ES2257861T3 - Procedimiento de produccion viral. - Google Patents
Procedimiento de produccion viral.Info
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Abstract
Procedimiento para la obtención de una densidad celular superior a 5 x 106 células productoras/ml en un microvehículo de dextrano reticulado basado en el procedimiento de biorreactor para la producción de un virus en una célula productora, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: a)preparar un cultivo de células productoras unidas a los microvehículos de dextrano reticulados en el que la proporción de células productoras a los microvehículos es de aproximadamente 10 células/microvehículo, b)sembrar el biorreactor con una cantidad de microvehículos recubiertos de células productoras preparados en la etapa (a) hasta una densidad superior a aproximadamente 6 gramos (basada en el peso seco del microvehículo) de microvehículos recubiertos de célula productora por litro de volumen del medio del biorreactor; y c)cultivar las células productoras en el biorreactor bajo condiciones de perfusión en un medio que contiene suero hasta una densidad superior a 100 células/microvehículo.
Description
Procedimiento de producción viral.
Una variedad de productos de la terapia génica
in vivo en desarrollo se basa en la administración de un
transgen terapéutico mediante vectores virales recombinantes. Un
vehículo común para la administración de los trangenes son los
adenovirus recombinantes, por lo general los deficientes en la
replicación en cualquier otra célula diferente de la línea celular
de empaquetamiento específica. Estas líneas celulares de
empaquetamiento específicas expresan ciertos genes adenovirales
necesarios para la replicación de los virus que se han suprimido en
el virus deficiente. Para la producción de adenovirus que contienen
deleciones en la región E1, la línea celular utilizada más
comúnmente es la línea celular 293. La producción del adenovirus
deficiente en la replicación en las células 293 es difícil porque es
difícil que la línea celular crezca. Por ejemplo, las células 293
requieren la unión a un sustrato y parecen diferenciarse a una
confluencia elevada. Otra limitación es que los adenovirus
deficientes en la replicación no replican como los virus de tipo
salvaje. Mientras la producción de virus específica para el
adenovirus de tipo salvaje en las células 293 es de aproximadamente
80.000 a 100.000 partículas por célula, el adenovirus deficiente en
la replicación E1 produce típicamente sólo de 1.000 a 2.000
partículas por célula. Las estimaciones basadas en las evaluaciones
actuales de los regímenes de dosificación y en el tamaño del
mercado terapéutico, han indicado que será necesaria la producción
anual de aproximadamente 10^{18} partículas para satisfacer la
demanda de algunos productos de terapia génica. Por lo tanto se
requieren mejoras en la producción de adenovirus recombinantes a
niveles que satisfagan el mercado anticipado de los productos de
terapia génica adenoviral para hacer que esta tecnología sea
factible comercialmente.
La presente invención describe un procedimiento
basado en un microvehículo para la producción de vectores virales
en líneas celulares de empaquetamiento que dependen del anclaje, lo
que permite una producción eficaz en el coste de productos de la
terapia génica adenoviral suficiente para satisfacer la demanda de
mercado proyectada. La presente invención describe un procedimiento
de producción escalable que produce más de 2 x 10^{15} partículas
virales en un biorreactor de 5 litros. Este procedimiento es
completamente escalable para la obtención de las 10^{18}
partículas proyectadas por año con un biorreactor tan pequeño como
columnas de purificación de 100 litros y de 5 litros.
La presente invención se dirige a un
procedimiento para la producción de vectores virales recombinantes
a títulos elevados que incorporan una variedad de progresos
importantes de la técnica. El procedimiento de la presente invención
incorpora las características múltiples que proporcionan la
producción incrementada de virus, particularmente los virus que
codifican los transgenes exógenos. El procedimiento ilustrado
específicamente describe un procedimiento para la producción de
medio libre de suero de título elevado de los adenovirus
defectuosos en la replicación recombinante que contienen un transgen
exógeno. La presente invención proporciona procedimientos para la
preparación de microvehículos, procedimientos para la siembra de
biorreactores a una densidad celular elevada, para incrementar la
infectividad de las células productoras a los virus, procedimientos
para incrementar el rendimiento de producto a través de la
sincronización del ciclo celular de las células productoras y
procedimientos para minimizar los efectos perjudiciales de los genes
transgénicos. La presente invención proporciona además células
productoras preparadas mediante el procedimiento de la presente
invención. La presente invención proporciona además los virus
producidos según el procedimiento.
La Figura 1 es una representación fotográfica de
los microvehículos recubiertos con células examinadas bajo
microscopio óptico. El panel A representa los microvehículos
confluentes que poseen aproximadamente 10^{6} células/ml o un
promedio aproximadamente de 23 células por microvehículo. El panel B
demuestra los resultados de la superconcentración de las células en
los microvehículos de aproximadamente 10^{7} células/ml o un
promedio de aproximadamente 230 células por microvehículo.
La Figura 2 es una representación gráfica de los
niveles de producción de partículas virales de ACN53 producidas
mediante el procedimiento descrito en los Ejemplos 1 a 5 en la
presente memoria. El eje vertical representa el número total de
partículas virales en el biorreactor. El eje horizontal representa
el tiempo posterior a la infección en horas. En este ejemplo 5 x
10^{6} células/ml se infectaron con los virus resultando en la
producción de aproximadamente 12.800 partículas virales ACN53 por
célula.
La Figura 3 es una representación gráfica de la
producción del virus ACN-Rb110 sustancialmente tal
como se describe en los Ejemplos 1 a 5 de la presente memoria. El
eje vertical representa el número total de partículas virales. El
eje horizontal representa el tiempo posterior a la infección en
horas. Estos datos demuestran la producción de aproximadamente
39.000 partículas virales ACN- Rb110 por célula.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes
de patentes citadas en la presente memoria se incorporan en la
presente memoria en su totalidad como referencia como si cada
publicación, patente o solicitud de patente individuales se
indicaran específica e individualmente para ser incorporadas como
referencia. La utilización del singular con términos específicos
implica asimismo la utilización del plural y viceversa. Las
secciones se incluyen únicamente a título ejemplificativo y no
limitativo del alcance de la exposición.
La producción de virus mediante el cultivo de
células de mamífero depende de una variedad de factores. Según se
describe a continuación, se puede utilizar una variedad de técnicas
para mejorar la producción de virus dentro de una célula productora
dada, tales como la sincronización de las células productoras, el
aumento de la infectividad de las células productoras y la supresión
de los efectos de los trangenes durante el cultivo. Aunque es
teóricamente factible producir grandes cantidades de partículas
virales mediante la expansión de la escala de la instalación de la
producción o mediante la repetición de procedimientos de bajo
rendimiento, estos factores se combinan para vencer la utilidad
comercial de tales enfoques. En consecuencia, la eficacia total del
procedimiento en un volumen dado depende, en gran parte, de la
concentración de células que se pueden mantener eficazmente en un
volumen dado del medio. Si uno puede conseguir una concentración
elevada de células productoras viables en un volumen dado,
combinada con una producción elevada de virus intracelulares, se
mejora la eficacia total del procedimiento para hacer que el
procedimiento sea económico.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la obtención de una densidad celular superior a
5 x 10^{6} células productoras/ml en un procedimiento de
biorreactor basado en un microvehículo para la producción de un
virus en una célula productora, comprendiendo dicho procedimiento
las etapas siguientes:
- a)
- preparar un cultivo de células productoras unidas a microvehículos en los que la proporción de células productoras a microvehículos sea aproximadamente 10 células/microvehículo.
- b)
- sembrar el biorreactor con una cantidad de microvehículos recubiertos con células productoras preparadas en la etapa (a) hasta una densidad superior a aproximadamente 6 gramos (basado en el peso seco del microvehículo) de los microvehículos recubiertos de células productoras por litro de volumen del medio de biorreactor; y
- c)
- cultivar las células productoras en el biorreactor bajo condiciones de perfusión en un medio que contiene suero hasta una densidad superior a 100 células/microvehículo.
El término "biorreactor" se refiere a un
dispositivo para el cultivo celular que contiene un recipiente en
el que se mantiene el cultivo celular. El diseño del biorreactor
debería asegurar la esterilidad y proporcionar confinamiento de la
célula productora y del virus construidos genéticamente. Se dispone
comercialmente de una variedad de biorreactores para el cultivo de
células productoras dependientes del anclaje y de cultivos en
suspensión y son bien conocidos por los expertos en la materia y se
pueden adaptar fácilmente a la forma de realización de la presente
invención. Los biorreactores están provistos preferentemente de un
sistema de agitación para mantener el contenido uniformemente
mezclado y para facilitar la transferencia de oxígeno.
Preferentemente, el biorreactor comprende sensores que permiten la
monitorización y manipulación de tantos parámetros de proceso como
sea posible (temperatura, pH, oxígeno disuelto) de forma que estos
parámetros se puedan mantener dentro de los intervalos óptimos para
el crecimiento celular. En una forma de realización preferida de la
presente invención un biorreactor contiene un aparato para oxigenar
el medio que está separado del lecho del microvehículo. Un
biorreactor útil preferido en la forma de realización de la
presente invención es el biorreactor CelliGen Plus® provisto del
rotor Cell-Lift® para una cizalladura baja y una
oxigenación elevada en los cultivos de microvehículos disponibles
comercialmente en New Brunswick Scientific Company, Inc., 44
Talmadge Road, Edison, New Jersey, USA, 08818-4005.
Se pueden utilizar ciertas modificaciones, tales como el tubo de
sedimentación celular o la columna decantadora, para facilitar la
manipulación del cultivo (disponible comercialmente en New
Brunswick Scientific).
Los términos virus y vector(es) se
utilizan de forma intercambiable en la presente memoria. Los
términos "partículas" o "partículas virales" se refieren a
viriones o envueltas en los que se empaqueta el genoma viral. Los
virus que se van a producir según la forma de realización de la
presente invención incluyen virus de ADN y ARN envueltos o no
envueltos modificados recombinantemente, preferentemente
seleccionados de entre baculoviridae, parvoviridae,
picornoviridae, herpesviridae, poxviridae, adenoviridae o
picornaviridae. Los virus pueden ser virus que están
presentes en la naturaleza o sus genomas virales se pueden
modificar mediante técnicas de ADN recombinantes para incluir la
expresión de transgenes exógenos y se pueden construir para ser
deficientes en la replicación, replicar condicionalmente o replicar
competentemente. Los vectores híbridos que explotan elementos
ventajosos de cada una de las propiedades del vector genitor (ver,
por ejemplo, Feng, et al., (1997) Nature Biotechnology
15:866-870) se pueden producir asimismo mediante
los procedimientos descritos en la presente memoria. Los sistemas
de vector mínimo en los que el esqueleto viral contiene solo las
secuencias necesarias para el empaquetamiento del vector viral y
pueden incluir opcionalmente un casete de expresión transgénico se
pueden producir asimismo según la forma de realización de la
presente invención. La presente invención es particularmente útil
en la preparación de los virus que se derivan de genomas
adenovirales, virales adeno-asociados y
retrovirales. En la forma de realización más preferida de la
presente invención, los vectores que se van a producir son vectores
no competentes en la replicación derivados del genoma de adenovirus
humano. En la forma de realización más preferida de la presente
invención, los vectores que se van a producir son vectores
deficientes en la replicación o adenovirales replicantes
condicionalmente. En la forma de realización más preferida de la
presente invención según se ejemplifica en la presente memoria, los
vectores que se van a producir son vectores adenovirales deficientes
en la replicación (E1 defectuoso/suprimido) que codifican un casete
de expresión para el gen supresor de tumor exógeno en una célula
infectada por el vector.
Los vectores virales replicantes condicionalmente
se utilizan para la obtención de una expresión selectiva en tipos
de células particulares mientras evitan una infección adversa de
amplio espectro. Ejemplos de vectores replicantes condicionalmente
se describen en Bischoff, et al., (1996) Science
274:373-376; Pennisi, E. (1996) Science
274:342-343; Russell, S.J. (1994) Eur. J. of Cancer
30A(8):1165-1171. Además, el genoma viral se
puede modificar para incluir los promotores inducibles que logran
la replicación o expresión del transgen sólo bajo ciertas
condiciones. Se conocen en la literatura científica ejemplos de
promotores inducibles (ver, por ejemplo, Yoshida y Hamada (1997)
Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; Iida,
et al., (1996) J. Virol.
70(9):6054-6059; Hwang, et al., (1997)
J. Virol 71(9):7128-7131; Lee, et
al., (1997) Mol. Cel. Biol.
17(9):5097-5105; y Dreher, et al.,
(1997) J. Biol. Chem. 272(46):29364-29371.
El transgen puede asimismo estar bajo control de una región
promotora específica de tejido que permita la expresión del
transgen sólo en tipos de células particulares.
Puede ser valioso en algunos casos utilizar virus
que efectúen la expresión del transgen en un tipo de célula
particular. Ciertos vectores presentan un tropismo natural para
ciertos tipos de tejido. Por ejemplo, los vectores derivados del
género herpesviridae han mostrado que poseen una infección
preferencial de las células neuronales. Ejemplos de vectores
herpesviridae modificados recombinantemente se describen en la
patente US nº 5.328.688 publicada el 12 de julio de 1994. La
especificidad del tipo celular o la elección del tipo celular se
puede conseguir asimismo en vectores derivados de virus que poseen
de forma característica infectividades amplias mediante la
modificación de las proteínas de envuelta virales. Por ejemplo, la
elección celular se ha conseguido con vectores de adenovirus
mediante la modificación selectiva de la protuberancia y fibra del
genoma viral que codifican las secuencias para la obtención de la
expresión de los dominios de protuberancia y fibra modificados que
poseen una interacción específica con receptores de superficie
celular únicos. Ejemplos de tales modificaciones se describen en
Wickham, et al., (1997) J. Virol.
71(11):8221-8229 (incorporación de péptidos
RGD en proteínas de fibra adenovirales); Arnberg, et al.,
(1997) Virology 227:239-244 (modificación de los
genes de fibra adenovirales para la obtención de tropismo en el ojo
y en el tracto genital); Harris y Lemoine (1996) TIG
12(10):400-405; Stevenson, et al.,
(1997) J. Virol. 71(6):4782-4790; Michael,
et al., (1995) Gene Therapy 2:660-668
(incorporación de un fragmento de péptido liberador de gastrina en
la proteína de la fibra del adenovirus); y Ohno, et al.,
(1997) Nature Biotechnology 15:763-767
(incorporación del dominio de unión de la proteína
A-IgG en el virus Sindbis). Se han logrado otros
procedimientos de elección específica celular mediante la
conjugación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos para las
proteínas de la envoltura (ver, por ejemplo, Michael, et
al., (1993) J. Biol. Chem. 268:6866-6869,
Watkins, et al., (1997) Gene Therapy
4:1004-1012; Douglas, et al., (1996) Nature
Biotechnology 14:1574-1578. De forma alternativa,
las mitades particulares se pueden conjugar con la superficie viral
para la obtención de la elección (ver, por ejemplo, Nilson, et
al., (1996) Gene Therapy 3:280-286 (conjugación
de EGF con proteínas retrovirales). Estos vectores modificados
recombinantemente se pueden producir según la forma de realización
de la presente
invención.
invención.
En la forma de realización preferida de la
presente invención, el virus que se va a producir se deriva del
género adenoviridae. Los virus particularmente preferidos se
derivan del adenovirus humano del tipo 2 o del tipo 5. Tales virus
son preferentemente deficientes en la replicación mediante
modificaciones o supresiones en las regiones codificadoras E1a y/o
E1b. Se prefieren otras modificaciones en el genoma viral para la
obtención de características de expresión particulares o para
permitir la administración repetitiva o disminuir la respuesta
inmune. Son más preferidos los adenovirus recombinantes que poseen
deleciones completas o parciales de la región codificadora E4, que
retienen opcionalmente E4orf6 y E4orf6/7. La secuencia codificadora
E3 se puede suprimir pero es preferible retenerla. En particular,
se prefiere que la región operadora promotora de E3 se modifique
para incrementar la expresión de E3 para la obtención de un perfil
inmunológico favorable para los vectores terapéuticos. Más
preferidos son los vectores de tipo 5 adenovirales humanos que
contienen una secuencia de ADN que codifica p53 bajo el control de
la región promotora del citomegalovirus y la secuencia guía
tripartita que posee E3 bajo control del promotor CMV y la deleción
de las regiones codificadoras E4 mientras retienen E4orf6 y
E4orf6/7. En una forma de realización más preferida de la presente
invención según se ejemplifica en la presente memoria, el vector es
ACN53, según se describe en Wills, et al., (1994) Human Gene
Therapy 5:1079-1088.
El término "célula productora" se utiliza en
la presente memoria para describir una línea celular de
empaquetamiento viral que depende del anclaje. Las células
dependientes del anclaje, o cultivos derivados de las mismas, son
las que crecerán, sobrevivirán, o mantendrán la función óptimamente
cuando se unan a una superficie tal como vidrio o plástico. La
utilización de este término no implica que las células sean
normales o que sean o no transformadas neoplásicamente. Dependiendo
de la naturaleza del virus que se va a propagar, el genoma de la
línea celular se puede modificar para complementar deleciones en el
genoma viral utilizado como vector. Cuando el vector es competente
en la replicación, cualquiera de las líneas celulares que dependen
del anclaje comúnmente utilizadas para el cultivo de células de
mamífero se pueden utilizar como líneas celulares de
empaquetamiento viral. Ejemplos de tales líneas celulares
dependientes del anclaje comúnmente utilizadas como líneas celulares
de empaquetamiento de vector viral son HeLa o células 293 (Graham y
Smiley (1997) J. Gen. Virol. 36:59-72), y
células PERC.6 (según se ha descrito en la publicación del
documento WO/97/00326, serie de solicitud nº PCT/NL96/00244).
En algunas aplicaciones, particularmente cuando
el virus se va a utilizar para aplicaciones de la terapia génica,
es preferible que el vector sea deficiente en la replicación (o
defectuoso en la replicación) para evitar la proliferación no
controlada del virus en el individuo que se va a tratar. En tales
circunstancias, se seleccionan las líneas celulares de mamífero que
se hayan construido, mediante modificación del genoma de células
productoras para codificar funciones virales esenciales o mediante
la coinfección de la célula productora con un virus auxiliar, para
expresar las proteínas que complementan el efecto de las secuencias
suprimidas del genoma viral. Por ejemplo, cuando el vector viral
que se va a producir es el vector VIH-1 o un
derivado modificado de forma recombinante del mismo, se puede
utilizar la línea celular de empaquetamiento VIH-1,
PSI422, según se describe en Corbeau, et al., (1996)
PNAS(USA) 93(24):14070-
14075. De forma similar, cuando el vector viral que se va a producir es un retrovirus, se puede utilizar la línea celular de empaquetamiento retroviral derivada de 293 humano (293GPG) capaz de producir concentraciones elevadas de partículas retrovirales según se describe en Ory, et al., (1996) PNAS(USA) 93(21):11400-11406. En la producción de sistemas de vectores mínimos, la célula productora se construye (mediante modificación del genoma viral o mediante la utilización del virus auxiliar o cósmido) para complementar las funciones del virus genitor que posibilita la replicación y el empaquetamiento en viriones en la línea celular productora.
14075. De forma similar, cuando el vector viral que se va a producir es un retrovirus, se puede utilizar la línea celular de empaquetamiento retroviral derivada de 293 humano (293GPG) capaz de producir concentraciones elevadas de partículas retrovirales según se describe en Ory, et al., (1996) PNAS(USA) 93(21):11400-11406. En la producción de sistemas de vectores mínimos, la célula productora se construye (mediante modificación del genoma viral o mediante la utilización del virus auxiliar o cósmido) para complementar las funciones del virus genitor que posibilita la replicación y el empaquetamiento en viriones en la línea celular productora.
En el caso en que el virus que se va a producir
sea un adenovirus recombinante que produce deficiencia en la
replicación mediante la supresión de las funciones E1a y/o E1b se
prefiere particularmente la línea celular 293 debido a su habilidad
para complementar la función E1a y E1b adenoviral. Sin embargo, las
células 293 se pueden utilizar asimismo para la expresión de los
adenovirus replicantes de forma competente o condicional en la
replicación. Ejemplos de otras líneas celulares que se pueden
utilizar para la producción de adenovirus defectuosos E1 son las
células PERC.6 (disponibles en IntroGene, b.v., P.O. Box 2048,
Leiden, Holanda) que codifican E1 en trans y se ha demostrado que
poseen una unión excelente a una superficie de microvehículo.
Los vectores recombinantes que se van a producir
mediante los procedimientos de la presente invención pueden
contener opcionalmente un casete de expresión de transgen. El
término "casete de expresión" se utiliza en la presente memoria
para definir una secuencia de nucleótido (ADN o ARN) que contiene
elementos reguladores y una secuencia codificadora de transgen de
forma que efectúe la expresión del transgen en la célula objetivo.
Los elementos reguladores incluyen promotores, potenciadores,
terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc. El
término "transgen" comprende no sólo la secuencia que codifica
las proteínas de tipo salvaje y las variaciones alélicas sino
también las secuencias de proteínas homólogas de otros organismos,
además de cualquier mutación o truncamiento, las mismas que
expresan la misma función esencialmente como la secuencia de
polinucleótido o proteína de tipo salvaje. Los ejemplos de
transgenes que se pueden incluir en tales vectores incluyen genes
supresores de tumores, inhibidores de cinasa dependientes de la
ciclina, genes citotóxicos, genes citostáticos, genes
proapoptóticos, genes activadores de profármaco, antígenos
específicos de tumores, o secuencias híbridas. La expresión
"genes supresores de tumores (TSG)" se refiere a los genes que
cuando se expresan en una célula objetivo, son capaces de suprimir
el fenotipo neoplásico. Ejemplos de antígenos específicos de
tumores incluyen MART1 y gp100 (Zhai, et al., (1997) J.
immunotherapy 20:15-25). Ejemplos de genes
supresores de tumores incluyen el gen Rb de retinoblastoma y sus
variantes Rb110 y Rb56, el gen MMAC-1, el gen p53,
el gen DCC, el gen NF-1, los genes erbA y erbB, p33
y p73. La expresión "inhibidores de cinasa dependiente de
ciclina" comprende los genes p27kip, p57kip2, p15ink4b,
p18ink4c, p19ink4d, p16ink4a y p21sdi-1. El término
"genes citotóxicos" se refiere a los genes que se diseñan para
poseer un efecto tóxico en la célula objetivo, solos o en
conjunción con los agentes químicos exógenos (por ejemplo, genes
activadores de profármaco). Ejemplos de tales genes citotóxicos
incluyen secuencias de ADN que codifican los dominios citotóxicos
de la ricina, de la difteria, o de la exotoxina pseudomonas además
del gen de adenovirus E311.6, adenovirus E1a. Ejemplos de genes
activadores de profármaco incluyen los genes de cinasa timidina y
citosina desaminasa. Los genes proapoptóticos incluyen los genes
p53 y de la ruta p53 (por ejemplo, bax, bid, caspasas, citocromo c,
etc) y adenovirus E4orf4. Ejemplos de otros transgenes terapéuticos
que se pueden incluir en los vectores que se van a producir
mediante la forma de realización de la presente invención incluyen
interferones (alfa, beta, gamma y consenso), proteínas de fusión de
a2b E2F-Rb de interferón, interleucinas (por
ejemplo, IL-2, IL-4,
IL-10), dopamina, serotonina, GABA, ACTH y NGF.
La mayoría de células animales utilizadas en la
producción de virus dependen del anclaje y requieren la unión a una
superficie para un crecimiento óptimo. En 1967 Van Wezel describió
la utilización de partículas pequeñas (0,2 mm), microvehículos,
para el crecimiento de células que dependían del anclaje. Estos
microvehículos se suspenden en el medio de cultivo mediante
agitación suave de forma que se obtenga un entorno homogéneo.
Puesto que las células se localizan sobre la superficie, están
sometidas a tensión mecánica y se deben tomar precauciones para
evitar el cizallamiento de las células de la superficie durante el
cultivo. Los gránulos macroporosos en los que las células que
dependen del anclaje tienen la posibilidad de utilizar la superficie
interior se pueden utilizar asimismo para reducir la posibilidad
que las fuerzas de cizalladura puedan romper las células que se van
a cultivar. Sin embargo, tales microvehículos limitan el área de
superficie disponible para la infección viral de forma que se
deberían ajustar los parámetros de infección viral. Los
microvehículos se han realizado en materiales sintéticos diferentes
que incluyen dextrano, poliacrilamida y poliestireno. La unión
celular a estos microvehículos cargados está mediada por
atracciones iónicas. Muchos tipos de células poseen una proteína de
superficie celular, fibronectina, que posee una unión bioespecífica
con la gelatina facilitando la utilización de los microvehículos
recubiertos de gelatina. Una ventaja de la utilización de la
gelatina es su susceptibilidad a la degradación con enzimas
proteolíticas, lo que permite la liberación de las células desde
los microvehículos con casi 100% de viabilidad mediante la
disolución de la matriz de gelatina con tripsina.
En la forma de realización preferida de la
presente invención, los microvehículos son microvehículos Cytodex®
disponibles comercialmente en Pharmacia Biotech AB, Uppsala,
Suecia. Los microvehículos Cytodex® se basan en los gránulos de
dextrano reticulados. Los gránulos son transparentes, esféricos e
hidratados y se sustituyen con grupos cargados positivamente. Los
microvehículos poseen un diámetro medio de aproximadamente 200
\mum y una densidad de 1,03 g/cm^{3}. Se ha derivatizado
Cytodex® para formar tres tipos; Cytodex® 3 está recubierto con
colágeno. En la forma de realización preferida de la presente
invención según se muestra a título de ejemplo en la presente
memoria, el microvehículo es Cytodex® 1.
Los microvehículos Cytopore® se basan en una
matriz de celulosa de algodón reticulada. Son intercambiadores DEAE
hidrofílicos con un diámetro medio de 230 \mum y una densidad de
1,03 g/cm^{3}. Los microvehículos son transparentes y se
transportan fácilmente por medio de tuberías. El Cytopore®
macroporoso protege las células de las fuerzas de cizalladura
generadas por el agitador o la aireación o el filtro de rotación.
La matriz posee un tamaño de poro promedio de 30 \mum lo que
posibilita a las células entrar en el interior del microvehículo.
Dentro de los microvehículos, las células están protegidas de las
fuerzas de cizalladura del agitador, del filtro de rotación o de las
burbujas creadas mediante el burbujeo. La microporosidad del
Cytopore® facilita el aporte de nutrientes a todos los lados de las
células.
Se produce un cultivo de células productoras
unidas a microvehículos cuando los microvehículos se ponen en
contacto con las células productoras en un medio que contiene suero
y se someten a las condiciones que permiten el crecimiento. Las
células crecen en presencia de los microvehículos y producen nuevas
células hijas, que se transfieren a la superficie del microvehículo
expuesta mediante la agitación del cultivo. Tras la finalización
del procedimiento descrito, las células se concentran hasta una
densidad elevada superior a 100 células por microvehículo. Esta
concentración elevada de células en el microvehículo facilita el
nivel elevado de producción del virus.
Se puede utilizar una variedad de procedimientos
para la obtención de una densidad celular elevada y facilitar la
unión de células hijas a los microvehículos. Las condiciones se
deberían diseñar para asegurar la transferencia eficaz de las
células hijas a la superficie del microvehículo sin sacar la célula
genitora de las superficies del microvehículo. En la situación en
la que existe una cantidad inicial baja de células productoras, las
células se pueden microtriturar a partir de los microvehículos
pasando los microvehículos recubiertos a través de un orificio a
una presión baja (aproximadamente 20 psi). Las células separadas se
pueden utilizar a continuación para sembrar uniformemente un número
superior de microvehículos. De forma alternativa, uno puede sembrar
el biorreactor directamente con una gran cantidad de células.
Alternativamente, uno puede introducir los microvehículos en un
matraz que contiene el medio. Los microvehículos se hundirán hacia
el fondo del matraz y las células se introducen en el matraz que se
hundirán y se unirán asimismo a la superficie del microvehículo. La
agitación ligera facilita el procedimiento de unión. La
concentración de las células sobre la superficie de los
microvehículos se puede determinar fácilmente mediante microscopía
óptica.
A medida que el cultivo celular se expande, es
necesario monitorizar y controlar los parámetros de cultivo tales
como la concentración de oxígeno disuelto, pH, temperatura y
agitación. El pH se debería monitorizar mediante el procedimiento
de crecimiento celular para asegurar las condiciones óptimas para la
replicación celular. A medida que las células crecen, los
metabolitos se liberan en el medio, un procedimiento que puede
cambiar el pH del medio. Por lo tanto, el pH del medio se debería
monitorizar atentamente y ajustar mediante la adición de una base o
de un ácido para mantener un pH relativamente constante. El pH
preciso que facilita el crecimiento óptimo variará algo con la línea
celular particular, pero generalmente está en el intervalo del pH
fisiológico. Se prefiere que para las células 293 el pH para el
cultivo celular se mantenga en el intervalo de aproximadamente pH 6
a aproximadamente pH 9, más preferentemente desde aproximadamente
pH 7 a aproximadamente pH 8, más preferentemente desde
aproximadamente pH 7,2 a aproximadamente 7,5, más preferentemente de
aproximadamente pH 7,2.
La temperatura es otro parámetro físico que se va
a monitorizar y a controlar. La temperatura en el cultivo celular
se debería estabilizar asimismo a la temperatura del crecimiento
óptimo de la línea celular para la obtención de una densidad
celular elevada. Las células de mamífero poseen una temperatura
óptima para el crecimiento. Si crece a una temperatura inferior a
la mínima, el crecimiento celular sucede lentamente. Por otro lado,
si la temperatura de crecimiento es demasiado elevada, puede
producirse la muerte celular. En la forma de realización preferida
de la presente invención, cuando la línea celular productora es la
línea celular 293, la temperatura se debería mantener
aproximadamente por debajo de 40ºC, más preferentemente en el
intervalo de aproximadamente 30ºC a aproximadamente 38ºC, más
preferentemente a aproximadamente 37ºC.
El término "siembra" según se describe en la
presente memoria describe la introducción de las células
productoras en el volumen de lecho del microvehículo. Los
microvehículos recubiertos preparados según el Ejemplo 1, a
continuación, se introducen después en el biorreactor. El
biorreactor se "siembra" con una cantidad de microvehículos
recubiertos de aproximadamente 6 gramos (basado en el peso seco del
microvehículo) de microvehículos recubiertos por litro de volumen
del biorreactor. Esto es sustancialmente mayor que el volumen
recomendado para la siembra de microvehículos en un volumen dado. La
convención en la técnica es que los microvehículos recubiertos no
deberían ocupar un volumen superior a aproximadamente 5% del
recipiente/volumen del medio, es decir, aproximadamente 2 gramos
(basado en el peso seco del microvehículo) de microvehículos
recubiertos por litro del medio/volumen del recipiente. En la forma
de realización de la presente invención, es aproximadamente 10
gramos (basado en el peso seco del microvehículo) el volumen de
microvehículos recubiertos depositados lo que comprende
aproximadamente 20% del volumen del recipiente. Esta concentración
elevada de microvehículos contribuye a una densidad celular elevada
en el cultivo final del virus recombinante e incrementa el
rendimiento viral. Para la obtención de rendimientos elevados en la
forma de realización de la presente invención, la concentración de
los microvehículos recubiertos debería ser aproximadamente de 6 a
25 gramos (basado en el peso seco del microvehículo) por litro del
volumen de reacción, preferentemente de 6 a 15 gramos, y más
preferentemente aproximadamente 10 gramos (basado en el peso seco
del microvehículo) por litro de volumen de reacción.
Las células crecen a continuación en el
biorreactor bajo condiciones de perfusión. El cultivo de células de
mamífero bajo condiciones de perfusión es bien conocido en la
técnica. Sin embargo, se debería indicar que ciertos parámetros se
deberían optimizar para la obtención de un crecimiento celular
máximo. Por ejemplo, es necesario monitorizar el contenido de
oxígeno durante todo el cultivo. A causa de que el oxígeno es
soluble en agua de forma moderada (8,4 mg/l a 25ºC), se debe
suministrar continuamente al cultivo en crecimiento en forma de
aire esterilizado o de oxígeno puro. La concentración de oxígeno
disuelto se debería mantener en el intervalo de aproximadamente 5% a
aproximadamente 200%, preferentemente desde 50% a aproximadamente
120%, más preferentemente a aproximadamente 100%. La concentración
de oxígeno disuelto se define según el punto en el que el 100% de
oxígeno disuelto representa la concentración de oxígeno disuelto en
el medio en equilibrio con el aire. La concentración de oxígeno se
puede medir por medios convencionales tales como las sondas de
monitorización de oxígeno disuelto disponibles comercialmente en
Instech Laboratories, Inc. 5209 Militia Hill Road, Plymouth Meeting
PA 19462-1216 o en Lazar Research Laboratories, Los
Angeles, CA.
La agitación adecuada del cultivo del biorreactor
es esencial para asegurar un suministro adecuado de nutrientes y
para prevenir la acumulación de metabolitos tóxicos dentro del
biorreactor. La agitación del medio afecta asimismo a la velocidad
de transferencia del oxígeno. La agitación excesiva puede causar
daño mecánico a las células de mamífero. Se debería evitar la
espuma ya que el burbujeo asociado con el proceso de la espuma
puede generar suficientes fuerzas de cizalladura dentro del cultivo
para resultar en el desplazamiento de las células de la superficie
del microvehículo o lisis de las células. Por lo tanto, se debe
mantener un equilibrio entre la necesidad de proporcionar un buen
mezclado y la necesidad de evitar el daño celular. En la forma de
realización preferida de la presente invención, según se muestra a
título de ejemplo en la presente memoria, se mantiene una agitación
aproximadamente de 70 rpm utilizando un biorreactor CelliGen Plus
de 5 litros. Para minimizar el espumado, el medio se separa de las
células y se oxigena antes de la reintroducción a las células
mediante la utilización de un dispositivo de burbujeo en el
biorreactor.
El procedimiento de la presente invención
proporciona además un procedimiento para la producción de una
población de células productoras que contienen una concentración
elevada de partículas virales en un biorreactor basado en un
microvehículo en un medio libre de suero, comprendiendo dicho
procedimiento el proceso descrito anteriormente y que comprende
además las etapas siguientes:
- d)
- eliminar el medio que contiene el suero;
- e)
- sincronizar las células productoras en la fase G1;
- f)
- infectar las células productoras con un virus;
- g)
- cultivar las células bajo condiciones que permitan la replicación viral hasta que se consiga un punto máximo.
Para preparar el biorreactor para la introducción
de medio libre de suero, en primer lugar se permite que cese la
agitación en el biorreactor. Los gránulos del microvehículo a
continuación precipitarán en la suspensión y sedimentarán en el
fondo del volumen del reactor, lo que permite que se drene el medio
que contiene el suero. A continuación se lavan los gránulos con
medio libre de suero para minimizar el porcentaje del medio que
contiene el suero. El lavado se lleva a cabo mediante la
restitución de la suspensión del microvehículo a su volumen
original con medio libre de suero y logrando la suspensión completa
de los microvehículos mediante la agitación suficiente. Este medio
se drena a continuación según se ha descrito anteriormente. Esta
etapa de lavado se puede repetir para la obtención de la
eliminación máxima del medio que contiene el suero.
Se añade a las células el medio libre de suero en
una cantidad suficiente para sustentar el cultivo celular durante
la infección. El medio libre de suero se define como el medio de
crecimiento para el cultivo celular animal sustancialmente libre de
suero derivado de animal. El medio libre de suero se conoce bien en
la técnica (ver, por ejemplo, Freshney, R.I. Culture of
Mammalian Cells, 1983, págs. 76-77. Alan R. Liss
Company, Nueva York). El medio libre de suero simple se puede
complementar con factores adicionales suficientes para posibilitar
el crecimiento de las células. De forma alternativa, el medio libre
de suero completo suficiente para sustentar el crecimiento de las
células de mamífero está disponible comercialmente a partir de una
variedad de suministradores comerciales. Ejemplos de medio libre de
suero preferidos incluyen medio libre de suero JRH
Ex-Cell 525 (número de catálogo
61129-79P), medio libre de suero CellGro (disponible
comercialmente en Gibco-BRL Life Sciences,
Gaitherburg Maryland, USA), medio libre de suero HyClone
(#A-1111-L) disponible
comercialmente en HyClone.
El medio libre de suero se complementa
frecuentemente con una o más hormonas tales como la insulina, la
transferrina, el factor de crecimiento epidérmico, la
hidrocortisona, etc. El medio libre de suero se puede potenciar
asimismo con agentes adicionales para facilitar el crecimiento de
las células y puede depender de la línea celular utilizada en el
virus que se va a producir. Por ejemplo, el medio se puede
potenciar con TGF-beta o agentes que sobrerregulen
el factor de crecimiento de transformación endógeno
(TGF)-beta en la célula. Alternativamente, se
pueden añadir al cultivo agentes que sobrerregulan o estabilizan
los receptores de unión virales, tales como las integrinas
\alpha\nu\beta3 y \alpha\nu\beta5, para mejorar la
eficacia de la infección. En la forma de realización más preferida
de la presente invención según se muestra a título de ejemplo en la
presente memoria, el medio libre de suero es el medio Eagle
modificado de Dulbecco Biowhittaker
#12-604-F (DMEM) que contiene 1% de
CMF-1 (Applied Nutrient Sciences, Sorrento Valley,
CA).
En el caso en que el virus recombinante utilice
un promotor muy fuerte (por ejemplo CMV) para la expresión del
transgen, la producción de proteína recombinante empezará a
competir con las fuentes necesarias para la replicación viral
óptima. En consecuencia, puede ser ventajoso añadir elementos al
medio libre de suero que infrarregulen o inhiban el promotor
transgénico. Por ejemplo, cuando el promotor transgénico es el
promotor temprano de citomegalovirus (CMV), se pueden añadir
elementos tales como la neuramidasa o la tunicamicina para suprimir
el promotor CMV durante el cultivo.
En segundo lugar, se conoce que los transgenes
terapéuticos particulares pueden poseer un efecto negativo sobre la
célula productora. Por ejemplo, los genes supresores de tumores
tales como p53 se sabe que inducen la apoptosis en células normales
con dosificación celular suficiente. En consecuencia, los virus que
expresan tales transgenes son particularmente difíciles de cultivar
en una densidad elevada. Por ejemplo, una comparación de los
rendimientos a partir de la forma de realización de la presente
invención representada en las figuras 2 y 3 demuestra el
rendimiento viral significativamente inferior como resultado de la
expresión del gen supresor del tumor p53. La presente invención
proporciona un procedimiento para minimizar el efecto negativo de un
transgen tóxico a la célula productora mediante la adición de un
agente al medio de cultivo en una concentración suficiente para
inhibir el promotor que impulsa el transgen. El agente que se va
añadir dependerá del promotor utilizado para impulsar la expresión
de transgen pero no debería interferir materialmente con la
expresión de genes virales esenciales para la replicación viral. Por
ejemplo, el promotor temprano inmediato principal de
citomegalovirus es un promotor utilizado comúnmente para impulsar
la expresión del transgen. Este promotor contiene sitios de unión
para el factor de transcripción NF-kB y requiere la
forma activada de NF-kB para su actividad. Ver, por
ejemplo, Bellas, et al., (1995) J. Clinical Investigations
96: 2521-27 y Loser, et al., (1998) J.
Virology 72:180-190. En presencia de
compuestos que inhiben la activación de NF-kB,
tales como
N-acetil-L-cisteína
o pentoxifilina, la actividad del promotor CMV se puede reprimir a
niveles de fondo (Bellas, et al. supra). De este modo la
represión transitoria del promotor CMV mediante la adición de tales
agentes a los cultivos durante la fase de producción de los virus
recombinantes, que codifican los transgenes
citotóxicos/citostáticos que impulsan el promotor CMV, mejorará el
rendimiento de tales virus. Las concentraciones eficaces de
N-acetil-L-cisteína
y pentoxifilina son aproximadamente de 10 a 30 mM y de 0,5 a 3,0
mM, respectivamente. De forma similar, los inhibidores de la
actividad de NF-kB son útiles para evitar la
expresión de transgen en situaciones en las que el
VIH-1-LTR se utiliza para impulsar
la expresión del transgen (Mhashilkar, et al., J. Virology
71:6486-6494). Se conocen en la técnica ejemplos de
agentes capaces de suprimir la acción de otros promotores y sus
intervalos de concentración eficaces y se pueden sustituir en la
forma de realización de la presente invención.
En el caso en que el transgen
citotóxico/citostático esté bajo el control de un promotor activo
en sólo (o principalmente) un tipo de célula particular, se
prefiere que se utilice una línea celular productora en la que esté
inactivo el promotor específico de la célula (o del tejido). Por
ejemplo, cuando el promotor es activo sólo en células de hígado
(ver, por ejemplo, promotor \alpha-fetoproteína
(Huber et al., PNAS 88:8039-8043)) la
línea celular productora preferentemente no se deriva de una línea
celular de hígado. Además, en el caso de los promotores inducibles
según se han descrito anteriormente, se prefiere que se mantengan
las condiciones de cultivo (composición química, temperatura, etc)
de forma que se evite la expresión del transgen a partir del
promotor inducible.
Será evidente para los expertos en la materia que
el procedimiento anterior para suprimir el efecto del transgen se
pueda aplicar a cualquier procedimiento para el cultivo de célula
eucariótica incluyendo pero no limitándose al cultivo basado en
microvehículo, cultivo en suspensión, cultivo giratorio, y el
denominado cultivo de células en "botella en rotación".
\newpage
Para la obtención de un rendimiento máximo, se
prefiere que las células se sincronicen en la fase G1 con el virus
recombinante antes de la infección. Manteniendo las células en la
fase G1, se preparan óptimamente para ser empujadas a la fase S, en
la que en primer lugar ocurre la síntesis de ácido nucleico.
Sincronizando las células, uno consigue el pico de la producción
viral intracelular. En ausencia de la sincronización, la
subpoblación de células productoras avanzadas en el ciclo celular
experimentará la lisis celular viral antes del punto de cosecha
óptimo. Estos viriones, que se arrojan al sobrenadante del
biorreactor, se perderán tras el cultivo celular. De forma similar,
las células que se quedan atrás en la fase G1 no alcanzarán las
concentraciones virales óptimas en el tiempo de la cosecha.
De forma alternativa, otro mecanismo para mejorar
la producción de virus mediante la sincronización de las células
productoras es la estabilidad del virus o la infección posterior de
ADN viral no encapsidada. Se ha mostrado, por ejemplo, que los
retrovirus poseen una vida media de 4 a 6 horas posteriores a la
infección y que las velocidades de infección más elevadas se
observan cuando las células se sincronizan. Andreadis, et
al., (1997) J. Virol. 71:7541-8;
Andreadis, et al., (1998) Biotechnology and Bioengineering
58:272-281; Andreadis, et al., (1996)
J. Theor. Biol. 182:1-20.
Se pueden utilizar una variedad de medios para
sincronizar las células en la fase G1. Mantener las células
productoras en el medio libre de suero sincronizará las células en
la fase G0/G1. Óptimamente, uno mantiene las células en el medio
libre de suero durante aproximadamente un tercio del ciclo celular
(aproximadamente 6 a 8 horas) para sincronizar completamente las
células. De forma alternativa, se pueden añadir agentes que
sincronicen las células. Ejemplos de tales agentes incluyen la
TGF-beta que produce la detención del ciclo celular
en la interfase G1/S. De forma similar, los inhibidores de la
fosfatidilinositol 3-cinasa (por ejemplo, la
wortmanina y la LY294002 (Eli Lilly and Company)) bloquearán las
células en la fase G1. Bacqueville, et al., (1998) Biochem.
Biophys. Res. Comm. 244:630-636. Además, los
inhibidores de proteosoma tales como la lactacistina y/o la
N-carbobenzoxi-L-leucil-L-leucil-L-norvalinal
han demostrado que inducen la detención del ciclo celular en las
fases G1 y G2 del ciclo celular. Mutomba, et al., (1997)
Mol. Biochem. Parisitol. 90:491-504. Ejemplos
de otros compuestos que se pueden añadir para sincronizar las
células incluyen mimosina y afidicolina (Oncogene (1997)
15(22)2749-2753), quercetina (Shen y
Webber (1997) Oncol. Res. 9:597-602), epirrubicina
(Hedenfalk, et al., (1997) Cytometry
29(4):321-327) y lovastatina (Molecular and
Cellular Biology (1985) 6(9):1197-1213).
Será evidente para los expertos en la materia que
el procedimiento anterior para incrementar el rendimiento mediante
la sincronización de las células se puede aplicar a cualquier
procedimiento para el cultivo celular eucariótico pero no se limita
al cultivo basado en microvehículo, cultivo en suspensión, cultivo
giratorio, y el denominado cultivo de células en "botella en
rotación".
En las células que se han infectado mediante
copias múltiples de un virus determinado, las actividades
necesarias para la replicación viral y el empaquetamiento de virión
son cooperativas. De este modo, se prefiere que las condiciones se
ajusten tal que exista una probabilidad significativa de que las
células productoras se infecten de forma multiplicada con el virus.
Un ejemplo de una condición que aumenta la producción del virus en
las células productoras es una concentración incrementada de virus
en la fase de infección. Sin embargo, es posible que el número
total de infecciones virales por célula productora se pueda
exagerar, resultando en efectos tóxicos para las células. En
consecuencia, se debería procurar mantener las infecciones en la
concentración de virus del intervalo de 10^{6} a 10^{10},
preferentemente 10^{9}, viriones por ml.
Los agentes químicos se pueden utilizar asimismo
para aumentar la infectividad de la línea celular productora. Por
ejemplo, la presente invención proporciona un procedimiento para
aumentar la infectividad de las líneas celulares productoras para
la infectividad viral mediante la inclusión de un inhibidor de
calpaína. Ejemplos de inhibidores de calpaína útiles en la forma de
realización de la presente invención incluyen el inhibidor de
calpaína 1 (conocido asimismo como
N-acetil-leucil-leucil-norleucinal,
disponible comercialmente en Boehringer Mannheim). Se observó que
el inhibidor de calpaína 1 incrementaba la infectividad de las
líneas celulares productoras al adenovirus recombinante.
Durante la fase en la que se procede a la
replicación viral, el biorreactor se alimenta continuamente con
medio complementado libre de suero. La concentración de oxígeno se
debería mantener a un nivel de aproximadamente 50% a
aproximadamente 120% de oxígeno disuelto, preferentemente
aproximadamente 100% de oxígeno disuelto. Para maximizar la
concentración intracelular de partículas virales, se debería
monitorizar la acumulación de partículas de virus dentro de las
células. En el procedimiento preferido, se determina la
concentración viral mediante HPLC utilizando una columna Resource
Q® según se describe en el Ejemplo 7 de la presente memoria. Cuando
el nivel de partículas virales empieza a estancarse, se detiene el
biorreactor y se cosechan las células.
La presente invención proporciona además un
procedimiento para la producción de partículas virales intactas que
comprende las etapas (a) a (g) anteriores y comprende además las
etapas siguientes:
- h)
- cosechar las células;
- i)
- lisar las células productoras;
- j)
- aislar las partículas virales;
- k)
- purificar las partículas virales intactas.
Cuando se optimiza la concentración de partículas
virales según se ha determinado anteriormente, los contenidos
enteros del biorreactor se eliminan y se regulan para mantener un
pH de aproximadamente pH 7,0 a aproximadamente 8,5. En este punto
las células se pueden congelar para su almacenamiento a -70ºC.
Cuando se desea aislar las partículas virales a
partir de las células productoras, se lisan las células, utilizando
una variedad de medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo,
las células de mamífero se pueden lisar bajo condiciones de presión
baja (100 a 200 psi de presión diferencial) o procedimientos de
congelación-deshielo convencionales. Se elimina el
ADN/ARN libre exógeno mediante la degradación con ADNasa/ARNasa.
Las partículas virales se purifican a continuación por medios
conocidos en la técnica. Se pueden utilizar los procedimientos
cromatográficos o de centrifugación de gradiente de densidad
diferencial. En la forma de realización preferida de la presente
invención, el virus se purifica mediante cromatografía de columna
sustancialmente según el procedimiento de Huyghe et al.,
(1995) Human Gene Therapy 6:1403-1416
según se ha descrito en la solicitud de patente US nº 08/400.793 en
trámite, presentada el 7 de marzo de 1995.
Como será evidente para los expertos en la
materia a la que pertenece la presente invención, la presente
invención se puede realizar mediante formas de realización
diferentes de las que se describen específicamente a continuación.
Las formas de realización particulares de la presente invención
descritas en los Ejemplos a continuación, se van a considerar, por
lo tanto, como ilustrativas y no limitativas del alcance de la
presente invención.
Los gránulos de microvehículo Cytodex 1 se
prepararon mediante hinchamiento e hidratación en PBS. El PBS para
este procedimiento se preparó mediante una dilución 1:10 de salino
regulado con fosfato 10x (PBS) en agua Milli-Q (pH
7,5). Se añadieron 10 gramos de gránulos de microvehículo de
Cytodex 1 a una botella de 500 ml limpia. Se añadieron
aproximadamente 300 a 400 mililitros de PBS a la botella y los
contenidos se agitaron hasta que los microvehículos se hidrataron y
se suspendieron completamente (aproximadamente 3 minutos). Se
dejaron sedimentar los microvehículos durante aproximadamente 10
minutos. Se eliminó el PBS mediante aspiración. El procedimiento de
lavado se repitió dos veces.
Se resuspendieron los microvehículos en un
volumen final de 300 ml de PBS. Los microvehículos se esterilizaron
en un autoclave durante 30 minutos a 250ºF. La botella que contenía
los microvehículos estériles se transfirió a una campana de
laboratorio de flujo laminar. Se eliminó el PBS mediante aspiración
y se lavaron los gránulos una vez como se había hecho anteriormente
con PBS estéril. Los microvehículos se lavaron a continuación una
vez más en DMEM estéril que contenía 10% de suero bovino fetal
(FBS). Se resuspendieron los microvehículos a un volumen final de
300 ml con DMEM estéril que contenía 10% de FBS.
Se colocaron 10 ml de DMEM estéril que contenía
10% de FBS en un tubo cónico de 15 ml. Se obtuvo un vial de células
293 GT que contenía aproximadamente 5 x 10^{6} células a partir
del almacenamiento en nitrógeno líquido y se descongelaron en un
baño de agua a 37ºC. Se lavó el exterior del vial en isopropanol al
70% y se abrió en una campana de laboratorio de flujo laminar. Los
contenidos del vial se transfirieron al tubo que contenía el medio.
El tubo se centrifugó a continuación a 1.000 rpm en una centrífuga
Beckman TJ6 durante aproximadamente 5 minutos. El sobrenadante se
eliminó a continuación mediante aspiración y se resuspendió el
sedimento en 10 ml de medio. A continuación se transfirió la
suspensión a un matraz T-225 y se incubó a 37ºC
durante aproximadamente 50 horas. Las células se dejaron crecer
hasta aproximadamente un 50 a 90% de confluencia según se determinó
mediante microscopía óptica.
Tras alcanzar la confluencia suficiente, se
eliminó el medio de los matraces y se pipetearon suavemente 10 a 30
ml de PBS junto con la parte superior de los matraces. A
continuación los matraces se dejaron tumbados, recubriendo las
células con PBS. Se eliminó el PBS de los matraces y se añadieron 10
ml de solución de tripsina al 0,05% (tripsina 0,05%, EDTA 0,53 mM
disponible comercialmente en GibcoBRL según nº de catálogo
25300-054). El matraz se balanceó suavemente para
asegurar que la solución de tripsina cubría la monocapa. Después de
aproximadamente 45 segundos, cada matraz se sacudió fuertemente
hasta que las células se separaron completamente del matraz.
Inmediatamente, se añadieron 20 ml de medio completo a cada matraz.
Los contenidos del matraz se agruparon vía centrifugación (1.000
rpm en una centrífuga Beckman TJ6 durante aproximadamente 5
minutos). El sobrenadante se decantó a partir del tubo de
centrífuga, se trituró y las células se agruparon utilizando el
medio completo. El contaje celular se determinó utilizando un
hemocitómetro Reichert Bright-Line (Buffalo,
NY).
El cultivo se dividió en cuatro matraces
T-225 (aproximadamente 5 x 10^{6} células por
matraz). Se pipetearon 10 ml de suspensión en cada uno de los
matraces que se iban a sembrar. Se añadió el medio completo a cada
uno de los matraces hasta un volumen de 50 ml. Se incubaron las
células a 37ºC en una atmósfera de dióxido de carbono humidificada
al 7%. A continuación las células se expandieron utilizando el
procedimiento anterior en 20 matraces T-225. Este
procedimiento se repitió hasta que se preparó una cantidad de
células suficiente para sembrar los microvehículos, aproximadamente
6,5 x 10^{8} células.
Se suspendieron aproximadamente 6,5 x 10^{8}
células 293 humanas, preparadas sustancialmente tal como se
describe en el Ejemplo 2 anteriormente, en 5 litros de medio Eagle
modificado de Dulbecco Biowhitakker #
12-604-F (DMEM), medio que contiene
suero (disponible comercialmente en Biowhitakker, Inc.,
Walkersville, MD) y en 50 gramos de microvehículos preparados
sustancialmente tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior. La
mezcla anterior se agitó bien por turbulencia durante un periodo de
aproximadamente 2 minutos. A continuación la mezcla entera se
sifoneó en un recipiente de cultivo limpio esterilizado de un
biorreactor de 5 litros CelliGen Plus® provisto de un rotor
Cell-Lift (obtenido de New Brunswick Scientific
Company, Inc., 44, Talmadge Road, Edison, New Jersey, USA,
08818-4005).
Las células se cultivaron a continuación a una
temperatura de 37ºC, manteniendo una concentración de oxígeno
disuelto de aproximadamente 100%. Se monitorizó la concentración de
oxígeno disuelto y se mantuvo mediante la utilización de una sonda
de oxígeno disuelto unida a un controlador (parte del biorreactor
CelliGen Plus) de forma que el oxígeno disuelto se mantuvo a
aproximadamente 100% mediante burbujeo con aire, CO_{2}, O_{2}
o N_{2} según fuera lo apropiado. El cultivo se mantuvo bajo
presión atmosférica y a un pH de aproximadamente 7,2. El recipiente
se agita a una velocidad que depende del volumen del recipiente del
biorreactor y puede estar en el intervalo de aproximadamente 15 a
200 rpm. Para el biorreactor de 5 litros utilizado en la presente
memoria, la velocidad de agitación se mantuvo aproximadamente a 70
rpm. Las células se cultivaron hasta que la densidad celular
alcanzó el nivel deseado (8 a 10 x 10^{6} células por mililitro o
aproximadamente 230 células por microvehículo). Se puede determinar
asimismo la densidad celular mediante la velocidad de consumo de
oxígeno, que es proporcional a la concentración celular. Después de
aproximadamente 3 días de incubación, el recipiente de reacción se
alimentó continuamente con el medio a la velocidad de
aproximadamente 0,5 litros por día por 1 x 10^{6} células. El
medio gastado se eliminó vía una columna de decantación. Las
células se dejaron cultivar durante un periodo de aproximadamente
14 días.
Para determinar el número de células por
mililitro, se incrementó la agitación a 100 rpm y se extrajo
rápidamente una muestra de 5 ml utilizando una jeringa estéril. Los
contenidos de la jeringa se transfirieron a continuación a un tubo
cónico de 15 ml. Cuando sedimentaron los microvehículos, se eliminó
el sobrenadante mediante aspiración y se sustituyó con un volumen
idéntico de solución de tripsina al 0,25 % (0,25% de tripsina, EDTA
1 mM, disponible comercialmente en GibcoBRL según nº de catálogo
25200-056). El tubo se tapó y se incubó en un baño
de agua a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos (o hasta que las
células consiguieron un aspecto erizado sobre los microvehículos). A
continuación el tubo se sometió a turbulencia durante 20 segundos y
tan pronto como los microvehículos empezaron a sedimentar
(aproximadamente 1 minuto) se extrajo una muestra de la capa de
microvehículo anterior para el contaje mediante el
hemocitómetro.
Una vez que las células consiguieron la densidad
deseada, se desconectaron el controlador de temperatura, el
agitador y la perfusión y se dejaron sedimentar los microvehículos.
Una vez que los microvehículos sedimentaron, se eliminó el medio
mediante sifón. El reactor se llenó con 5 litros de DMEM (sin suero
o aditivos, Biowhitakker). La agitación se conectó de forma
suficiente para romper la torta microvehículo/célula
(aproximadamente 150 rpm) durante aproximadamente 3 minutos. Se
paró la agitación y se dejaron sedimentar los microvehículos
recubiertos. Este procedimiento se repitió dos veces. A continuación
se llenó el reactor con 5 litros de DMEM que contenía 1% de
CMF-1 (Applied Nutrient Sciences, Sorrento Valley,
CA). La agitación se restituyó para romper la torta de células y a
continuación se fijó a 70 rpm para mantener la suspensión de los
microvehículos recubiertos. El controlador de temperatura se conectó
para mantener una temperatura de 37ºC.
Se añadieron 5 x 10^{12} partículas de
adenovirus recombinante (ACN53 descrito en Wills, et al.,
(1994) Human Gene Therapy) al recipiente de cultivo preparado en el
Ejemplo 4 anterior. Se restituyó la perfusión según el Ejemplo 3
anterior. Después de aproximadamente 20 horas de incubación, se
muestreó el recipiente de reacción para la concentración de virus.
Esto se consiguió aumentando la agitación a 100 rpm y extrayendo
rápidamente una muestra de 5 ml utilizando una jeringa estéril. Los
contenidos de la jeringa se transfirieron a continuación a un tubo
cónico de 15 ml. Se añadieron 0,5 ml de un regulador HSM (Hepes 50
mM, sacarosa 3%, MgCl_{2} 2 mM, NaCl 150 mM y
beta-ciclodextrina 5%, pH 7,5). El tubo se congeló
a continuación en nitrógeno líquido y se descongeló rápidamente en
un baño de agua a 10ºC. Esto procedimiento de
congelación-deshielo se repitió dos veces. Los tubos
se centrifugaron a 3.000 rpm en una centrífuga Beckman TJ6 durante
aproximadamente 5 minutos. Se extrajo una muestra de sobrenadante y
se determinó mediante el ensayo de Resource Q® según se ha descrito
por Shabram, et al., (1996-7) Human Gene
Therapy. Este procedimiento se repitió periódicamente
(aproximadamente cada 2 horas) hasta que se determinó que la
concentración viral empezaba a caer (es decir, se consiguió la
concentración viral óptima). Los resultados se presentan en datos
que se presentan en la Tabla 1 a continuación y se proporciona una
representación gráfica de los datos en la Figura 2 de los dibujos
anexos.
| Producción de ACN53 en células 293 GT | ||
| Horas posteriores a la infección | PN/ml | PN total |
| 24 | 1,12 x 10^{10} | 5,58 x 10^{13} |
| 32 | 2,67 x 10^{10} | 1,33 x 10^{14} |
| 38 | 4,61 x 10^{10} | 2,30 x 10^{14} |
| 46 | 4,34 x 10^{10} | 2,17 x 10^{14} |
| 47 | 4,36 x 10^{10} | 2,18 x 10^{14} |
| 48,5 | 4,62 x 10^{10} | 2,31 x 10^{14} |
| 49,5 | 6,38 x 10^{10} | 3,19 x 10^{14} |
| 50,5 | 5,23 x 10^{10} | 2,61 x 10^{14} |
| 51,5 | 5,02 x 10^{10} | 2,51 x 10^{14} |
| 52,75 | 5,77 x 10^{10} | 2,89 x 10^{14} |
| 53,75 | 5,74 x 10^{10} | 2,87 x 10^{14} |
| 54,75 | 5,15 x 10^{10} | 2,57 x 10^{14} |
Según se puede ver en los datos presentados
anteriormente, la concentración viral óptima para ACN53 se consigue
aproximadamente 50 horas después de la infección, aunque esto
variará con las construcciones individuales. Los contenidos del
recipiente se trasladaron a recipientes de congelación seguros y se
mezclaron con 10 a 20% de regulador HSM y se congelaron.
Se lisaron los contenidos completos que contenían
las células mediante un procedimiento repetido de
congelación/deshielo. Se congelaron los contenidos en un congelador
a -80ºC y se descongelaron en un baño de agua a temperatura
ambiente. El virus se purificó sustancialmente según el
procedimiento de Huyghe et al., (1995) Human Gene
Therapy 6: 1043-1416.
Se repitió el procedimiento descrito en los
Ejemplos 1 a 5 excepto por el hecho de que se utilizó un adenovirus
recombinante que expresa la proteína de retinoblastoma p110
(ACNRb110) para infectar las células 293. La construcción del
adenovirus ACNRB110 se describe en Smith, et al., (1997)
Circulation 96:1899-1905. La densidad
celular en el tiempo de la infección fue 1,0 x 10^{7} células/ml.
Los resultados del cultivo infectado se presentan en la Figura 3 de
los dibujos anexos. En este ejemplo, se consiguió una concentración
viral de aproximadamente 39.000 partículas virales por célula.
Se prepara un cultivo de células productoras 293
sustancialmente según lo descrito en los ejemplos 1 a 4 anteriores.
Las células se infectan con adenovirus ACN53 según se describe en
el Ejemplo 5. Sin embargo, el procedimiento del Ejemplo 5 se
modifica mediante la adición de
N-acetil-L-cisteína
a una concentración final de aproximadamente 10 a 30 mM en el medio
de cultivo para inhibir el promotor CMV. Las células se cultivan y
se cosechan sustancialmente según lo descrito en los Ejemplos 5 y
6. La concentración intracelular mejorada de las partículas virales
resulta de la inhibición de la expresión del transgen p53.
Claims (16)
1. Procedimiento para la obtención de una
densidad celular superior a 5 x 10^{6} células productoras/ml en
un microvehículo de dextrano reticulado basado en el procedimiento
de biorreactor para la producción de un virus en una célula
productora, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
siguientes:
- a)
- preparar un cultivo de células productoras unidas a los microvehículos de dextrano reticulados en el que la proporción de células productoras a los microvehículos es de aproximadamente 10 células/microve-hículo,
- b)
- sembrar el biorreactor con una cantidad de microvehículos recubiertos de células productoras preparados en la etapa (a) hasta una densidad superior a aproximadamente 6 gramos (basada en el peso seco del microvehículo) de microvehículos recubiertos de célula productora por litro de volumen del medio del biorreactor; y
- c)
- cultivar las células productoras en el biorreactor bajo condiciones de perfusión en un medio que contiene suero hasta una densidad superior a 100 células/microvehículo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la célula productora es una célula 293.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que el virus es un adenovirus.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el
que el virus es un adenovirus defectuoso en la replicación derivado
del genoma de adenovirus de tipo 5.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el
que el adenovirus defectuoso en la replicación comprende además un
casete de expresión para un transgen exógeno.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el
que el transgen exógeno es seleccionado de entre el grupo
constituido por genes supresores de tumores, genes citotóxicos,
genes citostáticos, genes proapoptóticos o genes activadores de
profármaco.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que el transgen exógeno es un gen supresor de tumor.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el
que el gen supresor de tumor es p53.
9. Procedimiento para la producción de una
población de células productoras, que contienen una concentración
elevada de partículas virales en un biorreactor basado en un
microvehículo en medio libre de suero, comprendiendo dicho
procedimiento el procedimiento según la reivindicación 1,
comprendiendo además las etapas siguien-
tes:
tes:
- d)
- eliminar el medio que contiene suero,
- e)
- sincronizar las células productoras en la fase G1,
- f)
- infectar las células productoras con un virus,
- g)
- cultivar las células bajo condiciones que permitan la replicación viral hasta que se alcance un punto máximo.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que la célula productora es una célula 293.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que la sincronización celular se consigue manteniendo las células
en un medio sin suero durante un tiempo superior a aproximadamente
un tercio del ciclo celular.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que el virus es un adenovirus.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el virus es un adenovirus defectuoso en la replicación
derivado del genoma de adenovirus de tipo 5.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el adenovirus defectuoso en la replicación comprende además
un casete de expresión para un transgen exógeno.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que el transgen exógeno es seleccionado de entre el grupo
constituido por genes supresores de tumores, genes citotóxicos,
genes citostáticos, genes proapoptóticos o genes activadores de
profármaco.
\newpage
16. Procedimiento para la producción de virus
según el procedimiento de la reivindicación 9, que comprende además
las etapas siguientes:
- h)
- cosechar las células,
- i)
- lisar las células productoras,
- j)
- aislar las partículas virales de la célula lisada, y
- k)
- purificar las partículas virales intactas.
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