ES2256579T3 - Anticuerpos que estimulan la produccion de 1l-1ra. - Google Patents
Anticuerpos que estimulan la produccion de 1l-1ra.Info
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Abstract
Anticuerpo monoclonal de clase IgG que reacciona con el hapteno DNP y al menos un autoantígeno seleccionado de entre la miosina, la actina, la proteína básica de la mielina (MBP) y la tubulina, caracterizado porque induce una sobreexpresión de la IL-1Ra en los macrófagos o los monocitos.
Description
Anticuerpos que estimulan la producción de
IL-1Ra.
La presente invención se refiere a la utilización
de anticuerpos naturales de la clase IgG capaces de inducir una
elevada producción de IL-1Ra por parte de unos
monocitos o unos macrófagos y a la utilización de dichos anticuerpos
para el tratamiento de enfermedades inflamatorias o autoinmunes.
La IL-1 es una citoquina que
corresponde a dos proteínas (IL-1a y
IL-1b) que desempeñan una función clave en la
respuesta inflamatoria (Dinarello CA, Blood, 1996, 87; 2095, 2137).
Aunque la IL-1 es considerada como el producto de
macrófagos activados, también es sintetizada por células linfoides y
no linfoides como las células vasculares, epiteliales, cutáneas,
nerviosas, dendríticas, fibroblásticas y condrocitarias. Es
considerada como un mediador central de la respuesta del huésped a
la infección y a otras formas de traumatismos.
La IL-1 es una citoquina
multifuncional que actúa sobre una gran variedad de células del
sistema inmunitario pero también sobre otros sistemas celulares. La
IL-1 actúa directamente sobre el sistema nervioso
central, induce la inhibición de la secreción de insulina por las
células de los islotes pancreáticos y estimula las respuestas
inmunitarias celulares, humorales y naturales.
La IL-1\alpha y la
IL-1\beta actúan uniéndose a unos receptores de
superficie expresados en numerosas células y disparan una serie de
señales que producen efectos en la proliferación celular, la
apoptosis, la inducción de citoquinas, la producción de
prostaglandinas, la activación de receptores y la secreción de
enzimas de degradación. Existen dos receptores que interactúan con
la IL-1a y la IL-1b: el receptor de
tipo I (80 kd) expresado sobre las células T, los fibroblastos y las
células epiteliales, que requiere una interacción con la IL1RacP
(IL-1 accessory protein) para transmitir la señal y
el receptor de tipo II (67 kd) expresado sobre las células B, los
neutrófilos y los macrófagos que no puede transmitir la señal porque
falta la parte intracelular.
Un tercer miembro de la familia de la
IL-1, la IL-1Ra
(IL-1 receptor antagonist) actúa como antagonista
natural de la IL-1a y de la IL-1b e
interactúa con el receptor de la IL-1 del tipo I
pero no transduce la señal intracelular o una respuesta biológica.
Estas tres proteínas tienen en común entre 25 y 30% de los ácidos
aminados. La IL-1Ra se asocia mal al receptor del
tipo II.
La IL-1 es considerada como un
mediador de la defensa del huésped contra las infecciones pero
también contra numerosas patologías y un nivel elevado de
IL-1 circulante es correlativo con una variedad de
situaciones clínicas y en particular con el choque séptico. Su
actividad es regulada finamente a nivel de la transcripción,
traducción y secreción. Otros mecanismos reguladores utilizan la
acción de otras citoquinas, la diferencia de expresión de los
receptores a la IL-1 y la producción de inhibidor
natural como la IL-1-Ra.
Numerosos estudios experimentales y algunos
ensayos clínicos han demostrado la función protectora de la
IL-1Ra en un cierto número de patologías: choque
séptico, artritis reumatoide, el rechazo al injerto, ataque e
isquemia cardiaca.
La IL-1Ra puede actuar como
competidor de la IL-1 y por lo tanto representa un
agente terapéuticamente interesante. Los documentos WO 95/16706, WO
99/36541, WO 01/42305, WO 01/41792 y WO 01/42304 describen el
péptido IL-1Ra, unos péptidos mutados y su
utilización para el tratamiento de diversas patologías.
El documento EP 1 059 088 (LFB) describe una
fracción de IgG o IgM que reacciona con la miosina, la actina, la
tubulina y el DNP para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
Towbin et al, Journal of Inmunologicals Methods, vol 170 nº
1, 1994 describe la secreción de la IL-1Ra por los
monocitos humanos estimulados por unas IgG humanas. La patente US nº
4.464.465 describe la producción de anticuerpos monoclonales a
partir de linfocitos transformados por EBV.
Sin embargo, aunque los ensayos terapéuticos que
utilizan la IL-1RA recombinante soluble han
demostrado una buena eficacia de este producto en el choque séptico,
la artritis reumatoide y la GVH, las dosis necesarias muy elevadas y
la corta vida media de la IL-1Ra recombinante son
obstáculos para su utilización.
Desde ese momento, cualquier estrategia que tenga
como objeto estimular específicamente la producción de la
IL-1Ra y por lo tanto inhibir la actividad
inflamatoria de la IL-1 presenta un interés
terapéutico en el tratamiento de un cierto número de patologías
inflamatorias agudas o crónicas como la artritis reumatoide, la GVH
y otros.
La presente invención se refiere a la utilización
de anticuerpos capaces de estimular en gran medida la producción
in vitro (e in vivo) de la IL-1Ra
(Interleukin 1 receptor antagonist), pero no la de una citoquina
proinflamatoria, la IL-1b (Interleukin 1b y 1a).
Estos anticuerpos humanos de tipo IgG poseen la característica de
reconocer en ELISA unas proteínas de su naturaleza tales como la
actina, la miosina, la tubulina, el ADN o la proteína básica de la
mielina (MBP) pero no unos antígenos de las vacunantes como la
anatoxina tetánica. Son seleccionados también por su capacidad de
unirse al hapteno dinitrofenil o DNP.
\newpage
Estos anticuerpos pueden por lo tanto substituir
ventajosamente la IL-1Ra para todas las aplicaciones
terapéuticas y responden a los problemas indicados
anteriormente.
Así, en un primer aspecto, la invención se
refiere a unos anticuerpos naturales de clase IgG que reaccionan con
el hapteno DNP y al menos un autoantígeno seleccionado de entre la
miosina, la actina, la proteína básica de la mielina (MBP) y la
tubulina, caracterizado porque induce una sobreexpresión de la
IL-1Ra a nivel del ARNm y de la proteína
secretada.
El término "sobreexpresión" significa que la
tasa de expresión de la IL-1Ra es al menos 50%
superior a la tasa de las células no estimuladas por los anticuerpos
de la invención.
Por "anticuerpos naturales de clase IgG", se
entiende designar unos anticuerpos, unas fracciones o unas
subpoblaciones de anticuerpos o anticuerpos monoclonales que
presentan una reactividad frente a antígenos de su naturaleza. Las
subpoblaciones de IgG son preparadas a partir de Ig polivalentes o
de cualquier otra fracción intermedia obtenida durante el
procedimiento de fabricación de las IgIV de uso terapéutico.
Ventajosamente, dichos anticuerpos naturales no
reaccionan con la anatoxina tetánica y otros antígenos que no son de
su naturaleza.
Mas específicamente, presentan una reactividad
frente al hapteno DNP superior a 100, 125 ó 150 con respecto a los
IgIV, en particular con respecto a TEGELINE®. Además, estos
anticuerpos presentan una tasa de reactividad con respecto a al
menos un autoantígeno seleccionado de entre el ADN, la miosina, la
MBP, la actina y la tubulina superior a 50, 75 ó 100 con respecto a
las IgIV polivalentes, en particular con respecto a TEGELINE®. La
tasa de enriquecimiento puede ser calculada con respecto a la
actividad de las Ig polivalentes iniciales como valor de referencia
en el caso de subpoblaciones de IgG o con respecto a un anticuerpo
monoclonal de referencia en el caso en que el anticuerpo natural
sea un anticuerpo monoclonal.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
un procedimiento de preparación de una subpoblación de IgG definida
anteriormente, caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
- a)
- preparación de un soporte insoluble sobre el que se injerta DNP-lisina,
- b)
- adsorción de Ig polivalentes sobre el soporte obtenido en la etapa a),
- c)
- elución de las Ig retenidas sobre el soporte de manera que recojan la fracción que interactúa con el DNP,
- d)
- selección de las fracciones que presentan una reactividad frente a unos autoantígenos determinados, y
- e)
- selección de las fracciones que inducen la sobreexpresión de la IL-1Ra por los macrófagos o los monocitos.
El experto en la materia conoce el procedimiento
general de preparación de Ig polivalentes que comprende
esencialmente las siguientes etapas:
- -
- fraccionamiento del plasma procedente de un banco de donantes por precipitación, adsorción y filtración y seguidamente ultrafiltración (obtención de una primera fracción "PSO 1"),
- -
- tratamiento con pepsina a pH ácido, formulación, reparto y liofilización (obtención del producto TEGELINE®),
Evidentemente, las Ig polivalentes pueden ser
preparadas utilizando otros procedimientos.
En la actualidad, la tolerancia y la eficacia de
las IgG polivalentes comercializadas, en particular TEGELINE® (LBF,
Francia) son reconocidas en particular en el tratamiento del PTI, de
la enfermedad de Kawasaki y de la retinocoroiditis de tipo
"Birdshot", patologías para las cuales se han obtenido las
autorizaciones de comercialización de las AMM.
Se entiende por "Ig polivalentes" en el
marco de la invención, unas IgG polivalentes enteras, unos
fragmentos de IgG polivalentes tales como F(ab')2 o
F(ab) y todas las fracciones intermedias obtenidas durante el
procedimiento de fabricación de las IgIV polivalentes.
Se puede realizar la etapa a) mediante el injerto
de DNP-lisina sobre un soporte sólido, en particular
sobre un gel de Sepharose®, Trisacryl®, Affiprep®, Affigel®, geles
activados con CNBr, NHS o C_{5}H_{8}O_{2} (glutaraldehido).
Así, en el procedimiento, las IgG depositadas sobre el soporte
sólido obtenido en la etapa a) son adsorbidas o bien en forma de IgG
polivalentes puestas en solución después de la liofilización o de
IgG polivalentes en forma líquida, o bien en forma de fracciones
intermedias obtenidas durante un procedimiento de fabricación de
IgG polivalentes en tampón fosfato que comprende NaCl cuya
concentración puede variar entre 0 M y 3 M.
La elución de las IgG retenidas en la etapa b) se
realiza con un tampón de iones que disocian la unión entre las IgG y
el DNP, seleccionados en particular de entre los caótropos tales
como la glicina-HCl o el ioduro de sodio (NaI), en
unas condiciones que hacen variar el pH y/o la molaridad del
tampón.
La etapa d) comprende un test ELISA realizado
sobre un panel de autoantígenos seleccionados en particular de entre
el ADN, la actina, la miosina, la MPB y la tubulina o cualquier otro
antígeno de su naturaleza. Esta etapa puede comprender también una
medición de la reactividad para un antígeno vacunal, por ejemplo la
anatoxina tetánica, tomando la tasa de enriquecimiento con respecto
a la actividad de las Ig polivalentes iniciales como valor de
control.
Se seleccionan a continuación en la etapa e) unas
subpoblaciones que poseen las propiedades enunciadas anteriormente,
es decir unas subpoblaciones que inducen la sobreexpresión del ARNm
y de la proteína IL-1Ra por los macrófagos o los
monocitos. Se considera que existe sobreexpresión cuando se detecta
un aumento significativo de la expresión comparada con la expresión
de base observada naturalmente en los macrófagos o los monocitos
(por ejemplo un aumento superior al 50% o más, por ejemplo 100% ó
200%)
La invención se refiere asimismo a las
subpoblaciones susceptibles de ser obtenidas a partir de este
procedimiento.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de preparación de anticuerpos monoclonales definidos
anteriormente, caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
- a)
- transformación de los linfocitos B procedentes de la sangre de donante sano por el EBV,
- b)
- identificación de clones en cada pocillo de cultivo que secreta unas IgG capaces de reconocer el hapteno DNP y al menos un determinado autoantígeno por un test ELISA,
- c)
- amplificación de los clones identificados en la etapa b),
- d)
- purificación de los anticuerpos producidos por los clones de la etapa c) y,
- e)
- selección de los anticuerpos monoclonales que inducen la sobreexpresión de la IL-1Ra por los macrófagos o los monocitos humanos.
Para mejorar la estabilidad de la expresión de
las Ig naturales, los clones identificados en la etapa b) pueden ser
fusionados con un mieloma no secretor de Ig.
En este procedimiento, el autoantígeno puede ser
seleccionado de entre el ADN, la actina, la miosina, la proteína
básica de la mielina (MBP) y la tubulina.
En otro aspecto, la invención prevé los clones de
las células B transformadas por EBV seleccionados, fusionados o no
con un mieloma y amplificados mediante el procedimiento mencionado
anteriormente. Estos clones se caracterizan porque producen unos
anticuerpos monoclonales naturales y capaces de inducir la
sobreexpresión de la IL-1Ra por los macrófagos o los
monocitos.
La invención se refiere asimismo a los
anticuerpos monoclonales obtenidos mediante dichos clones. Dichos
anticuerpos son capaces de inducir la sobreexpresión de la
IL-1Ra por los macrófagos o los monocitos.
En un modo suplementario de realización, la
invención se refiere a una composición que comprende un anticuerpo
natural definido anteriormente (subpoblación de anticuerpos, o
anticuerpo monoclonal) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Ventajosamente, esta composición está adaptada a una administración
por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular.
La invención prevé asimismo la utilización de un
anticuerpo natural mencionado anteriormente para la preparación de
un medicamento. Preferentemente, este medicamento está destinado al
tratamiento y a la prevención de enfermedades inflamatorias. Puede
ser útil para el tratamiento y la prevención de la septicemia y de
los choques sépticos, para el tratamiento y la prevención de la
artritis, de la artritis reumatoide, de la poliartritis, de la
osteoporosis, de las enfermedades inflamatorias del intestino, de
las enfermedades autoinmunes, de los rechazos a los injertos, de las
isquemias, de los traumatismos, en particular de los traumatismos
del cerebro, de la psoriasis, de las dermatitis, de las restenosis,
de las enfermedades respiratorias, de las rinitis alérgicas, de las
alergias y del cáncer.
Figura 1: Capacidad inhibidora de TEGELINE® y de
la fracción anti-DNP sobre la proliferación de
linfocitos humanos estimulados en un cultivo linfocitario mixto
(CLM).
Figura 2 A-B-C:
Efecto de TEGELINE® y de la fracción anti-DNP obre
la producción de citoquinas por los PBL humanos estimulados en
CML.
Figura 3: Secreción de IL-1Ra por
unos macrófagos de ratones in vitro.
Figura 4: Producción de IL-1Ra
por las células THP1 estimuladas por diferentes dosis de TEGELINE® o
de la fracción anti-DNP.
Figura 5: capacidad inhibidora de TEGELINE® y de
los anticuerpos monoclonales anti-D sobre la
proliferación de linfocitos humanos estimulados en CML.
Figura 6 A-B: efecto de TEGELINE®
y de anticuerpos monoclonales anti-D sobre la
producción de citoquinas por unos PBL humanos estimulados en
CML.
Figura 7: Producción de IL-1Ra
por las células THPA estimuladas por diferentes dosis (25, 50, 100
\mug/ml) de anticuerpos monoclonales anti-D
| Anticuerpos monoclonales | Anti-DNP |
| D 41/96 | (+++) |
| D 32/97 | (+) |
| D 35/97 | (-) |
| D 83/97 | (-) |
Figura 8: Dosificación de IL-1Ra
en ELISA en el sobrenadante de cultivo de células THP1 estimuladas
por
25 \mug/ml de TEGELINE® o por IgG procedente de cultivos de células B EBV+C1 (DNP++) o C2 (DNP-)
25 \mug/ml de TEGELINE® o por IgG procedente de cultivos de células B EBV+C1 (DNP++) o C2 (DNP-)
Se ha demostrado anteriormente (FR 99/166632) que
el paso sobre un inmunoadsorbente NHS-Affiprep
acoplado a la DNP-lisina de una preparación de IVIg
(TEGELINE®, LFB) permite obtener por elución con ioduro de sodio
(NaI), un eluido que representa 0,13% de las IgG depositadas. Este
eluido posee una fuerte reactividad en ELISA para la
DNP-albúmina y para numerosos antígenos tales como
la actina, la miosina, el MBP, el ADN y la tubulina pero no para la
anatoxina tetánica (tabla 1).
| Tasa de enriquecimiento de la fracción anti-DNP con respecto a TEGELINE® | |||||||
| Ana. Teta. | F(ab')2 | DNP | Actina | Miosina | MBP | ADN | Tubulina |
| 4,8 \pm 2,2 | 4,5 \pm 1,3 | 235 \pm 100 | 158 \pm 64 | 110 \pm 33 | 94 \pm 66 | 26,0 \pm 17 | 238 \pm 108 |
Esta fracción anti-DNP es capaz
de inhibir entre diez y veinte veces más que las IgG de partida
(TEGELINE®) la proliferación de dos suspensiones de PBL humanos
incompatibles en CML (figura 1).
El análisis en ELISA de la presencia de varias
citoquinas en el sobrenadante de los CML demuestra que la secreción
de IFNg, de IL-4, de IL-10, de TNFa
y de TGFb es inhibida más fuertemente por la fracción
anti-DNP que por TEGELINE®. Por el contrario, la
fracción anti-DNP estimula muy fuertemente la
síntesis de la IL-1Ra (Figuras 2).
La incubación de 2 X 10^{6} macrófagos
peritoneales de ratones in vitro con la fracción
anti-DNP durante 24h, 48h y 72h provoca la
liberación de la IL-1Ra de ratón; por el contrario,
la incubación con TEGELINE® no tiene ningún efecto (figura 3).
La medición de la cantidad de los ARNm de la
IL-1Ra en las células THP1 (descendencias de células
monocitarias humanas) se ha realizado por PCR cuantitativo. El nivel
de expresión del ARNm de la IL-1Ra con respecto al
nivel de expresión del ARNm de la actina ha aumentado después de la
incubación de las células THP1 en presencia de la fracción
anti-DNP, pero no de TEGELINE® (tabla 2). La
expresión del ARNm de TNF\alpha aumenta también en presencia de la
fracción pero en menor medida.
| Muestras (dosificación por RT-PCR cuantitativa) | ARNm TNF\alpha/ARNm | ARNm IL-1RA/ARNm |
| \beta actina | \beta actina | |
| Células THP1 | 4 | 2 |
| Células THP1 (+ TEGELINE® 50 \mug/ml) | 1 | 9 |
| Células THP1 (+ fracción anti-DNP 50 \mug/ml) | 21 | 148 |
Asimismo, el sobrenadante de las células THP1
estimuladas por la fracción anti-DNP contiene una
cantidad importante de IL-1Ra mientras que a las
mismas concentraciones, el TEGELINE® no induce ninguna producción de
esta citoquina (figura 4).
Unos experimentos anteriores (patente nº 99
16632) habían demostrado que esta fracción anti-DNP
administrada in vivo protegía contra el desarrollo de la
poliartritis inducida por el colágeno, de la encefalomielitis
experimental autoinmune (EAE) inducida por la MBP en el rata y de la
diabetes en el ratón NOD.
Esta actividad protectora es superior después de
la inyección de las IgG anti-DNP con respecto a las
IgIV no fraccionadas. Estos anticuerpos naturales podrían
representar un tratamiento eficaz de ciertas patologías
inflamatorias.
Ejemplo
2.1
Una serie de anticuerpos monoclonales humanos
(Acm) han sido obtenidos después de la transformación por el virus
EBV de los linfocitos B procedentes de la sangre de donantes
inmunizados por unos glóbulos rojos Rh+. Estos anticuerpos son todos
del tipo IgG 1 y tienen la propiedad de aglutinar los glóbulos rojos
Rh+. Son por lo tanto específicos del antígeno D.
Catorce Acm anti-D han sido
ensayados por su capacidad de reconocer en ELISA el hapteno DNP y
los autoantigénicos descritos anteriormente.
Sobre los catorce Acm, sólo dos Acm D41 y D32
reconocen el DNP pero sólo el D41 se une a los autoantígenos pero no
a la anatoxina tetánica. Los otros Acm no reconocen ninguno de los
antígenos de manera superior a TEGELINE® (tabla 3).
| Muestras | Tasa de enriquecimiento de la actividad con respecto a TEGELINE® | |||||||
| Anatoxina | DNP-Alb | DNA | F(ab)'2 | Actina | Miosina | MBP | Tubulina | |
| D16/96 P1 | <0,1 | 2,7 | 4 | <0,1 | 1,86 | <0,1 | <0,1 | <0,1 |
| D39/96 P4 | <0,1 | 3,52 | 0 | <0,1 | 1,2 | <0,1 | <0,1 | <0,1 |
| D12/96 P5 | <0,1 | 2,28 | 0 | <0,1 | 3,1 | <0,1 | <0,1 | 1,69 |
| D12/96 P7 | <0,1 | 1,06 | 0 | <0,1 | 1,75 | <0,1 | <0,1 | <0,1 |
TABLA
(continuación)
| Muestras | Tasa de enriquecimiento de la actividad con respecto a TEGELINE® | |||||||
| Anatoxina | DNP-Alb | DNA | F(ab)'2 | Actina | Miosina | MBP | Tubulina | |
| D41/96 P6/1 | <0,1 | 213 | 400 | <0,1 | 119 | <0,1 | <0,1 | 133 |
| D32/97 P1 | <0,1 | 154 | 3,4 | <0,1 | 2,36 | <0,1 | <0,1 | <0,1 |
| D49/97 P3 | <0,1 | 0,38 | 0,04 | <0,1 | 0,43 | <0,1 | <0,1 | <0,1 |
| D35/97 P3 | <0,1 | 0,03 | 0 | <0,1 | 0,08 | <0,1 | <0,1 | <0,1 |
| D83/97 P4 | <0,1 | 0,29 | 0 | <0,1 | 0,09 | <0,1 | <0,06 | <0,1 |
| Df5/97 P6 | <0,1 | 0,19 | 0 | <0,1 | 0,17 | <0,1 | 0,36 | <0,1 |
| D83/97 P7 | <0,1 | 3,45 | 0 | <0,1 | 0,24 | <0,1 | <0,51 | <0,1 |
| D31/97 P8 | <0,1 | 4,15 | 2,75 | <0,1 | 3 | <0,1 | 0,71 | 2,18 |
| Pf210 | 0,16 | 8,8 | 8,4 | NT | 2,8 | 2,5 | 0,15 | 6,1 |
La capacidad de los Acm anti-D de
inhibir la proliferación de linfocitos humanos incompatibles en CML
es superior a la de TEGELINE® para todos los anticuerpos aunque
reaccionen o no con el DNP (figura 5).
El estudio de la liberación de citoquinas en el
sobrenadante de los CML demuestra que, únicamente los dos Acm D41 y
D32 que reaccionan con el DNP, provocan una síntesis acrecentada de
IL-1Ra proporcionalmente a su reactividad frente al
DNP (figura 6). La síntesis de otras citoquinas o bien disminuye
(IL-4) o bien no se modifica (INFg y TNFa) por los
Acm sea cual sea su reactividad (Figuras 6).
El sobrenadante de las células THP1 estimuladas
por el Acm D41 y D32 contiene una importante cantidad de
IL1-Ra mientras que a las mismas concentraciones, el
Acm D35 y D83 solamente inducen una débil producción de esta
citoquina (Figura 7).
Ejemplo
2.2
Unos linfocitos B procedentes de la sangre de
donantes sanos han sido transformados por el EBV y puestos en
cultivo a razón de 10^{5} células por pocillo. Los sobrenadantes
de los pocillos han sido ensayados para la presencia de IgG capaces
de reconocer en ELISA el hapteno DNP y la actina. Los cuatro
pocillos más positivos han sido reunidos (C1) y clonados por
dilución a 1.000, 100, 50 y 10 células por pocillo. Se ha utilizado
el mismo enfoque para seleccionar unos pocillos negativos en
actividad anti-DNP y actina (C2) (tabla 4).
| Muestras | Tasa de enriquecimiento de la actividad con respecto a TEGELINE® | ||||||
| Anatoxina | DNP-Alb | F(ab)'2 | Actina | Miosina | MBP | Tubulina | |
| Preparación 1 | 1,2 | 40 | 6,1 | 16 | 126 | 27 | 56 |
| C1 | |||||||
| Preparación 2 | 5,8 | 115 | 19 | 96 | 392 | 276 | 212 |
| Preparación 1 | 0 | 0,9 | 0 | 1,1 | 0 | 0 | 0 |
| C2 | |||||||
| Preparación 2 | 0,2 | 3,9 | 0,1 | 6,2 | 5 | 1,4 | 5,1 |
Las células de los pocillos C1 y C2 han sido
amplificadas para obtener unas cantidades de anticuerpos suficientes
para ser purificados sobre proteína G. Los anticuerpos obtenidos son
de tipo IgG y la tabla 4 presenta los resultados de dos
purificaciones realizadas a partir de los sobrenadantes extraídos a
D+7 (preparación 1) y D+14 (preparación 2) y muestran que las IgG
purificadas del pocillo C1 reconocen el DNP y son reactivas para un
cierto numero de autoantígenos. Por el contrario, las IgG del
pocillo C2 no poseen ninguna actividad enriquecida con respecto a
TEGELINE®.
Las IgG purificadas a partir de dos pocillos C1 y
C2 han sido incubadas a la dosis de 25 µg/ml en presencia de células
THP1. El crecimiento celular es inhibido en presencia de las IgG de
C1 pero no de C2 (datos no presentados) y únicamente las IgG de C1
estimulan la producción in vitro de IL-1Ra
mediante las células THP1 (Figura 8).
Las células de los pocillos C1 y C2 están en fase
de clonado a 0,5 células por pocillo para obtener unas IgG
monoclonales.
Todos estos resultados demuestran una correlación
positiva entre la reactividad de anticuerpos de tipo IgG frente a
varios autoantígenos y la capacidad acrecentada de inducir la
síntesis de IL-1RA, sean éstos policlonales o
monoclonales, mediante unos monocitos o unos macrófagos.
Claims (23)
1. Anticuerpo monoclonal de clase IgG que
reacciona con el hapteno DNP y al menos un autoantígeno seleccionado
de entre la miosina, la actina, la proteína básica de la mielina
(MBP) y la tubulina, caracterizado porque induce una
sobreexpresión de la IL-1Ra en los macrófagos o los
monocitos.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1,
caracterizado porque no reacciona con la anatoxina
tetánica.
3. Anticuerpo según una de las
reivindicaciones 1 y 2, que presenta una tasa de reactividad frente
al hapteno DNP superior a 100 con respecto a las IgIV, en particular
con respecto a TEGELINE®.
4. Anticuerpo según una de las
reivindicaciones 1 a 3, que presenta una tasa de reactividad al
menos frente a un autoantígeno seleccionado de entre la miosina, la
actina, el MBP y la tubulina superior a 50 con respecto a las IgIV
polivalentes, en particular con respecto a TEGELINE®.
5. Procedimiento de preparación de
anticuerpos monoclonales según las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- transformación de los linfocitos B procedentes de la sangre de donante sano por el EBV,
- b)
- identificación de clones en cada pocillo de cultivo que secreta unas IgG capaces de reconocer el hapteno DNP y al menos un determinado autoantígeno por un test de ELISA,
- c)
- amplificación de los clones identificados en la etapa b),
- d)
- purificación de los anticuerpos producidos por los clones de la etapa c) y,
selección de los anticuerpos monoclonales que
inducen la sobreexpresión de la IL-1Ra por los
macrófagos o los monocitos humanos.
6. Procedimiento según la reivindicación
5, caracterizado porque el autoantígeno es seleccionado de
entre el ADN, la actina, la miosina, la proteína básica de la
mielina (MBP) y la tubulina.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque los clones
identificados en la etapa b) son fusionados con un mieloma no
secretor de Ig.
8. Anticuerpo monoclonal susceptible de
ser obtenido a partir del procedimiento según una de las
reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque es capaz de
inducir la sobreexpresión de la IL-1Ra por los
macrófagos o los monocitos.
9. Clones de linfocitos B EBV
identificados y amplificados mediante el procedimiento según una de
las reivindicaciones 5 a 7, caracterizados porque producen
unos anticuerpos monoclonales capaces de inducir la sobreexpresión
de la IL-1Ra por los macrófagos o los monocitos.
10. Anticuerpo monoclonal obtenido por un
clon según la reivindicación 9, caracterizado porque es capaz
de inducir la sobreexpresión de la IL-1Ra por los
macrófagos o los monocitos.
11. Composición que comprende un anticuerpo
según una de las reivindicaciones 1 a 4, 8 y 10 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
12. Composición según la reivindicación 11,
caracterizada porque está adaptada a una administración por
vía intravenosa, subcutánea o intramuscular.
13. Procedimiento de preparación de una
subpoblación de IgG, caracterizado porque comprende las
siguientes etapas:
- a)
- preparación de un soporte insoluble sobre el que se ha injertado DNP-lisina,
- b)
- adsorción de Ig polivalentes sobre el soporte obtenido en la etapa a),
- c)
- elución de las Ig retenidas sobre la parte DNP unida al soporte de manera que se recoja la fracción que interactúa con el DNP,
- d)
- selección de las fracciones que presentan una reactividad frente a unos autoantígenos determinados, y
- e)
- selección de las fracciones que inducen la sobreexpresión de la IL-1Ra por los macrófagos o los monocitos a nivel del ARNm y de la proteína secretada.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque la etapa d) comprende una medición de la
reactividad para la anatoxina tetánica tomando la tasa de
enriquecimiento con respecto a la actividad de las Ig polivalentes
iniciales como valor de control.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 13 y 14, caracterizado porque la etapa d)
comprende un test ELISA realizado sobre un panel de autoantígenos
seleccionados en particular de entre el ADN, la actina, la miosina,
la proteína básica de la mielina (MBP) y la tubulina.
16. Procedimiento según un de las
reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque las Ig
depositadas sobre el soporte sólido obtenido en la etapa a) son
adsorbidas o bien en forma de IgG polivalentes liofilizadas y
puestas en solución o en forma líquida, o bien en forma de
fracciones intermedias obtenidas durante un procedimiento de
fabricación de IgG polivalentes en tampón fosfato que comprende NaCl
cuya concentración puede variar entre 0 M y 3M.
17. Utilización de una subpoblación de IgG
susceptible de ser obtenida mediante el procedimiento según una de
las reivindicaciones 13 a 16, para la fabricación de un medicamento
para inducir una sobreexpresión de la IL-1Ra en los
macrófagos o los monocitos.
18. Utilización según la reivindicación 17,
caracterizada porque la subpoblación de IgG se prepara a
partir de Ig polivalentes o cualquier otra fracción intermedia
obtenida durante el procedimiento de fabricación de las IgIV de uso
terapéutico.
19. Utilización de un anticuerpo monoclonal
según una de las reivindicaciones 1 a 4, 8 y 10, para la preparación
de un medicamento.
20. Utilización según la reivindicación 19,
para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y la
prevención de enfermedades inflamatorias.
21. Utilización según la reivindicación 19
para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y la
prevención de la septicemia y de los choques sépticos.
22. Utilización según la reivindicación 19,
para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y la
prevención de la artritis, la artritis reumatoide, la poliartritis,
la osteoporosis, las enfermedades inflamatorias del intestino, las
enfermedades autoinmunes, los rechazos de los injertos, las
isquemias, los traumatismos, en particular de los traumatismos del
cerebro, la psoriasis, las dermatosis, las restenosis, las
enfermedades respiratorias, las rinitis alérgicas, las alergias y el
cáncer.
23. Utilización según la reivindicación 17 ó
18, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y
la prevención de enfermedades inflamatorias, la septicemia y los
choques sépticos, la artritis, la artritis reumatoide, la
poliartritis, la osteoporosis, las enfermedades inflamatorias del
intestino, las isquemias, los traumatismos, en particular los
traumatismos del cerebro, la psoriasis, las dermatosis, las
restenosis, las enfermedades respiratorias, las rinitis alérgicas,
las alergias y el cáncer.
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