ES2256972T3

ES2256972T3 - Metodo novedoso para la integracion de un adn foraneo dentro de genomas de eucariotas.

Info

Publication number: ES2256972T3
Application number: ES98960261T
Authority: ES
Inventors: Christopher L. Baszczynski; Leszek Alexander Lyznik; William J. Gordon-Kamm; Aragula Gururaj Rao; Laura A. Tagliani; Xueni Guan
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1997-11-18
Filing date: 1998-11-17
Publication date: 2006-07-16
Anticipated expiration: 2018-11-17
Also published as: PT1032680E; AU745960C; AU1590499A; NZ504511A; AU745960B2; DK1032680T3; US7223601B2; WO1999025840A1; DE69833457T2; CA2306188C; EP1032680B1; US20030119166A1; US6262341B1; BR9814669A; CA2306188A1; EP1032680A1; DE69833457D1; US6541231B1; ATE317440T1

Abstract

Proteína recombinante que comprende: una primera recombinasa específica de sitio fusionada en el marco con una segunda recombinasa específica de sitio distinta. Se proporcionan composiciones y métodos para introducir un ADN de interés dentro de un sitio de integración genómica. En particular, los métodos y composiciones implican el uso de una combinación de sitios diana de dos recombinasas específicas de sitio distintas, tales como Cre y FLP, y la expresión de una recombinasa quimérica con especificidad de sitio diana dual. Así, las composiciones comprenden recombinasas específicas de sitio novedosas con especificidades frente a sitios diana múltiples, y las secuencias de nucleótido y los casetes de expresión que codifican para esas recombinasas o sitios diana. Los métodos implican transformar una célula eucariota que tiene sitios diana para la recombinasa novedosa con ADN de interés que está flanqueada por sitios diana correspondientes. La expresión o bien de la recombinasa quimérica novedosa, o bien de dos recombinasas específicas de sitio en la célula eucariota da como resultado la integración del ADN de interés dentro del genoma. Las composiciones y los métodos de la invención hacen uso en la construcción de células eucariotas transformadas de manera estable, y en particular, células vegetales.

Description

Método novedoso para la integración de un ADN foráneo dentro de genomas de eucariotas.

La invención se refiere a la modificación genética de cromosomas. En particular, se proporcionan métodos y composiciones para la integración de ADN dentro de un genoma eucariota.

Antecedentes de la invención

Se han usados varios enfoques para integrar un ADN de interés dentro del genoma de una planta. En el método más simple, el ADN se introduce dentro de una célula y se integra al azar dentro del genoma mediante recombinación ilegítima. Una desventaja de este método es que los efectos posicionales debidos a la integración al azar hacen que la expresión génica sea difícil de analizar.

Como una alternativa a la recombinación ilegítima, la integración debe dirigirse a un sitio particular en el genoma mediante el uso de recombinación homóloga o recombinación específica de sitio. En plantas, en las que la tecnología de recombinación homóloga todavía no se ha desarrollado, la recombinación específica de sitio se usa para integrar una secuencia de interés dentro de un sitio de integración que se ha insertado previamente dentro del genoma huésped de la planta. Si tiene lugar integración específica de sitio mediante un acontecimiento de entrecruzamiento único entre un cromosoma y un replicón extracromosómico circular, el replicón entero se insertará dentro del cromosoma. Cuando no se desea la inserción del replicón entero, puede introducirse un fragmento del replicón que comprende el ADN de interés, flanqueado por sitios diana para una recombinasa específica de sitio, mediante un acontecimiento de entrecruzamiento recíproco doble, dentro de un cromosoma que tiene un sitio de integración correspondiente a los sitios diana que flanquean el ADN de interés. En cualquier caso, la integración no es eficaz porque es reversible, es decir, el ADN integrado puede escindirse mediante recombinación específica de sitio posterior entre los sitios diana que flanquean el ADN integrado.

Se han adoptado diversos enfoques para evitar la escisión de un ADN integrado. En un enfoque, se regula temporalmente la expresión de una recombinasa específica de sitio, tal como Cre o FLP. Véanse, O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355; Logie y Stewart (1995) Proc Natl Acad Sci 92:5940-5944; Zhang et al. (1996) Nuc Acid Res 24:543-548; Nichols et al. (1997) Mol Endocinol 11:950-961; y Feil et al. (1997) Biochem Biophy Res Comm 237:752-757. En estos métodos, la recombinasa se expresa brevemente, bien de manera transitoria o inducible, con el fin de permitir la integración. Sin embargo, la escisión del ADN integrado puede tener lugar antes de que la recombinasa activa desaparezca de la célula. Además, la escisión intramolecular está favorecida cinéticamente con respecto a la integración bimolecular. Por tanto, el ADN integrado es inherentemente inestable en presencia de recombinasa.

Un segundo enfoque reduce la escisión del ADN integrado usando pares de sitios diana mutados individualmente tanto en el cromosoma como en el ADN flanqueante de interés. Véanse Albert et al. (1995) Plant J 7:649-659; Schlake y Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751; O'Gorman et al. (1997) Proc Natl Acad Sci 94:14602-14607; y Araki et al. (1997) Nuc Acid Res 25:868-872. La recombinación entre sitios diana mutados individualmente da como resultado sitios diana mutados doblemente que flanquean el ADN insertado dentro del cromosoma. Los sitios diana mutados doblemente no los reconoce bien la recombinasa. Así, el ADN insertado se escinde del cromosoma mediante una reacción inversa sólo a bajos niveles. Sin embargo, este sistema presenta la desventaja de que los sitios diana mutados individualmente a menudo no actúan como sustratos de recombinación eficaces, y así se reduce la frecuencia de integración. Además, los transformantes son inestables debido a que todavía puede tener lugar escisión, aunque a frecuencia reducida.

Ow et al. (1995), Critical Reviews in Plant Sciences 14(3), 239-261, describen varios sistemas de recombinación específica de sitio que han demostrado que funcionan en células eucariotas superiores. Estos sistemas de dos componentes consisten en una recombinasa de polipéptido único y una secuencia de reconocimiento corta de menos de 35 pb.

En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar métodos eficaces para la integración específica de sitio de ADN en genomas eucariotas que evitan reacciones de escisión posteriores y otras reacciones de recombinación no productivas.

Sumario de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para introducir un ADN de interés dentro de un sitio de integración genómica. En particular, los métodos y composiciones implican el uso de una combinación de sitios diana de dos recombinasas específicas de sitio distintas, tales como Cre y FLP, y la expresión de una recombinasa quimérica con especificidad de sitio diana dual. Así, las composiciones comprenden recombinasas específicas de sitio novedosas con especificidades frente a sitios diana múltiples, y las secuencias de nucleótido y los casetes de expresión que codifican para esas recombinasas o sitios diana. Los métodos implican transformar una célula eucariota que tiene sitios diana para la recombinasa novedosa con ADN de interés que está flanqueada por sitios diana correspondientes. La expresión o bien de la recombinasa quimérica novedosa, o bien de dos recombinasas específicas de sitio en la célula eucariota da como resultado la integración del ADN de interés dentro del genoma. Las composiciones y los métodos de la invención hacen uso en la construcción de células eucariotas transformadas de manera estable, y en particular, células vegetales. Los métodos dan como resultado la integración genómica dirigida eficaz de ADN mediante recombinación específica de sitio.

Según la invención, se proporciona así una proteína recombinante que comprende una primera recombinasa específica de sitio fusionada en el marco con una segunda recombinasa específica de sitio distinta.

La invención también proporciona:

-: una proteína recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 3, 6, 9 y 11;

-: una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una primera recombinasa específica de sitio fusionada en el marco con una segunda recombinasa específica de sitio distinta;

-: una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7 u 8.

-: una célula eucariota que tiene incorporada de manera estable en su genoma la molécula de ácido nucleico de la invención;

-: una planta que tiene integrada de manera estable dentro de un cromosoma al menos un sitio de integración que comprende un sitio diana para una primera recombinasa específica de sitio y un sitio diana para una segunda recombinasa específica de sitio distinta, en la que dichos sitios diana son contiguos.

-: una planta que tiene integrada de manera estable dentro de su genoma una molécula de ácido nucleico de la invención;

-: un método para integrar un ADN de interés dentro del genoma de una célula eucariota, que comprende:

(a): introducir dentro de dicha célula eucariota un casete de transferencia que comprende dicho ADN de interés, en el que dicho ADN de interés está flanqueado por un sitio diana para una primera recombinasa específica de sitio y un sitio diana para una segunda recombinasa específica de sitio distinta, y dicho genoma de la célula eucariota comprende al menos un sitio de integración que comprende sitios diana correspondientes a dichos sitios diana que flanquean dicho ADN de interés; y,

(b): proporcionar en dicha célula eucariota una proteína recombinante que comprende dicha primera recombinasa, un derivado activo de dicha primera recombinasa, o un fragmento activo de dicha primera recombinasa fusionado en el marco con dicha segunda recombinasa distinta, un derivado activo de dicha segunda recombinasa distinta, o un fragmento activo de dicha segunda recombinasa distinta, en la que dicha primera y dicha segunda recombinasa, dicho derivado activo, o dicho fragmento activo catalizan un acontecimiento de recombinación específica de sitio conservativa,

: en el que el ADN de interés se integra dentro del genoma en el sitio de integración.

(a): introducir dentro de dicha célula eucariota un casete de transferencia que comprende dicho ADN de interés, en el que dicho ADN de interés está flanqueado por un sitio diana para una primera recombinasa específica de sitio y un sitio diana para una segunda recombinasa específica de sitio distinta, y dicho genoma de la célula eucariota comprende al menos un sitio de integración que comprende dichos sitios diana correspondientes a dichos sitios diana que flanquean dicho ADN de interés; y,

(b): proporcionar en dicha célula dicha primera recombinasa, un derivado activo de dicha primera recombinasa, o un fragmento activo de dicha primera recombinasa; y, dicha segunda recombinasa distinta, un derivado activo de dicha segunda recombinasa, o un fragmento activo de dicha segunda recombinasa distinta, en la que dichas primeras y dichas segundas recombinasas, dicho derivado activo, o dicho fragmento activo catalizan un acontecimiento de recombinación específica de sitio conservativo; y

-: una semilla transformada de una planta de la invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa esquemáticamente vectores de transformación de plantas, PHP13164 y PHP13147, para la expresión de la recombinasa moCRE y la recombinasa Cre:FLPm, respectivamente.

La figura 2 representa gráficamente la activación de la expresión de GUS mediante escisión mediada por FLPm o CRE:FLPm de una secuencia flanqueada por sitios FRT que separan un promotor de ubiquitina y el marco de lectura abierto de GUS.

La figura 3 representa gráficamente la activación de la expresión de GUS mediante escisión mediada por
CRE:FLPm de una secuencia flanqueada por sitios loxP que separan el promotor de ubiquitina y el marco de lectura abierto de GUS.

Descripción detallada de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para la integración específica de sitio de ADN en sitios de integración genómica predeterminados en un genoma huésped. La invención prevé el uso de recombinasas quiméricas que catalizan la recombinación específica de sitio entre sitios diana que se originan de diferentes sistemas de recombinación específicos de sitio. Una recombinasa quimérica de función dual de este tipo garantiza que los dos extremos de ADN foráneo no liguen entre sí, sino que en lugar de eso, se recombinen con sus sitios diana de pareja análoga que se alojan en el ADN genómico. Los métodos facilitan la selección como diana direccional de secuencias de nucleótidos y genes deseados dentro de sitios de integración correspondientes introducidos anteriormente dentro del genoma.

En los métodos de la invención, una combinación de sitios diana para dos recombinasas específicas de sitio se introducen dentro del genoma de un organismo de interés, estableciendo un sitio de integración para la inserción de secuencias de nucleótidos de interés. Para los fines de la invención, un sitio de integración comprenderá sitios diana flanqueantes en los que los sitios diana corresponden a los sitios de recombinación para dos recombinasas específicas de sitio distintas. Estos sitios diana o de recombinación pueden flanquear otras secuencias de nucleótido o pueden ser contiguos. Métodos para la producción de plantas transgénicas que contienen sitios de recombinación específicos integrados en el genoma de la planta se describen en la solicitud de patente provisional en tramitación junto con la presente, número de serie 60/065.627, titulada "Composiciones y métodos para la modificación genética de plantas", presentada el 18 de noviembre de 1997, y que se incorpora al presente documento como referencia. Una vez que se establece una planta estable o un tejido cultivado, se introduce un casete de transferencia que comprende un ADN de interés, flanqueado por sitios diana que corresponden a los del sitio de integración del genoma, en la planta o tejidos transformados de manera estable en presencia de una recombinasa quimérica con especificidades para cada uno de los sitios diana. Alternativamente, dos recombinasas distintas que corresponden a los sitios diana pueden estar presentes en la célula en lugar de una recombinasa quimérica. Este procedimiento da como resultado un intercambio de secuencias de nucleótidos entre los dos sitios diana idénticos del sitio de integración genómica y del casete de trans-
ferencia.

Así, la invención proporciona un método para integrar un ADN de interés dentro del genoma de una célula eucariótica, que comprende:

(a) transformar dicha célula con un casete de transferencia que comprende dicho ADN, en la que dicho ADN está flanqueado por un sitio diana para una primera recombinasa específica de sitio y un sitio diana para una segunda recombinasa específica de sitio, y dicho genoma contiene un sitio de integración que comprende sitios diana que corresponden a dichos sitios diana que flanquean dicho ADN; y

(b) proporcionar en dicha célula una proteína recombinante que comprende dicha primera recombinasa fusionada en el marco con dicha segunda recombinasa.

La invención proporciona además un método para integrar un ADN de interés dentro del genoma de una célula eucariota, que comprende:

(b) proporcionar en dicha célula dicha primera recombinasa y dicha segunda recombinasa.

Por "recombinasa específica de sitio" quiere decirse cualquier enzima que catalice la recombinación específica de sitio conservativa entre sus sitios de recombinación correspondientes. Para revisiones de recombinasa específica de sitio, véanse Sauer (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:521-527; y Sadowski (1993) FASEB 7:760-767.

Las primera y segunda recombinasas específicas de sitio pueden ser recombinasas de longitud completa y/o fragmentos activos o derivados de las mismas. Recombinasas específicas de sitio útiles para crear las recombinasas quiméricas de la invención incluyen recombinasas de la familia de las integrasas, derivados de las mismas, y cualquier otra enzima que tiene lugar de manera natural o que se produce de manera recombinante o derivados de las mismas, que catalizan la recombinación específica de sitio conservativa entre sitios de ADN especificados. La familia integrasa de recombinasas tiene más de treinta miembros e incluye FLP, Cre, Int y R. Preferiblemente, las recombinasas no necesitan cofactores o un sustrato superenrollado. Más preferiblemente, las recombinasas son Cre y FLP. Los sistemas de recombinación específica de sitio del bacteriófago P1, loxP-Cre, y el plásmido FRT/FLP de 2 \mu de Saccharomyces se han estudiado ampliamente y los expertos en la técnica conocen bien sus usos. Se sabe que Cre y FLP funcionan en una variedad de organismos, incluyendo bacterias, levaduras, Drosophila, mamíferos y plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Además, estas recombinasas no necesitan factores auxiliares para funcionar.

Las recombinasas específicas de sitio y las secuencias que las codifican que se usan en los métodos y composiciones de la invención pueden ser variantes de recombinasas que se producen de manera natural y los genes que las codifican. El término "variantes modificadas conservativamente" se aplica a las secuencias tanto de aminoácido como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes modificadas conservativamente se refieren a los ácidos nucleicos que codifican para variantes modificados idéntica o conservativamente de secuencias de aminoácido. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican para cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos para el aminoácido alanina. Así, en cada posición en la que la alanina se especifica por un codón, el codón puede modificarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin modificar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación modificada conservativamente. Un experto habitual en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para metionina) puede modificarse para dar una molécula idéntica
funcionalmente.

Como para las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que sustituciones individuales, deleciones o adiciones a un ácido nucleico, péptido, polipéptido, o secuencia de proteína que modifique, añada o delecione un aminoácido único o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" en la que la modificación da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Por tanto, cualquier número de residuos de aminoácido seleccionado del grupo de enteros que consisten en desde 1 hasta 15 pueden modificarse tanto. Así, por ejemplo, pueden realizarse 1, 2, 3, 4, 5, 7, o 10 modificaciones. Los variantes modificadas conservativamente proporcionan normalmente actividad biológica similar a la de la secuencia de polipéptido no modificada de la que se derivan. Por ejemplo, especificidad de sustrato, actividad enzimática, o unión ligando/receptor representan generalmente al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% de la proteína nativa para su sustrato nativo. Se conocen bien en la técnica tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos similares funcionalmente.

Los siguientes seis grupos contiene cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas el uno del otro:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

Véase Creighton (1984) Proteins, W.H: Freeman and Company.

Mejor que utilizar recombinasas de longitud completa, pueden utilizarse fragmentos funcionales de recombinasas específicas de sitio en los métodos y composiciones de la invención. Los fragmentos funcionales de recombinasas específicas de sitio pueden identificarse utilizando una variedad de técnicas. Por ejemplo, fragmentos funcionales de la proteína FLP pueden identificarse por su capacidad, en la introducción a células que contienen sustratos FRT apropiados, para catalizar la recombinación específica de sitio y dar como resultado la escisión de un gen marcador que se puede someter a ensayo.

Un enfoque general de tal análisis funcional implica subclonar fragmentos de ADN de un clon genómico, clon de ADNc o secuencia génica sintetizada dentro de un vector de expresión, introduciendo el vector de expresión dentro de un huésped heterólogo, y seleccionando para detectar el producto de recombinación (es decir, utilizando análisis de restricción para verificar el producto de recombinación a nivel de ácido nucleico, o confiando en un sistema de ensayo para recombinación como el descrito anteriormente). Se conocen bien los métodos para generar fragmentos de un ADNc o clon genómico. Variantes de un ADN aislado que codifica para una recombinasa específica de sitio pueden producirse mediante deleción, adición y/o sustitución de nucleótidos. Tales variantes pueden obtenerse, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida de oligonucleótido, mutagénesis de selección de secuencias de unión, mutagénesis usando la reacción en cadena de la polimerasa, y similares. Véanse, por ejemplo, Ausubel, Current Protocols In Molecular Biology, Wiley Interscience (1990) páginas 8.0.3-8.5.9, y McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach, (IRL Press, 1991).

Las proteínas recombinantes de función dual de la invención comprenden una primera recombinasa específica de sitio fusionada en el marco con un segunda recombinasa específica de sitio. Se reconocerá que en los métodos de la invención, las recombinasas que comprenden la recombinasa quimérica deben corresponder a los sitios diana del organismo transformado y la casete diana. Es decir, si se utilizan sitios FRT y loxP, se necesitará una recombinasa FLP:Cre quimérica.

Los marcos de lectura abiertos que codifican para las primera y segunda recombinasas pueden fusionarse directamente entre sí o pueden unirse mediante una secuencia de unión que mantiene el marco de lectura correcto de la recombinasa quimérica. Se entiende que las recombinasas pueden fusionarse en extremo amino con extremo carboxilo terminal, en extremo amino con extremo amino terminal, o en extremo carboxilo con extremo amino terminal.

Los genes que codifican para recombinasas específicas de sitio quiméricas y sitios de recombinación pueden producirse utilizando métodos recombinantes convencionales, técnicas de síntesis o combinaciones de los mismos. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y secuencias de unión se conoce bien en la técnica y pueden encontrarse en referencias tales como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Se dispone de una variedad de estrategias para ligar fragmentos de ADN, cuya elección depende de la naturaleza de las terminaciones de los fragmentos de ADN y cuya elección debe realizarse fácilmente por lo expertos en la técnica. El gen de la recombinasa FLP de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) está disponible comercialmente en el plásmido pOG44 de Stratagene Cloning Systems (11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037). Para la descripción del gen de FLP y varios ácidos nucleicos, véanse, por ejemplo, Stratagene Cloning Systems, Catalogs 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); y, Amersham Life Sciences, Inc, Catalog'97 (Arlington Heights, IL). De manera similar, las secuencias de otras muchas recombinasas específicas de sitio y sus sitios de recombinación análogos están disponibles pública o comercialmente. También pueden obtenerse los genes que codifican para FLP y Cre, por ejemplo mediante la síntesis de genes con oligonucleótidos largos que se ceban mutuamente. Véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.), Current Protocols In Molecular Biology, páginas 8.2.8 a 8.2.13, Wiley Interscience (1990). También véase Wosniak et al. (1987) Gene 60:115. Además, la técnicas actuales usando la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad de sintetizar genes tan grandes como de 1,8 kilobases de longitud (Adang et al. (1993) Plant Mol. Biol. 21:1131; Bombat et al. (1993) PCR Methods and Applications 2:266).

Cuando el ácido nucleico se prepara o modifica sintéticamente, puede obtenerse ventaja de las preferencias de codón conocido del huésped pretendido en el que va a expresarse el ácido nucleico. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden expresarse tanto en especies de plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias pueden modificarse para explicar las preferencias de codón específicas y las preferencias de contenido en GC de monocotiledóneas o dicotiledóneas puesto que estas preferencias han mostrado que difieren (Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-498; y Campbell et al. (1990) Plant Physiol. 92:1). Así, el codón preferido del maíz para un aminoácido particular puede derivarse de secuencias génicas conocidas del maíz. La utilización de codones de maíz para 28 genes de plantas de maíz se enumera en la tabla 4 de Murray et al., citado anteriormente.

Ejemplos de genes que codifican para recombinasas, utilizando codones de maíz preferidos incluyen, FLPm, descrito en la solicitud de patente en tramitación junto con la presente 08/972.258; cuyos contenidos se incorporan al presente documento como referencia, y moCre, mostradas en SEQ. ID NOS. 1 y 2. FLPm se deriva de la recombinasa FLP de plásmido de 2 \mu de Saccharomyces, pero está codificado por una secuencia de ácido nucleico que utiliza codones preferidos de maíz. Aunque la secuencia de ácido nucleico de FLPm incluye codones preferidos para la expresión de aminoácidos en maíz, se entiende que una secuencia útil puede contener codones que aparecen en el maíz con menos frecuencia que las frecuencias de codones de maíz notificadas como las más altas. Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican para recombinasas quiméricas incluyen Cre:FLPm (SEQ. ID NO. 4), moCre:FLPm (SEQ. ID NO. 5), Cre:FLP (SEQ. ID NO. 7) y FLPm:Cre (SEQ. ID NO. 8).

La invención también proporciona casetes de expresión que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica para una recombinasa específica de sitio quimérica, unida operativamente a un promotor que conduce la expresión en una célula eucariota. Preferiblemente, el promotor es un promotor de plantas. Por ejemplo, el vector de expresión de plantas PHP13147, mostrado en la figura 1, contiene un casete de expresión para Cre:FLPm, en el que el gen que codifica para la recombinasa quimérica está unido de manera operativa a un promotor de ubiquitina. Tal como se utiliza en el presente documento, "unido operativamente" se refiere a una unión funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en el que la secuencia de promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. Generalmente, unido operativamente significa que la secuencias de ácido nucleico que se están uniendo son contiguas y, en las que es necesario unir dos regiones codificantes de proteína, contiguas y en el mismo marco de lectura.

Tal como se utiliza en el presente documento "promotor" se refiere a una región de ADN hacia 5' desde el inicio de la transcripción y está implicado en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor de plantas" es un promotor que puede iniciar la transcripción en células vegetales. Promotores de plantas ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los que se obtienen de plantas, virus de plantas, y genes bacterianos que se expresan en células vegetales tales como los de Agrobacterium o Rhizobium. Pueden emplearse tanto promotores heterólogos como no heterólogos (es decir, endógenos) para dirigir la expresión de una secuencia que codifica para una recombinasa específica de sitio. El promotor puede ser constitutivo, inducible o específico de tejido.

Pueden utilizarse muchos promotores constitutivos diferentes en la presente invención. Promotores constitutivos ejemplo incluyen los promotores de virus de plantas tales como el promotor 35S de CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812) y los promotores de genes tales como actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); histona H3 del maíz (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231: 276-285 y Atanassova et al. (1992) Plant Journal 2(3):291-300); el promotor 1'- o 2' derivado del T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, el promotor Smas, el promotor alcohol cinámico deshidrogenasa (patente de los EE.UU. número 5.683.439), el promotor Nos, el promotor Pemu, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8, y otras regiones de iniciación de la transcripción de diversos genes de plantas conocidos por los expertos. El promotor ALS, un fragmento en XbaI/NcoI en 5-prima del gen estructural ALS3 de Brassica napus (o una secuencia de nucleótidos que tiene una similitud de secuencia sustancial a dicho fragmento de XbaI/NcoI), representa un promotor constitutivo particularmente útil. (Véase la solicitud de patente de los EE.UU. en tramitación junto con la presente de Pioneer Hi-Bred International 08/409.297 y la patente de los EE.UU. correspondiente número 5.659.026 publicada el 19 de agosto de 1997).

Pueden utilizarse una variedad de promotores inducibles en la presente invención. Véase Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Promotores inducibles ejemplo incluyen los del sistema ACE1 que responde al cobre (Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571); el gen In2 de maíz que responde a antídotos herbicidas de bencenosulfonamida (Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 y Gatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38); el promotor Adhl que es inducible por hipoxia o choque de frío, el promotor Hsp70 que se induce por choque de calor, y el promotor PPDK que es inducible por luz; o el represor Tet de Tn10 (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229-237. Un promotor inducible particularmente preferido es el promotor que responde a un agente inductor al que las plantas no suelen responder. Un promotor inducible ejemplo es el promotor inducible de un gen de hormona esteroidea cuya actividad transcripcional está inducido por una hormona glucocorticosteroide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:10421).

Ejemplos de promotores bajo control del desarrollo incluyen promotores que sólo inician la transcripción, o preferiblemente, en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, fruta, semilla, o flores. El funcionamiento de un promotor puede variar también dependiendo de su localización en el genoma. Así, un promotor inducible puede volverse total o parcialmente constitutivo en ciertas localizaciones.

La recombinasa quimérica debe expresarse en la célula vegetal con el fin de integrar el ADN de interés dentro del cromosoma huésped. En consecuencia, el casete de expresión que codifica para la recombinasa específica de sitio puede suministrarse en cis en el ADN de interés; en trans en un replicón cromosómico o extracromosómico del huésped; o puede transferirse al huésped y expresarse de manera transitoria cerca del momento en el que se desea la recombinación.

Las composiciones de la invención incluyen casetes de transferencia que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para las recombinasas quiméricas de la invención. Por casete de transferencia quiere decirse cualquier secuencia de nucleótidos que pueda utilizare para transformar una célula de interés. Por ejemplo, el casete de transferencia puede ser un replicón independiente tal como un plásmido, vector lanzadera, plásmido Ti, vector viral o similares. Alternativamente, el casete de transferencia podría ser un ácido nucleico que no puede replicarse de manera independiente, aunque podría transferirse dentro de un organismo de interés mediante una variedad de protocolos de transformación, tales como bombardeo con partículas, electroporación y similares. Así, la invención proporciona un casete de transferencia que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína recombinante que comprende una primera recombinasa específica de sitio fusionada en el marco con una segunda recombinasa específica de sitio, en la que dicha secuencia de nucleótidos está unida de manera operativa a un promotor que conduce la expresión en una célula eucariota.

En las composiciones y métodos de la invención, el ADN de interés está flanqueado por sitios diana para dos recombinasas específica de sitio distintas. Por "flanqueado por" quiere decirse que la recombinación o los sitios diana pueden ser directamente contiguos al ADN de interés, o puede haber uno o más intrones presentes entre uno o ambos extremos del ADN de interés y los sitos de recombinación específica de sitio. Intrones de interés particular incluirían secuencias de unión, adaptadores, marcadores seleccionables y/o otros sitios que ayudan en la construcción de vectores o análisis y casete de expresión para un gen de interés. Los expertos en la técnica conocen sitios diana para recombinasas específica de sitio y se tratan en la solicitud de patente provisional en tramitación junto con la presente 60/065.613. Ejemplos de sitios diana incluyen, pero no se limitan a FRT, FRT1, FRT5, FRT6, FRT7, otros mutantes de FRT, loxP, mutantes de loxP, y similares. Véanse, por ejemplo, Schlake y Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19:443-448; Sadowski (1995) In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology vol.51, páginas 53-91; Cox (1989) In Mobile DNA, Berg y Howe (eds) American Society of Microbiology, Washington D.C., páginas 116-670; Dixon et al. (1995) 18:449-458; Umlauf y Cox (1988) The EMBO Journal 7:1845-1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24:3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9:413-421: Rossant y Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592-594; Albert et al. (1995) The Plant J. 7:649-659: Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:353-361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223:369-378; Dale y Ow (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10558-105620; Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:901-913; y Dale et al. (1990) Gene 91:79-85.

Por "sitio diana para una recombinasa específica de sitio" quiere decirse una secuencia de ADN que es reconocida por una recombinasa específica de sitio particular. Los expertos en la técnica conocen una variedad de sitios de recombinación y pueden utilizarse en los métodos y las composiciones de la invención. El sitio puede tener la secuencia del sitio relacionado para una recombinasa dada, o puede modificarse, siempre que pueda actuar como sitio de recombinación. El sitio puede contener las secuencias mínimas necesarias para recombinación, o puede contener secuencias adicionales que favorecen la recombinación. Se conocen en la técnica ejemplos de sitios de recombinación para su uso en la invención e incluyen sitios FRT y sitios loxP. (Véanse, por ejemplo Schlake y Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19:443-448; Paul D. Sadowski (1995) In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology vol. 51, páginas 53-91; Michael M. Cox (1989) In Mobile DNA, Berg and Howe (eds) American Society of Microbiology, Washington D.C., páginas 116-670; Dixon et al. (1995) 18:449-458; Umlauf y Cox (1988) The EMBO Journal 7:1845-1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24:3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9:413-421: Rossant y Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592-594; Albert et al. (1995) The Plant J. 7:649-659: Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:353-361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223:369-378; Dale y Ow (1991) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 88:10558-105620; Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:901-913: Hardey et al. (1980) Nature 286: 860-864; Sauer (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:521-527; y Dale et al. (1990) Gene 91:79-85.

Cada sitio loxP y FRT contiene dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases que flanquean un espaciador de 8 pares de bases. El sitio FRT contiene una repetición de 13 pares de bases no esenciales adicional. Las secuencias de los sitios loxP y FRT se muestran en SEQ. ID NO.1 y SEQ. ID NO. 2. Un sitio FRT mínimo (SEQ ID Nº 10) que comprende dos repeticiones de 13 pares de bases, separadas por un espaciador de 8 bases, es:

5'GAAGTTCCTATTC[TCTAGAAA]GTATAGGAACTTC3'

en el que los nucleótidos dentro de los corchetes indican la región espaciadora. Los nucleótidos en la región espaciadora pueden sustituirse con una combinación de nucleótidos, mientras que las dos repeticiones de 13 bases estén separadas por ocho nucleótidos. FLP es una recombinasa conservativa, específica de sitio, que puede catalizar la inversión de una secuencia de ácido nucleico colocada entre dos FRT orientados inversamente; la recombinación entre dos moléculas conteniendo cada una un sitio FRT; y la escisión entre sitios FRT. La región del núcleo no es simétrica, y su asimetría dicta la direccionalidad de la reacción. La recombinación entre sitios FRT invertidos provoca la inversión de una secuencia de ADN entre ellos, mientras que la recombinación entre sitios orientados directamente conduce a la escisión del ADN entre ellos.

Pueden construirse las secuencias de nucleótidos que contienen un ADN de interés flanqueado por sitios diana, casetes de transferencia para dos recombinasas específicas de sitio distintas y vectores que llevan estas secuencias, utilizando técnicas de biología molecular convencionales. Véase por ejemplo, Sambrook et al. (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989).

Técnicas para transformar una amplia variedad de células eucariotas, incluyendo especies de plantas superiores se conocen bien y se describen en bibliografía técnica, científica y de patentes. Véase, por ejemplo, Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1988). Estos métodos son útiles para transformar una célula vegetal con los casetes de expresión de recombinasa quimérica de la invención y ADN de interés flanqueados por sitios diana para la recombinasa quimérica. El casete de expresión que codifica para la recombinasa específica de sitio puede estar presente en el genoma de la planta antes de la transformación del ADN de interés, o puede transformarse dentro de la planta aproximadamente el tiempo de transformación con el T-ADN a la célula vegetal de modo que se expresará de manera transitoria. Por ejemplo, el constructo de ADN puede introducirse directamente dentro del ADN genómico de la planta utilizando técnicas tales como la electroporación, poración con PEG, bombardeo de partículas, administración de fibras de silicona, o microinyección de protoplastos o callos embriogénicos de células vegetales.

Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens están bien descritas en la bibliografía científica. Véase, por ejemplo Horsch et al., Science 233: 496-498 (1984), Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803 (1983), Kado, (1991), Crit. Rev. Plant Sci. 10:1 y Moloney et al. (1989), Plant Cell Reports 8:238. Aunque Agrobacterium es útil principalmente en dicotiledóneas, ciertas monocotiledóneas pueden transformase por Agrobacterium. Por ejemplo, la transformación por Agrobacterium del maíz se describe en la patente de los EE.UU. número 5.550.318. Otros métodos de agroinfección incluyen transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes (véase, por ejemplo, Lichtenstein y Fuller In: Genetic Engineering, vol. 6, PWJ Rigby, Ed., Londres, Academic Press, 1987; y Lichtenstein, C. P., y Draper, J,. In: DNA Cloning, Vol. II, D. M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press, 1985), solicitud PCT/US87/02512 (documento WO 88/02405 publicado el 7 de abril de 1988) describe el uso de la cepa de A.rhizogenes A4 y su plásmido Ri, junto con los vectores de A. tumefaciens, pARC8 o pARC16.

Vectores y métodos optimizados para transformación mediada por Agrobacterium de plantas de la familia Graminae, tales como arroz y maíz se describen en Heath et al. (1997) Mol. Plant-Microbe Interact. 10:221-227; Hiei et al. (1994) Plant J. 6:271-282 e Ishida et al. (1996) Nat. Biotech. 14:745-750.

La eficacia de transformación del maíz se ve afectada por una variedad de factores que incluyen los tipos y las fases de tejido infectado, la concentración de Agrobacterium, el medio de cultivo tisular, los vectores Ti y el genotipo del maíz. Los vectores superbinarios que llevan los genes vir de las cepas de Agrobacterium A281 y A348 son útiles para la transformación de alta eficacia de monocotiledóneas.

La introducción de constructos de ADN utilizando la precipitación de polietilenglicol se describe en Paszkowski et al., Embo J. 3: 2717-2722 (1984). Las técnicas de electroporación se describen en Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824 (1985). Las técnicas de transformación balística se describen en Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987).

Se conocen en la técnica medios virales para introducir ADN dentro de células de mamífero. En particular, se conocen varios sistemas de vectores para la introducción de genes foráneos o nativos dentro de células de mamífero. Estos incluyen el virus SV40 (véase, por ejemplo, Okayama et al. (1985) Molec. Cell Biol. 5:1136-1142); virus del papiloma bovino (véase, por ejemplo, DiMaio et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4030-4034); adenovirus (véase, por ejemplo, Morin et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4626; Yifan et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1401-1405; Yang et al. (1996) Gene Ther. 3:137-144; Tripathy et al. (1996) Nat. Med. 2:545-550; Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; Wagner (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6099-6103; Curiel et al. (1992) Human Gene Therapy 3:147-154; Curiel (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850-8854; LeGal LaSalle et al. (1993) Science 259:590-599; Kass-Eisler et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1,1498-11502); virus adenoasociados (véase, por ejemplo, Muzyczka et al. (1994) J. Clin. Invest. 94:1351; Xiao et al. (1996) J. Virol. 70:8098-8108); virus del herpes simple (véase, por ejemplo, Geller et al. (1988) Science 241:1667; Huard et al. (1995) Gene Therapy 2:385-392; patente de los EE.UU. número 5.501.979); vectores basados en retrovirus (véase, por ejemplo, Curran et al. (1982) J. Virol. 44:674-682; Gazit et al. (1986) J. Virol. 60:19-28; Miller, A.D. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:1-24; Cavanaugh et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7071-7075; Smith et al. (1990) Molecular and Cellular Biology 10:3268-3271). Véase también, Wu et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:14338-14342; Wu y Wu J. Biol Chem. (1988) 263:14621-14624; Wu et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:16985-16987; Zenke et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3655-3659; Wagner et al. (1990) 87:3410-3414.

También puede introducirse ADN dentro de plantas mediante transferencia de ADN directa dentro de polen tal como se describe en Zhou et al., Methods in Enzymology, 101:433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 6:165 (1988). La expresión de genes que codifican para polipéptido puede obtenerse mediante inyección de ADN dentro de órganos reproductores de una planta tal como se describe en Pena et al., Nature, 325.:274 (1987). También puede inyectarse ADN directamente dentro de células de embriones inmaduros y rehidratar los embriones desecados tal como se describe en Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987); y Benbrook et al., in Proceedings Bio Erpo 1986, Butterworth, Stoneham. Mass., páginas 27-54 (1986). Se conoce en la técnica una variedad de virus de plantas que pueden emplearse como vectores e incluyen el virus del mosaico de la coliflor (CaMV), geminivirus, virus del mosaico del bromo, y virus del mosaico del tabaco.

Células vegetales transformadas de manera estable con un casete de expresión de recombinasa quimérica puede regenerarse por ejemplo, a partir de células únicas, tejido calloso, o discos de hoja según técnicas de cultivo tisular de plantas. Se conoce bien en la técnica que varias células, tejidos, y órganos a partir de casi cualquier planta pueden cultivarse de manera satisfactoria para generar una planta completa. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillilan Publishing Company, Nueva York, páginas 124-176 (1983); y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Ratón, páginas 21-73 (1985).

La regeneración de plantas que contienen los genes recombinantes puede lograrse tal como se describe en Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985). En este procedimiento, los transformantes se hacen crecer en presencia de un agente de selección y en un medio que induce la regeneración de brotes en la especie de planta que se está transformando tal como se describe en Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983). Este procedimiento produce normalmente brotes en de dos a cuatro semanas y estos brotes transformantes se transfieren entonces a un medio apropiado inductor de raíces que contiene el agente de selección y un antibiótico para evitar el crecimiento de bacterias. Las plantas transgénicas de la presente invención pueden ser fértiles o estériles.

También puede obtenerse regeneración a partir de callos, explantes y órganos de plantas, o partes de los mismos. Tales técnicas de regeneración se describen generalmente en Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486 (1987). La regeneración de plantas a partir de o bien protoplastos de plantas únicos o explantes diversos se conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach y H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988). Este procedimiento de regeneración y crecimiento incluye las etapas de selección de células y brotes transformantes, arraigando los brotes transformantes y el crecimiento de las plántulas en la tierra. Para el cultivo de células de maíz y regeneración véase generalmente, The Maize Handbook, Freeling y Walbot, Eds., Springer, Nueva York (1994); Corn and Corn Improvement, 3ª edición, Sprague and Dudley Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988).

Un experto reconocerá que tras un ADN, tal como un casete de expresión de recombinasa quimérica o un sitio diana para una recombinasa quimérica, se incorpora de manera estable en plantas transgénicas y se confirma que es funcional, puede introducirse dentro de otras plantas mediante cruzamiento sexual. Puede utilizarse cualquiera de varias técnicas de cultivo convencionales, dependiendo de las especies que se van a cruzar.

Los métodos y composiciones de la invención son útiles para integrar un ADN de interés dentro del genoma de cualquier célula huésped, incluyendo huésped de planta. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "planta" se refiere a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas y células vegetales y progenie de las mismas. Célula vegetal, tal como se utiliza en el presente documento incluye, sin limitación, cultivos en suspensión de semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas. La clase de plantas que pueden utilizarse en los métodos de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores dispuestas frente a técnicas de transformación, incluyendo tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Una monocotiledónea particularmente preferida es maíz. Otras monocotiledóneas de interés particular incluyen trigo, arroz, cebada, sorgo y centeno. Las dicotiledóneas de interés particular incluyen soja, Brassica, girasol, alfalfa y cártamo.

Debido al uso de recombinasas específica de sitio quiméricas y sitios diana proporcionados en el presente documento, las células transformadas mediante los métodos de la invención pueden distinguirse de otros métodos de transformación ya que las células modificadas de la invención contendrán secuencias de nucleótidos de interés insertadas dentro del genoma flanqueadas por sitios diana para distintas recombinasas.

Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Parte experimental Ejemplo 1 Construcción de vectores que contienen un ADN de interés flanqueado por sitios diana para un recombinasa específica de sitio quimérica

Se construyen fragmentos de ADN que contienen un ADN de interés flanqueado por sitios diana loxP y FRT mediante o bien sintetizando, apareando y ligando oligonucleótidos complementarios o bien creando cebadores para amplificación por PCR de un ADN de interés que contiene sitios loxP y FRT además de sitios de restricción útiles para clonar dentro de un vector de elección.

Por ejemplo, pueden diseñarse cebadores de PCR largos en los que el extremo 3' del cebador hibrida con el extremo 5' de ADN de interés y el extremo 5' del cebador contiene además sitios loxP y FRT y sitio de clonación útiles. El producto de la PCR resultante se digiere con la enzima de restricción apropiada y se inserta dentro de un vector apropiado.

Ejemplo 2 Escisión del sitio FRT mediante FLPm y la recombinasa quimérica Cre:FLPm

Se transformó un casete de transferencia que codifica para una recombinasa quimérica Cre-FLPm dentro de células vegetales que tienen un casete de expresión que codifica para GUS conducido por el promotor de ubiquitina, en el que una secuencia flanqueada por cualquiera de los sitios FRT o loxP idénticos interrumpían el marco de lectura abierto GUS. Las figuras 2 y 3 muestran que la recombinasa quimérica Cre-FLPm es funcional independientemente en cualquiera del sitio FRT o el sitio loxP, tal como se mide por la capacidad para activar la actividad la actividad de GUS tras la escisión de secuencias entre dos sitios diana idénticos, trayendo de ese modo la actividad de GUS bajo el control del promotor de ubiquitina.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los expertos en la técnica a los que se dirige esta invención.

Aunque la invención precedente se ha descrito en algún detalle por medio de ilustraciones y ejemplos para fines de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden realizarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> Pioneer Hi-Bred International, Inc.

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<120> Método novedoso para la integración de un ADN foráneo dentro de genomas de eucariotas

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<130> N.79644

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<140> EP 98960261.0

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<141> 17-11-1998

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<150> 60/099.435

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<151> 08-09-1998

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<150> 60/056.627

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<151> 18-11-1997

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<150> 60/065.613

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<151> 18-11-1997

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<160> 11

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 343

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: proteína Cre del bacteriófago P1 con codones preferidos de maíz (moCRE)

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<400> 1

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1

2

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<210> 2

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<211> 1032

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína Cre del bacteriófago P1 con codones preferidos de maíz (moCRE)

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<400> 2

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3

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<210> 3

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<211> 781

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: polipéptido Cre:FLPm, Cre del bacteriófago P1 y FLP de Saccharomyces con codones preferidos de maíz.

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<400> 3

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4

5

6

7

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<210> 4

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<211> 2346

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido Cre:FLPm, Cre del bacteriófago P1 y FLP (codones preferidos de maíz) de Saccharomyces

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<400> 4

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8

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<210> 5

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<211> 2346

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia que codifica para moCre:FLPm, Cre del bacteriófago P1 y FLP de Saccharomyces, ambos codones preferidos de maíz.

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(2346)

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<400> 5

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10

11

12

13

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<210> 6

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<211> 781

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 6

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14

15

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<210> 7

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<211> 2346

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia que codifica para un polipéptido Cre:FLP, Cre del bacteriófago P1 y FLP de Saccharomyces

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<400> 7

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16

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<210> 8

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<211> 2346

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia que codifica para un polipéptido FLPm:Cre, FLP (codones preferidos de maíz) de Saccharomyces, y Cre del bacteriófago P1

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(2346)

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<400> 8

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17

18

19

20

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<210> 9

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<211> 781

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 9

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21

22

23

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<210> 10

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: sitio de recombinación FRT de tipo salvaje mínimo

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc

\hfill

34

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<210> 11

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<211> 781

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: polipéptido Cre:FLPm, Cre del bacteriófago P1 y FLP de Saccharomyces

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<400> 11

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24

25

26

Claims

1. Proteína recombinante que comprende: una primera recombinasa específica de sitio fusionada en el marco con una segunda recombinasa específica de sitio distinta.

2. Proteína recombinante según la reivindicación 1, en la que dicha primera y dicha segunda recombinasa específica de sitio distinta son miembros de la familia integrasa de recombinasas, un derivado activo de un miembro de la familia integrasa de recombinasas o un fragmento activo de un miembro de la familia integrasa de recombinasas, en la que dichas recombinasas, dicho derivado activo, o dicho fragmento activo catalizan la recombinación específica de sitio conservativa.

3. Proteína recombinante según la reivindicación 2, en la que dicha primera y segunda recombinasa distinta se seleccionan del grupo que consiste en Cre, FLP, un derivado activo de Cre, y un fragmento activo de Cre, un fragmento activo de FLP, y un derivado activo de FLP, en el que dicha recombinasa, dicho fragmento activo, o dicho derivado activo catalizan la recombinación específica de sitio conservativa.

4. Proteína recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 3, 6, 9 y 11.

5. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una primera recombinasa específica de sitio fusionada en el marco con una segunda recombinasa específica de sitio distinta.

6. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica para dicha primera y dicha segunda recombinasas específica de sitio distintas de las reivindicaciones 2, 3, o 4.

7. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, en la que dicha primera o segunda recombinasa distinta comprende Cre o FLP, en la que dicha recombinasa Cre está codificada por SEQ ID NO: 2, un fragmento activo de SEQ ID NO: 2 o un derivado activo de SEQ ID NO: 2, y dicha recombinasa FLP está codificada por FLPm, y un fragmento activo de FLPm, o un derivado activo de FLPm, en la que dicho fragmento activo o derivado codifica para una recombinasa que puede catalizar un acontecimiento de recombinación específica de sitio conservativa.

8. Molécula de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, o 8.

9. Molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que dicha molécula está unida funcionalmente a un promotor que impulsa la expresión en una célula eucariota.

10. Célula eucariota que tiene incorporada de manera estable en su genoma la molécula de ácido nucleico tal como la que se define en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.

11. Célula eucariota según la reivindicación 10, en la que dicha célula es una célula vegetal.

12. Célula eucariota según la reivindicación 11, en la que dicha célula vegetal procede de una monocotiledónea.

13. Célula eucariota según la reivindicación 12, en la que dicha monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.

14. Célula eucariota según la reivindicación 11, en la que dicha célula procede de una dicotiledónea.

15. Célula eucariota según la reivindicación 14, en la que dicha dicotiledónea es soja, Brassica, girasol, o cártamo.

16. Planta que tiene integrada de manera estable en el cromosoma al menos un sitio de integración que comprende un sitio diana para una primera recombinasa específica de sitio y un sitio diana para una segunda recombinasa específica de sitio distinta, en la que dichos sitios diana son contiguos.

17. Planta según la reivindicación 16, en la que dicha planta es una monocotiledónea.

18. Planta según la reivindicación 17, en la que dicha monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.

19. Planta según la reivindicación 16, en la que dicha planta es una dicotiledónea.

20. Planta según la reivindicación 19, en la que dicha dicotiledónea es soja, Brassica, girasol, alfalfa o cártamo.

21. Semilla transformada procedente de la planta según una cualquiera de las reivindicaciones de 16 a 20.

22. Planta según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en la que dicha planta es una célula vegetal.

23. Método para integrar un ADN de interés dentro del genoma de una célula eucariota, que comprende:

(a): introducir dentro de dicha célula eucariota un casete de transferencia, que comprende dicho ADN de interés, en el que dicho ADN de interés está flanqueado por un sitio diana para una primera recombinasa específica de sitio y un sitio diana para una segunda recombinasa específica de sitio distinta, y dicho genoma de la célula eucariota comprende al menos un sitio de integración que comprende sitios diana correspondientes a dichos sitios diana que flanquean dicho ADN de interés; y,

en el que el ADN de interés se integra dentro del genoma en el sitio de integración.

24. Método para integrar un ADN de interés dentro del genoma de una célula eucariota, que comprende:

(b): proporcionar en dicha célula dicha primera recombinasa, un derivado activo de dicha primera recombinasa, o un fragmento activo de dicha primera recombinasa; y, dicha segunda recombinasa distinta, un derivado activo de dicha segunda recombinasa, o un fragmento activo de dicha segunda recombinasa distinta, en la que dicha primera y dicha segunda recombinasas, dicho derivado activo, o dicho fragmento activo catalizan un acontecimiento de recombinación específica de sitio conservativa.

25. Método según la reivindicación 23 o 24, en el que dicha célula eucariota es una célula vegetal.

26. Método según la reivindicación 25, en el que dicha célula vegetal es monocotiledónea o dicotiledónea.

27. Método según la reivindicación 26, en el que dicha célula vegetal monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno y dicha célula vegetal dicotiledónea es de soja, Brassica, girasol, alfalfa o cártamo.

28. Método según las reivindicaciones 23, 24, o 25, en el que dicha primera recombinasa es Cre, un derivado activo de Cre, o un fragmento activo de Cre, y dicha segunda recombinasa es FLP, un derivado activo de FLP, o un fragmento activo de recombinasa FLP, en el que dicha recombinasa, dicho derivado activo o dicho fragmento activo catalizan un acontecimiento de recombinación específica de sitio conservativa.

29. Método según la reivindicación 28, en el que dicha primera recombinasa específica de sitio comprende un derivado activo de Cre.

30. Método según la reivindicación 28, en el que dicha primera recombinasa específica de sitio comprende un fragmento activo de Cre.

31. Método según la reivindicación 28, en el que dicha primera recombinasa específica de sitio comprende Cre.

32. Método según las reivindicaciones 28, 29, 30 o 31, en el que dicha segunda recombinasa específica de sitio comprende un derivado activo de FLP.

33. Método según las reivindicaciones 28, 29, 30 o 31, en el que dicha segunda recombinasa específica de sitio comprende un fragmento activo de FLP.

34. Método según las reivindicaciones 28, 29, 30 o 31, en el que dicha segunda recombinasa específica de sitio comprende FLP.

35. Método según la reivindicación 34, en el que dicha primera recombinasa específica de sitio comprende Cre y dicha segunda recombinasa específica de sitio comprende FLP.

36. Método según las reivindicaciones 28, 29, 30 o 31, en el que dicha recombinasa FLP está codificada por FLPm.

37. Método según las reivindicaciones 28, 29, 30 o 31, en el que dicha recombinasa Cre esta codificada por SEQ ID NO: 2.

38. Método según la reivindicación 23, en el que dicha proteína recombinante está codificada por SEQ ID NO: 4, 5, 7, o 8.

39. Método según la reivindicación 23, en el que dicha primera recombinasa específica de sitio está fusionada con el extremo amino terminal de dicha segunda recombinasa específica de sitio distinta.

40. Método según la reivindicación 23, en el que dicha segunda recombinasa específica de sitio está fusionada con el extremo amino terminal de dicha primera recombinasa específica de sitio.

41. Planta que tiene incorporada de manera estable en su genoma la molécula de ácido nucleico tal como la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.

42. Planta de la reivindicación 41, en la que dicha planta es una monocotiledónea.

43. Planta según la reivindicación 42, en la que dicha monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.

44. Planta según la reivindicación 41, en la que dicha planta es una dicotiledónea.

45. Planta según la reivindicación 44, en la que dicha dicotiledónea es soja, Brassica, girasol, alfalfa, o cártamo.

46. Semilla transformada procedente de la planta según una cualquiera de las reivindicaciones de 41 a 45.