ES2255732T3 - Oligonucleotidos especificos de vih y procedimientos para su utilizacion. - Google Patents
Oligonucleotidos especificos de vih y procedimientos para su utilizacion.Info
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Abstract
Oligonucleótido sintético que presenta una secuencia de nucleótidos específicamente complementaria a los nucleótidos 324 a 345 de una zona gag conservada del genoma del VIH-1 publicada como SEC. ID. nº: 5, estando constituido el oligonucleótido por 21 nucleótidos que están unidos mediante enlaces internucleótido de fosforotioato, en el que los nucleótidos comprenden por lo menos dos ribonucleótidos con terminal 5¿ o por lo menos dos con terminal 3¿ y por lo menos dos ribonucleótidos con terminal 5¿, en el que los ribonucleótidos son ribonucleótidos sustituidos en 2¿, y en el que los ribonucleótidos son 2¿-O-metil ribonucleótidos.
Description
Oligonucleótidos específicos de VIH y
procedimientos para su utilización.
La presente invención se refiere al tratamiento
de la infección por VIH. Más particularmente, la presente invención
se refiere a oligonucleótidos sintéticos de cadena complementaria
modificados, a las composiciones farmacéuticas que contienen dichos
oligonucleótidos, a los procedimientos de inhibición de la
replicación del VIH y al tratamiento de la infección por VIH
utilizando dichos oligonucleótidos.
Los virus de inmunodeficiencia humana tipos 1 y 2
(VIH-1 y VIH-2), denominados
anteriormente virus de tipo III linfótropos de leucemia de
linfocitos T (HTLV-III), se considera que son los
agentes etiológicos del síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA). El VIH forma parte de la familia Retroviridaie, cuyos
miembros contienen un genoma de ARN y actividad de transcriptasa
inversa. Durante su ciclo de crecimiento, los retrovirus copian su
ARN en el ADN provírico. El ADN provírico es capaz de integrarse en
el ADN cromosómico de la célula huésped donde utiliza el sistema de
transcripción y de traducción del anfitrión para expresar el ARN
vírico y las proteínas. Los virus se liberan de la célula por
germinación en la membrana citoplasmática. En el caso de
VIH-1 y VIH-2 la replicación vírica
produce la muerte de las células madre de los linfocitos T
cooperadores, lo que conduce a un estado de inmunodeficiencia
grave, al desarrollo de varios cánceres e infecciones oportunistas
y por último a la muerte del organismo infectado.
La frecuencia del SIDA ha crecido en proporciones
epidémicas en muchos países sin el desarrollo de tratamientos o
terapias preventivos que tienen éxito a largo plazo. Estos pocos
agentes terapéuticos que han sido prescritos, tales como los
análogos de nucleósido
3'-azido-3'-desoxitimidina
(AZT), didesoxinosina (ddl) y didesoxicitosina (ddC) y varios
inhibidores de proteasa han tenido éxito limitado. Esto ha sido
debido en parte a la citotoxicidad de estos agentes. Además,
algunos virus escapan debido a las mutaciones que les hacen
insensibles a estos agentes y a la dificultad de la acción
antivírica debido a la capacidad del virus para integrarse en el
genoma del huésped. Por este motivo, existe una necesidad sentida
desde hace tiempo de agentes terapéuticos más eficaces y terapias
preventivas para el SIDA.
Más recientemente se han desarrollado nuevos
agentes quimioterapéuticos que son capaces de modular la expresión
génica celular y extraña. Estos agentes, denominados
oligonucleótidos de cadena complementaria, se unen a moléculas
diana de ácido nucleico de una sola cadena según la regla de
Watson-Crick o de Hoogstein de emparejamiento de
bases, y actuando de este modo, destruyen la función de la diana por
uno de varios mecanismos: impidiendo la unión de factores
requeridos para la traducción o transcripción normal; en el caso de
un ARNm diana, activando la destrucción enzimática del mensaje por
ARNasa H; o destruyendo la diana mediante grupos reactivos unidos
directamente al oligonucleótido de cadena complementaria.
Se han diseñado oligodesoxinucleótidos de cadena
complementaria para inhibir específicamente la expresión de
VIH-1 y de otros virus (véase, p. ej., Agrawal
(1992) Trends in Biotechnology 10:152-158;
Agrawal et al. en Gene Regulation: Biology of Antisense
RNA and DNA (Erickson e Izant, eds.) Raven Press Ltd., Nueva
York (1992) págs. 273-283); Matsukura et al.
en Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and
AIDS, Wiley-Liss, Inc. (1992) págs.
159-1798); y Agrawal (1991) en Prospects for
Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, (Wickstron, ed.)
Liss, Nueva York, págs. 145-148). Se ha demostrado,
por ejemplo, que los oligonucleótidos de cadena complementaria que
tienen enlaces internucleósido fosfodiéster y secuencias
complementarias a las porciones del ARN del VIH-1
genómico inhiben la replicación vírica en las células infectadas
inicialmente (Zamecnik et al. (1986) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83:4143-4147; Goodchild et al.
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:5507-5511).
Sin embargo, estas moléculas ligadas al
fosfodiéster son menos capaces de inhibir la replicación vírica en
las células infectadas de manera crónica (Agrawal et al.
(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:7790-7794), debido principalmente a su
sensibilidad a la nucleasa (Wickstrom (1986) J. Biochem.
Biophys. Meth. 13:97-102). Por consiguiente, se
han desarrollado análogos resistentes de nucleasa, modificados
químicamente, que son eficaces para inhibir la replicación de
VIH-1 en cultivos de tejido (véase, Sarin et
al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:7448-7451; Agrawal et al. (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:7079-7083; Matsukura
et al. (1988) Gene 72:343-347). Estos
análogos incluyen los oligonucleótidos con enlaces internucleótido
de fosforotioato resistentes a la nucleasa presentados para inhibir
la replicación de VIH-1 tanto en la infección aguda
(U.S.S.N. 08/309.823; Agrawal et al. (1989) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:7790-7794) como en las líneas
celulares infectadas de manera crónica (Agrawal et al.
(1991) en Gene Regulation: Biology of Antisense RNA, eds.
Erickson et al. (Raven Press, Nueva York), págs.
273-284; Vickers et al. (1991) Nucleic
Acids Res. 19:3359-3368; Matsukura et
al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:4244-4248; Agrawal et al. (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:7079-7083).
El documento WO 95/18813 describe los
oligonucleótidos de fosforotioato utilizados en un procedimiento
para la separación y caracterización de mononucleótidos y
oligonucleótidos no modificados y modificados. En particular, se
describe un oligonucleótido de 21 elementos (SEC. ID nº: 7) que
corresponde a la secuencia de nucleótidos complementaria a los
nucleótidos 324 a 325 de una zona gag conservada del genoma
de VIH-1, estando los 21 nucleótidos unidos mediante
enlaces internucleótido con fosforotioato.
Zhao Q. et al. (Biochemical Pharmacology,
vol. 51, nº 2, págs. 173-182, 1996) describe los
oligonucleótidos con fosforotioato y el efecto de estos
oligonucleótidos sobre la estimulación inmunitaria. Los
oligonucleótidos con fosforotioato incluyen formas truncadas en 5'
del oligonucleótido híbrido GEM-91 de 25 elementos.
Zhao Q. et al. describe además el oligonucleótido
GEM-91 H en el que los nucleótidos que flanquean el
motivo CpG interior están modificados químicamente por cuatro
restos de
2'-O-metil-ribonucleótido
en ambos terminales 3' y 5'.
El documento WO 97/06662 describe
oligonucleótidos modificados que pueden ser útiles para estudios de
expresión génica y para el procedimiento terapéutico de cadena
complementaria. Entre otros, se describen los oligonucleótidos con
fosforotioato GEM-91 y
GEM-91-H de 25 elementos.
Sin embargo, se ha observado que algunos
oligonucleótidos unidos a fosforotioato que tienen secuencias de
nucleótidos "ricas en GC" provocan respuestas
inmunoestimulantes en los organismos a los que se han administrado.
Por ejemplo, Kniep et al. (Nature (1995)
374:546-549) da a conocer que los oligonucleótidos
que contienen el dinucleótido CG flanqueado por determinadas otras
secuencias tienen efectos mitógenos y otros efectos secundarios.
Por lo tanto, todavía sigue habiendo necesidad de
un oligonucleótido anti-VIH más eficaz que presente
efectos terapéuticos que estén acompañados de menos efectos
secundarios, p. ej., poca toxicidad celular y respuesta
inmunoestimulante reducida.
Se ha descubierto que los oligonucleótidos
sintéticos dirigidos a una zona gag del VIH inhiben la
infección por VIH-1 y VIH-2 de
células de mamífero. Estos descubrimientos han sido aprovechados
para desarrollar la presente invención, que en su aspecto más
amplio, proporciona oligonucleótidos sintéticos que tienen una
secuencia de nucleótidos específicamente complementaria a los
nucleótidos 325 a 346 de una zona gag conservada del genoma
de VIH publicada como SEC. ID nº: 3. Estos oligonucleótidos tienen
21 nucleótidos ("21-meros") que están enlazados
por enlaces internucleótido con fosforotioato. Dichos enlaces de
fosforotioato contienen una sustitución de azufre por oxígeno,
haciendo de este modo resistente al oligonucleótido a la degradación
nucleolítica. Los enlaces fosforotioato pueden ser enantiómeros
P_{p} y S_{p} mixtos, o pueden ser estereorregulares o
sustancialmente estereorregulares en ambas formas R_{p} o S_{p}
(véase Iyer et al. (1995) Tetrahedron Asymmetry
6:1051-1054).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "oligonucleótido sintético" comprende los polímeros
sintetizados químicamente de 12 a 50, preferentemente de
aproximadamente 15 a aproximadamente 30, y más preferentemente, 21
ribonucleótidos y/o monómeros de desoxirribonucleótido conectados
conjuntamente o enlazados mediante por lo menos un, y
preferentemente más de un, enlace internucleótido 5' a 3'. La
expresión "secuencia de nucleótidos específicamente
complementaria a" los nucleótidos 324 a 345 de una zona
gag conservada del genoma de VIH significa una secuencia de
nucleótidos que se une a la secuencia gag del ARN genómico,
del ADN provírico o del ARNm en condiciones fisiológicas, p. ej.,
por emparejamiento de bases de Watson-Crick
(interacción entre oligonucleótido y ácido nucleico de una sola
cadena) o por emparejamiento de bases de Hoogsteen (interacción
entre oligonucleótido y ácido nucleico de doble cadena) o por
cualquier otro medio incluyendo en el caso de un enlace de
oligonucleótido a ARN, que produce la formación de pseudonudo. El
enlace por emparejamiento de bases de Watson-Crick o
Hoogsteen en condiciones fisiológicas se mide como una cuestión
práctica observando la interferencia con la función de la secuencia
del ácido nucleico. La expresión "una zona gag
conservada" se refiere a una secuencia de nucleótidos con el gen
gag que se encuentra en las cadenas de VIH citadas.
Los oligonucleótidos de la invención comprenden
por lo menos dos ribonucleótidos con terminal 5', o por lo menos
dos ribonucleótidos con terminal 3' y por lo menos dos con terminal
5'. En las formas de realización preferidas según este aspecto de
la invención, el oligonucleótido es un oligonucleótido híbrido de la
zona del núcleo que comprende una zona de por lo menos dos
desoxirribonucleótidos, flanqueados por las zonas de los
ribonucleótidos en 5' y 3', teniendo cada uno por lo menos dos
ribonucleótidos. En una forma de realización específica, los
oligonucleótidos de la invención tienen cuatro ribonucleótidos
contiguos con terminal 3' y cuatro ribonucleótidos contiguos con
terminal 3', que flanquean 13 desoxinucleótidos.
Los ribonucleótidos en el oligonucleótido híbrido
de la invención son ribonucleótidos sustituidos en 2'. Para los
objetivos de la invención, la expresión "sustituido en 2'"
significa la sustitución de la posición 2' del grupo pentosa. En la
invención reivindicada los ribonucleótidos son
2'-O-metil ribonucleótidos.
En las formas de realización específicas, los
oligonucleótidos de la invención presentan la SEC. ID nº: 1 o la
nº: 3. En algunas formas de realización, estos oligonucleótidos
inhiben la infección por VIH-1 o por
VIH-2 en una célula y/o presentan actividad
antivírica contra VIH-1 y VIH-2.
En otro aspecto todavía, la invención proporciona
formulaciones farmacéuticas adecuadas para inhibir y tratar la
infección por VIH-1 o VIH-2 y que
presentan efectos secundarios reducidos tal como inmunogenicidad.
Estas formulaciones y para inhibición que comprenden por lo menos
un oligonucleótido según la invención en un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Tal como se utiliza en la presente invención, un
"excipiente farmacéutica o fisiológicamente aceptable" incluye
cualquiera y todos los disolventes (incluyendo pero limitándose a la
lactosa), medios de dispersión, revestimientos, agentes
antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y retardadores
de la absorción y similares. La utilización de dichos medios y
agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien
conocida en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio
convencional o agente sea compatible con el ingrediente activo, se
contempla su utilización en las composiciones terapéuticas de la
invención. Los ingredientes activos complementarios pueden también
incorporarse en las composiciones.
En otro aspecto, la invención se refiere a la
utilización de un oligonucleótido sintético para la preparación de
una composición farmacéutica destinada a tratar la infección por
VIH-1 o VIH-2 en un mamífero. En
esta utilización debe administrarse un oligonucleótido según la
invención al mamífero en una cantidad eficaz para inhibir la
proliferación del virus. A título de la invención, el término
"mamífero" significa que comprende primates y seres humanos.
En algunas formas de realización, el oligonucleótido se administra
por vía oral al mamífero. La expresión "administrado por vía
oral" se refiere a la administración de la formulación por la
boca por ingestión o por alguna otra parte del sistema
gastrointestinal incluyendo el esófago. En otras formas de
realización, el oligonucleótido se administra mediante inyección
intravenosa. En otras formas de realización todavía el
oligonucleótido se administra por vía colorrectal. La expresión
"administración colorrectal", "administración rectal" o
"administrado por vía colorrectal" se refiere a la
administración de la formulación farmacéutica de la invención a
cualquier parte del intestino grueso por implantación quirúrgica,
administración anal o cualquier otro modo de colocación en
éste.
La invención proporciona asimismo en otro aspecto
un procedimiento de inhibición in vitro de la infección por
VIH-1 o VIH-2 en una célula. En este
procedimiento la célula se pone en contacto con un oligonucleótido
sintético según la invención.
En otro aspecto todavía, la invención se refiere
a la utilización de un oligonucleótido según la invención para la
preparación de una composición farmacéutica destinada a introducir
un oligonucleótido intacto en un mamífero por administración oral.
Esta utilización comprende la administración al mamífero de un
oligonucleótido según la invención que está presente en forma
íntegra en el plasma general del mamífero después de la
administración oral.
Éste y otros objetivos de la invención, las
diversas características de la misma, así como la propia invención
se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la descripción
siguiente, cuando se lee junto con los dibujos adjuntos, en los
que:
la Fig. 1 es una representación gráfica de la
inhibición de la infección por VIH-1 en las células
tratadas durante la infección inicial con un oligonucleótido
híbrido 4\times4 de la invención con la SEC. ID nº: 1;
la Fig. 2 es una representación gráfica de la
inhibición de la infección por VIH-1 en las células
tratadas después de la infección inicial con un oligonucleótido
híbrido 4\times4 de la invención con la SEC. ID nº: 1; y
la Fig. 3 es una representación gráfica de los
resultados de un análisis de XTT que demuestra la capacidad de un
oligonucleótido 4\times4 de la invención con la SEC. ID nº: 1 para
inhibir la destrucción celular producida por
VIH-2.
La patente y la bibliografía científica citada en
la presente memoria constituye el conocimiento que está a
disposición de los expertos en la materia.
Es conocido que los oligonucleótidos de cadena
complementaria, pueden unirse a una molécula diana de ácido
nucleico de una sola cadena según la regla de
Watson-Crick o la de Hoogstein de emparejamiento de
bases, y actuando de este modo, destruyen la función de la diana
por uno de varios mecanismos: impidiendo la unión de factores
requeridos para la transcripción, corte y empalme o traducción
normales; activando la destrucción enzimática del ARNm por la
ARNasa H si existe una zona contigua de los desoxirribonucleótidos
en el oligonucleótico y/o destruyendo la diana mediante grupos
reactivos unidos directamente al oligonucleótido de cadena
complementaria.
Se han diseñado nuevos oligonucleótidos de cadena
complementaria que inhiben la replicación de VIH-1 y
VIH-2. Estos oligonucleótidos son oligonucleótidos
sintéticos con enlaces internucleótido con fosforotioato y una
secuencia de nucleótidos que es complementaria a una parte de la
zona gag del genoma de VIH-1 y
VIH-2. Se ha demostrado que las secuencias situadas
en esta zona son esenciales para el empaquetamiento vírico. Estas
secuencias forman una estructura secundaria estable (Harrison et
al. (1991) en RNA Tumor Viruses (Coffin et al.,
eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, págs.
235). Los oligonucleótidos de la invención se han diseñado para
unirse a esta zona del ARN y ADN, destruyendo de este modo su
estabilidad natural y produciendo por último la inhibición del
empaquetamiento vírico y de la traducción del ARNm de gag. La
secuencia específica a la cual los oligonucleótidos de la invención
son complementarios es la de los nucleótidos 324 a 345 de la zona
gag de VIH-1. Esta secuencia está muy
conservada entre las cadenas de VIH-1, como se
demuestra a continuación en la Tabla 1.
El direccionamiento de un oligonucleótido de
cadena complementaria a dicha zona conservada que incluye un gen
activo permite la inhibición eficaz de la proliferación del VIH sin
la generación de "fuga de mutantes". La fuga de mutantes
aumenta cuando tiene lugar una mutación en la zona del genoma
dirigida por el oligonucleótido de cadena complementaria. Éstas se
producen con mayor frecuencia en las zonas sin codificación (como la
zona SA de VIH-1) que en las zonas que codifican
una proteína.
Los oligonucleótidos de la invención son más
específicos, menos tóxicos y poseen mayor resistencia a la nucleasa
que muchos otros agentes quimioterapéuticos diseñados para inhibir
la replicación de VIH. En particular, estos oligonucleótidos son
menos inmunoestimulantes que otros oligonucleótidos dirigidos a la
secuencia gag de VIH-1 porque sus secuencias
nucleotídicas no son ricas en GC. Además, estos oligonucleótidos
híbridos con enlaces de fosforotioato son menos resistentes a la
degradación nucleolítica que los compuestos de ADN con enlaces
fosfodiéster exclusivamente.
Los oligonucleótidos útiles en el procedimiento
de la invención son de 21 nucleótidos de longitud. Están compuestos
de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos (es decir, son
"híbridos"), con el extremo en 5' de un nucleótido y el
extremo en 3' de otro nucleótido que está unido por enlace covalente
por fosforoditioatos o fosforotioatos, enlaces internucleótido sin
fosfodiéster. Los oligonucleótidos con estos enlaces pueden
prepararse según los procedimientos conocidos tales como la química
del fosforamidato del H-fosfonato que puede
realizarse manualmente o con un sintetizador automático descrito por
Brown (A Brief History of Oligonucleotide Synthesis. Protocols
for Oligonucleotides and Analogs, Methods in Molecular Biology
(1994) 20:1-8). (Véase también, p. ej., Sonveaux
"Protecting Groups in Oligonucleotides Synthesis" en Agrawal
(1994) Methods in Molecular Biology 26:1-72;
Uhlman et al. (1990) Chem. Rev.
90:543-583).
Los oligonucleótidos de la composición pueden
también modificarse además de numerosas formas sin comprometer su
capacidad para hibridar el ácido nucleico diana. Dichas
modificaciones comprenden, por ejemplo, las que son internas o en
el o los extremos de la molécula de oligonucleótido y comprenden
adiciones a la molécula de los enlaces fosfato con internucleósido,
tal como compuestos de colesterilo o diamina con númerosas variantes
de restos de carbono entre los grupos amino y la ribosa terminal,
modificaciones de la desoxirribosa y fosfato que escinden o
reticulan las cadenas opuestas o las enzimas asociadas u otras
proteínas que se unen al genoma vírico. Ejemplos de dichos
oligonucleótidos modificados comprenden los oligonucleótidos con una
base modificada y/o azúcar tal como arabinosa en lugar de ribosa, o
un oligonucleótido sustituido en 3', 5' con un azúcar que, ambas de
sus posiciones 3' y 5' está unido a un grupo terminal distinto del
grupo hidroxilo (en su posición 3') y otro distinto de un grupo
fosfato (en su posición 5'). Otros oligonucleótidos modificados
están cubiertos con un sustituyente voluminoso que confiere
resistencia a la nucleasa en sus extremos 3' y/o 5', o tiene una
sustitución en un oxígeno que no forma puente por el nucleótido.
Dichas modificaciones pueden ser en algunos o todos los enlaces
internucleósido, así como en alguno o ambos extremos del
oligonucleótido y/o en el interior de la molécula. Para la
preparación de dichos oligonucleótidos modificados, véase, p. ej.,
Agrawal (1994) Methods in Molecular Biology 26; Uhlmann
et al. (1990) Chem. Rev. 90:543-583).
Se considera también que los oligonucleótidos que están
autoestabilizados son oligonucleótidos modificados útiles en los
procedimientos de la invención (Tang et al. (1993)
Nucleic Acids Res. 20:2729-2735). Estos
oligonucleótidos comprenden dos zonas: una zona de hibridación
diana; y una zona autocomplementaria con una secuencia de
oligonucleótidos complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos
que está dentro del oligonucleótido autoestabilizado.
La preparación de estos oligonucleótidos no
modificados y modificados es bien conocida en la materia (estudiada
en Agrawal et al. (1992) Trends Biotechnol.
10:152-158; véase, p. ej., Uhlmann et al.
(1990) Chem. Rev. 90:543-584; y (1987)
Tetrahedron Lett. 28 :(31) :3539-3542) ;
Agrawal (1994) Methods in Molecular Biology 20
:63-80) ; y Zhang et al. (1996) J.
Pharmacol. Expt. Thera. 278:1-5).
Los oligonucleótidos según la invención son
oligonucleótidos híbridos en los que contienen tanto
desoxinucleótidos como por lo menos dos ribonucleótidos sustituidos
en 2' en su o sus terminales. Para los objetivos de la invención, la
expresión "sustituido en 2'" significa la sustitución en la
posición de la ribosa por
2'-O-metilo.
Los oligonucleótidos híbridos útiles en el
procedimiento de la invención resisten la degradación nucleolítica,
forman duplicados estables con ARN o ADN y preferentemente activan
la ARNasa H cuando se hibridan con ARN. Por ejemplo, un
oligonucleótido útil en el procedimiento de la invención puede
contener todos los desoxirribonucleótidos con excepción de los
ribonucleótidos sustituidos en 2' en el terminal 5' del
oligonucleótido. Por otra parte, el oligonucleótido puede tener al
menos dos, y preferentemente 4, ribonucleótidos sustituidos en ambos
terminales 3' y 5'.
Los oligonucleótidos preferidos tienen por lo
menos dos y preferentemente cuatro ribonucleótidos
2'-O-metilo en ambos terminales 3'
y 5', siendo los restantes nucleótidos desoxirribonucleótidos. Un
oligonucleótido preferido es un oligonucleótido ligado a
fosforotioato de 21 elementos que contiene en este
desoxirribonucleótidos flanqueados en cada lado por cuatro
2'-O-metil ribonucleótidos. Este
oligonucleótido preferido se denomina "4\times4". Una clase
preferida de oligonucleótidos útil en el procedimiento de la
invención contiene cuatro o más desoxirribonucleótidos en un bloque
contiguo, a fin de proporcionar un segmento de activación para
ARNasa H. En determinados casos, más de un segmento de activación
estará presente en cualquier posición en el interior del
oligonucleótido. Pueden existir una mayoría de
desoxirribonucleótidos en los oligonucleótidos según la invención.
De hecho, dichos oligonucleótidos pueden tener como mucho todos,
pero siendo dos nucleótidos, desoxirribonucleótidos.
La Tabla 2 relaciona algunas especies
representativas de oligonucleótidos, los nucleótidos sustituidos en
2' están subrayados.
Los oligonucleótidos descritos anteriormente son
útiles en un procedimiento de inhibición de la infección por
VIH-1 o VIH-2 en una célula. En este
procedimiento se pone en contacto una célula con un oligonucleótido
de la invención de modo que el virus presente en la célula en el
momento de contacto o después de dicho contacto es incapaz de
replicarse.
Para determinar si los oligonucleótidos de la
invención podrían inhibir o impedir la infección por VIH, se
realizaron experimentos de infección basados en el efecto citopático
(CPE) en células MT-4. Los resultados de estos
estudios indican que los oligonucleótidos de la invención pueden
tanto inhibir una infección existente (Fig. 1) como proteger contra
dicha infección (Fig. 2).
Además, se determinó que los oligonucleótidos
sintéticos administrados por vía general a hembras murinas
embarazadas atravesaban la placenta y estaban disponibles en la
sangre de embriones en el útero. Por este motivo, se contempla que
los oligonucleótidos de la invención se utilizarán en un
procedimiento de tratamiento de fetos y de madres humanas que
albergan VIH.
Los oligonucleótidos descritos en la presente
memoria se administran al mamífero en forma de formulaciones
terapéuticas farmacéuticas que son eficaces para tratar la infección
por virus. Estas formulaciones farmacéuticas pueden administrarse
junto con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, AZT y/o varios
inhibidores de proteasa, para tratar el SIDA.
La formulación farmacéutica terapéutica que
contienen por lo menos un oligonucleótido según la invención
comprende un vehículo fisiológicamente aceptable que es coherente
con el modo de administración. Los Ejemplos incluyen un diluyente
inerte o un excipiente asimilable comestible. Dichas formulaciones
que comprenden excipientes farmacéuticamente aceptables para
introducir los compuestos en el torrente sanguíneo por inyección
intravenosa y otros aparte de las vías de inyección pueden
encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª ed.)
(Genarro, ed. (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA).
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para
utilización inyectable comprenden soluciones o dispersiones acuosas
esterilizadas y polvos esterilizados para la preparación improvisada
de soluciones o dispersiones inyectables esterilizadas. En todos
los casos la formulación debe estar esterilizada. Debe ser estable
en las condiciones de preparación y almacenamiento y puede
conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tal
como bacterias y hongos. El excipiente puede ser un disolvente o un
medio de dispersión. La prevención de la acción de los
microorganismos puede ser llevada a cabo por varios agentes
antibacterianos y antimicóticos. La absorción prolongada de los
agentes terapéuticos inyectables puede llevarse a cabo mediante la
utilización de las composiciones de agentes de absorción retardada.
Las soluciones inyectables esterilizadas se preparan incorporando el
oligonucleótido en la cantidad requerida en el disolvente apropiado,
seguido de ultrafiltración.
Por otra parte, el oligonucleótido de la
invención y otros ingredientes pueden estar ocluidos en una cápsula
de gelatina de carcasa dura o blanda, comprimidos en comprimidos o
incorporados directamente en la dieta del individuo. El
oligonucleótido puede estar incorporado con excipientes y utilizado
en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, grageas,
cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares.
Cuando el oligonucleótido se administra por vía oral, puede
mezclarse con otras formas alimenticias y potenciadores de sabor
farmacéuticamente aceptables. Cuando el oligonucleótido se
administra por vía enteral, puede introducirse en una forma sólida,
semisólida, en suspensión o emulsión y puede estar compuesto con
algún número de aditivos farmacéuticamente aceptables bien
conocidos. Los sistemas de administración oral de liberación lenta
y/o los revestimientos entéricos para las formas galénicas
administradas por vía oral se contemplan también tales como las
descritas en las patentes US nº 4.704.295, nº 4.556.552, nº
4.309.404 y nº 4.309.406.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la
cantidad total de cada componente activo de la formulación
farmacéutica o el procedimiento que es suficiente para presentar un
beneficio significativo en el sujeto o paciente, es decir, una
reducción en el crecimiento del tumor o en la expresión de las
proteínas que producen o caracterizan el cáncer. Cuando se aplica a
un ingrediente activo individual, administrado solo, la expresión
se refiere a este ingrediente solo. Cuando se aplica a una
combinación el término se refiere a cantidades combinadas del
ingrediente activo que producen el efecto terapéutico, si se
administran en combinación, en serie o simultáneamente.
Una "manera terapéuticamente eficaz" se
refiere a una vía, duración y frecuencia de administración de la
formulación farmacéutica que produce finalmente beneficio
significativo en el paciente, como se describió anteriormente. En
algunas formas de realización de la invención, la formulación
farmacéutica se administra por inyección, por vía sublingual,
colorrectal, intradérmica, oral, enteral o en inyección por
embolada, continua, intermitente o continua, seguido de regímenes
intermitentes.
La cantidad terapéuticamente eficaz de
oligonucleótido sintético administrado en el procedimiento de la
invención dependerá de la naturaleza y gravedad de la enfermedad
que se está tratando y de la naturaleza de los tratamientos
anteriores que el paciente ha recibido. Por último, el médico
adjunto decidirá la cantidad de oligonucleótido sintético con la
cual tratar a cada paciente. Inicialmente, el médico adjunto puede
administrar dosis bajas del oligonucleótido sintético y observar la
respuesta del paciente. Pueden administrarse dosis mayores de
oligonucleótido sintético hasta que el paciente obtenga el efecto
terapéutico óptimo y en ese momento la dosificación no se aumenta
más. Se contempla que las dosis de las composiciones farmacéuticas
administradas en el procedimiento de la presente invención deberían
contener aproximadamente 0,1 a 100,0 mg/kg de peso corporal al día,
preferentemente 0,1 a 75,0 mg/kg de peso corporal al día, más
preferentemente, 1,0 a 50,0 mg/kg de peso corporal al día, aún más
preferentemente, 1 a 25 mg/kg de peso corporal al día, y aún más
preferentemente, 1 a 10 o 1 a 5,0 mg/kg de peso corporal al día. El
oligonucleótido se administra preferentemente a una dosis suficiente
para alcanzar una concentración de oligonucleótido en sangre de
aproximadamente 0,01 \muM a aproximadamente 100 \muM.
Preferentemente, la concentración de oligonucleótido en la zona de
expresión génica aberrante debería ser desde aproximadamente 0,01
\muM a aproximadamente 50 \muM, más preferentemente, desde
aproximadamente 0,01 \muM a aproximadamente 10 \muM, y más
preferentemente desde aproximadamente 0,05 \muM a aproximadamente
5 \muM. Sin embargo, para la administración localizada, pueden
ser eficaces concentraciones mucho más bajas que ésta, y pueden
tolerarse concentraciones mucho mayores. Puede ser deseable
administrar simultánea o sucesivamente una cantidad terapéuticamente
eficaz de una o más composiciones terapéuticas de la invención
cuando sea individual como un único episodio de tratamiento.
Se apreciará que el contenido unitario de
ingrediente activo o los ingredientes contenidos en una dosis
individual de cada forma galénica necesaria no en sí misma
constituyen una cantidad eficaz ya que la cantidad eficaz necesaria
puede alcanzarse mediante administración de varias unidades de
dosificación (tales como supositorios, geles o cremas o
combinaciones de los mismos). De hecho se ha demostrado que la
multidosificación (una vez al día) aumenta significativamente las
concentraciones en el plasma y en los tejidos de MBO (datos no
mostrados).
La administración de composiciones farmacéuticas
según la invención o para poner en práctica el procedimiento de la
presente invención puede realizarse en una variedad de formas
convencionales, tal como por ingestión oral, administración
enteral, colorrectal o transdérmica, inhalación, administración
sublingual, o inyección cutánea, subcutánea, intramuscular,
intraocular, intraperitoneal o intravenosa, o alguna otra vía de
administración conocida en la materia para administrar agentes
terapéuticos.
Cuando la composición deba ser administrada por
vía oral, sublingual o por cualquier vía no inyectable, la
formulación terapéutica incluirá preferentemente un excipiente
fisiológicamente aceptable, tal como un diluyente inerte o un
excipiente asimilable comestible con el que se administra la
composición. Las formulaciones adecuadas que comprenden excipientes
farmacéuticamente aceptables para introducir los compuestos en el
torrente sanguíneo por otras vías aparte de las vías inyección
pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences
(18ª ed.) (Genarro, ed. (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). El
oligonucleótido y otros ingredientes pueden estar ocluidos en una
cápsula de gelatina de carcasa dura o blanda, comprimidos en
comprimidos o incorporados directamente en la dieta del individuo.
El oligonucleótido puede estar incorporado con excipientes y
utilizado en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales,
grageas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y
similares. Cuando la composición farmacéutica se administra por vía
oral, puede mezclarse con otras formas alimenticias y potenciadores
de sabor farmacéuticamente aceptables. Cuando la composición
farmacéutica se administra por vía enteral, puede introducirse en
una forma sólida, semisólida, en suspensión o emulsión y puede
estar compuesto con algún número de aditivos farmacéuticamente
aceptables bien conocidos. Se contemplan también Los sistemas de
administración oral de liberación lenta y/o los revestimientos
entéricos para las formas galénicas administradas por vía oral
tales como las descritas en las patentes US nº 4.704.295, nº
4.556.552, nº 4.309.404 y nº 4.309.406.
Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de la
composición de la invención se administra por inyección, el
oligonucleótido sintético preferentemente estará en forma de
solución acuosa exenta de pirógenos, parenteralmente aceptable. La
preparación de dichas soluciones parenteralmente aceptables, debido
al pH, isotonicidad, estabilidad y similares, está comprendida
dentro de la experiencia en la materia. Una composición farmacéutica
preferida para inyectables debería contener, además del
oligonucleótido sintético, un vehículo isotónico tal como inyección
de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa,
inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de Ringer
lacteada u otro vehículo conocido en la materia. La composición
farmacéutica de la presente invención puede contener además
estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes u otros
aditivos conocidos por los expertos en la materia. La formulación
farmacéutica puede administrarse en inyección a embolada,
dosificaciones continuas o intermitentes, o en combinación de
dosificaciones continuas e intermitentes, determinadas por el
medico el grado y/o etapa de la enfermedad del paciente. La duración
de la terapia que utiliza la composición farmacéutica de la
presente invención variará, dependiendo de las características
exclusivas del oligonucleótido y del efecto terapéutico concreto
que deba conseguirse, las limitaciones inherentes en la técnica de
preparación de dicha formulación terapéutica para el tratamiento de
los pacientes humanos, la gravedad de la enfermedad que se está
tratando y el estado y respuesta idiosincrásica potencial de cada
paciente en concreto. Por último el médico adjunto decidirá sobre
la duración apropiada de la terapia intravenosa que utiliza la
composición farmacéutica de la presente invención.
Para determinar el intervalo preclínico de la
actividad anti-VIH de varios oligonucleótidos (véase
Tabla 2), se realizaron evaluaciones con Oligo 12 (que tiene la
SEC. ID nº: 1), Oligo 32 (SEC. ID nº: 3) y Oligo 41 (SEC. ID nº:
6). Estas evaluaciones se realizaron para determinar la actividad de
estos compuestos frente a una variedad de cepas naturales y
resistentes al fármaco de VIH-1, incluyendo tanto
derivados de laboratorio como de baja atenuación, cepas clínicas de
virus y linfocitos T trópicos y virus trópicos macrófagos monocitos
iguales a los relacionados a continuación en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
| Cepa | Tropismo | AZT IC_{50} (\muM) | ddi IC_{50} (\muM) | Sincitio | Crecimiento |
| BAKI | L | 0,049 | 2,61 | SI | R/H |
| SLKA | M | 0,025 | 0,32 | NSI | S/L |
| WEJO | L | 0,056 | 2,18 | SI | R/H |
| ROJO | L | 0,016 | 0,87 | SI | R/H |
| ROMA | M | 0,016 | 0,16 | SI | R/H |
| STDA | L | 0,017 | 0,23 | SI | R/H |
| WOME | L | 0,016 | 0,41 | SI | R/H |
| VIHU | L | 0,016 | 1,21 | NSI | S/L |
| TEKI | L | 0,029 | 0,37 | NSI | S/L |
| TEKI | M | 0,016 | 1,70 | NSI | S/L |
| DEJO | L | 0,015 | ND | NSI | S/L |
| BLCH | L | 0,010 | ND | NSI | S/L |
| RIARL | L | 0,010 | ND | NSI | S/L |
| L - linfocito | |||||
| M - macrófago | |||||
| SI - producción de sincitio | |||||
| NSI - no producción de sincitio | |||||
| R/H - rápido/alto | |||||
| S/L - lento/bajo |
Además, se evaluó la actividad de los compuestos
frente a VIH-2, y se evaluó la toxicidad de Oligo 41
mediante una variedad de procedimientos en células humanas
infectadas y no infectadas, asentadas y frescas.
El experimento inicial realizado implicaba la
evaluación de Oligos 12, 32 y 41 frente a tres cepas de laboratorio
de VIH-1 (IIIB, RF y SKI) y una cepa de
VIH-2 (ROD) en paralelo con el compuesto ddC de
referencia positiva en el ensayo con anti-VIH
basado en XTT. Todos estos oligonucleótidos son activos tanto frente
a VIH-1 como a VIH-2. Se detectó un
aumento del nivel de actividad con estos compuestos cuando se
evaluaban frente a la cepa ROD de VIH-2. Los
resultados representativos se presentan en la Fig. 3.
En otro experimento, la actividad
anti-VIH de Oligos 12, 32 y 41 se evaluó frente a
una variedad de cepas clínicas de VIH-1 poco
atenuadas en células mononucleares de sangre periférica humana
recientes. Estas cepas incluyen los virus extraídos de pacientes
pediátricos que atiende el Children's Hospital University of Alabama
en Birmingham así como los virus representativos de varias clades
de VIH-1 halladas en todo el mundo, mostradas a
continuación en la Tabla 4.
| Virus | Clade | Fenotipo | País |
| 92RWOO9A | A | NSI | Ruanda |
| 92UG029A | A | SI | Uganda |
| 92BR021B | B | SI | Brasil |
| 92TH026B | B | NSI | Tailandia |
| 92BR025C | C | NSI | Brasil |
| 92UG021D | D | SI | Uganda |
| 92UG035D | D | NSI | Uganda |
| 92TH022E | E | NSI | Tailandia |
| 93BR029F | F | NSI | Brasil |
| 93BR020F | F | SI | Brasil |
Además de estas cepas T-trópicas,
se evaluó también la actividad de los compuestos frente a las cepas
monocito-macrófago BaL y ADA. Los Oligos 12 y 32
según la invención, así como el Oligo 41 son activos frente a las
cepas T-trópicas clínicas poco atenuadas de
VIH-1. La actividad de los compuestos varía de una
cepa a otra. Los compuestos no fueron activos frente a las cepas
monocito-macrófago-trópicas BaL y
ADA.
En otros estudios, la actividad
anti-VIH de los Oligos 12, 32 y 41 se evaluó frente
a una variedad de cepas de virus resistentes al fármaco, incluyendo
los virus resistentes a nevirapina (N119), 3TC (M198I), inhibidores
de proteasa (JE105/R y KN1272/R) y AZT
(4\timesAZT-R).
Además, se descubrió que los oligonucleótidos
sintéticos administrados sistémicamente a las hembras murinas
embarazadas atravesaban la placenta y estaban disponibles en la
sangre de los embriones in utero. Por lo tanto, se contempla
que los oligonucleótidos de la invención se utilizaron en
procedimientos destinados al tratamiento de fetos humanos y de
madres infectados con el VIH.
Para determinar si el oligonucleótido se absorbe
en los tejidos corporales, y si es así, en qué tejidos se produce
la absorción, se realizó el siguiente estudio. Se analizó la
radioactividad de muestras de varios tejidos corporales de monos y
ratas tratados en horas crecientes tras la administración
intravenosa u oral de un oligonucleótido específico para VIH
marcado con radioactividad. Se observó que este oligonucleótido se
absorbía a través del aparato digestivo y se acumulaba en varios
órganos y tejidos.
Para evaluar la forma química de radioactividad
en el plasma se utiliza HPLC para demostrar la presencia de ambos
oligonucleótidos íntegros así como los metabolitos varias horas
después de la administración oral. El oligonucleótido íntegro puede
detectarse también en el hígado varias horas después de la
administración. Más pruebas para apoyar la absorción del
oligonucleótido pueden proceder de los análisis de la muestra de
orina después de administrar por vía oral el oligonucleótido
específico para gag marcado con radioactividad. Que el
oligonucleótido continúe excretándose en la orina durante tiempo
después de la administración del oligonucleótido radiomarcado
implica que otros tejidos lo hayan absorbido, y que el cuerpo era
capaz de absorción durante un periodo de tiempo prolongado.
Los resultados de estas evaluaciones indican que
estos oligonucleótidos permanecieron activos contra los virus
resistentes a nevirapina, 3TC y a los inhibidores de proteasa, pero
fueron menos activos contra los virus con mutaciones que comunican
resistencia a AZT. Se detectó un aumento de nivel de actividad
frente a la cepa N119 resistente a nevirapina.
En otro experimento aún, se evaluó la toxicidad
de Oligo 41 en células mononucleares de sangre periférica humana
recientes no infectadas e infectadas con VIH-1,
utilizando una variedad de puntos finales cuantitativos. Se evaluó
la toxicidad utilizando los colorantes de tetrazolio XTT o MTT, azul
de tripano, recuento de células y de viabilidad celular y la
incorporación de timidina tritiada. Se realizaron análisis de dos
replicas. En el primer análisis, se utilizó Oligo 41 a una
concentración de ensayo elevada de 50 \mug/ml y se evaluó la
toxicidad el día 7. No se detectó toxicidad en ninguno de los
puntos finales cuantitativos empleados. Se realizó un segundo
análisis para evaluar más la toxicidad a la concentración de
compuesto mayor y con mayor exposición al compuesto. En este
análisis, empleando una concentración de análisis elevada de 150
\mug/ml y prolongando el tiempo de exposición al fármaco desde 7
días hasta 14 días, una vez más no se detectó toxicidad.
En otra serie de experimentos, se examinó la
biodisponibilidad de Oligo 12 in vivo, se encontró que estaba
biodisponible por vía intravenosa y oral para las ratas y seres
humanos después de una sola dosis. Además, los oligonucleótidos
sintéticos administrados por vía general a hembras murinas preñadas
se observó que atravesaban la placenta y que estaban disponibles en
la sangre de los embriones en el útero. Por este motivo, se
contempla que los oligonucleótidos de la invención pueden
utilizarse en procedimientos de tratamiento de fetos humanos y
madres que albergan VIH.
Los ejemplos siguientes ilustran los modos
preferidos de preparar y poner en práctica la presente invención,
pero no limitan el alcance de la misma ya que pueden utilizarse
procedimientos alternativos para obtener resultados similares.
Se sintetizaron fosforotioatos de oligonucleótido
utilizando un sintetizador de ADN automático (modelo 8700,
Biosearch, Bedford, MA) que utiliza un procedimiento de
fosforoamidita beta-cianoetilo en una escala de 10
micromoles. Para generar los enlaces de fosforotioato, se oxidó el
enlace fosfito intermedio obtenido después de cada acoplamiento
utilizando 3H,
1,2-benzoditiol-3H-ona-1,1-dióxido
(véase Beaucage, en Protocols for Oligonucleotides and Analogs:
Synthesis and Properties, Agrawal (ed.), (1993) Humana Press,
Totowa, NJ, págs. 33-62).
Se sintetizaron oligonucleótidos híbridos de
forma similar, excepto que los segmentos que contienen
2'-O-metilrribonucleótidos se
ensamblaron utilizando fosforoamidita de
2'-O-metilrribonucleósido, seguido
de oxidación a un enlace fosorotioato o fosfodiéster como se
describió anteriormente. La desprotección y purificación de
oligonucleótido se realizó según procedimientos normalizados (véase
Padmapriya et al. (1994) Antisense Res. & Dev.
4:185-199).
La línea celular CEM-SS (Southern
Research Institute-Frederick Research Center,
Frederick, MD) es muy sensible a la infección con VIH, forma
rápidamente sincitio multinucleado y son finalmente destruidos por
VIH. Se mantuvieron las células
(2-7\times10^{5} células por ml) en medio de
cultivo tisular RPMI 1640 enriquecido con suero de ternero fetal al
10%, glutamina y antibióticos y se atenuaron dos veces a la semana a
una dilución 1:20. Se registró el número de atenuaciones cada
semana. Se descartaron las células después de veinte semanas de
atenuaciones y las células CEM-SS recientes se
descongelaron y utilizaron en el análisis. Las soluciones madre de
células CEM-SS se congelaron en nitrógeno líquido en
viales NUNC de 1 ml en suero de ternero fetal al 90% y sulfóxido de
dimetilo al 10% (DMSO). Después de la descongelación, se leyeron de
forma rutinaria las células CEM-SS para ser
utilizadas en el ensayo de identificación primaria después de dos
semanas en cultivo. Antes de sustituir una línea celular de
atenuación tardía, se analizaron las nuevas células
CEM-SS en el protocolo de ensayo de identificación
que utiliza la solución madre actual de virus infeccioso y AZT. Si
la infectividad del virus era significativamente diferente en las
células nuevas o si AZT parecía menos activo que era de esperar las
nuevas células no se introducían en el programa de identificación.
La prueba del micoplasma fue realizada de forma rutinaria en todas
las líneas celulares.
Otras cepas víricas probadas incluían las
siguientes cepas resistentes al fármaco.
Se derivó la cepa N119 in vitro mediante
cultivo de la cepa clínica A018 en presencia del inhibidor no
nucleósido neviparina de la transcriptasa inversa. Esta cepa se
obtuvo a partir de la investigación de NIAID en SIDA y del Programa
del Reactivo de Referencia (catálogo nº 1392). La cepa posee una
mutación en la transcriptasa inversa (Y181C) y se ha encontrado la
cepa por ser sumamente citopática para los linfocitos T tales como
CEM-SS y MT2 (Richman et al. (1991) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:11241). Se seleccionó la cepa 3TC/M1841
in vitro utilizando la cepa de tipo IIIB natural del virus y
la atenuación sucesiva del virus en presencia de aumento de la
concentración del fármaco en las células CEM-SS
(Buckheit Jr. et al. (1996) Antimicrob. Chem.
Chemother. 7:243-252). La cepa JE 105/R se
derivó de la atenuación sucesiva de IIIB en presencia de un
inhibidor de proteasa. Esta cepa posee los cambios de aminoácido
I84V y S37N en la proteasa. La cepa KNI272/R fue derivada de la
atenuación sucesiva de IIIB en presencia del inhibidor de proteasa
KNI 272. La cepa posee tres cambios de aminoácido en la proteasa,
F53L, A71V y T80I. La cepa 4\timesAZT-Ri se obtuvo
por mutagénesis dirigida al sitio por introducción de cuatro
cambios de aminoácido en la transcriptasa inversa del virus
NL4-3 natural. Los cuatro cambios de aminoácido son
D67N, K70R, T215Y y K219Q.
Se prepararon grupos de virus (Southern Research
Institute-Frederick Research Center, Frederick M) y
se valoraron en células CEM-SS, se colocaron en
alícuotas de 5 ml y se congelaron a -135ºC. Tras la descongelación,
se descarta el virus no utilizado para impedir los cambios en el
título infeccioso. Se prepararon grupos de virus por infección
aguda de 5 \times 10^{5} células CEM-SS con VIH
en un volumen de 200 \mul a una multiplicidad de infección
determinada para proporcionar una destrucción celular completa el
día 7 tras la infección (aproximadamente 0,05 para la cepa
III_{B} de VIH-1 y 0,01 para la cepa RF de
VIH-1).
Se dejó continuar la infección durante una hora a
37ºC, tras lo cual las células se transfectaron a un matraz T25 y
el volumen aumentó a 2 ml. El día 1 tras la infección se llevó el
volumen a 5 ml y el día 2 el volumen se aumentó hasta 10 ml.
Comenzando el día 4, se sedimentaron las células, se guardó el
sobrenadante y se volvieron a poner en suspensión las células en
una alícuota de 10 ml reciente de medio de cultivo tisular. El medio
completo se cambia diariamente, en lugar de dejar crecer las
células en el medio durante periodos más prolongados de tiempo, se
deja que el inóculo del virus utilizado en la identificación
primaria permanezca relativamente sin eliminar de nutrientes cuando
se utilice para infectar células. La reacción de tinción utilizada
(XTT, véase procedimiento a continuación) exigía que la
concentración de glucosa permanezca elevada (161). Los pocillos
eliminados de glucosa por crecimiento celular no permitirán la
conversión metabólica del colorante de tetrazolio en el producto
formazán.
Los sobrenadantes exentos de células de las
células infectadas de forma aguda se guardaron los días 4, 5, 6 y
7. Se guardó por separado una alícuota de sobrenadante cada día para
su utilización en la determinación del título. Las determinaciones
del título incluían el ensayo de actividad con transcriptasa inversa
(véase más adelante), la valoración del punto final o el análisis
de cuantificación (CEM-SS) en placas de las
partículas infecciosas (véase más adelante) y la cuantificación de
la cinética de destrucción celular.
Se ha determinado que las concentraciones de
virus infeccioso en el pico se producen en los cultivos infectados
de forma aguda a medida que la viabilidad de las células disminuye
hasta el nivel del 50%. Puesto que el ensayo de identificación
primaria cuantifica los efectos protectores de un compuesto mediante
su capacidad para inhibir los efectos citopáticos inducidos por
VIH, la cantidad de virus requerido para destruir las células
CEM-SS en 6 días se utilizó de manera rutinaria
para determinar la cantidad de virus requerido por pocillo en el
ensayo de identificación primaria. Cada uno de los grupos se valoró
diariamente en el protocolo de ensayo XTT de colorante de
tetrazolio para la identificación primaria (véase más adelante)
realizando diluciones al doble del virus que comienza a una
concentración de ensayo elevada de 50 \mul de virus por pocillo.
Se utilizó el procedimiento de tinción con XTT para determinar la
cantidad exacta de virus requerido para destruir todas las células
CEM-SS en cada pocillo y esta cantidad mínima de
virus se utilizó para realizar todo el ensayo primario. Se
utilizaron dichos procedimientos para preparar todas las cepas de
virus utilizadas, incluyendo las cepas derivadas en laboratorio de
VIH-1, VIH-2 y SIV. Las cepas
clínicas utilizadas se atenuaron en células humanas recientes. Los
procedimientos para el cultivo de estas células y la producción de
grupos de virus se describen a continuación.
Se atenuaron en matraces T-150
células CEM-SS (programa de investigación del SIDA y
de reactivo de referencia, NIH) u otras líneas de linfocitos T
humanos creados utilizadas en estos experimentos para su utilización
en el ensayo. El día anterior al ensayo, se dividieron las células
1:2 para asegurar que estarían en una fase de crecimiento
exponencial en el momento de la infección. El día del ensayo se
lavaron las células dos veces con medio de cultivo tisular y se
volvieron a poner en suspensión en medio de cultivo tisular fresco.
Se realizó el recuento de las células totales y de la viabilidad
utilizando un hematocitómetro y colorante de exclusión
tripano-azul. La viabilidad de las células fue mayor
del 95% para las células que se deben utilizar en el ensayo. Se
sedimentaron las células y se volvieron a poner en suspensión en 2,5
\times 10^{4} células por ml en medio de cultivo tisular. Se
añadieron las células a las placas que contenían el fármaco en un
volumen de 50 \mul.
Se extrajo del congelador a -80ºC una alícuota
prevalorada de virus y se dejó descongelar lentamente a temperatura
ambiente en una cabina de seguridad biológica. El virus se volvió a
poner en suspensión y se diluyó en medio de cultivo tisular de modo
que la cantidad de virus añadida a cada pocillo en un volumen de 50
\mul fuese la cantidad determinada para proporcionar una
destrucción celular completa a los 6 días después de la infección.
En general los grupos de virus producidos con la cepa IIIB de VIH
requirieron la adición de 5 \mul de virus por pocillo. Los grupos
de virus RF fueron de cinco a diez veces más potentes, requiriendo
0,5 a 1 \mul por pocillo. El cálculo de TCID_{50} mediante
valoración del punto final en las células CEM-SS
indicó que la multiplicidad de infección de estos análisis oscilaba
entre 0,005 y 2,5.
Cada placa contenía pocillos de referencia con
células (células únicamente), pocillos de referencia de virus
(células más virus), pocillos de referencia de toxicidad del fármaco
(células más fármaco únicamente), pocillos de referencia
colorimétrica del fármaco (fármaco únicamente) así como pocillos
experimentales (fármaco más células más virus).
Después de 6 días de incubación a 37ºC en una
incubadora con CO_{2} al 5%, se analizaron las placas de ensayo
mediante tinción con el colorante de tetrazolio XTT. El
tetrazolio-XTT es metabolizado por las enzimas
mitocondriales de células metabólicamente activas hasta un producto
soluble de formazán, permitiendo el análisis cuantitativo rápido de
la inhibición de la destrucción de las células provocada por VIH por
sustancias de ensayo anti-VIH. El día 6 después de
la infección se extrajeron las placas del incubador y se observaron.
La utilización de placas de valoración de fondo redondo permite el
análisis macroscópico rápido de la actividad de un compuesto de
ensayo dado mediante la evaluación de las dimensiones del sedimento.
Los resultados de las observaciones macroscópicas se confirmaron y
aumentaron mediante análisis microscópico adicional.
La solución XTT se preparó a diario como una
solución madre de 1 mg/ml en PBS. Se preparó la solución de
metosulfato de fenazina (PMS) en 15 mg/ml en PBS y se almacenó a la
oscuridad a -20ºC. Se preparó la solución madre de
XTT-PMS inmediatamente antes de su utilización
diluyendo la PMS 1:100 en PBS y añadiendo 40 \mul por ml de
solución de XTT. Se añadieron cincuenta microlitros de XTT/PMS a
cada pocillo de la placa y se incubó la placa durante 4 horas
adicionales a 37ºC. Se utilizaron selladores de placa adherentes en
lugar de las tapas, se invirtió la placa sellada varias veces para
mezclar el producto soluble formazán y se leyó la placa por
espectrofotometría a A450 nm con un lector de placas Vmax de
Molecular Devices. Utilizando un programa de ordenador personal se
calcularon el % de reducción del CPE (efecto citopático), el % de
viabilidad celular, IC_{25, \ 50 \ y \ 95}, TC_{25, \ 50 \ y \
95} y otros índices y se presentó el resumen de resultados
gráficos.
Se utilizó una reacción de transcriptasa inversa
(RT) basado en microvaloración (Buckheit et al. (1991) AIDS
Research and Human Retroviruses 7:295-302).
Se volvió a poner en suspensión el trifosfato de timidina tritiado
(NEN) (TTP) en H_{2}O destilada a 5 Ci/ml. Se prepararon poli rA y
oligo dT como solución madre que se mantuvo a -20ºC. El tampón de
reacción RT se preparó reciente diariamente y consiste en 125 \mul
de EGTA 1 M, 125 \mul de dH_{2}O, 125 \mul de Triton
X-100, 50 \mul de Tris 1 M (pH 7,4), 50 \mul de
DTT 1 M y 40 \mul de MgCl_{2} 1 M. Estas tres soluciones se
mezclaron en una proporción de una parte de agua destilada. Se
colocaron diez microlitros de esta reacción en una placa de
microvaloración de fondo redondo y se añadieron 15 \mul de virus
que contenían sobrenadante y se mezcló. Se incubó la placa a 37ºC
durante 60 minutos. Tras la reacción, se transfirió el volumen de
reacción en almohadillas filtrantes, se lavó 6 veces durante 5
minutos cada una en un tampón de fosfato de sodio al 5%, dos veces
durante 1 minuto cada una en agua destilada, dos veces durante 1
minuto cada una en etanol al 70% y a continuación se secó. La
almohadilla filtrante seca se colocó en una bolsita de plástico de
muestra, se añadió fluido de centelleo Betaplate y la bolsa se selló
térmicamente. Se cuantificó la radioactividad incorporada utilizando
un contador de centelleo Microbeta de Wallac (Gaithersburg, MD).
Los kits ELISA se adquirieron en Coulter (Miami,
FL). El ensayo se realizó según las recomendaciones del fabricante.
Antes de los análisis ELISA se realizaron de forma rutinaria los
ensayos de actividad con transcriptasa inversa (descritos
anteriormente) y se utilizaron los valores para la radioactividad
incorporada en el ensayo de actividad de RT para determinar la
dilución que requieren las muestras para el ELISA. Se construyeron
curvas patrón de modo que las diluciones de virus que deben
utilizarse en el ELISA p24 pudieran determinarse exactamente a
partir del ensayo de actividad de RT. Se generaron curvas de
referencia en cada ensayo para cuantificar exactamente la cantidad
de proteína de cápsido en cada muestra. Los datos fueron obtenidos
por análisis espectrofotométrico a 450 nm utilizando un lector de
placas. Se calcularon las concentraciones en Vmax P24 de Molecular
Devices (Sunnydale, CA) a partir de los valores de densidad óptica
mediante la utilización del paquete informático Soft Max de
Molecular Devices (San José, CA).
Se analizaron cualitativamente las partículas
infecciosas de virus utilizando el análisis en placa de
CEM-SS según describe Nara et al.
(Nature (1988) 332:469-470). Se revistieron
las placas de microvaloración de 96 pocillos con fondo plano con 50
\mul de poli-L-lisina (Sigma. St.
Louis, MO) a 50 \mug/ml durante 2 horas a 37ºC. Se lavaron a
continuación los pocillos con PBS y se colocaron 2,5 \times
10^{5} células CEM-SS en el pocillo de
microvaloración donde se fijaron al fondo de la placa. Se añadieron
células suficientes para formar una monacapa de células
CEM-SS en cada pocillo. Se añadió sobrenadante que
contiene virus en cada pocillo de la placa XTT, incluyendo las
referencias de virus y células y cada dilución en serie de la
sustancia de prueba. Se determinó cualitativamente el número de
sincitios en la placa de microvaloración de 96 pocillos de fondo
plano con un microscopio invertido Olympus CK2 a los 4 días después
de la infección. Cada sincitio procedía de un único virión
infeccioso de VIH.
Se aislaron linfocitos humanos frescos de la
sangre periférica (PBL) en donantes voluntarios de la Cruz Roja,
seronegativos para VIH y VHB. Se diluyó 1:1 sangre leucoforizada con
solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS), se
estratificó sobre 14 ml de gradiente de densidad de
Ficoll-Hypaque en un tubo de centrifugadora de 50
ml. Se centrifugaron a continuación los tubos durante 30 minutos a
600 \times g. Los PBL estratificados se aspiraron suavemente en
la interfase resultante y se lavaron 2\times sucesivamente con PBS
mediante centrifugación a baja velocidad. Tras el lavado final, se
contaron las células por exclusión con tripano azul y se volvieron
a poner en suspensión en
1 \times 10^{-}/ml en RPMI 1640 con suero bovino fetal (FBS) al 15%, L-glutamina 2 mM, 4 mg/ml de PHA-P y se dejó incubar durante 48 a 72 horas a 37ºC. Tras la incubación, se centrifugaron los PBL y se volvieron a colocar en RPMI 1640 con FBS al 15%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 10 \mug/ml de gentamicina y 20 U/ml de IL-2 recombinante humano. Los PBL se mantuvieron en este medio a una concentración de 1-2 \times 10^{6}/ml con cambios de medio quincenales, hasta su utilización en el protocolo del ensayo.
1 \times 10^{-}/ml en RPMI 1640 con suero bovino fetal (FBS) al 15%, L-glutamina 2 mM, 4 mg/ml de PHA-P y se dejó incubar durante 48 a 72 horas a 37ºC. Tras la incubación, se centrifugaron los PBL y se volvieron a colocar en RPMI 1640 con FBS al 15%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 10 \mug/ml de gentamicina y 20 U/ml de IL-2 recombinante humano. Los PBL se mantuvieron en este medio a una concentración de 1-2 \times 10^{6}/ml con cambios de medio quincenales, hasta su utilización en el protocolo del ensayo.
Para el ensayo de PBL, se agruparon las células
estimuladas con PHA-P procedentes de por lo menos
dos donantes normales, se pusieron en medio reciente a 2 \times
10^{6}/ml y se colocaron en placas en los pocillos interiores de
una microplaca de 96 pocillos con fondo redondo a 50 \mul/pocillo.
Se prepararon diluciones de fármaco de ensayo a una concentración
2\times en tubos de microvaloración y se colocaron 100 \mul de
cada concentración en pocillos apropiados en un formato normal. En
cada pocillo de ensayo se colocaron cincuenta microlitros de una
dilución predeterminada de solución madre de virus. Los pocillos con
células y virus solos se utilizaron para virus de referencia. Las
placas independientes se colocaron idénticamente sin virus para
estudios de citotoxicidad del fármaco utilizando un sistema de
ensayo con XTT.
En el ensayo patrón de PBL (MOI:0,2), se acabó el
ensayo el día 7 después de la recogida de las muestras de
sobrenadante exentas de células para el ensayo de actividad con
transcriptasa inversa. En el ensayo de PBL de MOI baja (MOI:0,02),
las muestras de sobrenadante se recogieron los días 6, 11 y 14 tras
la infección y se analizó la actividad por RT. Se volvió a poner en
suspensión el trifosfato de timidina tritiado (NEN) (TTP) en
H_{2}O destilada a 5 Ci/ml. Se prepararon poli rA y oligo dT como
solución patrón que se mantuvo a -20ºC. Se preparó reciente el
tampón de reacción de RT diariamente y consiste en 125 \mul de DTT
1 M y 40 \mul de MgCl_{2} 1 M. Estas tres soluciones se
mezclaron en una proporción de 2 partes de TTP, 1 parte de poli
rA:oligo dT y 1 parte de tampón de reacción. Se colocaron 10
microlitros de esta mezcla de reacción en una placa de
microvaloración de fondo redondo y se añadieron y se mezclaron 15
\mul del sobrenadante que contiene el virus. Se incubó la placa a
37ºC en un baño de agua con un soporte sólido para evitar la
inmersión de la placa y se incubó durante 60 minutos. Después de la
reacción, se transfirió el volumen de reacción a piezas de papel
DE81, se lavó 5 veces durante 5 minutos cada una en un tampón de
fosfato de sodio al 5%, 2 veces durante 1 minuto cada una en agua
destilada, 2 veces durante 1 minuto cada una en etanol al 70% y a
continuación se secó. Se añadió Opti-Fluor O a cada
muestra y se cuantificó la radioactividad incorporada utilizando un
contador de centelleo líquido (Wallac 1450 Microbetaplus,
Gaithersburg, MD).
Se midió la incorporación de timidina tritiada en
cultivos en paralelo el día 7. Se pulsó cada pocillo con 1 \muCi
de timidina tritiada y se recogieron las células 18 horas después
con un recogedor de células Skatron en papeles de filtro de fibra
de vidrio. Se secaron los filtros, se colocaron en un vial de
centelleo con 1 ml de mezcla de centelleo y la radioactividad
incorporada se cuantificó en un contador de centelleo líquido (p.
ej., Packard Tri-Carb 1900 TR450).
Para el aislamiento de las células adhesivas, se
volvieron a poner en suspensión 3 \times 10^{6} células de
sangre periférica no estimuladas por PHA en solución salina
tamponada de Hanks (con calcio y magnesio) enriquecida con suero AB
humano al 10%. Las células se colocaron en una placa de
microvaloración de 24 pocillos a 37ºC durante 2 horas. Se
eliminaron las células no adherentes lavando a fondo seis veces. Se
cultivaron las células adherentes durante 7 días en medio de
cultivo tisular RPMI 1640 con suero bovino fetal al 15%. Los
cultivos se controlaron con cuidado para confluencia durante este
periodo de incubación. Se realizó la infección de las células con
las cepas BaL o ADA de VIH-1 monocitotrópico y el
par emparejado de cepas de virus sensible a AZT y resistente a AZT.
Cada una de estas cepas de virus se obtuvo en el programa de
investigación de SIDA y de reactivo de referencia NIAID. Los grupos
con título elevado de cada uno de estos virus ha sido recogido de
los cultivos infectados de células adherentes de la sangre
periférica y congelado en alícuotas de 1,0 ml a -80ºC. Se
infectaron monocapas de monocito-macrófago a una MOI
de 0,1. Los compuestos que han de evaluarse en el ensayo de
monocito-macrófago se añadieron a las monocapas
brevemente antes de la infección para maximizar el potencial para
identificación de compuestos activos.
2 días después de la infección, se decantó el
medio y se lavaron dos veces los cultivos con medio completo para
eliminar el exceso de virus. Se añadió medio reciente solo o medio
que contenía las concentraciones de fármacos apropiadas y se
continuó la incubación durante 5 días más. Se realizaron ensayos de
exclusión con XTT-tetrazolio o azul de tripano
(para la viabilidad celular) y análisis ELISA con p24 de VIH (para
la producción de antígeno con núcleo de p24) el día 7 después de la
infección. Se adquirieron kits de ELISA en Coulter. Se realizó el
ensayo según las recomendaciones del fabricante. Se generaron curvas
de referencia en cada ensayo para cuantificar exactamente la
cantidad de proteína con cápsido en cada muestra. Se obtuvieron los
datos por análisis espectrofotométrico a 450 nm usando un lector de
placas (Vmax de Molecular Devices). Se calcularon las
concentraciones de p24 a partir de los valores de densidad óptica
mediante la utilización del paquete informático de Molecular
Device.
Se realizaron experimentos de infección basados
en CPE utilizando células MT-4 (Pauwels et
al. (1988) J. Virol. Meth. 20:309, Papp et al.
(1997) AIDS Research and Human Retroviruses In Press). Se
adquirieron células MT-4 en el Banco de
investigación del SIDA y de reactivo de referencia, división de
SIDA, NIAID, el Dr. Richman contribuyó con NIH (Pauwels et
al. (1988) J. Virol. Meth. 20:309). Se adquirieron
células H9 T-linfoides (HUT-78) al
Dr. Robert Gallo, National Cancer Institute, Bethesda, MD (Popovic
et al., (1984) Science 224:497; Gazdar et al.
(1980) Blood 55 :409). Se mantuvieron los cultivos celulares
en medio RPMI 1640 (laboratorios GIBCO, Grand Island, NY)
enriquecido con (células H9) al 20% o suero bovino fetal inactivado
térmicamente (células MT-4) al 10% (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO) 250 unidades/ml de penicilina, 250 \mug/ml de
estreptomicina, 1-glutamina 2 mM y tampón HEPES 10
mM (ácido
N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico)
(medio completo) a 37ºC en CO_{2} al 5%. IIB de
VIH-1 se obtuvo originariamente en Dr. Robert Gallo,
National Cancer Institute (Popovic (1984) Science 224:497).
Se prepararon soluciones madre de virus de VIH-1
procedente del sobrenadante exento de células filtrado de cultivos
de H9 infectados crónicamente por el procedimiento de agitación
descrito anteriormente por Vujoie et al. (J. Infectious
Diseases (1988) 157:1047).
Se realizaron experimentos bajo dos series de
condiciones. Se prepararon diluciones de oligonucleótidos híbridos
según la invención con la SEC. ID nº: 1 en placas de 96 pocillos y
se realizaron infecciones en presencia de inhibidores, añadiendo
células MT-4 y una concentración de
TCID_{CPE-90%} de VIH_{-HHE} directamente a los
pocillos o infectando células MT-4 durante 4 horas a
37ºC en ausencia de inhibidores, lavando para eliminar el virus no
absorbido, a continuación añadiendo las células infectadas a los
pocillos que contienen inhibidores. El cultivo se incubó durante 6
días y se midió la CPE utilizando el procedimiento del colorante
MTT. (Rapid, (1983) J. Immunolog. Meth. 65:55).
Los resultados demuestran que un oligonucleótido
de la invención inhibe la infección por VIH-1 cuando
se añade a las células durante la infección vírica (Fig. 1) o la
adsorción posvírica (Fig. 2).
En el estudio se utilizan ratas
Sprague-Dawley macho (100 a 200 g, Harlan
Laboratories, Indianapolis, IN) y ratones CD-/F2 macho (25 \pm 3
g, Charles River Laboratory, Wilmington, MA). Los animales se
alimentan con dieta comercial y agua a voluntad durante 1 semana
antes del estudio.
Se disuelven los oligonucleótidos no marcados y
marcados con ^{35}S en solución salina fisiológica (NaCl al 0,9%)
a una concentración de 25 mg/ml y se administran a los animales en
ayunas mediante sonda nasogástrica a la dosis diseñada (30 a 50
mg/kg para ratas y 10 mg/kg para ratones). Las dosis están basadas
en el peso corporal del pretratamiento y redondeadas al 0,01 ml más
próximo. Después de la dosificación se coloca cada animal en una
jaula de metabolismo y se alimentan con dieta comercial y agua a
discreción. Se recoge la orina evacuada total y a continuación se
lava cada jaula de metabolismo siguiendo los intervalos de
recogidas. Se recogen las heces totales excretadas de cada animal
en varios puntos de tiempo y se homogenizan las muestras de heces
antes de la cuantificación de radioactividad. Se recogen muestras de
sangre de los animales en tubos heparinizados en varios puntos de
tiempo. Se separa el plasma por centrifugación. Se practica la
eutanasia a los animales por extracción de sangre bajo anestesia de
pentobarbital sódico en varios momentos (es decir, 1, 3, 6, 12, 24
y 48 h; 3 animales/punto de tiempo). Después de la eutanasia, se
recogen los tejidos de cada animal. A todos los tejidos/órganos se
les quita la grasa extraña o el tejido conectivo, se vacían y se
limpian de todos los contenidos, se pesan individualmente y se
registran los pesos.
Para cuantificar la absorción total del
oligonucleótido híbrido, se tratan dos grupos más de animales
(3/grupo) para cada oligonucleótido de ensayo utilizando el mismo
procedimiento que anteriormente. Se sacrifican los animales 6 ó 12
h después de la dosificación y se extrae a continuación el tubo
digestivo. Se determinan por separado las radioactividades en el
tubo digestivo, heces, orina, plasma y el resto del cuerpo. Se
determina también la recuperación total de radioactividad que es 95
\pm 6%. Se determina el porcentaje de radioactividad absorbida
procedente del oligonucleótido híbrido mediante el cálculo
siguiente: (radioactividad total en el resto del cuerpo +
radioactividad total en la orina) \div (radioactividad total en el
tubo digestivo, heces, orina, plasma y el resto del cuerpo).
Para obtener el oligonucleótido marcado con
^{35}S, se realiza la síntesis en dos etapas. Se montan los
primeros nucleótidos de la secuencia de oligonucleótidos de su
terminal en 3' utilizando el procedimiento de
\beta-cianoetil-fosforamidita
(véase, Beaucage en Protocols for Oligonucleotides and
Analogs (Agrawal, ed.), Humana Press, (1993), págs.
33-61). Se ensamblan los últimos nucleótidos
utilizando el procedimiento de H-fosfonato (véase,
Froehler en Protocols for Oligonucleotides and Analogs
(Agrawal, ed.) Humana Press, 1993, págs. 63-80). El
oligonucleótido unido al soporte de vidrio poroso controlado (CPG)
(30 mg de CPG; aproximadamente 1 \muM) que contiene cinco enlaces
de H-fosfonato se oxida con ^{35}S_{8} (4 mCi, 1
Ci/mg, Amersham; 1 Ci = 37 GBq) en 60 ml de disulfuro de carbono,
piridina, trietilamina (10:10:1). La reacción de oxidación se
realiza a temperatura ambiente durante 1 h con agitación ocasional.
A continuación se añade cada 30 min 2 \mul, 5 \mul y 200 \mul
de azufre (^{32}S_{3}) frío al 5% en la misma mezcla disolvente
para completar la oxidación. Se elimina la solución y se lava el
soporte de CPG con disulfuro de carbono/piridina/trietilamina
(10:10:1) (3 \times 500 \mul) y con acetonitrilo (3 \times
700 \mul). Se desprotege el producto en hidróxido de amonio
concentrado (55ºC, 14 h) y se evapora. El producto resultante se
purifica por electroforesis en gel de poliacrilamida
(poliacrilamida al 20% que contiene urea 7 M). La banda deseada se
escinde bajo oscurecimiento al UV y se extrajo el
PS-oligonucleótido del gel y se desaló con el
cartucho Sep-Pak C18 (Waters) y columna
G-15 de Sephadex.
Se determinan las radioactividades totales en los
tejidos y en los fluidos corporales por espectrometría de centelleo
líquida (LS 6000TA, Beckman, Irvine, CA). En resumen, se mezclan los
fluidos biológicos (plasma, 50 a 100 \mul; orina, 50 a 100
\mul) con 6 ml de disolvente de centelleo
(Budget-Solve, RPI, Mt. Prospect, IL) para
determinar la radioactividad total. Se muelen las heces y se pesan
antes de ser homogeneizadas en un volumen de 9 veces de solución
salina de NaCl al 0,9%. Se mezcla una alícuota del homogeneizado
(100 \mul) con solubilizante (TS-2, RPI, Mt.
Prospect, IL) y a continuación con disolvente de centelleo (6 ml)
para permitir la cuantificación de la radioactividad total.
Después de su eliminación, se transfieren los
tejidos inmediatamente a papel de filtro Whatman nº 1 y se pesan
antes de homogeneizarse en solución salina de NaCl al 0,9% (3 a 5 ml
por gramo de peso húmedo). Se mezcla el homogeneizado resultante
(100 \mul) con solubilizante (TS-2, RPI, Mt.
Prospect, IL) y a continuación con disolvente de centelleo (6 ml)
para determinar la radioactividad total. Se registra el volumen de
solución salina de NaCl al 0,9% añadido a cada muestra de tejido.
Los tejidos/órganos homogeneizados se mantienen congelados a
\leq-70ºC hasta su utilización en análisis
posteriores.
Se analiza la radioactividad en la orina por HPLC
de iones emparejados utilizando una modificación del procedimiento
descrito esencialmente por Sands et al. (Mol. Pharm.
(1994) 45:932-943). Se centrifugan las muestras de
orina y se pasan a través de un filtro Acro de 0,2 \mum (Gelman,
Ann Arbor, MI) antes del análisis. Se extraen el oligonucleótido
híbrido y los metabolitos en muestras de plasma utilizando los
procedimientos anteriores en la preparación de la muestra para
PAGE. Se emplea una columna MV-C4 de Microsorb
(Rainin Instruments, Woburn, MA) en HPLC utilizando un HPLC 1050 de
Hewlett Packard con una bomba cuaternaria para la preparación del
gradiente. La fase móvil comprende dos tampones; el tampón A era el
reactivo A 5 mM (Waters Co., Bedford, MA) en agua y el tampón B es
4:1 (v/v) acetonitrilo (Fisher)/agua. Se eluye la columna a un
caudal de 1,5 ml/min utilizando el gradiente siguiente: (1) 0 a 4
min, tampón B al 0%; (2) 4 a 15 min con tampón B de 0 a 35%; y (3)
15 a 70 min con tampón B del 35 al 80%. Se equilibra la columna con
tampón A durante por lo menos 30 min antes de la serie siguiente.
Utilizando un colector de fracciones RediFrac (Pharmacia LKB
Biotechnology, Piscataway, NJ), se recogen las fracciones de 1 min
(1,5 ml) en viales de centelleo de 7 ml y se mezclan con 5 ml de
disolvente de centelleo para determinar la radioactividad en cada
fracción.
Se realiza la electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE) de oligonucleótidos y sus metabolitos por
procedimientos conocidos y demostrados. Se incuban homogeneizados
de plasma y tejido con proteinasa K (2 mg/ml) en tampón de
extracción (SDS al 0,5%/NaCl 10 mM/Tris HCl 20 mM, pH 7,6/EDTA 10
mM) durante 1 h a 60ºC. Se extraen a continuación las muestras dos
veces con fenol/cloroformo (1:1, v/v) y una vez con cloroformo.
Después de la precipitación con etanol, se analizan los extractos
por electroforesis en geles de poliacrilamida al 20% que contienen
urea 7 M. Se filtran las muestras de orina, se desalan y a
continuación se analizan por PAGE. Se fijan los geles en ácido
acético al 10%/solución de metanol al 10% y a continuación se secan
antes de la autorradiografía.
<110> HYBRIDON, INC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVOS OLIGONUCLEÓTIDOS ESPECÍFICOS
DE VIH Y PROCEDIMIENTOS PARA SU UTILIZACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> hyz069pct
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US98/16345
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1998-08-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN/ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipucgcacccat ctctctccuu c
\hfill21
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<210> 2
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Virus de inmunodeficiencia humana
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<210> 3
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<212> ADN/ARN
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<213> Virus de inmunodeficiencia humana
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<210> 4
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<213> Virus de inmunodeficiencia humana
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\hfill21
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<210> 5
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\hskip-.1em\dddseqskiptcgcacccat ctctctcctt c
\hfill21
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Claims (13)
1. Oligonucleótido sintético que presenta una
secuencia de nucleótidos específicamente complementaria a los
nucleótidos 324 a 345 de una zona gag conservada del genoma
del VIH-1 publicada como SEC. ID. nº: 5, estando
constituido el oligonucleótido por 21 nucleótidos que están unidos
mediante enlaces internucleótido de fosforotioato,
en el que los nucleótidos comprenden por lo menos
dos ribonucleótidos con terminal 5' o por lo menos dos con terminal
3' y por lo menos dos ribonucleótidos con terminal 5',
en el que los ribonucleótidos son ribonucleótidos
sustituidos en 2', y
en el que los ribonucleótidos son
2'-O-metil ribonucleótidos.
2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, en
el que los nucleótidos están constituidos esencialmente por cuatro
ribonucleótidos con terminal 3' y cuatro ribonucleótidos con
terminal 5', que flanquean 13 desoxinucleótidos y en el que los
ribonucleótidos son 2'-O-metil
ribonucleótidos.
3. Oligonucleótido según la reivindicación 1, que
presenta la SEC. ID. nº: 1 o la SEC. ID. nº: 3.
4. Oligonucleótido según la reivindicación 2, que
presenta la SEC. ID. nº: 1 o la SEC. ID. nº: 3.
5. Oligonucleótido según la reivindicación 1 que
inhibe la infección por VIH-1 o
VIH-2 en una célula o presenta actividad antivírica
contra VIH-1 y VIH-2.
6. Utilización de un oligonucleótido sintético
para la preparación de una composición farmacéutica destinada al
tratamiento de una infección por VIH-1 p
VIH-2, siendo el oligonucleótido especialmente
complementario a los nucleótidos 324 a 345 de una zona gag
conservada del genoma de VIH-1 publicado como SEC.
ID. nº: 5 y que está constituida por 21 nucleótidos que están unidos
por enlaces internucleótidos de fosforotioato,
en la que los nucleótidos del oligonucleótido
comprenden por lo menos dos ribonucleótidos con terminal 5' o por lo
menos dos con terminal 3' y por lo menos dos ribonucleótidos con
terminal 5',
en la que los ribonucleótidos del oligonucleótido
son ribonucleótidos sustituidos en 2', y en la que los
ribonucleótidos del oligonucleótido son
2'-O-metil ribonucleótidos.
7. Utilización según la reivindicación 6, en la
que los nucleótidos del oligonucleótido están constituidos
esencialmente de cuatro ribonucleótidos con terminal 3' y cuatro
ribonucleótidos con terminal 5', que flanquean a 13
desoxinucleótidos, en la que los ribonucleótidos del oligonucleótido
son 2'-O-metil ribonucleótidos.
8. Utilización según la reivindicación 6, en la
que el oligonucleótido presenta la SEC. ID. nº: 1 o la SEC. ID. nº:
3.
9. Utilización según la reivindicación 7, en la
que el oligonucleótido presenta la SEC. ID. nº: 1 o la SEC. ID. nº:
3.
10. Utilización según la reivindicación 6, en la
que el oligonucleótido debe administrarse por vía oral o
intravenosa.
11. Formulación farmacéutica que comprende el
oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un
portador farmacéuticamente aceptable.
12. Procedimiento para la inhibición de la
infección por VIH-1 o VIH-2 en una
célula in vitro que comprende la etapa de poner en contacto
la célula con el oligonucleótido sintético según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5.
13. Utilización del oligonucleótido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de una
composición farmacéutica destinada a introducir un oligonucleótido
intacto en un mamífero por administración oral,
de manera que el oligonucleótido está presente en
forma intacta en el plasma sistémico tras la administración
oral.
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