ES2256837T3 - Procedimientos y composiciones para el control de la traduccion de las proteinas del vch. - Google Patents
Procedimientos y composiciones para el control de la traduccion de las proteinas del vch.Info
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Abstract
LAS PRESENTACIONES DEL PRESENTE INVENTO HACEN RESALTAR METODOS Y COMPOSICIONES PARA CONTROLAR EL TRASLADO DE PROTEINAS Y PEPTIDOS VIRICOS A PARTIR DE ACIDOS NUCLEICOS VIRICOS, CON ESPECIAL APLICACION A PESTIVIRUS Y HCV. LOS METODOS Y COMPOSICIONES RESALTAN LOS ELEMENTOS DE CONTROL DE LA REGION 5''UT DEL GENOMA VIRICO.
Description
Procedimientos y composiciones para el control de
la traducción de las proteínas del VHC.
La invención se refiere a composiciones y
procedimientos para el control de la traducción de las proteínas del
virus de la hepatitis C (VHC). El VHC ha sido descrito como una
infección de transmisión sanguínea por un virus de hepatitis
distinto del VHA y del VHB (VNANB). De forma más específica, las
realizaciones de esta invención muestran composiciones y
procedimientos para el control y la regulación de la traducción del
VHC in vivo. Las composiciones y procedimientos tienen
aplicación para reducir o aumentar la replicación del VHC y reducir
o aumentar la expresión de las proteínas del VHC.
El aislamiento prototipo del VHC ha sido
caracterizado en las publicaciones EPO nº 318216 y nº 388232. El
término "VHC", como se usa en este documento, incluye nuevos
grupos, genotipos y aislamientos de la misma especie vírica. El
término "VHC-1" se usa en el mismo sentido que
en la publicación EPO nº 318216.
El VHC es una enfermedad transmisible que se
distingue de otras formas de enfermedades hepáticas asociadas con
virus, incluyendo las causadas por los virus de hepatitis conocidos,
es decir, el virus de la hepatitis A (VHA), el virus de la hepatitis
B (VHB), el virus de la hepatitis delta (VHD), así como las
hepatitis inducidas por citomegalovirus (CMV) o el virus de
Epstein-Barr (VEB). El VHC se identificó
inicialmente en individuos receptores de transfusiones de sangre.
Una hepatitis post-transfusional (HPT) se produce en
aproximadamente el 10% de los pacientes receptores de transfusiones
y el VHC es responsable en hasta el 90% de estos casos. La
enfermedad progresa frecuentemente hasta una lesión hepática crónica
(25-55%).
Actualmente existe una gran necesidad de control
del proceso de traducción respecto a los ácidos nucleicos víricos.
El control del proceso de traducción puede constituir una terapia
efectiva para las enfermedades víricas. A modo de ejemplo, sin
limitación, la capacidad de reducir la expresión de las proteínas
víricas puede limitar la enfermedad. La capacidad de aumentar la
expresión de las proteínas víricas in vivo puede dar lugar a
una fuerte estimulación inmune. La capacidad de aumentar la
expresión de las proteínas víricas puede producir también mayores
cantidades de proteínas víricas que pueden purificarse más
fácilmente.
El genoma del VHC comprende una cadena sencilla
positiva de ARN. En la figura 1 se muestra una representación
esquemática del genoma del VHC. El genoma del VHC posee un marco de
lectura abierto ("open reading frame", ORF) traduccional
continuo que codifica una poliproteína de aproximadamente 3000
aminoácidos. En la ORF, la(s) proteína(s)
estructural(es) parece estar codificada en aproximadamente la
primera cuarta parte de la región N-terminal, siendo
el resto de la poliproteína responsable de la codificación de
proteínas no estructurales.
El genoma del VHC tiene un área en el extremo 5'
para la que no se conoce la traducción de ninguna proteína o
polipéptido. La región se denomina la región 5' no traducida
("untranslated") (región 5'UT o 5'UTR) o la región líder
5'.
La región 5'UT contiene hasta 5 ORFs secuencia
arriba, de las cuales las primeras cuatro se solapan en
VHC-1, el aislamiento prototipo del VHC (Choo y
col., "Genetic organization and diversity of the hepatitis C
virus" (Organización genética y diversidad del virus de la
hepatitis C), Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991)
88:2451-2455; Han y col., "Characterization of
terminal regions of hepatitis C viral RNA: Identification of
conserved sequences in the 5' untranslated region and poly(A)
tails at the 3' end" (Caracterización de las regiones terminales
del ARN vírico de la hepatitis C: identificación de secuencias
conservadas en la región 5' no traducida y en las colas de
poli(A) del extremo 3'), Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991)
88:1711-1715). La región 5'UT es homóloga en
secuencia de nucleótidos a los pestivirus (Han y col.).
El análisis de extensión de cebador ha revelado
que en muestras derivadas de pacientes infectados existen dos
especies principales de ARN del VHC (Han y col.). Una de las
especies es de mayor longitud y se supone que es ARN genómico de
longitud completa. El RNA genómico de longitud completa tiene un
extremo 5' para el que se predice la formación de una estructura de
horquilla (Han y col.; Inchauspe y col., "Abstract, Third
International Symposium on HCV" (Resumen, tercer simposio
internacional sobre VHC), V. 19, Estrasburgo, Francia, 1991; Okamoto
y col. "Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C
virus isolated from a human carrier: Comparison with reported
isolates for conserved and divergent regions" (Secuencia
nucleotídica del ARN genómico del virus de la hepatitis C aislado
de un huésped humano: comparación con aislamientos descritos en
cuanto a regiones conservadas y divergentes), J. Gen. Virol. (1991)
72:2697-2704. La otra especie es de menor longitud,
supuestamente un ARN subgenómico 5', cuyo extremo 5' comienza a 145
nucleótidos del extremo 5' del ARN de mayor longitud
(Han y col.).
(Han y col.).
Moléculas polinucleotídicas antisentido para el
VHC se describen de forma general en la publicación EP nº
388232.
La presente invención muestra composiciones y
procedimientos para el control de la traducción de las proteínas del
VHC a partir del ácido nucleico del VHC. La invención se basa en el
uso de ácidos nucleicos complementarios de una pequeña región del
extremo 5' de ARN del VHC. Una realización de la presente invención
muestra un procedimiento de control de la traducción de las
proteínas del VHC a partir del ácido nucleico del VHC que comprende
la etapa de puesta en contacto de un primer ácido nucleico que no
existe de forma natural con el ácido nucleico del VHC bajo
condiciones de hibridación. El primer ácido nucleico es un ácido
nucleico antisentido: tiene una secuencia sustancialmente
complementaria de una secuencia de la cadena codificante dentro de
la región 5'UT del ácido nucleico del VHC, que se extiende entre las
bases 277 a 300. La cadena codificante es la cadena del ARN genómico
o mensajero sujeta al proceso de traducción. El primer ácido
nucleico se pone junto con el ácido nucleico del VHC bajo
condiciones en las que ambos ácidos nucleicos son capaces de formar
un producto de hibridación, alterando este producto de hibridación
el nivel de traducción del ácido nucleico del VHC.
El procedimiento puede usarse en células para
generar proteínas víricas de interés in vitro.
Por consiguiente, en un aspecto de la invención
se proporciona un procedimiento in vitro para el control de
la traducción de las proteínas del virus de la hepatitis C (VHC) a
partir del ácido nucleico del VHC que comprende las etapas: (a)
proporcionar un primer ácido nucleico que no existe de forma
natural, en que este primer ácido nucleico comprende una secuencia
complementaria de una cadena codificante dentro de la región 5'UT
del ácido nucleico del VHC, que se extiende entre las bases 277 a
300 con referencia a la secuencia con número de identificación (ID
SEC Nº):1; y (b) poner en contacto dicho ácido nucleico del VHC con
dicho primer ácido nucleico bajo condiciones en las que dichos
primer ácido nucleico y ácido nucleico del VHC son capaces de
formar un producto de hibridación, alterando dicho producto de
hibridación el nivel de traducción de dicho ácido nucleico del
VHC.
En otro aspecto, esta invención se refiere a una
composición y al uso de ésta para el control de la traducción de las
proteínas del VHC a partir del ácido nucleico del VHC, comprendiendo
esta composición un primer ácido nucleico, o los medios para
preparar un primer ácido nucleico, con una secuencia complementaria
de una secuencia de la cadena codificante dentro de la región 5'UT
del ácido nucleico del VHC, que se extiende entre las bases 277 a
300 con referencia a ID SEC Nº: 1. Preferentemente la secuencia del
primer ácido nucleico es ID SEC Nº: 2.
En otro aspecto de esta invención, se proporciona
un procedimiento in vitro para el control de la traducción de
las proteínas del VHC a partir del ácido nucleico del VHC que
comprende las etapas: (a) proporcionar un primer ácido nucleico que
no existe de forma natural con una secuencia complementaria de la
secuencia dentro de la región 5'UT del VHC que se extiende entre las
bases 277 y 300 con referencia a ID SEC Nº: 1; y (b) poner en
contacto dicho ácido nucleico del VHC con dicho primer ácido
nucleico bajo condiciones en las que dichos primer ácido nucleico y
ácido nucleico del VHC son capaces de formar un producto de
hibridación, alterando dicho producto de hibridación el nivel de
traducción de dicho ácido nucleico del VHC. En otro aspecto, el
procedimiento comprende además la transcripción de un segundo ácido
nucleico que no existe de forma natural que comprende un promotor
ligado operativamente a una secuencia complementaria de dicho primer
ácido nucleico. El procedimiento se puede usar también para impedir
la expresión de las proteínas del VHC en células que no han sido
infectadas por el VHC, pero que pueden sufrir infección en algún
momento en el futuro (células "susceptibles").
La figura 1 es una representación esquemática
del genoma vírico del VHC;
la figura 2 es una representación esquemática
del genoma de ARN vírico del VHC, en la que dicho genoma de ARN
vírico se ha modificado incluyendo las secuencias de ARNm para
cloranfenicol acetiltransferasa (CAT);
la figura 3 es una representación esquemática
del genoma modificado de ARN vírico del VHC con otras deleciones y
modificaciones;
la figura 4 es una representación esquemática de
cinco construcciones de ARN, pSV_{2}CAT, SVCAT, SV*CAT, pT7EMCAT y
EMCVCAT;
la figura 5 es una representación esquemática de
tres construcciones de ARN, pCMV(CAT/SV40/LacZ)
pCMV(CAT/VHC/LacZ) y pCMV(CAT/polio/LacZ);
la figura 6 representa gráficamente la actividad
de las construcciones con LacZ y LacZ/CAT de la figura 5; y
la figura 7 muestra los resultados de los
efectos de las moléculas antisentido AS5 en la transcripción de
R6.
La presente invención se describirá en detalle
como procedimientos y composiciones para el control de la traducción
del ácido nucleico del VHC. Las composiciones y procedimientos se
discutirán en detalle con respecto al ácido nucleico del VHC.
La práctica de la presente invención empleará, a
no ser que se indique de otra manera, técnicas convencionales de
química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e
inmunología que pertenecen a la competencia en la materia. Estas
técnicas se explican en detalle en la bibliografía. Véase por
ejemplo, Sambrook, Fitsch y Maniatis, "Molecular Cloning; A
Laboratory Manual" (Clonación molecular: un manual de
laboratorio) (1989); "DNA cloning" (Clonación de ADN),
volúmenes I y II (D.N. Glover, ed. 1985); "Oligonucleotide
Synthesis" (Síntesis de oligonucleótidos) (M.J. Gait, ed. 1984);
"Nucleic Acid Hybridization" (Hybridación de ácidos nucleicos)
(B.D. Hames y S.J. Higgins, eds. 1984); la serie "Methods in
Enzymology" (Métodos en enzimología) (Academic Press, Inc.),
particularmente vol. 154 y vol. 155 (Wu y Grossman, eds.).
Definiciones:definiciones de términos
seleccionados se establecen a continuación para facilitar la
comprensión de la invención. El término "correspondiente"
significa homólogo o complementario de una secuencia particular de
un ácido nucleico. Como entre ácidos nucleicos y péptidos,
correspondiente se refiere a los aminoácidos de un péptido en un
orden derivado de la secuencia del ácido nucleico o de su
complemento.
La expresión "ácido nucleico que no existe de
forma natural" se refiere a una porción de ácido nucleico
genómico, ADNc, ácido nucleico semisintético o ácido nucleico de
origen sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no
está asociado con ningún ácido nucleico con el que está asociado en
la naturaleza, (2) está ligado a un ácido nucleico o a otro agente
químico distinto de aquel con el que está ligado en la naturaleza, o
(3) no existe en la naturaleza.
Como se usa en este documento, los términos
"polinucleótido", "oligonucleótido" y "ácido
nucleico" son términos genéricos para polidesoxirribonucleótidos
(con
2-desoxi-D-ribosa),
para polirribonucleótidos (con D-ribosa), para
cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un
N-glicósido de una base purina o pirimidina y para
otros polímeros con esqueletos no nucleotídicos (por ejemplo, ácidos
nucleicos proteínicos y polímeros sintéticos de ácidos nucleicos de
secuencia específica, comercializados por Anti-Gene
Development Group, Corvallis, Oregon, como polímeros Neugene®) o
enlaces no estándar, siempre que los polímeros contengan nucleobases
en una configuración que permita el apareamiento de las bases y el
apilamiento de las bases, como se encuentra en el ADN y el ARN. No
se pretende una distinción en longitud entre los términos
"polinucleótido" y "oligonucleótido" y estos términos se
usarán de forma intercambiable. Estos términos se refieren solamente
a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, estos términos
incluyen ADN bi- y monocatenario, así como ARN bi- y monocatenario e
híbridos ADN:ARN, y también incluyen tipos conocidos de
modificaciones, por ejemplo, marcadores conocidos en la materia,
metilación, caperuzas, sustitución de uno o varios de los
nucleótidos presentes de forma natural por un análogo,
modificaciones internucleotídicas como, por ejemplo, aquellas con
enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres,
fosforamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por
ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas que
contienen fracciones laterales como, por ejemplo, proteínas
(incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal,
poli-L-lisina, etc.), aquellas con
intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.) aquellas
que contienen agentes quelantes (por ejemplo, metales, metales
radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellas que contienen
agentes alquilantes, aquellas con enlaces modificados (por ejemplo,
ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas sin
modificar del polinucleótido u oligonucleótido.
Se apreciará que, como se usa en este documento,
los términos "nucleótido", "nucleósido" y "ácido
nucleico" incluirán aquellas fracciones que contienen no sólo las
bases purinas y pirimidinas conocidas, sino también otras bases
heterocíclicas que hayan sido modificadas. Tales modificaciones
incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas
aciladas, u otros heterociclos. Nucleótidos o nucleósidos
modificados incluirán también modificaciones en el azúcar, por
ejemplo, cuando se sustituye uno o varios de los grupos hidroxilo
por halógenos, grupos alifáticos o se funcionalizan como éteres,
aminas u otros similares.
Organización del genoma del VHC: las
genotecas de ADNc del VHC derivan de secuencias de ácidos nucleicos
presentes en el plasma de un chimpancé o de un humano infectados por
el VHC. La construcción de una de estas genotecas, la genoteca
"c" (ATCC nº 40394) se describe en la publicación PCT nº
WO90/14436. Las correspondientes secuencias de ADN de importancia
para la presente invención se establecen en este documento como ID
SEC
Nº: 1.
Nº: 1.
La región 5'UT tiene una longitud de
aproximadamente 341 nucleótidos, basada en al menos 5 clones de
supuesta longitud completa del VHC descritos hasta la fecha (Han y
col.; Inchauspe y col.; Okamoto y col.). A diferencia de la región
de la poliproteína, la región 5'UT de los aislamientos del VHC está
muy conservada. Como se observa en la figura 2, la región 5'UT
contiene hasta cinco ORFs secuencia arriba, de las cuales las cuatro
primeras se solapan en VHC-1, el aislamiento
prototipo del VHC (Choo y col.; Han y col.). La región 5'UT es
sustancialmente homóloga en secuencia de nucleótidos a los
pestivirus (Han y col.). Por tanto, la discusión sobre la regulación
de la traducción del ácido nucleico del VHC se puede aplicar a otros
pestivirus.
El análisis de extensión de cebador ha revelado
dos especies principales de ARN del VHC (Han y col.). Una de las
especies es de mayor longitud y se supone que es ARN genómico de
longitud completa. Para el extremo 5' del ARN genómico de longitud
completa se predice la formación de una estructura de horquilla (Han
y col.; Inchauspe y col.; Okamoto y col.). El extremo 5' del ARN
subgenómico de menor longitud comienza a 145 nucleótidos del extremo
5' del RNA de mayor longitud (Han y col.).
Ácidos nucleicos: Las realizaciones de la
presente invención muestran ácidos nucleicos que pueden
interaccionar con distintos elementos de control en cis del
VHC y, por lo tanto, pueden bloquear, reprimir o potenciar la
traducción del ácido nucleico del VHC.
Una realización de la presente invención muestra
un procedimiento para el control de la traducción de las proteínas
del VHC a partir del ácido nucleico del VHC que comprende la etapa
de poner un primer ácido nucleico que no existe de forma natural
junto con el ácido nucleico del VHC. El primer ácido nucleico tiene
una secuencia complementaria de una secuencia en la cadena
codificante dentro de la región 5'UT del ácido nucleico del VHC, que
se extiende entre las bases 277 y 300 con referencia a ID SEC Nº: 1.
El primer ácido nucleico se pone junto con el ácido nucleico del VHC
bajo condiciones en las que el primer ácido nucleico es capaz de
formar un producto de hibridación y alterar el nivel de traducción
el ácido nucleico del VHC.
Preferentemente, el ácido nucleico antisentido de
esta invención es ARN, ADN o un ácido nucleico modificado. Ejemplos,
sin limitación, de ácidos nucleicos modificados son derivados
sulfurados o con tiofosfato de los ácidos nucleicos, resistentes a
la degradación, y amidas polinucleosídicas (publicación PCT nº
WO91/16331 a Stec y col.; publicación PCT nº WO88/07544 a Zon y
col.; P.E. Nelsen y col., Science (1991)
254:1497-1500; M. Egholm, JACS (1992)
114:1895-1897). Modificaciones preferidas
particularmente del diseño de los ácidos nucleicos antisentido de la
presente invención son modificaciones diseñadas para: (1) aumentar
la estabilidad intracelular del ácido nucleico; (2) aumentar la
permeabilidad celular del ácido nucleico; (3) aumentar la afinidad
del ácido nucleico por la cadena codificante, o (4) reducir la
toxicidad (si existe) del ácido nucleico. Muchas de estas
modificaciones son conocidas en la materia, como se describe en
"Atisense research and applications" (Investigaciones sobre
antisentido y aplicaciones) (S.T. Crooke y B. Lebleu, eds., CRC
Press, 1993). Por tanto, los ácidos nucleicos pueden contener bases,
azúcares o enlaces alterados o modificados, ser administrados
mediante sistemas especializados como liposomas o terapia génica, o
pueden contener fracciones asociadas. Estas fracciones asociadas
incluyen fracciones hidrófobas como lípidos, que aumentan la
interacción con las membranas celulares, o fracciones policatiónicas
como polilisina, que actúan como neutralizadores de carga del
esqueleto de fosfato. Como lípidos que pueden estar asociados se
prefiere particularmente colesteroles. Las fracciones pueden estar
asociadas a los extremos 3' o 5' de los ácidos nucleicos y también
pueden estar asociadas a través de una base, un azúcar o un enlace
inter-
nucleosídico.
nucleosídico.
Otras fracciones pueden ser grupos caperuza
colocados específicamente en los extremos 3' o 5' de los ácidos
nucleicos para impedir la degradación por exonucleasas. Estos grupos
caperuza incluyen, pero no se limitan a, grupos protectores de
hidroxilo conocidos en la materia, incluyendo glicoles como
polietilenglicoles, tetraetilenglicol y otros similares.
El ácido nucleico preferido designado "AS5"
es capaz de unirse a una región que solapa con la caja de homología
IV de los pestivirus que se extiende entre las bases 277 y 300 de ID
SEC Nº: 1. En una realización preferida de esta invención el ácido
nucleico AS5 está completamente fosforotioado, es decir, sólo
contiene enlaces fosforotioato en lugar de los enlaces fosfodiéster
naturales. En otra realización preferida de esta invención el ácido
nucleico AS5 está unido covalentemente a una fracción de colesterol,
con mayor preferencia a través del extremo 3' del nucleósido.
Administración del ácido nucleico: el
ácido nucleico puede introducirse en la célula por cualquiera de los
modos conocidos en la materia. Las células se pueden transfectar con
un segundo ácido nucleico capaz de generar el primer ácido nucleico
como producto de transcripción; por ejemplo, incluyendo el segundo
ácido nucleico en un vehículo vírico como se muestra en Dulbecco,
patente US nº 4593002; o por procedimientos de terapia génica, tales
como incluir el segundo ácido nucleico en un vector retrovírico. Un
ejemplo de terapia génica antisentido se describe en un artículo de
Mukhopadhyay y col., "Specific Inhibition of K-RAS
Expression and Tumorigenicity of Lung Cáncer Cells by Antisense
RNA" (Inhibición específica de la expresión de
K-RAS y la tumorigenicidad de células de cáncer de
pulmón por ARN antisentido), Cáncer Research (1991)
51:1744:1748.
La presente invención también contempla vehículos
para introducir el primer ácido nucleico o el segundo ácido nucleico
en células infectadas por el VHC, o en células que se han de
proteger frente a la infección por el VHC. Ejemplos de tales
vehículos comprenden vectores, liposomas y suspensiones de lípidos,
como metilsulfato de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTAP), cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA) y otros similares. Alternativamente, el lípido puede estar
ligado directamente al primer ácido nucleico de forma covalente.
El ácido nucleico antisentido puede también estar
ligado a fracciones que aumenten la absorción celular del ácido
nucleico. Estas fracciones pueden ser hidrófobas, como fosfolípidos
o lípidos como esteroides (por ejemplo, colesterol) o pueden ser
policatiónicas (por ejemplo, polilisina). Las fracciones hidrófobas
o policatiónicas están asociadas en cualquier punto del ácido
nucleico antisentido, incluyendo los extremos 3' y 5', la base, los
hidroxilos del azúcar y los enlaces internucleosídicos.
Una fracción preferida para aumentar la absorción
es un grupo colesterol. Grupos similares a colesterol pueden estar
asociados a través de un cloroformato de colesterol activado, por
ejemplo, o ácido cólico, de forma conocida en la materia, como se
refleja en "Antisense research and applications", (como
arriba). En un ejemplo (p. 318) una fracción de colesterol puede
estar conjugada a un grupo hidroxilo 2' usando un ligador amino y un
grupo funcional en el colesterol que reacciona con una amina. En
otro procedimiento, un grupo colesterol se une al fosfato 3' usando
CCl_{4} y colesteriloxicarbonilaminoetilamina como se describe en
R.L. Letsinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989)
86:6553-6556.
Formulaciones farmacéuticas: las
composiciones de la presente invención pueden prepararse para
administración farmacéutica. Preparados inyectables y supositorios
pueden contener habitualmente 1-10 mg del ácido
nucleico o del análogo de ácido nucleico por ampolla o cápsula. Para
pacientes humanos la dosis diaria es de aproximadamente
0,1-1000 mg, preferentemente 1-100
mg (desde 10-20 mg/kg a 1000/2000 mg/kg de peso
corporal). Sin embargo, la dosis concreta para cada paciente depende
de una amplia variedad de factores, por ejemplo, de la efectividad
del ácido nucleico o análogo de ácido nucleico usado en concreto, de
la edad, peso, estado general de salud, sexo, de la dieta, de la
hora y modo de administración, de la velocidad de eliminación,
combinación con otros medicamentos usados conjuntamente y gravedad
de las enfermedades concretas para las que se aplica la terapia.
Artículos farmacéuticos elaborados dentro del
alcance de la presente invención incluyen artículos en los que los
ingredientes activos de los mismos están presentes en una cantidad
suficiente para conseguir el propósito deseado. Un intervalo
preferido se ha descrito anteriormente y la determinación de las
cantidades más efectivas para el tratamiento de cada infección del
VHC pertenece a la competencia en la materia.
Además del ácido nucleico y de sus análogos
sulfurados y fosforotioados de la presente invención, las
preparaciones farmacéuticas pueden contener excipientes adecuados y
coadyuvantes que faciliten el procesado de los compuestos activos.
Las preparaciones, en particular aquellas que pueden administrarse
por vía oral y que pueden usarse para el tipo preferido de
administración, como tabletas, grageas y cápsulas, y preparaciones
que pueden administrarse por vía rectal como supositorios, así como
disoluciones adecuadas para administración por vía parenteral u
oral y composiciones que pueden administrarse por vía bucal o
sublingual, pueden contener del 0,1 al 99% en peso de los
ingredientes activos, junto con el excipiente. Un procedimiento
preferido de administración es la vía parenteral, especialmente la
administración intravenosa.
Formulaciones adecuadas para la administración
por vía parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos
activos en forma soluble en agua o dispersable en agua. Además,
pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos como
suspensiones inyectables oleosas adecuadas. Disolventes o vehículos
lipófilos adecuados incluyen ácidos grasos, por ejemplo, aceite de
sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo oleato de
etilo o triglicéridos. Las suspensiones inyectables acuosas pueden
contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, por
ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano.
Opcionalmente, la suspensión puede contener también
estabilizantes.
Adicionalmente, los compuestos de la presente
invención pueden administrarse también encapsulados en liposomas,
composiciones farmacéuticas en las que el ingrediente activo está
contenido, bien disperso o bien presente de forma diversa, en
corpúsculos que constan de capas acuosas concéntricas adheridas a
capas lipídicas. El ingrediente activo, dependiendo de su
solubilidad, puede estar presente en ambas capas acuosa y lipídica,
o en lo que se denomina generalmente una suspensión liposómica. De
forma general pero no exclusiva, la capa hidrófoba comprende
fosfolípidos como lecitina y esfingomielina, esteroides como
colesterol, tensioactivos más o menos iónicos como fosfato de
dicetilo, estearilamina o ácido fosfatídico, y/o otros materiales de
naturaleza hidrófoba. Los diámetros de los liposomas están
generalmente entre 15 nm y 5 \mum. Lípidos preferidos en
particular para las preparaciones de liposomas y/o suspensiones de
lípidos son DOTMA y DOTAP.
DOTAP se comercializa por Boehringer Mannheim o
puede prepararse siguiendo los procedimientos descritos por L.
Stamatatos y col., Biochem. (1988) 27:3917-3925; H.
Eibl y col., Biophys. Chem. (1979) 10:261-271. DOTMA
se comercializa con el nombre de Lipofectin® (BRL, Gaithersburg, MD)
y está descrito por P.L. Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
(1987) 84:7413-7417.
La presente invención se ilustrará ahora con
referencia a los siguientes ejemplos que establecen realizaciones
particularmente ventajosas. Sin embargo, debe considerarse que estas
realizaciones son ilustrativas y no deben interpretarse como
limitación de la invención en modo alguno.
Las células HUH7, HeLa y HepG2 se crecieron en
medio de Eagle modificado por Dulbecco, suplementado con 10% de
suero bovino de ternero (Gibco-BRL, Gaithersburg,
MD). Las células se crecieron en presencia del 7% de CO_{2}. Todos
los plásmidos se crecieron en Escherichia coli HB101,
adquirida de Gibco-BRL.
Las enzimas de restricción y la ligasa de ADN de
T4 se adquirieron de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). La
polimerasa Taq de Perkin Elmer (Norwalk, CT), la polimerasa de ARN
de T7 y RNasin de Promega (Madison, WI).
La construcción de los plásmidos pT7EMCAT y
pSV_{2}CAT ha sido descrita (Elroy-Stein y col.
"Cap-dependent translation of mRNA conferred by
encephalomyocarditis virus 5' sequence improves the performance of
vaccinia virus/bacteriophage T7 hybrid expression system" (La
traducción de ARNm dependiente de caperuza conferida por la
secuencia 5' del virus de la encefalomiocarditis mejora el
rendimiento del sistema de expresión híbrido del virus de la
vaccinia / bacteriofago T7), Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989)
86:6126-6130; Gorman y col., "Recombinant genomes
which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian
cells" (Genomas recombinantes que expresan cloranfenicol
acetiltransferasa en células de mamíferos), Mol. Cell. Biol. (1989)
2:1044-1051. El plásmido pVHCCAT se construyó
agrgando sitios HindIII a ambos extremos de la región 5'UT
del ADNc del VHC (Han y col.) mediante PCR (Saiki y col.,
"Primer-directed enzymatic amplification of DNA
with a thermostable DNA polymerase" (Amplificación enzimática de
ADN dirigida por cebador con una polimerasa de ADN termoestable),
Science (1988) 230:1350-1354) y clonando el
fragmento resultante en el sitio HindIII de pSV_{2}CAT.
El plásmido pEQ355 se construyó insertando la
región 5'UT de 341 bp de VCH-1 en los sitios
HindIII/Asp718 residentes en el sitio de clonación
múltiple del plásmido de expresión de la
beta-galactosidasa (\beta-gal),
pEQ176 (Achleiss y col., "Translational control of human
cytomegalovirus gp48 expression" (Control traduccional de la
expresión del citomegalovirus humano gp48), J. Virol. (1991)
65:6782-6789). La región 5'UT de
VHC-1 se generó como un fragmento PCR
HindIII/Asp718 usando B114, un fragmento EcoRI
de un vector lambda, como molde.
El plásmido pEQ391 [pCMV(CAT/VHC/LacZ)] se
generó ligando un fragmento HindIII/BanI de 716 bp que
codifica el gen CAT aislado del plásmido pSV_{2}CAT (Gorman col.)
en el sitio HindIII del plásmido pEQ355. Los sitios
HindIII se ligaron y el sitio BanI y el sitio
HindIII no ligado en pEQ355 se transformaron en romos con
Klenow y se religaron.
El plásmido pEQ416 [pCMV(CAT/polio/LacZ)]
se construyó ligando un fragmento PCR HindIII/BamHI de
716 bp que codifica el gen CAT, generado usando pSV_{2}CAT como
molde, un fragmento BamHI/XhoI de 995 bp que codifica
la región 5'UT del virus de la polio, junto con el plásmido de
expresión de \beta-gal pEQ176 digerido en el sitio
HindIII/XhoI del poliligador.
pEQ396 es un plásmido de expresión de
\beta-gal construido clonando la secuencia de la
región 5'UT del virus de la polio obtenida de pLNPOZ (Adam y col.,
"Internal initiation of translation in retroviral vectors carrying
picornavirus 5' nontranslated regions" (Iniciación interna de la
traducción en vectores retrovíricos que portan regiones 5' no
traducidas de picornavirus), J. Virol. (1991)
65:4985-4990), como un fragmento
XhoI/PstI transformado en romo mediante Klenow, en
pEQ377 digerido en los sitios XbaI/SnaBI del
poliligador. El sitio XbaI también se rellenó con Klenow para
crear extremos romos. La transcripción de
\beta-gal en pEQ377 responde al promotor del
bacteriófago
T7.
T7.
El plásmido p(CAT/SV40/LacZ) se construyó
ligando el fragmento PCR HindIII/BamHI de 716 bp que
codifica el gen CAT descrito anteriormente, junto con las señales de
poliadenilación de SV40 y el plásmido de expresión de
\beta-gal pEQ176 digerido con
HindIII/BglII. La autenticidad de todos los productos
PCR se verificó por secuenciación de cada uno de los fragmentos
resultantes en los plásmidos (Chen y Seeburg, "Supercoil
secuencing: a fast and simple method for sequencing plasmid DNA"
(Secuenciación en superenrollamiento: un procedimiento rápido y
sencillo para secuenciar ADN plasmídico) DNA (1985)
4:165-170).
Los segmentos de los vectores pSV_{2}CAT se
amplificaron por PCR como se ha descrito (Saiki y col.; Shyamala y
Ames, "Use of exonuclease for rapid polymerase chain reaction
based In vitro mutagenesis" (Uso de exonucleasa para una
rápida mutagénesis in vitro basada en la reacción en cadena
de la polimerasa), Gene (1991) 97:1-6. Todos los
segmentos se muestran en las figuras 2 y 3. Cada cebador codificante
(PSV o P1 a P9) se designó para tener un promotor del bacteriófago
T7 (TAATACGACTCACTATAG) en el extremo 5' y una secuencia de SV40 o
del VHC de 16 a 18 bases en el extremo 3'. Un cebador antisentido
tenía un tramo de 40 Ts en el extremo 5' y una secuencia
complementaria de SV40 (GGAGGAGTAG) en el extremo 3'. Esta secuencia
se une a los vectores, 350 bp después de un codón de parada en el
gen CAT, mediante un ajuste perfecto de 10 nucleótidos y un tramo de
poli(A) adicional presente en el ADN molde. Un segmento de
pT7EMCAT se amplificó con cebadores T7 y T30.
Cada producto PCR se transcribió con polimerasa
de T7 con o sin análogo de caperuza (Promega, p2010), se trató con
ADNasa, se extrajo con fenol-cloroformo y se
precipitó dos veces con etanol en presencia de acetato amónico 2,5
M. La concentración de cada ARN poli(A)+ se estimó por
absorción de UV y se confirmó por hibridación de transferencia
Northern y transferencia de puntos como se ha descrito (Han y col.,
"Selective expression of rat pancreatic genes during embryonic
development" (Expresión selectiva de genes pancreáticos de la
rata durante el desarrollo embrionario), Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1986) 83:110-114) usando JHC271 como sonda. En
SV*CAT, R11, R13 y R14 se insertaron o delecionaron secuencias
internamente mediante un procedimiento de PCR solapante (Shyamala y
Ames). Se confirmó que los productos PCR eran correctos por
secuenciación.
Los ARNs sintéticos se tradujeron en lisados de
reticulocitos de conejo (Gibco-BRL) tratados con
nucleasa en presencia de acetato potásico 140 mM, como sugiere el
fabricante. Se realizaron estudios adicionales en presencia de
acetato potásico 50, 100, 150 y 200 mM para examinar la influencia
de la concentración del ión K^{+} en la dependencia de caperuza.
Se analizaron alícuotas del producto de traducción marcado con
[^{35}S]metionina por electroforesis en un gel del 12% de
poliacrilamida como se ha descrito previamente (Laemmli, "Cleavage
of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4" (Corte de proteínas estructurales durante el
ensamblaje de la cabeza del bacteriófago T4), Nature (1970)
227:680-685).
Se transfectaron 2 \mug de cada uno de los ARNs
sintéticos en 1x10^{6} células en una placa Costar de 3,5 cm
(Thomas Scientific, Swedesboro, NJ) mediante 15 mg de lipofectina
(Gibco-BRL) según el procedimiento de Felgner y col.
"Lipofection: A highly efficient, lipid-mediated
DNA-transfection procedure" (Lipofección: un
procedimiento de alta eficiencia para la transfección de ADN mediada
por lípidos), Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987)
84:7413-7417, modificado por el fabricante. Las
células se incubaron durante la noche y se recogieron para el ensayo
de CAT como se ha descrito previamente (Gorman y col.). La actividad
CAT relativa resultó ser lineal entre 0,5 mg y 5 mg de ARN
transfectado. Una incubación post transfección entre 6 horas y una
noche no afectó significantemente a la actividad CAT.
Para la traducción de los ARNs en células
infectadas por el virus de la polio, se infectaron células HUH7 con
el virus de la polio (cepa Mahoney, ATCC VR-59) con
una multiplicidad de infección (MDI) de 100. Las células se
transfectaron con los ARNs 2 horas después de la infección y se
recogieron 4 horas después de la transfección. Las células
mantuvieron una morfología normal durante las 6 horas de infección,
después de las cuales comenzaron a cambiar la morfología y a
separarse de la placa de cultivo.
Se transfectaron 20 \mug de ADN de cada
plásmido, purificado por bandeo en un gradiente de CsCl, en
2x10^{6} células HUH7 por el procedimiento del fosfato cálcico
(Gorman y col.) Las células se recogieron 48 horas después de la
transfección y se preparó un extracto celular por congelación y
descongelación repetidas. El ensayo de CAT se realizó como se ha
descrito (Gorman y col.). El ensayo de LacZ fue según Miller
(Miller, "Assay of beta-galactosidase" (Ensayo
de beta-galactosidasa), en "Experiments in
Molecular Genetics" (Experimentos en genética molecular), pp.
352-355, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring
Harbour, Nueva York, 1972).
Ejemplo
1
Para cartografiar elemento(s) que actúan
en cis controlando la traducción en el genoma del VHC,
versiones de longitud completa (desde el nucleótido 1 al 341) o
versiones delecionadas de la región 5'UT del ARN de
VHC-1 se ligaron a la región codificante del ARNm de
la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Las construcciones se
ilustran en la figura 3 y se describen en la tabla 1, a
continuación.
| ID de la construcción | Secuencia de la región 5'UT | Deleción u otra característica |
| R1 | 1-341 | |
| R2 | 23-341 | deleción 1-22 |
| R3 | 35-341 | deleción 1-34 |
| R4 | 83-341 | deleción 1-82 |
| R5 | 99-341 | deleción 1-98 |
| R6 | 145-341 | deleción 1-144 |
| R6.ho | 145-341 | deleción 1-144 con bases horquilla 1-23 añadidas |
| al extremo 5' adición 1-23 | ||
| R7 | 218-341 | deleción 1-217 |
| ID de la construcción | Secuencia de la región 5'UT | Deleción u otra característica |
| R8 | 255-341 | deleción 1-254 |
| R8.ho | 255-341 | deleción 1-254 con bases horquilla 1-23 añadidas |
| al extremo 5' | ||
| R9 | 322-341 | deleción 1-321 |
| R11 | 1-322 | deleción 323-341 |
| R13 | 1-205 | deleción 206-341 |
| R14 | 1-145 | deleción 146-341 |
| R17 | 145-322 | deleciones 1-144 y 323-341 |
| R18 | 145-294 | deleciones 1-144 y 295-341 |
Cada ARN se sintetizó por transcripción con la
polimerasa de T7 de un fragmento de ADN que primeramente se
amplificó por PCR para contener una deleción específica 5' o 3'.
Cada ARN se designó con una caperuza en el extremo 5' y una cola
poli(A) (A40) en el extremo 3' para aumentar la estabilidad
en las células. Este enfoque permite una producción eficiente de una
gran cantidad de ARN con extremos 5' y 3' definidos uniformemente. A
diferencia de las estrategias de transfección convencionales, la
transfección de células con ARN usando este enfoque evita posibles
problemas de corte y empalme y de transporte que pueden encontrar
ciertas moléculas de ARN en el núcleo.
Por el mismo procedimiento se sintetizaron dos
ARNs adicionales: 1) el SVCAT con el líder 5' del ARNm temprano de
SV40, que sirvió de control positivo para una traducción
convencional dependiente de caperuza (Kozak, "The scanning model
for translation: An update" (El modelo de exploración para la
traducción: una actualización), J. Cell Biol. (1989)
108:229-241), y el EMCVCAT con el líder 5' de EMCV
que sirvió de control positivo para la iniciación interna
independiente de caperuza (Jang y col., "Initiation of protein
synthesis by internal entry of ribosomes into the 5' nontranslated
region of Encephalomyocarditis virus RNA In vivo"
(Iniciación de la síntesis de proteínas por entrada interna de los
ribosomas en la región 5' no traducida del ARN del virus de la
encefalomiocarditis in vivo), J. Virol. (1989)
63:1651-1660).
Ejemplo
2
Para confirmar que los ARNs sintéticos eran
biológicamente activos y para determinar su perfil traduccional
in vitro, los ARNs del ejemplo 1 se tradujeron en lisado de
reticulocitos de conejo. Todos los ARNs, incluyendo SVCAT, generaron
una proteína CAT del tamaño esperado.
Los resultados in vitro se pueden resumir
como sigue: 1) En las construcciones VHCCAT, R1 a R5 produjeron
proteína CAT, pero sólo a niveles apenas detectables. Este nivel de
traducción aumentó gradualmente en R6 y en R7, alcanzando un máximo
aumento de 12 veces en R8. 2) A una concentración de KCl de 140 mM,
la traducción in vitro de los ARNs con caperuza de SVCAT y
VHCCAT (R7, R8) fue más eficiente que la de los ARNs sin caperuza
una media de 20 veces. 3) A concentraciones inferiores de KCl (50 a
100 mM) la traducción del molde R1 sin caperuza generó proteína CAT
a niveles comparables a los del molde R1 con caperuza, indicando que
posiblemente tiene lugar una débil iniciación interna.
De forma sorprendente e inesperada, estos
resultados se oponen a datos recientes de
Tsukiyama-Kohara y col., "Internal ribosome entry
site within hepatitis C virus RNA" (Sitio interno de entrada de
ribosomas en el ARN del virus de la hepatitis C), J. Virol. (1992)
66:1476-1483, que ha descrito la detección de un
sitio interno de entrada de ribosomas en la región 5'UT del ARN del
VHC usando lisado de reticulocitos de conejo y extractos de células
HeLa. La síntesis de proteínas in vitro usando lisados
celulares no siempre representa con fidelidad las condiciones de
traducción in vivo (Kozak, "Comparison of initiation of
protein synthesis in prokaryotes, eukaryotes, and organells"
(Comparación de la iniciación de la síntesis de proteínas en
procariotas, eucariotas y orgánulos), Microbiol. Rev. (1983)
47:1-45). Se utilizó un enfoque alternativo.
\newpage
Ejemplo
3
Para determinar el perfil de traducción de las
construcciones monocistrónicas in vivo, los ARNs se
transfectaron (R1 a R18) junto con el ARN control, SVCAT, en una
línea celular de hepatocitos humanos (HUH7) usando lipofectina
(Felgner y col.) Las actividades CAT se monitorizaron y los datos se
resumen en la tabla 2.
| ID de la | Secuencia de la | Deleción u otra característica | Actividad CAT |
| construcción | región 5'UT | ||
| R1 | 1-341 | no detectada | |
| R2 | 23-341 | deleción 1-22 | 0,5 |
| R3 | 35-341 | deleción 1-34 | 2,0 |
| R4 | 83-341 | deleción 1-82 | 2,1 |
| R5 | 99-341 | deleción 1-98 | 2,5 |
| R6 | 145-341 | deleción 1-144 | 2,1 |
| R6.ho | 145-341 | deleción 1-144 con bases horquilla 1-23 añadidas | 0,1 |
| al extremo 5' adición 1-23 | |||
| R7 | 218-341 | deleción 1-217 | 5,2 |
| R8 | 255-341 | deleción 1-254 | 7,9 |
| R8.ho | 255-341 | deleción 1-254 con bases horquilla 1-23 añadidas | 0,1 |
| al extremo 5' | |||
| R9 | 322-341 | deleción 1-321 | 0,6 |
| R11 | 1-322 | deleción 323-341 | no detectada |
| R13 | 1-205 | deleción 206-341 | no detectada |
| R14 | 1-145 | deleción 146-341 | no detectada |
| R17 | 145-322 | deleciones 1-144 y 323-341 | 1,5 |
| R18 | 145-294 | deleciones 1-144 y 295-341 | 0,6 |
En la construcción de longitud completa R1, la
actividad CAT fue repetidamente no detectable a no ser que la
cantidad de ARN se aumentara 10 veces y se usara más extracto
celular. Este resultado sugiere que el ARN de longitud completa del
VHC puede no ser un eficiente molde de traducción in
vivo.
Se analizó una serie de construcciones con
deleciones 5' como se describen en el ejemplo 1. Una actividad CAT
se detectó en primer lugar en R2, en la que se había eliminado la
horquilla terminal 5' de 23 nucleótidos. Esta actividad aumentó 4
veces en R3 y un nivel de actividad similar se detectó en R4, R5 y
R6 en las que se habían delecionado sistemáticamente las ORF 1 a
4.
La secuencia 5'UT en R6 era idéntica a la del ARN
subgenómico 5' detectado in vivo (Han y col., 1991). La
actividad CAT volvió a aumentar 2 veces en R7 en la que se había
eliminado el codón AUG de la ORF 5, y 1,5 veces adicionalmente en
R8, que conserva sólo 86 nucleótidos de la secuencia 3' proximal. La
construcción R8 representa la máxima actividad CAT. Estos datos
sugieren que las secuencias por encima del nucleótido 255 incluyendo
la pequeña ORF inhiben la traducción desde el codón de iniciación
principal de la poliproteína.
La máxima actividad CAT observada en R8 disminuyó
marcadamente al delecionar adicionalmente 67 nucleótidos en la
construcción R9. Este resultado sugiere que secuencia abajo del
nucleótido 255 puede encontrarse un eficiente elemento de control
positivo que estimula la traducción. Esta región de 86 nucleótidos
contiene una secuencia de 28 nucleótidos con el 90% de identidad a
los pestivirus y se denomina la caja IV de homología con los
pestivirus, designada en las figuras 2 y 3 como
PEST-IV (Han y col., 1991). Para determinar si el
elemento PEST-IV es el único responsable de la
observada estimulación de la traducción, la construcción de ARN R6
se sometió a un análisis de deleción.
La construcción R6 tiene una deleción de la
secuencia 1-145 de la región 5'UT, que elimina la
porción del extremo 5' del ARN del VHC asociada con las
construcciones inactivas. Se favoreció R6 frente a R8 para el
análisis de deleción. Una deleción 3' en R8 generaría ARN con una
región 5'UT de poca longitud.
En la transfección, la actividad CAT observada en
R6 se redujo 1,5 veces por la deleción de 20 nucleótidos del extremo
3' de R6 en la construcción R17, y se redujo otras 2,5 veces más por
la deleción adicional de 28 nucleótidos en la construcción R18.
Estos datos indican que secuencias adicionales
arriba y abajo de PEST-IV eran necesarias para un
máximo aumento de la traducción. La secuencia
PEST-IV parece ser parte de un elemento que actúa en
cis positivamente que puede transferirse a un líder 5'
heterólogo. Con respecto ahora a la figura 4, esta secuencia de 28
bases se insertó en SVCAT para crear SV*CAT y confirió un aumento de
3 veces en actividad CAT.
Se prepararon otras construcciones de ARN con
deleciones 3'. No se detectó actividad CAT en R11 y R14 así como
tampoco en R13, todas las cuales contenían la horquilla 5'. Estos
datos son consistentes con la opinión de que la horquilla 5' inhibe
la traducción del ARN del VHC.
Ejemplo
4
Dado que los ARNs con un extremo 5' intacto
fueron todos inactivos independientemente de sus secuencias más
abajo, se evaluó una potencial estructura de horquilla 5', residente
en los 23 nucleótidos más distales, con respecto a la inhibición de
la traducción observada. Por consiguiente, la horquilla 5' se ligó
al extremo 5' de los dos ARNs activos, R6 y R8. Estos ARNs, R6ho y
R8ho, fueron transfectados en células HUH7 y se midió la actividad
CAT.
Con respecto a la tabla 2, la yuxtaposición de la
horquilla en estas construcciones casi abolió la traducción, como se
demuestra por la actividad CAT relativa. Los datos sugieren que la
horquilla 5' es un potente inhibidor de la traducción, aunque la
completa inhibición requiere más nucleótidos que los 23 de la
horquilla solamente.
Ejemplo
5
Se conoce que la infección por el virus de la
polio inhibe la traducción dependiente de caperuza del ARNm celular
y, por tanto, estimula la traducción de su propio ARN heterólogo que
contiene un sitio interno de entrada de ribosomas (IRES) dentro de
su región 5'UT (Jang y col., "Initiation of protein synthesis by
internal entry of ribosomes into the 5' nontranslated region of
Encephalomyocarditis virus RNA In vivo" (Iniciación de la
síntesis de proteínas por entrada interna de ribosomas en la región
5' no traducida del ARN del virus de la encefalomiocarditis in
vivo), J. Virol. (1989) 63:1651-1660; Macejak y
Sarnow, "Internal initiation of translation mediated by the 5'
leader of a cellular mRNA" (Iniciación interna de la traducción
mediada por el líder 5' de un ARNm celular), Nature (1991)
353:90-94; Pelletier y Sonenberg, "Internal
initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence
derived from poliovirus RNA" (Iniciación interna de la traducción
de ARNm eucariótico dirigida por una secuencia derivada del virus de
la polio), Nature (1988) 334:320-325). Se cree que
esta inhibición está mediada indirectamente por la proteinasa 2A
codificada por el virus de la polio, mediante activación de una
proteasa celular latente que, a su vez, corta p220, un componente
del complejo proteico celular que se une caperuzas
(elF-4F) (Sonenberg, "Cap-binding
protein of eukaryotic mRNA: functions in initiation and control of
translation" (Proteína que se une a caperuzas del ARNm de
eucariotas: funciones en la iniciación y control de la traducción),
Prog. Nucleic Acid Res. Molec. Biol. (1988)
35:173-297).
35:173-297).
ARNs híbridos de CAT con varias regiones 5'UT
fueron transfectados en células HUH7 infectadas por el virus de la
polio. Esta estrategia se diseñó para determinar la dependencia de
caperuza de cada ARN y para detectar la posible existencia de un
sitio interno de entrada de ribosomas (IRES) débil que pudiera estar
presente en la región 5'UT del VHC.
Como se esperaba, la infección por el virus de la
polio aumentó la actividad CAT 7 veces en EMCVCAT sobre un ARN
control positivo para iniciación interna
(Elroy-Stein y col.). En contraste, la infección por
polio redujo sustancialmente la actividad CAT en SVCAT así como en
dos construcciones de VHC, Ra y R8, respectivamente. Las reducidas
actividades CAT observadas en las células infectadas por el virus de
la polio se redujeron aún más cuando las células infectadas se
incubaron más tiempo (2,5 horas) antes de la transfección de ARN. La
actividad CAT de R1 se mantuvo indetectable independientemente de la
infección por el virus de la polio. El resultado sugiere con fuerza
que no se encuentra ningún IRES presente en la región 5'UT del ARN
del VHC.
Con la excepción de la construcción R1, las
construcciones ensayadas en el experimento anterior contenían largas
deleciones de la región 5'UT. Es posible que tales deleciones puedan
haber afectado una supuesta estructura y/o función IRES. Para
evaluar el efecto de estas deleciones las construcciones con las
deleciones menos extensivas se ensayaron en cuanto a su capacidad
para traducir la proteína CAT en células infectadas por el virus de
la polio. De acuerdo con los resultados previos, la actividad CAT de
las construcciones R1 se mantuvo indetectable en presencia o
ausencia de infección por virus de la polio. Las construcciones R2 y
R5 mostraron niveles relativos de actividad CAT similares a aquellos
descritos previamente cuando se ensayaron en ausencia de infección
por el virus de la polio. Sin embargo, las actividades CAT del los
moldes líder del VHC fueron prácticamente abolidos en las células
infectadas por virus de la polio.
Además, los moldes SVCAT y R1 y R3 se ensayaron
en un protocolo similar usando mensajeros sin caperuza. Los moldes
sin caperuza fueron inactivos en células transfectadas,
independientemente de si las células fueron infectadas a
continuación o no con el virus de la polio. Estos resultados
sugieren con fuerza que mensajeros monocistrónicos con elementos
reguladores derivados de la región 5'UT del VHC se traducen por un
mecanismo dependiente de caperuza y que la región 5' no codificante
del VHC no tiene ningún elemento IRES.
Ejemplo
6
La posible presencia de un IRES dentro de la
región 5'UT del VHC se ensayó además por transfección de células
HUH7 con construcciones de ADN diseñadas para transcribir un ARNm
dicistrónico. Por tanto, la región 5'UT del ARN del VHC se colocó
como un espaciador intercistrónico entre CAT, como primer cistrón, y
LacZ, como segundo cistrón. El ADN ligado se clonó en un vector de
expresión, en el que la transcripción está dirigida por el fuerte
potenciador-promotor del principal gen temprano
inmediato ("major immediate early", MIE) en citomegalovirus
(CMV). Vectores dicistrónicos de control positivo y negativo, en los
que la región 5'UT del VHC se reemplazó con la región 5'UT del virus
de la polio y la región 3'UT del gen temprano de SV40, se
construyeron como se muestra en la
figura 5.
figura 5.
En la transfección de células HUH7, las tres
construcciones mantuvieron la traducción del primer cistrón CAT a un
nivel comparable. Con respecto a la figura 6, las actividades
enzimáticas de las tres construcciones se resumen en forma de un
diagrama de barras. La construcción dicistrónica con el líder del
VHC no mantuvo la traducción del segundo cistrón LacZ a un nivel
comparable al de la construcción dicistrónica de control que emplea
un líder del virus de la polio. Estos datos apoyan la evidencia
previa generada usando construcciones monocistrónicas de que la
región 5'UT de longitud completa del genoma del VHC no contiene un
IRES.
Ejemplo
7
Ensayos de transfección transitoria pueden
proporcionar lecturas diferentes que dependen de la línea celular.
Para asegurar que los resultados obtenidos no estuvieran reducidos a
las células HUH7, las construcciones R1, R7 y R8 se transfectaron en
células HeLa y HepG2. Los modelos de actividad CAT resultantes
fueron cualitativamente similares a los observados en las células
HUH7.
Ejemplo
8
Los procedimientos para la preparación de
análogos y derivados de oligonucleótidos y su uso como agentes
antivíricos se han descrito en, entre otros: documentos PCT
WO88/07544 y PCT WO91/16331.
Análogos sulfurados de oligonucleótidos se
preparan para su uso como agentes antisentido de acuerdo con lo
expuesto en el documento PCT WO91/16331. Un oligonucleótido
fosforotioato de 23 bases, correspondiente a las bases
1-23 de ID SEC Nº: 1 se sintetiza por el
procedimiento de la fosforamidita en un sintetizador automático
(modelo 380B Applied Biosystems, Foster City, California). Se sigue
el protocolo de síntesis estándar, excepto que en lugar de la etapa
de oxidación, se incluye una etapa de sulfuración, dicha sulfuración
precediendo la etapa de encaperuzamiento. Por tanto, la síntesis
consta de ciclos repetidos de detritilación, acoplamiento,
sulfuración y encaperuzamiento. La separación del producto final de
la columna de síntesis y la purificación se llevan acabo de modo
estándar.
La etapa de sulfuración se realiza exponiendo la
cadena creciente a una disolución 0,2 M de sulfuro de ácido
O,O-diisopropilfosforoditioico en piridina durante
un minuto a temperatura ambiente. Se espera que el rendimiento de
catión tritilo liberado en las etapas de detritilación será del 99%
como media. El rendimiento de tritilo es a la vez una medida de la
eficiencia del acoplamiento y una medida de la sulfuración, ya que
los enlaces de fósforo trivalente no sulfurados u oxidados en el
oligonucleótido son sensibles al corte durante la detritilación.
El 23mero correspondiente al antisentido de las
bases 1-23 de ID SEC Nº: 1 se separa del soporte y
se desprotege con hidróxido amónico concentrado a 55ºC durante 6
horas. El oligonucleótido tritilado se aisla por HPLC, se detritila
y se precipita como sal sódica. El análogo fosforotioato es
resistente a las nucleasas presentes normalmente en las células.
Se espera que las células cultivadas con
concentraciones del oligómero de fosforotioato serán resistentes a
la infección vírica por el VHC a concentraciones tan bajas como 0,5
mM.
Se espera que el análogo de oligonucleótido
23mero complementario de las secuencias 1-23 del ARN
codificante reduzca la traducción del ARN mensajero del VHC mediante
la unión a la configuración de horquilla y su estabilización.
Ejemplo
9
Este Ejemplo usa una secuencia de 28 nucleótidos
correspondiente a las secuencias de la caja IV de homología con los
pestivirus. Se sintetiza un análogo fosforotioato de oligonucleótido
complementario de las bases 291 a 318 de ID SEC Nº: 1 de acuerdo con
la Solicitud de Patente Internacional PCT WO88/07544.
Los fosforotioatos de la presente invención se
sintetizan en un sintetizador de ADN, Applied Biosystems
380-B, de forma similar a la del ciclo de síntesis
de oligonucleótidos fosfato normales, uando
O-metilfosforamidita. La principal diferencia se
encuentra en los reactivos usados durante la etapa de oxidación.
Como reactivo oxidante se usa una disolución de
azufre al 5% que consta de 7,5 g de azufre elemental S_{8},
disueltos primeramente en 71 ml de disulfuro de carbono, junto con
71 ml de pirimidina y 7,5 ml de trietilamina. El volumen total
indicado es suficiente para una síntesis de tres columnas de un
30mero.
Antes y después de la etapa de oxidación la
columna se lava repetidamente con una disolución 1:1 de disulfuro de
carbono y piridina para retirar cualquier azufre residual que
pudiera precipitar en las líneas. Un volumen total de 380 ml de esta
disolución debe ser suficiente para una síntesis de tres columnas de
un 30mero. Las disoluciones deben ser lo más anhidras posible, y
deben prepararse de nuevo para cada nueva síntesis.
La oxidación por azufre no es tan rápida como la
oxidación por yodo y, por tanto, requiere una etapa de espera de 450
segundos durante el ciclo de síntesis, comparado con los 30 segundos
de la etapa de espera de la oxidación por yodo. Además, el
procedimiento final está ligeramente modificado de modo que el flujo
inverso se mantiene durante cinco segundos más de lo normal, por un
total de diez segundos, para asegurar la retirada de cualquier sal
resultante disuelta en metanol después de administrar tiofenol a la
columna.
El análogo fosforotioato de ácido nucleico de 28
nucleótidos se sintetiza cambiando automáticamente el ciclo de
oxidación en el momento deseado. Después de la separación de la
columna y el desbloqueo en amonio acuoso (60ºC, 10h), los oligómeros
fosforotioato y los copolímeros de bloques se purifican por HPLC de
fase inversa (columna PRP-1, tampón de acetato de
trietilamonio al 1%, acetonitrilo a pH 7 (20%, aumento al 40% a los
20 minutos) y la disolución se extrae con dos volúmenes iguales de
acetato de etilo, se congela en hielo seco y se liofiliza.
Los sólidos se disuelven en 0,3 ml de NaCl 1M y
el producto se precipita por adición de 3,5 volúmenes de etanol
absoluto. Las sales de acetato de algunos oligómeros fosforotioato,
en particular el homopolímero dC_{28}, son extremadamente
insolubles en NaCl 1M. La introducción de una pequeña cantidad de
vapor de amonio (no amonio acuoso) mediante una pipeta Pasteur
solubiliza todos los sólidos.
Se espera que las células puestas en contacto con
disoluciones que contienen concentraciones 0,5 mM del análogo de 28
nucleótidos muestren resistencia a la infección por el VHC o a la
expresión de proteínas víricas por el VHC.
Ejemplo
10
Un oligonucleótido antisentido 24mero designado
AS5, que se une a los nucleótidos 277-300 de la
región 5'UT del VHC se sintetizó como anteriormente con la secuencia
siguiente:
- 5' CCTATCAGGCAGTACCACAAGGCC 3' (ID SEC Nº: 2)
AS5-PO designa el oligonucleótido
AS5 con los enlaces fosfodiéster normales. AS5-PS
designa el oligonucleótido AS5 en el que todos los enlaces
internucleosídicos son enlaces fosforotioato, y se sintetiza como en
el ejemplo 9 anteriormente. AS5-3'
CHOL-PS y AS5-3'
CHOL-PO designan los oligonucleótidos
AS5-PS y AS5-PO respectivamente, en
los que se añade un grupo colesterol al extremo 3' de la molécula y
fueron sintetizados por Lynx Pharmaceuticals (Foster City, CA). El
grupo colesterol puede también añadirse al extremo 3' por los
procedimientos descritos en este documento.
Los oligonucleótidos antisentido (OASs) se
ensayaron en el ensayo siguiente para determinar su capacidad para
inhibir la traducción controlada por la región 5' del VHC. Las
células HUH7 se crecieron como se describe en Materiales y Métodos.
Diversas moléculas antisentido (AS5-PO,
AS5-PS, AS5-3'
CHOL-PS y una secuencia control 21mera derivada del
virus del herpes simple (VHS) en realizaciones -PO, -PS y
3'-CHOL) se suplementaron al medio de cultivo de las
células HUH7 a concentraciones finales que variaron entre 0,1 y 1,0
\muM y se incubaron durante 12-14 horas.
Después de la incubación con los OASs, las
células se transfectaron con los ARNs de ensayo (R6 y el ARN SVCAT
como se describe en el ejemplo 5 y en las figuras 2 y 3) como sigue:
se mezclaron 2 a 4 \mug de cada ARN con 15 \mug de lifofectina
(Gibco-BRL) en 200 \mul de una disolución salina
tamponada con fosfato, se incubó durante 15 minutos y se añadió a
las células como se describe anteriormente en la sección F de
Materiales y Métodos. La actividad CAT se ensayó como en la sección
F anteriormente (C.M. Gorman y col., Mol. Cell. Biol. (1982)
2:1044-1051. Los resultados se muestran en la figura
7.
Las columnas 2 y 11-13 contienen
ARN molde de SVCAT, mientras que las columnas 3-9 y
14-18 contienen el ARN molde R6. Las columnas
1-3, 10-11 y 14 son controles sin
incubación con OAS. Las columnas restantes contienen los OAS
control, AS5 o VHS, como se indica. Los datos muestran que los OAS,
AS5-3' CHOL-PO y
AS5-3' CHOL-PS, inhiben
específicamente la transcripción y traducción de CAT bajo el control
de la región 5'UT del VHC y que no inhiben dicha transcripción y
traducción bajo el control del la región del promotor de SV40.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Jang H. Han, Richard R. Spaete, Byoung J. Yoo, Byung S. Suh, Mark J. Selby, Michael Houghton, Michael S. Urdea
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: procedimientos y composiciones para el control de la traducción de las proteínas del VHC
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Chiron Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4560 Horton Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Emeryville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- DISTRITO POSTAL: 94608
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: disquete, 5,25 pulgadas (13,33 cm)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS, versión 3.3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WordPerfect 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: No disponible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: No disponible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN: No disponible
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/952799
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28 de septiembre de 1992
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Goldman, Kenneth M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 34174
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: 0044002
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (510)601-2719
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFÁX: (510)655-3542
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX: No disponible
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 341 nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL: (ATCC nº 40394)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- AISLAMIENTO INDIVIDUAL: ns5hcv1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID SEC Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID SEC Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTATCAGGCAGTACCACAAGGCC
\hfill
Claims (8)
1. Uso de un ácido nucleico que no existe de
forma natural con una secuencia complementaria de la secuencia
dentro de la región 5' que no se traduce (5'UT) del virus de la
hepatitis C (VHC), que se extiende entre las bases 277 a 300 en
referencia a ID SEC Nº: 1, para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de la infección por VHC mediante el
control de la traducción de las proteínas del ácido nucleico del
VHC.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho
primer ácido nucleico tiene la secuencia ID SEC Nº: 2.
3. El uso de las reivindicaciones 1 ó 2 en el que
dicho ácido nucleico es un análogo fosforotioato de ácido
nucleico.
4. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho primer ácido nucleico
comprende además una fracción de colesterol ligada al extremo
3'.
5. El uso de la reivindicación 1 ó 2, que
comprende además la transcripción de un segundo ácido nucleico que
no existe de forma natural que comprende un promotor ligado
operativamente a una secuencia complementaria de dicho primer ácido
nucleico.
6. Un procedimiento para el control de la
traducción de las proteínas del ácido nucleico del VHC in
vitro que comprende las etapas:
suministrar un primer ácido nucleico que no
existe de forma natural, mencionado en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3; y
poner en contacto dicho ácido nucleico del VHC
con dicho primer ácido nucleico bajo condiciones en las que dicho
primer ácido nucleico y dicho ácido nucleico del VHC son capaces de
formar un producto de hibridación, alterando dicho producto de
hibridación el nivel de traducción de dicho ácido nucleico del
VHC.
7. El procedimiento de la reivindicación 6 que
comprende además la transcripción de un segundo ácido nucleico que
no existe de forma natural, que comprende un promotor ligado
operativamente a una secuencia complementaria de dicho primer ácido
nucleico.
8. Una composición para el control de la
traducción de las proteínas del ácido nucleico del VHC que comprende
el primer ácido nucleico mencionado en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
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