrato puede ser colocado en una
solución que contenga la proteína complementaria y el compuesto de
prueba. Después de la incubación, los glóbulos puede ser
precipitados por centrifugación, y puede ser calculada la magnitud
de unión entre un polipéptido de VGF y su acompañante de unión
utilizando los métodos descriptos en la presente. Alternativamente,
el complejo substrato-proteína puede ser
inmovilizado en una columna con la molécula de prueba y proteína
complementaria pasando a través de la columna. La formación de un
complejo entre un polipéptido de VGF y su acompañante de unión puede
ser entonces calculada utilizando cualquiera de las técnicas
descriptas aquí (por ejemplo, radiorotulado o unión con
anticuerpos).
Otro ensayo in vitro que es útil para la
identificación de una molécula de prueba que incrementa o disminuye
la formación de un complejo entre un polipéptido de VGF y un
acompañante de unión de polipéptido VGF es un sistema detector de
resonancia de plasmón de superficie tal como el sistema de ensayo
BIAcore (Pharmacia, Piscataway, NJ). El sistema BIAcore es utilizado
según es especificado por el fabricante. Este ensayo implica
esencialmente la unión covalente de tanto el polipéptido de VGF como
un acompañante de unión de polipéptido de VGF con un chip sensor
recubierto con dextrano que está ubicado en un detector. El
compuesto de prueba y la otra proteína complementaría pueden ser
entonces inyectados, ya sea simultáneamente o uno detrás de otro, en
la cámara que contiene el chip sensor. La cantidad de proteína
complementaria que se une puede ser calculada en base al cambio de
masa molecular que está asociado físicamente con el lado recubierto
con dextrano del chip sensor, siendo medido el cambio de masa
molecular por el sistema detector.
En algunos casos, puede ser deseable evaluar dos
o más compuestos de prueba conjuntamente con su capacidad para
incrementar o reducir la formación de un complejo de polipéptido VGF
y un acompañante de unión de polipéptido VGF. En estos casos, los
ensayos expuestos aquí puede ser fácilmente modificados por
agregado de tal(es) compuesto(s) de prueba
adicional(es) ya sea simultáneamente con, o de manera
subsiguiente a, el primer compuesto de prueba. El resto de las
etapas en el ensayo se desarrollan como se ha expuesto en la
presente.
Los ensayos in vitro tales como aquéllos
descriptos en la presente pueden ser utilizados ventajosamente para
rastrear grandes cantidades de compuestos para determinar un efecto
sobre la formación de un complejo de polipéptido VGF y un
acompañante de unión de polipéptido VGF. Los ensayos pueden ser
automatizados para rastrear compuestos generados en exhibición de
fago, péptido sintético, y bibliotecas de síntesis química.
Los compuestos que aumentan o disminuyen la
formación de un complejo de polipéptido VGF y un acompañante de
unión de polipéptido VGF pueden también ser rastreados en cultivo
celular utilizando células y líneas celulares que expresan tanto
polipéptido de VGF como un acompañante de unión de polipéptido de
VGF. Las células y líneas de células pueden ser obtenidas de
cualquier mamífero, pero preferentemente será de fuentes humanas o
de otras fuentes de primates, caninos, o roedores. La unión de un
polipéptido VGF a células que expresan acompañante de unión de
polipéptido de VGF a nivel superficial es evaluada en presencia o
ausencia de moléculas de prueba, y la extensión de unión puede ser
determinada por, por ejemplo, citometría de flujo utilizando un
anticuerpo biotinilado para un acompañante de unión de polipéptido
de VGF. Los ensayos de cultivo celular pueden ser usados
ventajosamente para evaluar
adicionalmente compuestos que dan resultados positivos en los ensayos de unión de proteínas descriptos en la presente.
adicionalmente compuestos que dan resultados positivos en los ensayos de unión de proteínas descriptos en la presente.
Los cultivos celulares pueden ser también
empleados para rastrear el impacto de un candidato de droga. Por
ejemplo, los candidatos de droga pueden disminuir o acrecentar la
expresión del gen de VGF. En ciertas realizaciones, la cantidad de
polipéptido VGF o de un fragmento de polipéptido VGF que es
producido puede ser medida después de exposición del cultivo celular
al candidato de droga. En ciertas realizaciones, se puede detectar
el impacto real del candidato de droga sobre el cultivo celular. Por
ejemplo, la sobreexpresión de un gen determinado puede tener un
impacto particular sobre el cultivo celular. En tales casos, se
puede poner a prueba una capacidad del candidato de droga para
incrementar o disminuir la expresión del gen o su capacidad para
evitar o inhibir un impacto particular sobre el cultivo celular. En
otros ejemplos, la producción de un producto metabólico particular
tal como un fragmento de un polipéptido, puede dar como resultado, o
estar asociado con, una enfermedad o cuadro patológico. En tales
casos, se puede poner a prueba una capacidad del candidato de droga
para disminuir la producción de tal producto metabólico en un
cultivo celular.
La secuencia de proteína tat (de HIV)
puede ser utilizada para internalizar proteínas dentro de una
célula. Véase, por ejemplo, Falwell y otro(s), 1994, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91: 664-68. Por
ejemplo, una secuencia de 11 aminoácidos
(Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R;
SEQ ID NO: 11) de la proteína tat de HIV (denominada el
"dominio de transducción de proteína" o TAT PDT) ha sido
descripta como mediando la transferencia a través de la membrana
citoplasmática y la membrana nuclear de una célula. Véase Schwarze y
otro(s), 1999, Science, 285: 1569-72;
y Nagahara y otro(s), 1998, Nat. Med., 4:
1449-52. En estos procedimientos, se preparan
construcciones de FITC
(G-G-G-G-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R
rotulada con FITC; SEQ ID NO: 12), que penetran los tejidos a
continuación de la administración intraperitoneal, y se detecta la
unión de tales construcciones a células por análisis de
clasificación celular activado por fluorescencia (FACS). Las células
tratadas con una proteína de fusión
tat-\beta-gal demostrarán la actividad de
\beta-gal. Luego de la inyección, la expresión de
una construcción tal puede ser detectada en una pluralidad de
tejidos, incluyendo tejido de hígado, riñón, pulmón, corazón, y
cerebro. Se cree que tales construcciones sufren algún grado de
desplegado a fin de ingresar a la célula, y como tal, puede
requerir un replegado después de la entrada a la célula.
Se apreciará de tal modo que la secuencia de
proteína tat puede ser utilizada para internalizar un
polipéptido deseado en una célula. Por ejemplo, empleando la
secuencia de proteína tat, un antagonista de VGF (tal como un
agente de unión selectivo anti-VGF, molécula
pequeña, receptor soluble, u oligonucleótido
anti-sentido) puede ser administrado
intracelularmente para inhibir la actividad de una molécula de VGF.
Tal como se lo emplea aquí, el término "molécula de VGF" hace
referencia tanto a moléculas de ácido nucleico de VGF como a
polipéptidos VGF como se definen en la presente. En el caso de que
se desee, la proteína de VGF misma puede ser también administrada
internamente a una célula empleando estos procedimientos. Véase
también, Straus, 1999, Science,
285-1466-67.
Los polipéptidos VGF y los agentes de unión
selectivos de la presente invención pueden ser empleados para
tratar, diagnosticar, mejorar, o prevenir una cantidad de
enfermedades y cuadros agudos y crónicos, incluyendo aquéllos
mencionados en la presente.
Las enfermedades, cuadros, y trastornos
relacionados con VGF incluyen obesidad, esterilidad, caquexia,
trastornos de la alimentación, complejo relacionado con SIDA;
cuadros hipermetabólicos, hiperactividad, hipoactividad, e
hiperproducción de insulina.
Otras enfermedades causadas, o mediadas, por
niveles indeseables de polipéptidos VGF están comprendidas dentro de
los alcances de la presente invención. Niveles indeseables incluyen
niveles excesivos de polipéptidos VGF y niveles
sub-normales de polipéptidos VGF.
Las composiciones terapéuticas se encuentran
dentro de los alcances de la presente invención. Tales composiciones
farmacéuticas de polipéptido VGF pueden comprender una cantidad
terapéuticamente efectiva de un polipéptido VGF en mezcla con un
agente de formulación farmacéutica o fisiológicamente aceptable
elegido de modo que sea adecuado para el modo de administración. Las
composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad
terapéuticamente efectiva de uno o más agentes de unión selectivos
para polipéptido VGF en mezcla con un agente de formulación
farmacéutica o fisiológicamente aceptable elegido de modo que sea
adecuado para el modo de administración.
Los materiales de formulación aceptables son
preferentemente no tóxicos a los receptores a las dosis y
concentraciones empleadas.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener
materiales de formulación para modificar, mantener, o preservar, por
ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la transparencia, el
color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, el
régimen de disolución o de transferencia, la adsorción, o la
penetración de la composición. Materiales de formulación adecuados
incluyen, pero sin estar limitados a, aminoácidos (tales como
glicina, glutamina, asparagina, arginina, o lisina), agentes
antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito
de sodio, o sulfito ácido de sodio), tampones (tales como borato,
bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, u otros
ácidos orgánicos), agentes de volumen (tales como manitol o
glicina), agentes quelantes (tales como ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA)), agentes formadores de complejos
(tales como cafeína, polivinilpirrolidona,
beta-ciclodextrina, o
hidroxipropil-beta-ciclodextrina),
rellenos, monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos (tales
como glucosa, manosa, o dextrinas), proteínas (tales como albúmina
de suero, gelatina, o inmunoglobulina), colorantes, agentes
savorizantes y diluyentes, agentes emulsionantes, polímeros
hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo
peso molecular, contraiones formadores de sal (tales como sodio),
preservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico,
ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno,
propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico, o peróxido de
hidrógeno), solventes (tales como glicerina, propilenglicol, o
polietilenglicol), alcoholes de azúcar (tales como manitol o
sorbitol), agentes de suspensión, agentes tensioactivos o
humectantes (tales como pluronics; PEG; ésteres de sorbitán;
polisorbatos tales como polisorbato 20 o polisorbato 80; tritón;
trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal), agentes
intensificadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol),
agentes intensificadores de la tonicidad (tales como haluros de
metal alcalino -preferentemente cloruro de sodio o potasio- o
manitol sorbitol), vehículos de transferencia, diluyentes,
excipientes, y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase Remington's
Pharmaceutical Sciences (18ª edición, A. R. Gennaro, editor,
Mack Publishing Company, 1990).
La composición farmacéutica óptima será
determinada por un profesional experimentado en función de, por
ejemplo, la vía de administración pretendida, el formato de
administración, y la dosis deseada. Véase Remington's
Pharmaceutical Sciences, supra. Tales composiciones
pueden influenciar el estado físico, la estabilidad, el régimen de
transferencia in vivo, y el régimen de clearance in
vivo de la molécula de VGF.
El vehículo o portador primario en una
composición farmacéutica puede ser ya sea de naturaleza acuosa o
bien no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador aceptables para
inyección puede ser agua, solución salina fisiológica, o fluido
cerebroespinal sintético, suplementados posiblemente con otros
materiales comunes en composiciones para administración parenteral.
Otros vehículos que se pueden mencionar como ejemplo son solución
salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina de
suero. Otros ejemplos de composiciones farmacéuticas comprenden
tampón de Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o
tampón de acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que
puede incluir además sorbitol o un substituto adecuado. En una
realización de la presente invención, las composiciones de
polipéptido VGF puede ser preparadas para almacenamiento mezclando
la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con
agentes de formulación óptimos (Remington's Pharmaceutical
Sciences, supra) en la forma de torta liofilizada o una
solución acuosa. Además, el producto de polipéptido VGF puede ser
formulado como un producto liofilizado utilizando excipientes
apropiados tales como sacarosa.
Las composiciones farmacéuticas de polipéptido
VGF pueden ser seleccionadas para administración parenteral.
Alternativamente, las composiciones pueden ser elegidas para
inhalación o para transferencia a través del tracto digestivo, tal
como por vía oral. La preparación de tales composiciones
farmacéuticamente aceptables se encuentra dentro de la técnica de la
especialidad.
Los componentes de formulación están presentes en
concentraciones que sean aceptables para el sitio de administración.
Por ejemplo, se emplean tampones para mantener la composición a pH
fisiológico o a pH ligeramente inferior, típicamente dentro de un
intervalo de pH de desde aproximadamente 5 a aproximadamente 8.
Cuando está contemplada la administración
parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta
invención pueden encontrarse en la forma de una solución acuosa
parenteralmente aceptable libre de pirógenos que comprenda la
deseada molécula de VGF en un vehículo farmacéuticametne aceptable.
Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es
agua destilada estéril en la cual una molécula de VGF es formulada
como una solución isotónica estéril, apropiadamente preservada. Otra
preparación más puede implicar la formulación de la molécula deseada
con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas
bio-erosionables, compuestos poliméricos (tales como
ácido poliláctico o ácido poliglicólico), glóbulos, o liposomas, que
proporcionan la transferencia controlada o sostenida del producto
que puede ser luego transferido a través de una inyección de
depósito. También puede emplearse ácido hialurónico, y éste puede
tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación.
Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada
incluye dispositivos de transferencia de droga implantables.
En una realización, una composición farmacéutica
puede ser formulada para inhalación. Por ejemplo, el polipéptido VGF
puede ser formulado como un polvo seco para inhalación. También
pueden ser formuladas soluciones de inhalación de molécula de
polipéptido de VGF o de ácido nucleico con un propelente para
administración por aerosol. En aún otra realización, las soluciones
pueden ser nebulizadas, La administración pulmonar es descripta
además en la Publicación PCT Nº WO 94/20069, que describe la
transferencia pulmonar de proteínas modificadas químicamente.
Se contempla también que ciertas formulaciones
pueden ser administradas por vía oral solamente. En una realización
de la presente invención, los polipéptidos VGF que son administrados
de esta manera pueden ser formulados con o sin aquellos vehículos
corrientemente utilizados en la composición de formas de
dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo,
una cápsula puede ser diseñada para liberar al agente activo de la
formulación en el tracto gastrointestinal en el momento en el cual
la biodisponibilidad se encuentra maximizada y la degradación
pre-sistémica minimizada. Pueden ser incluidos
agentes adicionales para facilitar la absorción del polipéptido VGF.
Pueden también ser empleados diluyentes, saborizantes, ceras de bajo
punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de
suspensión, agentes de desintegración de comprimidos, y
aglutinantes.
Otra composición farmacéutica puede involucrar
una cantidad efectiva de polipéptidos VGF en una mezcla con
excipientes no tóxicos que sean adecuados para la fabricación de
comprimidos. Disolviendo los comprimidos en agua estéril, u otro
vehículo apropiado, se pueden preparar soluciones en forma de dosis
unitaria. Excipientes adecuados incluyen, pero sin estar limitados
a, diluyentes inertes, tales como carbonato o bicarbonato de
calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa, o fosfato de
calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina, o goma
arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio,
ácido esteárico, o talco.
Otras composiciones farmacéuticas de polipéptido
VGF serán evidentes para aquéllos con conocimientos en la
especialidad, incluyendo formulaciones que involucran polipéptidos
de VGF en formulaciones de transferencia sostenida o controlada. Son
también conocidas por aquéllos con experiencia en la especialidad
técnicas para formular una variedad de otros medios de transferencia
sostenida o controlada, tales como vehículos de liposoma,
micropartículas bio-erosionables o glóbulos porosos
e inyecciones de depósito. Véase, al respecto, PCT/US 93/00829, que
describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas
porosas para la transferencia de composiciones farmacéuticas.
Ejemplos adicionales de preparaciones de
liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en
la forma de artículos configurados, por ejemplo, películas, o
microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir
poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (Patente Estadounidense Nº
3,773,919 y Publicación EP Nº 058481), copolímeros de ácido
L-glutámico y gamma
etil-L-glutamato (Sidman y
otro(s), 1983, Biopolymers, 22:
547-56), poli(metacrilato de
2-hidroxietilo) (Langer y otro(s), 1981,
J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 y Langer,
1982, Chem. Tech., 12: 98-105), acetato de
etilenvinilo (Langer y otro(s), supra) o ácido
poli-D(-)-3-hidroxibutírico
(Publicación EP Nº 133988). Composiciones de liberación sostenida
pueden también incluir liposomas, que se pueden preparar por
cualquiera de diversos métodos conocidos en la especialidad. Véase,
por ejemplo, Eppstein y otro(s), 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 82: 3688-92 y Publicaciones EP
Nos. 036676, 088046, y 143949.
La composición farmacéutica de VGF a ser empleada
para administración in vivo debe ser típicamente estéril.
Esto puede lograrse por medio de filtración a través de membranas de
filtrado estériles. En los casos que la composición sea liofilizada,
la esterilización empleando este método puede ser llevada acabo ya
sea antes de, o después de, la liofilización y reconstitución. La
composición para administración parenteral puede ser almacenada en
forma liofilizada o en una solución. Además, las composiciones
parenterales generalmente son colocadas en un recipiente que tenga
una boca de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de
solución intravenosa que tiene un tapón que se puede perforar con
una aguja de inyección hipodérmica.
Una vez que la composición farmacéutica ha sido
formulada, puede ser almacenada en frascos estériles como una
solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o como un polvo
deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden ser
almacenadas ya sea en una forma lista para usar o en una forma (por
ejemplo liofilizada) que requiere. En una realización específica la
presente invención está dirigida a kits para la producción de unidad
de administración de dosis única. Los kits contienen cada uno tanto
un primer recipiente que tiene una proteína seca como un segundo
recipiente que tiene una formulación acuosa. También incluidos
dentro de los alcances de esta invención se encuentran kits que
contienen jeringas pre-cargadas de cámara única o de
múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas de líquido y
lisojeringas).
La cantidad efectiva de una composición
farmacéutica de VGF a ser empleada terapéuticamente dependerá de,
por ejemplo, del contexto y de los objetivos terapéuticos. Una
persona con conocimientos en la especialidad apreciará que los
niveles de dosis apropiados para el tratamiento variarán de este
modo en parte en función de la molécula transferida, la indicación
para la cual la molécula de VGF está siendo usada, la vía de
administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal, o
tamaño del órgano) y el estado (la edad y salud general) del
paciente. En concordancia, el clínico puede titular la dosis y
modificar la vía de administración para obtener el efecto
terapéutico óptimo. Una dosis típica puede variar de desde
aproximadamente 0,1 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más,
dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras
realizaciones, la dosis puede variar de desde aproximadamente 0,1
\mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg; o de desde 0,1 \mug/kg a
aproximadamente 100 mg/kg; o de desde 5 \mug/kg a aproximadamente
100 mg/kg.
La frecuencia de dosificación dependerá de los
parámetros farmacocinéticos de la molécula de VGF en la formulación
que se vaya a utilizar. Típicamente, un clínico administrará la
composición hasta que sea alcanzada una dosis que logra el efecto
deseado. La composición puede ser por consiguiente administrada como
una dosis única, como dos o más dosis (que pueden contener o no la
misma cantidad de la molécula deseada) a través del tiempo, o como
una infusión continua, a través de un dispositivo de implantación o
un catéter. Un ajuste fino ulterior de la dosis apropiada es
efectuado rutinariamente por aquéllos con conocimientos corrientes
en la especialidad y se encuentra dentro del ámbito de las tareas
llevadas a cabo rutinariamente por ellos. Las dosis apropiadas
pueden ser determinadas a través del uso de informaciones de
respuesta a dosis apropiadas.
La vía de administración de la composición
farmacéutica está de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, por
vía oral, a través de inyección por las vías intravenosa,
intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal),
intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial,
intraportal, o intralesional; a través de sistemas de liberación
sostenida, o a través de dispositivos de implantación. En el caso de
que se desee, las composiciones pueden ser administradas por
inyección de bolo o en forma continua por infusión, o mediante
dispositivo de implantación.
Alternativa o adicionalmente, la composición
puede ser administrada localmente a través de implantación de una
membrana, esponja, u otro material apropiado dentro del cual la
molécula deseada haya sido absorbida o encapsulada. En el caso de
que se emplee un dispositivo de implantación, el dispositivo puede
ser implantado en cualquier tejido u órgano adecuados, y la
transferencia de la molécula deseada puede ser llevada a cabo por
difusión, bolo de liberación programada en el tiempo, o
administración continua.
En algunos casos, puede resultar deseable
utilizar composiciones farmacéuticas de polipéptido VGF de una
manera ex vivo. En tales casos, las células, tejidos, u
órganos que han sido extraídos del paciente se exponen a
composiciones farmacéuticas de polipéptido VGF después de lo cual
las células, tejidos, u órganos se reimplantan seguidamente en el
paciente.
En otros casos, un polipéptido VGF puede ser
transferida por implantación de ciertas células que han sido
modificadas mediante ingeniería genética, utilizando métodos tales
como aquéllos descriptos en la presente, para expresar y secretar al
polipéptido VGF. Tales células pueden ser células animales o
humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas, o xenogénicas.
Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. A fin de
disminuir el riesgo de una respuesta inmunológica, las células
pueden ser encapsuladas para evitar la infiltración de tejidos
circundantes. Los materiales de encapsulado son envolturas o
membranas poliméricas típicamente semipermeables biocompatibles que
permiten la liberación de el/los producto(s) de proteína pero
evitan la destrucción de las células por el sistema inmune del
paciente u otros factores perjudiciales provenientes de los tejidos
circundantes.
Como se trata en la presente, puede ser deseable
tratar poblaciones de células aisladas (tales como células madres,
linfocitos, glóbulos rojos, condrocitos, neuronas, y similares) con
uno o más polipéptidos VGF. Esto puede llevarse a cabo exponiendo
las células aisladas al polipéptido directamente, en los casos en
los que éste se encuentra en una forma que es permeable a la
membrana celular.
Realizaciones adicionales de la presente
invención se refieren a células y métodos (por ejemplo,
recombinación homóloga y/u otros métodos de producción
recombinantes) tanto para producción in vitro de polipéptidos
terapéuticos como para la producción y transferencia de polipéptidos
terapéuticos por terapia genética o terapia celular. Pueden
emplearse métodos de recombinación homóloga y otros de recombinación
para modificar una célula que contiene un gen de VGF por lo regular
transcripcionalmente silente, o un gen
sub-expresado, y producen de tal modo una célula que
expresa cantidades terapéuticamente eficaces de polipéptidos
VHG.
La recombinación homóloga es una técnica
originalmente desarrollada para dirigir genes para inducir o
corregir mutaciones en genes transcripcionalmente activos,
Kucherlapati, 1989, Prog. in Nucl. Acid Res. & Mol.
Biol., 36: 301. La técnica básica se desarrolló como un método
para la introducción de mutaciones específicas en regiones
específicas del genoma de mamífero (Thomas y otro(s), 1986,
Cell, 44: 419-28; Thomas Y Capecchi, 1987,
Cell, 51: 503-12; Doetschmann y
otro(s), 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:
8583-87) o para corregir mutaciones específicas
dentro de genes defectivos (Doetschmann y otro(s), 1987,
Nature., 330: 576-78). Técnicas de
recombinación homóloga que pueden servir de ejemplo se describen en
la Patente Estadounidense Nº 5,272,071: Publicaciones EP Nos.
9193081 y 505500; PCT/US 90/07642; y Publicación PCT Nos. WO
91/09955).
A través de la recombinación homóloga, la
secuencia de ADN a ser insertada en el genoma puede ser dirigida a
una región específica del gen de interés por acoplamiento de la
misma a ADN direccionado ["targeting"]. El ADN direccionado es
una secuencia de nucleótidos que complementaria (homóloga) respecto
de una región del ADN genómico. Pequeñas partes de ADN direccionado
que son complementarias respecto de una región específica del genoma
son puestos en contacto con la hebra madre durante el proceso de
replicación del ADN. Es en general una propiedad del ADN que ha sido
insertado en una célula hibridizarse, y por consiguiente,
recombinarse con otras partes de ADN endógeno a través de regiones
homólogas compartidas. Si esta hebra complementaria es acoplada a
un oligonucleótido que contiene una mutación o una secuencia
diferente o un nucleótido adicional, es incorporada también a la
hebra recientemente sintetizada como un resultado de la
recombinación. Como un resultado de la función de lectura de prueba,
es posible que la nueva secuencia de ADN sirva como la plantilla. De
este modo, el ADN transferido es incorporado en el genoma.
Acopladas a estas partes de ADN direccionado se
encuentran regiones de ADN que pueden interactuar con o controlar la
expresión de un polipéptido VGF, por ejemplo, secuencias de
flanqueo. Por ejemplo, un elemento de promotor/intensificador, un
supresor, o un elemento modulador de transcripción exógeno es
insertado en el genoma de la célula huésped prevista en proximidad y
orientación suficiente para influir la trascripción del ADN que
codifica el polipéptido VGF deseado. El elemento de control controla
una porción del ADN presente en el genoma de la célula huésped. De
este modo, la expresión del polipéptido VGF deseado puede ser
lograda no por transfección de ADN que codifica al gen de VGF mismo,
sino más bien mediante el uso de ADN direccionado (que contiene
regiones de homología con el gen endógeno de interés) acoplado con
segmentos reguladores de ADN que proporcionan la secuencia de gen
endógena con señales reconocibles para transcripción de un gen de
VGF.
En un método ilustrativo, la expresión de un gen
seleccionado como objetivo deseado en un célula (es decir, un gen
celular endógeno deseado) es alterado a través de recombinación
homóloga dentro del genoma celular en un lugar preseleccionado,
mediante la introducción de ADN que incluye al menos una secuencia
reguladora, un exón, y un sitio de donor de empalme. Estos
componentes son introducidos en ADN cromosomal (genómico) de una
manera tal que éste, en efecto, da como resultado la producción de
una nueva unidad de transcripción (en la cual la secuencia
reguladora, el exón, y el sitio de donor de empalme presentes en la
construcción de ADN están vinculadas operativamente con el gen
endógeno). Como un resultado de la introducción de estos componentes
en el ADN cromosomal, se altera la expresión del gen endógeno
deseado.
La expresión alterada de genes, tal como se
describe aquí, comprende activar (o hacer que sea expresado) un gen
que es normalmente silente (no expresado) en la célula como es
obtenida, así como también incrementar la expresión de un gen que no
está expresado en niveles fisiológicamente significativos de la
célula como es obtenida. Las realizaciones abarcan además el cambio
de patrón de regulación o inducción de modo tal que el mismo sea
diferente del patrón de regulación o inducción que se presenta en la
célula como es obtenida, y reducir (incluyendo eliminar) la
expresión de un gen que es expresado en la célula como es
obtenida.
Un método mediante el cual puede ser utilizada
recombinación homóloga para incrementar, o provocar, la producción
de polipéptido VGF a partir de un gen de VGF endógeno de una célula
implica primero utilizar recombinación homóloga para colocar una
secuencia de recombinación de un sistema de recombinación específica
de sitio (por ejemplo, Cre/loxP, FLP/FRT) (Sauer, 1994, Curr.
Opin. Biotechnol., 5: 521-27; Sauer, 1993,
Methods Enzymol., 228: 890-900) corriente
arriba de (es decir, 5' respecto de) la región de codificación de
polipéptido VGF genómica endógena de la célula. Un plásmido que
contiene un sitio de recombinación homólogo respecto del sitio que
estaba ubicado justo corriente arriba de la región de codificación
de polipéptido VGF genómica es introducido en la línea celular
modificada conjuntamente con la enzima recombinasa apropiada. Esta
recombinasa hace que el plásmido se integre, a través del sitio de
recombinación del plásmido, al sitio de recombinación ubicado justo
corriente arriba de la región de codificación de polipéptido VGF
genómico en la línea celular (Baubonis y Sauer, 1993, Nucleic
Acids Res., 21: 2025-29; O'Gorman y
otro(s), 1991, Science, 251: 1351-55).
Cualquier secuencia de flanqueo conocida que incremente la
transcripción (por ejemplo, intensificador/promotor, intrón,
intensificador de traducción), si está posicionada apropiadamente en
este plásmido, se integraría de una manera tal de generar una unidad
transcripcional nueva o modificada dando como resultado la
producción de nuevo o aumentada de polipéptido VGF a partir del gen
de VGF endógeno de la célula.
Otro método para usar la línea celular en la cual
la secuencia de recombinación específica de sitio había sido
colocada justo corriente arriba de la región de codificación de
polipéptido VGF genómica endógena de la célula es emplear
recombinación endógena para introducir un segundo sitio de
recombinación en alguna parte del genoma de la línea celular. La
enzima recombinasa apropiada es luego introducida en la línea
celular de dos sitios de recombinación, provocando un episodio de
recombinación (deleción, inversión, y translocación) (Sauer, 1994,
Curr. Opin. Biotechnol., 5: 521-27; Sauer,
1993, Methods Enzymol., 228: 890-900) que
generaría una unidad transcripcional nueva o modificada dando como
resultado la producción de nuevo o aumentada de polipéptido VGF a
partir del gen de VGF endógeno de la célula.
Un enfoque adicional para incrementar, o
provocar, la expresión de polipéptido VGF a partir de un gen de VGF
endógeno de la célula implica incrementar, o provocar, la expresión
de un gen o genes (por ejemplo, factores de transcripción) y/o
disminuir la expresión de un gen o genes (por ejemplo, represores
transcripcionales) de una manera que de cómo resultado la producción
de nuevo o aumentada de polipéptido VGF a partir del gen de VGF
endógeno de la célula. Este método incluye la introducción de un
polipéptido de presencia no natural (por ejemplo, un polipéptido que
comprende un dominio de unión de ADN específico de sitio fusionado a
un dominio de factor transcripcional) en la célula de modo tal que
resulte la producción de nuevo o aumentada de polipéptido VGF a
partir del gen de VGF endógeno de la célula.
La terapia de célula de polipéptido VGF, por
ejemplo, la implantación de células que producen polipéptidos VGF,
está también contemplada. Esta realización implica la implantación
de células capaces de sintetizar y secretar una forma biológicamente
activa de polipéptido VGF. Tales células productoras de polipéptido
VGF pueden ser células que son productores naturales de polipéptidos
VGF o pueden ser células recombinantes cuya capacidad para producir
polipéptidos VGF ha sido aumentada por transformación con un gen que
codifica al polipéptido VGF deseado o con un gen que aumenta la
expresión del polipéptido VGF. Tal modificación puede ser lograda
por medio de un vector adecuado para la transferencia del gen así
como también la promoción de su expresión y secreción. A fin de
minimizar una reacción inmunológica potencial en pacientes a los que
se les está administrando un polipéptido VGF, como puede tener
lugar con la administración de un polipéptido de una especie
extraña, se prefiere que las células naturales que producen
polipéptido VGF sean de origen humano y produzcan polipéptido VGF
humano. Asimismo, se prefiere que las células recombinantes
productoras de polipéptido VGF sean transformadas con un vector de
expresión que contenga un gen que codifique un polipéptido VGF
humano, pudiendo ser las células implantadas encapsuladas para
evitar la infiltración de tejidos circundantes. Las células de
animales humanas o no humanas pueden ser implantadas en pacientes en
envolturas o membranas poliméricas semipermeables biocompatibles que
permitan la liberación de polipéptido VGF, pero que eviten la
destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por
otros factores perjudiciales provenientes del tejido circundante.
Alternativamente, las células propias del paciente, transformadas
para que produzcan polipéptidos VGF ex vivo, pueden ser
implantadas directamente dentro del paciente sin tal
encapsulamiento.
Son conocidas en la especialidad técnicas para el
encapsulamiento de células vivas, y la preparación de las células
encapsuladas y su implantación en pacientes pueden ser logradas
rutinariamente. Por ejemplo, Baetge y otro(s) (Publicación
PCT Nº WO 95/05452 y PCT/US 94/09299) describe cápsulas de membrana
que contienen células modificadas por ingeniería genética para la
transferencia efectiva de moléculas biológicamente activas. Las
cápsulas son biocompatibles y son fácilmente recuperables. Las
cápsulas encapsulan células transfectadas con moléculas de ADN
recombinante que comprende secuencias de ADN que codifican moléculas
biológicamente activas vinculadas operativamente con promotores que
no están sometidos a regulación hacia abajo in vivo después
de implantación dentro de una célula de mamífero. Los dispositivos
prevén la transferencia de las moléculas desde células vivientes a
sitios específicos dentro de un receptor. Además, véanse las
Patentes Estadounidenses Nos. 4,892,538; 5,011,472; y 5,106,627. Un
sistema para encapsulado de células vivientes se describe en la
Publicación PCT Nº WO 91/10425 (Aebischer y otro(s)). Véase
también la Publicación PCT Nº WO 91/10470 (Aebischer y
otro(s)); Winn y otro(s), 1991, Exper. Neurol.,
113: 322-28; Aebischer y otro(s), 1991,
Exper. Neurol, 111: 269-75; y Tresco y
otro(s), 1992, ASAIO, 38:17-23.
La administración de terapia génica in
vivo e in vitro está también contemplada. Un ejemplo de
técnica de terapia génica es emplear un ácido nucleico (ya sea ADN
genómico, ADNc, y/o ADN sintético) que codifica un polipéptido VGF
que puede estar operativamente vinculado con un promotor
constitutivo o inducible para formar una "construcción de ADN para
terapia génica". El promotor puede ser homólogo o heterólogo
respecto del gen de VGF endógeno, con la condición de que sea activo
en el tipo de célula o tejido en el cual la construcción vaya a ser
insertada. Otros componentes de la construcción de ADN para terapia
génica puede incluir opcionalmente moléculas de ADN diseñadas para
integración especifica de sitio (por ejemplo, secuencias endógenas
útiles para recombinación homóloga), promotores específicos de
tejido, intensificadores o silenciadores, moléculas de ADN capaces
de proporcionar una ventaja selectiva sobre la célula madre,
moléculas de ADN útiles como rótulos para identificar células
transformadas, sistemas de selección negativa, agentes de unión
específicos de célula (como, por ejemplo, para direccionado de
células), factores de internalización específicos de célula,
factores de transcripción que refuerzan la expresión desde un
vector, y factores que permiten la producción de vector.
Una construcción de ADN para terapia génica puede
ser luego introducido en células (ya se ex vivo o in
vivo) utilizando vectores virales o no virales. Un medio para la
introducción de la construcción de ADN para terapia génica es por
medio de vectores virales como se describe en la presente. Ciertos
vectores, tales como vectores retrovirales, transferirán la
construcción de ADN al ADN cromosomal de las células, pudiendo el
gen integrarse en el ADN cromosomal. Otros vectores funcionarán como
epitomas, y la construcción de ADN para terapia génica permanecerá
en el citoplasma.
En incluso otras realizaciones, pueden ser
incluidos elementos reguladores para la expresión controlada del gen
de VGF en la célula diana. Tales elementos son activados en
respuesta a un efector apropiado. De esta manera, puede ser
expresado un polipéptido terapéutico cuando se desee. Un medio de
control convencional implica el uso de dimerizadores o rapálogos de
molécula pequeña para dimerizar proteínas quiméricas que contienen
un dominio de unión de molécula pequeña y un dominio capaz de
iniciar un proceso biológico, tal como una proteína de unión a ADN o
una proteína de activación transcripcional (véanse Publicaciones PCT
Nos. WO 96/41865, WO 97/31898, y WO 97/31899). La dimerización de
las proteínas puede ser empleada para iniciar la transcripción
del
transgen.
transgen.
Una tecnología de regulación alternativa emplea
un método de almacenamiento de proteínas expresadas a partir del gen
de interés dentro de la célula como un agregado o agrupamiento
["cluster"]. El gen de interés es expresado como una proteína
de fusión que incluye un dominio de agregación condicional que da
como resultado la retención de la proteína agregada en el retículo
endoplasmático. Las proteínas almacenadas son estables e inactivas
dentro de la célula. Las proteínas pueden ser liberadas, sin
embargo, por la administración de una droga (por ejemplo, un ligando
de molécula pequeña) que elimina el dominio de agregación
condicional y con ello separa específicamente los agregados o
agrupamientos de modo que las proteínas puedan ser secretadas de la
célula. Véase Aridor y otro(s), 2000, Science, 287:
816-17 y Rivers y otro(s), 2000,
Science, 287: 826-30.
Otros medios de control adecuados o llaves de
encendido ["switches"] de genes incluyen, pero sin estar
limitados a, los sistemas descriptos en la presente. Se emplea
mifepristone (RU486) como un antagonista de progesterona. La unión
de un dominio de unión de ligando de receptor de progesterona
modificado al antagonista de progesterona activa la transcripción
formando un dímero de dos factores de transcripción que luego pasan
al núcleo para unirse a ADN. El dominio de unión de ligando es
modificado para eliminar la capacidad del receptor de unirse al
ligando natural. El sistema de receptor de hormona esteroide
modificado es descripto además en la Patente Estadounidense Nº
5,364,791 y las Publicaciones PCT Nos. WO 96/40911 y WO
97/10337.
Aún otro sistema de control utiliza ecdisona (una
hormona esteroide de la mosca de la fruta) que se une a y activa un
receptor de ecdisona (receptor citoplasmático). El receptor se
transloca luego al núcleo para unirse a un elemento de respuesta a
ADN específico (promotor procedente del gen que responde a la
ecdisona). El receptor de ecdisona incluye un dominio de
transactivación, un dominio de unión a ADN, y un dominio de unión a
ligando para iniciar la transcripción. El sistema de ecdisona es
descripto además en la Patente Estadounidense Nº 5,514,578 y las
Publicaciones PCT Nos. WO 97/38117, WO 96/37609, y WO 93/03162.
Otro medio de control emplea un transactivador
controlable por tetraciclina positivo. Este sistema involucra un
dominio de unión de ADN de proteína de represor tet (cambios de
aminoácido de tet R-4 mutado que dan como resultado
una proteína de transactivador regulada por tetraciclina inversa, es
decir, se une a un operador tet en presencia de tetraciclina)
vinculada a un polipéptido que activa la transcripción. Tales
sistemas se describen en las Patentes Estadounidenses Nos.
5,484,758; 5,650,298; y 5,654,168.
Sistemas de control de expresión y construcciones
de ácido nucleico adicionales se describen en las Patentes
Estadounidenses Nos. 5,741,679 y 5,834,186, de Innovir Laboratories,
Inc.
La terapia de gen in vivo puede lograrse
introduciendo una molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido VGF dentro de células a través de inyección local o
mediante otros vectores de transferencia virales o no virales.
Hefti, 1994, Neurology, 25: 1418-35. Por
ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido
VGF puede estar contenida en un vector de virus
adeno-asociado (AAV) para lograr la transferencia a
las células seleccionadas como objetivo (véase, al respecto, Jonson,
Publicación PCT Nº WO 95/34670, Solicitud PCT Nº PCT/US 95/07178).
El genoma de AAV recombinante contiene típicamente repeticiones
terminales invertidas de AAV que flanquean una secuencia de ADN que
codifica un polipéptido VGF vinculado operativamente con secuencias
de promotor y de poliadenilación funcionales.
Alternativamente vectores virales adecuados
incluyen, pero sin estar limitados a, vectores de retrovirus,
adenovirus, virus de herpes simplex, lentivirus, virus de hepatitis,
parvovirus, papovavirus, poxvirus, alfavirus, coronavirus,
rabdovirus, paramixovirus, y virus de papiloma. La Patente
Estadounidense Nº 5,672,344 describe un sistema de transferencia de
gen mediado en forma viral in vivo que involucra un vector
de HSV-1 neurotrófico recombinante. La Patente
Estadounidense Nº 5,399,346 proporciona ejemplos de un proceso para
suministrar a un paciente una proteína terapéutica mediante la
transferencia de células humanas que han sido tratadas in
vitro para insertarles un segmento de ADN que codifica una
proteína terapéutica. Otro métodos y materiales para la práctica de
técnicas de terapia génica se describen en las Patentes
Estadounidenses Nos. 5,631,236 (que se refiere a vectores
adenovirales); 5,672,510 (que se refiere a vectores retrovirales); y
5,635,399 (que se refiere a citoquinas que expresan vectores
retrovirales).
Métodos de transferencia no virales incluyen,
pero sin estar limitados a, transferencia mediada por liposoma,
transferencia de ADN desnudo (inyección directa), transferencia
mediada por receptor (complejo de ligando-ADN),
electroporación, precipitación con fosfato de calcio, y bombardeo
con micropartículas (por ejemplo, cañón de genes). Los materiales y
métodos para terapia génica pueden incluir también promotores
inducibles, intensificadores-promotores específicos
de tejido, secuencias de ADN diseñadas para integración especifica
de sitio, secuencias de ADN capaces de proporcionar una ventaja
selectiva sobre la célula madre, rótulos para identificar células
transformadas, sistemas de selección negativos y sistemas de control
de expresión (medidas de seguridad), agentes de unión específicos de
célula (para direccionado de célula), factores de internalización
específicos de célula, y factores de transcripción para reforzar la
expresión mediante un vector así como también métodos de fabricación
de vectores. Tales métodos y materiales adicionales para la práctica
de técnicas de terapia génica se describen en las Patentes
Estadounidenses Nos. 4,970,154 (que involucra técnicas de
electroporación), 5,679,559 (que describe un sistema que contiene
lipoproteína para transferencia génica), 5,676,954 (que involucra
vehículos de liposoma), 5,593,875 (que describe métodos para
transfección de fosfato de calcio), y 4,945,050 (que describe un
proceso en el cual partículas biológicamente activas son lanzadas en
células a una velocidad en la cual las partículas penetran la
superficie de las células y se incorporan en el interior de las
mismas), y la Publicación PCT Nº WO 96/40958 (que involucra
ligandos nucleares).
Está también contemplado que la terapia génica o
la terapia celular con VGF puedan incluir además la transferencia de
uno o más polipéptidos adicionales en la misma o en diferentes
células. Tales células pueden ser introducidas por separado dentro
del paciente, o las células pueden estar contenidas en un
dispositivo implantable único, tal como la membrana de
encapsulamiento descripta anteriormente, o las células pueden ser
modificadas separadamente por medio de vectores virales.
Un medio para incrementar la expresión de
polipéptido VGF endógena en una célula a través de una terapia
génica es insertar uno o más elementos de intensificador en un
promotor de polipéptido VGF, en donde los elementos de
intensificador pueden servir para incrementar la actividad
transcripcional de un gen de VGF. Los elementos de intensificador
utilizados se seleccionarán en base al tejido en el cual se desean
activar los elementos de gen-intensificador
conocidos para conferir activación de promotor en aquel tejido que
se seleccionará. Por ejemplo, si un gen que codifica un polipéptido
VGF debe ser "encendido" en células T, el elemento de
intensificador de promotor Ick puede ser usado. En este caso, la
porción funcional del elemento transcripcional a ser añadido puede
ser insertado en un fragmento de ADN que contenga al promotor de
polipéptido VGF (y opcionalmente, insertado en un vector y/o
secuencias de flanqueo de 5' y/o de 3') empleando técnicas de
clonación corrientes. Esta construcción, conocida como una
"construcción de recombinación homóloga" puede ser entonces
introducida en las células deseadas ex vivo o in
vivo.
La terapia génica puede ser también usada para
reducir la expresión de polipéptido VGF mediante la modificación de
la secuencia de nucleótido del promotor endógeno. Tal modificación
se logra típicamente a través de métodos de recombinación homóloga.
Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene toda o una porción del
promotor del gen de VGF seleccionado para inactivación pueden ser
modificado para eliminar y/o reemplazar partes del promotor que
regulan la transcripción. Por ejemplo, pueden ser suprimidas la caja
TATA y/o el sitio de unión de un activador transcripcional del
promotor utilizando técnicas de biología molecular convencionales,
pudiendo tal deleción inhibir la actividad de promotor reprimiendo
de tal modo la transcripción del correspondiente gen de VGF. La
deleción de la caja TATA o del sitio de unión de activador de
transcripción en el promotor puede ser llevada a cabo mediante la
generación de una construcción de ADN que comprenda la totalidad o
la porción relevante del promotor de polipéptido VGF (procedente de
la misma o de una especie relacionada con el gen de VGF a ser
regulado) en el cual uno o más de los nucleótidos de la caja TATA
y/o del sitio de unión de activador transcripcional son mutados por
substitución, deleción y/o inserción de uno o más nucleótidos. Como
resultado, la caja TATA y/o el sitio de unión de activador
transcripcional han disminuido su actividad o se han vuelto
completamente inactivos. Esta construcción, que también contendrá
típicamente al menos aproximadamente 500 bases de ADN que
corresponden a las secuencias de 5' y 3' nativas (endógenas)
adyacentes al segmento de promotor que ha sido modificado, puede ser
introducida en las células apropiadas (tanto ex vivo como
in vivo) ya sea directamente o a través de un vector viral
como se describe en la presente. Típicamente, la integración de la
construcción dentro del ADN genómico de las células se realizará a
través de recombinación homóloga, pudiendo servir las secuencias de
ADN de 5' y de 3' en la construcción de promotor para ayudar en la
integración de la región de promotor modificada por medio de
hibridación al ADN cromosomal endógeno.
Los polipéptidos VGF pueden ser utilizados
(simultáneamente o uno tras otro) en combinación con una o más
citoquinas, factores de crecimiento, antibióticos,
antiinflamatorios, y/o agentes quimioterapéuticos según sea
apropiado para el cuadro que se esté tratando.
Se pueden emplear también otros métodos en los
casos que sea deseable para inhibir la actividad de uno o más
polipéptidos VGF. Tal inhibición puede ser llevada a cabo mediante
moléculas de ácido nucleico que son complementarias con y se
hibridan para dar secuencias de control de expresión (formación de
triple hélice) o para dar ARNm de VGF. Por ejemplo, moléculas de ADN
o ARN antisentido, que tienen una secuencia que es complementaria
con al menos una porción de un gen de VGF pueden ser introducidas en
la célula. Pueden ser diseñadas sondas antisentido mediante técnicas
disponibles utilizando la secuencia del gen de VGF dado a conocer en
la presente. Típicamente, cada una de tales moléculas antisentido
será complementaria con el sitio de comienzo (extremo de 5') de cada
gen de VGF seleccionado. Cuando la molécula antisentido se hibrida
luego para dar el correspondiente ARNm de VGF, la traducción de este
ARNm es evitada o reducida. Los inhibidores antisentido proporcionan
información relativa a la disminución o ausencia de un polipéptido
VGF en una célula u organismo.
Alternativamente, la terapia génica puede ser
empleada para crear un inhibidor dominante-negativo
de uno o más polipéptidos VGF. En esta situación, el ADN que
codifica un polipéptido mutante de cada polipéptido VGF seleccionado
puede ser preparado e introducido en las células de un paciente
utilizando ya sea métodos virales o no virales según se describe
aquí. Cada uno de tales mutantes está típicamente diseñado para
competir con polipéptido endógeno en su rol biológico.
Además, un polipéptido VGF, sea biológicamente
activo o no, puede ser usado como un inmunogen, es decir, el
polipéptido contiene al menos un epítopo al cual puedan ser atraídos
los anticuerpos. Agentes de unión selectivos que se unen a un
polipéptido VGF (como se describe en la presente) pueden ser
empleados para propósitos de diagnóstico in vivo e in
vitro, incluyendo, pero sin estar limitados a, uso en forma
rotulada para detectar la presencia de polipéptido VGF en un fluido
corporal o muestra celular. Los anticuerpos pueden ser utilizados
también para prevenir, tratar, o diagnosticar una cantidad de
enfermedades y trastornos, incluyendo aquéllos mencionados en la
presente. Los anticuerpos pueden unirse a un polipéptido VGF de modo
de disminuir o bloquear al menos una característica de actividad de
un polipéptido VGF, o puede unirse a un polipéptido para incrementar
al menos una característica de actividad de un polipéptido VGF
(incluyendo el incremento de la farmacoquinesia del polipéptido
VGF).
Los polipéptidos VGF de la presente invención
pueden ser utilizados para clonar receptores de polipéptido VGF,
utilizando un estrategia de clonación de expresión. Pueden ser
empleados polipéptido VGF radiorotulado (125-yodo) o
polipéptido VGF con etiquetamiento de afinidad/actividad (tal como
una fusión de Fc o una fusión de fosfatasa alcalina) en ensayos de
unión para identificar un tipo de célula o línea celular o tejido
que exprese receptores de polipéptido VGF. El ARN aislado de tales
células o tejidos puede ser convertido en ADNc, clonado en un vector
de expresión de mamífero, y transfectado en células de mamífero (tal
como células COS o 293) para generar una biblioteca de expresión. Un
polipéptido VGF radiorotulado o etiquetado puede ser entonces
empleado como un ligando de afinidad para identificar y aislar de
esta biblioteca el subconjunto de células que expresan los
receptores de polipéptido VGF en su superficie. El ADN puede ser
entonces aislado de estas células y transfectado en células de
mamífero para crear una biblioteca de expresión secundaria en la
cual la fracción de células que expresan los receptores de
polipéptido VGF es muchas veces mayor que en la biblioteca original.
El procedimiento de enriquecimiento puede ser repetido
reiteradamente hasta que se aísle un solo clon recombinante que
contenga un receptor de polipéptido VGF. El aislamiento de los
receptores de polipéptido VGF es útil para la identificación o
desarrollo de agonistas y antagonistas novedosos del mecanismo de
señalización del polipéptido VGF. Tales agonistas y antagonistas
incluyen receptores de polipéptido VGF solubles, anticuerpos
anti-receptor de polipéptido VGF, moléculas
pequeñas, u oligonucleótidos antisentido, y los mismos pueden ser
usados para tratar, prevenir, o diagnosticar una o más de las
enfermedades o cuadros descriptos en la presente.
Los siguientes ejemplos están concebidos solo con
propósitos de ilustración, y no deberán ser interpretados como
limitando los alcances de la invención de ninguna manera.
Los anticuerpos contra polipéptidos VGF son
producidos por inyección a conejos de polipéptidos VGF sintetizados
por el grupo Amgen Boulder Peptide Technology utilizando protocolos
de síntesis de péptidos standard. A continuación de la síntesis de
péptido, los polipéptidos VGF de diferentes lotes son reunidos y
liofilizados. Se determinó el contenido de péptido para cada
polipéptido VGF por hidrólisis con HCl.
Para preparar anticuerpos
anti-polipéptido VGF policlonales a partir de
polipéptidos VGF (VGF-I; SEQ ID NO: 1 o
VGF-2; SEQ ID NO: 4; Tabla I) que carecían de
residuos de cisterna, se transfirieron 5 mg de un polipéptido VGF y
0,5 mL de tampón de conjugación Inject® EDC (Pierce, Rockford, IL) a
un frasco de 2 mL, y la mezcla se agitó por formación de vórtice. Se
diluyó un frasco de 20 mg de hemocianina Inject® de lapa
californiana (keyhole limpet) (Pierce) en 2 mL de agua esterilizada,
y se agregaron 0,5 mL de esta solución a la solución de polipéptido
VGF. Después de la adición de hemocianina de lapa californiana
(keyhole limpet), se agregó 0,1 mL de EDC (10 mg de EDC (Pierce) en
1 mL de agua esterilizada) al polipéptido VGF y este solución se
incubó a temperatura ambiente durante al menos 2 horas.
Después de la incubación, se transfirió
polipéptido VGF conjugado a tubería de diálisis Spectra/Por 6
(Spectrum Laboratories, Rancho Domínguez, CA), que tiene un corte de
peso molecular de 1000, y se dializó en 2 L de PBS durante toda la
noche a 4ºC para eliminar el EDTA, que es un conocido
anticoagulante, de la muestra. La solución de polipéptido conjugado
dializada se transfirió a un tubo cónico de 15 mL y se agregó PBS
para llevar el volumen de la solución a 4 mL. Se transfirieron
alícuotas de 1 mL cada una a tubos con tapa a rosca de 2 mL, siendo
aspirada cada alícuota en una jeringa de vidrio de 2 mL, y luego se
aspiró 1 mL de adyuvante de investigación Titermax® (CytRx_{2},
Norcross, Georgia).
La jeringa se conectó con una aguja de mezclado
calibre 18 y la solución se mezcló para que se emulsionara. La
mezcla se transfirió luego a dos jeringas de 1 mL para ser inyectada
intramuscularmente a los conejos. Los conejos fueron inyectados con
0,1 mL de solución de polipéptido VGF/adyuvante en 2 sitios de
inyección, y luego se les aplicó a los conejos un refuerzo a las 4
semanas y a las 6 semanas a partir de entonces. Se les tomaron a los
conejos muestras de sangre (extrayendo aproximadamente 5 mL) a
continuación del segundo refuerzo, siendo extraídas nuevas muestras
luego después de dos semanas. Si los sangrados de producción eran
juzgados como aceptables, a los conejos se les aplicaba nuevamente
un refuerzo y se les tomaba entonces una muestra una vez a la semana
durante seis semanas (extrayendo aproximadamente 40 mL) dos semanas
después de este refuerzo. Las Figuras 1 y 2 ilustran los niveles de
título de anticuerpo de conejos a los que se les inyectó ya sea
VGF-1 o VGF-2.
Para preparar anticuerpos antipolipéptido VGF
policlonales a partir de polipéptido VGF que posee residuos de
cisterna, se transfirieron 5 mg de un polipéptido VGF y 0,5 mL de
tampón de conjugación de maleimida Inject® (Pierce) a un frasco de 2
mL, y la mezcla se agitó por formación de vórtice. Se diluyó en 2 mL
de agua esterilizada un frasco de 20 mg de hemocianina de lapa
californiana (keyhole limpet) Inject® (Pierce), y se agregó 0,5 mL
de esta solución a la solución de polipéptido VGF. A continuación de
la adición de hemocianina de lapa californiana (keyhole limpet), la
solución de polipéptido VGF se incubó a temperatura ambiente durante
al menos 2 horas.
Después de la incubación, se transfirió
polipéptido VGF conjugado a tubería de diálisis Spectra/Por 6 y se
dializó en 2 L de PBS durante toda la noche a 4ºC para eliminar el
EDTA de la muestra. La solución de polipéptido VGF conjugado
dializada se transfirió a un tubo cónico de 15 mL y se agregó PBS
para llevar el volumen de la solución a 4 mL. Se transfirieron
alícuotas de 1 mL cada una a tubos con tapa a rosca de 2 mL, siendo
aspirada cada alícuota dentro de una jeringa de vidrio de 2 mL, y
luego se aspiró 1 mL de adyuvante de investigación Thermax®
(CytRx).
La jeringa se conectó con una aguja de mezclado
de calibre 18 y la solución se mezcló para que se emulsionara. La
mezcla se transfirió entonces a dos jeringas de 1mL para inyección
intramuscular en conejos. A los conejos se les inyectó 0,1 mL de
polución de polipéptido VGF/adyuvante en 2 sitios de inyección,
siéndole aplicado un refuerzo a los conejos a las 4 semanas y 6
semanas a partir de entonces. Se les tomaron muestras de sangre a
los conejos (extrayendo aproximadamente 5 mL) después del segundo
refuerzo y luego se tomaron nuevamente muestras de sangre después de
dos semanas. Si los sangrados de producción eran juzgados como
aceptables, a los conejos se les aplicaba nuevamente un refuerzo y
se les tomaba entonces una muestra una vez a la semana durante seis
semanas (extrayendo aproximadamente 40 mL) dos semanas después de
este refuerzo.
Se analizó la actividad biológica de polipéptidos
VGF en ratones "knockout" empleando polipéptidos VGF
sintetizados por el grupo Amgen Boulder Peptide Technology
utilizando protocolos de síntesis de péptidos standard. A
continuación de la síntesis de los péptidos, se reunieron
polipéptidos VGF procedentes de diferentes lotes y se liofilizaron.
Se determinó el contenido de péptido de cada polipéptido VGF por
hidrólisis con HCl.
Los ratones "knockout" con gen de VGF se
obtuvieron de Steve Salton de Mt. Sinai School of Medicine, Nueva
York, NY. Antes de la administración del polipéptido VGF, los
ratones "knockout" se alojaron en condiciones de LO de 12:12
(es decir, 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad). Veinticuatro
horas antes de la inyección de polipéptido VGF, los ratones
"knockout" se pusieron en jaulas individuales y se llevaron a
un recinto de alojamiento temporario en donde los ratones se
mantuvieron durante el resto del experimento bajo condiciones de LO
de 12:12.
El polipéptido VGF fue administrado a los ratones
"knockout" dos veces por día (a las 9.00 de la mañana y a las
6.00 de la tarde) por inyección intraperitoneal de 2 mg de
VGF-1a (SEQ ID NO. 2; Tabla 1). Antes de la
inyección, el polipéptido VGF-1a se diluyó a 16% en
tampón de solución de aCSF (NaCl 126,6 mM; KCl 2,6 mM; MgCl_{2}
2,0 mM; y CaCl_{2} 1,4 mM; NaPO_{4} 10 mM; pH 7,4). Se les
administró a los ratones "knockout" polipéptido
VGF-1a durante cinco días y se midió diariamente el
peso corporal de cada ratón. El peso corporal de ratones tratados se
midió diariamente durante 3 días después de retirar el polipéptido
VGFF-1.
La Figura 1 ilustra el peso corporal de ratones
"knockout" productores de VGF a continuación de la
administración de VGF-1a. Tres de los cuatro ratones
tratados ganaron 10-15 por ciento en peso corporal.
A partir de este experimento, no fue posible determinar si el
incremento de peso era el resultado de un consumo mayor de alimento
o agua.
Los polipéptidos VGF son expresados como
proteínas de fusión con una región Fc de cadena pesada de IgC de
inmunoglobulina humana en su carboxi-término o
amino-término. Utilizando cebadores de PCR
apropiados y procedimientos de amplificación de PCR corrientes, se
preparan las construcciones de fusión de polipéptidos
VGF-Fc fusionando en marco una secuencia de ADN que
codifica la región Fc de IgC humano con aquélla que codifica
polipéptido VGF-1 (SEQ ID NO: 1),
VGF-1b (SEQ ID NO: 3), o VGF-2 (SEQ
ID NO: 4).
Los productos de fusión polipéptido
VGF-Fc generados por PCR son digeridos con las
endonucleasas de restricción Nde I y Bam H1, ligadas dentro de un
vector pAMG21, y luego trasformados dentro de células de E.
coli cepa 2596 competentes utilizando técnicas standard. Los
clones son rastreados para determinar su capacidad de producir
producto de proteína recombinante y de poseer la fusión de gen que
tenga la secuencia de nucleótido correcta.
Se crían cultivos bacterianos que contengan las
construcciones de fusión de Fc en la cepa de E. coli GM221 a
37ºC en medio de Caldo Luria que contiene 50 mg/mL de canamicina. Se
logra inducción de expresión de producto génico a partir del
promotor luxPR después de la adición del autoinductor sintético
lactona de
N-(3-oxohexanoil)-DL-homoserina
al medio de cultivo hasta una concentración final de 20 ng/mL. Los
cultivos se incuban a 37ºC durante 3 horas adicionales. Después de
la incubación, los cultivos bacterianos son examinados por
microscopía para determinar la presencia de cuerpos de inclusión y
son luego recolectados por centrifugación. Los pellets de células
son lisados directamente por resuspensión en tampón de muestra de
Laemmli que contiene 10% de \beta-mercaptoetanol y
son analizados por SDS-PAGE.
Las proteínas de fusión polipéptido
VGF-Fc son purificadas separando primero las células
en agua utilizando homogenización de alta presión (es decir, 2
pasadas a 95,5 MPa [14.000 psi]). Los cuerpos de inclusión son
recolectados por centrifugación a 4200 r.p.m. en
J-6B durante 1 hora y los cuerpos de inclusión son
solubilizados en guanidina 6 M, Tris 50 mM, DTT 8 mM, pH 8,7 durante
1 hora con un relación de 1/10. La mezcla solubilizada es luego
diluida 20 veces en urea 2 M, Tris 50 mM, arginina 160 mM, cisterna
3 mM, pH 8,5. La mezcla se agita durante toda la noche en el frío,
se concentra aproximadamente 10 veces por ultrafiltración, y luego
se diluye 3 veces con Tris 10 mM, urea 1,5 M, pH 9. El pH de esta
mezcla es luego ajustado a pH 5 con ácido acético. El precipitado es
eliminado por centrifugación y el sobrenadante es cargado en una
columna SP-Sepharose Fast Flow equilibrada en NaAc
20 mM, NaCl 100 mM, pH 5 (carga de proteína 10 mg/mL, temperatura
ambiente). La proteína es eluida de la columna empleando un
gradiente de volumen de columna 20 en el mismo tampón que varía de
desde NaCl 100 mM a NaCl 500 mM. Los productos de la columna
reunidos se diluyeron 3 veces y se cargaron en una columna
SP-Sepharose de HP en de NaAc 20 mM, NaCl 150 mM, pH
5 (carga de proteína 10 mg/mL, temperatura ambiente). La proteína
es eluida utilizando un gradiente de volumen de columna 20 en el
mismo tampón que varía de desde NaCl 150 mM a NaCl 400 mM. El pico
es reunido y filtrado.
La actividad de la proteína de fusión polipéptido
VGF-Fc es evaluada utilizando métodos descriptos en
la presente o conocidos por una persona con experiencia corriente en
la especialidad.
Para evaluar la actividad biológica de
polipéptido VGF, se preparó una construcción que codificaba un
polipéptido VGF murino bajo el control del promotor de sinapsina
utilizando protocolos standard. Se espera que la transferencia de
esta construcción cause cambios patológicos que permitan extraer
información en que respecta a la función del polipéptido VGF. De
manera similar, se preparó una construcción que contenía al
polipéptido VGF de longitud completa bajo el control del promotor de
beta actina utilizando protocolos standard. Se espera que la
transferencia de esta construcción de cómo resultado expresión
ubicua.
Para generar estas construcciones, se utilizó PCR
para amplificar secuencias de ADN de plantilla que codificaban
polipéptido murino utilizando cebadores que correspondían a los
extremos de 5' y 3' de la secuencia deseada y que incorporaba sitios
de enzima de restricción para permitir la inserción del producto
amplificado en el vector de expresión. Después de la amplificación,
los productos de PCR se purificaron en gel, se digirieron con las
enzimas de restricción apropiadas, y se acoplaron a un vector de
expresión empleando técnicas de ADN recombinante convencionales.
Véase, Graham y otro(s), 1997, Nature Genetics, 17:
272-74 y Ray y otro(s), 1991, Genes
Dev., 8: 2265-73.
Después del ligado, las mezclas de reacción se
usaron para transformar una cepa de E. Coli por
electroporación y se seleccionaron transformantes para resistencia a
droga. Se aislaron plásmidos de ADN de colonias seleccionadas y se
sometieron a secuenciamiento de ADN para confirmar la presencia de
un inserto apropiado y ausencia de mutación. Los vectores de
expresión de polipéptido VGF se purificaron a través de dos rondas
de centrifugación de gradiente de densidad de CsC1, se escindieron
con una enzima de restricción apropiada, y se purificó el fragmente
linearizado que contenía el trasgen de polipéptido VGF murino
mediante electroforesis en gel. El fragmento purificado fue
resuspendido en Tris 5 mM, pH 7,4, y EDTA 0,2 mM a una concentración
de 2 \mug/mL.
Se les inyectó a embriones unicelulares de
ratones de cría BDF1 x BDF1 según lo descripto (Publicación PCT Nº
97/23614), Los embriones se cultivaron durante toda la noche en un
incubador de CO_{2} y se transfirieron 15-20
embriones de dos células a los oviductos de un hembra de ratón CD1
pseudopreñada. Se rastrearon las crías obtenidas de la implantación
de embriones microinyectados por amplificación de PCR del transgen
integrado en muestras de ADN genómico de la siguiente manera: Se
digirieron trozos de oído ["ear pieces"] en 20 \muL de tampón
de oído (Tris 20 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, 0,5% de SDS, y 500 mg/mL de
proteinasa K) a 55ºC durante toda la noche. La muestra se diluyó
entonces con 200 \muL de TE, y 2 \muL de la muestra de oído se
utilizaron en una reacción de PCR utilizando cebadores
apropiados.
Se identificaron animales fundadores transgénicos
y se utilizaron para generar ratones F 1. Para llevar a cabo esto,
se extrajeron porciones del bazo, hígado y cerebro completo de
ratones F 1 y se aisló el ARN celular total de los bazos utilizando
el kit de extracción de ARN total (Qiagen) y expresión transgénica
determinada por RT-PCR. El ARN recuperado de los
bazos es convertido en ADNc usando el sistema de preamplificación
Superscript® (Gibco-BRL) como se indica a
continuación. Un cebador apropiado, ubicado en la secuencia de
vector de expresión y en 3' respecto del trasngen de polipéptido
VGF, es utilizado para cebar la síntesis de ADNc a partir de los
transcriptos transgénicos. Diez mg de ARN total preparado a partir
del tejido del hígado, cerebro y bazo de fundadores transgénicos y
controles son incubados con 1 mM de cebador durante 10 minutos a
70ºC y colocados en hielo. La reacción es entonces suplementada con
Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5
mM, 10 mM de cada dNTP, DTT 0,1 mM, y 200 U de transcriptasa inversa
SuperScript 11. Después de incubación por 50 minutos, la reacción es
detenida por calentamiento durante 15 minutos a 72ºC y digerida con
2 U de Rnasa H durante 20 minutos a 37ºC. Se amplifican entonces
muestras mediante PCR utilizando cebadores específicos para
polipéptido VGF murino.
Las crías de ratones F1 positivos transgénicos
son cruzadas para generar ratones homocigóticos F2. En nivel de
expresión de ARNm de VGF en ratones F2 se determino como se indica
aquí.
Antes de la eutanasia, los animales transgénicos
F2 obtenidos en el Ejemplo 4 se pesan, se anestesian mediante
isofluorano y se aspira la sangre mediante una punción cardíaca. Las
muestras se someten a análisis químico hematológico y de suero. Se
lleva a cabo examen radiográfico después del desangrado terminal.
Tras la disección basta, los órganos principales son sometidos a
análisis de peso.
Tras la disección basta, se extraen tejidos (es
decir, hígado, bazo, páncreas, estómago, el tracto gastrointestinal
completo, riñón, órganos reproductores, piel y glándulas mamarias,
hueso, cerebro, corazón, pulmón, timo, tráquea, esófago, tiroides,
glándulas suprarrenales, vejiga urinaria, nodos linfáticos y
musculatura esqueletal) y se fijan en Zn-formalina
tamponada al 10% para examen histológico. Después de la fijación,
los tejidos se procesan para obtener bloques de parafina y se
extraen secciones de 3 mm. Todas las secciones son teñidas con
hematoxilina y exosina, y son entonces sometidas a examen
histológico.
El bazo, nodo linfático, y parches de Peyer de
tanto los ratones transgénicos como de los de control se sometieron
a análisis inmunohistológico con anticuerpos específicos de célula B
y célula T de la manera que se describe a continuación. Las
secciones incluidas en parafina fijadas en formalina son
desparafinizadas e hidratas en agua desionizada. Las secciones son
desactivadas con peróxido de hidrógeno al 3%, bloqueadas con Protein
Block (Lipshaw, Pittsburgh, PA), e incubadas en B220 y CD3
anti-ratón monoclonal de rata (Harlan, Indianápolis,
IN). La unión a anticuerpos es detectada mediante inmunoglobulinas
anti-rata de conejo y estreptavidina conjugada con
peroxidasa biotiniladas (BioGenex, San Ramon, CA) con DAB como un
cromagen (Bio Tek, Santa Barbara, CA). Las secciones son
contrateñidas con hematoxilina.
Tras la necropsia, se extraen MLN y secciones de
bazo y timo de los animales transgénicos y de las crías de control.
Se preparan suspensiones unicelulares moliendo suavemente los
tejidos con el extremo plano de una jeringa contra el fondo de un
filtro de célula de nylon de 100 mm (Beckton Dickinson, Franklin
Lakes, NJ). Las células se lavan dos veces, se cuentan, y se incuban
entonces aproximadamente 1 x 10^{6} células de cada tejido
durante 10 minutos con 0,5 \mug de bloque de Fc CD 16/32
(Fc\gammaIII/II) en un volumen de 20 \muL. Las muestras se tiñen
entonces durante 30 minutos a 2-8ºC en un volumen de
100 \muL de PBS (que carece de Ca^{+} y Mg^{+}), 0,1% de
albúmina de suero bovino, y 0,01% de azida de sodio con 0,5 \mug
de anticuerpos de FITC o de anticuerpos monoclonales conjugados con
PE contra CD90.2 (Thy-1,2). CD45R (B220),
CDIIb(Mac-1), Gr-1, CD4 o CD8
(PharMingen, San Diego, CA). A continuación de la unión de los
anticuerpos, las células son lavadas y luego analizadas por
citometría de flujo en un FACScan (Beckton Dickinson).
Si bien la presente invención ha sido descripta
en términos de realizaciones preferidas, se entiende que a aquéllos
con conocimientos en la especialidad pueden ocurrírsele variaciones
y modificaciones. Por consiguiente, se pretende que las
reivindicaciones anexas cubran todas dichas variaciones equivalentes
que caen dentro de los alcances de la invención según se
reivindica.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Yan, Hai
\hskip1cmBoone, Tom
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polipéptidos VGF y métodos para el
tratamiento de trastornos relacionados con VGF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
00-422-A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/144,797
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-07-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gln Glu Glu Ala Asp Ala Glu Glu Arg Arg
Leu Gln Glu Gln Glu}
\sac{Glu Leu Glu Asn Tyr Ile Glu His Val Leu Leu
His Arg Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gln Glu Glu Ala Asp Ala Glu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gln Glu Gln Glu Glu Leu Glu Asn Tyr Ile
Glu His Val Leu Leu}
\sac{His Arg Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Glu Gly Ser Phe Leu Gly Gly Ser Glu Ala
Gly Glu Arg Leu Leu}
\sac{Gln Gln Gly Leu Ala Gln Val Glu Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gln Glu Glu Ala Pro Gly His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Phe His His Ala Leu Pro Pro Ala Arg His
His Pro Asp Leu Glu}
\sac{Ala Gln Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Gly Glu Asp Glu Val Gly Glu Glu Asp
Glu Glu Ala Ala Glu}
\sac{Ala Glu Ala Glu Ala Glu Glu Ala Glu Arg Ala
Arg Gln Asn Ala Leu}
\sac{Leu Phe Ala Glu Glu Glu Asp Gly Glu Ala Gly
Ala Glu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
Claims (19)
1. Un polipéptido aislado que tiene la secuencia
de aminoácidos como se presenta en la SEQ. ID. NO: 2.
2. Un polipéptido aislado que comprende un
fragmento de la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ.
ID. NO: 2, en el cual el fragmento tiene una actividad del
polipéptido como se presenta en la SEQ. ID. NO: 2.
3. Un polipéptido aislado que tiene la secuencia
de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una substitución de aminoácido conservativa, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2,
- (b)
- la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una inserción de aminoácido, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2,
- (c)
- la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una deleción de aminoácido, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2,
- (d)
- la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, que tiene al menos una truncación C- y/o N-terminal, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2, y
- (e)
- la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, con al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en substituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos, truncación carboxi-terminal y truncación amino-terminal, y teniendo el polipéptido una actividad del polipéptido como se presenta en la SEQ ID NO: 2.
4. Un polipéptido de fusión que comprende al
polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3
fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.
5. El polipéptido de fusión de la reivindicación
4, en el cual la secuencia de aminoácidos heteróloga es un dominio
constante de IgC o fragmento del mismo.
6. Una composición que comprende al polipéptido
de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 y un agente de
formulación farmacéuticamente aceptable.
7. La composición de la reivindicación 6, en la
cual el agente de formulación farmacéuticamente aceptable es un
vehículo, adyuvante, solubilizante, estabilizador, o
antioxidante.
8. Un polipéptido que comprende un derivado del
polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
9. El polipéptido de la reivindicación 8 que está
covalentemente modificado con un polímero soluble en agua.
10. El polipéptido de la reivindicación 9, en el
cual el polímero soluble en agua se selecciona del grupo que
consiste en polietilenglicol,
monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa,
poli-(N-vinil pirrolidona) polietilenglicol,
homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de poli-óxido de
propileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados, y alcoholes
polivinílicos.
11. El polipéptido de la reivindicación 9, en el
cual el polímero soluble en agua se selecciona del grupo que
consiste en polietilenglicol y dextrano.
12. El uso de un polipéptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la fabricación de un
medicamento para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad,
trastorno, o cuadro relacionados con VGF.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12,
en el cual la enfermedad, trastorno, o cuadro relacionados con VGF
es obesidad.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 12,
en el cual la enfermedad, trastorno, o cuadro relacionados con VGF
se selecciona del grupo que consiste en esterilidad, caquexia,
trastornos de la alimentación, complejo relacionado con SIDA,
cuadros hipermetabólicos, hiperactividad, hipoactividad, e
hiperproducción de insulina.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14,
en el cual el trastorno de la alimentación es bulimia y anorexia
nerviosa.
16. Un método para diagnosticar in vitro
un cuadro relacionado con el polipéptido VGF o una susceptibilidad a
un cuadro relacionado con el polipéptido VGF en un sujeto que
comprende:
- (a)
- determinar la presencia o magnitud de expresión del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, y
- (b)
- diagnosticar un cuadro relacionado con el polipéptido VGF, o una susceptibilidad a un cuadro relacionado con el polipéptido VGF, en base a la presencia o magnitud de expresión del polipéptido.
17. Un método para identificar un compuesto que
se une a un polipéptido que comprende:
- (a)
- poner en contacto el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 con un compuesto, y
- (b)
- determinar la extensión de la unión del polipéptido al compuesto.
18. El método de la reivindicación 17 que
comprende además determinar la actividad del polipéptido cuando está
unido al compuesto.
19. Un dispositivo que comprende:
- (a)
- una membrana adecuada para implantación, y
- (b)
- células encapsuladas dentro de dicha membrana, en donde dichas células segregan una proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, siendo dicha membrana permeable a dicha proteína e impermeable a materiales perjudiciales para dichas células.
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