ES2257564T3 - Metodo para determinar la presencia de bacterias resistentes a antibioticos que lisan las celulas. - Google Patents

Abstract

Un método para determinar la presencia de bacterias diana en una muestra, bacterias diana que son resistentes a un antibiótico que lisa las células, que comprende los pasos secuenciales de: i) incubar la muestra en un medio de incubación que incluye el antibiótico que lisa las células, ii) capturar las células no lisadas de las bacterias diana sobre un soporte sólido que comprende un agente de captura, iii) exponer las células no lisadas de las bacterias diana a un agente capaz de causar la lisis celular de las mismas, iv) determinar la presencia de material intracelular de las células lisadas de las bacterias diana.

Description

Método para determinar la presencia de bacterias resistentes a antibióticos que lisan las células.

La presente invención se dirige a un método para determinar la presencia de una o más bacterias diana en una muestra, bacterias diana que son resistentes a un antibiótico o antibióticos que lisan las células. La invención se dirige particularmente, aunque no exclusivamente, a un método para determinar la presencia de una o más bacterias resistentes a meticilina en una muestra clínica.

El surgimiento de bacterias que tienen resistencia a antibióticos comúnmente utilizados es un problema cada vez más frecuente con serias implicaciones para el tratamiento de individuos infectados. De hecho, estos denominados súper patógenos, tales como Staphylococcus aureus, son a menudo resistentes a casi todos los antibióticos más potentes. El problema se ha vuelto particularmente grave en el entorno hospitalario, donde la infección nosocomial de individuos con sistemas inmunes debilitados por bacterias resistentes a los antibióticos puede llevar a serias complicaciones e incluso la muerte. Por consiguiente, existe la necesidad de minimizar el riesgo de infección en tal entorno. Un modo de minimizar el riesgo se basa en la determinación temprana de la presencia de tales bacterias, para posibilitar que los individuos y el entorno sean monitorizados cuidadosamente y, si es necesario, sean tratados en una fase temprana.

Los métodos actuales para la determinación de la presencia de bacterias resistentes a antibióticos, sin embargo, consumen mucho tiempo y requieren cultivar primero las bacterias en forma pura y seguidamente exponerlas a una serie de antibióticos para ver si su crecimiento se inhibe. El proceso total puede llevar al menos dos días y puede acarrear un frecuente retraso crítico antes de que se pueda administrar un régimen de tratamiento óptimo a un individuo infectado. Por supuesto, tales retrasos no sólo son perjudiciales para la salud de los individuos, si no que acarrean también estancias más largas en el entorno hospitalario.

Por consiguiente, existe la necesidad de un método para la determinación rápida de la presencia de bacterias que son resistentes a ciertos antibióticos en un paciente o entorno.

El documento WO 99/37799 enseña un método rápido para determinar si una bacteria en particular, que se sabe está presente en un cultivo, es susceptible o resistente a un antibiótico en particular. El método es, sin embargo, limitado en que requiere preferiblemente que la bacteria esté presente como un cultivo puro o sea un aislado puro. El método, sin embargo, puede adaptarse para determinar la resistencia o susceptibilidad a antibióticos de una bacteria en particular en un cultivo mixto. En ese caso, el método se basa en general en un paso de separación preliminar antes del tratamiento con el antibiótico en particular u otra acción específica para la bacteria en particular.

Alternativamente, y siempre que se conozca el modo de acción del antibiótico, el método puede revelar la resistencia o susceptibilidad a antibióticos de una bacteria en particular que se sabe está presente en un cultivo mixto a través de un análisis comparativo del contenido de adenilato quinasa intracelular de cuatro alícuotas derivadas del cultivo mixto y cultivadas en presencia de i) ningún antibiótico, ii) antibiótico, iii) un bacteriófago específico para la bacteria y iv) una mezcla de ambos antibiótico y bacteriófago. Una bacteria susceptible a un antibiótico que lisa las células, por ejemplo, puede deducirse sobre la base de que la adenilato quinasa intracelular se reduce en una muestra cultivada con el antibiótico y el bacteriófago cuando se compara con la muestra cultivada con el bacteriófago solo.

Aunque podría suponerse que los métodos descritos en WO 99/37799 podrían indicar simplemente la presencia de una bacteria en un cultivo mixto que tiene resistencia a un antibiótico en particular, en la práctica tal resultado no puede obtenerse inequívocamente y de manera fiable especialmente cuando las concentraciones de la bacteria resistente son bajas.

Incluso, si se pudiera, resultará evidente que la determinación de esa presencia requiere aun así la ejecución de varios pasos repetitivos que implican el cultivo, tratamiento y ensayo de al menos cuatro alícuotas diferentes del cultivo mixto. Tales repeticiones son poco elegantes y aumentan la posibilidad de error. Además, el método comprende un retraso inherente en el hecho de que el tratamiento de una alícuota del cultivo mixto con un bacteriófago requiere tiempo para asegurar que las bacterias están establecidas en la fase logarítmica de su crecimiento.

Por consiguiente, permanece la necesidad de un método simple y rápido para determinar la presencia de bacterias que tienen resistencia a antibióticos en una muestra. En particular, permanece la necesidad de un método simple y rápido para determinar la presencia de bacterias que tienen resistencia a antibióticos en una muestra clínica.

La presente invención busca por lo tanto proporcionar un método simple y rápido, que implique un mínimo de pasos necesarios, para determinar si hay bacterias resistentes a antibióticos presentes en una muestra, especialmente una muestra clínica, tomada, por ejemplo, mediante un frotis a individuos infectados.

La presente invención comienza a partir de la comprensión de que una amplia variedad de bacterias son generalmente susceptibles a los antibióticos que lisan las células y que, en consecuencia, el material intracelular de las bacterias susceptibles en un cultivo mixto puede descartarse de manera ventajosa en primer lugar.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia de bacterias diana en una muestra, bacterias diana que son resistentes a un antibiótico que lisa las células, que comprende los pasos secuenciales de:

i) incubar la muestra en un medio de incubación que incluye el antibiótico que lisa las células,

ii) capturar las células no lisadas de las bacterias diana sobre un soporte sólido que comprende un agente de captura,

iii) exponer las células no lisadas de las bacterias diana a un agente capaz de causar la lisis celular de las mismas,

iv) determinar la presencia de material intracelular de las células lisadas de las bacterias diana.

En una realización de la presente invención el método comprende además un paso de lavado y/o un paso de filtración antes del paso iii), para separar el material intracelular derivado de las células susceptibles al antibiótico que lisa las células.

Se entenderá que en toda esta solicitud la frase "antibiótico que lisa las células" describe un agente que perturba la síntesis de la pared celular bacteriana durante la replicación celular. Así, cualesquiera de los antibióticos \beta-lactámicos son adecuados para la ejecución del método de la presente invención. En una realización preferida de la presente invención el antibiótico que lisa las células es una penicilina tal como ampicilina o meticilina.

En una realización de la presente invención el agente de captura puede ser específico sólo para una especie en particular de bacterias. En otras realizaciones el agente de captura puede ser específico para una cepa en particular de bacterias. En una realización preferida, el agente de captura es fibrinógeno que se une a Staphylococcus aureus. Alternativamente, el agente de captura es un anticuerpo específico para Staphylococcus aureus.

Se comprenderá por supuesto que el método de la presente invención puede incluir un paso o pasos de intervención adicionales para posibilitar la determinación de la presencia de una o más bacterias diana. Típicamente, estos pasos pueden comprender capturar las células no lisadas de las bacterias diana sobre un soporte sólido que comprende uno o más agentes de captura.

De manera ventajosa, el medio de cultivo para ejecutar la presente invención comprende un caldo líquido. En esta realización el soporte sólido puede comprender perlas magnéticas recubiertas con un anticuerpo adecuado u otro agente de captura. Alternativamente, el soporte sólido puede comprender una espátula, pala o filtro recubierto al menos en parte con un anticuerpo adecuado u otro agente de captura.

En una realización adicional de la presente invención, el agente capaz de causar la lisis celular es selectivo frente a las bacterias diana. Preferiblemente el agente es selectivo para Staphylococcus aureus. Aún más preferiblemente el agente capaz de causar la lisis celular es lisostafina.

En otra realización de la presente invención, el agente capaz de causar la lisis celular es un bacteriófago selectivo frente a las bacterias diana o un derivado de lisina del mismo. En una realización adicional el agente capaz de causar la lisis celular es una colicina.

Por supuesto, se comprenderá también que el método de la presente invención puede incluir varios de tales pasos para que la presencia de otras bacterias diana pueda también determinarse.

La determinación del material intracelular derivado de las células lisadas de las bacterias diana puede comprender cualquier ensayo apropiado, como se conoce en la técnica. Preferiblemente, el ensayo comprende un ensayo de bioluminiscencia. Aún más preferiblemente, el ensayo de bioluminiscencia se basa en la adenilato quinasa (AK) como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 94/17202 y WO 96/02665. Sin embargo, el ensayo puede comprender alternativamente un ensayo colorimétrico o fluorimétrico basado en marcadores enzimáticos intracelulares - por ejemplo, fosfatasa o peroxidasa.

Un aspecto de la presente invención proporciona estuches ("kits") de ensayo para ejecutar el método de la invención. Preferiblemente, el "kit" de ensayo es un "kit" de ensayo desechable. El "kit" de ensayo puede comprender componentes adecuados para permitir llevar a cabo el ensayo elegido. Preferiblemente, el "kit" de ensayo comprende un medio de cultivo adecuado que contiene un antibiótico elegido que lisa las células. Aún más preferiblemente, el "kit" de ensayo comprende un soporte sólido que incluye un agente de captura específico para las bacterias diana, una solución de lavado y un agente capaz de causar la lisis celular de las bacterias diana.

En una realización de la presente invención, el "kit" de ensayo comprende un caldo líquido que comprende meticilina. Preferiblemente, el caldo líquido que contiene meticilina se suministra en forma liofilizada.

De manera ventajosa, el "kit" de ensayo puede suministrarse en forma de un recipiente con múltiples pocillos tal como el que se describe en la solicitud de patente GB 0110476.9.

Una ventaja del método de la presente invención proporciona una determinación rápida (aproximadamente 3 horas) de la presencia de bacterias resistentes a un antibiótico que lisa las células, que implica un único ensayo para el material intracelular. Además, el método evita la necesidad de ensayos múltiples comparativos y confiere adicionalmente la ventaja de que los resultados pueden interpretarse de un modo independientemente cualitativo inequívoco, más que de un modo comparativo o cuantitativo.

La presente invención se describirá a continuación por referencia a realizaciones no limitantes y a los siguientes dibujos, en los que

la Figura 1 es una ilustración esquemática de los pasos esenciales del método de la presente invención;

la Figura 2 es una gráfica que destaca la diferencia entre ensayos negativos y positivos;

la Figura 3 es una gráfica que muestra resultados de ensayos con cepas resistentes a meticilina y sensibles a meticilina de Staphylococcus aureus tras una incubación de 3,5 horas con 50 \mug/ml de ampicilina o 4 \mug/ml de meticilina; y

la Figura 4 es una vista en corte de un "kit" de ensayo según la presente invención.

Con referencia ahora a la Figura 1, una muestra tomada en forma de frotis, por ejemplo de un paciente, y que comprende una mezcla de bacterias que contiene las bacterias 11, en general resistentes a meticilina, y, las bacterias 12, en general susceptibles, se cultiva a 37ºC en un caldo líquido de aproximadamente 1 ml de volumen que contiene aproximadamente 4 \mug de antibiótico.

Las bacterias resistentes a meticilina 11 sobreviven y pueden multiplicarse. Las bacterias susceptibles a meticilina 12, sin embargo, tras una fase inicial de crecimiento, desarrollan las paredes celulares debilitadas 13 y se lisan, liberando su material intracelular 14 al caldo líquido.

Tras un periodo de 2 a 4 horas, el caldo líquido comprende por lo tanto una mezcla de bacterias no lisadas, resistentes a meticilina, y las bacterias lisadas susceptibles a meticilina.

La presencia de las bacterias en particular, Staphylococcus aureus por ejemplo, se determina seguidamente por la adición al caldo líquido de las perlas paramagnéticas 15 recubiertas con fibrinógeno. El fibrinógeno es un agente de unión específico para Staphylococcus aureus. Tras un periodo de 2 a 10 minutos las perlas se eliminan magnéticamente del caldo y se lavan antes de un paso de análisis.

Las perlas 15 y las bacterias diana unidas 11 se tratan seguidamente en un recipiente separador con un detergente capaz de lisar las células. El material intracelular así obtenido se analiza para buscar la adenilato quinasa usando un protocolo de bioluminiscencia con luciferina-luciferasa. La presencia del Staphylococcus aureus resistente a meticilina se revela por una señal 16. La señal 16 puede, a los efectos de cerciorarse, compararse con una señal control adecuada, para excluir anomalías provenientes de las concentraciones de fondo de adenilato quinasa.

Resultará evidente que sólo aquellas células que permanecen impermeables a la meticilina y se inmovilizan sobre las perlas magnéticas proporcionan una señal significativa en respuesta al ensayo de adenilato quinasa.

Por supuesto, la presencia de otras especies diana resistentes a meticilina puede investigarse por un paso o pasos alternativos o adicionales que comprenden la adición que perlas que comprenden otros recubrimientos o perlas que incluyen uno o más agentes de captura en sus recubrimientos.

Alternativamente o adicionalmente, la especificidad puede introducirse en el método dirigiéndose a una variedad en particular de las especies bacterianas en el paso de lisis celular final. Por ejemplo, puede usarse un bacteriófago o una combinación de detergentes que sea específica para Staphylococcus aureus.

La Figura 2 muestra los resultados de bioluminiscencia obtenidos para la determinación de la presencia de Staphylococcus aureus en una serie de muestras clínicas. Como puede verse, un resultado positivo del ensayo (muestras números M421000M y M421148L) se distingue fácilmente de un resultado negativo del ensayo (muestras números M421117S y
M421131P).

La Figura 3 muestra los resultados de bioluminiscencia obtenidos para diferentes cepas de Staphylococcus aureus cultivadas en presencia de ampicilina, así como de meticilina. En cada caso el método distingue la presencia de las cepas resistentes a los antibióticos de las cepas susceptibles a los antibióticos.

Con referencia ahora a la Figura 4, un "kit" de ensayo para usar en el método de la presente invención comprende una caja sólida de polipropileno moldeado por inyección, en general designada 17, que comprende varios pocillos 18, 19, 20, 21, 22 que actúan como cámaras de almacenaje y/o cámaras de reacción para varios reactivos o herramientas adecuados (como se describen más abajo).

La cámara 18 almacena un caldo líquido 22 que contiene un antibiótico que lisa las células, que es adecuado para incubar una muestra de un frotis obtenido de un individuo infectado. La cámara 18 está provista de un bastoncillo sólido 23 que lleva un hisopo 24 para obtener esta muestra. El bastoncillo 23 lleva una porción transversal 25 que actúa como asa para el bastoncillo 18 y proporciona convenientemente una tapa 26, que sella el caldo líquido 22 que contiene el antibiótico que lisa las células en la cámara 18.

Las cámaras adyacentes 19, 20 almacenan respectivamente una solución acuosa que contiene una suspensión de perlas magnéticas 27 y una solución de lavado salina acuosa tamponada con fosfato, 28. Las perlas magnéticas adecuadas son las obtenidas de Dynal con el nombre Dynalbeads^{TM}. Como se ha mencionado previamente, las perlas están recubiertas con un agente capaz de capturar las bacterias diana.

La cámara 21, que actúa como la cámara de reacción del "kit", está provista de una solución tampón acuosa 29 adecuada para la ejecución del ensayo de bioluminiscencia basado en la adenilato quinasa. La cámara está provista también de las cápsulas selladas con una hoja 30, 31 por encima de la solución tampón 29, que contienen respectivamente un reactivo bioluminiscente basado en luciferina/luciferasa y una solución acuosa de difosfato de adenosina que contiene un detergente o agente capaz de lisar las células de las bacterias diana. Una fuente de magnesio, tal como acetato de magnesio, que actúa como un promotor para el ensayo de bioluminiscencia, se proporciona en el espacio 32 que divide las cápsulas selladas con una hoja.

La cámara 22 está provista de una varilla hueca 33 que lleva una punta cónica afilada 34 adecuada para agujerear las cápsulas selladas con una hoja 30, 31. La varilla 33 está provista de una porción transversal 35 que lleva un medio de engranaje (p. ej., ranuras - no mostrado) para engranar un mecanismo adecuado para mover la varilla 33 en dirección vertical y horizontal, bajo el control de hardware o software de control (no mostrado). La porción transversal 35 está provista también de una apertura (no mostrada) que permite a la varilla 33 recibir un imán cilíndrico retractable (no mostrado).

Las cámaras 19, 20, 21, 22 están provistas de un medio de sellado laminado en forma de una hoja de metal 36. En contraste con el medio de sellado proporcionado para la cámara 18, el medio de sellado laminado no pretende ser reutilizable una vez que se ha roto.

Al usarlo, el bastoncillo sólido 23 que lleva el hisopo 24 se retira manualmente de la cámara 18 mediante el asa 25 y se usa para obtener una muestra de un individuo infectado. El bastoncillo 23 se devuelve inmediatamente a la cámara de tal forma que el hisopo 24 se sumerge en el caldo líquido 22 y se vuelve a formar el sellado entre la tapa 26 y la cámara 18.

El "kit" de ensayo se mantiene en condiciones adecuadas durante un periodo de aproximadamente 3 h para incubar la muestra del paciente. Al final de este periodo, el bastoncillo 23 se retira de la cámara 18 y se retiran las hojas de metal que sellan las cámaras 19, 20, 21, 22.

La varilla hueca 33 (que contiene el imán retractable) se engrana con el mecanismo en movimiento. Bajo el control del hardware o software de control, la varilla 33 se mueve hacia la cámara 19 donde recoge las perlas magnéticas de la suspensión 27 y desde allí a la cámara 18, donde la retracción del imán mediante, por ejemplo, medios accionados por tornillo sinfín, causa que las perlas se depositen en el caldo.

Tras un periodo de tiempo adecuado, y agitando si es apropiado, se hace regresar el imán a la varilla 33 para que recoja las perlas. La varilla 33 se retira seguidamente hacia la cámara 20, donde las perlas se depositan en la solución de lavado 28 y, tras un periodo de tiempo adecuado adicional, se recuperan como se ha descrito previamente.

La varilla 33 que lleva las perlas lavadas se retira subsiguientemente hacia la cámara de reacción 21, de tal forma que se hace que la punta cónica afilada 34 libere los contenidos de las cápsulas selladas con una hoja 30, 31 a la solución tampón 29. Las perlas se liberan seguidamente a la solución 29 por retracción del imán de la varilla 33, y la varilla se devuelve a la cámara 22.

Un fotomultiplicador (no mostrado) colocado bajo la cámara 21 de la caja de polipropileno 17 detecta la luz emitida proveniente de la reacción de bioluminiscencia que sigue. (Una descripción detallada de la reacción se da en los documentos WO 94/17202 y WO 96/02665).

Claims (20)

1. Un método para determinar la presencia de bacterias diana en una muestra, bacterias diana que son resistentes a un antibiótico que lisa las células, que comprende los pasos secuenciales de:

i) incubar la muestra en un medio de incubación que incluye el antibiótico que lisa las células,

ii) capturar las células no lisadas de las bacterias diana sobre un soporte sólido que comprende un agente de captura,

iii) exponer las células no lisadas de las bacterias diana a un agente capaz de causar la lisis celular de las mismas,

iv) determinar la presencia de material intracelular de las células lisadas de las bacterias diana.

2. Un método según la Reivindicación 1, en el que el paso iii) está precedido por un paso de lavado y/o filtración.

3. Un método según la Reivindicación 1 o Reivindicación 2, en el que el agente de captura es un anticuerpo específico para Staphylococcus aureus.

4. Un método según la Reivindicación 1 o Reivindicación 2, en el que el agente de captura es fibrinógeno.

5. Un método según la Reivindicación 4, en el que el agente capaz de causar la lisis celular es selectivo frente a Staphylococcus aureus.

6. Un método según la Reivindicación 5, en el que el agente capaz de causar la lisis celular es lisostafina.

7. Un método según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente capaz de causar la lisis celular es un bacteriófago.

8. Un método según cualquier Reivindicación precedente, en el que el medio de cultivo es un caldo líquido.

9. Un método según cualquier Reivindicación precedente, en el que el soporte sólido comprende perlas magnéticas.

10. Un método según cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 9, en el que el paso iv) comprende un ensayo de bioluminiscencia.

11. Un método según la Reivindicación 10, en el que el ensayo de bioluminiscencia se basa en la adenilato quinasa.

12. Un método según cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 9, en el que el paso iv) comprende un ensayo colorimétrico o fluorimétrico basado en un marcador enzimático intracelular.

13. Un método según cualquier Reivindicación precedente, en el que el antibiótico que lisa las células es meticilina.

14. Un "kit" de ensayo que comprende una caja sólida de polipropileno moldeado por inyección como se muestra en la Fig. 4, para determinar la presencia en una muestra de bacterias diana resistentes a un antibiótico que lisa las células, que comprende un medio de cultivo que contiene el antibiótico que lisa las células, uno o más soportes sólidos que comprenden un agente de captura específico para las bacterias diana, uno o más agentes capaces de causar la lisis celular de las bacterias diana y reactivos para determinar la presencia de material intracelular de las células lisadas de las bacterias diana.

15. Un "kit" de ensayo según la Reivindicación 14, en el que el antibiótico que lisa las células es meticilina.

16. Un "kit" de ensayo según la Reivindicación 14 o Reivindicación 15, en el que los uno o más agentes de captura incluyen un agente de captura específico para Staphylococcus aureus.

17. Un "kit" de ensayo según cualquiera de las Reivindicaciones 14 a 16, en el que los uno o más agentes de captura comprenden fibrinógeno.

18. Un "kit" de ensayo según cualquiera de las Reivindicaciones 14 a 17, en el que los uno o más agentes que lisan las células comprenden lisostafina.

19. Un "kit" de ensayo según cualquiera de las Reivindicaciones 14 a 18, en el que los reactivos para determinar la presencia de material intracelular de las células lisadas de las bacterias diana son adecuados para efectuar un ensayo de bioluminiscencia, colorimétrico o fluorimétrico para un marcador enzimático intracelular.

20. El uso de un "kit" de ensayo como se reivindica en las Reivindicaciones 14-19 para determinar la presencia de bacterias diana en una muestra, bacterias diana que son resistentes a un antibiótico que lisa las células, y ejecutar un método como se reivindica en las Reivindicaciones 1-13.