ES2257883T3 - Procedimiento de obtencion de plantas transgenicas que expresan una proteina con actividad productora de peroxido de hidrogeno por transformacion mediante agrobacterium rhizogenes. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de obtención de plantas transgénicas que expresan una proteína con actividad productora de H2O2, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: (a) transformar células vegetales o explantes con Agrobacterium rhizogenes que contiene un vector portador de un gen que codifica una proteína productora de H2O2 en un contexto que permite su expresión en la planta, induciendo dicha transformación la formación de raíces transformadas; (b) seleccionar las raíces transformadas que contienen y expresan este gen, mediante un ensayo colorimétrico con peroxidasa; (c) regenerar las plántulas a partir de las raíces seleccionadas, y monitorizar la expresión de dicho gen que codifica una proteína productora de H2O2 en las plántulas obtenidas, realizándose dicha monitorización de la expresión mediante un ensayo colorimétrico con peroxidasa; (d) seleccionar según el fenotipo y eventualmente mediante análisis molecular de la descendencia de las plantas transgénicas, permitiendo la seleccióno la confirmación de las plantas transgénicas obtenidas que contienen solamente el transgén y no el ADN-T específico de A. rhizogenes.

Description

Procedimiento de obtención de plantas transgénicas que expresan una proteína con actividad productora de peróxido de hidrógeno por transformación mediante Agrobacterium rhizogenes.

La invención se refiere al campo de la transformación genética de las plantas mediante Agrobacterium rhizogenes, combinada con el uso de un gen que codifica una proteína con actividad productora de peróxido de hidrógeno, y especialmente la oxalato oxidasa.

El objeto de la presente invención es un procedimiento de obtención de plantas transgénicas, caracterizado porque utiliza una transformación mediante Agrobacterium rhizogenes asociada con una selección visual de los sucesos de transformación, basada en la coloración, sencilla de realizar y rápida, de las raíces transformadas que expresan el trangen.

Desde que los primeros ensayos de campo, y por lo tanto fuera del aislamiento, de plantas transgénicas han tuvieron lugar en 1986, el uso de un gen de resistencia a un antibiótico como gen de selección a sido objeto de numerosas revisiones (Casse-Delbart y Tepfer, Biofutur, (1990), Junio; 56-59, así como Bryant y Leather, Tibtech, (1992), 10, 274-275). Aunque las posibilidades de una transmisión de genes desde la planta transgénica a bacterias del suelo no se ha demostrado, el uso de genes de resistencia a antibióticos está muy mal visto por algunos autores (Heinemann, TIG, (1991), 7, 181-185).

Se han propuesto numerosos sustitutos para el gen de resistencia a la kanamicina (Ratner, Bio-Technology, (1989), 7, 337-341), pero la mayoría de estos genes de resistencia a otro antibiótico o a un herbicida conducen a objeciones parecidas o a dificultades técnicas de realización.

El uso de la oxalato oxidasa como gen de selección ofrece una alternativa a los sistemas anteriores. Demostrado en algunas plantas, está proteína es capaz de degradar el ácido oxálico, que es una fitotoxina producida durante la infección por numerosos patógenos de plantas.

Una primera aplicación de la oxalato oxidasa ha sido la producción de plantas transgénicas resistentes a los patógenos del género Sclerotinia (documento WO 92/14824).

La solicitud de patente WO 94/13790 describe un nuevo uso de la oxalato oxidasa en sustitución de la kanamicina, en un sistema de presión selectiva de los transformantes. Según el procedimiento descrito en el documento WO 94/13790, sólo los transformantes (callos) que contienen el gen de la oxalato oxidasa sobreviven a una dosis subletal determinada de ácido oxálico, presente en el medio. Sin embargo, la preparación de los medios de selección (dosis de ácido oxálico, agentes quelantes de calcio) es incómoda y limitante.

Hasta ahora, la oxalato oxidasa se utilizaba acoplada con el agente tóxico, el ácido oxálico, en una perspectiva de presión selectiva, mientras que en el procedimiento de la presente invención se utiliza simplemente como marcador para una selección visual de los transformantes. Sin embargo, esta proteína no parecía ser a priori un buen candidato como marcador, puesto que era fuertemente expresada en plantas infectadas por un agente patógeno, puesto que había un riesgo importante de falsear los resultados (falsos positivos, por ejemplo). Además, la enseñanza de la solicitud de patente WO 94/13790 no incitaba al experto en la técnica a usar un ensayo colorimétrico para la selección de los transformantes, puesto que tal ensayo permite seleccionar sucesos individualizados (células transformadas) y no sucesos dispersados en un material heterogéneo tal como el callo, procedente de la transformación mediante Agrobacterium tumefaciens y que contiene una mezcla de células transformadas y células no transformadas.

La presente invención proporciona por lo tanto un procedimiento de obtención de plantas transgénicas, ventajoso porque suprime los impedimentos técnicos del procedimiento descrito aquí arriba mediante la combinación de las características de Agrobacterium rhizogenes y una proteína con actividad productora de H_{2}O_{2}. En particular, se explota la formación de raíces inducida por Agrobacterium rhizogenes y el fenotipo de los transformantes (hojas gofradas, raíces plagiotrópicas, entrenudos más cortos) en asociación con la producción de H_{2}O_{2} (peróxido de hidrógeno) mediante la proteína para el desarrollo de un nuevo sistema de selección de transformantes homogéneos. En este sistema, el peróxido de hidrógeno producido se revela en presencia de peroxidasa, para producir una coloración de las muestras de raíces transformadas.

Según un primer aspecto, la presente invención tiene por objeto un procedimiento de obtención de plantas transgénicas que comprende las etapas siguientes:

(a) transformar células vegetales mediante Agrobacterium rhizogenes que contiene un vector portador de un gen que codifica una proteína con actividad productora de H_{2}O_{2};

(b) seleccionar los transformantes que contienen y expresan este gen, mediante un ensayo colorimétrico a base de peroxidasa;

(c) regenerar las plantas a partir de las raíces seleccionadas, y monitorizar la expresión de las plántulas obtenidas mediante un ensayo colorimétrico a base de peroxidasa;

(d) seleccionar, según su fenotipo, y eventualmente validar mediante análisis molecular la descendencia de las plantas transgénicas obtenidas, permitiendo la selección o la confirmación de plantas que contienen solamente el transgen y no el ADN-T propio de Agrobacterium rhizogenes.

El ensayo colorimétrico a base de peroxidasa utilizado en las etapas b) y c) del procedimiento de la invención consiste en incubar una muestra de tejidos vegetales recogida en presencia de un medio que contiene un sustrato para la proteína con actividad productora de H_{2}O_{2}, tal como por ejemplo el ácido oxálico, y revelar la formación de H_{2}O_{2} con la ayuda de la peroxidasa en presencia de un sustrato apropiado cuya oxidación se acompaña mediante un cambio de color. La concentración de sustrato en el medio de incubación no es crítica puesto que el sistema de selección visual en la muestra según la presente invención no requiere la supervivencia de las células, mientras que ese es el caso para la selección selectiva "vital" de las células transformadas descrita en la solicitud WO 94/13790. En el presente caso, la concentración de sustrato es ventajosamente una concentración de saturación de forma que esté favorecida la actividad productora de H_{2}O_{2} y que los productos se revelen fácilmente con peroxidasa, en forma de una coloración azul intensa. En el documento de la solicitud WO 94/13790 no se indica el uso de una concentración de ácido oxálico mayor que la dosis subletal ejemplificada, que es de 3 mM; sin embargo, se encuentra que las concentraciones óptimas de sustrato para la selección visual están muy por encima de esta concentración crítica. A título de ejemplo, las concentraciones de ácido oxálico pueden estar comprendidas en un amplio intervalo que oscila de 5 a 50 mM, y preferentemente de 10 a 20 mM, particularmente 15 mM.

El ensayo colorimétrico efectuado en la etapa b) del procedimiento se realiza ventajosamente sobre una muestra de la raíz. Se puede efectuar igualmente sobre el medio líquido de incubación, ventajosamente después de la descontaminación de los explantes (eliminación de las agrobacterias), sabiendo que la proteína, tal como la oxalato oxidasa, se puede difundir desde el sitio en el que se expresa. Igualmente, también es posible una revelación en la mancha dejada por los explantes transformados sobre un medio de agar o sobre una membrana.

El ensayo colorimétrico efectuado en la etapa c) del procedimiento se puede efectuar sobre una muestra de tejido vegetal de las plantas regeneradas.

Según la invención, las células vegetales se transforman mediante Agrobacterium rhizogenes que contiene un ADN recombinante que comprende un gen que codifica una proteína con actividad productora de H_{2}O_{2} en un contexto que permite su expresión en la planta. Agrobacterium rhizogenes, que se describe por ejemplo por Tepfer, Physiologica Plantarium, (1990), vol. 79 p. 140-146, es una bacteria susceptible de infectar dichas células vegetales permitiendo la integración, en el genoma de estas últimas, de las secuencias de ADN de interés inicialmente contenidas en el ADN-T de agrobacterium rhizogenes. En realidad, la transformación de las células vegetales utiliza un sistema binario (Watson en Genetic engineering of crop plants, Butterworths, 1990) que comprende dos vectores: siendo el primero el pRi específico de Agrobacterium rhizogenes y responsable de la formación de las raíces transformadas; el segundo vector, de tipo binario (Bevan, Nuc. Acid. Res. (1984), 12: 8711), contiene el gen que codifica la proteína con actividad productora de H_{2}O_{2}, y preferentemente la oxalato oxidasa; este gen se denominara a continuación gen de selección.

La proteína codificada por el gen de selección es una proteína con actividad productora de H_{2}O_{2}. A título de ejemplo de tales proteínas, se pueden citar NADPH oxidasas, oxalato oxidasas, ámina oxidasas, glucosa oxidasas, etc. (Bolwell y Wojtazek, Plant Mol. Plant Pathol., (1998), 51, 347). Para los fines de la invención, se pueden utilizar los genes que codifican estas proteínas.

Preferentemente, se utilizará un gen que codifica una proteína con actividad oxidasa, tal como por ejemplo la oxalato oxidasa de cebada (comercializada por Boehringer, ref. 567698), de sorgo (Pundier, Phytochemistry, (1991), 30, 4, 1065), o de musgo Mnium menziesii (Laker et al, Clinical Chemistry, (1980), 26, 7, 827).

Una proteína con actividad oxalato oxidasa particularmente apreciada es la germina de trigo, cuya secuencia se ha descrito por Dratewka-Kos, J. Biol. Chem., (1989), 264, 4896) y Lane, J. Biol. chem. (1991), 266, 10461). Teniendo en cuanta la degeneración del código genético, existe un número importante de secuencias nucleotídicas que codifican la oxalato oxidasa, que se pueden igualmente utilizar para los fines de la invención.

El ADN recombinante comprende el gen que codifica la proteína con actividad productora de H_{2}O_{2}, flanqueado por los medios necesarios para su expresión, especialmente un promotor, un terminador de la transcripción, y eventualmente una secuencia que codifica un péptido de origen vegetal que se dirige a una diana.

Preferentemente, el promotor es un promotor constitutivo fuerte, por ejemplo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.

De manera alternativa, se puede usar el promotor del gen que codifica el factor alargador vegetal, tal como el promotor EF-1\alpha descrito en la solicitud de patente WO 90/02172 o por Axelos et al. Plant. Mol. Biol., (1989), 219: 1-2, 106. Igualmente se puede usar un promotor específico del tejido, un promotor activo durante una etapa específica del desarrollo de la planta, o un promotor inducible en situaciones de estrés, por ejemplo tras un choque térmico, una herida o la interacción entre la planta y parásitos (Kuhlemeir et al., Ann. Rev. Plant. Physiol., (1987), 38; 221), si la fase de selección necesita la expresión del gen productor de H_{2}O_{2} en estas situaciones.

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Entre los demás promotores de la transcripción que se pueden usar, se pueden citar especialmente:

- el promotor constitutivo doble 35S (pd35S) del CaMV, descrito en el artículo de Kay et al., Science, (1987), 236: 4805;

- el promotor quimérico superpromotor PSP (Ni M et al., Plant J., (1995), 7: 661) que consiste en la fusión de una triple repetición de un elemento activador transcripcional del promotor del gen de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, de un elemento activador transcripcional del promotor del gen de la manopina sintasa y del promotor de la manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens;

- el promotor de actina del arroz, seguido del intrón de actina del arroz (PAR-IAR) contenido en el plásmido pActl-F4 descrito por Mc Elroy et al., (Mol. Gen. Genet., (1991), 231: 150);

Igualmente se pueden usar promotores específicos de la semilla, especialmente:

- el promotor HMGW (glutenina de peso molecular elevado) de cebada descrito por Anderson et al., T.A.G., (1989), 77, 689-700;

- el promotor del gen de la \gamma-zeína de maíz (P\gamma-zeína) contenido en el plásmido p\gamma63, y que permite la expresión en el albumen de las semillas de maíz, descrito por Reina et al., Nucleic Acid Research, (1990), 18, 6426;

- el promotor PCRU del gen de la cruciferina de rábano, que permite la expresión de las secuencias asociadas únicamente con las simientes (o semillas) de la planta transgénica obtenida; este promotor se describe por Depigny-This et al., Plant. Mol., Biol., (1992), 20, 467-479;

- los promotores PGEA1 y PGEA6 que corresponden a la región 5' no codificante de los genes para la proteína de almacenamiento en semillas, GEA1 y GEA6, respectivamente, de Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., Mol. Gen. Genet. (1993), 238, p. 409-418), y que permiten una expresión específica en las semillas;

Se usa una secuencia terminadora que comprende sitios de poliadenilación, que se puede aislar de genes vegetales o de genes que se expresan en los vegetales, como por ejemplo el terminador del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., J. Mol. Apl. Genet. (1982), 1, 561-573).

Entre las secuencias que codifican un péptido de origen vegetal que se dirige a una diana, que se pueden usar en el ámbito de la invención, se pueden citar:

- la secuencia nucleotídica de 69 nucleótidos que codifica el prepéptido (péptido señal) de 23 aminoácidos de la sporamina A en la batata, que permite la entrada de los polipéptidos recombinantes en el sistema de secreción de las células vegetales transformadas;

- la secuencia nucleotídica de 42 nucleótidos que codifica el propéptido N-terminal para la selección vacuolar como dianas de 14 aminoácidos de la sporamina A en la batata, que permite la acumulación de los polipéptidos recombinantes en las vacuolas de las células vegetales transformadas;

- la secuencia de 111 nucleótidos que codifica el prepropéptido de 37 aminoácidos de la sporamina A que consiste, desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, en los 23 aminoácidos del péptido señal mencionado anteriormente, seguido de los 14 aminoácidos del propéptido mencionado anteriormente, permitiendo este prepropéptido la entrada de polipéptidos recombinantes en el sistema de secreción, y su acumulación en las vacuolas de las células vegetales transformadas según la invención, estando descritas las tres secuencias mencionadas anteriormente por Murakami et al., Plant Mol. Biol., (1986), 7, 343-355 y por Matsuoka et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1991), 88, 834-838.

- el propéptido carboxiterminal de la lectina de cebada, descrito especialmente por Schroeder et al. en Plant Physiol., (1993), 101, 451-458 y por Bednarek et al., en The Plant Cell, (1991), 3, 1195-1206;

- y la PRS (proteína relacionada con patogénesis) de Cornelissen et al. Nature, (1986), 321, 531-532, que permite la secreción.

Entre las secuencias que codifican un péptido que se dirige a una diana, se pueden igualmente citar las que codifican los péptidos Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL); Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu (SEKDEL); y His-Asp-Glu-Leu (HDEL), y que permiten la selección de una diana en el retículo endoplasmático.

Una bacteria, por ejemplo de la especie Escherichia coli, que contiene el ADN recombinante definido aquí arriba con los medios que permiten su replicación, puede servir para la clonación de este ADN recombinante. Una bacteria susceptible de infectar una planta con transferencia de material genético, Agrobacterium rhizogenes, que contiene este ADN en un contexto que permita su replicación, servirá para transformar células vegetales.

La invención permite también obtener una célula vegetal, caracterizada porque se transforma mediante el ADN recombinante definido anteriormente. Esta célula vegetal puede proceder de una especie de grandes cultivos, tales como, por ejemplo, el maíz, la soja, el trigo, la cebada, la colza, el girasol y el guisante, o de una especie de huertas, tal como la lechuga, el melón, el tomate, los coles, la cebolla y el maíz (preferentemente maíz dulce). Especies particularmente apreciadas son la colza Brassica napus, el girasol helianthus annuus, el tabaco Nicotiana tabacum, la coliflor Brassica oleracea y el tomate Lycopersicon esculentum. Preferentemente, la invención se refiere a especies que no expresan la oxalato oxidasa de manera endógena.

La invención permite también obtener una planta o una parte de planta, caracterizada porque contiene el ADN recombinante definido anteriormente, y porque se seleccionó mediante visualización de la actividad enzimática de la proteína con actividad productora de H_{2}O_{2} mediante el uso de un ensayo colorimétrico con peroxidasa, aplicado a las raíces que proceden del cultivo in vitro o a los tejidos vegetales extraídos sobre las plantas enteras. Las plantas transgénicas son regeneradas directamente a partir de las raíces u órganos seleccionados mediante el ensayo colorimétrico con peroxidasa.

Las partes de plantas definidas según la invención comprenden especialmente los hipocotilos, bohordos de flores, pecíolos y, preferentemente, los cotiledones. Mediante la expresión "parte de plantas", se entienden igualmente las células cultivadas in vitro o las células de dicha planta.

Según otro aspecto de la invención, la secuencia de ADN recombinante que codifica una proteína con actividad productora de H_{2}O_{2} se usa para seleccionar células vegetales transformadas con una secuencia de interés.

Así, la invención se refiere igualmente a un procedimiento para la obtención de plantas transgénicas que expresan un gen de interés, distinto al de la proteína con actividad productora de H_{2}O_{2}, asociado con el gen que codifica una proteína productora de H_{2}O_{2} que comprende las etapas siguientes:

(a) transformar células vegetales mediante agrobacterium rhizogenes que contiene un ADN recombinante que comprende al mismo tiempo un gen que codifica la proteína productora de H_{2}O_{2} y un gen que codifica una proteína de interés, en un contexto que permita su expresión en la planta;

(b) seleccionar transformantes que contienen el gen que codifica la proteína de interés mediante un ensayo colorimétrico con peroxidasa;

(c) regenerar las plantas a partir de los transformantes seleccionados, y monitorizar la expresión de las plántulas obtenidas mediante un ensayo colorimétrico con peroxidasa;

(d) seleccionar según el fenotipo, y eventualmente realizar un análisis molecular de la descendencia de las plantas transgénicas, para seleccionar o confirmar las plantas que contienen sólo el transgén y no el ADN-T específico de A. rhizogenes;

(e) llegado el caso, purificar la proteína de interés producida.

Este nuevo sistema de revelación inmediato sobre raíces es particularmente interesante en el caso en el que el gen de interés se expresa en una etapa tardía del desarrollo, o en un órgano vegetativo distinto del órgano sobre el cual se efectúa la selección, o también si es difícil de demostrar. Por ejemplo, es utilizable para seleccionar sucesos de transformación que se refieren a un gen de interés puesto bajo control de un promotor específico de la semilla o específicamente expresado en los tejidos verdes.

La secuencia de interés puede ser cualquier secuencia de ADN de interés agronómico o industrial. Por ejemplo, puede estar implicada en una vía metabólica dada, especialmente la de los aceites, almidones, proteínas, aminoácidos, lignina, componentes de la pared celular, o también en la vía de resistencia a los patógenos. Igualmente, esta secuencia de interés se puede utilizar en sentido o en antisentido.

Igualmente, puede ser, por ejemplo, una secuencia reguladora ventajosa. También puede ser una secuencia que codifica una proteína de interés, o que codifica un precursor de esta última. A título de ejemplo de secuencias que codifican una proteína de interés, se pueden citar las secuencias que codifican las lipasas.

Según un modo preferido de realización de la invención, la secuencia de interés confiere a las plantas una resistencia a los agentes patógenos, tales como los hongos, las bacterias, así como los artrópodos, especialmente los insectos, y los nematodos.

Tal secuencia de interés puede ser, por ejemplo, una secuencia que codifica una proteína con actividad de endoquitinasa o un precursor de esta última. En efecto, se sabe que, como se describe en la solicitud de patente WO 92/01792, tal proteína tiene un efecto fitoprotector debido a que es capaz de degradar la quitina, un polímero polisacarídico que consiste en unidades de N-acetilglucosamina enlazadas mediante enlaces \beta-1,4, que es un compuesto estructural importante de la pared de la mayoría de los hongos patógenos, del exoesqueleto de los artrópodos, en particular de los insectos, y de la envoltura externa de los huevos y quistes de nematodos.

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Una secuencia interesante que codifica una proteína con actividad de endoquitinasa, o un precursor de esta última, es la descrita en la solicitud de patente WO 92/01792, incorporada como referencia.

Otra secuencia que codifica una proteína con actividad de endoquitinasa, o un precursor de esta última, es la de la quitinasa de aphanocladium album descrita en la solicitud de patente EP-A1-531.218, incorporada como referencia.

La invención permite también obtener células vegetales, caracterizadas porque se transforman mediante el ADN recombinante definido anteriormente, a saber, el ADN recombinante que comprende un gen que codifica una proteína con actividad productora de H_{2}O_{2} y un gen que codifica una proteína de interés, así como los medios necesarios para su expresión. Dichos medios son los mismos que los definidos anteriormente. Estas células vegetales pueden proceder de las especies de grandes cultivos o de las especies de huertos anteriormente indicadas.

La invención permite también obtener una planta o parte de planta, caracterizada porque expresa la proteína de interés susodicha, con los medios necesarios para la expresión del gen que codifica una proteína capaz de producir H_{2}O_{2}, y especialmente la oxalato oxidasa. Esta planta o parte de planta se selecciona mediante un ensayo colorimétrico para revelar el H_{2}O_{2} formado en las raíces que proceden de cultivo in vitro o de plantas en invernadero. Las plantas transgénicas se regeneran directamente a partir de las raíces que expresan el transgén que se seleccionan mediante el ensayo colorimétrico.

Las partes de plantas son como se definen anteriormente.

La invención se ilustrará con la ayuda de los ejemplos descritos a continuación.

En esta parte experimental, se usa el clon gf-2.8 de la germina de trigo descrito por Lane et al., J. Biol. Chem., (1991), 226, 10461.

Una gran parte del conjunto de las técnicas siguientes, bien conocidas por el experto en la técnica, se expone en detalle en las publicaciones de Sambrook et al.: "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", publicada en 1989 por los editores Cold Spring Harbor Press en Nueva York (2a edición), y en la publicación de Gelvin et al.: "Plant Molecular Biology Manual", publicada en 1988 por los editores Kluwer Academics.

Ejemplos Ejemplo 1 Transformación de plantas mediante el gen de la germina de trigo, y selección de los transformantes mediante un ensayo colorimétrico en la raíz 1-1 Obtención de colza transgénica a) Vectores de la transformación

Según un primer modo de realización de la invención, la secuencia que codifica la germina de trigo se liga a la secuencia del promotor de 35S del virus del mosaico de la coliflor, y a la secuencia terminadora NOS de Agrobacterium tumefaciens, antes de ser insertada en el vector binario pBIN19 (Bevan, Nucl. Acid. Res., (1984), 12, 8711-8721) según el modo de realización descrito en la Sección 2 de la solicitud WO 94-13790, incorporada como referencia. El vector obtenido, denominado pPH100, se clona en la cepa HB101 de E. coli (Clontech).

Según otro modo de realización de la invención, se operó de la misma manera que aquí arriba, utilizando la secuencia promotora del gen que codifica el promotor de Factor de Elongación EF-1\alpha aislado de Arabidopsis thaliana (Axelos et al., Plant Mol. Biol., (1989), 219: 1-2, 106), en lugar de la secuencia del promotor 35S. El nuevo vector, denominado p631, se clona en la cepa HB101 de E. coli.

La secuencia promotora puede igualmente ser la secuencia promotora inducible descrita en la solicitud de patente WO 94/21793, y portada por el vector pPH118 descrito en el Ejemplo 3 siguiente.

b) Transferencia en Agrobacterium rhizogenes

La transferencia de los plásmidos susodichos se realiza según el método de congelación-descongelación descrito por Gelvin et al. en Plant Molecular Biology Manual susodicho, con la cepa A4 de Agrobacterium rhizogenes descrita por Guerche et al. en Mol. Gen. Genet., (1987), 206, 382.

Las bacterias se reparten sobre placas de Petri que contienen 100 mg/l de rifampicina y 25 mg/l de kanamicina. Entonces, las colonias que se forman se subcultivan varias veces sobre el medio de selección. La presencia del gen de oxalato oxidasa en Agrobacterium rhizogenes se verifica mediante el método de Southern, en una preparación de ADN total (lisis de las bacterias, purificación del ADN mediante extracción con la ayuda de la mezcla fenol/cloroformo según el protocolo descrito por Gelvin en la publicación citada aquí arriba, corte por escisión del ADN purificado con la ayuda de enzimas de restricción, electroforesis sobre gel de agarosa, transferencia sobre membrana, e hibridación según las técnicas bien conocidas por le experto en la técnica).

c) Obtención de raíces transformadas, y selección

La transformación se realiza según el protocolo de Guerche et al (1987), y los distintos medios de cultivo, cuya composición se presenta en la tabla 1 siguiente, son los descritos por Pelletier et al. (Mol. Gen. Genet., (1983), 191, 244).

Se extraen segmentos de tallos en el extremo apical de plantas de colza (Brassica napus: variedades de primavera Brutor y variedades de invierno Nickel o Navajo). Estos segmentos se esterilizan en su superficie, se enjuagan en agua estéril, se cortan en segmentos de 1,5 cm aproximadamente de longitud, y se disponen en un tubo que contiene el medio A. Alternativamente, el explante usado para la transformación puede consistir en cotiledones extraídos de germinaciones jóvenes de ocho días aproximadamente. La inoculación del extremo de los segmentos de bohordos, de los hipocotilos o de los pecíolos de cotiledones se efectúa depositando una suspensión de la cepa de Agrobacterium rhizogenes que contiene el vector pPH100 o el vector p631. Aparecen raíces transformadas sobre el segmento de tallo o sobre los pecíolos de cotiledones después de 1 a 2 semanas, se retiran después de 3 semanas y se disponen sobre el medio B de agar-agar (15 g/l). Estas raíces contienen el ADN-T del vector pRi específico de Agrobacterium rhizogenes, solo o acompañado del ADN-T del vector portador del gen que codifica la oxalato oxidasa.

La selección de los transformantes que contienen el ADN-T de los plásmidos pPH100 o p631 portadores del gen que codifica la germina de trigo, se realiza según el protocolo siguiente:

- la primera etapa consiste en extraer, con un escalpelo, los extremos apicales (0,5 a 1 cm) de raíces cultivadas preferentemente in vitro (etapa de descontaminación o cultivo líquido), o de fragmentos de hojas de plantas cultivadas en un invernadero, e introducirlos en tubos Eppendorf de 1,5 ml que contienen 0,5 ml de mezcla de reacción de "oxalato oxidasa" (oxalato de Na 0,015 M en un tampón de succinato, pH 4; 0,05 M). Los tubos que contienen las raíces se conservan en hielo hasta el final de la recogida de muestras.

- la segunda etapa es la incubación de los tubos en baño maría a 37ºC durante 1 hora, condiciones que permiten el desarrollo de la reacción catalizada mediante la oxalato oxidasa.

- la tercera y última etapa es la revelación del agua oxigenada producida en la etapa anterior; se añaden sucesivamente a la mezcla de reacción: un sustrato cuya oxidación se acompaña de un cambio de color; este sustrato se elige entre los compuestos fenólicos o las aminas aromáticas, y, por ejemplo, 0,1 ml de 4-cloro-1-naftol a 0,3% en etanol absoluto, y 0,1 ml de peroxidasa a 0,006% en el tampón Tris pH 7,6, 50 mM. Se agitan los tubos y después se incuban al menos 2 horas en baño maría a 37ºC. Se obtiene un color azul en las raíces transformadas, preferentemente a nivel de la parte apical y del cilindro central de las raíces. Este ensayo coloreado sobre la muestra de la raíz permite la detección de los transformantes que se han integrado y que han expresado el gen de oxalato oxidasa.

A continuación se describen las disoluciones de los productos usados:

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Tampón de Succinato 0,05 M, pH 4, c.s. 250 ml (conservar a 4ºC, 3 semanas como máximo)

3,375 g de Succinato de Na, ajustar hasta pH 4 con HCl

Mezcla de reacción de ``oxalato oxidasa'' (Preparar extemporáneamente)

18 mg de oxalato de Na en 10 ml de tampón de succinato

Disolución madre de 4-cloro-1-naftol (Conservar a 4ºC)

0,3 g/10 ml de etanol aboluto

Disolución de trabajo de 4-cloro-1-naftol (Preparar extemporáneamente)

0,1 ml de disolución madre/10 ml de Tris 50 mM; pH 7,6

Tampón Tris 50 mM; pH 7,6 c.s. 250 ml (conservar a 4ºC)

1,96 g Tris-HCl, ajustar hasta pH 7,6 con NaOH

Peroxidasa (tomar una parte alícuota y congelar a -20ºC)

6 mg/100 ml de tampón Tris 50 mM; pH 7,6.

d) Regeneración de plantas transformadas y selección fenotípica

Se incuban fragmentos de raíces seleccionadas durante 15 días sobre un medio D que contiene 3 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, y después se disponen sobre un medio de inducción RCC de yemas. Las plantas enraizadas se obtienen después mediante pasos de las yemas sobre los medios F y G. Las plantas se cultivan y se autofecundan para dar semillas. La expresión de las plantas regeneradas obtenidas se puede fácilmente comprobar mediante técnicas sencillas (frotis, transferencia, mancha o tinción directa sobre fragmentos de hojas, de tallos, etc.). Una selección de la descendencia según los caracteres fenotípicos de las plantas transformadas permite eliminar las plantas que contienen el ADN-T de pRi, que presentan especialmente hojas gofradas y entrenudos más cortos. Después, esta selección se confirma mediante métodos de análisis molecular.

1-2 Obtención de coliflor transgénica

Según el mismo protocolo, se extraen segmentos de tallos a partir de flores jóvenes de Brassica oleracea L. var. Botrytis cv. Taroke, y se transforman vía las cepas de A4 de Agrobacterium rhizogenes antes mencionadas. Las raíces que expresan el gen que codifica la oxalato oxidasa se seleccionan según el ensayo coloreado descrito, y se hacen regenerar para la obtención de plantas transgénicas. Las plantas regeneradas obtenidas se cultivan en un invernadero, se vernalizan y después se autofecundan, y su descendencia se selecciona en base a los caracteres fenotípicos y a los análisis moleculares para conservar solamente las plantas que contienen únicamente el ADN-T portador del gen de oxalato oxidasa.

1-3 Obtención de callos de girasol transgénicos

Se recogen segmentos de pecíolos a partir de plantas de girasol Helianthus annuus (Variedad Euroflor Rustica Prograin Genetique) de 6 a 10 semanas. Los segmentos se desinfectan empapando durante 30 minutos en una disolución de hipoclorito de calcio al 1%. Después, los segmentos de pecíolos se colocan en un tubo que contiene un medio de cultivo de agar-agar de Murashige y Skoog. La inoculación del extremo de estos segmentos se efectúa depositando una suspensión de la cepa de Agrobacterium rhizogenes que contiene el plásmido pPH100. Entonces, aparecen raíces transformadas en el segmento de pecíolo después de 1 mes aproximadamente. Estas raíces se extraen y se colocan sobre el medio M de agar-agar (Tabla 2 adjunta) suplementado de 6 g/l de agarosa.

La selección de las raíces que expresan la proteína con actividad de oxalato oxidasa se efectúa en el estado de raíz según el protocolo descrito anteriormente. Entonces, las raíces positivas al ensayo colorimétrico se subcultivan en el mismo medio, dando callos totalmente transformados que expresan la oxalato oxidasa.

1-4 Obtención de tabaco transgénico

El nervio central de las hojas de tabaco se corta en fragmentos que se colocan en un medio de agar-agar de Murashige y Skoog (MS). Estos explantes se inoculan con la ayuda de una suspensión de la cepa de A. rhizogenes que contiene el plásmido pPH100. Las raíces que aparecen después de unos días se subcultivan en el mismo medio que contiene 500 mg/l de cefotaxima a fin de eliminar la bacteria, y se transfieren después sobre un medio de agar-agar de Murashige y Skoog que contiene 0,1 mg/l de AIA (ácido 3-indolilacético) y 1 mg/l de BAP (6-bencilaminopurina). Las yemas que se forman se subcultivan en un medio de agar-agar de MS, y las plantas obtenidas se transfieren a un invernadero.

1-5 Obtención de tomate transgénico

Se pueden obtener plantas de tomates según el mismo protocolo de transformación y de selección, a partir de raíces de plantas transformadas (Shahin et al., TAG (1986), 72: 770; Morgan et al., Plant Science (1987), 49: 37).

Ejemplo 2 Uso de este procedimiento de selección con peroxidasa para obtener plantas transgénicas que expresan un segundo gen de interés: el gen que codifica una proteína con actividad de endoquitinasa 2-1 Obtención de colza transgénica

El vector de transformación pPH106, que comprende el gen que codifica la germina de trigo, que procede del plásmido pPH100 susodicho, y el gen quimérico que codifica una actividad de endoquitinasa (documento WO 92/01792), se obtiene según el procedimiento descrito en la solicitud de patente WO 94/13790, incorporada como referencia.

La preparación del vector de transformación comprende las etapas siguientes:

a) Preparación del fragmento portador del gen que codifica la oxalato oxidasa

El fragmento HindIII-EcoRI de 1420 pb aproximadamente, del plásmido pPH100 citado en la sección 1-1 del ejemplo 1, se purifica y se reclona en un vector pUC19 según los métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Después, este plásmido se linealiza gracias a la endonucleasa de restricción EcoRI, y el extremo cohesivo se llena por medio del fragmento de Klenow. Después, tras cortar con la endonucleasa HindIII, se purifica el fragmento terminado despuntado con HindIII.

b) Preparación del fragmento portador de un gen híbrido que codifica una proteína con actividad de endoquitinasa

El fragmento HindIII-EcoRI obtenido del plásmido pBR1 descrito en la solicitud de patente WO 92/01792, ejemplo 1, incorporada como referencia, y que contiene un gen quimérico que codifica una proteína con actividad de endoquitinasa que comprende el promotor 35S, una secuencia que codifica una quitinasa híbrida tomato-tabaco, y el terminador NOS, se purifica, se reclona en el vector pUC19, y después el sitio de HindIII se destruye de manera clásica. Se purifica el fragmento de EcoRI terminado despuntado.

c) Preparación de un vector para transformar plantas que no contienen el gen de resistencia a la kanamicina

El fragmento NheI-HindIII que comprende la parte que codifica el gen de resistencia a la kanamicina se elimina del ADN-T del plásmido pBIN19. El uso, según los métodos bien conocidos por el experto en la técnica, de los oligonucleótidos CTAGCA y AGCTTG, permite recircularizar el plásmido volviendo a crear los sitios de restricción de NheI y de HindIII. Después, el plásmido resultante se linealiza con las endonucleasas de restricción HindIII y EcoRI.

d) Ensamblaje del vector de transformación

Se ligaron, con la ayuda de ADN T4 ligasa, el gen que codifica la oxalato oxidasa, obtenido en a) aquí arriba, y el gen quimérico que codifica una proteína con actividad de quitinasa (obtenido en b) aquí arriba), en un vector binario pBIN19, del que se ha eliminado el gen de resistencia a la kanamicina que se expresa en las plantas (obtenido en c) aquí arriba). El vector obtenido, denominado pPH106, se clona en la cepa de E. coli HB101 (Clontech).

Las etapas de transformación, selección y regeneración se realizan según el protocolo suministrado en el primer ejemplo.

2-2 Demostración de la expresión de la proteína de interés en las plantas transgénicas regeneradas

Tal como se describe en la solicitud de patente WO 94/13790, incorporada como referencia, las técnicas de transferencia Western y de medida de la actividad quitinolítica sobre extractos brutos de proteínas de plantas transformadas permiten confirmar la expresión correlacionada de la endoquitinasa con la de la oxalato oxidasa.

La preparación de los extractos brutos de proteínas de plantas transformadas se efectúa según el método siguiente: los fragmentos de tejidos (callos y hojas de plantas) se congelaron en nitrógeno líquido, se redujeron a polvo y se almacenaron a -20ºC.

Para la realización de la electroforesis, la oxalato oxidasa se extrae directamente a partir del polvo vegetal mediante el tampón de carga de Laemmli (ref. a continuación).

Para las evaluaciones de la actividad de oxalato oxidasa, el extracto enzimático se obtiene suspendiendo el polvo vegetal en un tampón de succinato 0,05 M, pH 4.

Para las evaluaciones de proteínas, el extracto vegetal, en suspensión en el tampón de succinato aquí arriba, se centrifuga a 10.000 g durante 5 min.

La concentración de las proteínas totales se determina en los sobrenadantes, denominados a continuación extractos brutos de proteínas, siguiendo la técnica de Bradford, Anal. Biochem., (1976), 72, 248-254).

Los experimentos de transferencia Western o para demostrar la actividad quitinolítica siguen los protocolos siguientes:

a) Inmunodetección de la quitinasa híbrida (transferencia Western)

Los extractos brutos de proteínas se someten a una transferencia Western, técnica bien conocida por el experto en la técnica y descrita por Towbin et al. (Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, (1979), 76, 4350-4354), que comprende especialmente las etapas siguientes:

- desnaturalizar mediante calentamiento a 100ºC durante 10 minutos en un tampón, denominado tampón de carga, que consiste en Tris 0,125 M, pH 6,8, SDS al 4%, azul de bromofenol al 0,002%, glicerol al 20%, \beta-mercaptoetanol al 10% (según el protocolo descrito por Laemmli U.K., Nature, (1970), 227, 680-685), seguido de la centrifugación a 10.000 g;

- separar electroforéticamente las distintas proteínas contenidas en el solubilisado, según el protocolo descrito por Laemmli;

- electrotransferir dichas proteínas contenidas en el gel sobre una membrana de PVDF (según la técnica de Towbin et al., ref. aquí arriba).

La inmunodetección se realiza según el protocolo que comprende las etapas siguientes:

- saturar la membrana de PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)) sobre la cual las proteínas se han transferido incubando durante al menos 2 h a 37ºC en una disolución de gelatina al 3% en una disolución salina tamponada con fosfato, que contiene 0,05% de detergente Tween 20.

- incubar (durante 1 h a 37ºC) en presencia del inmunosuero preparado anteriormente (que contiene los anticuerpos policlonales que reconocen la proteína recombinante), diluido 1/10.000 en una disolución salina tamponada con fosfato.

- efectuar 3 lavados en una disolución salina tamponada con fosfato, que contiene 0,05% de detergente Tween 20.

La inmunodetección de la proteína de interés se realiza gracias a un inmunosuero que contiene anticuerpos policlonales que reconocen a la proteína híbrida con actividad de quitinasa (véase el documento WO 92/01792, ejemplo 5, incorporado como referencia).

Después, el complejo de antígeno-anticuerpo se revela con la ayuda de un sistema de estreptavidina-biotina conjugado con fosfata alcalina con el kit RPN 23 de Amersham ("Blotting detección kit"), usado según las indicaciones del fabricante.

La mancha obtenida muestra, para las hojas de plantas de tabaco transformadas con el plásmido pPH106, la presencia de una proteína con un peso molecular aparente de aproximadamente 26 \pm 6 kDa reconocida por los anticuerpos policlonales y que no se encuentra en las hojas de las plantas testigo. Esta proteína tiene el mismo peso molecular aparente que la proteína híbrida con actividad de quitinasa descrita en la solicitud WO 92/01792.

b) Demostración de la actividad quitinolítica de la proteína recombinante

La actividad quitinolítica de los extractos brutos de proteínas de hojas de plantas transformadas con el plásmido pPH106 y del extracto bruto de proteínas de hojas de plantas no transformadas se puede medir según el método siguiente.

La actividad de endoquitinasa de la proteína se mide mediante un método radioquímico que permite estimar la cantidad de monómeros o de oligómeros liberados por la enzima a partir de un sustrato (quitina tritiada). Este método, descrito por Molano et al. (Anal. Biochem., (1977), 83, 648-656), se resuma a continuación.

Se añaden 50 \mul de una suspensión de quitina tritiada de actividad específica de 0,58 MBq/ml a un volumen de extracto proteico de 10 \mul. El volumen final se ajusta a 300 \mul con un tampón de acetato de sodio 0,2 M de pH 5,0.

Después de incubar durante 90 minutos a 30ºC, la reacción de hidrólisis de la quitina se detiene con 100 \mul de ácido tricloroacético al 20%. Después, los tubos de reacción se centrifugan durante 10 minutos a 12.000 g. Se extrae una parte alícuota de 100 \mul de sobrenadante que contiene los oligómeros solubles de quitina, y se mide la radioactividad correspondiente mediante centelleo de líquidos en presencia de 5 ml de mezcla de centelleo. La actividad quitinolítica específica se expresa en dpm/\mug de proteína.

Se observa que los extractos de plantas transformados con el plásmido pPH106 tienen una actividad quitinolítica significativamente mayor que la del extracto de plantas testigo. Por lo tanto, la selección mediante un ensayo colorimétrico permite obtener plantas que expresan un gen de interés, en este caso el gen híbrido que codifica una proteína con actividad de quitinasa descrito en la solicitud de patente WO 92/01792.

Se puede obtener una variante del ADN recombinante susodicho sustituyendo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor por el promotor del gen EF-1\alpha de Arabidopsis, en dirección de uno o de los dos genes anteriormente descritos.

Según el mismo procedimiento, se pueden obtener plantas de coliflor, de girasol, de tabaco y de tomate transgénicas.

Ejemplo 3 Uso e inducción de un promotor inducible

Es posible usar preferentemente un promotor inducible en situaciones de estrés (por ejemplo choque térmico, heridas, choque hormonal, elicitor biótico o abiótico, o infección bacteriana, fúngica o vírica), que se expresa a nivel sostenido en los distintos órganos y tejidos de una planta, especialmente las raíces y el meristemo de una planta.

En este ejemplo, se usó el promotor inducible por estrés que comprende la secuencia de ADN (secuencia B precedida por la secuencia C) [SEQ ID Nº4 precedida por SEQ ID Nº5] o una secuencia que presenta un grado elevado de homología con esta secuencia, tal como se describe en la solicitud WO 94/21793, incorporada como referencia. Este promotor se denomina en lo sucesivo p246-C.

3-1 Preparación de los vectores de transformación a) Construcción del promotor inducible-oxalato oxidasa

El vector pPH100 descrito en el ejemplo 1-1 a) se abre con la ayuda de las enzimas de restricción HindIII y BamHI, y después el fragmento de aproximadamente 13500 pares de bases, que corresponde a la parte codificante de oxalato oxidasa, seguida del terminador NOS en el vector pBIN19, se purifica mediante electroforesis sobre gel de agarosa.

El vector pPH118 obtenido mediante inserción, según los procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica, del promotor p246-C inducible por estrés, definido aquí arriba, en el plásmido pTZ19R comercializado por PHARMACIA, se abrió con la ayuda de las mismas enzimas de restricción. Después de una electroforesis sobre gel de agarosa, se aisló y se purificó el fragmento de HindIII-BamHI de aproximadamente 1275 pb. Éste corresponde a la secuencia B precedida por la secuencia C del promotor inducible tales como se describen aquí arriba y en la solicitud WO 94/21793.

La ligación de la secuencia promotora así obtenida al vector HindIII-BamHI anterior coloca a la parte codificante de la oxalato oxidasa bajo el control del promotor inducible y del terminador NOS; el vector binario así creado se denomina p643. La construcción de este vector se ilustra en la figura 1 adjunta.

3-2 Transformación y selección

La transformación de la colza se realiza según el protocolo descrito anteriormente en el ejemplo 1-1. Las raíces transformadas que expresan el gen de oxalato oxidasa se seleccionan tal como se describe anteriormente, y se dejan regenerar. Después de un choque hormonal, se forma un callo a partir de las raíces, y produce yemas que, después, se subcultivan para dar plantas. Estas plantas se transfieren a un invernadero después de un periodo de aclimatación.

Según este mismo protocolo, se pueden obtener plantas de tabaco, tomate y coliflor.

Ejemplo 4 Selección de los transformantes mediante un ensayo colorimétrico en medio líquido o transferencia de placa de medio de agar-agar o membrana

Como la oxalato oxidasa se puede difundir a partir del lugar en el que se expresa, es posible usar soportes distintos de la raíz para realizar el ensayo colorimétrico.

4-1 Medio líquido

La selección de los transformantes portadores del gen que codifica la germina de trigo se puede llevar a cabo directamente en el medio de cultivo in vitro tras eliminar las agrobacterias. Después de haber retirado las plantas jóvenes descritas en el punto c) del ejemplo 1 apartado 1.1, la mezcla de reacción de "oxalato oxidasa" se añade al medio de cultivo o a una muestra recogida de éste, y después el procedimiento se lleva a cabo como se describe en el ejemplo 1, para favorecer la reacción enzimática y revelar los productos así obtenidos.

4-2 Transferencia sobre membrana a) Selección de plantas jóvenes

Se esterilizan en su superficie semillas de colza transgénicas obtenidas según el ejemplo 1, apartado 1.1, y se dejan germinar en una placa de materia plástica cuyo fundo está revestido de varias capas de papel de filtro y de una membrana de PVDF, Hybond C o nitrato de celulosa, utilizadas clásicamente para la realización de las transferencias Western. Las semillas se depositan sobre la membrana, sobre una rejilla que permite ver su posición. La membrana se humedece con agua estéril; después, la placa se cierra y se coloca en una cámara de cultivo durante aproximadamente ocho días. Cuando las raíces de las germinaciones jóvenes tienen 1 a 2 cm, las plántulas se transfieren a otra placa, sobre un papel de filtro humedecido, respectando la posición que tenían sobre la membrana.

Después, la membrana se revela según una variante del protocolo descrito en el ejemplo 1, apartado 1.1;

-

la membrana se incuba a 37ºC durante una hora, tras haber sido impregnada con la mezcla de reacción de "oxalato oxidasa" (oxalato de Na 0,015 M en un tampón de succinato pH 4, 0,05 M),

-

la membrana se revela mediante adición del sustrato (compuesto fenólico o amina aromática), y por ejemplo de 4-cloro-1-naftol al 0,03% en etanol absoluto, y una disolución de peroxidasa al 0,0006% en el tampón Tris-HCl pH 7,6; 50 mM. Esta revelación se continúa durante 2 horas a 37ºC.

Las transferencias sobre la membrana de raíces de plantas que expresan la oxalato oxidasa se colorean de azul, lo que permite ver los transformantes a conservar.

b) Selección sobre transferencias realizadas a partir de cortes de tejidos

Se recogen diversos órganos de plantas (hojas, pecíolos, raíces, piezas florales, etc.) transformadas según las etapas descritas en el ejemplo 1. En estas muestras frescas, se realiza una sección con la ayuda de un escalpelo, y la superficie de corte se aplica firmemente contra la superficie de una membrana de nitrocelulosa. Después de un secado al aire de varios minutos, se efectúa la revelación de la membrana tal como se describe anteriormente.

Ejemplo 5 Uso de un promotor específico de la semilla

El sistema de revelación inmediato en la raíz es particularmente ventajoso en el caso en el que el gen de interés se expresa en una etapa tardía del desarrollo, como por ejemplo en la semilla.

5-1 Preparación de los vectores de transformación

Se obtuvo un primer vector que contiene una secuencia nucléica que codifica una lipasa bajo el control del promotor PGEA1 de Arabipopsis thaliana, específico de la semilla (Gaubier et al., 1993, citado anteriormente), según los métodos de clonación conocidos por el experto en la técnica, a partir de las secuencias cuyas informaciones están disponibles en Genbank: la secuencia UO2622 de 1641 nucleótidos que codifica una lipasa 1 de Geotrichum candidum -cepa ATCC 34614 se puso bajo el control de la secuencia nucleotídica del promotor PGEA1 de Arabidopsis thaliana (Z11158, 1659 nucleótidos), y se fusionó con el terminador NOS, en un plásmido pBluescript.

Tal como se describe en el punto d) del ejemplo 2, apartado 2.1, el fragmento obtenido anteriormente se ligó con la ayuda del ADN ligara T4 al gen que codifica la oxalato oxidasa en un vector binario pBIN19 para la etapa de transformación.

5-2 Transformación y selección

La transformación de la colza se realiza según el protocolo descrito en el ejemplo 1 con la ayuda del vector que deriva de pBIN19 descrito anteriormente, y la selección de los transformantes se realiza al formarse las raíces, según uno de los métodos descritos en el ejemplo 1 en el ejemplo 4.

Los resultados muestran que es posible, según el sistema de revelación inmediato en el estado de raíz de la invención, seleccionar muy pronto transformantes que expresan normalmente el gen de interés en una etapa tardía del desarrollo (semilla) o en un órgano vegetativo distinto a aquel sobre el cual se realizó la selección.

Según un protocolo parecido, se pueden igualmente obtener plantas de tabaco, tomate y coliflor.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

TABLA 2 Composición del medio de cultivo M usado para el cultivo de las raíces transformadas de girasol

	Composición (mg/l)
NH_{4}NO_{3}	330
KNO_{3}	380
KH_{2}PO_{4}	170
MgSO_{4}	370
CaCl_{2}	440
H_{3}BO_{3}	6,3
MnSO_{4}.4H_{2}O	22,3
ZnSO_{4}.7H_{2}O	1,6
KI	0,83
Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O	0,25
CuSO_{4}.5H_{2}O	0,025
CoCl_{2}.6H_{2}O	0,025
Piroxidina HCl	0,1
Ácido nicotínico	0,1
Glicina	0,4
Inositol	20
Tiamina	0,02
Sacarosa	30000
Citrato de hierro	200

Claims (19)

1. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas que expresan una proteína con actividad productora de H_{2}O_{2}, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a) transformar células vegetales o explantes con Agrobacterium rhizogenes que contiene un vector portador de un gen que codifica una proteína productora de H_{2}O_{2} en un contexto que permite su expresión en la planta, induciendo dicha transformación la formación de raíces transformadas;

(b) seleccionar las raíces transformadas que contienen y expresan este gen, mediante un ensayo colorimétrico con peroxidasa;

(c) regenerar las plántulas a partir de las raíces seleccionadas, y monitorizar la expresión de dicho gen que codifica una proteína productora de H_{2}O_{2} en las plántulas obtenidas, realizándose dicha monitorización de la expresión mediante un ensayo colorimétrico con peroxidasa;

(d) seleccionar según el fenotipo y eventualmente mediante análisis molecular de la descendencia de las plantas transgénicas, permitiendo la selección o la confirmación de las plantas transgénicas obtenidas que contienen solamente el transgén y no el ADN-T específico de A. rhizogenes.

2. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas que expresan un gen de interés y un gen que codifica una proteína con actividad productora de H_{2}O_{2}, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a) transformar células vegetales o explantes con Agrobacterium rhizogenes que contiene un ADN recombinante que comprende al mismo tiempo un gen que codifica la proteína productora de H_{2}O_{2} y un gen que codifica una proteína de interés en un contexto que permite su expresión en la planta, induciendo dicha transformación la formación de raíces transformadas;

(b) seleccionar las raíces transformadas que contienen el gen que codifica la proteína de interés y que expresa el gen que codifica una proteína productora de H_{2}O_{2}, mediante un ensayo colorimétrico con peroxidasa;

(c) regenerar plántulas a partir de las raíces seleccionadas, y monitorizar la expresión de dicho gen que codifica una proteína productora de H_{2}O_{2} en las plántulas obtenidas, realizándose dicha monitorización de la expresión mediante un ensayo colorimétrico con peroxidasa;

(d) seleccionar según el fenotipo y eventualmente mediante análisis molecular de la descendencia de las plantas transgénicas para seleccionar o confirmar las plantas que contienen solamente el transgén y no el ADN-T específico de A. rhizogenes;

(e) purificar, llegado el caso, la proteína de interés producida.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el ensayo colorimétrico con peroxidasa según la etapa (b) o (c) se efectúa en presencia de un sustrato para dicha proteína con actividad productora de H_{2}O_{2}, y en presencia de peroxidasa para revelar la formación de H_{2}O_{2}.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la proteína productora de H_{2}O_{2} es una proteína con actividad de oxalato oxidasa.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la proteína con actividad de oxalato oxidasa se elige entre el grupo que consiste en la oxalato oxidasa de cebada, de sorgo, de musgo Mnium mensiezii o de la germina de trigo.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ensayo colorimétrico de la etapa (b) se efectúa sobre una muestra de la raíz.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ensayo colorimétrico de la etapa (b) se efectúa sobre un medio líquido de incubación tras eliminar las agrobacterias.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ensayo colorimétrico de la etapa (b) se efectúa en la huella dejada por los explantes transformados en un medio de agar-agar o en una membrana.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la selección en la etapa (b) se realiza en presencia del ácido oxálico como sustrato de la proteína con actividad productora de H_{2}O_{2}.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la concentración de ácido oxálico está comprendida entre 5 y 50 mM.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la concentración de ácido oxálico es de 15 mM.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ensayo colorimétrico de la etapa (c) se efectúa en una muestra de tejido vegetal de las plántulas obtenidas.

13. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el gen de interés es un gen de interés que se expresa en una etapa tardía del desarrollo.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque las células vegetales son células vegetales que proceden de una especie de grandes cultivos elegida entre la colza, coliflor, girasol, trigo, maíz, cebada, tabaco, soja, o de una especie vegetal tal como el tomate, melón, lechuga, cebolla.

15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque las células vegetales son células de cotiledones, hipocotilos o bohordos florales.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque las células vegetales no producen oxalato oxidasa de manera endógena.

17. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, caracterizado porque la proteína de interés es una endoquitinasa.

18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, caracterizado porque la proteína de interés se elige entre el grupo que consiste en una proteína implicada en la vía metabólica de los aceites, almidones, proteínas, aminoácidos, de la lignina, de los componentes de la pared celular, o en la vía de resistencia a los patógenos.

19. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, caracterizado porque la proteína de interés confiere a las plantas una resistencia a los agentes patógenos.