ES2255708T3 - Uso de anticuerpos para bloquear los efectos de las bacterias gram-positivas y las micobacterias. - Google Patents

Abstract

SE SUMINISTRA UN CONVERTIDOR DE ENLACE DE MODULACION DE ANCHURA DE IMPULSOS (PWM) DE TRANSICION DE TENSION CERO (ZVT) MEJORADO QUE INTRODUCE UN ESQUEMA DE MODULACION DE VECTOR DE ESPACIO Y UN CIRCUITO AUXILIAR QUE INCLUYE UNA FUENTE DE ALIMENTACION DE CONMUTACION (20) O UN DISPOSITIVO DE CONMUTACION ESPECIAL (S1-S6) UTILIZADO PARA DESCARGAR LAS CORRIENTES INDUCTORAS RESONANTES (LA, LB Y LC) A CERO Y PARA RECUPERAR LA ENERGIA DE CONMUTACION. EN UNA REALIZACION ALTERNATIVA, UN CONVERTIDOR DE ENLACE PWM ZVT MEJORADO SUMINISTRA UN CONMUTADOR AUXILIAR (SXU Y SXD) PARA CONMUTADOR PRINCIPAL (S1-S6) EN EL CONVERTIDOR PARA CONSEGUIR LA ZVT. LOS NUEVOS CONVERTIDORES ZVT SUMINISTRAN UNA CONMUTACION DE TENSION CERO SIN INCREMENTAR LA ACCION DE CONMUTACION DE LOS CONMUTADORES PRINCIPALES. DE ESTA FORMA, SE MANTIENEN LAS VENTAJAS DE CONTROL DE PWM. LA PERDIDA DE CONDUCCION, LAS PERDIDAS DE APAGADO Y EL ESFUERZO ELECTRICO DE LOS CONMUTADORES PRINCIPALES SON LOS MISMOS QUE EN LOS CONVERTIDORES PWM, PERO SEELIMINAN LAS PERDIDAS DE ENCENDIDO DOMINANTES, DE MANERA QUE SE MINIMICEN LAS PERDIDAS DE POTENCIA TOTALES.

Description

Uso de anticuerpos para bloquear los efectos de las bacterias Gram-positivas y las micobacterias.

Solicitudes de patentes estadounidenses relacionadas

Esta solicitud es una Continuación-en-Parte de la patente estadounidense nº de serie 07/990.378, rellenada en la Oficina de Patentes de los Estados Unidos el 15 de diciembre e 1992.

Declaración de derechos guvernamentales

Esta invención fue apoyada en parte por las becas nº A115136, GM28485, HL23586 y GM37696 del Instituto Nacional de Salud de los E.E.U.U. El gobierno estadounidense podría tener un interés significativo en esta invención.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención está relacionada con los métodos y composiciones para la prevención o tratamiento de estados de enfermedad causados por bacterias. Más concretamente, la presente invención está relacionada con los anticuerpos y moléculas que median la activación celular en respuesta a las bacterias Gram-positivas y a las micobacterias.

2. Descripción de la materia relacionada

El shock séptico es una complicación trágica de las infecciones bacterianas, que se caracteriza por hipotensión refractaria, lo que da lugar a una perfusión inadecuada de los órganos, fallo multiorgánico, y frecuentemente, la muerte (Glauser et al., Lancet, 338:732-736, 1991; Bone, Chest, 100:802-808, 1991). El lipopolisacárido (endotoxina, LPS) de las bacterias Gram-negativas dispara unas respuestas celulares y fisiológicas como las observadas durante la sepsis Gram-negativa (Glauser et al., supra; Ulevitch y Tobias, Curr. Opin. Immunol. 6:125-130, 1994). Las células de los sistemas inmune/inflamatorio responden al LPS a través de una vía que involucra tanto proteínas plasmáticas como de membrana (Ulevitch y Tobias, supra, 1994; Tobias et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 7:239-245, 1992). Se incluye en este grupo de proteínas la proteína de unión a lipopolisacárido (LBP), una proteína sérica soluble que se une al LPS y, consiguientemente, permite la unión del LPS a una segunda molécula, el CD14. La vía dependiente de LBP/CD14 está operativa en condiciones fisiológicas y controla la activación celular cuando se utilizan concentraciones nanomolares de LPS (Schumann et al., Science, 249:1429-1433, 1990; Wright et al., Science, 249:1431-1433, 1990). El CD14 se encuentra como una proteína de membrana anclada a glicosilfosfatidilinositol (mCD14) en las células mieloides, o como una proteína soluble (sCD14) en el plasma/suero (Ulevitch y Tobias, supra, 1994; Tobias et al., supra, 1992; Pugin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2744-2748, 1993a). La unión del LPS al mCD14 da lugar a la activación celular y a la generación de varias moléculas pro-inflamatorias (Ulevitch y Tobias, supra, 1994). Otros tipos celulares como las células endoteliales, epiteliales, del músculo liso vascular y los astrocitos, no muestran CD14 pero responden a complejos solubles CD14-LPS (Pugin et al., supra, 1993a; Frey et al., J. Exp. Med., 176:1665-1671, 1992). Una vía de estimulación del LPS, independiente de CD14 y LBP, se observa sólo cuando se utilizan concentraciones de LPS altas.

En ensayos multicéntricos recientes sobre la sepsis, se encontró que las bacterias Gram-positivas eran responsables de la mitad de los casos de sepsis bacteriana (Bone, Arch. Intern. Med., 154:26-34, 1994). La prevalencia de la sepsis debida a bacterias Gram-positivas ha aumentado de forma marcada en las dos últimas décadas, y estos microorganismos podrían perfectamente predominar como causa de sepsis durante los próximos años (Bone, supra, 1994; Schaberg et al., Am. J. Med., 91:72S-75S, 1991). Contrariamente a lo mucho que se ha estudiado el mecanismo de estimulación de las células por el LPS, los mecanismos moleculares de activación celular por las bacterias Gram-positivas son mucho menos conocidos. Los productos de las bacterias Gram-positivas que pueden activar las células huésped incluyen exotoxinas solubles y componentes de la pared celular (Bone, supra, 1994). Es conocido el hecho de que las paredes celulares aisladas de diferentes cepas Gram-positivas, así como los componentes de la pared celular purificados, como el peptidoglicano o el ácido lipoteicoico, activan las células de origen mieloide e inducen respuestas celulares muy similares a las del LPS (Chin y Kostura, J. Immunol., 151:5574-5585,1993; Mattson et al., FEMS Immun. Med. Microbiol., 7:281-288, 1993; Rotta, Z. Immunol. Forsch, Bd., 149:230-244, 1975). A pesar de ello, pocos estudios se han dirigido al estudio de los mecanismos de reconocimiento, dependientes de receptor, de los componentes de la pared celular de las Gram-positivas en células de mamífero.

La hipótesis de los receptores de reconocimiento de patrones avanzada por Janeway (Today, 13:11-16, 1992) sugiere que unas vías de reconocimiento celular comunes podrían estar involucradas en las respuestas a moléculas con características estructurales similares de una variedad de patógenos. Actualmente no existen datos que apoyen esta hipótesis, excepto una comunicación sobre la activación con lipoarabinomanano (LAM) de Mycobacterium tuberculosis de una línea celular humana de monocitos mediante mecanismos dependientes de CD14 (Zhang et al., J. Clin. Invest., 91:2076-2063, 1993). Además, el grupo de Espevik et al. (Eur. J. Immunol., 23:255-261, 1993; Otterlei et al., Infect. Immun., 61:1917-1925, 1993) identificó polímeros de ácido poliurónico ligados S1-4 de diferentes orígenes, lo que incluye especies de Pseudomonas, capaces de estimular los monocitos humanos de forma dependiente de CD14. Sin embargo, un estudio reciente sugiere que la liberación de factor de necrosis tumoral (TNF) por los monocitos humanos de sangre periférica, estimulados con grandes cantidades de componentes de la pared celular de Gram-positivas, no se inhibía mediante un anticuerpo monoclonal contra el CD14 humano, MY4, que bloquea la liberación de TNF inducida por el LPS bajo ciertas condiciones experimentales (Heumann et al., Infect. Immun., 69:2715-1721, 1994).

Para explorar en más detalle el papel del mCD14 o sCD14 en la mediación de respuestas celulares a las preparaciones de paredes celulares de organismos Gram-positivos y al LAM de las micobacterias, se compararon las respuestas de líneas celulares CD14-positivas y CD14-negativas a estos agonistas en presencia y ausencia de anticuerpos anti-CD14. Se encontró evidencia de una activación celular dependiente de CD14 por las preparaciones de paredes celulares de las Gram-positivas y por el LAM. Estos datos proporcionan una nueva información sobre las vías de activación celular utilizadas por las bacterias Gram-positivas y las micobacterias, y apoya el concepto de los receptores de reconocimiento de patrones en las células del sistema inmune.

Los conocimientos actuales apoyan el argumento de que la respuesta primaria del huésped (incluyendo los humanos) al LPS involucra el reconocimiento del LPS por las células de la estirpe de los monocitos/macrófagos, seguido de una rápida generación de una variedad de productos celulares que incluyen el grupo genérico conocido como citocinas. Otros tipos celulares que se cree que participan en la sepsis, y en particular, en la respuesta al LPS son los leucocitos polimorfonucleares y las células endoteliales; cada uno de estos tipos celulares es también capaz de responder al LPS con la generación de potentes sustancias inflamatorias.

Se cree que el LPS es una causa primaria de muerte durante la sepsis por Gram-negativos en humanos, en particular cuando los síntomas incluyen el síndrome de dificultad respiratoria aguda en el adulto (ARDS) (van Deventer et al., Lancet, 1:605, 1988; Ziegler et al., J. Infect. Dis., 136:19-28, 1987). Como ejemplo, una citocina en particular, el factor necrosis tumoral alfa/caquectina (TNF), se ha descrito recientemente como un mediador primario del shock séptico (Beutler et al., N. Eng. J. Med., 316:379, 1987). Una inyección intravenosa de endotoxina de LPS bacteriana en animales de experimentación y en humanos produce una liberación rápida y transitoria de TNF (Beutler et al., J. Immunol., 135:3972, 1985; Mathison et al., J. Clin. Invest., 81:1925, 1988). La evidencia de que el TNF es un mediador crítico del shock séptico se origina en unos experimentos en los que el pretratamiento de los animales con anticuerpos anti-TNF reduce la letalidad (Beutler et al., Science, 229:869, 1985; Mathison et al., J. Clin. Invest., 81:1925,1988). Estas comunicaciones sugieren que la interrupción de la secreción de TNF, causada por el LPS u otros factores, podría reducir los síntomas frecuentemente letales de la sepsis.

Tras la introducción del LPS en la sangre, éste puede unirse a una proteína llamada proteína de unión a lipopolisacárido (LBP). La LBP es una glicoproteína de 60 kD presente en concentraciones inferiores a 100 ng/ml en el suero de los animales sanos y en el hombre. Durante la fase aguda, la LBP es sintetizada por los hepatocitos, y alcanza concentraciones de 30-50 ng/ml en el suero. La LBP puede purificarse del suero de humanos y conejos en la fase aguda (Tobias et al., J. Exp. Med., 164:777-793, 1986). La LBP reconoce la región del lípido A del LPS y forma complejos de alta afinidad, con estequiometría 1:1 tanto con la forma rugosa como lisa del LPS (Tobias et al., 264:10867-10871, 1989). La LBP presenta homología de secuencia en N-terminal con la proteína de unión a LPS conocida como factor bactericida de aumento de la permeabilidad (BPI) (Tobias et al., supra, 1988). El BPI se almacena en unos gránulos específicos de los PMN (Weiss et al., Blood, 69:652-659, 1987) y mata a las bacterias Gram-negativas mediante la unión al LPS y la interrupción de la barrera de permeabilidad (Weiss et al., J. Immunol., 132:3109-3115, 1984). A diferencia del BPI, la LBP no es citotóxica directamente para las bacterias Gram-negativas (Tobias et al., J. Biol. Chem., 263:13479-13481, 1988) y su función biológica concreta permanece oscura.

Para aportar más antecedentes, las células de la estirpe de los monocitos/macrófagos realizan diferentes funciones inmunes, lo que incluye la fagocitosis de los microorganismos, la recogida de material antigénico y su presentación en una forma que es estimuladora de las células T ayudantes. Probablemente, éstas están también involucradas en la vigilancia inmune contra los tumores y secretan algunos componentes del complemento y citocinas. Los antígenos de la superficie de la membrana tienen un papel esencial en la regulación de estas actividades. Se han identificado muchos antígenos de la superficie de monocitos/macrófagos y se ha determinado su peso molecular. Uno de estos antígenos, el CD14, es una glicoproteína de 55 kD expresada por los monocitos, macrófagos, y granulocitos activados. Éste es reconocido por un número de anticuerpos monoclonales (mAb), incluidos el MO2, MY4, 3C10 y LEUM3. Aunque todavía no se le ha atribuido una función biológica al CD14, su expresión restringida a células maduras sugiere una función efectora importante. Se ha determinado la secuencia nucleotídica del gen que codifica el antígeno de diferenciación de la superficie celular de los monocitos CD14, y la secuencia de residuos aminoacídicos del CD14 se ha deducido de la misma (Ferrero et al., Nucleic Acids Research Vol., 16:4173, 1988).

Breve resumen de la invención

El receptor del CD14 es un regulador primario de la producción y liberación de citocinas, en particular en las células de la estirpe de los monocitos/macrófagos. Considerando que la secreción de citocinas juega un papel importante en la producción de los síntomas de la sepsis, la presente invención contempla los métodos y agentes para la inhibición de estas citocinas, concretamente del TNF.

La presente invención está relacionada con el uso de un anticuerpo anti-CD14, que inhibe la unión de los componentes toxigénicos de la pared celular de las Gram-positivas al CD14, para la preparación de una composición terapéutica para reducir la toxemia en pacientes que se asocien con una infección por bacterias Gram-positivas, en la que dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 63D3 producido por el hibridoma ATCC Núm. HB44 o por una célula transformada y que expresa un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo.

Además, la invención está relacionada con el uso de un anticuerpo anti-CD14, suficiente para inhibir en un paciente la secreción inducida por la toxina de la pared celular de las Gram-positivas de factor de necrosis tumoral por las células de la estirpe de los macrófagos monoclonales, para la preparación de una composición terapéutica para reducir los síntomas de la bacteriemia asociada con la infección por bacterias Gram-positivas en dicho paciente, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 63D3 producido por un hibridoma ATCC Núm. HB44 o por una célula transformada y que expresa un ácido nucléico que codifica dicho anticuerpo.

También se describe aquí la administración de un anticuerpo anti-CD14, preferiblemente por vía intravenosa, a un paciente con riesgo de sufrir o que sufre síntomas de la sepsis u otras condiciones resultantes de la exposición a toxinas bacterianas como el LPS, los componentes toxigénicos de la pared celular de las Gram-positivas, o el LAM de las micobacterias que inducen secreción de citocinas.

También se describe aquí un método para el tratamiento de los síntomas asociados con la infección por bacterias Gram-positivas y micobacterias, y la toxemia asociada con los componentes toxigénicos de la pared celular de las Gram-positivas, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD14 que bloquea la secreción de citocinas. El método puede utilizarse solo o en combinación con la administración sustancialmente simultanea de otras modalidades terapéuticas que se sabe previenen o reducen los síntomas de sepsis, lo que incluye el tratamiento con uno o más antibióticos, esteroides, anticuerpos anti-TNF, antagonistas del TNF y similares.

Además se describen las composiciones terapéuticas, típicamente en forma de una dosis unitaria, útiles para la prevención o reducción de los síntomas de bacteriemia asociada con una infección por bacterias Gram-positivas y micobacterias, y la toxemia asociada con los componentes toxigénicos de la pared celular de las Gram-positivas, como la sepsis. Las composiciones comprenden un transportador farmacéuticamente aceptable y contienen uno o más anticuerpos anti-CD14, o fragmentos del mismo que inhiben la producción de citocinas como ingrediente activo.

Dicha composición terapéutica puede contener además, como ingredientes activos, algunos agentes que se sabe previenen o reducen los síntomas de la sepsis, como los antibióticos, esteroides, anticuerpos anti-TNF, antagonistas del TNF, CD14 soluble y similares, tanto solos como en sub-combinación o combinación.

Breve descripción de las figuras

En las figuras que forman parte de la descripción de esta invención:

La Figura 1 ilustra que la LBP aumenta la interacción de los ELPS con los MO. Las monocapas de MO se incubaron con los E o ELPS^{lo} en presencia de dosis variadas de LBP, y se valoró el índice de unión. Una proteína de la fase aguda control, la proteína de unión a manosa (MBP) (5 ug/ml) no causó un aumento de la unión de los ELPS^{lo} (índice de unión 4.9). Los resultados representan 4 experimentos separados.

La Figura 2 ilustra que la unión dependiente de la LBP de los ELPS a los MO depende de la densidad del LPS en la membrana de los E. Los ELPS se prepararon con dosis variadas de LPS y luego se incubaron con las monocapas de MO en presencia o ausencia de 5 ug/ml de LBP. Los resultados representan 4 experimentos separados.

La Figura 3 ilustra que los MO no reconocen a la LBP en ausencia de LPS. Los E recubiertos sólo con biotina y estreptavidina (EBAV) se incubaron con LBP biotinilada para dar lugar a ELBP. Tanto los ELBP como los EBAV se incubaron con dosis concretas de LPS durante 20 min a 37ºC, se lavaron, y se midió la unión a monocapas de MO.

La Figura 4 ilustra que la LBP aumenta la fagocitosis mediada por Fc. Las monocapas de MO (día 5 de cultivo) se incubaron durante 45 min con E, ELBP, o EC3bi en presencia de varias diluciones de IgG anti-E. La fagocitosis de los E se determinó como se describe en Materiales y Métodos. Los ELBP se obtuvieron mediante la adición de 1 ug/ml de LBP a los ELPS^{lo} (0,3 ug de LPS/3x10 E) durante la incubación con los MO. La unión de estos E en ausencia de IgG anti-E fue como sigue: E, índice de unión (AI)=0; EC3bi, AI=417; ELBP, AI=404. Los resultados son representativos de seis experimentos separados.

La Figura 5 ilustra que la secreción de peróxido de hidrógeno ocurre durante la expansión de los MO en superficies recubiertas de ligando. Se añadieron 3x10^{4} MO (día 3 de cultivo) a pocillos microtitulados recubiertos y se midió a intervalos la evolución de peróxido de hidrógeno. Durante la expansión sobre complejos inmunes (HSA-anti-HSA, círculos rellenos) o en respuesta al agonista soluble, PMA (rombos rellenos) apareció una producción muy activa de peróxido. Durante la interacción con las superficies recubiertas con LPS (triángulos vacíos) se observó una liberación de peróxido baja pero reproducible. No obstante, la expansión sobre superficies recubiertas con LBP (cuadrados vacíos) no causó liberación, y el recubrimiento de las superficies recubiertas de LPS con LBP (rombos vacíos) prevenía la generación de peróxido inducida por el LPS. La LBP sola no impedía la producción o medida del peróxido ya que los MO en los pocillos recubiertos con LBP mostraron una evolución normal del peróxido en respuesta a PMA.

La Figura 6 ilustra la inhibición de la unión de los complejos LPS-LBP mediante anticuerpos monoclonales anti-CD14. Las monocapas de MO humanos se incubaron durante 15 min a 0ºC con las concentraciones indicadas de anticuerpos monoclonales. Se añadieron los eritrocitos recubiertos de forma secuencial con LPS y LBP, y se midió la unión. Los resultados son representativos de tres experimentos separados de respuesta a la dosis y de diez experimentos realizados a una concentración fija de anticuerpo. Las concentraciones altas de un gran panel de mAb dirigidos contra otros determinantes de los macrófagos no tuvieron ningún efecto en la unión de los ELBP.

La Figura 7 ilustra que los mAb anti-CD14 unidos a la membrana modulan negativamente la unión de los complejos LBP-LPS. Las monocapas de macrófagos humanos se establecieron sobre sustratos recubiertos con 25 ug/ml de los anticuerpos monoclonales indicados. Las células se lavaron, se añadieron los ELPS^{lo}, y se midió la unión.

La Figura 8 ilustra que la LBP nativa es necesaria para que el LPS induzca la producción de TNF. Los macrófagos de exudado peritoneal de conejo (PEM) se expusieron al LPS en presencia de las concentraciones indicadas de LBP nativa (LBP), LBP calentada (desnaturalizada), albúmina de suero bovino (BSA) o suero bovino fetal (FCS). Se determinó entonces la cantidad de TNF producido por los PEM expuestos.

La Figura 9 ilustra la susceptibilidad de la LBP a la digestión con tripsina en presencia o ausencia de un ligando al que se une, es decir, LPS de Re595. En los carriles adyacentes a los que contenían LBP aparecen los marcadores de peso molecular (Pharmacia, Piscataway, N.J.; Núm. catálogo 17-0446-01; fosforilasa B de 94 kilodaltons (kD), albúmina de suero bovino de 67 kD, ovoalbúmina de 43 kD, anhidrasa carbónica de 30 kD, inhibidor de la tripsina de soja de 20,1 kD y alfa lactalbúmina de 14,4 kD.). Los resultados sugieren que la unión de la LBP al LPS resulta en un cambio conformacional de la LBP, que podría ser responsable de su capacidad de unir CD14, sólo cuando está presente como parte de un complejo LPS-LBP.

La Figura 10A es un Western blot de los sobrenadantes de células murinas tratadas con fosfolipasa C específica de fosfoinositol, teñido con anti-IgG murina de conejo preparado como se describe en el Ejemplo 21. RAW = línea celular RAW 264,7 de macrófagos murinos; J774 = línea celular J774 de macrófagos murinos; LR9 = células LR9 mutantes de J774; L929 = células L929 de fibroblasto murino.

Las Figuras 10B y 10C son gráficas que muestran los resultados del análisis por FACS de las células J774 y LR9, respectivamente, que inmunoreaccionan con los fragmentos F(ab')_{2} de una anticuerpo IgG anti-CD14 murino de conejo o fragmentos de un F(ab')_{2} de una IgG control de un conejo no inmunizado, utilizando un anticuerpo secundario de cabra anti-conejo con FITC.

La Figura 11A es una gráfica que muestra la producción de nitrito por una línea celular J774 de macrófagos murinos, estimulada con el LPS de E. coli 0111:B4. Sólo LPS = círculos vacíos; LPS más 0,25 mg/ml de IgG de anti-CD14 murino = triángulos rellenos.

La Figura 11B es una gráfica que muestra la producción de nitrito por una línea celular LR9 (mutante de J774) de macrófagos murinos, estimulada con el LPS de E. coli O111:B4. Sólo LPS = círculos vacíos; LPS más 0,25 mg/ml de IgG de anti-CD14 murino = triángulos rellenos.

La Figura 11C es una gráfica que muestra la producción de nitrito por una línea celular J774 de macrófagos murinos, estimulada con las paredes celulares B. subtilis. Sólo paredes celulares = círculos vacíos; paredes celulares más 0,25 mg/ml de IgG de anti-CD14 murino = triángulos rellenos.

La Figura 11D es una gráfica que muestra la producción de nitrito por una línea celular LR9 (mutante de J774) de macrófagos murinos, estimulada con las paredes celulares B. subtilis. Sólo paredes celulares = círculos vacíos; paredes celulares más 0,25 mg/ml de IgG de anti-CD14 murino = triángulos rellenos.

La Figura 12A es una gráfica que muestra la producción de nitrito por macrófagos obtenidos del peritoneo murino de la cepa de ratón C3H/FeJ, en respuesta al LPS de E. coli O111:B4. Sólo LPS = círculos vacíos; LPS más 0,25 mg/ml de IgG de anti-CD14 murino = triángulos rellenos.

La Figura 12B es una gráfica que muestra la producción de nitrito por macrófagos obtenidos del peritoneo murino de la cepa de ratón C3H/HeJ, en respuesta al LPS de E. coli O111:B4. Sólo LPS = círculos vacíos; LPS más 0,25 mg/ml de IgG de anti-CD14 murino = triángulos rellenos

La Figura 12C es una gráfica que muestra la producción de nitrito por macrófagos obtenidos del peritoneo murino de la cepa de ratón C3H/FeJ, en respuesta a las paredes celulares B. subtilis. Sólo paredes celulares = círculos vacíos; paredes celulares más 0,25 mg/ml de IgG de anti-CD14 murino = triángulos rellenos.

La Figura 12D es una gráfica que muestra la producción de nitrito por macrófagos obtenidos del peritoneo murino de la cepa de ratón C3H/HeJ, en respuesta a las paredes celulares B. subtilis. Sólo paredes celulares = círculos vacíos; paredes celulares más 0,25 mg/ml de IgG de anti-CD14 murino = triángulos rellenos.

La Figura 12E es una gráfica que muestra la producción de nitrito por macrófagos obtenidos del peritoneo murino de la cepa de ratón C3H/FeJ, en respuesta a las paredes celulares de S. aureus. Sólo paredes celulares = círculos vacíos; paredes celulares más 0,25 mg/ml de IgG de anti-CD14 murino = triángulos rellenos.

La Figura 12F es una gráfica que muestra la producción de nitrito por macrófagos obtenidos del peritoneo murino de la cepa de ratón C3H/HeJ, en respuesta a las paredes celulares de S. aureus. Sólo paredes celulares = círculos vacíos; paredes celulares más 0,25 mg/ml de IgG de anti-CD14 murino = triángulos rellenos.

Las Figuras 13A, 13B y 13C presentan gráficas que muestran la secreción de IL-8 por las células THP-1, diferenciadas mediante 1,25 dihidroxi-vitamina D_{3}, en respuesta al LPS de E. coli O111:B4 (panel A), las paredes celulares de B. subtilis (panel B), y el lipoarabinomanano de las micobacterias (LAM, panel C). Anticuerpos añadidos: sin anticuerpo = cuadrados pequeños punteados; 0,25 mg/ml de IgG anti-CD14 humano de cabra = círculos vacíos; 0,25 mg/ml de IgG de cabra no inmunizada = círculos rellenos; 0,25 mg/ml de fragmentos F(ab')_{2} de una IgG anti-CD14 humano de cabra = cuadrados vacíos; 0,25 mg/ml de fragmentos F(ab')_{2} de una IgG de cabra no inmunizada = cuadrados rellenos; 10 \mug/ml del mAb anti-CD14 28C5 = triángulos vacíos; 10 \mug/ml del mAb anti-CD14 63D3 = triángulos rellenos.

Las Figuras 14A, 14B, y 14C muestran gráficas que presentan los resultados del análisis por FACS de la regulación positiva de las IgM en superficie (expresado como el canal medio de fluorescencia en unidades arbitrarias) de las células pre-B 70Z/3 murinas en respuesta al LPS de E. coli O111:B4 (panel A), las paredes celulares de B. subtilis (panel B), y el lipoarabinomanano de las micobacterias (LAM, panel C). Células transfectadas con vector (círculos vacíos); células transfectadas con el CD14 salvaje (círculos rellenos); células transfectadas con el CD14 transmembrana quimera (triángulos rellenos).

La Figura 15A muestra las gráficas de la secreción de IL-8 por las células SW620 en respuesta al LPS. Sólo agonista = círculos vacíos; agonista más un 2% de suero humano normal = NHS, cuadrados vacíos; agonista más un 2% de NHS con 0,25 mg/ml de un anticuerpo IgG anti-CD14 humano de cabra = triángulos vacíos.

La Figura 15B muestra las gráficas de la secreción de IL-8 por las células SW620 en respuesta a las paredes celulares de B. subtilis. Sólo agonista = círculos vacíos; agonista más un 2% de suero humano normal = NHS, cuadrados vacíos; agonista más un 2% de NHS con 0,25 mg/ml de un anticuerpo IgG anti-CD14 humano de cabra = triángulos vacíos.

La Figura 16A es una gráfica que muestra la unión del sCD14-^{35}S a los componentes toxigénicos de la pared celular de las Gram-positivas.

La Figura 16B es una gráfica que muestra la competición del LAM con el FITC-Re595-LPS por unirse al CD14 soluble. Se añadió o no LAM (curva superior) o LAM en un exceso de 50 veces o 250 veces en peso sobre el LPS (curva inferior), a una mezcla de FITC-LPS, LBP y CD14 soluble. Los cambios en la fluorescencia del FITC-Re595-LPS se registraron a lo largo del tiempo con un fluorímetro SLM 6000.

Descripción detallada de la invención A. Definiciones

Residuo: Es preferible que los residuos aminoacídicos descritos aquí estén en la forma isomérica "L". Sin embargo, los residuos en la forma isomérica "D" pueden sustituirse por cualquier residuo aminoacídico "L", siempre que las propiedades funcionales deseadas de unión de inmunoglobulinas se mantengan en el polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino-terminal de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxi-terminal de un polipéptido. De acuerdo con la nomenclatura estándar de los polipéptidos (J. Biol. Chem., 243:3552-59, 1969), se muestran las abreviaturas de los residuos aminoacídicos en la siguiente tabla de correspondencia:

TABLA DE CORRESPONDENCIA

	Símbolo	Aminoácido
	1\cdotLetra	3\cdotLetras
	Y	Tyr	tirosina
	G	Gly	glicina
	F	Phe	fenilalanina
	M	Met	metionina
	A	Ala	alanina
	S	Ser	serina
	I	Ile	isoleucina
	L	Leu	leucina
	T	Thr	treonina

TABLA DE CORRESPONDENCIA (continuación)

	Símbolo	Aminoácido
	1\cdotLetra	3\cdotLetras
	V	Val	valina
	P	Pro	prolina
	K	Lys	lisina
	H	His	histidina
	Q	Gln	glutamina
	E	Glu	ácido glutámico
	W	Try	triptófano
	R	Arg	arginina
	D	Asp	ácido aspártico
	N	Asn	asparagina
	C	Cys	cisteína

Debe notarse que todas las secuencias de residuos aminoacídicos están representadas aquí por fórmulas cuya orientación izquierda y derecha es la dirección convencional de amino-terminal hacia carboxi-terminal. Además, debe tenerse en cuenta que un guión al principio o al final de una secuencia de residuos aminoacídicos indica una unión peptídica con una secuencia adicional de uno o más residuos aminoacídicos.

El término "anticuerpo" en sus diferentes formas gramaticales se refiere a una composición que contiene moléculas de inmunoglobulina y/o porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, fragmentos de anticuerpo o moléculas que contienen un sitio de combinación del anticuerpo o paratopo. En las realizaciones preferidas, los anticuerpos usados se han purificado por afinidad.

Un "sitio de combinación del anticuerpo" es aquella porción estructural de una molécula de anticuerpo que comprende las regiones variables e hipervariables de las cadenas pesada y ligera que se unen específicamente al antígeno.

La frase "molécula de anticuerpo", en las diferentes formas gramaticales usadas aquí, contempla tanto una molécula de inmunoglobulina como una porción inmunológicamente activa de la molécula de inmunoglobulina.

Ejemplos de moléculas de anticuerpo son las moléculas de inmunoglobulina intactas, las moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y aquellas porciones de una molécula de inmunoglobulina que contengan el paratopo, lo que incluye aquellas porciones conocidas en la materia como Fab, Fab', F(ab')_{2} y F(v), cuyas porciones son preferidas para su uso en los métodos terapéuticos aquí descritos.

Las porciones de moléculas de anticuerpo Fab y F(ab')_{2} se preparan mediante la reacción proteolítica con papaína y pepsina, respectivamente, sobre moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas mediante métodos que son bien conocidos. Véase por ejemplo, la Patente estadounidense Nº 4.342.566 de Theofilopolous et al. (las descripciones de la materia citadas aquí se incorporan como referencias). Las porciones de moléculas de anticuerpo Fab' también son bien conocidas y se producen a partir de porciones F (ab')_{2} mediante una reducción de los puentes disulfuro que unen las dos porciones de cadena pesada, por ejemplo con mercaptoetanol, y con una alquilación posterior de la proteína mercaptano resultante con un reactivo como la yodoacetamida. Es preferible la utilización de un anticuerpo que contiene moléculas de anticuerpo intactas, tal y como se ilustra aquí.

La frase "anticuerpo monoclonal", en sus diferentes formas gramaticales, se refiere a un anticuerpo que contiene sólo una especie de sitio de combinación del anticuerpo capaz de inmunoreaccionar con un antígeno particular. Así, un anticuerpo monoclonal muestra normalmente una única afinidad de unión por cualquier antígeno con el que inmunoreaccione. Asimismo, un anticuerpo monoclonal puede contener una molécula de anticuerpo que tenga una pluralidad de sitios de combinación del anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para un antígeno diferente, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico (quimérico).

La frase "sustancialmente simultáneo" se usa aquí para indicar que se utiliza dentro de un periodo de tiempo suficiente para producir resultados concurrentes, por ejemplo, una lisis bacteriana como resultado de la administración de un antibiótico y reducción o prevención de los síntomas de la sepsis que pueden aparecer como resultado de esa lisis mediante la administración de un anticuerpo anti-CD14, un anticuerpo anti-LBP, un análogo del péptido LBP, o una subcombinación o combinación de los mismos, como se ha descrito aquí.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a las entidades moleculares y composiciones que son tolerables fisiológicamente y que no producen normalmente una reacción alérgica o adversa similar, como trastornos gástricos, mareos y similares, cuando son administrados a un humano.

B. Usos Terapéuticos

La presente invención contempla los usos de un anticuerpo anti-CD14, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 63D3, para el tratamiento y/o prevención de uno o más síntomas de enfermedades como la sepsis, que se asocian con infección bacteriana, y en particular aquellas que se asocian con un aumento transitorio de los niveles de TNF en sangre, como la fiebre, hipotensión, neutropenia, leucopenia, trombocitopenia, shock y fallo multiorgánico. Los pacientes que necesitan dicho tratamiento incluyen aquellos con riesgo de sufrir o que sufren toxemia, como la endotoxemia resultante de una infección o toxemia por bacterias Gram-positivas o micobacterias, envenenamiento por veneno de serpiente, fallo hepático, y similares. Además, algunos pacientes que presentan infecciones virales o fúngicas muestran los síntomas de la sepsis y pueden beneficiarse del método terapéutico de la presente invención. Los pacientes que podrán beneficiarse particularmente de la presente invención son aquellos que sufren infecciones por estafilococos o pneumococos. Los pacientes en riego de sufrir sepsis, incluyen aquellos que sufren quemaduras, heridas de disparos, fallo renal o hepático debido a envenenamiento o abuso de químicos, y similares.

Así, en una realización, la presente invención contempla los usos para la reducción de uno o más de los síntomas de la sepsis u otras condiciones resultantes de la exposición a toxinas bacterianas como el LPS, los componentes toxigénicos de la pared celular de las bacterias Gram-positivas, o el LAM de las micobacterias, que inducen la secreción de citocinas, para la preparación de una composición terapéutica, para su administración preferiblemente intravenosa a un paciente con riesgo de sufrir o que sufre los síntomas de dichas enfermedades.

Asimismo, en una realización de la invención se proporciona el uso para la preparación de una composición terapéutica, para el tratamiento de los síntomas asociados con la bacteriemia y la toxemia causadas por las bacterias Gram-positivas y las micobacterias, de un anticuerpo anti-CD14 que bloquea la secreción de citocinas. El uso puede utilizarse solo o en combinación con una administración sustancialmente simultanea con otras modalidades terapéuticas conocidas que prevengan o reduzcan los síntomas de la sepsis y la toxemia, lo que incluye el tratamiento con uno o más antibióticos, esteroides, anticuerpos anti-TNF, antagonistas del TNF y similares.

También se describen aquí las composiciones terapéuticas, típicamente en forma de dosis unitaria, útiles para la prevención o reducción de los síntomas de condiciones infecciosas, como la bacteriemia, la sepsis, y otras formas de toxemia, causadas por las bacterias Gram-positivas y las micobacterias (un tipo de bacterias Gram-positivas ácido-rápidas). Las composiciones comprenden un transportador farmacéuticamente aceptable y contienen como ingrediente activo uno o más anticuerpos anti-CD14, o un fragmento de los mismos, que inhiben la producción de citocinas. Una composición terapéutica puede además contener como ingredientes activos, a agentes que se sabe que previenen o reducen los síntomas de las condiciones bacterianas y la sepsis, como los antibióticos, esteroides, anticuerpos anti-TNF, antagonistas del TNF, CD14 soluble y similares, tanto solos, en subcombinación o en combinación.

La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se utiliza aquí con el significado de una cantidad suficiente para, prevenir, y preferiblemente reducir en al menos un 30 por ciento, más preferiblemente en al menos un 50 por ciento, y aún más preferiblemente en al menos un 90 por ciento, un aumento clínicamente significativo de los niveles de TNF en plasma. Las cantidades terapéuticamente efectivas preferidas para los agentes utilizados aquí como ingredientes activos incluyen aquellas descritas en la Sección C. Un aumento clínicamente significativo de los niveles de TNF en plasma es un aumento de al menos 25 pg/ml. Los métodos para la determinación de los niveles de TNF en plasma son bien conocidos en la materia, siendo particularmente preferidos aquellos métodos descritos aquí.

Se debe notar que los niveles de TNF en humanos normales sanos o en animales de laboratorio se estima que no son superiores a alrededor de 10 pg/ml, un valor que está en el límite de detección del ensayo más sensible del TNF (Michie et al., New Eng. J. Med., 318: 1481-1486, 1988; Mathison et al., J. Clin. Invest., 81:1925, 1988; y Waage et al., Lancet, 1:355-357, 1987). Se ha demostrado que tras la exposición a LPS, los niveles de TNF aumentan unas 10-20 veces hasta niveles de hasta 400 pg/ml (vide supra). Recientemente, se ha demostrado una buena correlación entre los niveles de TNF en suero y un desenlace fatal en las infecciones con bacterias Gram-negativas meningocócicas, que contienen LPS (Waage et al., supra, 1987). Además, en modelos animales de la sepsis en primates subhumanos, se detectaron aumentos similares del TNF y estos cambios correlacionaron directamente con la letalidad (Tracey et al., Nature, 330:662-664, 1987).

También se describe aquí un método que comprende la administración, a un paciente con necesidad de tratamiento o con riesgo de sepsis, de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD14, preferiblemente una cantidad suficiente para inhibir la secreción de TNF inducida in vivo por el LPS, los componentes toxigénicos de la pared celular de las Gram-positivas, o el LAM de las micobacterias, en células como las de la estirpe de los monocitos/macrófagos, preferiblemente en macrófagos derivados de monocitos.

El anticuerpo anti-CD14 utilizado para la preparación de la composición terapéutica de esta invención es un anticuerpo monoclonal (mAb). Es preferible que las moléculas de anticuerpo anti-CD14 utilizadas aquí estén en forma de las porciones Fab, Fab', F(ab')_{2} o F(v) de las moléculas de anticuerpo completas.

Los anticuerpos monoclonales preferidos útiles en la práctica de la presente invención son aquellos capaces de ser producidos por un hibridoma como el 60b descrito en Ashman et al. (Blood, 69:886-892, 1987), y más preferiblemente por el 3C10 (número de depósito TIB22B en la American Type Culture Collection, Rockville. MD), descrito en Van Voorhis et al. (J. Exp. Med., 158:126-145, 1983) y similares. Aunque los mAb 60b y 3C10 pueden ser producidos mediante el cultivo de un hibridoma, la invención no se ve limitada por ello. También se contempla el uso de mAb producidos por un ácido nucleico clonado de un hibridoma como el 60b y/o 3C10, que exprese la inmunoglobulina anti-CD14. Es decir, el ácido nucleico que expresa las moléculas de anticuerpo anti-CD14 secretadas por el hibridoma 3C10 o similares puede transferirse a otra línea celular para producir un transformante. El transformante es genotípicamente distinto del hibridoma original, pero también es capaz de producir moléculas de anticuerpo anti-CD14, incluyendo fragmentos inmunológicamente activos de las moléculas de anticuerpo completas, que corresponden a aquellos secretados por el hibridoma. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense Núm. 4.642.334 para Reading; Publicación PCT Núm.: WO 890099 para Robinson et al.; Publicaciones de Patente Europea Núm. 0239400 para Winter et al. y Núm. 0125023 para Cabilly et al.

Los anticuerpos monoclonales preferidos muestran una inmunoreactividad para el CD14 que es similar a la de aquellos producidos por los hibridomas anteriormente descritos. Como se usa aquí, el término "inmmunoreactividad", en sus diferentes formas gramaticales, se refiere a la concentración de antígeno requerida para alcanzar una inhibición del 50% de la inmunoreacción entre una cantidad dada del anticuerpo y una cantidad dada del antígeno CD14 del LPS, los componentes toxigénicos de la pared celular de las Gram-positivas, o del LAM de las micobacterias. Es decir, la inmunoreactividad es la concentración de antígeno o componente toxigénico requerido para alcanzar un valor de B/B_{0} de 0,5, donde B_{0} es la cantidad máxima de anticuerpo unido en ausencia del antígeno competidor, y B es la cantidad de anticuerpo unido en presencia del antígeno competidor, y tanto B_{0} como B se han ajustado con el ruido de fondo (véase, Robard, Clin. Chem.,:20:1255-1270, 1974).

También se describe aquí un método terapéutico de la presente invención, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-LBP, preferiblemente un anticuerpo policlonal purificado por afinidad y más preferiblemente un mAb. Además, es preferible que las moléculas de anticuerpo anti-LBP utilizadas aquí estén en forma de porciones Fab, Fab' F(ab')_{2} o F(v) de las moléculas de anticuerpo completo. Preferiblemente, la cantidad de anticuerpo anti-LBP administrada es suficiente para reducir en al menos alrededor del 30 por ciento, preferiblemente en al menos un 80 por ciento, un aumento clínicamente significativo de los niveles en sangre de TNF inducido por el complejo LBP-LPS, en un paciente que muestra al menos uno de los síntomas de la sepsis. Como se ha discutido previamente, los pacientes que pueden beneficiarse de este método incluyen aquellos que sufren endotoxemia como resultado de una infección por bacterias Gram-negativas. Los métodos para aislar la LBP e inducir anticuerpos anti-LBP son bien conocidos en la materia. Véase, por ejemplo Tobias et al. (J. Exp Med., 164:777-793, 1986). Los métodos para determinar y optimizar la capacidad de un anticuerpo anti-LBP de inhibir la unión de los complejos LBP-LPS al CD14 y por tanto inhibir la secreción de TNF inducida por LBP, son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, un anticuerpo anti-LBP puede sustituirse por el anticuerpo anti-CD14 en el ensayo descrito en el Ejemplo 16.

Los anticuerpos anti-LBP preferidos reaccionan de forma inmunológicamente cruzada con un péptido análogo de la LBP. Un "péptido análogo de la LBP" es un polipéptido capaz de inhibir de forma competitiva la unión de los complejos LPS-LBP al CD14 expresado en la superficie de los macrófagos derivados de los monocitos. Los péptidos análogos de la LBP preferidos son aquellos que se muestran en la Tabla 1.

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TABLA I

Designación	Secuencia de Residuos Aminoacídicos
C16Y	CNRLNRAPQPDELY
Y16C	YTTPEPSELDDEDFRC
K16C	KRVDADADPRQYADTC

Los métodos para producir anticuerpos policlonales anti-polipéptido son bien conocidos en la materia. Véase la Patente Estadounidense Núm. 4.493.795 para Nestor et al. Un anticuerpo monoclonal, que normalmente contiene porciones Fab y/o F(ab')_{2} de moléculas de anticuerpo útiles, puede prepararse utilizando la tecnología de hibridoma descrita en "Antibodies, A Laboratory Manual", Harlow y Lane, eds. Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), que se incorpora aquí como referencia. Brevemente, para formar el hibridoma desde el que se produce la composición de anticuerpo monoclonal, se fusiona un mieloma u otra línea celular de autoperpetuación con los linfocitos obtenidos del bazo de un mamífero hiperinmunizado con CD14 o con una porción del mismo de unión a la LBP, o con la LBP, o una porción de la misma de unión al CD14. Alternativamente, el mamífero puede hiperinmunizarse con componentes toxigénicos de la pared celular de bacterias Gram-positivas, o con LAM de micobacterias, particularmente con porciones de los mismos de unión a CD14.

Es preferible que la línea celular de mieloma sea de la misma especie que los linfocitos. Normalmente, el mamífero preferido es un ratón de la cepa 129 GIX^{+}. Los mielomas de ratón adecuados para su uso en la presente invención incluyen las líneas celulares sensibles a hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) P3X63-Ag8.653, y Sp2/0-Ag14 que están disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville. MD. bajo las designaciones CRL 1580 y CRL 1581, respectivamente.

Los esplenocitos se fusionan normalmente con células de mieloma utilizando polietilenglicol (PEG) 6000. Los híbridos fusionados se seleccionan por su sensibilidad a HAT. Los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal útil para la práctica de esta invención se identifican por su capacidad de inmunoreaccionar con CD14 o LBP y su capacidad de inhibir la secreción de TNF inducida por el LPS utilizando el método descrito en el Ejemplo 16.

Un anticuerpo monoclonal útil en la práctica de la presente invención puede producirse iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal, que comprende un medio de nutrientes que contiene un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpo con la especificidad de antígeno apropiada. El cultivo se mantiene por un periodo de tiempo suficiente y bajo las condiciones adecuadas para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo al medio. Entonces se recoge el medio que contiene el anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo pueden entonces aislarse mediante técnicas bien conocidas.

Los medios útiles para la preparación de estas composiciones son bien conocidos en la materia y están disponibles comercialmente, e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones consanguíneos y similares. Un ejemplo de medio sintético es el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al., Virol., 8:396, 1959) suplementado con 4,5 g/l de glucosa, glutamina 20 mM, y suero bovino fetal al 20%. Un ejemplo de cepa consanguínea de ratones es la cepa Balb/c.

Los métodos para producir anticuerpos monoclonales anti-polipéptido son también bien conocidos en la materia (véase Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4949-4953, 1983). Normalmente, uno o más análogos del péptido de la LBP se utilizan, bien solos o conjugados a un transportador inmunogénico, como el inmunógeno descrito en el procedimiento anterior para producir anticuerpos monoclonales anti-CD14. Los hibridomas se criban en función de su capacidad de producir un anticuerpo que inmunoreaccione con el péptido análogo de la LBP y la LBP o con la porción de unión a CD14 de la pared celular de las bacterias Gram-positivas (los componentes toxigénicos) o con el LAM de las micobacterias.

La capacidad de inhibir la unión del complejo LPS-LBP al CD14 mediante un mAb, que demuestra una adecuada reactividad cruzada inmunológica, se evidencia utilizando el ensayo del Ejemplo 16.

También se describe aquí un método terapéutico que involucra la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido análogo de la LBP, preferiblemente un análogo que tenga la secuencia que se muestra en la Tabla I.

Los pacientes con riesgo de o que muestren los síntomas de la sepsis pueden beneficiarse de la administración de modalidades terapéuticas conocidas en la materia para prevenir o reducir estos síntomas. Así, la presente invención contempla la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD14, un anticuerpo anti-LBP, un péptido análogo de la LBP, una subcombinación o combinación de los mismos, sustancialmente simultánea con la administración terapéutica de una modalidad conocida para prevenir o tratar los síntomas de la sepsis. Por ejemplo, la intervención en el papel del TNF en la sepsis, tanto directa como indirectamente, como mediante el uso de un anticuerpo anti-TNF y/o un antagonista del TNF, puede prevenir o reducir los síntomas de la sepsis. El uso de un anticuerpo anti-TNF es particularmente preferido como ingrediente activo así como el anticuerpo monoclonal que tiene una especificidad inmunológica para el TNF que corresponde al descrito por Tracey. et al., Nature, 330:662-664, 1987).

De forma similar, un método terapéutico puede además incluir tratamientos sustancialmente simultáneos con un esteroide, como el cortisol, la hidrocortisona y similares.

Un paciente que muestra los síntomas de la sepsis se trata normalmente con un antibiótico, típicamente un aminoglucósido como la gentamicina o un betalactámico como la penicilina, cefalosporina y similares. Así, un método terapéutico preferido incluye la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD14, un anticuerpo anti-LBP, un péptido análogo de la LBP, una subcombinación o combinación de los mismos como se describe aquí, sustancialmente simultánea con la administración de una cantidad bactericida de un antibiótico. La frase "cantidad bactericida" se utiliza aquí con el significado de una cantidad suficiente para alcanzar una concentración en sangre que elimine las bacterias en el paciente receptor del tratamiento. La cantidad bactericida de los antibióticos, que se reconoce generalmente como segura para su administración a humanos, es una cantidad bien conocida en la materia, y varía, como es bien sabido, según el antibiótico y el tipo de infección bacteriana a tratar.

En realizaciones preferidas, la administración de un anticuerpo anti-CD14, de un anticuerpo anti-LBP, de un péptido análogo de la LBP o de una combinación de los mismos como la descrita aquí se produce dentro de alrededor de 48 horas, preferiblemente dentro de alrededor de 12-36 horas, más preferiblemente dentro de alrededor de 2-8 horas y más preferiblemente sustancialmente simultánea con la administración del antibiótico.

Los antibióticos útiles en la práctica de la presente invención incluyen aquellos agentes antibióticos, antibacterianos y antisépticos con formulaciones descritas en la "Physicians' Desk Reference", Huff, B. B. ed., Medical Economics Company, Inc., Oradell. N.J. (1989). En otra realización, la presente invención contempla la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de CD14, preferiblemente una porción soluble del mismo que se una a complejos LPS-LBP, solo, en subcombinación o en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TNF, un anticuerpo anti-LBP, y un antibiótico. El cDNA que codifica para el CD14 y su secuencia deducida de residuos aminoacídicos son bien conocidos en la materia. Véase Goyert et al., Science, 239:497-500 1988; Ferrero et al., Nuc. Acids Res., 16:4173, 1988; y Bazil et al., Eur. J. Immunol., 16:1583-1589, 1986.

C. Usos Terapéuticos

La presente invención también contempla el uso de un anticuerpo anti-CD14 para la preparación de una composición terapéutica. Un ejemplo de composición terapéutica incluye, una mezcla de un excipiente farmacéuticamente aceptable (transportador) y uno o más anticuerpos anti-CD14, anticuerpos anti-LBP y péptidos análogos de la LBP como se describe aquí, como ingrediente activo. En usos preferidos, la composición comprende un mAb anti-CD14 capaz de inhibir la unión de los complejos LPS-LBP al CD14. Un mAb como el descrito aquí es el 60b, y más preferiblemente es el 3C10. Para el tratamiento de la sepsis u otros estados de enfermedad asociados con la producción de citocinas y causados por bacterias Gram-positivas o micobacterias, el anticuerpo monoclonal preferido para la preparación de la composición terapéutica es el mAb 63D3, (ATCC Núm. ____). También se describe el mAb 28C5, (ATCC Núm. ____).

También se describen las composiciones que comprenden un anticuerpo anti-LBP, preferiblemente un mAb, que inhiben la unión de los complejos LPS-LBP al CD14. Son particularmente preferidas las composiciones donde el anticuerpo anti-LBP inmunoreacciona con un péptido análogo de la LBP con una secuencia como la que se muestra en la Tabla I.

Una composición puede comprender un péptido análogo de la LBP que actúe como un antagonista de los complejos LPS-LBP en la unión al CD14. Los péptidos análogos de la LBP preferidos para su uso en composiciones son aquellos con una secuencia como la que se muestra en la Tabla I.

Las composiciones terapéuticas pueden además incluir una cantidad efectiva de uno o más de los siguientes ingredientes activos: un antibiótico, un esteroide, y un anticuerpo anti-TNF y un antagonista del TNF. Formulaciones de ejemplo se muestran a continuación:

Formulación A

Ingrediente	Dosis(mg/ml)
gentamicina (sulfato)	40
anti-CD14 (mAb 3C10)	10
bisulfito sódico USP	3,2
EDTA disódico USP	0,1
agua para inyectar csp	1,0 ml

Formulación B

Ingrediente	Dosis (mg/ml)
anticuerpo anti-TNF	10
anti-CD14 (mAb 3C10)	10
bisulfito sódico USP	3,2
EDTA disódico USP	0,1
agua para inyectar csp	1,0 ml

Formulación C

Ingrediente	Dosis (mg/ml)
gentamicina (sulfato)	40
anticuerpo anti-TNF	10
anti-CD14 (mAb 3C10)	10
bisulfito sódico USP	3,2
EDTA disódico USP	0,1
agua para inyectar csp	1,0 ml

También se describe aquí una composición terapéutica útil en el tratamiento de la sepsis, que comprende el CD14 o una porción soluble del mismo que se une a la LBP en un transportador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición incluye además una concentración terapéuticamente efectiva de uno o más anticuerpos anti-TNF, anticuerpos anti-LBP y un antibiótico.

La preparación de composiciones terapéuticas que contienen polipéptidos o moléculas de anticuerpo como ingredientes activos es bien conocida en la materia. Normalmente, tales composiciones se preparan como inyectables, tanto en soluciones líquidas como suspensiones, sin embargo, pueden también prepararse formas sólidas adecuadas para su disolución o suspensión en líquido antes de ser inyectadas. La preparación puede también emulsificarse. El ingrediente terapéutico activo se mezcla a menudo con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Son excipientes adecuados, por ejemplo, el agua, la solución salina, la dextrosa, el glicerol, el etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsificantes y agentes tamponadores del pH que aumenten la efectividad del ingrediente activo.

Un polipéptido o anticuerpo puede formularse en la composición terapéutica en forma de sales neutralizadas farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácida (formada con los grupos libre amino de la molécula de polipéptido o de anticuerpo) y que se forman con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico y fosfórico, o los ácidos orgánicos como el ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas por los grupos libres carboxilo pueden también derivarse de bases inorgánicas como, por ejemplo, los hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico, y aquellas bases orgánicas como la isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, y similares.

Las composiciones terapéuticas que contienen un polipéptido o anticuerpo se administran convencionalmente por vía intravenosa, por ejemplo mediante la inyección de una dosis unitaria. El término "dosis unitaria" cuando se utiliza en referencia a una composición terapéutica de la presente invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis única para humanos, en las que cada unidad contiene una cantidad predeterminada del material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el diluyente requerido, es decir, un transportador o vehículo.

Las composiciones se administran de forma compatible con la formulación de la dosis y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La cantidad a administrarse depende del individuo a tratar, la capacidad del sistema inmune del individuo de utilizar el ingrediente activo, y del grado deseado de inhibición o neutralización de la capacidad de unión del CD14 o de los complejos de LPS-LBP. Las cantidades precisas de ingrediente activo a administrar dependen del juicio del facultativo y son particulares de cada individuo. Aún así, las dosis adecuadas oscilan entre 0,1 y 20, preferiblemente entre alrededor de 0,5 y alrededor de 10, y más preferiblemente de uno a varios miligramos de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal del individuo por día y dependen de la vía de administración. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo son también variables, pero constan de una administración inicial seguida de repetidas dosis a intervalos de una o más horas, mediante inyección u otra administración. De forma alternativa, se contempla una infusión intravenosa continua suficiente para mantener unas concentraciones de diez nanomolar a diez micromolar en sangre.

Como se utiliza aquí, "pg" significa picogramos, "ng" significa nanogramos, "ug" significa microgramos, "mg" significa miligramos, "ul" significa microlitros, "ml" significa mililitros y "l" significa litros.

El anticuerpo anti-CD14 murino bloquea la activación celular

Para establecer si el anticuerpo anti-CD14 murino bloquea la activación celular inducida por el LPS, se determinó primero su efecto sobre la activación de los monocitos/macrófagos murinos. Una preparación de una IgG policlonal de conejo anti-CD14 murino inhibió la producción de TNF inducida por el LPS en células RAW y en sangre de ratón, mientras la IgG de un conejo no inmunizado no tuvo ningún efecto (estos datos no se muestran). En experimentos que no se muestran aquí, la producción de nitrito dependiente del LPS por las células RAW y J774 también se bloqueó con la IgG anti-CD14 murino. El anticuerpo anti-CD14 no tuvo efectos sobre la producción de nitrito inducida por el TNF en las mismas células, demostrando la especificidad de inhibición con el anticuerpo anti-CD14 (no se muestra). Los fragmentos F(ab')_{2} de la IgG anti-CD14 murino inhibieron de la misma forma que el anticuerpo intacto, eliminando cualquier contribución de las interacciones del dominio Fc con la célula (no se muestra).

Los resultados que se muestran en la Figura 10 demuestran que el anticuerpo policlonal anti-CD14 murino reconoce el CD14 murino nativo y bloquea la activación celular inducida por el LPS que ocurre a través del CD14 (no se muestra). Basándonos en estos hallazgos, se realizaron experimentos adicionales para probar la hipótesis de que el CD14 puede jugar un papel en las respuestas de los macrófagos murinos frente a las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas y frente al LAM.

Como se muestra en la Figura 11, se ha descubierto que el anticuerpo policlonal anti-CD14 murino inhibe la producción de nitrito dependiente del LPS o la pared celular de B. subtilis en células J774. Las células LR9 mostraron una respuesta marcadamente baja a la estimulación tanto por el LPS como por las paredes celulares de las Gram-positivas, como se muestra en la Figura 11B. El aumento de la concentración del LPS a 3 ng/ml o de las paredes celulares a 1000 ng/ml indujo la producción de nitrito en las células, pero bajo estas condiciones experimentales, la administración de un anticuerpo anti-CD14 no redujo la respuesta (Figura 11). Datos similares se obtuvieron con las paredes celulares de una cepa de Streptococcus del grupo A (datos no mostrados). Los PEM de los C3H/FeJ (ratones que responden al LPS) respondieron al LPS y a las preparaciones de paredes celulares de B. subtilis o de S. aureus, como se muestra en la Figura 12; el anticuerpo policlonal anti-CD14 murino inhibió las respuestas tanto al LPS como a las paredes celulares. No sorprendió que los PEM de los ratones C3H/HeJ (una cepa que se sabe que no responde al LPS) no respondieran al LPS, pero produjeron nitrito tras el tratamiento con preparaciones de paredes celulares de dos microorganismos Gram-positivos diferentes (Figura 12). Las características de respuesta a la dosis para las preparaciones de pared celular fueron muy parecidas en los PEM de las dos cepas diferentes de ratón. Otra preparación de pared celular de Streptococcus del grupo B también estimuló la producción de nitrito en los PEM (no se muestra).

De forma bastante inesperada, se observó que la producción de nitrito inducida por pared celular, en los PEM de los C3H/HeJ se inhibió mediante el anticuerpo policlonal anti-CD14, tal y como se muestra en la Figura 12. Además, las células GG2EE, macrófagos derivados de ratones C3H/HeJ (Blasi et al., 1987), se estimularon mediante LAM para producir una respuesta del nitrito que se bloqueó mediante una IgG anti-CD14 murino (no se muestra).

Se encontró que las vías independientes de CD14 para la estimulación mediante preparaciones de pared celular de Gram-positivas o del LPS también estaban operativas, ya que los efectos inhibidores del anti-CD14 siempre fueron superados al aumentar las concentraciones de estímulo. Sin embargo, la totalidad de los hallazgos presentados en las Fig. 11 y 12 apoyan el importante papel de CD14 en las respuestas frente al LPS y a las paredes celulares de las Gram-positivas, de forma que la intervención terapéutica de los anticuerpos anti-CD14 puede modificar y reducir los efectos tóxicos de las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas en mamíferos.

Respuestas en líneas celulares CD14-positivas y CD14-negativas

Aunque los resultados obtenidos con las líneas celulares J774 (CD14-positiva) y LR9 (CD14-negativa) sugieren un papel importante del CD14 en las respuestas a las paredes celulares de las Gram-positivas, estos datos deben interpretarse con precaución. Aunque los inventores han mostrado aquí que las células LR9 carecen de CD14, ya que esta línea ha sido seleccionada de células J774 químicamente mutagenizadas, no se conoce completamente la base de la baja respuesta al LPS. Por lo tanto, se realizó una serie adicional de experimentos utilizando células THP-1 que expresan niveles altos de CD14 tras el tratamiento con 1,25 dihidroxivitamina D3 (Tobias et al., J. Immunol., 150:3011-3021, 1993) o bien células 70Z/3 transfectadas que expresan el CD14 humano (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:9930-9934, 1993). La estimulación de las células THP-1 con el LPS o los componentes toxigénicos de la pared celular de las Gram-positivas para liberar IL-8, requiere un tratamiento previo con vitamina D3 (no se muestra).

Para determinar el papel de la expresión de CD14 en estas células, se probó la capacidad de bloquear la activación celular de varios anticuerpos anti-CD14 humano. Primero se compararon los efectos de anticuerpos monoclonales y policlonales anti-CD14 humano sobre la activación de las THP-1 mediante el LPS, las preparaciones de paredes celulares de las Gram-positivas, y mediante el LAM. Como se muestra en la Figura 13, el anticuerpo policlonal anti-hCD14 (fracción de la IgG o fragmentos F(ab')_{2}de la IgG) bloqueó la liberación de IL-8 inducida por el LPS, la pared celular de las Gram-positivas, y el LAM, mientras que las IgG no inmunogénicas o sus fragmentos F(ab')_{2} no tuvieron ningún efecto. Los anticuerpos monoclonales anti-CD14 humano, 63D3 (ATCC Núm. HB44) y 28C5
(ATCC Núm. ____) se utilizaron para pretratar las células antes de añadir las preparaciones del LPS o de la pared celular de las Gram-positivas.

Como se muestra en la Figura 13, el mAb 28C5 bloqueó las respuestas a las preparaciones de LPS, de pared celular y de LAM. Por el contrario, el mAb 63D3 no inhibió la estimulación por el LPS, pero bloqueó parcialmente la estimulación por el material de la pared celular y por el LAM. La activación celular de las THP-1 mediante las paredes celulares de B. subtilis o de LAM utilizadas a unas concentraciones de 1-3 pg/ml no se pudo bloquear mediante un anticuerpo policlonal anti-hCD14 (Figura 13). Se observó que la activación celular de las THP-1 era dependiente de CD14 cuando la concentración de agonista estaba en el rango de nanogramos/ml. En otros estudios se determinó que la estimulación mediante la preparación de la pared celular de S. pneumoniae también requería de CD14 (no se muestra), pero la estimulación de las células THP-1 con peptidoglicano soluble de S. aureus no se bloqueaba al incluir la IgG policlonal anti-CD14 (no se muestra).

El efecto de la expresión del CD14 en las respuestas al LPS de una línea celular pre-B murina, la 70Z/3, se ha descrito previamente (Lee et al., J. Exp. Med., 175:1697 1705, 1992; Lee et al., supra, 1993). Las células 70Z/3 transfectadas con CD14 (células 70Z/3-hCD14) se comportan de forma similar a los macrófagos en cuanto a su unión al LPS y a los eventos de señalización temprana (Lee et al., supra, 1993). Estas células permiten un análisis más definido del papel de los sucesos mediados por el CD14, ya que la única diferencia entre las células transfectadas con hCD14 y las células transfectadas con vectores vacíos es la expresión del CD14 humano. La Figura 14 muestra los resultados de un experimento en el que las células 70Z/3-hCD14 se incubaron con LPS, paredes celulares de B. subtilis o LAM. Del mismo modo que el LPS, las paredes celulares y el LAM indujeron un aumento significativo en la regulación positiva de las IgM cuando el hCD14 se expresaba en la superficie de las células, indicando la participación definida del CD14 en la respuesta de estos diferentes agonistas. Como se había descrito previamente para el LPS (Lee et al., supra, 1993), la activación celular por las paredes celulares de las Gram-positivas y por el LAM fue independiente de si el CD14 se expresaba como una proteína anclada a GPI o como una proteína transmembrana.

Los siguientes estudios se condujeron a determinar si una línea celular que carecía de CD14 unido a membrana, pero que se sabe que responde al LPS a través de una vía dependiente del CD14 soluble (sCD14), se podía activar mediante las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas a través de un mecanismo dependiente del sCD14. Estudios previos de Pugin et al., supra, 1993a, documentan la importancia del sCD14 en la activación de líneas celulares como las células SW620, derivadas de un adenocarcinoma de colon. Las células SW620 se estimularon mediante paredes celulares de B. subtilis y esta respuesta requirió de la presencia de suero. Como se muestra en la Figura 15, un anticuerpo policlonal de conejo anti-CD14 murino bloqueó la liberación de IL-8 por estas células hasta el mismo alcance que el que se observó en un sistema de activación inducido por el LPS. En estudios que no se muestran aquí, también se encontró que las preparaciones de paredes celulares de las bacterias Gram-positivas inducían una activación de las células endoteliales humanas hasta un alcance similar al observado con el LPS. Estos resultados muestran que el CD14 soluble interviene en una activación dependiente de la pared celular de las Gram-positivas en las células humanas que no contienen el CD14.

Unión de las paredes celulares de las gram-positivas o del lipoarabinomanano al CD14

Dos experimentos independientes proporcionan una evidencia bioquímica de interacciones directas entre el CD14 y los componentes de la cubierta celular bacteriana. La unión del sCD14 a la pared celular de las Gram-positivas se obtuvo utilizando ^{35}S-sCD14. Como se muestra en la Figura 16, el ^{35}S-sCD14 se une a las paredes celulares, inhibiéndose la unión por la presencia de un exceso de sCD14 no marcado, y eliminándose esta unión cuando el ^{35}S-sCD14 se desnaturaliza por un calentamiento a 100ºC durante 5 min como se muestra en la Figura 16A.

Se desarrolló un ensayo espectrofluorimétrico para monitorizar las interacciones entre el FITC-Re595-LPS y el sCD14. Cuando el FITC-Re595-LPS se une al sCD14, se observa un aumento marcado en la intensidad de fluorescencia que aparece rápidamente tras un periodo de varios minutos (Figura 16B, diagrama superior). Cuando se añade LAM en exceso a las mezclas de reacción, se observa una inhibición marcada del aumento de la intensidad de fluorescencia del FITC-Re595-LPS (Figura 16B, diagramas central e inferior). Estos datos indican que existe una competición entre el LAM y el LPS para unirse al sCD14.

En base a los estudios que se presentan aquí, se cree que el receptor mieloide del CD14 sirve como una molécula de reconocimiento para una amplia variedad de moléculas de la cubierta bacteriana, como el LPS de los organismos Gram-negativos, el lipoarabinomanano de las micobacterias y el(los) componente(s) de las paredes celulares de las Gram-positivas. La interacción de estos agonistas con los macrófagos a través del CD14 conduce a la activación celular. Sin el deseo de unirse a ningun mecanismo de reconocimiento molecular, se cree que el CD14 es un receptor de reconocimiento de patrones con múltiples especificidades de unión a ligandos microbianos.

La respuesta inmune a los microorganismos infecciosos en vertebrados es un proceso en dos pasos, con una inmunidad inicial no adaptativa (innata), seguida de una inmunidad adaptativa con expansión de las defensas clonales específicas. Las células mieloides juegan un papel central durante la fase no adaptativa (temprana) de las defensas frente a los microbios. El reconocimiento de las partículas infecciosas por los macrófagos da lugar a una rápida activación de las defensas no específicas, con la producción de monocinas (TNF, IL-1, o IL-6), enzimas varios, y radicales de oxígeno y nitrógeno. Como se ha propuesto recientemente en Janeway, supra, 1992, es muy probable que los receptores inmunes no clonales detecten constituyentes comunes o altamente conservados de los microorganismos patogénicos. La presión evolutiva habría seleccionado estos receptores por sus amplias propiedades de reconocimiento. La interacción de diferentes estructuras de la superficie microbiana a través del mismo receptor daría lugar a las típicas respuestas no específicas de la inmunidad innata. El CD14, con su poliespecificidad para las estructuras microbianas, como se ha demostrado aquí en los Ejemplos, es una muestra prototípica de estos receptores. Otras proteínas de la superficie de las células de mamífero pueden reconocer diferentes componentes bacterianos. Ciertamente, se ha demostrado que los miembros de la familia de receptores "scavenger" presentan estas propiedades (Krieger et al., J. Bio. Chem., 268:4569-4572, 1993). No obstante, a diferencia del CD14, este grupo de proteínas no participa en la activación celular, sino que parece funcionar en la entrada de ligandos desde el compartimiento extracelular.

Las estructuras microbianas reconocidas por los receptores poliespecíficos no adaptativos deben estar altamente conservadas entre los patógenos, y ser críticas para la integridad microbiana o la patogenicidad. El LPS cumple estos criterios en el grupo de las bacterias Gram-negativas. El LPS es necesario para la patogenicidad de las Gram-negativas, está altamente conservado, y es reconocido por el CD14. El lipoarabinomanano (LAM) también es una estructura de la cubierta crítica para la patogenicidad y conservado en las micobacterias (Chatterjee et al., Infect. Immun., 60:1249-1253, 1992), y da lugar a la activación celular a través de CD14. Existen similitudes significativas entre las estructuras del LPS y del LAM. Ambas moléculas son anfofílicas, con cadenas acilo lipídicas hidrofóbicas en un extremo y polisacáridos hidrofílicos en el otro extremo (Tobias et al., supra, 1992; Prinzis et al., J. Gen. Microbiol., 139:2649-2658, 1993).

En las paredes celulares de las Gram-positivas, se desconoce la estructura responsable de la activación de los macrófagos a través de CD14. No obstante, esta estructura parece estar altamente conservada entre las diferentes bacterias Gram-positivas, ya que las paredes celulares de todas las cepas probadas activaban los macrófagos de una forma dependiente de CD14. Los candidatos a ser los principales ligandos de las paredes celulares de las Gram-positivas que se unen al CD14 incluyen los monómeros u oligómeros de los muropéptidos o fragmentos de ácido teicoico.

Los inventores han descubierto aquí que algunas células que no contienen CD14 responden a una amplia variedad de estructuras microbianas a través de una vía dependiente del CD14 soluble, estas son las células endoteliales y epiteliales. Una vez activadas, estas células son críticas para el tráfico de leucocitos en los tejidos, para la secreción de citocinas, de radicales de oxígeno y nitrógeno, y para la modulación de la coagulación. Estas células pueden por lo tanto, participar en los sucesos tempranos, no específicos de la inmunidad frente a los organismos infecciosos en asociación con los macrófagos. Es interesante notar que las células endoteliales y algunas células epiteliales son también potenciales células presentadoras de antígeno, y pueden participar con los macrófagos y las células dendríticas en la iniciación de la fase clonal adaptativa de la inmunidad (Hughes et al., Immunol. Rev., 117:85-102, 1990).

En un estudio reciente (Heumann et al., supra) se demostró que el suero es necesario para la activación de los monocitos humanos por productos de la pared celular de las Gram-positivas (Heumann et al., supra). Estos autores encontraron que un mAb anti-CD14 (MY4) no bloqueaba la activación de los monocitos humanos primarios originada por grandes cantidades (1-10 ug/ml) de paredes celulares de Gram-positivas. En nuestros estudios, se observó una dependencia de CD14 sólo con bajas concentraciones de agonistas (300 ng/ml e inferior). Además, el mAb anti-CD14 MY4 puede reconocer un dominio funcional que no es crítico para la unión de las paredes celulares de las Gram-positivas al CD14. Estos hechos podrían explicar los resultados aparentemente discrepantes entre ambos estudios.

Los experimentos con macrófagos de los ratones C3H/HeJ indican que a pesar del hecho de que varios agonistas inducen respuestas celulares similares a través de CD14, estos agonistas no parecen compartir la misma vía de activación. Los macrófagos C3H/HeJ son normalmente resistentes al LPS pero pueden activarse con otros agonistas, como el LAM (Chatterjee et al., supra) o bacterias completas Gram-positivas inactivadas por calor (Freudenberg y Galanos, Infect. Immun. 59:2110-2115, 1991). De forma importante, encontramos que los macrófagos C3H/HeJ respondieron al LAM y a las paredes celulares de las Gram-positivas de forma dependiente de CD14. Previamente se había propuesto que la forma de CD14 de membrana anclado a GPI mediaba la señalización intracelular a través de un presunto transductor transmembranal (Ulevitch y Tobias, supra). Los resultados de los experimentos discutidos aquí indican que o bien el mismo presunto transductor tiene diferentes epítopos para diferentes agonistas, o bien existen diferentes moléculas de transducción en la superficie de la célula y reconocen sólo un agonista específico "presentado" por CD14. La deficiencia tan específica del LPS en los ratones C3H/EleJ podría explicarse entonces por una mutación en el lugar del LPS del transductor de señal poliespecífico, o bien por la falta de función del transductor de señal específico del LPS.

En resumen, se muestra que el CD14 en su forma unida a la membrana (células mieloides) o en su forma soluble (células endoteliales y epiteliales) media la activación celular en respuesta a una amplia variedad de moléculas conservadas de las cubiertas de las bacterias patogénicas. Proponemos al CD14 como un prototipo de receptor/mediador de la respuesta inmune temprana no específica y no adaptativa a los microorganismos patogénicos. Los agentes terapéuticos que modulan las funciones del CD14 proporcionan una gran esperanza para el tratamiento y/o la prevención de muchas enfermedades letales bacterianas diferentes. En el caso de la sepsis bacteriana, el bloqueo de las funciones del CD14 con anticuerpos anti-CD14 puede prevenir potencialmente las abrumadoras respuestas deletéreas del huésped frente a las bacterias Gram-negativas o Gram-positivas.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos intentan ilustrar, pero no limitar, la presente invención.

Los ejemplos 1-11 ilustran los estudios que establecen que las células humanas de la estirpe de los monocitos/macrófagos se unen a los complejos LPS-LBP a través de un receptor de la superficie celular que es móvil en el plano de la membrana. El ejemplo 12 ilustra que los anticuerpos anti-CD14 pueden inhibir de forma específica la unión de los complejos LPS-LBP al CD14. Los ejemplos 13-15 demuestran que el CD14 se une específicamente a los complejos LPS-LBP y que esta unión induce la secreción de TNF a partir de los MO. El ejemplo 16 demuestra que los mAb anti-CD14 inhiben la secreción de TNF inducida por los complejos LPS-LBP en la sangre humana. El ejemplo 17 proporciona un resumen y discusión de los resultados de los ejemplos 1-16.

1. Reactivos

La LBP se purificó a partir de suero de conejo en la fase aguda (Tobias et al., supra., 1986), y apareció homogénea en geles teñidos con plata. Los anti-LBP de conejo se produjeron en cabra. La MBP se obtuvo del Dr. R. A. B. Ezekowitz (Boston, MA). El factor bactericida de aumento de la permeabilidad (BPI) se obtuvo del Dr. J. Gabay (New York, NY). El LPS de Salmonella minnesota (Re595 o cepa salvaje) se obtuvo de List Biological (Campbell, CA). Los anticuerpos monoclonales (mAb) IB4 contra CD18 y 3G8 contra FcyRIII (CD16) se describieron en Wright et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:5699-5703, 1983). El mAb 543 contra CR1 se obtuvo del Dr. R. Schreiber (St. Louis. MO), y los mAb 22 y IV.3, contra FcyRI y FcyRII, se obtuvieron del Dr. M. Fanger (Hanover, NH). La albúmina sérica humana libre de pirógenos (HSA) se obtuvo de Armour Pharmaceuticals, y el PBS libre de pirógenos y el DGVB++ se obtuvieron de Whitaker MA Bioproducts. La NHS-biotina, la sulfo-NHS-biotina y la estreptavidina se obtuvieron de Pierce Chemical.

2. Superficies

Las superficies de plástico de cultivo de tejidos se recubrieron mediante la incubación de 25 ug/ml de proteína (anticuerpo, LBP, o HSA) o 1 microgramo/mililitro (ug/ml) de LPS durante 1 hora (h) a 20ºC. Para formar complejos inmunes, las superficies recubiertas con HSA se incubaron con antisuero anti-HSA (1:50) durante 30 minutos (min) adicionales. En algunos casos, las superficies recubiertas de LPS se trataron posteriormente con 10 ug/ml de LBP durante 30 min a 20ºC. Para los ensayos de producción de peróxido de hidrógeno, todas las superficies recubiertas se expusieron a 1 miligramo por mililitro (mg/ml) de HSA durante 1 h antes de la adición de los fagocitos. Las superficies recubiertas se lavaron cuidadosamente con PBS libre de pirógenos previamente a los ensayos.

3. Células

Los macrófagos derivados de monocitos (MO) se obtuvieron mediante cultivo de monocitos humanos purificados en vasos de precipitados de Teflón durante 3-10 días como se describe en Wright et al. (J. Exp. Med., 156: 1149-1164, 1982). Se obtuvieron monocapas de monocitos frescos al permitir que las células mononucleares de sangre periférica se adhirieran al plástico recubierto de proteínas durante 45 min a 37ºC. Los PMN se purificaron a partir de sangre fresca mediante el método de English et al. (J. Immunol. Methods, 5:249, 1974). Las células T, purificadas mediante roseteo con eritrocitos, se obtuvieron de J. Ming (Rockefeller U.). Las monocapas de células endoteliales de vena umbilical humana (Lo et al., J. Exp. Med., 169:1779-1793, 1989) se obtuvieron del Dr. S. K. Lo
(Rockefeller U.).

Los eritrocitos de oveja (E) se recubrieron con IgG (EIgG) o IgM (EIgM) como se describe en Wright et al., supra, 1982.

El C3bi se depositó sobre los EIgM mediante la incubación de 2-10x10^{8} EIgM en 1 ml de suero humano deficiente en C5 al 10% (Sigma) durante 30 min a 37ºC. Los eritrocitos se lavaron entonces y se incubaron durante 10 min a 0ºC en un tampón que contenía etilendiaminotetraacetato (EDTA) 2,5 mM. Los EC3bi resultantes no contenían C3b como se comprobó mediante roseteo resistente a EDTA con MO.

Los E se recubrieron con el LPS como se describe en Wright et al. (J. Exp. Med., 164:1876-1888, 1986). La cantidad de LPS utilizado en la preparación se varió para proporcionar ELPS^{hi} (1-10 ug/4x10^{7}E) o ELPS^{lo} (0,2-1 ug/4x10^{7}E). Los ELPS^{lo} se recubrieron con LBP mediante la incubación de volúmenes iguales de ELPS^{lo} (10^{8}/ml) y de LBP (10 ug/ml) durante 20 min a 37ºC. Los ELPS recubiertos de LBP resultantes (E recubiertos de ligando) se lavaron y utilizaron inmediatamente.

Para algunos estudios, los E se recubrieron también con LBP mediante un método alternativo. Los E se biotinilaron en primer lugar mediante la incubación de 5x10^{8} E con 250 ug de sulfo-NHS-biotina durante 20 min a 5ºC en carbonato sódico 0,1 M pH 9,2, y la LBP se biotiniló mediante la incubación de 50 ug de LBP con 5 ug de sulfo-NHS-biotina y dializando con PBS. La proteína biotinilada se unió entonces a los E biotinilados mediante un puente de estreptavidina. Se incubaron 10^{8} E biotinilados (EB) y lavados, con 10 ug de estreptavidina durante 30 min a 20ºC para proporcionar eritrocitos recubiertos con avidina (EBAV). Los experimentos preliminares utilizando estreptavidina con fluoresceína mostraron que los EBAV eran uniforme e intensamente fluorescentes, y no se pudo observar aglutinación. Se incubaron 2,5x10^{7} EBAV lavados con 2,5 ug de la LBP biotinilada durante 30 min a 20ºC para proporcionar EBAV-
LBP.

Se cultivó Salmonella typhimurium LT2 Gal E en presencia o ausencia de galactosa para proporcionar células con el LPS completo o truncado, respectivamente (Wright et al., supra, 1986). Los cultivos en crecimiento exponencial se lavaron, se marcaron con fluoresceína, y se ajustaron a 2x10^{8}/microlitro (ul) con PBS como se ha descrito previamente (Wright et al., supra, 1986).

4. Ensayos

La aglutinación de los eritrocitos recubiertos de LPS (Ejemplo 3) se midió mediante la agitación de 10^{6} ELPS^{hi} en 10 ul de LBP diluida durante 30 min a 21ºC en una placa de microensayo de fondo redondeado. La aglutinación se interpretó por el patrón de sedimentación.

La unión de los E recubiertos de ligando (Ejemplo 3) a los MO se midió como se describe en Wright et al., supra, 1982. Brevemente, las placas de cultivo tisular Terasaki se recubrieron con HSA u otras proteínas (Ejemplo 2), y se establecieron monocapas de MO mediante la incubación de 5 ul de células (0,5x10^{6}/ml en PBS que contenía glucosa 3 mM, HSA 0,5 mg/ml, y aprotinina 0,3 u/ml (Sigma), durante 45 min a 37ºC. Se añadieron a las monocapas los E recubiertos de ligando y las proteínas indicadas. Se permitió que los E se establecieran durante 10 min a 0ºC, entonces se calentó la placa durante 15 min a 37ºC. Los E no unidos se eliminaron mediante lavado y la unión se evaluó mediante microscopía de contraste de fases. La unión de la Salmonella fluoresceinada se evaluó por un método similar utilizando una incubación de 15 min a 37ºC como se describe en Wright et al., supra, 1986. Los resultados se muestran como un índice de unión, el número de E o bacterias por cada 100 MO. La fagocitosis de los E recubiertos de ligando se midió por métodos similares (Wright et al., supra, 1982), con la excepción de que la incubación de los MO con los E fue de 45 min a 37ºC, y los E no ingeridos se lisaron mediante una breve exposición a medio hipotónico antes de valorar los pocillos.

5. La LBP se une al LPS Insertado en las Membranas Eritrocitarias

La adición de una cantidad tan pequeña como 0,5 ug/ml de LBP a los ELPS^{hi} causó aglutinación. El LPS se particionó en la membrana de los E mediante interacciones hidrofóbicas con los fosfolípidos, esta observación sugiere que la LBP reconoce la porción expuesta hidrofílica del lípido A, y que la LBP tiene la capacidad de formar multímeros. Los ELPS no aglutinaron de forma potente y se pudieron separar mediante un pipeteo suave.

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6. La LBP aumenta la unión de los ELPS y la Salmonella a los macrófagos

Las bacterias Gram-negativas y los eritrocitos recubiertos de LPS se unen a los MO a través de la interacción del LPS con miembros del complejo de receptores CD18 en los leucocitos (Wright et al., supra., 1986). Por lo tanto, se examinó la capacidad de la LBP de alterar esta interacción. En estudios iniciales se utilizaron E preparados con elevados niveles de LPS. Estos ELPS^{hi} se unían con avidez a los MO, y la adición de LBP aumentó ligeramente su unión. Para examinar la naturaleza de este aumento, se prepararon E con niveles reducidos de LPS. Se incubaron monocapas de MO con ELPS^{lo} en presencia o ausencia de 5 microgramos (ug) por mililitro (ml) de LBP. Los ELPS^{lo} se unieron pobremente a los MO, pero la adición de la LBP provocó un aumento dramático de esta unión (Figura 1). La unión aumentada era dependiente de la dosis, con un efecto máximo a 1 ug/ml de LBP. La especificidad de este efecto viene indicada por la observación de que otro reactivo de fase aguda, la proteína de unión a manosa, no tenía ningún efecto sobre la unión de los ELPS^{lo} a los MO (Figura 1) a concentraciones tan altas como 100 ug/ml; otra proteína de unión a LPS, la BPI, no afectaba la unión a concentraciones tan altas como 10 ug/ml; y el antisuero policlonal anti-LBP (1:200) causó una reducción de 20 veces del roseteo de los ELPS^{lo} causados por la LBP.

La capacidad de la LBP de aumentar la interacción de los ELPS con los MO también era dependiente de la cantidad de LPS en la membrana eritrocitaria (Figura 2). La LBP podía mediar de forma efectiva la unión de los E preparados con cantidades de LPS de 20 a 100 veces menores que la cantidad necesaria para mantener una interacción directa entre los ELPS y los MO.

Las cepas de bacterias Gram-negativas que expresan un LPS truncado (cepas rugosas) se unen ávidamente a los MO, pero las cepas lisas, con un LPS completo, se unen pobremente (Wright et al., supra, 1986). Como la LBP se une igual de bien tanto al LPS liso como al rugoso (Tobias et al., supra, 1989), se examinó la capacidad de la LBP de opsonizar la Salmonella lisa. Como se ilustra con los datos que se muestran en la Tabla II, la adición de LBP causa un aumento dramático de la unión de la Salmonella lisa a los MO.

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TABLA II La LPB Aumenta la Unión de Salmonella a los MO^{1}

Índice de unión	\mathit{S.\ typhimurium} lisa	\mathit{S. \ typhimurium} rugosa
-LBP	273	1096
+LBP	1661	2109
^{1} \begin{minipage}[t]{155mm}Las preparaciones de las formas lisa y rugosa de S. typhimurium LT2 se obtuvieron cultivando mutantes GalE de esta cepa en presencia o ausencia de galactosa como se describe en Wright et al. (J. Exp. Med., 164:1876-1888, 1986). La unión de las bacterias a las monocapas de macrófagos se midió entonces en presencia o ausencia de 2,5 ug/ml de LBP. La adición de LBP causó un aumento de 5,9 + 1,9 (n=4) veces en la unión de las bacterias lisas a los MO.\end{minipage}

La Tabla II ilustra que la adición de LBP también aumenta la unión de la Salmonella rugosa, pero el efecto parece menos dramático que el que se observa con S. typhimurium lisa debido a la ávida unión de las bacterias no opsonizadas. Así pues, la LBP puede aumentar la interacción de las bacterias vivas e intactas con los MO.

7. Los MO Reconocen los Complejos de LBP con LPS

En el Ejemplo 6, la LBP se añadió junto a los MO y los ELPS. Para determinar si la LBP se une a los MO o a los ELPS, las células se incubaron separadamente con LBP(tratadas), se lavaron y entonces se combinaron. Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla III.

TABLA III El pretratamiento de los ELPS Pero No de los MO Con LBP Aumenta Su Interacción ^{1}

Índice de unión	Estado
	Estudio 1	Estudio 2	Estudio 3
Sin LBP	6	17	4
ELPS^{lo} pretratados	820	715	942
MO pretratados	5	21	16
coincubado de LBP,	629	520	796
ELPS^{lo} y MO
^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} La unión de los ELPS^{lo} (0,2 ug/4x10^{8}E) a las monocapas de MO se midió como se describe en el Ejemplo 4. Los ELPS^{lo} o MO se pretrataron con 5 ug/ml durante 20 min a 37^{o}C y se lavaron antes del ensayo. Alternativamente, se añadieron 5 ug/ml de LBP durante el ensayo de unión. \end{minipage}

El pretratamiento de los ELPS^{lo} con LBP aumentó notablemente la unión a los MO (Tabla III) con una curva de dosis respuesta idéntica a la observada en los experimentos de coincubación (datos no mostrados). Este resultado sugiere que la LBP se asocia de forma estable con los ELPS y que la LBP unida a la superficie es reconocida por los MO. El pretratamiento de los MO, por otro lado, no afectó su posterior unión de los ELPS (Tabla III).

La LBP forma un complejo en la superficie de los ELPS con el LPS. Para determinar si los MO se unen a la LBP en ausencia de LPS, se biotiniló la LBP y se unió a eritrocitos recubiertos de estreptavidina. Los EBAV-LBP resultantes no se unían a los MO (Figura 3), pero la adición de LPS causaba una unión potente de los ELBP a los MO. El LPS parece aumentar la adherencia de los EBAV-LBP mediante su unión a la LBP, ya que la cantidad de LPS necesaria para causar la unión de los ELBP fue 50 veces inferior a la necesaria para provocar la unión de los E que carecen de LBP (Figura 3). Además, los ELBP tratados con LPS se unieron ávidamente a los MO deficientes en CD18, que no se unen a los ELPS. Así pues, la LBP debe estar formando complejos con el LPS para poder ser reconocida por los MO.

8. La LBP es Reconocida por un Receptor Móvil Exclusivo de los Fagocitos Mononucleares

Los ELPS tratados con LBP se unieron virtualmente al 100% de los monocitos y los MO, sugiriendo que la actividad de unión está presente en todos los miembros de estas poblaciones. Para determinar si la LBP interacciona con otros tipos celulares, se incubaron monocapas de PMN, células T, y células del endotelio de la vena umbilical con ELPS^{lo} tratados con LBP. No se observó ninguna unión. De forma similar, nunca no se observó que los linfocitos que de forma ocasional contaminan las preparaciones de MO, se unieran a los E recubiertos de LBP. Así, la capacidad de unir partículas recubiertas de LBP parece ser una propiedad restringida de los fagocitos mononucleares.

La existencia de un receptor específico para LBP se demostró permitiendo que los MO se expandieran en superficies recubiertas con complejos de LPS y LBP. La Tabla IV ilustra que la LBP unida a superficie regula fuertemente de
forma negativa la unión de los ELPS tratados con LBP, pero no tiene ningún efecto sobre la unión de los EIgG o EC3bi.

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TABLA IV Los receptores de la LBP Son Móviles en el Plano de la Membrana ^{1}

Superficie	ELPS^{lo}LBP	ELPS^{hi}	EC3bi	EIgG
HSA	833	507	915	621
HSA-anti-HSA	795	455	1051	45
IB4	846	149	200	253
LPS-LBP	147	628	1161	762
^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} Las superficies plásticas se recubrieron con HSA (500 ug/ml), mAb IB4 (25 ug/ml) o LPS (1 ug/ml) durante 2 h a 21^{o}C y se lavaron generosamente. Donde se indica, se añadió anti-HSA (dilución 1:40 de antisuero de conejo anti-HSA) o LBP (5 ug/ml) y se incubó durante 30 min a 20^{o}C. Los MO se dejaron expandir en las superficies recubiertas durante 45 min a 37^{o}C, y tras otro lavado adicional, se añadieron los eritrocitos recubiertos de ligando. Los ELPS^{hi} se prepararon con 3 ug de LPS/4x10^{7}E. Los ELPS^{lo} se prepararon con 0,3 ug de LPS/4x10^{7} E, entonces se trataron con 5 ug/ml de LBP como se describe en el Ejemplo 3. Los datos mostrados son representativos de cuatro experimentos separados. \end{minipage}

Los resultados anteriores indican que la LBP es reconocida por una molécula que es móvil en el plano de la membrana, y sugieren que este receptor es diferente de CR3 y FcR.

9. La LBP no Interactúa con CR3 o FcR

Como se sabe que el LPS es reconocido por CR3 y otros miembros del complejo CD18 (LFA-1 y p150,95) (Wright et al., supra, 1986), parecería posible que la LBP potenciara la unión de los ELPS facilitando la interacción de una baja cantidad de LPS con estos receptores. Muchas observaciones, no obstante, descartan esta posibilidad. Los resultados ilustrados en la Tabla V indican que la LBP provoca una fuerte unión de los ELPS a monocitos aislados de dos pacientes con una deficiencia congénita de CD18. Las células deficientes en CD18 presentaron una unión inapreciable de los ELPS^{hi} o los EC3bi en ensayos paralelos.

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TABLA V La LBP media la Unión de Los ELPS^{lo} a Los Monocitos de Pacientes Deficientes en CD18 ^{1}

Sujeto	Índice de unión
	ELPS^{hi}	ELPS^{lo}	+LBP	EC3bi
Control	108	31	282	129
Control	185	27	437	162
Paciente 1	17	15	394	4
Paciente 2	5	14	529	16
^{1} \begin{minipage}[t]{155mm}Las monocapas de monocitos de dos pacientes deficientes en CD18 (los leucocitos deficientes en CD18 responden a LPS in vitro) y dos controles de adultos normales se incubaron con EC3bi, ELPS^{hi} (3 ug/4x10^{8} E) y ELPS^{lo} (1 ug/4x10^{8} E), y se midió el índice de unión. Donde se indica, se añadieron 2,5 ug/ml de LBP a los ELPS^{lo}. \end{minipage}

Unos experimentos en los que las moléculas de CD18 se eliminaron de la superficie apical de los MO al permitirles expandirse sobre superficies recubiertas con un mAb anti-CD18, originaron más evidencias en contra de la participación de las moléculas de CD18 en el reconocimiento de los ELPS^{lo} tratados con LBP. El Ma IB4 modula de forma negativa las moléculas de CD18, como se muestra con la disminución de la unión de EC3bi y ELPS^{hi}, siendo normal la unión de los ELPS^{lo} tratados con LBP a estas células (Tabla IV). Finalmente, la eliminación del Ca++ y del Mg++ bloquea completamente la unión del C3bi y el LPS al complejo CD18 (Wright et al., supra, 1982; y Wright et al., supra, 1986), pero la unión de los ELPS^{lo} tratados con LBP fue equivalente en tampones que contenían
EDTA.

La participación de los receptores Fc en el reconocimiento de la LBP también se descartó. La expansión de las células en una superficie recubierta de complejos inmunes moduló fuertemente de forma negativa los receptores de Fc, como se probó mediante la unión de EIgG. No obstante, la unión de los ELPS^{lo} recubiertos por LBP se vio inalterada (Tabla IV). Estudios similares demostraron que la proteína de unión a manosa unida a la superficie y los mAb FcRI, FcRII, FcRIII, y CR1 unidos a superficie no afectan a la unión de la LBP a los MO. Estos datos sugieren que la LBP no es reconocida por los receptores de CR1, CR3, FcR o de la proteína de unión a manosa.

10. Los Receptores de la LBP Potencian la fagocitosis mediada por Fc

La adición de una IgG anti-E provocó que los MO fagocitaran de forma ávida a los ELPS^{lo} recubiertos con LBP (Figura 4). La dosis de IgG anti-E necesaria para alcanzar la fagocitosis media máxima fue 5 veces inferior a la necesaria para inducir la fagocitosis de los E sin recubrir (Figura 4). Así, la LBP parece actuar de forma sinérgica con la IgG para inducir una respuesta fagocítica. De acuerdo con artículos previos (Ehlenberger et al., J. Exp. Med., 145:357-371, 1977), la deposición de C3bi sobre los E también potenció la fagocitosis mediada por IgG, y la extensión de esta mejora fue similar a la provocada por la LBP (Figura 4).

También se examinó la fagocitosis mediada por LBP sola. Aunque los ELPS recubiertos de LBP formaban rosetas floridas con los MO, ninguno de los E unidos fue fagocitado por los MO en reposo, los estimulados con fibronectina o los estimulados con PMA (Figura 4). Estudios paralelos mostraron una fagocitosis de los EC3bi fuertemente estimulada por fibronectina o PMA. Una posible explicación para la ausencia de fagocitosis mediada por LBP es la alta movilidad lateral del LPS en la superficie de un eritrocito. El LPS puede "cubrir" el polo del E unido al MO, dejando una cantidad de ligando insuficiente en la circunferencia del E para guiar un pseudópodo en avance. Para prevenir este recubrimiento, se unió LPB biotinilada a proteínas biotiniladas del E como se describe en la Figura 4 anterior. De nuevo, ninguno de los E unidos de esta manera fueron fagocitados por los MO en reposo recubiertos de E o por los MO biestimulados con PMA (Índice fagocítico = 0). Estudios paralelos mostraron que con F(ab)_{2} biotinilados de un mAb anti-CD18 (IB4) fueron fácilmente fagocitados (Índice fagocítico =482). Así pues, los receptores de la LBP no pueden iniciar por sí mismos la fagocitosis de un eritrocito recubierto.

11. Los Receptores de la LBP No Inician Una expansión Oxidativa

Para determinar si la interacción de la LBP con su receptor inicia una respuesta citotóxica de los MO, se midió la producción de peróxido de hidrógeno durante la interacción de los MO con las superficies recubiertas.

La liberación de peróxido de hidrógeno durante la expansión de los MO sobre superficies recubiertas se midió como se describe en delaHarpe et al. (J. Immunol. Methods, 78:323-336,1985). Brevemente, se añadieron 3-4x10^{4} MO (día 3 o 4) a pocillos de cultivo de tejidos recubiertos por proteína, que contenían peroxidasa de rábano picante y 2,4 nmol de escopoletina. La placa se incubó a 37ºC, y se midió a diferentes intervalos el consumo de escopoletina utilizando un lector automático de fluorescencia de placas. Se hizo una media de los resultados de los pocillos por triplicado y se presentaron como nmoles de peróxido producido por pocillo. La adición del estimulante control, PMA (100 ng/ml), resultó en una evolución rápida de peróxido que fue idéntico en tasa y extensión para todas las superficies recubiertas probadas.

La Figura 5 ilustra que la unión de los MO a las superficies recubiertas de LPS provoca una liberación de peróxido baja (12% de la provocada por los complejos inmunes o PMA). Las superficies recubiertas con LBP, no obstante, no provocaron la liberación de peróxido por encima de la línea basal. Además, la adición de la LBP a las superficies recubiertas de LPS bloqueó la liberación provocada por el LPS, confirmando así que la LBP interactúa de forma efectiva con el LPS en este experimento. Algunos experimentos paralelos mostraron que la expansión de los MO sobre las superficies recubiertas de LBP o LPS+LBP provocaba una modulación negativa de la unión de los ELPS^{lo} tratados con LBP, confirmando de esta manera que había ocurrido una unión a los receptores de la LBP. Así, los receptores de LBP parecieron ser incapaces de provocar una expansión oxidativa.

12. Inhibición De La Unión del Complejo LPS-LBP a los MO Mediante Anticuerpos Anti-CD14

Se examinó la capacidad de tres mAb anti-CD14 de inhibir la unión de los complejos LPS-LBP a los MO. Las monocapas de MO humanos se incubaron durante 15 minutos a 0ºC con los mAb 3C10, 60b o 26ic a concentraciones de 0 ug/ml, 0,15 ug/ml, 0,5 ug/ml, 1,5 ug/ml, 5 ug/ml, y 15 ug/ml. La capacidad de las monocapas de unir los ELPS^{lo} tratados con LBP (Ejemplo 3) se probó como se describe en el Ejemplo 4.

Los resultados de este estudio, ilustrados en la Figura 6, indican que los mAb 3C10 y 60b producen un índice de unión que disminuye con el aumento de la concentración del mAb utilizado, mientras que el mAb 26ic, que reconoce un epítopo diferente del que reconocen los mAb 3C10 y 60b, no redujo el índice por debajo de los niveles conseguidos a la concentración control de mAb (0 ug/ml), es decir, no inhibió la unión. Así pues, los mAb 3C10 y 60b tienen la capacidad de inhibir la unión de los complejos LPS-LBP a los MO. La especificidad de la inhibición viene indicada por la observación de que los mAb contra el CD11b, CD18, CD16 y HLA no inhiben la unión (datos no mostrados).

Por otro lado, la Figura 7 ilustra que los mAb 26ic, 3C10 y 60b eran capaces todos ellos de modular negativamente la unión de los complejos LPS-LBP a los MO. Los anticuerpos monoclonales se fijaron a las placas de cultivo de tejidos previamente al establecimiento de las monocapas de MO. Esto se consiguió añadiendo el mAb a la placa a una concentración de 25 ug de proteína/ml, manteniendo el mAb en las placas durante 60 minutos a 20ºC y lavando entonces el mAb no unido a la placa, previamente al sembrado de los MO. Los MO unidos a las superficies recubiertas con los mAb anti-CD14, pero no con otros mAb, mostraron una reducción de la unión de eritrocitos recubiertos con los complejos LPS-LBP. Así, el CD14 que se redistribuye a la superficie basal de los macrófagos unidos, es necesario para la unión de los complejos LPS-LBP. Este resultado confirma la conclusión de la Figura 6 de que el CD14 sirve como receptor para los complejos LPS-LBP.

13. El CD14 Se Une Específicamente a los Complejos LPS-LBP

Se examinó la capacidad del CD14 purificado de unirse específicamente a los complejos LPS-LBP. El CD14 se inmovilizó en las superficies recubriéndolas primero con el mAb anti-CD14 y después con un extracto Triton X-100 de monocitos. Se resuspendieron 10^{8} monocitos en Triton al 1% en PBS, se incubaron durante 15 min a 0ºC, y luego se eliminó el material insoluble por centrifugación. El extracto, que contiene el CD14, se aplicó a las superficies recubiertas de anticuerpo. Este procedimiento dio lugar a superficies recubiertas con CD14. En los pocillos control que contenían anticuerpos contra otros antígenos diferentes de CD14, este procedimiento dio lugar a superficies recubiertas con proteínas diferentes de CD14. Tras un lavado abundante, se añadieron eritrocitos recubiertos con complejos LPS-LBP a los pocillos recubiertos, y la unión de los eritrocitos (ELPS^{lo}) se documentó mediante fotografías. El CD14 adsorbido a la superficie a través del mAb 26ic, un anticuerpo contra el CD14 que no bloquea el sitio de unión para la unión de LPS-LBP, se unió fuertemente a los eritrocitos recubiertos. Las superficies recubiertas con otros antígenos no tuvieron esta actividad. Así, las moléculas de CD14 purificadas tienen la capacidad de unir complejos de LPS-LBP. Esta observación prueba que el CD14 es un receptor de los complejos LPS-LBP.

14. Los Complejos LPS-LBP Inducen la Secreción De TNF En Los MO

Se examinó la capacidad del LPS en presencia de LBP, de la LBP tratada con calor, de la albúmina sérica bovina (BSA) o del suero bovino fetal (FCS), de inducir la secreción de TNF en macrófagos de exudado peritoneal (PEM).

Para producir los PEM de conejo, se inyectó en conejos NZW (2-2,5 kg) por vía intraperitoneal, aceite mineral 35 (Drakeol 6VR, Pennreco, Butler, PA) que contenía 10 ug de preparación de paredes celulares de BCG (paredes celulares de BCG, R-200, Ribi Immunochem Research. Inc. Hamilton, MT). Tres días después, se realizó una inyección iv. en bolo de 120 mg de pentobarbital sódico (Western Medical Supply Inc., Arcadia, CA), seguido de un lavado aséptico del peritoneo con 500 ml de RPMI-1640 enfriado con hielo (GIBCO, Grand Island, NY) suplementado con L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, 50 U/50 ug de penicilina/estreptomicina por ml, Hepes 10 mM, suero bovino fetal al 2% y heparina 5 U/ml. Las células recogidas se centrifugaron (1000xG, 10 minutos, 4ºC) y se resuspendieron en el medio anterior sin FBS (medio libre de suero). Tras una centrifugación adicional y la resuspensión en medio libre de suero, las células se contaron utilizando un hemocitómetro y se plaquearon en recipientes de 150 cm^{2} a una densidad de 8-10x10^{7} macrófagos/recipiente. Tras 2 horas a 37ºC, al 5% de CO_{2}, las células no adheridas se eliminaron de los recipientes mediante un lavado vigoroso y se rellenó con 20 ml de medio libre de suero. Las células del exudado peritoneal inducidas por el aceite mineral, al examinarse utilizando preparaciones de citocentrífuga teñidas con Wright, contenían aproximadamente un 60% de macrófagos, un 35% de neutrófilos y un 5% de linfocitos. Tras el plaqueado y el lavado, las células adheridas eran macrófagos en más de un 90%. Los PEM de conejo así producidos se trataron con LPS aislado de Salmonella minessota Re595 (100 pg/ml) en presencia y ausencia de las proteínas anotadas anteriormente durante 12 horas y en el sobrenadante libre de células se realizó el ensayo del TNF como se ha descrito anteriormente, utilizando una modificación del ensayo L929 de Ruff et al. (Lymphokines, 2:235-242, 1981) como se describe en Mathison et al. (J. Clin. Invest. 81:1925, 1988).

Brevemente, las células L929 (CCL 1, American type Culture Collection, Rockville, MD) se mantuvieron en RPMI 1640 (GIBCO, Grand lsland. NY) suplementado con Hepes 10 mM y suero fetal bovino al 10% (Hyclone, Rehatuin F.S., Reheis Chemical Co., Phoenix, AZ). Los cultivos confluentes (3-4x10^{7} células/recipientes de 75 cm) se enjuagaron brevemente con tripsina al 0,5% (TRL3, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ) en solución salina fisiológica que contenía EDTA 5 mM y Hepes 10 mM pH 7,4, resuspendido en medio fresco que contenía actinomicina D (1 ug/ml) y se añadió a placas de 96 pocillos (5-7x10^{4} células/pocillo). Tras 2 h en cultivo, se añadieron muestras diluidas en serie a los pocillos y las placas se incubaron durante la noche (5% CO_{2}, 37ºC). Tras la evaluación microscópica, el medio se decantó, y los pocillos se rellenaron con una solución de cristal de violeta al 0,2%, formalina al 10% y fosfato al 0,01 M pH 7-7,5 durante 5 min, se lavaron vigorosamente con agua y se secaron. El grado de lisis se cuantificó espectrofotométricamente (550 nm) utilizando un lector de placas Bio-Tek Modelo EL310 (Bio-Tek Instruments, Inc., Burlington. VT) conectado a un ordenador IBM-PC. Los resultados del ensayo se expresaron como U/ml, con una unidad (U) definida como la cantidad de TNF resultante en la lisis del 50% de las células.

De forma rutinaria, se colocaban de 8 a 12 placas por ensayo. Cada placa incluía dos estándares de laboratorio, el medio acondicionado de células 264.7 RAW tratadas con el LPS de Re595 (6x10^{3} U/ml) y medio acondicionado de los PEN de conejo tratado con el LPS de Re595 (1,3x10^{3} U/ml). Estos estándares, a su vez, se calibraron con TNF recombinante humano (Cetus Corporation, Emeryville, CA, 2x10^{7} U/mg) y los resultados del ensayo se normalizaron de acuerdo con esto. Las muestras se ensayaron por cuadruplicado, y se observó un coeficiente de variación (DE/media) de 0,12 \pm 0,08 (DE). Utilizando este ensayo, se pudo detectar TNF derivado de los macrófagos de conejo, en una cantidad tan baja como 10 pg/ml (actividad específica de 1x10^{8} U/mg). No obstante, debido a que las concentraciones de suero mayores del 10% provocan el redondeo inespecífico y la pérdida de adherencia de las células L929, el límite inferior de la detección de TNF de conejo en suero fue de 20 U/ml (correspondiente a 0,2 ng de TNF/ml).

Los resultados de este estudio, mostrados en la Figura 8, demuestran que el TNF sólo se produce si el LPS y la LBP activa están presentes. El LPS de Re595 es de una cepa rugosa de Salmonella; se obtenían resultados idénticos si el LPS utilizado se aislaba de cepas de organismos lisos, como el LPS de E. coli 0111:B4 indicando la generalidad de los efectos observados aquí.

15. La Unión de LPS a LBP Protege a la LBP de la escisión con Tripsina

Se prepararon las muestras, que contenían LBP a una concentración final de 0,3 mg/ml, en un tampón que contenía 50 mM de HEPES, 10 mM de EDTA pH 7,4. A la primera muestra se le añadió LPS a una concentración final de 0,125 mg/ml. A la segunda muestra se le añadió sulfato de dextrano a una concentración final de 0,125 mg/ml. A continuación, se añadió tripsina a las tres muestras a una concentración final de 2 ug/ml. Se cogieron alícuotas de las muestras tratadas con tripsina a intervalos de tiempo de 5, 25, 60 y 120 minutos mientras se mantenía la temperatura a 37ºC. Las alícuotas se analizaron entonces mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) utilizando geles al 12%. Los resultados de este estudio, mostrado en la Figura 9, indican que la unión de LPS mediante LBP protege a la LBP de la degradación enzimática. El LPS podría proteger a la LBP mediante la inducción de un cambio conformacional en la LBP que previniera la escisión o impidiendo estéricamente el acceso al sitio de escisión.

16. Los Anticuerpos Monoclonales Anti-CD14 Inhiben la Producción de TNF Inducida Por el Complejo LPS-LBP en Sangre Total Humana

La capacidad de los mAb anti-CD14 de inhibir la secreción de TNF mediante los MO en sangre humana se examinó utilizando el ensayo de la actividad citotóxica inducida por TNF descrita por Espevik et al. (J. Immunol. Meth., 95:99-105, 1986). Brevemente, se preparó sangre total humana anticoagulada con heparina y se incubó con los mAb 3C10, 60b o IB4 a una concentración final de 1 ug/ml a 37ºC durante 30 minutos. A continuación, se incubaron las células con LPS de Re595 a una concentración final de 0, 0,01, 0,1, o 1,0 ng/ml a 37ºC durante 12 horas en un incubador humidificado, al 10% de CO_{2}. Se recogió entonces el plasma de cada muestra y se examinó la presencia de TNF.

Para estos estudios no fue necesaria la adición de más LBP, ya que los niveles constitutivos de LBP en la sangre de sujetos sanos se estima que es de 100-250 ng//ml (Tobias et al., supra, 1986; y Tobias et al., Infect. Immun.. 50:73-76, 1985). Basándonos en las estimaciones de la afinidad del LPS hacia la LBP (Tobias et al. supra, 1989), los niveles constitutivos de LBP son más que suficientes para unir todo el LPS añadido.

Se obtuvieron células WEHI clon 13 de T. Ezpevik de la Universidad de Trondheim, Noruega, y se cultivaron en medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco) que contenía 10% de FCS, glutamina 0,1 mM y gentamicina 30 ug/ml. Las células se sembraron en placas microtituladas a una concentración de 2x10^{4} células por pocillo en 100 microlitros (ul) de medio de cultivo RPMI 1640. Se mezclaron muestras de 5 a 50 microlitros (ul) de sobrenadante del cultivo de MO con el medio de cultivo de WEHI clon 13 y se incubó durante 20 h a 37ºC. A continuación, se añadieron en cada pocillo de la placa microtitulada 10 microlitros de MTT de tetrazolio (M-2128 Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) a una concentración de 5 mg/ml en PBS, y los pocillos se incubaron durante 4 h más a 37ºC. Tras aspirar 100 microlitros del sobrenadante de los pocillos, se añadieron 100 microlitros de isopropanol con 0,04 N de HCl a cada pocillo. Tras disolver los cristales azul oscuro de formazan, las placas se leyeron en un lector de placas microtituladas, utilizando una longitud de onda de ensayo de 570 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm.

El porcentaje de células diana muertas se determinó como sigue:

= 100 - \frac{densidad \ óptica \ en \ los \ pocillos \ con \ CF/TNF}{densidad \ óptica \ en \ los \ pocillos \ control} x 100

El porcentaje de células muertas obtenidas en los cultivos experimentales se comparó entonces con los porcentajes obtenidos de varias diluciones conocidas de TNF para determinar la correspondiente concentración de TNF de cada cultivo experimental. Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla VI.

TABLA VI Efecto de los Anticuerpos Monoclonales en la Producción de TNF en Sangre Total Humana Inducida por LPS

[LPS de Re595], ng/ml	Anticuerpo^{1}	[TNF], U/ml^{2}
-	-	<0,5
0,01	-	<0,5
0,1	-	4,8
1,0	-	39
-	3C10	<0,5
0,01	3C10	<0,5
0,1	3C10	<0,5
1,0	3C10	3
-	60b	<0,5
0,01	60b	<0,5
0,1	60b	2
1,0	60b	12
-	IB4^{3}	<0,5
0,01	IB4	2
0,1	IB4	13
1,0	IB4	40
^{1} Todos los anticuerpos monoclonales se añadieron a una concentración final de 1 ug/ml.
^{2} \begin{minipage}[t]{155mm} Los ensayos de TNF se realizaron con las WEHI clon 13, utilizando como estándar un TNF recombinante con una actividad específica de 2x10^{7} unidades (u) por mg. \end{minipage}
^{3} Un mAb Anti-CD18.

De la Tabla VI se puede deducir que la producción de TNF inducida por el LPS en sangre total humana aumenta con la concentración de LPS. Además, se puede observar que la producción de TNF inducida por el complejo LPS-LBP estaba significativamente inhibida por los anticuerpos monoclonales anti-CD14, 3C10 y 60b, mientras que el anticuerpo monoclonal anti-CD18 IB4 no producía una inhibición significativa de la producción de TNF. Se realizaron experimentos similares con LPS aislado de la forma lisa de bacterias E. coli O111:B4, que indicaron la generalidad del efecto en las preparaciones de LPS con un contenido en carbohidratos variado, siempre que contengan las estructuras de lípido A conservadas.

Se estableció la especificidad del TNF en la actividad citotóxica encontrada en la sangre total, utilizando un anticuerpo IgG policlonal anti-TNF humano como se describe en Mathison et al. (J. Clin. Invest., 81:1925, 1988). Este anticuerpo neutraliza completamente toda la actividad citotóxica encontrada en las muestras de sangre total tratada con LPS.

17. Discusión de los Resultados de los Ejemplos 1-16

Los anteriores ejemplos demuestran que la LBP funciona como una opsonina, ya que se une a las bacterias y facilita su unión y fagocitosis por los macrófagos. Se cree que mientras la LBP se une al LPS a través de un dominio que es homólogo al dominio de unión al LPS de la BPI, la unión de la LBP a las células está mediada por un dominio único de la LBP.

La LBP situada en la superficie de las partículas recubiertas de LPS es reconocida por un receptor específico, el CD14, que es móvil en los MO en el plano de la membrana. Las partículas recubiertas de LBP se unen a las células que expresan CD14, como los MO, pero no a otras células de la sangre. La actividad de unión a la superficie apical de los MO es eliminada por la expansión de las células en sustratos recubiertos con complejos LBP-LPS. El receptor para la LBP, el CD14, es distinto de otros receptores opsónicos ya que los anticuerpos unidos a superficie CR1, CR3, y FcR no reducen la unión de las partículas recubiertas de LBP.

Como opsonina, la LBP promueve la eliminación de agentes infecciosos que inducen la sepsis, como las bacterias Gram-negativas. No obstante, durante la sepsis puede ocurrir la bacteriolisis, tanto a través de la acción de los mecanismos endógenos de lisis, lo que incluye el complemento y las enzimas degradativas, o siguiendo el tratamiento con antibióticos. La lisis conlleva la liberación sistémica de LPS provocando el aumento de los niveles de LPS en sangre. Ya que estos niveles se estima que están entre 1-1000pg de LPS/ml hay suficiente LBP presente para formar complejos LPS-LBP de alta afinidad (Sturk et al., en Detection of Bacterial Endotoxins with the Limulus Amebocyte Lystate Test., eds. Watson, S. W. Allan R. Liss, NY 1987:371-385; van Deventer, S.J.H. et al., Lancet, 1:605-608, 1988). Los complejos LPS-LBP se unen al CD14 sobre las células de la estirpe de los macrófagos/monocitos e inician una síntesis rápida y liberación de la monocina y de TNF, y por lo tanto contribuyen significativamente al desarrollo completo del síndrome séptico.

La clásica opsonina, la IgG, facilita la unión de las partículas recubiertas de IgG, su ingestión fagocítica, y la liberación de compuestos tóxicos como el peróxido de hidrógeno. La otra opsonina clásica, la C3, facilita principalmente la unión de partículas recubiertas de C3. La fagocitosis mediante MO no estimulados se observa sólo si las partículas recubiertas de C3 también llevan IgG (Ehlenberger et al., J. Exp. Med., 145:357-371, 1977), y si no se ha iniciado la producción de peróxido de hidrógeno (Wright et al., J. Exp. Med., 158:2016-2023, 1983).

La actividad opsónica de la LBP parece más cercana a la de la C3. Las partículas recubiertas de LBP se unen ávidamente a los MO, pero la unión no inicia la fagocitosis o la liberación de peróxido de hidrógeno (Figura 5). La LBP también actúa como la C3, en tanto que potencia la fagocitosis de las partículas recubiertas con cantidades bajas de IgG (Figura 4). El efecto opsónico de la LBP difiere de la de la C3 sólo en este aspecto. Mientras que las proteínas del complemento pueden iniciar la fagocitosis si los MO se tratan con un estímulo auxiliar como el PMA (Wright et al., supra, 1982) o la fibronectina (Wright et al., supra, 1983), la LBP no provoca la fagocitosis aún en estas células estimuladas de forma óptima.

Actuando como una opsonina, la LBP limita la expansión de las bacterias Gram-negativas en un animal. La aparición de la LBP durante la fase aguda la hace adecuada para combatir la infección, y se cree por lo tanto, que la LBP representa un mecanismo de defensa contra agentes infecciosos como las bacterias Gram-negativas.

18. Células

La línea celular RAW 264.7 de macrófagos murinos (RAW 264.7) (ATCC Núm. TIB71), la línea celular J774.1 de macrófagos murinos (J774.1) (ATCC Núm. TIB67), las líneas celulares L929, SW620 (ATCC Núm. CCL227) y THP-1 (ATCC Núm. TIB202) se obtuvieron de la ATCC, y las células LR9 aisladas de células mutagenizadas de la línea celular J774.1 de macrófagos murinos, se derivaron como se ha descrito en Hara-Kuge et al. J. Biol. Chem., 265:66066610, 1990, que se incorpora aquí como referencia. Las células GG2EE y los macrófagos derivados de células de ratón C3H/HeJ, fueron proporcionadas por L. Varesio (National Cancer Institute, Frederick, MD) y se prepararon como se describe en Blasi et al. (Eur. J. Immunol., 17:1491-1498, 1987), que se incorpora aquí como referencia. Todas las líneas celulares se cultivaron en un medio RPMI 1640 libre de endotoxinas (RPMI completo) (GIBCO) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FCS) (HyClone, Logan, Utah), L-glutamina 2 mM (GIBCO, Grand Island, NY), estreptomicina 50 ug/ml (GIBCO) y penicilina 50 U/ml (GIBCO). Las células SW620 se mantuvieron en un medio idéntico, excepto que el RPMI se sustituyó por DMEM (DMEM completo). En las células THP-1 se indujo la expresión de CD14, mediante el tratamiento con 1,25 dihidroxi-vitamina D3 0,1 \muM (Biomol Research Lab, Plymouth Meeting, PA) como se describe en Tobias et al., supra, 1993. Las células 70Z/3 pre-B murinas que expresan un CD14 anclado a glicosilfosfatidilinositol (GPI) (70Z/3-hCD14), o un CD14 humano integral de membrana (70Z/3-hCD14CI), o las transfectadas con un vector vacío (70Z/3-RSV) se produjeron y mantuvieron como se describe en Lee et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:9930-9934, 1993), que se incorpora aquí como referencia. Los macrófagos obtenidos del peritoneo murino con tioglicolato (PEM) se obtuvieron como se describe en Han et al. (J. Biol. Chem., 268:25009-25014. 1993), que se incorpora aquí como referencia. El aislamiento y mantenimiento de células endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) fue como se describe en Pugin et al., supra, 1993a; y Pugin et al., supra, 1993b, que se incorporan aquí como referencia.

La sangre total heparinizada de ratón (10 U/ml) se obtuvo de ratones Balb/c mediante punción cardíaca.

19. Reactivos

Las preparaciones de pared celular de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococci de grupo A y grupo B, Streptococcus pneumoniae, y Streptococcus mitis se obtuvieron y purificaron como ha sido descrito (Gracia et al., J. Biol. Chem., 262:15400-15405, 1987; DeJonge et al., J. Biol. Chem., 267:11248-11254, 1992; Heumann et al., supra). El peptidoglicano soluble de S. aureus se obtuvo de R. Dziarski (Universidad de Indiana, Gary, IN). El lipoarabinomanano (LAM) de la cepa H37Ra de Mycobacterium tuberculosis se obtuvo de P. Brennan (Universidad del estado de Colorado, Ft. Collins, CO). El interferón-\gamma murino (\gamma-IFN) se obtuvo de Robert Schreiber Ph.D. (Universidad de Washington, St. Louis, MO) y el LPS de E. coli 0111:84 de List (Campbell, CA). El Re595 fluoresceinado (FITC-LPS) se produjo como se describe en Skelly et al., (Infect. Immun., 23:287-283, 1979). El mAb anti-CD14 63D3 (ATCC, Rockville, MO) se purificó a partir de una ascitis. El mAb anti-CD14 28C5 se obtuvo de D. Leturcq y A. Moriarty (R.W. Johnson Pharmaceutical Research Institute, San Diego, CA). El antisuero anti-hIL-8 se obtuvo de S.L. Kunkel (Escuela médica de la Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI).

La contaminación del LAM, las preparaciones de paredes celulares de las Gram-positivas, o de peptidoglicano soluble con LPS siempre es una preocupación. Se comprobó que las preparaciones de agonista estaban libres de contaminación detectable de LPS utilizando el ensayo cromogénico del limulus (BioWhittaker, Walkersville. MD). En ningún caso la inclusión de polimixina B 50 ug/ml (CalBiochem, San Diego, CA) bloqueó la estimulación de ninguna de las sustancias agonistas probadas, excepto el propio LPS. Además, se determinó que el LAM y las paredes celulares de Gram-positivas podían activar los macrófagos C3H/HeJ resistentes a LPS mientras que estas células no respondieron a una cantidad tan alta como 100 ng/ml de LPS de E. coli O111:B4.

20. Expresión del CD14 y TNF murinos

El cDNA del CD14 murino se obtuvo del cDNA de la línea celular RAW 264.7 de macrófagos murinos (células RAW) mediante PCR, utilizando los cebadores descritos en Lee et al. (J. Exp. Med., 175:1697-1705, 1992) y se subclonó en el vector de expresión procariota pDSpv3, que se utilizó para transformar E. coli DHSa^{TM}. Se recogieron por centrifugación las bacterias de un cultivo de 0,5L después de toda la noche, se lavaron y lisaron utilizando un tampón basado en lisozima, se sonicaron, y se solubilizaron en guanidina-HCl 7 M. La proteína solubilizada se purificó por HPLC de fase reversa utilizando una columna C-4 (Pierce Chemicals, Rockford, IL) y un gradiente de acetonitrilo/ácido trifluoroacético. Las fracciones se cribaron para una banda de 41 kD en geles SDS-PAGE (peso molecular esperado del CD14 murino no glicosilado). La microsecuenciación de proteínas del material purificado reveló la secuencia NH_{2}-terminal esperada del CD14 murino como se proporciona en Matsuura et al. (Nucleic Acids Res., 17:2132, 1989).

El TNF-\alpha murino recombinante (mTNF\alpha) se obtuvo utilizando los mismos procedimientos de expresión y solubilización descritos anteriormente, con la excepción de que el plásmido contenía un cDNA que codificaba el TNF\alpha murino, como se describe en Kravchenko et al., enviado (1994). La purificación se consiguió utilizando DE-52 y cromatografía de intercambio iónico de hidroxiapatita. La microsecuenciación de los primeros 20 aminoácidos del extremo N-terminal del material purificado fue idéntica a la secuencia publicada del extremo N-terminal del TNF\alpha murino. La bioactividad del TNF\alpha murino purificado se midió mediante el bioensayo de los fibroblastos de ratón WEHI clon 13 como se describe en Espevik y Nissen-Meyer (J. Immunol. Methods, 95:99-105, 1986) y se encontró que era de 7x10^{7} unidades/mg de proteína.

21. Producción y caracterización de un anticuerpo anti-CD14 murino

Se administraron ocho inmunizaciones subcutáneas de 100 \mug de CD14 murino recombinante a conejos White New Zealand durante un periodo de 24 semanas, con una inmunización inicial en adyuvante de Freund completo y todas las subsiguientes inmunizaciones en adyuvante de Freund incompleto. Como se muestra en la Figura 10B, el antisuero de uno de los tres conejos reaccionó con las células RAW 264 y J774 cuando se realizaron estudios de FACS (FACScan®, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ). Una tinción similar se obtuvo cuando se utilizó un fragmento F(ab')_{2} de la IgG purificada preparado como se describe en Andrew y Titus (Current Protocols in Immunology, eds. New York: John Wiley & Sons, pp.2.8.5, 1991) en lugar del suero completo. Por el contrario, las células LR9 no se marcaron con el anticuerpo anti-CD14 murino. De forma similar, los fragmentos F(ab')_{2} de la IgG preparados a partir de IgG de conejos no inmunizados, no marcaron ninguna de las líneas celulares (no se muestra).

Se realizó un experimento adicional para evaluar la capacidad del anticuerpo IgG anti-CD14 murino de reconocer el CD14 murino nativo, utilizando como fuente de CD14 murino nativo un sobrenadante libre de células, de células RAW o J774 (5x10^{6} células/ml) tratado con 1 U/ml de fosfolipasa C especifica de fosfatidilinositol (PI-PLC, Sigma) durante 1 h a 37ºC. También se prepararon sobrenadantes libres de células de las células LR9 o los fibroblastos murinos L929 tratadas con PI-PLC. La misma cantidad de proteína de estos sobrenadantes se sometió a SDS-PAGE y se transfirieron luego a nitrocelulosa. Se realizó un inmunoblotting utilizando una IgG de conejo anti-CD14 murino obtenida como se ha descrito anteriormente o una IgG no inmune, seguido de la adición de una IgG de cabra anti-conejo conjugada con peroxidasa. Como se muestra en la Figura 10A, el tratamiento con PI-PLC resultó en la liberación de proteína inmunoreactiva por las células RAW y J774, mientras que una fracción comparable de células LR9 y L929 no reaccionó con el anti-CD14 murino. La totalidad de estos datos apoya el concepto de que el anticuerpo anti-CD14 murino reconoce el CD14 murino nativo y que las células LR9 no expresan CD14. En pruebas similares, el CD14 murino no se detectó con ninguno de los anticuerpos monoclonales anti-hCD14 comercialmente disponibles MY-4, 63D3, y 3C10.

22. Preparación de anticuerpo anti-CD14 humano

El sCD14 humano recombinante, preparado como se describe en Han et al., supra, se inmunopurificó de los sobrenadantes del cultivo celular utilizando el mAb 63D3 anti-CD14 inmovilizado, y se utilizó como antígeno para inmunizar una cabra; se preparó IgG purificada y fragmentos F(ab')_{2} de la IgG como se describe en Andrew y Titus, supra. Se determinó la especificidad de esta fracción de anticuerpo mediante técnicas de Western blotting, ELISA (con el sCD14 como antígeno), y FACS utilizando células CHO transfectadas que expresan el CD14 recombinante en su superficie (no se muestra).

23. Medición de la Activación Celular

Las células RAW, J774, GG2EE así como los macrófagos obtenidos del peritoneo (PEM) de ratones C3H/FeJ (una cepa que responde al LPS) o ratones C3H/HeJ (una cepa que no responde al LPS) se distribuyeron en placas estériles microtituladas (Costar, Cambridge, MA) a una densidad de 2-3x10^{5} células/pocillo para las células RAW y J774 o 10^{5} células/pocillo para las células PEM. Tras 5 h de incubación, se retiró el RPMI completo y se lavaron las células con RPMI libre de suero. Diferentes mezclas de (1) LPS, (2) paredes celulares de bacterias Gram-positivas, (3) LAM, (4) TNF\alpha murino, y (5) una fracción de anticuerpo anti-CD14 humano purificada descrita en el Ejemplo 22, se diluyeron en RPMI libre de suero que contenía 0,5 mg/ml de albúmina sérica humana y se añadieron a los pocillos por duplicado o triplicado. Los experimentos se realizaron en 200 \mul de volumen con suero bovino fetal (Sigma) a una concentración final del 5%.

En algunos experimentos, se obtuvieron muestras de los sobrenadantes tras 4 h para las mediciones de TNF, utilizando el bioensayo del clon 13 WEHI (Espevik). En otros experimentos, se añadieron 10 U/ml de IFN-\gamma murino a las mezclas y se llevaron a cabo incubaciones de alrededor de 15 h. Se ensayó la producción de nitrito en los sobrenadantes como se describe en Ding et al. (J. Immunol., 141:2407-2412, 1988). Los diferentes agonistas y anticuerpos no afectaron la viabilidad de las células, como se evaluó mediante el ensayo colorimétrico del MTT (no se muestra) (Mosmann, J. Immunol. Methods, 65:55-63, 1983).

Como se muestra en la Figura 11, el anticuerpo anti-CD14 murino inhibió la producción de nitrito dependiente de LPS o de las de paredes celulares de B. subtilis en las células J774. Las células LR9 tuvieron una respuesta marcadamente baja a la estimulación con LPS o con paredes celulares de Gram-positivas. El aumento de la concentración de LPS a 3 ng/ml o de las paredes celulares de Gram-positivas a 1000 ng/ml indujo la producción de nitrito en estas células, pero bajo estas condiciones experimentales el anti-CD14 no redujo la respuesta.

La sangre total de ratón heparinizada se repartió en una placa microtitulada (200 \mul/pocillo) y se incubó en presencia de LPS e IgG policlonal anti-CD14 murino. Tras 4 h de incubación a 37ºC, se ensayó la bioactividad del TNF en el plasma acondicionado utilizando el método de Espevik y Nissen-Meyer, supra. En los experimentos con células THP-1, las células se lavaron dos veces con RPMI libre de suero que contenía 0,5 mg/ml de albúmina sérica humana, se resuspendieron en medio libre de suero, y se distribuyeron a una concentración de 5-7x10^{4} células/pocillo. Se añadió suero bovino fetal (Sigma) para obtener una concentración final del 5%. Varias concentraciones de LPS, preparaciones de pared celular, LAM o peptidoglicano soluble se añadieron a las células con o sin anticuerpos, en duplicados, y se incubaron a 37ºC durante 7 h. Entonces, se recogieron muestras de los sobrenadantes libres de células y se congelaron a -20ºC. La IL-8 se valoró con un ELlSA, como se ha descrito previamente en Standiford et al. (J. Immunol., 145:1435-1439, 1990), con los resultados que se muestran en la Figura 13.

Se midió la expresión de IgM por las células 70Z/3 como se ha descrito previamente en Lee et al., supra. Las células se resuspendieron en RPMI completo y se distribuyeron en placas de 48 pocillos (Costar) a una concentración de 5x10^{5} células/pocillo en 0,5 ml de volumen. Se consiguió la estimulación en suero fetal bovino al 5% mediante la adición de varias concentraciones de LPS, preparación de pared celular de B. subtilis, o LAM de micobacterias. La expresión de IgM se evaluó mediante análisis FACS tras una incubación de 18 h a 37ºC. Como se muestra en la Figura 14, del mismo modo que el LPS, las paredes celulares y el LAM indujeron un aumento significativo en la regulación positiva de IgM, cuando el hCD14 se expresaba en la superficie celular, indicando un papel definido del CD14 en la respuesta de estos diferentes agonistas.

24. Interacciones Bioquímicas Entre el CD14 Soluble y las Paredes Celulares o el lipoarabinomanano

El ^{35}S-sCD14 se produjo utilizando células de ovario de hámster chino que se transfectaron con el cDNA del CD14 de acuerdo con el método de Han et al., supra, y entonces se incubaron con ^{35}S-metionina (Dupont NEN, Boston, MA). El ^{35}S-sCD14 se purificó de los sobrenadantes del cultivo celular utilizando el mAb anti-CD14 63D3. La concentración de ^{35}S-sCD14 se determinó mediante ELISA como se describe en Pugin et al., supra, 1993a, y se comprobó que era de una pureza >95% mediante SDS-PAGE. Su actividad específica fue de 150 cpm/ng. La unión del ^{35}S-sCD14 a las paredes celulares se evaluó como sigue: 120 \mug/ml de paredes celulares de S. mitis (insoluble en soluciones acuosas) se resuspendieron en tampón fosfato salino (PBS) a un pH de 7,3, suplementado con 2 mg/ml de albúmina sérica humana baja en endotoxinas (HSA) y se incubó con 120 ng/ml de ^{35}S-sCDl4 durante 1 h a 37ºC. Las paredes celulares se recogieron entonces por centrifugación a 4ºC utilizando centrifugación de alta velocidad (13000 g), se resuspendieron, se vortearon y se lavaron tres veces con PBS/HSA enfriado con hielo, y se midió la radioactividad con un contador de centelleo.

En experimentos posteriores se mostró que la intensidad de fluorescencia del Re595 que contenía fluoresceína unida covalentemente (FITC-Re595-LPS) preparado de acuerdo con el método de Skelly et al., supra, está marcadamente aumentada tras su unión al sCD14. Estos cambios en la fluorescencia permiten un análisis a tiempo real de la unión del LPS a las proteínas de unión al LPS, incluyendo el sCD14. En este ensayo basado en la fluorescencia se utilizó LAM de micobacterias para probar su capacidad de interferir con la unión del FITC-Re595-LPS al sCD14. En este experimento, se añadió un exceso de 50 o 250 veces (peso/peso) de LAM sobre LPS, al FITC-Re595-LPS 20 ng/ml en presencia de 0,1 \mug/ml de LBP de conejo purificada y 10 \mug/ml de CD14 soluble recombinante (0,25 ml de volumen final). Los cambios en la fluorescencia se registraron utilizando un fluorímetro SLM 6000 (SLM, Aminco, Urbana, IL), utilizando longitudes de onda de excitación y emisión de 490 nm y 520 nm, respectivamente (resultados no mostrados).

La especificación anterior, incluyendo las realizaciones y ejemplos específicos, intenta ser ilustrativa de la presente invención y no se debe entender como limitante. Otras muchas variaciones y modificaciones pueden efectuarse sin alejarse del alcance de la invención.

Claims (7)

1. El uso de un anticuerpo anti-CD14 que inhibe la unión de los componentes toxigénicos de la pared celular de las Gram-positivas al CD14 para la preparación de una composición terapéutica para reducir en un paciente la toxemia asociada con una infección por bacterias Gram-positivas, en el que dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 63D3 producido por el hibridoma ATCC Núm. HB44 o por una célula transformada y que expresa un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo.

2. El uso de la reivindicación 1 en el que la toxemia es sepsis.

3. El uso de la reivindicación 2, en el que dicha sepsis está provocada por una infección de bacterias Gram-positivas.

4. El uso de la reivindicación 2 en la que dicha sepsis está provocada por una micobacteria y la pared celular contiene lipoarabinomanano (LAM).

5. El uso de un anticuerpo anti-CD14 suficiente para inhibir en un paciente la secreción, inducida por la toxina de la pared celular de las Gram-positivas, de factor de necrosis tumoral por las células de la estirpe de los macrófagos monoclonales para la preparación de una composición terapéutica para la reducción de los síntomas de una bacteriemia asociada con una infección por bacterias Gram-positivas en dicho paciente, en el que dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 63D3 producido por el hibridoma ATCC Núm. HB44 o por una célula transformada y que expresa un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo.

6. El uso de la reivindicación 5, en el que dicho anticuerpo anti-CD14 es un anticuerpo monoclonal que inhibe de forma competitiva la unión de la toxina al CD14.

7. El uso de la reivindicación 5 o 6 en el que las bacterias Gram-positivas se seleccionan del grupo que consiste en los Streptococci del Grupo A y Grupo B, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, o una micobacteria, preferiblemente Mycobacterium tuberculosis.