ES2256031T3 - Copolimeros de bloque cationicos. - Google Patents

Copolimeros de bloque cationicos.

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ES2256031T3 ES00956162T ES00956162T ES2256031T3 ES 2256031 T3 ES2256031 T3 ES 2256031T3 ES 00956162 T ES00956162 T ES 00956162T ES 00956162 T ES00956162 T ES 00956162T ES 2256031 T3 ES2256031 T3 ES 2256031T3
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Thomas Kissel
Holger Petersen
Dagmar Fischer
Klaus Kunath
Anke Von Harpe
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Abstract

Compuesto de fórmula I o II en el que A representa un polímero hidrófilo no iónico, lineal o ramificado con un peso molecular de 100 a 10.000.000 g/mol; B representa una polietilenimina (PEI) lineal o ramificada con un peso molecular de 100 a 1.000.000 g/mol; X representa un enlace directo de los bloques A y B o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI: -OC(O)NH(CH2)oNHC(O)- con o = 1 a 20, -OC(O)NH(aril)NHC(O)- con arilo = unidad aromática, -O(CH2)pC(O)- con p = 1 a 10, OC(O)-o O(CH2)q-con q = 1 a 20; n representa un número entero de 1 a 200; C representa una PEI lineal o ramificada con un peso molecular de 100 a 1.000.000 g/mol; D un resto de un polietilenglicol unido por O de fórmula -(CH2CH2O)n'' - R1 en el que n¿ es = 3 a 25.000 y R1 es hidrógeno, un resto alifático u otro grupo protector de OH o un ligando celular; Y representa un enlace directo de los bloques C y D o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI: -C(O)NH(aril)NHC(O)O- con arilo = unidad aromática, -(CH2)tC(O)O- con t = 2 a 10, CH2CH(OH)CH2O-0 (CH2)uO-con u = 1 a 20; y m representa un número entero de 1 a 200, con la condición de que los restos y las variables en la fórmula II estén definidos de tal manera que ningún compuesto de fórmula I esté comprendido por éstos.

Description

Copolímeros de bloque catiónicos.
Del documento WO98/59064 se conocen copolímeros de bloque de PEI-PEG y su uso como vehículo para el transporte de ácido nucleico en células eucariotas superiores. El copolímero descrito se sintetizó de PEI ramificada y PEG lineal. Para el acoplamiento con PEG de la PEI se usó PEG de propionato de metoxi-succinimidilo.
S. V. Vinogradov, T. K. Bronich y A. V. Kabanov (Bioconjugate Chem. 1998, 9, 805-812) describen la preparación de copolímeros de bloque de PEI-PEG y poliespermina-PEG mediante el uso de PEI ramificada y poliespermina ramificada mediante reacción de acoplamiento con un monometoxi-PEG activado con 1,1'-carbonildiimidazol. Los copolímeros se usaron para la complejación con oligonucleótidos.
En L. M. Bronstein, M. Antonietti, y col. (inorganica Chimica Acta 1998, 280, 348-354) se describen copolímeros de bloque de PEI-PEG y su fabricación mediante acoplamiento de PEI ramificada con monometoxi-PEG, que dispone de una función de cloruro de ácido terminal, y su uso para la preparación de coloides metálicos.
V. Toncheva y col. (Biochimica et Biophysika Acta 1998, 138, 354-358) se refiere a copolímeros de bloque compuestos por poli(L-lisina) y varios polímeros hidrófilos, como PEG, dextrano y poli(N-(2-hidroxipropil)metacrilamida, procedimiento para su fabricación y su uso como vehículo para la transferencia génica de ácido nucleico.
Estos copolímeros de bloque conocidos tienen en común los siguientes tres puntos:
1. El polímero catiónico está provisto con brazos laterales de un polímero hidrófilo no iónico.
2. En todos los casos, el extremo reactivo del polímero hidrófilo no iónico se activó adicionalmente para la reacción de acoplamiento con el polímero catiónico mediante un reactivo que representa un miembro de puente entre los bloques en el copolímero producido.
3. El polímero hidrófilo no iónico era en todos los casos un polímero lineal.
Además, del documento US-A5204196 se conocen polímeros que contienen una espina dorsal de PEI a la que está unida un éter de polietilenglicol de fórmula -O(CH_{2}-CH_{2})_{n}-CH_{3} mediante un isocianato. Estos polímeros se usan en combinación con sales inorgánicas como conductor eléctrico permanente.
Se encontraron nuevos copolímeros de bloque catiónicos de fórmula general I y II
(I)A(-X-B)_{n}
(II)C(-Y-D)_{m}
en los que
A
representa un polímero hidrófilo no iónico, lineal o ramificado con un peso molecular de 100 a 10.000.000 g/mol, preferiblemente de 1.000 a 100.000 g/mol y especialmente de 5.000 a 50.000 g/mol;
B
representa una polietilenimina (PEI) lineal o ramificada con un peso molecular de 100 a 1.000.000 g/mol, preferiblemente de 400 a 100.000 g/mol y especialmente de 400 a 50.000 g/mol;
X
representa un enlace directo de los bloques A y B o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
\quad
-OC(O)NH(CH_{2})_{o}NHC(O)- con o = 1 a 20, preferiblemente 2 a 10, especialmente 4 a 6,
\quad
-OC(O)NH(aril)NHC(O)- con arilo = unidad aromática con preferiblemente 6-14 átomos de C compuesta por uno o varios núcleos aromáticos que están unidos entre sí en forma condensada o polifenílica, preferiblemente con un núcleo, especialmente toluil-, -O(CH_{2})_{p}C(O)- con p = 1 a 10, preferiblemente 1 a 3, especialmente 1,
\quad
-OCH_{2}CH(OH)CH_{2}-,
\quad
-OC(O)- o
\quad
-O(CH_{2})_{q}- con q = 1 a 20, preferiblemente 1 a 6, especialmente 1 a 3;
\newpage
n
representa un número entero de
\quad
1) 1 a 200, preferiblemente,
\quad
2) 1 a 50,
\quad
3) 1 a 12,
\quad
4) 1 a 8 o con especial preferencia,
\quad
5) 2 a 8;
C
representa una PEI lineal o ramificada con un peso molecular de 100 a 1.000.000 g/mol, preferiblemente de 400 a 100.000 g/mol y especialmente de 400 a 50.000 g/mol;
D
representa un resto de un polietilenglicol unido por O de fórmula
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-R^{1}
\quad
en el que n' es = 3 a 25.000, preferiblemente 10 a 5.000 y especialmente 10 a 1.000 y R^{1} representa hidrógeno, un resto alifático como alquilo (C_{1}-C_{6}) (metilo, etilo, terc-butilo y similares) u otro grupo protector de OH como acilo (por ejemplo, dado el caso benzoxicarbonilo sustituido), dado el caso bencilo, picolilo o un ligando celular sustituido para provocar la absorción específica de un complejo de ácido nucleico-copolímero mediante enlace a proteínas superficiales de las células, especialmente receptores;
Y
representa un enlace directo de los bloques C y D o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
\quad
-C(O)NH(aril)NHC(O)O- con arilo = unidad aromática con preferiblemente 6 a 14 átomos de C compuesta por uno o varios núcleos aromáticos que están unidos entre sí en forma condensada o polifenólica, preferiblemente con un núcleo, especialmente toluil-,
\quad
-(CH_{2})_{t}C(O)O- con t = 2 a 10, preferiblemente 2 a 3, especialmente 2,
\quad
-CH_{2}CH(OH)CH_{2}O- o
\quad
-(CH_{2})_{u}O- con u = 1 a 20, preferiblemente 1 a 6, especialmente 1 a 3; y
m
representa un número entero de
\quad
1) 1 a 200, preferiblemente
\quad
2) 1 a 100, especialmente
\quad
3) 1 a 50,
con la condición de que los restos y las variables en la fórmula II estén definidos de tal manera que ningún compuesto de fórmula I esté comprendido por éstos.
Los copolímeros de bloque catiónicos según la invención se diferencian de los copolímeros de bloque conocidos en al menos una de las tres siguientes características:
Un polímero hidrófilo no iónico está provisto con brazos laterales de un polímero catiónico.
1. Los miembros de puente se diferencian de esos copolímeros de bloque conocidos.
2. Presentan un polímero ramificado hidrófilo no iónico.
Por A se entienden preferiblemente polímeros lineales o ramificados sintetizados a partir de carbono y oxígeno que, dado el caso, también pueden contener estructuras cíclicas, con forma de estrella o dendríticas, como por ejemplo restos de PEG lineal, PEG ramificado de varios brazos, PEG con forma de estrella, polisacáridos, inclusive ciclodextrinas, PVA, arboroles (dendrímeros con grupos hidroxi terminales), pero preferiblemente PEG lineales y ramificados de varios brazos y con forma de estrella. Éstos últimos pueden obtenerse comercialmente entre otros de Aldrich, Fluka, Sigma y Shearwater.
Por B y C se entienden restos polietilenimina lineales o ramificados que presentan la fórmula III
(III)-[CH_{2}CH_{2}N(^{z+})(R^{2})_{x}]_{y}-H [A^{-}]_{w},
en los que R^{2} representa restos iguales o diferentes y significa hidrógeno o un resto de fórmula IV,
(IV)-[CH_{2}CH_{2}N(^{z'+})(R^{3})_{x'}]_{y'}-H[A^{-}]_{w'}
R^{3} representa restos iguales o diferentes que se definen (recursivamente) como R^{2},
A^{-} representan un equivalente de un anión adecuado, preferiblemente inorgánico, como OH^{-}, Cl^{-}, Br^{-} y similares,
x y x' son iguales o diferentes y significan 1 ó 2,
y y y' son iguales o diferentes y representan números enteros que se seleccionan de manera que los restos B y/o C presenten un peso molecular proporcional de 100 a 1.000.000 g/mol, preferiblemente de 400 a 100.000 g/mol y especialmente de 400 a 50.000 g/mol, en el que y' también puede ser 0,
z y z' son iguales o diferentes, z = x-1 y z' = x'-1, y
w y w' son números enteros iguales o diferentes que se seleccionan de manera que las cargas positivas puedan compensarse en los restos de fórmulas III y IV.
Las polietileniminas pueden fabricarse de una manera conocida en sí o pueden obtenerse en el mercado con las marcas de BASF Lupasol® o con la denominación de polímero de polietilenimina o etilenimina en diferentes pesos moleculares de 400 a 2.000.000 g/mol (de Aldrich, Sigma, Fluka o directamente de BASF). Se prefieren polietileniminas B con un peso molecular de 400 a 2.000 g/mol y polietileniminas C con un peso molecular de 400 a 800.000 g/mol, con especial preferencia de 400 a 25.000 g/mol.
Los grupos descritos en D son restos de polietilenglicoles que están protegidos en un extremo por un resto R^{1} como por ejemplo metilo u otro grupo protector adecuado. Pero R^{1} también puede ser un grupo que desempeñe una función biológica específica o no específica, especialmente un ligando para interacciones con receptores para la absorción específica de células diana de un complejo de copolímero de bloque-principio activo en células eucariotas superiores y sus núcleos celulares, en los que el principio activo representa preferiblemente un oligonucleótido o un gen (focalización en los genes). Por tanto, R^{1} también puede ser un ligando para una interacción específica y absorción en los tejidos o células del órgano diana, por ejemplo proteínas, especialmente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos como Fab, F(ab)_{2}, scFv, citocinas o linfocinas, como interleucinas (IL-2 a x), interferón GM-CSF, factores de crecimiento como EGF, PDGF, FGF, EPO, integrinas como ICAM, VCAM o glicoproteínas como lectinas o proteínas glicosiladas (véase anteriormente) o lipoproteínas como LDL, HDL o proteínas transportadoras como transferrina o péptidos como LH-RH, calcitonina, oxitocina, insulina, somatostatina, IGF, RGD o hidratos de carbono como galactosa, manosa, glucosa, lactosa u hormonas como esteroides, THR o vitaminas como B_{12}, ácido fólico.
La invención también se refiere a procedimientos para la fabricación de compuestos de fórmula I, que se caracterizan porque
a) se hacen reaccionar compuestos de fórmula general V
(V)A-(OH)_{n}
con A y n = como en la fórmula I
con diisocianato, preferiblemente hexametilendiisocianato, y el compuesto resultante de esto se hace reaccionar con polietileniminas con las fórmulas generales III y IV, o
b) se añaden compuestos de fórmula general VI
(VI)A-(NH_{2})_{n}
(con A y n = como se define en la fórmula I)
en la polimerización de etilenimina a la mezcla básica de reacción desde el inicio de la polirreacción o sólo después en el transcurso de la polirreacción, o
c) se utilizan compuestos de fórmula general VII
(VII)A-(OS(O)_{2}R^{4})_{n}
\newpage
con A como en la fórmula I y R^{4} = resto alifático o aromático, preferiblemente p-toluilo, fluoruro, trifluorometilo o metilo, como macroiniciador para la polimerización de etilenimina.
Los compuestos de fórmula VI pueden obtenerse comercialmente en diferentes pesos moleculares, por ejemplo de Shearwater.
Los compuestos de fórmula general VII se obtienen mediante la reacción de compuestos de fórmula general V con compuestos de fórmula general VIII
(VIII)Cl-S(O)_{2}R^{4}
(R^{4} como se define anteriormente).
La invención se refiere además a procedimientos para la fabricación de compuestos de fórmula II que se caracterizan porque
d) se hacen reaccionar en primer lugar compuestos de fórmula general IX
(IX)D-OH
(con D como se define en la fórmula II)
con diisocianato, preferiblemente hexametilendiisocianato, y a continuación el compuesto obtenido con polietilenimina lineal o ramificada. Dado el caso pueden disociarse de una manera conocida en sí grupos protectores introducidos para proteger los grupos OH (véase por ejemplo, Büllesbach, Kontakte (Merck) 1/1980, página 23 y siguientes).
El procedimiento descrito en a) se conduce preferiblemente de manera que se utilice un exceso de 4 a 20 veces de diisocianato, preferiblemente hexametilendiisocianato, por cada grupo hidroxi terminal del polímero de bloque A. La reacción se realiza en cloroformo a temperaturas de temperatura ambiente a la temperatura de ebullición del disolvente, pero preferiblemente a la temperatura de ebullición del disolvente. La duración de la reacción se selecciona entre 2 y 24 horas, pero preferiblemente 4 horas. La concentración de polímero en la mezcla básica de reacción está entre 10 g/l y 500 g/l, preferiblemente 100 g/l. El producto se aísla mediante eliminación del disolvente a presión reducida y eliminación del diisocianato en exceso mediante extracción múltiple con éter de petróleo (intervalo de ebullición: 40-60ºC). Este producto intermedio se hace reaccionar con un exceso de 3 a 10 veces de macromoléculas de PEI por cada grupo hidroxi terminal del compuesto de partida. La reacción se realiza en cloroformo a temperaturas de temperatura ambiente a la temperatura de ebullición del disolvente, pero preferiblemente a la temperatura de ebullición del disolvente. La duración de la reacción se selecciona entre 6 y 72 horas, pero preferiblemente 12 horas. Las concentraciones de polímero, tanto las de PEI como las del polímero no iónico hidrófilo activado con hexametilendiisocianato en la mezcla básica de reacción, están entre 10 g/l y 500 g/l, preferiblemente entre 30-200 g/l. El producto se aísla mediante precipitación del polímero en un exceso de volumen de 10-30 veces en éter dietílico. El copolímero de bloque puede purificarse de la PEI en exceso mediante reprecipitación reiterada con los disolventes etanol y éter dietílico.
El procedimiento descrito en b) se conduce mediante la colocación previa de tanto la etilenimina como del polímero hidrófilo no iónico terminado en amino en agua en una concentración de respectivamente 10 g/l a 500 g/l. La relación molar de ambos componentes está entre 1: 10 a 1: 10.000. Entonces se inicia la polimerización de etilenimina mediante adición de un catalizador adecuado, por ejemplo ácido clorhídrico, y la mezcla básica se lleva a una temperatura de 40-100ºC. El copolímero se produce mediante una reacción de ruptura de cadena. El copolímero de bloque se purifica mediante reprecipitación reiterada con ayuda de disolventes adecuados, por ejemplo etanol y éter dietílico, y/o mediante filtración a presión de la PEI homopolimérica que posiblemente se forma como producto secundario. Una variación de este procedimiento de fabricación consiste en añadir el polímero hidrófilo no iónico terminado en amino sólo después de una duración de la reacción determinada de 30 minutos a 72 horas a la mezcla básica de polimerización caliente.
El procedimiento descrito en c) se conduce haciendo reaccionar el(los) grupo(s) hidroxi terminal(es) del polímero de bloque A con un cloruro de ácido sulfónico de fórmula general VIII, pero especialmente con cloruro del ácido toluenosulfónico (cloruro de tosilo). Esta reacción se realiza en disolventes orgánicos acuosos y/o polares, preferiblemente en una mezcla de agua/tetrahidrofurano, a temperaturas de -10ºC a la temperatura de ebullición del disolvente, preferiblemente a temperaturas de 0ºC a 25ºC, y (en caso de que sea necesario) en presencia de catalizadores, como por ejemplo trietilamina o hidróxido sódico. El producto se aísla mediante eliminación del disolvente a presión reducida. Este polímero sirve a continuación como macroiniciador en la polimerización de etilenimina. Además, el producto con la fórmula general VII se hace reaccionar con etilenimina en disolventes orgánicos acuosos o polares a temperaturas de 0ºC a la temperatura de ebullición del disolvente. La relación molar de ambos componentes está entre 1: 10 a 1: 10.000. En esta reacción no se forma ningún producto secundario. El producto final puede aislarse mediante precipitación del polímero en un disolvente adecuado, como por ejemplo éter dietílico. El procedimiento descrito en d) se conduce preferiblemente de manera que se hace reaccionar un compuesto con la fórmula general IX con un pequeño exceso, por ejemplo un exceso de 2 a 10 veces de diisocianato, preferiblemente hexametilendiisocianato. La reacción se realiza en cloroformo a temperaturas de 20ºC a la temperatura de ebullición del disolvente, pero preferiblemente a la temperatura de ebullición del disolvente. La duración de la reacción se selecciona entre 2 y 24 horas, pero preferiblemente 10 a 14 horas. La concentración de polímero en la mezcla básica de reacción está entre 10 g/l y 500 g/l, preferiblemente 30 a 150 g/l. El producto se aísla mediante eliminación del disolvente a presión reducida y eliminación del diisocianato en exceso mediante extracción múltiple con éter de petróleo (intervalo de ebullición: 40-60ºC). Este producto intermedio se hace reaccionar con macromolécula de PEI en una relación molar de 1: 1 a 100: 1. La reacción se realiza en cloroformo y, en caso de que sea necesario, con una adición de dimetilformamida a temperaturas de temperatura ambiente a la temperatura de ebullición del disolvente, pero preferiblemente a 60-70ºC. La duración de la reacción se selecciona entre 6 y 72 horas, pero preferiblemente 12 horas. Las concentraciones de polímero, tanto las de PEI como las del polímero no iónico hidrófilo activado con hexametilendiisocianato en la mezcla básica de reacción están entre 10 g/l y 500 g/l, preferiblemente entre 30-200 g/l. El producto se aísla mediante precipitación del polímero en un exceso de volumen de 10-30 veces en éter dietílico.
En comparación con las PEI, los nuevos compuestos presentan las siguientes propiedades:
Los copolímeros de bloque presentan en pruebas de citotoxicidad una toxicidad más baja que los homopolímeros de PEI y permanecen más tiempo en la circulación sanguínea (véase el párrafo "Ejemplos biológicos").
Los copolímeros de bloque son, dependiendo de la estructura, sustancias más o menos tensioactivas que pueden usarse como tensioactivos.
Además, los copolímeros de bloque también pueden usarse
\bullet como aditivo en sistemas de adhesivos y barnices
\bullet como fijador para la mejora de la resistencia del papel
\bullet como capa de fondo para sistemas compuestos de polímeros como por ejemplo hojas de embalaje de varias capas
\bullet para la modificación de plásticos (mejora de la tintabilidad, capacidad de barnizado, efecto barrera)
\bullet para la fijación de colorantes reactivos sobre algodón
\bullet como floculante y dispersante en sustancias en suspensión finamente distribuidas en aguas residuales industriales
\bullet para el enlace de sales de metales pesados
\bullet para la dispersión de pigmentos orgánicos e inorgánicos
\bullet como adición en constituyentes cerámicos y cementosos
\bullet para las funciones más diferentes en la cosmética dermatológica y capilar, así como en el campo dental
\bullet para la fijación de principios activos médicos o compuestos biológicamente activos sobre superficies
\bullet para la filtración de endotoxinas y patógenos del plasma sanguíneo
\bullet para la penetración mediante membranas mucosas.
Además, los copolímeros de bloque forman en sistemas acuosos complejos con ácidos polinucleicos, como ADN y ARN, inclusive ribozimas. Debido a esta propiedad son adecuados como vehículo o vectores para la transferencia génica (penetración mediante membranas celulares y translocación en los núcleos celulares). Por tanto, pueden aplicarse en experimentos de transfección, en la terapia génica y el diagnóstico (véase el párrafo "Ejemplos biológicos").
Por tanto, la invención también se refiere especialmente al uso de compuestos de fórmula I o II, que se definen como anteriormente, y en los que además Y puede representar -C(O)NH(CH_{2})_{s}NHC(O)O- con s = 1 a 20, preferiblemente 2 a 10, especialmente 4 a 6, para la complejación de ácidos polinucleicos, como ADN, ARN y ribozimas, en sistemas acuosos, así como composiciones que comprenden al menos un ácido nucleico tal y un compuesto de fórmula I o II.
La invención también se refiere al uso de los compuestos de fórmula I o II definidos en el apartado precedente como tensioactivos.
Los siguientes ejemplos sirven para aclarar la invención, sin que ésta se limite a éstos.
\newpage
Ejemplos químicos Ejemplo 1 Preparación de un copolímero de bloque de PEI(PEG)_{n} Activación de mPEG-550
En un matraz con fondo redondo de 100 ml con varilla agitadora magnética, condensador de reflujo y tubo secador incorporado se colocan previamente 10 ml de cloroformo y se mezclan con 7 ml de hexametilendiisocianato (HMDI) (43,64 mmol, 8 eq). Se disuelven 3 g de éter monometil de poli(óxido de etileno) (mPEG, M_{n} = 550 g/mol) (5,45 mmol, 1 eq) en 40 ml de cloroformo. Esta disolución se gotea ahora lentamente con agitación a la disolución de HMDI. La mezcla básica se calienta a reflujo durante 12 horas. A continuación se elimina el disolvente a presión reducida y el HMDI en exceso se extrae con éter de petróleo (40-60) (5 veces 50 ml). El producto se obtiene en rendimiento casi cuantitativo (3,8 g, 97%) como aceite incoloro muy fluido.
Preparación de un copolímero de bloque de PEI-PEG de injerto
En un matraz con fondo redondo de 100 ml con varilla agitadora magnética, condensador de reflujo y tubo secador incorporado se pesan 1,74 g de PEIb (P_{M} = 25 kDa, M_{n} = 10 kDa, 0,1736 mmol, 1 eq) y se lleva a disolución con 40 ml de dimetilformamida (DMF). Se disuelven 2,5 g del mPEG activado con HMDI (M_{n} = 720 Da, 3,47 mmol) en 10 ml de cloroformo y esta disolución se gotea lentamente con agitación a la disolución de PEI. La mezcla básica se calienta durante 12 horas a 60-70ºC. A continuación se gotea la mezcla básica en 500 ml de éter dietílico. Después de dos horas se ha depositado un aceite amarillento viscoso. Se rechaza el sobrenadante turbio y el aceite se disuelve en 30 ml de etanol. La disolución se gotea de nuevo en 500 ml de éter dietílico y el aceite precipitado de nuevo se aísla mediante decantación. El producto se disuelve para la filtración en etanol y se libera del disolvente en una estufa de secado a vacío a 50ºC. Se obtienen 2,8 g de un aceite amarillento de viscoso a tipo resina (rendimiento: 45%).
La caracterización de los polímeros tuvo lugar mediante espectroscopia de RMN ^{1}H, ^{13}C y cromatografía de permeación en gel. Los siguientes datos se recogieron para el ejemplo nº 1. Son válidos a modo de ejemplo para los otros ejemplos, para los que se recogieron datos similares.
RMN ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}): \delta/ppm = 1,17 (isocianato-CH_{2}), 1,26 (isocianato-CH_{2}), 2,30-2,72 (etilenimina-CH_{2}), 2,96 (isocianato-CH_{2}), 3,15 (isocianato-CH_{2}), 3,49 etilenglicol-CH_{2}).
RMN ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}): \delta/ppm = 14,3 (isocianato-CH_{2}), 26,2 (isocianato-CH_{2}), 29,6 (isocianato-CH_{2}), 36,2 (isocianato-CH_{2}), 37,5 (etilenimina-CH_{2}), 39,1 (etilenimina-CH_{2}), 41,1 (isocianato-CH_{2}), 47,2 (etilenimina-CH_{2}), 48,9 (etilenimina-CH_{2}), 52,8 (etilenimina-CH_{2}), 54,1 (etilenimina-CH_{2}), 58,7 (isocianato-CH_{2}), 69,3 y 70,2 y 71,6 (etilenglicol-CH_{2}), 156,2 (-NHC(O)O-), 161,7 (-NHC(O)NH-).
GPC (gel de metacrilato de aminoetilo, ácido fórmico al 1%, 0,5 ml/min, 25ºC, calibrado frente a patrones de pululano): M_{n} = 8800, P_{M} = 1640000, M_{p} = 85000, PD = 19,6, monomodal. Comparación con mezcla de PEI (Aldrich, 25 kDa) y mPEG (Aldrich, 550 Da): M_{n} = 69000, P_{M} = 1480000, M_{p} = 99000 y 1100, PD = 2,1, bimodal.
Las investigaciones para la actividad interfacial del polímero del ejemplo nº 1 se realizaron a 22ºC con un tensiómetro según el método de Lecomte du Nouy (procedimiento del anillo). Se midió la tensión interfacial de la disolución frente al aire. El calibrado del aparato se hizo con agua muy pura, que también se utilizó como disolvente para la muestra de polímero.
Datos de medición: \sigma_{mín} = 51 mN/m, CMC = 15 mg/ml.
Pueden fabricarse de la misma manera: (todos los compuestos de partida pueden obtenerse de Aldrich).
\vskip1.000000\baselineskip
Nº Compuestos de partida/homopolímeros
Polietilenimina Polímero hidrófilo Relación Estructura
no iónico molar del copolímero
PEI:PEG de bloque
2 PEIl M_{n} mPEG M_{n} 1: 1 Dibloque AB
aproximadamente 423 aproximadamente 550
3 1: 2 Tribloque ABA
(Continuación)
Nº Compuestos de partida/homopolímeros
Polietilenimina Polímero hidrófilo Relación Estructura
no iónico molar del copolímero
PEI:PEG de bloque
4 PEIb P_{M} mPEG M_{n} 1: 1 Dibloque AB
aproximadamente 800 aproximadamente 550
5 1: 2 Tribloque ABA
6 1: 4 Con forma de
estrella
7 PEIb P_{M} mPEG M_{n} 1: 1 Dibloque AB
aproximadamente 800 aproximadamente 5.000
8 1: 2 Tribloque ABA
9 1: 4 Con forma de
estrella
10 PEIb P_{M} mPEG M_{n} 1: 1 Dibloque AB
aproximadamente 2.000 aproximadamente 550
11 1: 2 Tribloque ABA
12 1: 4 Con forma de
estrella
13 PEIb P_{M} mPEG M_{n} 1: 1 Dibloque AB
aproximadamente 2.000 aproximadamente 5.000
14 1: 2 Tribloque ABA
15 PEIb P_{M} mPEG M_{n} 1: 1 Dibloque AB
aproximadamente 25.000 aproximadamente 550
16 1: 2 Tribloque ABA
17 1: 4 Con forma de
estrella
18 1: 20 Con forma de
estrella
19 PEIb P_{M} mPEG M_{n} 1: 1 Dibloque AB
aproximadamente 25.000 aproximadamente 2.000
20 1: 2 Tribloque ABA
21 1: 4 Con forma de
estrella
22 1: 10 Con forma de
estrella
23 PEIb P_{M} mPEG M_{n} 1: 1 Dibloque AB
aproximadamente 25.000 aproximadamente 5.000
(Continuación)
Nº Compuestos de partida/homopolímeros
Polietilenimina Polímero hidrófilo Relación Estructura
no iónico molar del copolímero
PEI:PEG de bloque
24 1: 2 Tribloque ABA
25 1: 4 Con forma de
estrella
26 1: 10 Con forma de
estrella
Ejemplo 27 Preparación de un copolímero de bloque de PEG(PEI)_{n} Activación del PEG ramificado
En un matraz con fondo redondo de 100 ml con varilla agitadora magnética, condensador de reflujo y tubo secador incorporado se disuelven 3,79 g de HMDI (22,54 mmol, 80 eq) en 10 ml de cloroformo. Se gotea lentamente con agitación una disolución de 2 g de un PEG ramificado de ocho brazos (PEGb, PM = 10 kDa, 0,2 mmol, 1 eq) en 20 ml cloroformo a la disolución de HMDI. La mezcla básica se calienta durante 4 horas a ebullición y se agita posteriormente otras 8 horas a temperatura ambiente. El disolvente se elimina a presión reducida y el HMDI en exceso se extrae con éter de petróleo (40-60) (3 veces 50 ml). Se obtiene un aceite rojizo con rendimiento del 58% (1,38 g).
Preparación de un copolímero de bloque de PEG-PEI de injerto
En un matraz con fondo redondo de 100 ml con varilla agitadora magnética, condensador de reflujo y tubo secador incorporado se disuelven 2,20 g de una PEI ramificada (PEIb, P_{M} = 800 Da, M_{n} = 600 Da, 3,66 mmol, 25 eq) en 20 ml de cloroformo. Se gotea lentamente con agitación una disolución de 1,21 g del PEGb activado con HMDI (M_{n} = 8,5 kDa, 0,14 mmol, 1 eq) en 30 ml cloroformo a temperatura ambiente a la disolución de PEI. La mezcla básica se calienta durante 12 horas a ebullición. La disolución se instila entonces lentamente con agitación en 500 ml de éter dietílico. Después de 12 horas se ha depositado un aceite amarillento viscoso. Se rechaza el sobrenadante turbio y el aceite se disuelve en 50 ml de etanol. La disolución se gotea de nuevo en 500 ml de éter dietílico y el aceite precipitado de nuevo se aísla mediante decantación. El producto se disuelve para la filtración en etanol y se libera del disolvente en una estufa de secado a vacío a 50ºC. Se obtienen 1,13 g de un aceite amarillento de viscoso a tipo resina (rendimiento: 59%).
La caracterización de los polímeros tuvo lugar mediante espectroscopia de RMN ^{1}H, ^{13}C y cromatografía de permeación en gel. Los siguientes datos se recogieron para el ejemplo nº 27. Son válidos a modo de ejemplo para los otros ejemplos, para los que se recogieron datos similares.
RMN ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}): \delta/ppm = 1,22 (isocianato-CH_{2}), 1,36 (isocianato-CH_{2}), 2,40-2,70 (etilenimina-CH_{2}), 3,03 (isocianato-CH_{2}), 3,19 (isocianato-CH_{2}), 3,55 etilenglicol-CH_{2}).
RMN ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}): \delta/ppm = 25,9 (isocianato-CH_{2}), 29,4 (isocianato-CH_{2}), 39,2 (etilenimina-CH_{2}), 41,2 (isocianato-CH_{2}), 47,0 (etilenimina-CH_{2}), 48,9 (etilenimina-CH_{2}), 52,0 (etilenimina-CH_{2}), 54,2 (etilenimina-CH_{2}), 61,1 (isocianato-CH_{2}), 69,2 y 71,1 y 72,3 (etilenglicol-CH_{2}), 156,0 (-NHC(O)O-), 162,1 (-NHC(O)NH-).
GPC (gel de metacrilato de aminoetilo, ácido fórmico al 1%, 0,5 ml/min, 25ºC, calibrado frente a patrones de pululano): M_{n} = 22000, P_{M} = 43000, M_{p} = 31000, PD = 1,9, monomodal. Comparación con mezcla de PEG de 8 brazos (Shearwater, 10 kDa) y PEI (Aldrich, 800 Da): M_{n} = 3100, P_{M} = 15000, M_{p} = 12000, PD = 4,91, monomodal.
Las investigaciones para la actividad interfacial del polímero del ejemplo nº 27 se realizaron a 22ºC con un tensiómetro según el método de Lecomte du Nouy (procedimiento del anillo). Se midió la tensión interfacial de la disolución frente al aire. El calibrado del aparato se hizo con agua muy pura, que también se utilizó como disolvente para la muestra de polímero.
Datos de medición: \sigma_{mín} = 56 mN/m, CMC = 12 mg/ml.
\newpage
Pueden fabricarse de la misma manera:
\vskip1.000000\baselineskip
Nº Compuestos de partida/homopolímeros
Polímero hidrófilo Polietilenimina Estructura del
no iónico copolímero
de bloque
28 MPEG M_{n} PEIl M_{n} AB
aproximadamente aproximadamente
5.000 (Aldrich) 423 (Aldrich)
29 PEIb M_{n} AB
aproximadamente
800 (Aldrich)
30 PEIb M_{n} AB
aproximadamente
2.000 (Aldrich)
31 PEGl M_{n} PEIl M_{n} ABA
aproximadamente aproximadamente
5.000 (Aldrich) 423 (Aldrich)
32 PEIb M_{n} ABA
aproximadamente
800 (Aldrich)
33 PEIb M_{n} ABA
aproximadamente
2.000 (Aldrich)
34 PEG de 4 brazos PM PEIl M_{n} AB_{4}
aproximadamente 15.000 aproximadamente
(Shearwater) 423 (Aldrich)
35 PEIb M_{n} AB_{4}
aproximadamente
800 (Aldrich)
36 PEIb M_{n} AB_{4}
aproximadamente
2.000 (Aldrich)
37 PEG de 8 brazos PM PEIl M_{n} AB_{8}
aproximadamente 10.000 aproximadamente
(Shearwater) 423 (Aldrich)
38 PEIb M_{n} AB_{8}
aproximadamente
800 (Aldrich)
39 PEIb M_{n} AB_{8}
aproximadamente
2.000 (Aldrich)
40 Star-PEG 429 PM PEIl M_{n} AB_{13}
aproximadamente 250.000 aproximadamente
(Shearwater) 423 (Aldrich)
(Continuación)
Nº Compuestos de partida/homopolímeros
Polímero hidrófilo Polietilenimina Estructura
no iónico del copolímero
de bloque
41 PEIb M_{n} AB_{13}
aproximadamente
800 (Aldrich)
42 PEIb M_{n} AB_{13}
aproximadamente
2.000 (Aldrich)
43 \alpha-ciclodextrina (Aldrich) PEIl M_{n} AB_{18}
aproximadamente
423 (Aldrich)
44 PEIb M_{n} AB_{18}
aproximadamente
800 (Aldrich)
45 PEIb M_{n} AB_{18}
aproximadamente
2.000 (Aldrich)
46 \beta-ciclodextrina (Aldrich) PEIl M_{n} AB_{21}
aproximadamente
423 (Aldrich)
47 PEIb M_{n} AB_{21}
aproximadamente
800 (Aldrich)
48 PEIb M_{n} AB_{21}
aproximadamente
2.000 (Aldrich)
49 \gamma-ciclodextrina (Aldrich) PEIl M_{n} AB_{24}
aproximadamente
423 (Aldrich)
50 PEIb M_{n} AB_{24}
aproximadamente
800 (Aldrich)
51 PEIb M_{n} AB_{24}
aproximadamente
2.000 (Aldrich)
52 80% de PVA hidrolizado PEIl M_{n} AB_{n}
P_{M} = 9.000-10.000 aproximadamente
423 (Aldrich)
53 PEIb M_{n} AB_{n}
aproximadamente
800 (Aldrich)
54 PEIb M_{n} AB_{n}
aproximadamente
2.000 (Aldrich)
Ejemplo 55 Preparación de un copolímero de PEG-PEI (ruta de macrorreguladores)
En un matraz con fondo redondo de 50 ml con varilla agitadora magnética y condensador de reflujo se pesa 1 g (0,2 mmol) de un PEG monometilado (PM 5000 g/mol), que en el otro extremo de cadena lleva un grupo amino, y se disuelve en 20 ml de agua destilada. A esta disolución polimérica se añaden 2 ml (39 mmol) de etilenimina. La polimerización se inicia con 200 \mul (2 mmol) de sulfato de dimetilo como iniciador y la mezcla básica se calienta durante 8 días a 60ºC. Entonces, el disolvente se elimina a presión reducida para desleír de nuevo la masa que queda en 20 ml de etanol. La disolución se instila en 250 ml de éter dietílico, en el que precipita el polímero. Mediante filtración se aísla el polímero y se libera durante 3 semanas a 50ºC en estufa de secado a vacío de los restos de disolventes. Se obtienen 1,9 g de un polímero débilmente amarillento, de tipo resina (rendimiento: 73%).
Pueden fabricarse de la misma manera: (todos los PEG modificados con amino pueden obtenerse de RAPP Polymere, Tübingen)
Nº Compuestos de partida
Polietilenglicol Polietilenimina Relación Estructura
molar del copolímero
EG:EI de bloque
56 CH_{3}O-PEG-NH_{2} M_{n} Etilenimina 1: 1 Dibloque AB
aproximadamente
2000
57 1: 2 Dibloque AB
58 1: 10 Dibloque AB
59 CH_{3}O-PEG-NH_{2} M_{n} Etilenimina 1: 1 Dibloque AB
aproximadamente
5000
60 1: 10 Dibloque AB
61 CH_{3}O-PEG-NH_{2} M_{n} Etilenimina 1: 1 Dibloque AB
10.000
62 1: 2 Dibloque AB
63 1: 10 Dibloque AB
64 CH_{3}O-PEG-NH_{2} M_{n} Etilenimina 1: 1 Dibloque AB
20.000
65 1: 2 Dibloque AB
66 1: 10 Dibloque AB
La caracterización de los polímeros tuvo lugar mediante espectroscopia de RMN ^{1}H, ^{13}C y cromatografía de permeación en gel. Los siguientes datos se recogieron para el ejemplo nº 56. Son válidos a modo de ejemplo para los otros ejemplos, para los que se recogen datos muy similares.
RMN ^{1}H (500 MHz, D_{2}O): \delta/ppm = 2,60-3,00 (etilenimina-CH_{2}), 3,78 (etilenglicol-CH_{2}).
RMN ^{13}C (125 MHz, D_{2}O): \delta/ppm = 38,2 (etilenimina-CH_{2}), 39,9 (etilenimina-CH_{2}), 46,2 (etilenimina-CH_{2}), 47,9 (etilenimina-CH_{2}), 51,7 (etilenimina-CH_{2}), 53,4 (etilenimina-CH_{2}), 54,8 (etilenimina-CH_{2}), 70,2 (etilenglicol-CH_{2}).
GPC (gel de metacrilato de aminoetilo, ácido fórmico al 1%, 0,5 ml/min, 25ºC, calibrado frente a patrones de pululano): M_{n} = 21000, P_{M} = 40000, M_{p} = 16000, PD = 1,9, monomodal. Comparación con CH_{3}O-PEG-NH_{2} (RAPP Polymere, 5000 Da): M_{n} = 9100, P_{M} = 14000, M_{p} = 16000, PD = 1,6, monomodal.
Ejemplo 67 Preparación de un copolímero de PEG-PEI (ruta de macroiniciadores) Preparación del macroiniciador
En un matraz con fondo redondo de 50 ml con varilla agitadora magnética y condensador de reflujo se pesan 2 g (0,4 mmol, 1 eq) de un polietilenglicol de éter monometílico (Aldrich, PM 5000) y se disuelven en 25 ml de cloroformo destilado. Se añaden con agitación 0,31 g de cloruro de tosilo (1,6 mmol, 4 eq) a la disolución polimérica. A continuación se añaden 0,22 ml de trietilamina (0,16 g, 1,6 mmol, 4 eq) como catalizador a la mezcla básica. La mezcla básica se calienta durante 18 h a reflujo. Para el aislamiento y la purificación del polímero, la disolución se vierte en 500 ml de éter dietílico. El polímero precipitado se separa por filtración, se lava posteriormente con abundante éter dietílico y se seca a vacío. Se obtienen 1,90 g de una sustancia blanca, floculenta (rendimiento del 91%).
Preparación del copolímero de bloque de PEG-PEI
En un matraz con fondo redondo de 25 ml con varilla agitadora magnética y condensador de reflujo se pesan 0,5 g del macroiniciador (0,096 mmol, 1 eq) y se disuelven en 10 ml de agua destilada. Se gotea con agitación 1 ml de etilenimina (0,832 g, 19,32 mmol, 200 eq) y la mezcla básica se calienta durante 24 h a 60ºC. Los constituyentes volátiles se eliminan a presión reducida. Otra vez permanece una sustancia blanca, de tipo resina, que se lleva de nuevo a disolución con 10 ml de agua y se precipita con 200 ml de tetrahidrofurano. El polímero se aísla mediante decantación y se seca a vacío. Se obtienen 0,95 g de una sustancia amarillenta, de tipo resina (rendimiento del
71%).
Pueden fabricarse de la misma manera: (todos los PEG de monometilo pueden obtenerse de Aldrich).
Nº Compuestos de partida
Polietilenglicol Polietilenimina Relación Estructura
molar del copolímero
PEG:EI de bloque
68 CH_{3}O-PEG-Ts M_{n} Etilenimina 1: 10 Dibloque AB
aproximadamente 550
69 1: 50 Dibloque AB
70 1: 200 Dibloque AB
71 CH_{3}O-PEG-Ts M_{n} Etilenimina 1: 10 Dibloque AB
aproximadamente 750
72 1: 50 Dibloque AB
73 1: 200 Dibloque AB
74 CH_{3}O-PEG-Ts M_{n} Etilenimina 1: 10 Dibloque AB
aproximadamente 2.000
75 1: 50 Dibloque AB
76 1: 200 Dibloque AB
77 CH_{3}O-PEG-Ts M_{n} Etilenimina 1: 10 Dibloque AB
aproximadamente 5.000
78 1: 50 Dibloque AB
La caracterización de los polímeros tuvo lugar mediante espectroscopia de RMN ^{1}H, ^{13}C y cromatografía de permeación en gel. Los siguientes datos se recogieron para el ejemplo nº 67. Son válidos a modo de ejemplo para los otros ejemplos, para los que se recogen datos muy similares.
RMN ^{1}H (500 MHz, D_{2}O): \delta/ppm = 2,80-3,20 (etilenimina-CH_{2}), 3,80 (etilenglicol-CH_{2}).
RMN ^{13}C (125 MHz, D_{2}O): \delta/ppm = 37,9 (etilenimina-CH_{2}), 39,4 (etilenimina-CH_{2}), 46,1 (etilenimina-CH_{2}), 47,2 (etilenimina-CH_{2}), 51,3-52,7 (etilenimina-CH_{2}), 70,2 (etilenglicol-CH_{2}).
GPC (gel de metacrilato de aminoetilo, ácido fórmico al 1%, 0,5 ml/min, 25ºC, calibrado frente a patrones de pululano): M_{n} = 35000, P_{M} = 90000, M_{p} = 52000, PD = 2,6, monomodal. Comparación con CH_{3}O-PEG-Ts de 5000 Da): M_{n} = 4800, P_{M} = 7600, M_{p} = 8600, PD = 1,6, monomodal.
Abreviaturas
PEGb
Polietilenglicol ramificado (branched)
PEIb
Polietilenimina ramificada (branched)
CMC
Concentración micelar crítica
DMF
Dimetilformamida
HMDI
Hexametilendiisocianato
PEGl
Polietilenglicol lineal (linear)
PEIl
Polietilenimina lineal (linear)
M_{n}
Promedio en número del peso molecular
M_{p}
Peso molecular máximo
mPEG
Monometoxi-polietilenglicol
P_{M}
Promedio en peso del peso molecular
PM
Promedio del peso molecular no determinado
PD
Polidispersión
Ts
Tosil-
\sigma_{m\text{í}n}
Tensión superficial mínima
Ejemplos biológicos I. Experimentos de transfección
Se investigaron las propiedades de transfección de los polímeros PEI(PEG)_{20} (ejemplo 1) y PEG(PEI)_{8} (ejemplo 27) en la línea celular 3T3. Se sembraron 50000 células/pocillo en placas de 12 pocillos y se incubaron durante 24 horas (DMEM + glutamina 2 mM + SBF al 10%, 37ºC, CO_{2} al 10%). Entonces se cambió el medio. Por pocillo se complejaron respectivamente 4 \mug de plásmido pGL3 en 100 \mul de disolución de cloruro sódico 150 mM con la correspondiente cantidad de polímero en 100 \mul de disolución de cloruro sódico 150 mM y después de 10 minutos se añadieron a las células. Después de 4 horas se cambió de nuevo el medio, después de 48 horas tuvo lugar la evaluación. La expresión de luciferasa se determinó con el kit de ensayo de luciferasa de Promega sobre un luminómetro Sirius de Berthold. La concentración de proteína se cuantificó con un ensayo de BCA modificado. Los datos indicados son respectivamente el valor medio de tres pocillos \pm desviación estándar para los cocientes nitrógeno/fósforo correspondientes.
Ejemplo 1 [PEI(PEG)_{20}]
Datos de medición:
N/P 5: 0,0057 \pm 0,0036 ng/mg de proteína
N/P 10: 0,1786 \pm 0,1522 ng/mg de proteína
N/P 20: 0,6952 \pm 0,5498 ng/mg de proteína
N/P 50: 5,1963 \pm 2,6863 ng/mg de proteína
(sólo plásmido: 0,0000 \pm 0,00004 ng/mg de proteína)
Ejemplo 27 [PEG(PEI)_{8}]
Datos de medición:
N/P 5: 0,0024 \pm 0,0012 ng/mg de proteína
N/P 10: 0,0045 \pm 0,0046 ng/mg de proteína
N/P 20: 0,0109 \pm 0,0078 ng/mg de proteína
N/P 50: 0,0765 \pm 0,0498 ng/mg de proteína
(sólo plásmido: 0,0000 \pm 0,00004 ng/mg de proteína)
En ambos casos pudo detectarse expresión génica debido a la transfección realizada. En este sentido, el PEI(PEG)_{20}
presenta una eficiencia de transfección claramente superior a la del PEG(PEI)_{8}.
II. Determinación de la citotoxicidad in vitro mediante el ensayo MTT
Los copolímeros de los ejemplos 1 y 27 se investigaron en lo referente a su citotoxicidad en el modelo de cultivo celular mediante el ensayo MTT según el método de Mosmann (J. Immunol. Methods. 65: 55-63 (1983)). Se incubaron previamente durante 24 h 8000 fibroblastos L929 de ratón/pocillo en 96 pocillos y se trataron 3, 12 y 24 h con las disoluciones poliméricas de las diferentes concentraciones. La determinación de la actividad mitocondrial tuvo lugar mediante la reacción del colorante MTT para dar formazano, que se cuantificó espectrofotométricamente. Los polímeros se utilizaron como disoluciones en DMEM con SBF al 10% en cinco concentraciones diferentes. En caso de que fuera necesario, el valor de pH se ajustó a 7,4 y las muestras se filtraron de manera estéril (0,2 \mum). Las mezclas se fabricaron mediante mezclado de ambos componentes individuales (menos la cantidad de espaciador). Para la evaluación se repre-
sentó la viabilidad celular [%] frente a las concentraciones de polímeros utilizadas, así como se determinó la CI50.
Resultado
\bullet La citotoxicidad in vitro de los polímeros libres aumenta con concentración creciente de polímero y el incremento de la duración de la incubación.
\bullet Copolímero del ejemplo 1: la toxicidad de la mezcla de los componentes individuales PEI de 25 kDa y PEG de 550 Da corresponde a la toxicidad de la PEI de 25 kDa libre. Mediante el ligamiento covalente de ambos componentes mejora claramente la compatibilidad. Después de 24 h, el perfil de toxicidad todavía corresponde concretamente al de los componentes individuales y por tanto al de la PEI de 25 kDa libre, en cambio, en el caso de fases de incubación más cortas desciende la citotoxicidad. Mediante el recubrimiento de PEG se enmascara la carga positiva de la polietilenimina y por tanto se reducen los efectos mediados por la carga sobre las membranas celulares.
\bullet Copolímero del ejemplo 27: la mezcla de ambos componentes individuales PEI de 700 Da y PEG de 10 kDa no mostró hasta 10 mg/ml ninguna reducción de la capacidad de vida de las células. En el mismo intervalo de concentración, el copolímero mostró una alta limitación de la viabilidad celular después de 3, 12 y 24 h, que debe explicarse con la constitución del peso molecular.
\bullet En comparación, el ejemplo 27 presenta una citotoxicidad más baja que el ejemplo 1.
III. Determinación de la citotoxicidad in vitro mediante el ensayo LDH
Se sembraron fibroblastos L929 de ratón en la misma densidad celular que en el ensayo MTT en multiplacas de 6 pocillos, se incubaron previamente 48 h y se incubaron 1, 2, 3 y 6 h con las disoluciones poliméricas (en PBS pH 7,4). La proporción de LDH extracelular se cuantificó con un kit habitual (Sigma, DG-1340-K) mediante determinación fotométrica de la reducción de NAD en presencia de lactato y LDH. Para determinar el valor del 100% se lisaron células con Triton X-100 al 0,1%.
Resultado
El ensayo LDH confirma los resultados de la prueba MTT. La correlación de ambos ensayos muestra que en primer lugar empieza el daño de la membrana y, retardada en el tiempo, la reducción de la actividad metabólica. Con duración de la incubación y concentración creciente de polímero se intensifica la acción dañina de la membrana de los polímeros.
IV. Enlace de ADN de los copolímeros determinado mediante electroforesis en gel de agarosa
La capacidad de enlace de los copolímeros de los ejemplos 1 y 27 se determinó electroforéticamente con geles de agarosa al 1% a 80 V. La localización de los plásmidos (CMV-nlacZ) tiene lugar mediante excitación UV a 254 nm después de tinción de bromuro de etidio.
Resultado
\bullet Ambos polímeros están en condiciones de interactuar electrostáticamente con el plásmido.
\bullet De acuerdo con la mezcla, el polímero del ejemplo 1 está en condiciones de unir completamente plásmido a partir de un relación nitrógeno-PEI/fosfato-ADN (razón N/P) de 1,7. La exclusión de bromuro de etidio observada en la mezcla (a partir de N/P 5,8), una señal de una condensación intensa de ADN, no es completa para el copolímero hasta N/P 23,0.
\bullet Mientras que para la mezcla del ejemplo 27 sólo se observa un enlace de plásmido completa a partir de N/P 4,1 y ninguna exclusión íntegra de etidio, el copolímero mostró enlace de plásmido a partir de N/P 2,4 y exclusión del colorante a partir de N/P 16,6.
V. Ensayo de agregación de eritrocitos
Los eritrocitos se aislaron de la sangre citrada de ratas Wistar según el método de Parnham y Wetzig (Chem. Phys. Lipids, 1993, 64: 263-274), se sembraron en 24 pocillos y se incubaron durante 2 h con las disoluciones de prueba a 37ºC. Microscópicamente se investigó la agregación y adhesión de los eritrocitos bajo la influencia del polímero. Como controles sirvieron eritrocitos no tratados.
Resultado
\bullet El copolímero libre del ejemplo 1 mostró a concentraciones de 0,27-18 \mug/pocillo, en comparación con la mezcla y con la PEI de 25 kDa, una agregación y adhesión reducida de los glóbulos rojos en las placas de cultivo celular. Mientras que a concentraciones bajas (0,27-0,7 \mug/pocillo) no se observó ninguna diferencia significativa, con concentración creciente pudo detectarse una diferencia más clara entre copolímero y mezcla y/o PEI de 25 kDa. El efecto de agregación crece a relación N/P creciente.
\bullet El copolímero del ejemplo 27 mostró el comportamiento contrario. La agregación de la mezcla y/o de la PEI libre está más débilmente marcada que la del copolímero.
\bullet Mediante la complejación con ADN de plásmido disminuye significativamente en ambos copolímeros la agregación de los eritrocitos en comparación con el polímero libre.
VI. Ensayo de hemólisis
Los eritrocitos se aislaron de la sangre citrada de ratas Wistar según el método de Parnham y Wetzig (Chem. Phys. Lipids, 1993, 64: 263-274), se mezclaron con las disoluciones poliméricas y se incubaron durante 1 h a 37ºC. Los eritrocitos se peletizan mediante centrifugación (10 min, 25ºC, 700 g) y el hemolizado se mide fotométricamente del sobrenadante a 540 nm.
Resultado
\bullet Los componentes individuales de PEG de 8 brazos, PEG de 500 Da y PEI de 700 Da no muestran ningún efecto hemolítico significativo en el intervalo de concentración 0,001-10 mg/ml (todos 1-3%).
\bullet El copolímero del ejemplo 27 tampoco presenta ningún efecto marcado en el mismo intervalo de concentración (<5%).
\bullet En el caso del componente individual PEI de 25 kDa, así como de la mezcla del ejemplo 1, la actividad hemolítica aumenta a 0,001-10 mg/ml (22,13% a 10 mg/ml).
\bullet El copolímero del ejemplo 1 muestra hasta 0,5 mg/ml una actividad lítica ascendente hasta 13,30%, a concentración más alta hasta 10 mg/ml decrece de nuevo el efecto hemolítico (2,90% a 10 mg/ml).
VI. Farmacocinética y distribución en los órganos de los complejos de polímero-ADN en el ratón
La farmacocinética y la distribución en los órganos de los copolímeros del ejemplo 1 y 27 se determinaron en ratones balb/c. Los polímeros se marcaron radiactivamente con reactivo de Bolton Hunter de ^{125}I (Pharmacia Biotech). Se complejaron respectivamente 0,4 y/o 0,04 y/o 0,008 mg de (proporción de) PEI por kg de ratón con la cantidad correspondiente de oligodesoxinucleótido (ODN) anti NF-\kappaB en relación nitrógeno/fósforo N/P 3,5 y/o N/P 6 en un volumen total de 80 \mul en disolución de glucosa al 5% y después de 10 minutos se inyectaron a los ratones narcotizados por la vena subclavia. Después de 20 segundos, 1, 2, 5, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos se extrajeron muestras de sangre por un catéter de la arteria aorta común. Por un catéter urinario se recogió orina durante 120 minutos. Después de 120 minutos, los ratones se decapitaron y se extrajeron los órganos corteza, riñones, hígado, corazón, pulmón, bazo y tejido adiposo. La cantidad de polímero en las muestras se determinó mediante medición de la radioactividad con un contador gamma automático 1277 Gammamaster (LKB Wallac).
Los datos se evaluaron con el programa Kinetica 1.1 y un modelo de 2 compartimentos para inyección intravenosa en bolo. De las curvas del nivel en sangre se calcularon el volumen de distribución (V_{D}), la constante para la eliminación (C_{el}) y el ABC (área bajo la curva).
En el caso de tres animales que pueden evaluarse se indica el valor medio \pm desviación estándar, en el caso de dos animales, la mediana, en el caso de sólo un animal se da el valor entre paréntesis.
Fabricación de complejos y dosificaciones
Polímero N/P Dosis V_{D} [ml] C_{el} [min^{-1}] ABC [min \mug
[mg/kg] ml^{-1}]
PEI de 25 kDa 3,5:1 0,4 23,39 0,106 4,89
Ejemplo 1 3,5:1 0,4 (4,54) (0,028) (79,03)
Ejemplo 27 3,5:1 0,4 5,84\pm0,4 0,104\pm0,017 16,86\pm1,64
PEI de 25 kDa 6:1 0,4 5,39 0,099 19,22
PEI de 25 kDa 6:1 0,04 1,37\pm0,2 0,14\pm0,026 6,22\pm1,18
PEI de 25 kDa 6:1 0,008 9,57\pm1,78 0,063\pm0,009 0,34\pm0,1
Ejemplo 1 6:1 0,4 6,20 0,067 27,84
Ejemplo 1 6:1 0,04 3,37\pm0,32 0,072\pm0,01 4,0\pm0,67
Ejemplo 1 6:1 0,008 5,1\pm0,55 0,054\pm0,004 0,80\pm0,10
Ejemplo 27 6:1 0,4 8,12 0,0593 21,72
Resultado
\blacksquare Las observaciones a dosis más bajas indican toxicidad más débil de la PEI(PEG)_{20} en comparación con la PEI de 25 kDa.
\blacksquare Los niveles en plasma de todos los polímeros pudieron describirse con un modelo de 2 compartimentos.
\blacksquare Los copolímeros tienen un ABC más alta, así como un volumen de distribución más pequeño que la PEI de 25 kDa. PEI(PEG)_{20} (ejemplo 1) tiene un efecto mayor que PEG(PEI)_{8} (ejemplo 27).
\blacksquare La eliminación era reducida en los copolímeros.
\blacksquare V_{D} y C_{el} no muestran ninguna dependencia reconocible de la dosis.
\blacksquare El ABC calculada era para PEI de 25 kDa y el ejemplo 1 proporcional a la dosis, la pendiente de las rectas ABC/dosis era mayor en el copolímero del ejemplo 1.
\blacksquare Los órganos principales de la distribución después de 120 minutos eran el hígado, riñones y bazo. Para los complejos 6:1, los copolímeros muestran, en comparación con PEI de 25 kDa, una absorción reducida en el hígado y el bazo, así como una absorción más alta en los riñones.

Claims (17)

1. Compuesto de fórmula I o II
(I)A(-X-B)_{n}
(II)C(-Y-D)_{m}
en el que
A representa un polímero hidrófilo no iónico, lineal o ramificado con un peso molecular de 100 a 10.000.000 g/mol;
B representa una polietilenimina (PEI) lineal o ramificada con un peso molecular de 100 a 1.000.000 g/mol;
X representa un enlace directo de los bloques A y B o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-OC(O)NH(CH_{2})_{o}NHC(O)- con o = 1 a 20,
-OC(O)NH(aril)NHC(O)- con arilo = unidad aromática,
-O(CH_{2})_{p}C(O)- con p = 1 a 10,
-OC(O)- o
-O(CH_{2})_{q}- con q = 1 a 20;
n representa un número entero de 1 a 200;
C representa una PEI lineal o ramificada con un peso molecular de 100 a 1.000.000 g/mol;
D un resto de un polietilenglicol unido por O de fórmula
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n'}-R^{1}
en el que n' es = 3 a 25.000 y R^{1} es hidrógeno, un resto alifático u otro grupo protector de OH o un ligando celular;
Y representa un enlace directo de los bloques C y D o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-C(O)NH(aril)NHC(O)O- con arilo = unidad aromática,
-(CH_{2})_{t}C(O)O- con t = 2 a 10,
-CH_{2}CH(OH)CH_{2}O- o
-(CH_{2})_{u}O- con u = 1 a 20; y
m representa un número entero de 1 a 200,
con la condición de que los restos y las variables en la fórmula II estén definidos de tal manera que ningún compuesto de fórmula I esté comprendido por éstos.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
A representa un polímero hidrófilo no iónico, lineal o ramificado con un peso molecular de 1.000 a 100.000 g/mol;
B representa una polietilenimina (PEI) lineal o ramificada con un peso molecular de 400 a 100.000 g/mol;
X representa un enlace directo de los bloques A y B o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-OC(O)NH(CH_{2})_{o}NHC(O)- con o = 2 a 10,
-OC(O)NH(aril)NHC(O)- con arilo = unidad aromática con un núcleo,
-O(CH_{2})_{p}C(O)- con p = 1 a 3,
-OCH_{2}CH(OH)CH_{2}-,
-OC(O)- o
-O(CH_{2})_{q}- con q = 1 a 6,
n representa un número entero de 1 a 50;
C una PEI lineal o ramificada con un peso molecular de 400 a 100.000 g/mol;
D representa un resto de un polietilenglicol unido por O de fórmula
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-R^{1}
en el que n' es = 10 a 5.000 y R^{1} es hidrógeno, un resto alifático u otro grupo protector de OH o un ligando celular;
Y representa un enlace directo de los bloques C y D o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-C(O)NH(aril)NHC(O)O- con arilo = unidad aromática con un núcleo,
-(CH_{2})_{t}C(O)O- con t = 2 a 3,
-CH_{2}CH(OH)CH_{2}O- o
-(CH_{2})_{u}O- con u = 1 a 6; y
m representa un número entero de 1 a 100,
con la condición de que los restos y las variables en la fórmula II estén definidos de tal manera que ningún compuesto de fórmula I esté comprendido por éstos.
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el que
A representa un polímero hidrófilo no iónico, lineal o ramificado con un peso molecular de 5.000 a 50.000 g/mol;
B representa una polietilenimina (PEI) lineal o ramificada con un peso molecular de 400 a 50.000 g/mol;
X representa un enlace directo de los bloques A y B o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-OC(O)NH(CH_{2})_{o}NHC(O)- con o = 4 a 6,
-OC(O)NH(aril)NHC(O)- con arilo = toluil-,
-O(CH_{2})_{p}C(O)- con p = 1,
-OCH_{2}CH(OH)CH_{2}-,
-OC(O)- o
-O(CH_{2})_{q}- con q = 1 a 3;
n representa un número entero de 1 a 12;
C representa una PEI lineal o ramificada con un peso molecular de 400 a 50.000 g/mol;
D representa un resto de un polietilenglicol unido por O de fórmula
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n'}-R^{1}
en el que n' es = 10 a 1.000 y R^{1} es hidrógeno, un resto alifático u otro grupo protector de OH o un ligando celular;
Y representa un enlace directo de los bloques C y D o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-C(O)NH(aril)NHC(O)O- con arilo = toluil-,
-(CH_{2})_{t}C(O)O- con t = 2,
-CH_{2}CH(OH)CH_{2}O- o
-(CH_{2})_{u}O- con u = 1 a 3; y
m representa un número entero de 1 a 50,
con la condición de que los restos y las variables en la fórmula II estén definidos de tal manera que ningún compuesto de fórmula I esté comprendido por éstos.
4. Compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 3, que presenta la fórmula I.
5. Compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 3, que presenta la fórmula II.
6. Compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que X representa un miembro de puente de fórmula -OC(O)NH(CH_{2})_{o}NHC(O)-.
7. Uso de un compuesto de fórmula II, en el que Y representa un miembro de puente de fórmula -C(O)NH(CH_{2})_{s}
NHC(O)O- con s = 1-10 y los restantes restos se definen como en una de las reivindicaciones 1 a 3, para la complejación de ácidos polinucleicos en sistemas acuosos.
8. Procedimiento para la fabricación de un compuesto de fórmula I según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque
a) se hacen reaccionar compuestos de fórmula general V
(V)A-(OH)_{n}
con A y n = como en la fórmula I
con diisocianato, o
b) se añaden compuestos de fórmula general VI
(VI)A-(NH_{2})_{n}
(con A y n = como se define en la fórmula I)
en la polimerización de etilenimina a la mezcla básica de reacción desde el inicio de la polirreacción o sólo después en el transcurso de la polirreacción, o
c) se utilizan compuestos de fórmula general VII
(VII)A-(OS(O)_{2}R^{4})_{n}
con A como en la fórmula I y R^{4} = resto alifático o aromático como macroiniciador para la polimerización de etilenimina.
9. Procedimiento para la fabricación de compuestos de fórmula II según una de las reivindicaciones 1 a 3 y 5, caracterizado porque se hacen reaccionar en primer lugar compuestos de fórmula general IX
(IX)D-OH
(con D como se define en la fórmula II)
con diisocianato y a continuación el compuesto obtenido con polietilenimina lineal o ramificada.
10. Uso de un compuesto de fórmula I o II
(I)A(-X-B)_{n}
(II)C(-Y-D)_{m}
en el que
A representa un polímero hidrófilo no iónico, lineal o ramificado con un peso molecular de 100 a 10.000.000 g/mol;
B representa una polietilenimina (PEI) lineal o ramificada con un peso molecular de 100 a 1.000.000 g/mol;
X representa un enlace directo de los bloques A y B o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-OC(O)NH(CH_{2})_{o}NHC(O)- con o = 1 a 20,
-OC(O)NH(aril)NHC(O)- con arilo = unidad aromática,
-O(CH_{2})_{p}C(O)- con p = 1 a 10,
-OC(O)- o
-O(CH_{2})_{q}- con q = 1 a 20;
n representa un número entero de 1 a 200;
C representa una PEI lineal o ramificada con un peso molecular de 100 a 1.000.000 g/mol;
D un resto de un polietilenglicol unido por O de fórmula
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-R^{1}
en el que n' es = 3 a 25.000 y R^{1} es hidrógeno, un resto alifático u otro grupo protector de OH o un ligando celular;
Y representa un enlace directo de los bloques C y D o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-C(O)NH(CH_{2})_{S}NHC(O)O- con s = 1 a 20,
-C(O)NH(aril)NHC(O)O- con arilo = unidad aromática,
-(CH_{2})_{t}C(O)O- con t = 2 a 10,
-CH_{2}CH(OH)CH_{2}O- o
-(CH_{2})_{u}O- con u = 1 a 20; y
m representa un número entero de 1 a 200,
con la condición de que los restos y las variables en la fórmula II estén definidos de de tal manera que ningún compuesto de fórmula I esté comprendido por éstos para la complejación de ácidos polinucleicos en sistemas acuosos.
11. Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque se usa un compuesto de fórmula I o II, en el que
A representa un polímero hidrófilo no iónico, lineal o ramificado con un peso molecular de 1.000 a 100.000 g/mol;
B representa una polietilenimina (PEI) lineal o ramificada con un peso molecular de 400 a 100.000 g/mol;
X representa un enlace directo de los bloques A y B o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-OC(O)NH(CH_{2})_{o}NHC(O)- con o = 2 a 10,
-OC(O)NH(aril)NHC(O)- con arilo = unidad aromática con un núcleo,
-O(CH_{2})_{p}C(O)- con p = 1 a 3,
-OCH_{2}CH(OH)CH_{2}-,
-OC(O)- o
-O(CH_{2})_{q}- con q = 1 a 6,
n representa un número entero de 1 a 50;
C una PEI lineal o ramificada con un peso molecular de 400 a 100.000 g/mol;
D representa un resto de un polietilenglicol unido por O de fórmula
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-R^{1}
en el que n' es = 10 a 5.000 y R^{1} es hidrógeno, un resto alifático u otro grupo protector de OH o un ligando celular;
Y representa un enlace directo de los bloques C y D o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-C(O)NH(CH_{2})_{s}NHC(O)O- con s = 2 a 20,
-C(O)NH(aril)NHC(O)O- con arilo = unidad aromática con un núcleo,
-(CH_{2})_{t}C(O)O- con t = 2 a 3,
-CH_{2}CH(OH)CH_{2}O- o
-(CH_{2})_{u}O- con u = 1 a 6; y
m representa un número entero de 1 a 100,
con la condición de que los restos y las variables en la fórmula II estén definidos de tal manera que ningún compuesto de fórmula I esté comprendido por éstos.
12. Uso según una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque se usa un compuesto de fórmula I o II, en el que
A representa un polímero hidrófilo no iónico, lineal o ramificado con un peso molecular de 5.000 a 50.000 g/mol;
B representa una polietilenimina (PEI) lineal o ramificada con un peso molecular de 400 a 50.000 g/mol;
X representa un enlace directo de los bloques A y B o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-OC(O)NH(CH_{2})_{o}NHC(O)- con o = 4 a 6,
-OC(O)NH(aril)NHC(O)- con arilo = toluil-,
-O(CH_{2})_{p}C(O)- con p = 1,
-OCH_{2}CH(OH)CH_{2}-,
-OC(O)- o
-O(CH_{2})_{q}- con q = 1 a 3;
n representa un número entero de 1 a 12;
C representa una PEI lineal o ramificada con un peso molecular de 400 a 50.000 g/mol;
D representa un resto de un polietilenglicol unido por O de fórmula
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n'}-R^{1}
en el que n' es = 10 a 1.000 y R^{1} es hidrógeno, un resto alifático u otro grupo protector de OH o un ligando celular;
Y representa un enlace directo de los bloques C y D o un miembro de puente con las siguientes estructuras, cuya parte terminal de C está ligada con un átomo de nitrógeno de la PEI:
-C(O)NH(CH_{2})_{s}NHC(O)O- con s = 4 a 6,
-C(O)NH(aril)NHC(O)O- con arilo = toluil-,
-(CH_{2})_{t}C(O)O- con t = 2,
-CH_{2}CH(OH)CH_{2}O- o
-(CH_{2})_{u}O- con u = 1 a 3; y
m representa un número entero de 1 a 50,
con la condición de que los restos y las variables en la fórmula II estén definidos de tal manera que ningún compuesto de fórmula I esté comprendido por éstos.
13. Uso de un compuesto según una de las reivindicaciones 10 a 12 para la complejación de ADN en sistemas acuosos.
14. Uso de un compuesto según una de las reivindicaciones 10 a 12 para la complejación de ARN en sistemas acuosos.
15. Uso de un compuesto según una de las reivindicaciones 10 a 12 para la complejación de ribozimas en sistemas acuosos.
16. Composición que comprende al menos un ácido nucleico y un compuesto de fórmula I o II, que se define como en una de las reivindicaciones 10 a 12.
17. Uso de un compuesto de fórmula I o II, que se define como en una de las reivindicaciones 10 a 12, como tensioactivo.
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