ES2256062T3

ES2256062T3 - Proteina lppq antigenica de mycoplasma mycoides subsp.mycoides sc, su preparacion y uso.

Info

Publication number: ES2256062T3
Application number: ES00977578T
Authority: ES
Inventors: Joachim Frey; Jacques Nicolet; El-Mostafa Abdo
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1999-11-29
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2006-07-16
Anticipated expiration: 2020-11-24
Also published as: DE60025522T2; DE60025522D1; ATE315649T1; JP2003515340A; AU1524001A; EP1240328A1; AU777145B2; WO2001040471A1; EP1240328B1

Abstract

Una proteína de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides colonia pequeña(SC) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 25, o partes antigénicas de la misma.

Description

Proteína LppQ antigénica de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, su preparación y uso.

La presente invención se encuentra principalmente en el campo de la medicina veterinaria y la producción de ganado. Más específicamente la invención se refiere a la proteína LppQ de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC y al ADN que codifica dicha proteína. La invención se refiere a la detección serológica de infecciones por Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC de tipo colonias pequeñas (SC), el agente etiológico de la pleuroneumonía bovina contagiosa (CBPP) y al diseño de cualquier tipo de vacuna, en particular vacunas marcadoras para la diferenciación de animales infectados de animales vacunados. La lipoproteína específica LppQ, y especialmente su porción antigénica N-terminal es expresada como péptido recombinante que se va a utilizar como antígeno específico para la serodetección de CBPP.

La pleuroneumonía bovina contagiosa (CBPP), causada por Mycoplasma mycoides subsp. mycoides de tipo colonias pequeñas (SC) es una enfermedad grave que afecta al ganado así como a los búfalos. La CBPP ocasiona graves pérdidas económicas en regiones endémicas y está declarada por la Office International des Epiozooties (OIE) una enfermedad de la lista "A", que contiene las enfermedades animales contagiosas más graves; estas enfermedades requieren regulaciones internacionales especiales para su erradicación.

La CBPP fue erradicada de la mayor parte de los continentes durante el siglo 19 pero permaneció endémica en Africa. A pesar de los estrictos controles sanitarios está volviendo a emerger en Europa desde 1980, constituyendo de ese modo una seria amenaza para la salud animal y para la producción de ganado (ter Laak, 1992; Nicholas and Bashiruddin, 1995; Provost y col., 1987; Egwu y col., 1996).

La serodiagnosis es la herramienta más importante para el control de la CBPP. Se han descrito numerosos ensayos serológicos durante los últimos cincuenta años incluyendo la aglutinación en porta, la fijación del complemento (CF) (Campbell y Turner, 1953), la precipitación en gel de agar (Gourlay y Shifrine, 1965), el análisis de inmunoabsorción con enzima ligada, la hemaglutinación pasiva, la transferencia Western y la transferencia puntual (Nicholas y col., 1996). El ensayo de fijación del complemento (CF) es actualmente el ensayo de diagnóstico serológico más ampliamente utilizado (Nicholas y col., 1996), y se piensa que es específico y sensible en la fase aguda de la enfermedad. No obstante, se ha informado de que el ensayo de CF detecta sólo aproximadamente el 70% de los animales infectados crónicamente y parece no detectar los animales asintomáticos en la fase temprana de la infección (Provost y col., 1987). Además, se experimentan problemas con la especificidad del ensayo de CF; los análisis recientes de las muestras del control del ganado en un área sin CBPP ha mostrado un número significativo de resultados falsos positivos (Stark y col., 1995b; Stark y col., 1995a). Recientemente se ha desarrollado un ELISA competitivo para la serodiagnosis de infecciones por M. mycoides subsp. mycoides SC basado en un anticuerpo monoclonal que detecta un epítopo específico de un antígeno de 80 kDa de M. mycoides subsp. mycoides SC (Le y Thiacourt, 1998). Hasta ahora no existe un antígeno específico de M. mycoides subsp. mycoides SC ni un ensayo simple tal como el ELISA en fase sólida indirecto no competitivo (captura de anticuerpos) para la serodetección de infecciones por M. mycoides subsp. mycoides SC. Para los ELISA indirectos, la calidad de las preparaciones de antígeno es decisiva para la especificidad y la sensibilidad del ensayo. Los antígenos celulares totales o los extractos de M. mycoides subsp. mycoides SC contienen muchos antígenos que presentan reacción cruzada con los micoplasmas relacionados y no pueden ser utilizados. Parte de la presente invención comprende el uso de una lipoproteína específica de M. mycoides subsp. mycoides SC como antígeno para los ensayos serológicos.

Hasta ahora las vacunas se basan en cepas atenuadas de M. mycoides subsp. mycoides SC y se utilizan como vacunas vivas. Estas vacunas, no obstante, no permiten la diferenciación del ganado vacunado del ganado infectado lo que supone un impedimento principal en los programas de control y erradicación en los que se utiliza la
vacunación.

Recientemente Abdo y col. (1998) han analizado el transcurso de las reacciones inmunes de antígenos de omaso de M. mycoides subsp. mycoides SC en lavado bronquial y suero de ganado infectado experimentalmente con la cepa Africana Afadé (consignada en la European Collection of cell Cultures, Salisbury, Wilshire SP4OJG.UK, número de consigna: 99081024) y la cepa Europea L2 utilizando las transferencias Western y la fijación del complemento. Se identificaron varios antígenos inmunogénicos dominantes comunes con masas moleculares de 110, 95, 85, 80, 72, 62, 48 y 39 kDa. Puesto que se conocen muchas cepas de micoplasmas muy íntimamente relacionadas con M. mycoides subsp. mycoides SC, era cuestionable que cualquiera de los antígenos inmunogénicos identificados fuera específico de M. mycoides subsp. mycoides SC. No obstante, se ha encontrado ahora sorprendentemente que la proteína de 48 kDa enumerada antes tiene especificidad por M. mycoides subsp. mycoides SC permitiendo a los expertos en la técnica desarrollar las realizaciones de la presente invención como se describe más
abajo.

La presente invención es el descubrimiento de un antígeno lipoproteico denominado LppQ que es específico para M. mycoides subsp. mycoides SC y su uso o el uso de parte de su proteína, en particular la mitad N-terminal del péptido como antígeno específico para la serodetección de infecciones por M. mycoides subsp. mycoides SC utilizando el péptido v.g. como antígeno específico en un ELISA en fase sólida indirecto no competitivo o cualquier otro método de ensayo serológico. En la invención se incluye la secuencia génica de lppQ para la expresión de antígenos, o para su uso en la identificación o detección genética de M. mycoides subsp. mycoides SC para el diseño y la producción de cualquier tipo de vacuna contra M. mycoides subsp. mycoides SC. Esto incluye el diseño de vacunas marcadoras mediante la construcción de cepas de M. mycoides subsp. mycoides SC que están desprovistas de la biosíntesis de LppQ, la formulación de vacunas utilizando LppQ como componente así como los procedimientos de vacunación utilizando la secuencia génica de lppQ (v.g. vacunas de ADN).

La presente invención proporciona una proteína específica de la membrana de M. mycoides subsp. mycoides SC y su correspondiente gen y los datos de la secuencia génica para la serodetección específica de animales infectados con M. mycoides subsp. mycoides SC. La proteína, denominada LppQ, es una lipoproteína de M. mycoides subsp. mycoides SC. Su correspondiente gen lppQ fue clonado a partir de la cepa Afadé de M. mycoides subsp.
mycoides SC.

La secuencia génica de lppQ y la correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína LppQ se presentan en la Tabla 5.

El gen lppQ está presente en la cepa tipo PG1 así como en todos los productos aislados Europeos y Africanos de M. mycoides subsp. mycoides SC sometidos a ensayo determinados mediante PCR (ver la Tabla 1).

Con el fin de expresar lppQ en cepas de E. coli recombinantes y otros sistemas de expresión génica, la secuencia génica fue mutada con el fin de cambiar UGA por UGG_{trp}. En total 9 codones UGA tenían que ser cambiados a UGG_{trp} mediante mutagénesis puntual. Se han construido tres genes sintéticos:

\bulletlppQ^{*} que codifica el gen lppQ total pero que contiene el código genético universal que puede ser leído por E. coli y otros huéspedes para la expresión génica (Tabla 6). El plásmido que contiene el gen lppQ^{*} es pJFFmaLP48-MuHis1 (consignado en la European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4OJG.UK, número de consigna: 99081025).

\bulletlppQ^{*}N' que codifica la porción N'terminal, antigénica de LppQ, LppQN'. lppQ^{*}N' contiene el código genético universal (Tabla 8). El plásmido que contiene el gen lppQ^{*}N' es pJFFLP48-11.

\bulletlppQ^{*}C' que codifica la porción C'terminal, de LppQ, LppQC'. lppQ^{*}C' contiene el código genético universal (Tabla 10). El plásmido que contiene el gen lppQ^{*}C' es pJFFmaLppQ-Cterm.

La expresión de los tres genes sintéticos presentes en los plásmidos descritos antes ha sido lograda utilizando el vector de expresión pETHIS-1. La secuencia génica del plásmido pETHIS-1 es asequible de GenBank/EMBL núm. de acceso AF012911. El plásmido pETHIS-1 fue construido para permitir la expresión de las proteínas de fusión con el hexámero de histidina N-terminal y/o el decámero de histidina C-terminal en células huésped de E. coli especializadas que contienen genes de la ARN polimerasa de T7 inducibles como v.g. la cepa de E. coli BL21(DE3)(F-,ompT, r-(B),m-(B), lambda DE3, i21,laci,lacUV5lacZ, T_{7}-RNA-pol.(lisogenica),int^{-}). Los péptidos de His de LppQ con una cola de polihistidina fueron purificados mediante cromatografía de quelación con Ni.

La porción N-terminal de LppQ es una porción antigénica de esta lipoproteína. Esto se demuestra mediante un experimento de inmunotransferencia, cuyos resultados se muestran en la Tabla 12. El antisuero de conejo dirigido contra LppQ-His recombinante completa reconocía tanto LppQN'-His N-terminal recombinante como LppQC'-His C-terminal recombinante así como la proteína LppQ-His completa (Tabla 12, panel 1). El suero de una vaca infectada con M. mycoides subsp. mycoides SC de un brote de CBPP en Italia en 1992 reaccionaba fuertemente con el péptido N-terminal recombinante de la proteína, LppQN'-His, y con LppQ-His completa, pero no con la porción C-terminal LppQC'-His (Tabla 12, panel 2). La misma observación se realizó con suero de una infección experimental. El suero de la fase temprana (Tabla 12, panel 4) y de la fase tardía de la infección mostraba fuertes reacciones con LppQN' (Tabla 12, panel 5). No se encontró reacción en el suero de control tomado del animal antes de la infección (Tabla 12, panel 3).

LppQ, y en particular la porción N-terminal de la proteína LppQN' es un marcador antigénico temprano y persistente de las infecciones por M. mycoides subsp. mycoides SC. Esto es demostrado mediante experimentos de inmunotransferencia con sueros de infecciones experimentales controladas de ganado con dos cepas diferentes de M. mycoides subsp. mycoides SC, una cepa Africana Afadé y una cepa Europea L2 (Abdo y col., 1998). Los sueros de los animales infectados por contacto experimentalmente mostraron una respuesta temprana, fuerte y persistente a LppQN'-His (Tabla 13). El suero representativo de una vaca que había sido infectada por contacto con la cepa Europea L2 mostraba señales claras en las inmunotransferencias que contenían LppQN'-His partiendo del día 92 después de la infección por contacto, de acuerdo con el primer título positivo del ensayo de CF normalizado y persistía hasta el día 224 después de la infección por contacto (Tabla 13, parte A) cuando el título del ensayo de CF normalizado estaba por debajo del límite de detección durante más de 2 meses (Abdo y col., 1998). El suero representativo de una vaca infectada con la cepa Africana Afadé mostraba una fuerte señal el día 28 después de la infección por contacto, de acuerdo con el primer título positivo claro y que persistía hasta el día 134 después de la infección por contacto (Tabla 13, parte B) cuando el título del ensayo de CF normalizado estaba por debajo del límite de detección durante más de 3 semanas (Abdo y col., 1998).

La porción N-terminal de LppQ (LppQN') es un antígeno específico de M. mycoides subsp. mycoides SC. El suero de un conejo que había sido inmunizado con las células totales de M. mycoides subsp. mycoides SC cepa tipo PG1 reaccionaba fuertemente con LppQN' en las inmunotransferencias, mientras los sueros de los conejos que habían sido inmunizados con las células totales de micoplasmas relacionados de la agrupación M. mycoides o Mycoplasma putrefaciens no mostraban reacción con LppQN'-His en las mismas condiciones. Además, los sueros de ganado Suizo que eran positivos para Mycoplasma bovis pero que estaban libres de CBPP no mostraban reacción con LppQN'-His (Tabla 14).

La porción N-terminal de LppQ (LppQN'-His) es producida en grandes cantidades a partir del plásmido pJFFLP48-11 albergado en E. coli cepa JF1979 [BL21(DE3)(F-, ompT, r-(B),m-(B), lambda DE3, i21, lacI, lacUV5lacZ, T_{7}-RNA-pol.(lisogenica),int^{-})/pJFFLP48-11 Ap^{R}]. LppQN'-His es purificada directamente a partir de células solubilizadas con hidrocloruro de guanidinio mediante cromatografía con quelato de Ni. Un cultivo de 50 ml de la cepa JF1979 rendía 2 mg de proteína LppQN'-His purificada. Se pueden utilizar otros sistemas de expresión para la producción de péptidos LppQN' o derivados del mismo.

La invención se aplica a la producción de estuches de ensayo serológicos tales como inmunotransferencias o ELISA en fase sólida indirecto no competitivo o cualquier otro método de detección de anticuerpos para infecciones por M. mycoides subsp. mycoides SC que son útiles para rastrear CBPP en animales y portadores de M. mycoides subsp. mycoides SC.

"Sistemas de detección inmunológica" representa métodos para detectar anticuerpos dirigidos contra componentes específicos de M. mycoides subsp. mycoides SC en sueros de animales tales como las inmunotransferencias (ver la Tabla 12) y ELISA (ver Tabla 2). Estos métodos serán utilizados para la serodiagnosis de infecciones por M. mycoides subsp. mycoides SC. Los ejemplos de un ensayo ELISA en el que se utilizan microplacas recubiertas con LppQN'-His se dan en la Tabla 2. El ELISA basado en placas de microtitulación recubiertas con LppQN'-His era significativamente más sensible que el ensayo CF, en particular con sueros tomados en la fase tardía post-infección (ver los resultados de la Tabla 2).

El gen lppQ puede ser utilizado para diseñar un sistema para la detección genética de M. mycoides subsp. mycoides SC. La especificidad del gen lppQ para M. mycoides subsp. mycoides SC es mostrada en la Tabla 1 que demuestra que lppQ estaba presente en todas las cepas de M. mycoides subsp. mycoides SC aisladas de diferentes continentes y países y en diferentes décadas. El gen lppQ no fue encontrado en otros Mycoplasmas en particular en Mycoplasmas animales íntimamente relacionados fenotípicamente y antigénicamente.

Con el fin de explicar la invención más claramente, se proporciona más abajo una lista de algunas realizaciones de la invención. Esta lista no restringe la invención exclusivamente a estas realizaciones.

A. Una realización de la invención es una proteína de M. mycoides subsp. mycoides SC que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 5 (precursor de LppQ, SEC ID NUM: 25), o partes del mismo, donde las partes se caracterizan preferiblemente por las secuencias de aminoácidos mostradas en la tabla 7 (LppQ madura, SEC ID NUM: 27), o la tabla 9 (LppQN', SEC ID NUM: 29). Asimismo son realizaciones de la invención el precursor de LppQ, la proteína LppQ madura y la mitad N-terminal de LppQ (LppQN').

B. Otra realización de la invención es una proteína como se describe en el apartado A, donde la secuencia de la proteína está precedida y/o seguida de 2 a 12 restos histidina, preferiblemente precedida por seis y/o seguido por diez restos histidina, respectivamente.

C. Una realización adicional de la invención es una proteína como se ha descrito en el apartado A que es una lipoproteína. Otra realización de la invención es una proteína como se ha descrito en el apartado A que es una glicoproteína. Semejante glicoproteína puede resultar de la expresión de un ADN como se describe en el apartado D en una célula huésped eucariótica.

D. Asimismo una realización de la invención es un ADN que codifica una proteína como se ha descrito en el apartado A, B o C, caracterizada preferiblemente por una secuencia de ADN como se muestra en la tabla 5 (gen del precursor de lppQ, SEC ID NUM: 24), tabla 6 (lppQ^{*}, SEC ID NUM: 26), o tabla 8 (lppQ^{*}N', SEC ID NUM: 28). El ADN puede ser ADN genómico, ADNc o ADN artificial.

E. Una realización de la invención es el uso de una proteína como se ha descrito en los apartados A, B o C en un método de diagnóstico para la detección directa o indirecta de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, preferiblemente donde el método de diagnóstico es un método inmunológico y se selecciona de un grupo que comprende la inmunotransferencia, los ensayos serológicos y ELISA.

F. Otra realización de la invención es el uso de una proteína como se ha descrito en los apartados A, B o C o un ADN como se ha descrito en el apartado D para la preparación de una vacuna contra la infección por Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC; la propia vacuna; y el uso de un ADN como se ha descrito en el apartado D para la preparación de células de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC vivas, atenuadas o inactivadas para utilizarlas como vacuna marcadora, donde dichas células carecen de capacidad para sintetizar la lipoproteína
LppQ.

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G. Asimismo una realización de la invención es un ADN como se ha descrito en el apartado D en un método de detección de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, preferiblemente donde el método de detección se selecciona del grupo formado por la PCR y los métodos de hibridación.

H. Una realización adicional de la invención es el uso de un ADN como se ha descrito en el apartado D para la expresión de una proteína como se ha descrito en el apartado A, B o C, un vector que comprende dicho ADN, y una célula huésped que comprende dicho vector o dicho ADN.

I. Una realización adicional de la invención es un procedimiento para la preparación de una proteína como se ha descrito en el apartado A, B o C, donde

(a): un vector que comprende el ADN descrito en el apartado D es introducido en una célula huésped adecuada;

(b): las células huésped son cultivadas en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína; y

(c): la proteína de la etapa (c) es aislada de las células huésped o el sobrenadante.

J. Asimismo una realización de la invención es un procedimiento para la preparación de un ADN caracterizado por la secuencia de ADN de la tabla 5 (SEC ID NUM: 25), donde

(a): un banco de ADN de ADN genómico de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC es clonado en un fago adecuado;

(b): el fago de la etapa (a) es utilizado para infectar células huésped adecuadas;

(c): las células huésped son rastreadas con sueros de un mamífero infectado con Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC;

(d): los clones positivos son seleccionados y purificados; y

(e): el ADN genómico del fago de la etapa (d) es aislado.

K. Una realización adicional de la invención es un procedimiento para la preparación de un ADN caracterizado por la secuencia de ADN de la tabla 6 (lppQ^{*}, SEC ID NUM: 26), o la tabla 8 (lppQ^{*}N', SEC ID NUM: 28), donde

(a): un ADN caracterizado por la secuencia de ADN de la tabla 5 (SEC ID NUM: 24) y grupos adecuados de cebadores según la tabla 3 (SEC ID NUM: 1 a 4 y 6 a 21) son aplicados en una PCR de extensión del solapamiento (OE PCR) dando como resultado un primer producto de PCR;

(b): el primer producto de la PCR de la OE PCR de la etapa (a) es aplicado en una o más OE PCR según se requiera por el número de mutaciones deseadas dando como resultado un producto de la PCR final; y

(c): el producto de la PCR final es aislado.

L. Asimismo una realización de la invención es un procedimiento para la detección de anticuerpos dirigidos a una proteína como se ha descrito en el apartado A, B o C en un fluido corporal de un animal, donde

(a): una proteína según el apartado A, B o C es transferida a una membrana adecuada;

(b): la membrana es incubada con dicho fluido corporal;

(c): la membrana es incubada con un producto conjugado marcado; y

(d): se inicia una reacción de color con el fin de detectar un complejo del anticuerpo del producto conjugado y los anticuerpos del fluido corporal dirigidos a la proteína,

preferiblemente donde el fluido corporal se selecciona del grupo formado por el suero y el fluido bronquial, la membrana es una membrana de nitrocelulosa o nailon y el producto conjugado está marcado con fosfatasa alcalina.

M. Otra realización de la invención es un procedimiento para la detección de anticuerpos dirigidos a una proteína como se ha descrito antes en los apartados A, B o C en un fluido corporal de un animal, donde

(a): una placa de microtitulación es recubierta con una proteína como se ha descrito en los apartados A, B o C;

(b): la placa de microtitulación es incubada con dicho fluido corporal;

(c): la placa de microtitulación es incubada con un producto conjugado marcado; y

(d): se inicia una reacción de color con el fin de detectar un complejo del anticuerpo del producto conjugado y anticuerpos del fluido corporal dirigidos a la proteína,

preferiblemente donde el fluido corporal se selecciona de un grupo que comprende suero y fluido bronquial y el producto conjugado está marcado con fosfatasa alcalina.

N. Además, una realización de la invención es un procedimiento para la detección de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, donde

(a): un par de cebadores de PCR adecuados para la detección de ADN mostrado en la tabla 5 (precursor de LppQ, SEC ID NUM: 24) es utilizado en una reacción de PCR con una muestra que va a ser sometida a ensayo; y

(b): tras la PCR es verificada la presencia del producto de PCR esperado con un par de cebadores de PCR adecuados,

preferiblemente donde el par de cebadores de PCR adecuados se selecciona del grupo que comprende los cebadores MMMSCO5-7 (SEC ID NUM: 22) y MMMSCO5-6 (SEC ID NUM: 23) como se muestra en la Tabla 3.

O. Una realización adicional de la invención es un anticuerpo monoclonal específico para una proteína según los apartados A, B o C.

P. Otra realización de la invención es un estuche de diagnóstico que contiene una proteína según los apartados A, B o C y/o al menos un anticuerpo según el apartado O en un recipiente adecuado.

Algunas de las realizaciones de la invención enumeradas antes se describen a continuación más detalladamente.

En la invención se incluyen también los fragmentos y variantes de LppQ. Los polipéptidos que se califican como variantes de LppQ pueden ser producidos, de acuerdo con la presente invención, mediante mecanismos genéticos inversos convencionales, es decir, diseñando una secuencia genética basada en una secuencia de aminoácidos o mediante mecanismos de empalme genético convencionales. Por ejemplo, las variantes de LppQ pueden ser producidas mediante mecanismos que implican mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis dirigida al oligonucleótido. Ver, por ejemplo, "Mutagenesis of Cloned DNA", en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 8.0.3 y sig. (Ausubel, y col. eds. 1989)("Ausubel").

Otras variantes de LppQ de la presente invención son moléculas que corresponden a una porción de LppQ, o a un fragmento de la misma, o que comprenden una porción de LppQ pero no coinciden con el polipéptido natural, ambos los cuales presentan la actividad inmunogénica de LppQ cuando se presentan solas, o alternativamente, cuando se unen a un portador. Una variante de LppQ de esta clase podría representar un fragmento real de la molécula natural o podría ser un polipéptido sintetizado de novo o recombinantemente.

En otra realización más, se preparan las variantes de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Estas pueden ser, por ejemplo, variantes menores de la secuencia de la proteína que se originan debido a una variación natural en la población de ese microorganismo a partir del cual se identifica la proteína, o pueden ser homólogos de una proteína encontrada en otros microorganismos. También pueden ser secuencias que no se producen naturalmente en la proteína pero que son suficientemente similares ya que provocan una respuesta inmune cuando se administran a un huésped. Las variantes de secuencia pueden ser preparadas mediante métodos normalizados de mutagénesis dirigida al
sitio.

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de la proteína pueden ser variantes por sustitución, inserción o deleción. La variantes por deleción carecen de uno o más restos de la proteína nativa que no son esenciales para la actividad inmunogénica. Otro tipo común de variante por deleción es la que carece de las secuencias señal secretoras o de las secuencias señal que dirigen a una proteína para unirse a una parte concreta de la célula.

Las variantes por sustitución típicas contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios de la proteína, y son diseñadas para modular una o más propiedades de la proteína tales como la estabilidad frente a la escisión proteolítica. Las sustituciones son preferiblemente conservativas, esto es, un aminoácido es remplazado por otro de forma y carga similar. Las sustituciones conservativas son bien conocidas en la técnica y entre ellas se incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina por serina; arginina por lisina; asparragina por glutamina o histidina; aspartato por glutamato; cisteína por serina; glutamina por asparragina; glutamato por aspartato; glicina por prolina; histidina por asparragina o glutamina; isoleucina por leucina o valina; leucina por valina o isoleucina; lisina por arginina, glutamina o glutamato; metionina por leucina o isoleucina; fenilalanina por tirosina, leucina o metionina; serina por treonina; treonina por serina; triptófano por tirosina; tirosina por triptófano o fenilalanina; y valina por isoleucina o
leucina.

Las variantes por inserción contienen proteínas de fusión tales como las utilizadas para permitir una rápida purificación de la proteína. Entre otras variantes por inserción se pueden incluir aquellas en las que se introducen aminoácidos adicionales dentro de la secuencia codificadora de la proteína. Estas son típicamente inserciones más pequeñas que las proteínas de fusión descritas antes y son introducidas, por ejemplo, para desorganizar un sitio de escisión de una proteasa.

En otra realización, son identificados los determinantes antigénicos principales de la proteína por medio de un enfoque empírico en el cual se expresan las porciones del gen que codifica la proteína en un huésped recombinante, y las proteínas resultantes se someten a ensayo en cuanto a su capacidad para proteger a los animales huésped de la sensibilización. Por ejemplo, se puede utilizar la PCR para preparar una gama de proteínas que carezcan sucesivamente de fragmentos más largos del extremo C de la proteína. La actividad inmunitaria de cada una de estas proteínas identifica después aquellos fragmentos o dominios de la proteína que son esenciales para esta actividad. Experimentos adicionales en los cuales se separan solamente un pequeño número de aminoácidos en cada interacción permiten después la localización de los determinantes antigénicos de la proteína.

Otra realización para la preparación de las proteínas de la invención es el uso de péptido miméticos. Los miméticos son moléculas que contienen péptidos que imitan los elementos de la estructura secundaria de la proteína. Ver, por ejemplo, Johnson y col. (1993). La base lógica subyacente al uso de péptido miméticos es que el esqueleto peptídico de las proteínas existe sobre todo para orientar las cadenas laterales de los aminoácidos de tal manera que faciliten las interacciones moleculares, tales como las del anticuerpo y el antígeno. Una proteína péptido mimético de la presente invención lograría, cuando se administrara a un huésped, una respuesta inmunitaria que conduciría al reconocimiento de la proteína de la célula huésped natural.

Las aplicaciones acertadas del concepto del péptido mimético han sido enfocadas hasta ahora de ese modo a miméticos de giros \beta de las proteínas, que se sabe que son altamente antigénicos. Del mismo modo, la estructura del giro \beta en una proteína de la invención puede ser pronosticada por medio de algoritmos con una base computarizada como se ha mencionado antes. Una vez que los aminoácidos componentes del giro han sido determinados, se pueden construir miméticos para lograr una orientación espacial similar de los elementos esenciales de las cadenas laterales de aminoácidos, como ha sido mencionado por Johnson y col., supra. El mimético puede ser conjugado después con una proteína portadora para su uso como vacuna.

En otra realización, se utiliza el análisis de la secuencia por ordenador para determinar la localización de los epítopos de los determinantes antigénicos principales pronosticados de la proteína recombinante. El soporte lógico capaz de llevar a cabo este análisis es fácilmente asequible comercialmente, por ejemplo MacVector (IBI, New Haven, CT). El soporte lógico utiliza típicamente algoritmos normalizados tales como los métodos de Kyte/Doolittle o Hoops/Woods para localizar secuencias hidrófilas que se encuentran característicamente sobre la superficie de las proteínas y, por lo tanto, es probable que actúen como determinantes antigénicos. Una vez que se realiza este análisis, se pueden preparar polipéptidos que contienen al menos los rasgos esenciales del determinante antigénico y pueden ser empleados en vacunas. Los genes que codifican estos determinantes pueden ser construidos e insertados en vectores de expresión mediante métodos normalizados, por ejemplo, utilizando la metodología de clonación por
PCR.

Como alternativa a los polipéptidos recombinantes, se pueden preparar péptidos sintéticos correspondientes a los determinantes antigénicos. Tales péptidos tienen una longitud de seis aminoácidos como mínimo, y pueden contener hasta aproximadamente 35 restos, que es el límite de longitud máxima aproximado de las máquinas de síntesis peptídica automáticas, tales como las asequibles de Applied Biosystems (Foster City, CA). El uso de tales péptidos pequeños en las vacunas requiere típicamente la conjugación del péptido con una proteína portadora inmunogénica tal como el antígeno de superficie de la hepatitis B. Los métodos para realizar esta conjugación son bien conocidos en la
técnica.

La invención también hace referencia a una vacuna. En una realización particularmente preferida, la vacuna comprende la proteína descrita en el apartado A, B o C o un fragmento de la misma, junto con un portador o coadyuvante y, cuando sea apropiado, sustancias coadyuvantes, para inmunizar al ganado frente a Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC.

Más generalmente, no obstante, la vacuna de la presente invención está destinada a la inmunización de un mamífero susceptible. Entre los mamíferos que son susceptibles a Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC además de la especie bovina se incluyen los grandes y pequeños rumiantes.

Tras la purificación hasta un grado aceptable (que es generalmente mayor del 50% del péptido o la proteína total), el antígeno puede ser administrado después a los animales en forma de una vacuna. En las realizaciones preferidas de la invención, los animales que van a ser inmunizados son ganado. Cuando sea apropiado, se pueden utilizar células completas en las vacunas. Por ejemplo se podrían utilizar células Sf9 o células CHO que expresen el antígeno recombinante directamente, en forma viva o muerta, para administrar el antígeno a los animales huésped. Alternativamente se pueden utilizar en las vacunas virus vivos que contengan secuencias de ácido nucleico que codifiquen los antígenos de la invención.

En la vacuna se puede incluir cualquier número de sustancias diferentes referidas como coadyuvantes, que se sabe que estimulan la porción apropiada del sistema inmune del animal vacunado. Entre los coadyuvantes adecuados para la vacunación de animales se incluyen pero no está limitados a, emulsiones en aceite tales como el coadyuvante completo o incompleto de Freund (no adecuado para su uso con ganado), Marcol 52:Montanide 888 (Marcol es una Marca registrada de Esso, Montanide es una Marca registrada de SEPPIC, Paris), escualano o escualeno, Coadyuvante 65 (conteniendo aceite de cacahuete, monooleato de manida y monoestearato de aluminio), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio y alumbre, tensioactivos tales como hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-N,N'-bis(2-hidroxietil)-propanodiamina, metoxihexadecilglicerol y polioles plurónicos, polianiones tales como pirano, sulfato de dextrano, ácido poliacrílico y carbopol, péptidos y aminoácidos tales como muramildipéptido, dimetilglicina, tuftsina y dimicolato de trealosa.

También se pueden administrar antígenos, productos de expresión y/o polipéptidos sintéticos de la presente invención tras la incorporación a liposomas u otros micro-portadores, o tras la conjugación con polisacáridos, proteínas o polímeros o combinados con Quil-A para formar "Isocom" (complejos inmunoestimuladores).

Las rutas de administración, las dosificaciones que se van a administrar, y la frecuencia de las inyecciones son todos factores que pueden ser optimizados utilizando el conocimiento práctico de la técnica. Típicamente, la vacunación inicial está seguida algunas semanas más tarde de una o más vacunaciones de "refuerzo", cuyo efecto neto es la producción de una respuesta inmunitaria celular y humoral vigorosa.

El método de inmunización de un mamífero contra CBPP implica la administración al mamífero de una cantidad eficaz del inmunógeno anterior. La administración puede implicar cualquier procedimiento bien conocido en la técnica. Se puede emplear cualquier ruta de inmunización que se pueda contemplar o mostrar que produce una respuesta inmunitaria apropiada, según la presente invención, aunque se prefiere la administración subcutánea. Entre las formas de administración adecuadas se incluyen las inyecciones parenterales, intracutáneas o intramusculares o las preparaciones adecuadas para la administración oral, nasal o rectal.

La presente invención también hace referencia a anticuerpos y antisueros para LppQ natural, fragmentos de LppQ, LppQ recombinante, o variantes de LppQ. Tales anticuerpos y antisueros se originan utilizando regímenes de vacunación normalizados en huéspedes apropiados. El huésped es vacunado al menos con un antígeno o vacuna de la presente invención, con o sin coadyuvante, para generar una respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria puede ser controlada, pro ejemplo, midiendo los niveles de anticuerpos producidos, utilizando métodos de ELISA normalizados.

En una realización preferida, se lleva a cabo la producción de antisueros policlonales utilizando ganado como huésped. Se toman muestras de sangre del huésped regularmente y se purifica cualquier fracción de anticuerpo purificada de la sangre mediante métodos normalizados, v.g., mediante cromatografía con proteína A o con proteína G. En una realización alternativa, el huésped es un ratón, y los hibridomas productores de anticuerpo monoclonal son preparados mediante métodos normalizados. Ver CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Coligan y col., (1991) c.2.5. Los anticuerpos monoclonales son preparados después a partir de las células de hibridoma mediante métodos normalizados.

La invención también hace referencia a un estuche de diagnóstico que contiene la proteína según el apartado A, B o C y preferiblemente al menos uno de los anticuerpos descritos antes en recipientes adecuados.

Los estuches de diagnóstico para la detección de la infestación por Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC son preparados proporcionando al menos uno de los anticuerpos preparados antes, junto con un patrón de control positivo de concentración conocida del antígeno de la presente invención. En una realización, el control positivo antigénico es LppQ recombinante o LppQN'. El formato del estuche se ajusta a un formato de diagnóstico normalizado tal como el formato de ELISA.

Algunos aspectos de la invención se explicarán ahora con más detalle con la ayuda de los Ejemplos, sin estar restringida a ellos.

Ejemplo 1 Identificación de LppQ

Con el fin de investigar las respuestas inmunitarias humorales y bronquiales en el ganado infectado por M. mycoides subsp. mycoides SC, se analizaron sueros y lavados bronquiales recogidos sucesivamente del ganado infectado experimentalmente por contacto con la cepa Africana Afadé o la cepa Europea L2 mediante inmunotransferencia (Abdo y col., 1998). Se identificaron varios antígenos inmunogénicos dominantes comunes con masas moleculares de 110, 95, 85, 80, 72, 62, 48 y 39 kDa. Los estudios revelaron - entre otras reacciones inmunitarias - una reacción inmunitaria temprana y persistente para una proteína de 48 kDa tanto en los sueros como en los lavados bronquiales de ganado infectado con la cepa Afadé, la cepa de referencia para la agrupación Africana de M. mycoides subsp. mycoides SC (Cheng y col., 1995), o la cepa L2, la cepa de referencia para la agrupación Europea (Cheng y col., 1995). Ahora se ha demostrado mediante el análisis de inmunotransferencia de antígenos de micoplasmas que están más íntimamente relacionados genética y antigénicamente con M. mycoides subsp. mycoides SC utilizando los mismos sueros que la de 48 kDa era específica para la especie M. mycoides subsp. mycoides SC (Tabla 1). El antígeno de 48 kDa es seleccionado por lo tanto como candidato para un antígeno específico, predominante y persistente para el presente desarrollo de serodetección de pleuropneumonía bovina contagiosa (CBBP) y/o para el desarrollo de los componentes de las vacunas contra CBBP.

Ejemplo 2 Identificación y clonación del gen lppQ

El gen lppQ que codifica la lipoproteína LppQ fue clonado construyendo un banco génico elaborado con ADN genómico digerido con Sau3AI de M. mycoides subsp. mycoides SC clonado en el vector \lambdaZAP-express® (Stratagene, La Jolla, CA, USA) seguido de empaquetamiento in vitro e infectando la cepa de E. coli compatible con los fagos recombinantes utilizando el estuche de empaquetamiento "Gigapack gold" (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Las placas del fago fueron rastreadas con sueros del ganado que había sido infectado experimentalmente con M. mycoides subsp. mycoides SC cepa Afadé (Abdo y col., 1998) utilizando un procedimiento normalizado para rastrear bancos génicos (Ausubel y col., 1990). Varios clones de fagos fueron transformados en clones de fagémidos utilizando el fago coadyuvante f1 según el protocolo del productor de \lambdaZAP-express® (Stratagene). Las secuencias de ADN de diversos clones fueron determinadas utilizando un analizador genético ABI Prism modelo 310 (Applied Biosystems/Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn, USA) y el soporte lógico para el ensamblaje de secuencias de ADN Sequencher 3.0 (GeneCode, Ann Arbor, MI, USA) para obtener secuencias contiguas. Un clon, el plásmido pJFFma5 mostraba un ORF que codificaba una lipoproteína característica de 48 kDa determinada por los parámetros descritos (Hayashi 1990). El gen que codificaba la lipoproteína de 48 kDa fue denominado lppQ (Tabla 5).

Ejemplo 3 Mutagénesis de los 9 codones del gen lppQ

Con el fin de intercambiar los codones UGA_{trp} específicos de Mycoplasma por los codones UGG_{trp} universales, se realizó la mutagénesis dirigida al sitio del gen lppQ, mediante el método descrito por Urban y col. (1997), utilizando los cebadores oligonucleotídicos enumerados en la Tabla 3 y el gen lppQ clonado en el plásmido pJFFma5 como molde. El gen sometido a mutagénesis con los codones UGG_{rp} es referido como lppQ^{*} (Tabla 6).

Ejemplo 4 Construcción de los plásmidos que expresan los péptidos LppQ con cola de poli-histidina

El plásmido pJFFmaLP48-MuHis1 que expresa lppQ con cola de poli-histidina (denominado LppQ-His) fue construido como sigue. El gen lppQ^{*} sometido a mutagénesis (Tabla 6) obtenido como se ha descrito antes fue utilizado como molde para la amplificación mediante PCR utilizando los cebadores oligonucleotídicos P48EcoR1 y P48B7r (Tabla 3) y la polimerasa Pwo. El gen amplificado fue sometido a digestión con enzimas de restricción utilizando EcoR1 y BamH1 y posteriormente ligado al correspondiente vector de clonación/expresión digerido pETHIS-1. El plásmido pJFFLP48-11 que expresaba la mitad N'-terminal con cola de poli-His de LppQ, denominado LppQN'-His, fue construido como sigue: El gen lppQ^{*} sometido a mutagénesis (Tabla 6) obtenido como se ha descrito antes fue utilizado como molde para la amplificación por PCR utilizando los cebadores oligonucleotídicos MMMLP481 y PMMML484 (Tabla 3) y la polimerasa Pwo. El fragmento del gen amplificado lppQ^{*}N' (Tabla 8) fue digerido con las enzimas de restricción Nde1 y BamH1 y con posterioridad ligado a los sitios de clonación correspondientes del vector de expresión pETHIS-1.

El plásmido pJFFmaLppQ-Cterm que expresaba la mitad C-terminal con cola de polihistidina de LppQ, denominado LppC'-His fue construido como sigue: el gen lppQ^{*} sometido a mutagénesis (Tabla 6) obtenido como se ha descrito antes fue utilizado como molde para la amplificación por PCR utilizando los cebadores oligonucleotídicos P48B1f y P48B7r (Tabla 3) y la polimerasa Pwo. El gen amplificado, denominado lppQ^{*}C' (Tabla 10) fue sometido a digestión con enzimas de restricción utilizando EcoR1 y BamH1 y con posterioridad ligado a los correspondientes sitios de clonación del vector de expresión pETHIS-1 digerido con EcoR1 y BamH1.

Ejemplo 5 Expresión de las proteínas marcadas con poli-histidina en E. coli especializada

Para la expresión de los tres péptidos LppQ con cola de poli-histidina, la cepa BL21 (DE3) (Stratagene) de E. coli fue transformada con los plásmidos pJFFmaLP48-MuHis1, pJFFLP48-11, o pJFFmaLppQ-Cterm (Tabla 4). La expresión y posterior purificación de los péptidos con cola de poli-histidina fueron obtenidas tras la inducción de los cultivos celulares en la fase de crecimiento semi-exponencial con IPTG y purificación utilizando la cromatografía de quelación con Ni^{2+} como describen con detalle Braun y col. (1999).

Ejemplo 6 Protocolos de Inmunotransferencia

Se realizaron inmunotransferencias como describen Ausubel y col. (1990). Se utilizaron suero o fluido de lavado bronquial de la infección descrita (Abdo y col., 1998). Las proteínas recombinantes purificadas (200 \mug/ml) fueron mezcladas con un volumen igual de tampón de muestra de SDS (Tris HCl 0,06 M pH 6,8, SDS al 2%, Glicerol al 10%, \beta-mercaptoetanol al 2%, azul bromofenol al 0,025%), y se hirvieron durante 5 minutos. Los antígenos fueron separados mediante geles de poliacrilamida para SDS-PAGE utilizando geles de poliacrilamida en gradiente al 5-15%, después fueron transferidos a una membrana de nitrocelulosa con un tamaño de poro de 0,2 \mum (Bio-Rad). La membrana fue bloqueada después con tampón con leche durante 1 hora a la temperatura ambiente (t.a.), se secó, y se cortó en tiras. Las tiras fueron incubadas con las muestras de suero durante 1 hora a la t.a., y lavadas 3 veces con TBS (Tris HCl 100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) durante 5 minutos. Las tiras fueron incubadas después 1 hora a la t.a. con productos conjugados marcados con fosfatasa alcalina, que fueron diluidos en tampón con leche. Los productos conjugados utilizados fueron a) Anticuerpo monoclonal (Mab) anti-IgG bovina (Sigma #A7554) diluido 1:5000, b) Ab policlonal anti-IgG de conejo o de ratón (Kirkegaard y Perry Gaithersburg, MD, USA) diluido 1:2000. Todas las tiras fueron lavadas 3 veces con tampón TBS. Se inició una reacción de color por medio de 0,3 mg/ml de nitroazul de tetrazolio (NBT) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), 0,15 mg de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) (Boehringer Mannheim) en tampón alcalino, y se detuvo con agua destilada.

Ejemplo 7 Método de PCR basada en el gen lppQ como sistema específico para la detección de M. mycoides subsp. mycoides SC

Se desarrolló un método de PCR específica que permitía la identificación del organismo M. mycoides subsp. mycoides SC basándose en el gen LppQ. Los cebadores específicos desarrollados fueron MMMSCO5-7 y MMMSCO5-6 (Tabla 3). Los parámetros de la PCR específica son: desnaturalización 94ºC, 30 seg.; recocido 48ºC, 30 seg.; elongación 72ºC, 1 min.; 35 ciclos. Esta PCR amplificaba un fragmento de 1304 pb específico de todas las cepas de M. mycoides subsp. mycoides SC sometidas a ensayo que eran originarias de los lugares más distantes de la tierra (Tabla 1). No se observaron ampliaciones con los otros organismos micoplásmicos relacionados (Tabla 1) en las mismas condiciones.

Ejemplo 8 Sistemas de detección inmunológica

Se produjo LppQN'-His recombinante (péptido N-terminal) a partir de la cepa JF979 y se purificó con posterioridad mediante cromatografía de quelación con Ni (Figura 6). LppQN'-His fue utilizado para recubrir placas de Microtitulación. El recubrimiento fue realizado mediante procedimientos normalizados (Nicolet y Martel 1996) utilizando 100 \mul de LppQ 10 \mug/ml en tampón de recubrimiento de carbonato (Na_{2}CO_{3} 0,1 M/NaHCO_{3} pH 9,6). Las placas de microtitulación recubiertas (conteniendo 1 \mug de LppQN' por pocillo) fueron utilizadas para realizar un ELISA indirecto de los sueros de diverso ganado con CBBP de diferentes países, sueros de ganado sano, sueros de ganado infectado experimentalmente y sueros de ganado sano incluyendo sueros que daban falso positivo con el ensayo de CF normalizado. Los datos preliminares de este ELISA se muestran en la Tabla 2. Los datos muestran que un ensayo ELISA basado en LppQN'-His es adecuado para una serodiagnosis específica y sensible para detectar animales con CBPP o animales que estaban infectados con M. mycoides subsp. mycoides SC.

Publicaciones

Abdo, E-M., Nicolet, J., Miserez, R., Goncalves, R., Regalla, J., Griot, C., Bensaide, A., Krampe, M. y Frey, J.: Humoral and bronchial immune responses en cattle experimentally infected con Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony type. Vet. Microbiol. 59 (1998) 109-122.

Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. y Struhl, K: Current protocols in molecular biology. John Wiley and Sons, Inc. (1990) Nueva York.

Braun, M., Kuhnert, P., Nicolet, J., Burnens, A.P., y Frey, J. (1999) Cloning and characterization of two bistructural S-layer-RTX proteins from Campylobacter rectus, J. Bacteriol. 181:2501-2506.

Campbell, A.D. y Turner, A.W.: Studies on contagious pleuropneumonia of cattle. IV. An improvement complement-fixation test. Aust. Vet. J. 29 (1953) 154-163.

Cheng, X., Nicolet, J., Pourmarat, F., Regalla, J., Thiacourt, F., y Frey, J. (1995) Insertion element IS1296 in Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony identifies a European clonal line distinct from African and Australian strains. Microbiology 141:3221-3228.

Coligan y col., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Eds. John Wiley, Nueva York, (1991) c. 2.5.

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Hayashi, S, Wu Hc.: Lipoproteins in bacteria: J. Bioenerg. Biomembr. 22(3):(1990) 451-471.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

3

4

\newpage

^{*} AAHL, Australian Animal Health Laboratory, Geelong, Vic., Australia; BVVG, Jena, Alemania; CIRAD, CIRAD-EMVT, Montpellier, Francia; FVLP, Facultad de Veterinaria, Universidad de Las Palmas, España; ICBBE, Institute for Veterinary Bacteriology, University of Berne, Suiza; LNV, Laboratorio Nacional de Veterinaria, Lisboa, Portugal; LPB Laboratorie de Pathologie Bovine; Lyon, Francia; NCTC, National Collection of Type Cultures, PHLS, Londres, Reino Unido; NVI, National Veterinary Institute, Uppsala, Suecia.

lppQ fue determinado mediante PCR y/o hibridación por transferencia Southern.

5

TABLA 3

Nombre	Secuencia (5' - - - - 3')	SEC	Temp^{A}	Uso^{B}	Const^{C}
		ID
		NUM
MMMLP481	CgccatatgCCATTAGTTGTTGTTTCATGTAAA	1	54ºC	SDM, C	2
MMMLP482	TCTTGTTTTTGCCACTCATTTTTTG	2	54ºC	SDM
MMMLP483	CAAAAAATGAGTGGCAAAAACAAGA	3	54ºC	SDM
MMMLP484	CcggatccCCAATTTGATAAAACTTGATTAAAGT	4	54ºC	SDM, C	2
P48B1f	AacgaattcAGTTTTATCAAATTGGAATACAGAAAAT	5	55ºC	SDM, C	3
P48B1r	CATTTGCTGTTTTCCAGCTCGATAAATC	6	55ºC	SDM
P48B2f	GTGATTTATCGAGCTGGAAAACAGCAAATG	7	55ºC	SDM
P48B2r	CATTACTTACATTCCAACTCGAAATAATCTT	8	55ºC	SDM
P48B3f	AAGATATTTCGAGTTGGAATGTAAGTAATG	9	55ºC	SDM
P48B3r	ATATTTTTTAGATTCCAATCTGAAAGTGAT	10	55ºC	SDM
P48B4f	ATCACTTTCAGATTGGAATCTAAAAAATAT	11	55ºC	SDM
P48B4r	CTTTTGATACATCCCAATCTAAAGACTTAT	12	55ºC	SDM
P48B5f	ATAAGTCTTTAGATTGGGATGTATCAAAAG	13	55ºC	SDM
P48B5r	TTTGAAACATTCCAATTAGTTATATTTTG	14	55ºC	SDM
P48B6f	TCAAAATATAACTAATTGGAATGTTTCAAAT	15	55ºC	SDM
P48B6r	ACATTATCAACTCTCCAATTTTTTATATCT	16	55ºC	SDM
P48B7f	AGATATAAAAAATTGGAGAGTTGATAATGTA	17	55ºC	SDM
P48B7r	CcggatccTACATTTTTTACATTCCAACTTGAAATATC	18	55ºC	SDM, C	1 \textamp 3
P48FBF	GTTTTATCAAATTGGAATACAGAAAATGTA	19	55ºC	SDM
P48FAL	TACATTTTCTGTATTCCAATTTGATAAAAC	20	55ºC	SDM
P48EcoRI	GcagaattcCCATTAGTTGTTGTTTCATGTAAA	21	55ºC	SDM, C	1
MMMSCO5-7	CTCTGAGAGGGAATAATG	22	48ºC	D
MMMSCO5-6	CAACCAAAGGCATCAATG	23	48	D

Las letras en cursiva minúsculas indican los nucleótidos que se habían añadido con el fin de crear un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción (subrayado) para la clonación

A): temperatura de recocido para la amplificación por PCR

B): SDM = mutagénesis dirigida al sitio, C = clonación, D = detección

C): 1 = lppQ^{*} clonado en pJFFmaLP48-MuHis1

: 2 = lppQ^{*}N' clonado en pJFFLP48-11

: 3 = lppQ^{*}C' clonado en pJFFMaLppQ-

TABLA 4

Cepa	Cepa Huésped	Plásmido	Péptido
JF2124	BL21(DE3)	pJFFmaLP48-MuHis1	LppQ-His
JF1979	BL21(DE3)	pJJFLP48-11	LppQN'-His
JF2199	BL21(DE3)	in pJFFmaLppQ-Cterm	LppQC'-His
JF1943	XL1-blue	pJFFma5	No (gen tipo salvaje)

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TABLA 5 Secuencia de nucleótidos del gel lppQ y secuencia de aminoácidos de la lipoproteína LppQ

Mycoplasma mycoides supbsp. Mycoides SC; cepa Afadé Gen lppQ, Lipoproteína Q; secuencia codificadora Codón genético: Mycoplasma (Nota: UGA es triptófano)

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7

8

9

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TABLA 6 Secuencia de nucleótidos del gen lppQ^{*} sintético que codifica LppQ de M. mycoides subsp. mycoides SC, (LppQ madura)

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11

La letras en negrita/cursiva muestran las mutaciones puntuales inducidas con el fin de obtener el codón UGG_{trp} universal

TABLA 7 Secuencia de aminoácidos de LppQ de M. mycoides subsp. Mycoides SC, (LppQ madura)

12

TABLA 8 Secuencia de nucleótidos del gen lppQ^{*}N' que codifica LppQN' de M. mycoides subsp. Mycoides SC, (porción N-terminal de LppQ)

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Las letras en negrita/cursiva muestran las mutaciones puntuales inducidas con el fin de obtener el codón universal UGG_{trp}

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TABLA 9 Secuencia de aminoácidos de LppQN' de M. mycoides subsp. Mycoides SC, (porción N-terminal de LppQ)

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TABLA 10 Secuencia de nucleótidos del gen lppQ^{*}C' sintético que codifica LppQC' de M. mycoides subsp. Mycoides SC, (porción C-terminal deLppQ)

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TABLA 11 Secuencia de aminoácidos de LppQC' de M. mycoides subsp. Mycoides SC, (porción C-terminal de LppQ)

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TABLA 12 Antigenicidad de la porción N' y C' de LppQ de M. mycoides subsp. mycoides SC

1: anti LppA-His de conejo (1:1000)

C	N	F
+	+	+

2. Suero de ganado con CBPP Italia (1:100)

C	N	F
-	+	+

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3. Suero de vaca #511 (1:100) 28 días antes de la infección por contacto*

C	N	F
-	-	-

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4. Suero de vaca #511 (1:100) 28 días después de la infección por contacto*

C	N	F
-	+	+

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5. Suero de vaca #511 (1:100) 134 días después de la infección por contacto*

C	N	F
-	+	+

Antígenos:
C:	LppQC'-His 1 \mug
N:	LppQN'-His 1 \mug
F:	LppA-His completo 0,3 \mug

^{*} infección experimental Abdo y col., 1998

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TABLA 13 Reactividad serológica de LppQN'-His recombinante con sueros recogidos sucesivamente de animales infectados por contacto con M. mycoides subsp. mycoides SC cepa L2 y Afadé (CBPP).

Infección experimental con la cepa Europea L2

Días después de la	64	70	92	100	105	112	119	126	169	196	224
infección por
contacto
Animal #502	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+
\begin{minipage}[t]{150mm} Nota: el animal \alm{1}502 era seronegativo antes del día 92 posterior a la infección determinado mediante el ensayo de CD (Abdo y col., 1998). \end{minipage}

B. Infección experimental con la cepa Africana Afa

Días después de la	-28	-7	7	21	28	35	49	77	98	126	134
infección por
contacto
Animal #511	-	-	-	-	+	+	+	+	+	+	+
\begin{minipage}[t]{150mm} Nota: el ensayo de CF del animal \alm{1}511 era negativo el día 21 y antes y ligeramente positivo (1/20) el día 28 (Abdo y col., 1998) \end{minipage}

Condiciones de inmunotransferencia:	Antígeno: 1 \mug LppQ/inmunotransferencia
	Dilución suero: 1:100
	Ver método: Abdo y col., 1998

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TABLA 14 Especificidad serológica de LppQN' para M. mycoides subsp. mycoides SC en ausencia de reacciones cruzadas con micoplasmas relacionados

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
LppQN'-His	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Las inmunotransferencias que contenían 1 \mug de LppQN'-His se hicieron reaccionar con suero hiperinmunitario de conejo o con suero de ganado

1: Suero de conejo (1:1000) contra M. mycoides subsp. mycoides SC (PG 1)

2: Suero de conejo (1:1000) contra M. mycoides sp. bovino grupo 7 (PG 50)

3: Suero de conejo (1:1000) contra M. capricolum subsp. capricolum (Calif kid)

4: Suero de conejo (1:1000) contra M. mycoides subsp. capri (PG3)

5: Suero de conejo (1:1000) contra M. capricolum subsp. caprupneumoniae (F38)

6: Suero de conejo (1:1000) contra M. putrifaciens

7: Suero de conejo (1:1000) contra M. mycoides subsp. mycoides LC (Y-cabra)

8: Suero de ganado (1:50) positivo para M. bovis (#68)

9: Suero de ganado (1:50) positivo para M. bovis (#4488/64)

10: Suero de ganado (1:50) positivo para M. bovis (#9/369)

11: Suero de ganado (1:50) positivo para M. bovis (#58/58)

17

18

<110> AKZO Nobel N.V.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Proteína antigénica LppQ de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, su preparación y uso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> OLI-99PRIO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgccatatgc cattagttgt tgtttcatgt aaa

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(25)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcttgttttt gccactgatt ttttg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(25)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaaaaatga gtggcaaaaa caaga

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(34)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggatcccc aatttgataa aacttgatta aagt

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(37)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacgaattca gttttatcaa attggaatac agaaaat

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(28)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catttgctgt tttccagctc gataaatc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgatttatc gagctggaaa acagcaaatg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cattacttac attccaactc gaaatatctt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagatatttc gagttggaat gtaagtaatg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatttttta gattccaatc tgaaagtgat

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcactttca gattggaatc taaaaaatat

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttttgatac atcccaatct aaagacttat

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataagtcttt agattgggat gtatcaaaag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(29)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttgaaacat tccaattagt tatattttg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(31)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaaaatata actaattgga atgtttcaaa t

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acattatcaa ctctccaatt ttttatatct

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(31)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agatataaaa aattggagag ttgataatgt a

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(38)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggatccta cattttttac attccaactt gaaatatc

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttatcaa attggaatac agaaaatgta

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacattttct gtattccaat ttgataaaac

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagaattcc cattagttgt tgtttcatgt aaa

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actctgagag ggaataatg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaccaaagg catcaatg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1335

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1335)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PEPTIDO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(445)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1185

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1185)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 395

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mycoplasma mycoides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PEPTIDO

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<222> (1)..(395)

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<400> 27

23

24

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<210> 28

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<211> 588

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<212> ADN

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<213> Mycoplasma mycoides

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<221> gen

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<222> (1)..(588)

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<400> 28

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25

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<210> 29

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<211> 196

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<212> PRT

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<213> Mycoplasma mycoides

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<221> PEPTIDO

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<222> (1)..(196)

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<400> 29

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26

27

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<210> 30

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<211> 627

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<212> ADN

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<213> Mycoplasma mycoides

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<221> gen

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<222> (1)..(627)

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<400> 30

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28

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<210> 31

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<211> 209

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<212> PRT

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<213> Mycoplasma mycoides

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<221> PEPTIDO

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<222> (1)..(209)

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<400> 31

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29

Claims

1. Una proteína de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides colonia pequeña (SC) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 25, o partes antigénicas de la misma.

2. Una proteína precursora LppQ aislada de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC caracterizada por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NUM: 25.

3. Una proteína aislada según la reivindicación 1, donde las porciones se caracterizan por la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 27 o la SEC ID NUM: 29.

4. La proteína LppQ madura aislada de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC caracterizada por la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 27.

5. La mitad N-terminal de la proteína LppQ madura de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC caracterizada por la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 29.

6. La proteína aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la proteína es una lipoproteína.

7. El ADN que codifica una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. El ADN según la reivindicación 7, caracterizado por la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NUM: 24, la SEC ID NUM: 26, o la SEC ID NUM: 28.

9. El uso de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un método de diagnóstico para la detección directa o indirecta de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC.

10. El uso según la reivindicación 9, donde el método de diagnóstico es un método inmunológico y se selecciona del grupo que comprende inmunotransferencia, ensayos serológicos y ELISA.

11. El uso de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 para la preparación de una vacuna contra una infección causada por Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC.

12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 para la preparación de células de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC vivas, atenuadas o inactivadas para utilizarlas como vacuna marcadora, donde dichas células carecen de capacidad para sintetizar la proteína LppQ.

13. El uso de un ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 en un método de detección de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC.

14. El uso según la reivindicación 13, donde el método de detección se selecciona del grupo formado por la PCR y los métodos de hibridación.

15. El uso de un ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 para la expresión de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

16. Un vector comprende un ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.

17. Un vector según la reivindicación 16, caracterizado porque dicho vector es el vector pJFFmaLP48-MuHis 1 consignado en la European Collection of cell Cultures, Salisbury, Witshire SP40JG.UK, con número de consigna: 99081025.

18. Una célula huésped que comprende un vector según la reivindicación 16 o 17, o un ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.

19. Un procedimiento para la preparación de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde

(a) un vector según las reivindicaciones 16 o 17 es introducido en una célula huésped adecuada;

(b) la célula huésped es cultivada en condiciones que permiten la expresión de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

(c) la proteína de la etapa (b) es aislada de la célula huésped o el sobrenadante.

20. Un procedimiento para la preparación de un ADN caracterizado por la secuencia de ADN de la SEC ID NUM: 25, donde

(a) un banco de ADN de ADN genómico de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC es clonado en un fago adecuado;

(b) el fago de la etapa (a) es utilizado para infectar células huésped adecuadas;

(c) las células huésped son rastreadas con sueros de un mamífero infectado con Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC;

(d) los clones positivos son seleccionados y purificados; y

(e) el ADN genómico del fago de la etapa (d) es aislado.

21. Un procedimiento para la preparación de un ADN caracterizado por la secuencia de ADN de la SEC ID NUM: 26, o la SEC ID NUM: 28, donde

(a) un ADN caracterizado porque comprende la secuencia de ADN de la SEC ID NUM: 24 y grupos de cebadores según las SEC ID NUMS: 1 a 4 y 6 a 21 son aplicados en una PCR de extensión del solapamiento (OE PCR) dando como resultado un primer producto de PCR;

(b) el producto de la PCR de la OE PCR de la etapa (a) es aplicado en una o más OE PCR según se requiera por el número de mutaciones deseadas dando como resultado un producto de la PCR final; y

(c) el producto de la PCR final es aislado.

22. Un procedimiento para la detección de anticuerpos dirigidos a una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un fluido corporal de un animal, donde

(a) una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 es transferida a una membrana adecuada;

(b) la membrana es incubada con dicho fluido corporal;

(c) la membrana es incubada con un producto conjugado marcado; y

(d) se inicia una reacción de color con el fin de detectar un complejo del anticuerpo del producto conjugado y los anticuerpos del fluido corporal dirigidos a una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

23. Un procedimiento para la detección de anticuerpos dirigidos a una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un fluido corporal de un mamífero, donde

(a) una placa de microtitulación es recubierta con una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;

(b) la placa de microtitulación es incubada con dicho fluido corporal;

(c) la placa de microtitulación es incubada con un producto conjugado marcado; y

(d) se inicia una reacción de color con el fin de detectar un complejo del anticuerpo del producto conjugado y anticuerpos del fluido corporal dirigidos a una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

24. Un procedimiento para la detección de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC, donde

(a) un par de cebadores de PCR adecuados para la detección de ADN según la SEC ID NUM: 24 es utilizado en una reacción de PCR con una muestra que va a ser sometida a ensayo; y

(b) tras la reacción PCR, es verificada la presencia del producto de PCR esperado con un par de cebadores de PCR adecuados.

25. Un procedimiento según la reivindicación 24, donde el par de cebadores de la PCR es seleccionado del grupo que comprende los cebadores de la SEC ID NUM: 22 y la SEC ID NUM: 23.

26. Un anticuerpo monoclonal específico para una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

27. Un estuche de diagnóstico que contiene una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o al menos un anticuerpo según la reivindicación 26 en un recipiente adecuado.

28. Una vacuna que comprende una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 contra la infección por Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC.