ES2258261T3 - Tratamiento de enfermedades autoinmunes por administracion oral de autoantigenos. - Google Patents
Tratamiento de enfermedades autoinmunes por administracion oral de autoantigenos.Info
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Abstract
LA INVENCION ESTA DIRIGIDA A UN PROCESO DE TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD AUTOINMUNE EN ANIMALES MEDIANTE CELULAS T INCLUYENDO SERES HUMANOS, MEDIANTE LA ADMINISTRACION ORAL DE AUTOANTIGENOS, FRAGMENTOS DE AUTOANTIGENOS, O MEDICAMENTOS DE ESTRUCTURA ANALOGA RELACIONADOS ESTRUCTURALMENTE A ESTOS AUTOANTIGENOS, QUE SON ESPECIFICOS PARA LA ENFERMEDAD AUTOINMUNE PARTICULAR. EL PROCESO DESCRITO EN LA INVENCION INCLUYE AMBAS MEDIDAS PROFILACTICAS Y TERAPEUTICAS.
Description
Tratamiento de enfermedades autoinmunes por
administración oral de autoantígenos.
La presente invención se refiere al sector de
tratamiento de enfermedades autoinmunes y, en particular, de
enfermedades autoinmunes mediadas por células T o dependientes de
células T. Específicamente, la presente invención prevé la
administración de autoantígenos o fragmentos o análogos de los
mismos, para el tratamiento profiláctico y terapéutico de dichas
enfermedades autoinmunes.
Las enfermedades autoinmunes son provocadas por
una respuesta inmune anormal con respecto a células o anticuerpos
dirigidos contra tejidos normales. Se ha desarrollado una serie de
estrategias para suprimir enfermedades autoinmunes, la mayor parte
mediante medicamentos que suprimen de manera no específica la
respuesta inmune. Un método para inducir tolerancia inmunológica
por administración oral de un antígeno para prevenir respuestas
autoinmunes ha sido demostrado, en primer lugar, por Wells in 1911:
Wells, H., J. Infect. Dis. 9:147 (1911). La inducción oral
de falta de reacción ha sido demostrada para varios antígenos que
dependen de células T. Ngan, J. y otros, J. Immunol. 120:861
(1978), Gautam, S. y otros, J. Immunol. 135:2975 (1985),
Titus, R. y otros, Int. Arch. Allergy Appl. Immun. 65:323
(1981). Se ha demostrado recientemente que la tolerancia inmune
periférica activada por antígenos por la ruta oral sirve como
enfoque terapéutico inmunorregulador eficaz en varias enfermedades
autoinmunes experimentales (Higgins, P.J., y otros, J. Immunol.
140:440 (1988); Lider, O., y otros, J. Immunol.
142:748-752 (1989); Bitar, D.M., y otros,
Cell. Immunol. 112:364 (1988); Nussenblatt, R.B., y otros,
J. Immunol. 144:1689 (1990); Nagler-Anderson,
C., y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:7443-7446 (1986); Thompson, H.S.G., y otros,
Clin. Exp. Immunol. 64:581-586 (1986)).
Los científicos han estudiado también formas de
suprimir enfermedades autoinmunes en varios modelos de animales. La
encefalomielitis alérgica experimental (EAE) es una enfermedad
autoinmune mediada por células T, dirigida contra la proteína
básica de la mielina (MBP) y ha sido estudiada como modelo para
esclerosis múltiple en diferentes especies de mamíferos. Ver,
Alvord, E. y otros, Experimental Allergic
Encephalomyelitis-A Useful Model For Multiple
Sclerosis (Allan R. Liss, Nueva York, 1984). La
inmunorregulación de EAE es sabido que por lo menos es parcialmente
dependiente de células T supresoras (Ts). Se ha demostrado que las
células Ts se encuentran presentes en ratas que se han recuperado
de EAE. Swierkosz, J. y otros, J. Immunol. 119:1501
(1977). Además, se ha demostrado que las células T supresoras son
responsables de la falta de reacción ante EAE exhibida por algunas
cepas de ratones. Lando, Z. y otras, Nature 287:551
(1980).
Se han utilizado diferente métodos para inducir
supresión específica de antígenos de EAE. Por ejemplo, inmunización
con MBP emulsionado en adyuvante incompleto de Freund, tal como ha
sido demostrado por Lando, Z. y otros, J. Immunol. 126:1526
(1981), y se ha utilizado inyección intravenosa de células linfoides
conjugadas de MBP, tal como se ha demostrado por Sriram, S. y
otros, Cell. Immunol. 75:378 (1983).
Tres documentos de Alvord y otros se han reseñado
en Annals of Neurology en Vol. 6 en páginas
461-468, 468-473, y
474-482, respectivamente (1979). El primero y
segundo de estos documentos dan a conocer la supresión de EAE en
monos por administración parenteral de MBP, solamente cuando se
administra conjuntamente con un factor aditivo no específico, por
ejemplo, un antibiótico o un esteroide. El tercer informe da a
conocer la presencia en fluido cerebroespinal de pacientes con
esclerosis múltiple de varias proteasas que degradan la MBP a
fragmentos de péptidos antigénicamente activos.
Documentos de Traugott y otros, J.
Neurological Science 56:65-73 (1982), y Raine y
otros, Lab. Investigation 48:275-84 (1983)
dan a conocer que el tratamiento de una cepa de cobayas afectadas de
relapso crónico de EAE, mediante MBP administrada parenteralmente,
sola o con adyuvante de Freund incompleto (IFA) o en combinación
con un hapteno lípido de mielina, en especial, galactocerebrósida,
suprimía los síntomas clínicos de EAE.
Además, McKenna y otros, Cell. Immun.
81:391-402 (1983), dan a conocer que la preinyección
de ratas con MBP de cobaya acoplada a leucocitos de bazo singénico
o células rojas singénicas suprimía la inducción subsiguiente de
EAE utilizando MBP de cobayas en adyuvante completo de Freund. El
grado de supresión se correlacionaba positivamente con la cantidad
de MBP administrada.
Un informe de Strejan y otros, Cell. Immun.
84:171-184 (1984), da a conocer que la
preinyección de ratas con MBP de cobaya encapsulada con liposomas
de fosfatidilserina suprimía los signos y síntomas clínicos de EAE
que aparecen en razas inyectadas con MBP de cobaya en adyuvante
completo de Freund.
Otro documento de McKenna y otros, Cell.
Immun. 88:251-259 (1984), da conocer que los
efectos supresivos de los complejos de leucocitos de MBP de guinea
inyectados, que se dieron a conocer en su informe de 1983, quedaron
suprimidos cuando los animales fueron pretratados con
ciclofosfamida, medicamento que inhibe la producción de T linfocitos
supresores.
Un informe de Krasner y otros, Neurology
36:92-94 (1986) da a conocer que el copolímero C
I sintético, que se está probando como tratamiento para esclerosis
múltiple porque protege animales contra EAE, no muestra reactividad
inmunológica cruzada con MBP.
Además, Belik y otros, Vopr. Med. Khim.
24:372-377 (1978), da a conocer la
administración parenteral de "fragmentos de proteína de mielina
alcalina" y "péptidos encefalitogénicos sintéticos" a
cobayas con EAE. Los animales se recuperaron después de la
administración de "fragmentos de proteínas de mielina alcalina"
a los animales sensibilizados por "fragmentos de proteína de
mielina alcalina" o "péptidos encefalitogénicos
sintéticos".
Otros estudios previos en EAE y EAU demostraron
que la dosificación creciente de MBP o S-Ag se
asociaban con una mejor protección contra la enfermedad (Higgins,
P.J., y otros, J. Immunol. 140:440 (1988); Nussenblatt,
R.B., y otros, J. Immunol 144:1689 (1990) y, en general, los
investigadores han informado una mejora de la tolerancia oral
mediante la alimentación de cantidades mayores de antígeno (Mowat,
A.M. Immunol. Today 8:93 (1987)).
Un informe ha sugerido que el EAE puede ser
suprimido por transferencia adoptiva de células CD8^{+} T de
animales tolerizados oralmente (Lider, O., y otros, J. Immunol.
142:748-752 (1989)).
No obstante, no se conoce, en esta técnica, el
tratamiento satisfactorio de EAE después de que EAE se haya
manifestado por sí misma en el animal afectado. Asimismo, tampoco se
conoce en esta técnica el tratar satisfactoriamente esclerosis
múltiple después de que la esclerosis múltiple se manifiesta en el
paciente. Por lo tanto, existe necesidad de encontrar un método
para la supresión y tratamiento de esclerosis múltiple.
La artritis adyuvante (AA) es un modelo
experimental de enfermedades inflamatorias de las articulaciones, y
especialmente un modelo de artritis reumatoide. La artritis
adyuvante es inducida por inyección intradérmica de una suspensión
de Mycobacterium tuberculosis (MT) en aceite (Pearson, C.M.,
J. Chronic Dis. 16:863-874 (1963)). Entre 10
y 15 días después de la inyección, los animales desarrollan una
fuerte artritis progresiva.
Dado su parecido con la artritis reumatoide
humana, tanto en características clínicas como histopatológicas
(Jasin, H.E., Federation Proc. 32:147 (1972)), la AA ha sido
utilizada como modelo para investigar mecanismos de enfermedades de
las articulaciones inmunomediadas y para investigar métodos para el
tratamiento de una enfermedad autoinmune específica de órgano.
La artritis adyuvante es una enfermedad
autoinmune mediada por células y puede ser transferida por
poblaciones de células o por clones de células T específicas para
MT (Taurog, J.D. y otros, Cell. Immunol. 75:271 (1983);
Taurog, J.D. y otros, Cell. Immunol. 80:198 (1983); Cohen,
L.R. y otros, Arthritis and Rhem. 28:841 (1985)). Se ha
sugerido en ciertos estudios que el autoantígeno primario en la
artritis adyuvante es una proteína micobacteriana de choque térmico
de 65-kd (HSP) (van Eden, W. y otros, Nature
331:171 (1988)). Esta proteína parece ser también importante en la
artritis de la pared celular por estreptococos (DeJoy, S.Q. y otros,
J. Exp. Med. 170:369 (1989); van den Broek, M. y otros, J.
Exp. Med. 170:449 (1989)). Se ha demostrado que existe inmunidad al
colágeno de tipo II en artritis adyuvante (Trentham, D.E. y otros,
J.Clin. Invest. 66:1109 (1980)).
La tolerización después de administración oral e
intravenosa de colágeno se ha demostrado que suprime otro tipo de
artritis denominada artritis inducida por colágeno (CIA). La
supresión de CIA en ratones DBA por colágenos de tipo II
administrados oralmente (CII) depende de la dosis con supresión
observada cuando se administró 0,5 mg, pero no 3 mg, 8 veces
durante un período de dos semanas (Nagler-Anderson,
C. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:7443-7446 (1986)). Se informaron de
resultados similares para CIA en ratones con mayor protección
cuando se administró CII a 2,5 \mug/g que con 25 \mug/g
(Thompson, H.S.G., y otros, Clin. Exp. Immunol.
64:581-586 (1986)). En términos de tolerización
i.v., se administró 1 mg para suprimir CIA en ratones DBA (Myers,
L.K. y otros, J. Exp. Med. 170:1999 (1989)).
La transferencia adoptiva de protección para
artritis CIA ha sido informada para animales tratados por vía
intravenosa con CII (Myers, L.K., y otros, J. Immunol.
143:3976 (1989)) pero no para tolerización oral
(Nagler-Anderson, C., y otros, Proc. Natl. Acad.
Sci.USA 83:7443-7446 (1986); Thompson, H.S.G., y
otros, Clin.Exp. Immunol. 64:581-586
(1986)).
No obstante, no se conocía anteriormente que la
administración oral de CII suprime AA, el modelo animal para
artritis reumatoide humana, y que esta supresión puede ser
transferida adoptivamente por células T del bazo de animales
alimentados con CII.
Por lo tanto, existe la necesidad del tratamiento
de enfermedades autoinmunes, y especialmente para el tratamiento de
enfermedades autoinmunes mediadas por células T o dependientes de
células T.
La presente invención, tal como se ha definido en
las reivindicaciones adjuntas, proporciona métodos para el
tratamiento de una enfermedad autoinmune mediada por células T o
dependiente de células T en un sujeto que necesita dicho
tratamiento, comprendiendo la administración oral de autoantígenos,
fragmentos de autoantígenos o análogos relacionados
estructuralmente con autoantígenos específicos para la enfermedad
autoinmune particular, a dicho sujeto, en una cantidad efectiva
para tratar la enfermedad autoinmune.
Tanto los efectos clínicos como histológicos de
dichas enfermedades autoinmunes se suprimen de manera dependiente a
la dosis por los métodos de la invención. Además, dicha supresión
tiene lugar tanto si la administración de autoantígenos tiene lugar
antes o después de la declaración de la enfermedad autoinmune.
De acuerdo con los métodos de la invención, las
enfermedades autoinmunes dependientes de células T son también
suprimidas por administración oral de fragmentos que no inducen
enfermedad y que inducen enfermedad del autoantígeno. La
administración oral de autoantígenos representa, por lo tanto, un
método eficaz y simple por el cual una enfermedad autoinmune puede
ser inmunorregulada de forma natural.
En un aspecto adicional de la invención, se dan a
conocer métodos para el tratamiento y supresión de la artritis
reumatoide, cuyos métodos prevén la administración entérica de
colágeno de tipo II (CII) a un sujeto que necesita dicho
tratamiento, siendo útiles dichos métodos antes o después de la
declaración de la enfermedad autoinmune.
Figura 1: especificidad de antígeno de la
supresión inducida oralmente de respuesta proliferativa en ratas
Lewis. Se administraron a los animales fed 500 \mug de MBP o BSA
en los días -7, -5 y -2, y a continuación se les inmunizó con 100
\mug MBP en CFA en el día 0. Nueve días después de la
inmunización, se retiraron nodos del linfa y se determinó la
respuesta proliferativa a MBP, BSA y PPD (todos a 50 \mug/ml), tal
como se describe en el Ejemplo 3. Índice de estimulación = cpm
experimental/cpm de control.
Figura 2: supresión inducida oralmente de
artritis adyuvante, medida por hinchado de las articulaciones.
Figura 3: protocolo para la inducción de EAE
murina relapsante.
Figura 4: supresión inducida oralmente de
proliferación de células linfoides en ratones SJL. Se administraron
a los animales 400 \mug de MBP 7 veces a lo largo de un período de
dos semanas y se inmunizaron con 400 \mug MBP en CFA (0,6 mg/ml
M. tuberculosis). El índice de estimulación es la
proliferación inducida por MBP dividida por el fondo.
Figura 5: supresión específica de antígenos de
respuestas a células de nodos linfáticos de drenaje poplíteo (PLNC)
por células de nodos linfáticos mesentéricos y de bazo (LNC)
obtenidos de ratas alimentadas con proteína básica de mielina
(MBP). Los resultados se expresan en forma de porcentaje de
supresión de PLNC a MBP (círculos) como Mycobacterium
tuberculosis (cuadrados). Los círculos cerrados o cuadrados
cerrados representan la respuesta de células del bazo. Los círculos
abiertos o los cuadrados abiertos representan la respuesta de
células de nodos linfáticos mesentéricos.
Figura 6: supresión específica de respuestas IgG
a MBP después de alimentación oral de MBP. Las ratas fueron
sangradas a intervalos y los sueros fueron examinados para
anticuerpos anti-OVA (figura 6A, círculos abiertos)
o anti-MBP (figura 6B, cuadrados abiertos). Estos
sueros fueron comparados con sueros obtenidos a partir de animales
sin administración y ataque (símbolos cerrados). Los resultados se
expresan como ELISA 0.D. 492 niveles \pm desviación estándar.
Figura 7: se administró a ratas Lewis MT (A) o
CII (B), en los días -7, -5 y -2. A continuación, los animales
fueron inyectados por vía intradérmica con CFA que contenía 10 mg/ml
de MT en la base de la cola en el día 0 para inducción de AA.
Empezando en el día 13, se examinaron los animales en cuanto a
signos clínicos de AA y se calificaron individualmente, la
"evaluación de la artritis" refleja la evaluación promedio de
la artritis (suma de las cuatro patas) de 5-10
ratas individuales de cada grupo para cada momento de tiempo.
Figura 8: se administró a ratas Lewis tampón solo
(control), o dosis variables de CII tal como se ha indicado, en los
días -7, -5 y -2. A continuación, los animales fueron inmunizados
por vía intradérmica con CFA conteniendo 10 mg/ml de MT en la base
de la cola. Un mes más tarde, los animales fueron atacados con 20
\mug CII (A), o 10 \mug MT (B). El grosor de la oreja fue
medido antes y 48 horas después de la inyección. P valores de
comparación de animales con administración con respecto a animales
de control. ns = no significativo.
Figura 9: se administraron ratas Lewis con
diferentes dosificaciones de MT en los días -7, -5 y -2 y se
inmunizaron en el día 0 con 0,1 ml de CFA en la base de la cola.
Los nodos de linfa drenantes fueron recogidos 9 días más tarde y se
midieron las respuestas proliferativas.
Figura 10: se indujo artritis en ratas Lewis por
inyección intradérmica de CFA conteniendo 10 mg/ml de MT. Los
signos iniciales de artritis aparecieron 13-14 días
después de la inducción de la enfermedad. En el día 17, los
animales fueron separados en dos grupos con gravedad correspondiente
de la enfermedad. El grupo de control permaneció sin tratamiento,
mientras que el grupo tratado recibió 3 \mug de CII por vía oral
tres veces por semana, uno de cada dos días. Los animales de ambos
grupos fueron evaluados en cuanto a artritis hasta el día 34. Los
datos se expresan como calificación media de artritis \pm error
estándar.
En la descripción siguiente, se utilizan una
serie de términos usados en inmunología. A efectos de proporcionar
una comprensión clara y ordenada de la descripción y
reivindicaciones, incluyendo el ámbito que tienen que recibir dichos
términos, se facilitan las siguientes definiciones.
Enfermedad autoinmune. Una enfermedad
autoinmune es un funcionamiento defectuoso del sistema inmune del
animal, incluyendo humanos, en el que el sistema inmune falla en la
distinción entre substancias extrañas dentro del cuerpo del animal
y substancias que son parte de la propia composición normal del
animal.
Autoantígeno. Un "autoantígeno" es
cualquier substancia que se encuentra normalmente en el cuerpo de un
animal que, en una situación anormal, tal como una enfermedad
autoinmune, no es ya reconocida como parte del propio animal por
los linfocitos o anticuerpos del animal, y que, por lo tanto, es
atacada por el sistema inmunorregulatorio como si fuera una
substancia extraña.
Fragmentos biológicamente activos. Los
"fragmento(s) biológicamente activo(s)" de un
antígeno incluyen cualquier secuencia de aminoácido parcial de un
autoantígeno que es capaz de inducir la misma respuesta biológica
que el autoantígeno de longitud completa, es decir, la capacidad de
suprimir o eliminar respuesta autoinmune mediada por células T o
dependiente de células T, cuando tiene lugar la introducción
oral.
Análogo. El término
"análogo(s)" de un autoantígeno incluye compuestos que
están relacionados estructuralmente al autoantígeno, de forma tal
que poseen la misma actividad biológica que el autoantígeno, es
decir, la capacidad de eliminar o suprimir igual o equivalente
respuesta autoinmune mediada por células T o dependiente de células
T, cuando tiene lugar la administración del autoantígeno. El término
incluye secuencias de aminoácido que difieren de la secuencia de
aminoácido del autoantígeno, en uno o varios aminoácidos
(reteniendo, no obstante, substancialmente actividad biológica
equivalente del autoantígeno) así como compuestos químicos que
imitan la actividad biológica de los autoantígenos en su capacidad
de suprimir o aliviar los síntomas de la enfermedad. Estos
compuestos pueden consistir en tejidos de un órgano objetivo o diana
que es el lugar en una enfermedad autoinmune.
Animal. El término "animal" cubre
todas las formas de vida que tienen un sistema inmunorregulador y
que, por lo tanto, son susceptibles de enfermedades autoinmunes,
incluyendo los humanos.
Tratamiento. El término "tratamiento"
está destinado a incluir tanto las medidas profilácticas para
impedir dichas enfermedades autoinmunes, como también la supresión
o alivio de síntomas después del inicio de dichas enfermedades
autoinmunes.
Administración. Por el término
"introducción" o "administración" de un autoantígeno a un
sujeto que necesita tratamiento con dicho autoantígeno se desea
proporcionar el autoantígeno o sus fragmentos biológicamente
activos, o análogos biológicamente activos, a dicho sujeto de
manera que retiene la efectividad terapéutica de dicho autoantígeno
durante un período de tiempo suficiente para proporcionar un efecto
beneficioso deseado a dicho sujeto. En una realización preferente,
el autoantígeno es introducido en el estómago de dicho sujeto a
través de la boca. No obstante, por el término "oral", los
solicitantes no intentan limitar la administración a la
proporcionada oralmente ("per os") y desean incluir
cualquier administración que proporcione dichos autoantígenos al
estómago o tubo digestivo del
sujeto.
sujeto.
Colágeno de Tipo II. El colágeno de tipo
II ("CII") es el tipo de colágeno que se encuentra, entre
otros, en cartílagos, discos intervertebrales y cuerpo vítreo. El
colágeno de tipo II contiene tres cadenas \alpha1(II)
[\alpha1(II)]_{3}.
Tal como es conocido en esta técnica, el colágeno
es una familia de proteínas fibrosas que han sido clasificadas en
una serie de distintos tipos estructuralmente y genéticamente
(Stryer, L. Biochemistry, 2ª Edición, W.H. Freeman &
Co., 1981, páginas 184-199). El colágeno de tipo I
es la forma más prevalente y se encuentra, entre otros, en la piel,
tendones, córnea y huesos, y consiste en dos subunidades de colágeno
\alpha1(I) y una subunidad de una secuencia distinta
designada \alpha2. Otros tipos de colágenos, que incluyen el
colágeno de tipo II, tienen tres subunidades idénticas o cadenas,
cada una de las cuales consiste en unos 1.000 aminoácidos. El
colágeno de tipo III se encuentra, entre otros, en los vasos
sanguíneos, sistema cardiovascular y piel fetal, y contiene tres
cadenas \alpha1(III) ([\alpha1(III)]_{3}). El
colágeno de tipo IV está localizado, entre otros, en membranas de
base y contiene tres cadenas \alpha1(IV)
([\alpha1(V)]_{3}).
La presente invención se refiere al tratamiento
de enfermedades autoinmunes mediadas por células T o dependientes
de células T, por la administración oral de autoantígenos
específicos para dichas enfermedades autoinmunes, así como
fragmentos biológicamente activos de los autoantígenos y análogos de
los mismos.
El uso principal de la invención es el de tratar
una amplia categoría de enfermedades, antes y/o después del inicio
de las mismas, siendo designadas colectivamente dichas enfermedades
como enfermedades autoinmunes, incluyendo sin que ello sirva de
limitación esclerosis múltiple, miastenia gravis, artritis
reumatoide, diabetes mellitus y, especialmente, diabetes mellitus
juvenil, lupus eritematosus sistémico, tiroiditis autoinmune,
anemia hemolítica autoinmune, y enfermedad de sensibilidad de
contacto, que puede ser, por ejemplo, provocada por plantas, tal
como hiedra venenosa (zumaque).
Por lo tanto, de acuerdo con los métodos de la
invención, la respuesta autoinmune que se encuentra en la base de
la artritis reumatoide puede ser tratada por la administración de
partes biológicamente activas de CII.
La presente invención se basa inicialmente en el
descubrimiento y confirmación de que la administración oral o
entérica de MBP es un medio efectivo para la supresión de EAE
monofásica crónica y aguda. En una realización muy preferente, esta
administración es por vía bucal. La supresión de EAE por la
administración entérica de MBP después de la manifestación de la
enfermedad es inesperada.
La presente invención se basa además en el
descubrimiento de que la administración entérica de colágeno de
tipo II es una forma efectiva de suprimir artritis adyuvante. La
supresión de artritis adyuvante por el colágeno de tipo II es
especialmente sorprendente porque el colágeno de tipo II es
inesperadamente mucho más eficaz en la supresión de artritis
adyuvante que el MT. En una realización preferente, dicha
administración tiene lugar por vía oral.
La tolerancia inducida entéricamente tanto en
artritis EAE como artritis adyuvante depende de la dosis, y tanto
los síntomas clínicos como histológicos de la enfermedad se reducen
en cuanto a gravedad. Dado que, por ejemplo, la administración oral
de un antígeno irrelevante, tal como suero albúmina bovina (BSA) u
otro autoantígeno tal como colágeno o antígeno "S" (el
autoantígeno involucrado con uveítis autoinmune experimental), no
tiene efecto en la susceptibilidad a EAE, se puede afirmar que la
tolerancia a EAE inducida por vía oral es específica para MBP, el
antígeno al que se sensibilizan las células T que median la
enfermedad.
Además, la administración oral de MBP a ratas
induce la supresión de respuestas inmunes a MBP. Por ejemplo, la
proliferación de células linfoides y la producción de anticuerpos
anti-MBP disminuyen en ambos casos. Las células
responsables para la supresión de la enfermedad y la supresión de
respuestas celulares específicas de antígeno in vitro son de
origen en células T, y son linfocitos T supresores/citotóxicos
CD8+.
Por lo tanto, tal como se demuestra más adelante,
utilizando el modelo de EAE animal para esclerosis múltiple y
utilizando el modelo animal para AA, el simple método de
administración de autoantígenos tales como MBP o CII
respectivamente, tal como se prevé en la invención, es un
tratamiento eficaz para suprimir el desarrollo de enfermedad
autoinmune específica, ciertas respuestas inmunes a los
autoantígenos, y el avance de la enfermedad después de que dicha
enfermedad se ha manifestado en un sujeto.
En general, el autoantígeno, fragmento o análogo
es introducido por vía oral en una cantidad comprendida entre uno y
1000 mg por día, y se puede administrar en forma de dosis única o en
forma de dosis múltiples. Preferentemente, el autoantígeno,
fragmento, o análogo es administrado en una cantidad comprendida
entre 25 y 850 mg por día. Tal como se comprenderá por los técnicos
en la materia, la dosificación exacta es función del autoantígeno,
de la edad, sexo y estado físico del paciente, así como otros
tratamientos simultáneos administrados. Estas preparaciones pueden
ser administradas a un animal que necesite tratamiento de dicha
enfermedad autoinmune a efectos de mejorar, suprimir, aliviar,
invertir o reducir la gravedad de la enfermedad. Estos preparados
pueden ser también administrados a un animal predispuesto a
desarrollar dicha enfermedad autoinmune, a efectos de prevenir el
inicio de dicha enfermedad o de reducir la severidad de dicha
enfermedad cuando ésta se presenta.
En el caso de que el autoantígeno, fragmento del
mismo, o análogo, sea introducido oralmente, se puede mezclar con
otras formas de alimentos y se puede consumir en forma sólida,
semi-sólida, de suspensión o de emulsión. Este
autoantígeno puede ser mezclado con sales farmacéuticamente
aceptables, portadores, productos de sabor, y similares.
Un autoantígeno puede ser administrado en
combinación con cualquier otro autoantígeno apropiado para
administración a un sujeto que requiera dicho autoantígeno. Por
ejemplo, se pueden utilizar colágenos de tipo II de más de una
fuente de tejido o especie. Los autoantígenos de la presente
invención pueden ser también administrados en combinación con un
portador farmacológicamente apropiado para administración a un
sujeto que requiera dicho autoantígeno. Estos autoantígenos pueden
ser administrados en cualquier forma que produzca efectos
profilácticos, paliativos, preventivos o curativos de una
enfermedad autoinmune en humanos y animales.
Los autoantígenos de la invención pueden ser
utilizados en formas de dosificación tales como tabletas, cápsulas,
producto en polvo o soluciones líquidas para administración oral,
siempre que la actividad biológica del autoantígeno no quede
destruida por dicha forma de dosificación.
Las preparaciones de los autoantígenos de la
invención para administración oral incluyen autoantígenos
suministrados en forma de polvo seco, alimentos, disolventes
acuosos o no acuosos, suspensiones o emulsiones. Son ejemplos de
disolventes no acuosos el propilén glicol, polietilén glicol, aceite
vegetal, aceite de pescado y ésteres orgánicos inyectables. Los
portadores de tipo acuoso incluyen agua, soluciones
agua-alcohol, emulsiones o suspensiones, incluyendo
solución salina y vehículos parenterales de tipo médico tamponados,
entre los que se incluyen una solución de cloruro sódico, solución
de dextrosa de Ringer, solución de dextrosa más cloruro sódico,
solución de Ringer que contiene lactosa, o aceites fijados.
En el caso de que el autoantígeno, fragmento o
análogo, sea administrado por vía entérica, puede ser introducido
en forma sólida, semi-sólida, de suspensión o de
emulsión, y se puede combinar con cualquier portador
farmacéuticamente aceptable, incluyendo agua, agentes de suspensión
o agentes emulsificantes.
Los autoantígenos de la invención pueden ser
también administrados por medio de bombas o en forma de liberación
continuada, especialmente cuando se administran como medida
preventiva, a efectos de impedir el desarrollo de enfermedad
autoinmune en un sujeto o cuando se administran para mejorar o
retrasar una enfermedad autoinmune ya declarada.
Los compuestos farmacéuticos que contienen el
autoantígeno de la invención, y que son útiles en los métodos de la
misma, son fabricados según métodos ya conocidos. Por ejemplo, los
autoantígenos pueden ser administrados como compuesto farmacéutico
por medio de mezcla convencional, granulación, grajeado, disolución,
liofilización o procesos similares. Estos compuestos son
utilizables en sí mismos en el control de enfermedades autoinmunes
agudas o crónicas.
Adicionalmente, una versión de baja potencia de
dichos compuestos es utilizable en el tratamiento de alteraciones
autoinmunes de tipo suave, crónico o agudo.
Los autoantígenos que se encuentran
sustancialmente libres de contaminantes naturales pueden ser
aislados y purificados partiendo de sus fuentes naturales o
recombinantes, de acuerdo con condiciones y técnicas convencionales
conocidas anteriormente en la técnica y utilizadas para aislar
dichas proteínas, tales como extracción, precipitación,
cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis, o
similares.
Un técnico en la materia puede identificar los
campos antigénicos de un autoantígeno, utilizando técnicas
conocidas en el sector, sin experimentación indebida, y estos
dominios son preferentes en los métodos de la invención. Por
ejemplo, se pueden preparar derivados de los autoantígenos
originales o derivados de autoantígenos producidos de forma
recombinante, por fraccionamiento proteolítico de una proteína de
longitud completa con proteasas comunes, tales como, por ejemplo,
tripsina, quimotripsina y subtilisina. La cromatografía de afinidad
con resinas actin-derivatizadas se puede utilizar
para ensayo de dichos fragmentos en cuanto a su capacidad de
supresión de la enfermedad autoinmune.
Cuando se desea la identificación de compuestos o
fragmentos de los mismos que poseen actividad de supresión de la
enfermedad autoinmune, dichos compuestos o fragmentos pueden ser
también identificados utilizando técnicas conocidas.
Además, estos fragmentos pueden ser identificados
por su homología con respecto a otros dominios autoantigénicos
conocidos, en los que se puede hacer la predicción de que la función
seguirá la homología.
Por ejemplo, los autoantígenos útiles de los
métodos de la invención pueden ser identificados por la capacidad
de dichos autoantígenos en suprimir la enfermedad autoinmune
inducida por antiantígenos, en el momento de la administración de
dicho autoantígeno a un sujeto afectado con la enfermedad autoinmune
o predispuesto a la misma. En los métodos de la invención, la
enfermedad autoinmune puede ser suprimida por la mencionada
administración de autoantígenos, antes o después de la aparición de
síntomas de enfermedad.
Una vez descrita la invención de manera general,
los siguientes ejemplos describirán adicionalmente los materiales y
métodos utilizados en llevar a cabo la invención. Los ejemplos no
están destinados a limitar la invención en modo alguno.
Animales: ratas hembra Lewis o Wistar
Furth con pesos de 150 a 220 g (6-8 semanas de edad)
se obtuvieron del Charles River Laboratory, Wilmington, MA, o de
Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, IN, y se utilizaron en
todos los experimentos.
Inmunización de animales: se inmunizaron
ratas en ambas patas traseras con 50 \mug de MBP de cobaya,
emulsificado en adyuvante de Freund completo (CFA). En algunos
experimentos, se añadieron 50 \mug de ovalbúmina (OVA) (Sigma) a
los antígenos emulsionados y se inyectó de manera similar. El EAE se
caracterizó por parálisis de extremidades y se calificó del modo
siguiente: 0) si enfermedad; 1) actividad reducida, cola inactiva;
2) parálisis ligera, inestabilidad; 3) paraparesis moderada,
extremidades separadas; y 4) tetraplegia.
Inducción de tolerancia oral: las ratas
recibieron MBP o seroalbúmina bobina (BSA) cinco veces a intervalos
de tres días 1 mg en 1 ml PBS (8 gm NaCl 0,2 gm KCl, 1,44 gm de
Na_{2}HPO_{4}, 0,24 gm de KH_{2}PO_{4} en 1000 ml de
H_{2}O) utilizando una aguja de medida 23 cubierta con un tubo de
plástico.
Ensayo de proliferación: nueve días
después de inmunización, las ratas fueron sacrificadas y sus nodos
de linfa poplíteo fueron retirados. Se preparó una suspensión
celular única presionando los nodos del linfa a través de una malla
de acero inoxidable. Un total de 10^{5} células de nodo linfático
(LNC) fueron cultivadas con el número indicado de LNC irradiadas
(2000 Rads) o intactas, derivadas de ratas que habían recibido
alimentación, por cuadruplicado en placas de 96 pocillos de fondo
redondo (Costar). MBP y Mycobacterium tuberculosis (Mt), 50
\mug/ml se añadieron al cultivo en un volumen de 20 \mul. Los
cultivos fueron incubados durante 80 horas y se sometieron a
impulsos de 1 \muCi[^{3}H]TdR/pocillo durante las
últimas 16 horas de cultivo. Los cultivos fueron recogidos a
continuación en un cultivador automático de células y se sometieron
a lectura en un contador de centelleo líquido estándar.
Se calculó la supresión percentual de LNC (PLNC)
cebadas mediante la fórmula siguiente:
% Supresión =
100 x 1 - \frac{\text{cpm (LNC irradiadas de ratas con
tratamiento + PLNC + antígeno)}}{\text{cpm (LNC irradiadas de ratas
sin tratamiento + PLNC +
antígeno)}}
Medio de proliferación: RPMI (Gibco) fue
utilizado en todos los experimentos. El medio fue filtrado estéril
después de añadir 2 x 10^{-5}M. 2-mercaptoetanol,
1% de pirubato sódico, 1% de penicilina y estreptomicina, 1% de
aminoácidos no esenciales y 1% de suero autólogo.
Purificación de diferentes subconjuntos de
células: para el agotamiento de las poblaciones de CD3, CD4, y
CD8 de células de bazo, se utilizó selección negativa. Se
recubrieron plantillas petri durante una noche a 4ºC con 10 ml de
anticuerpos 1/1000 de cabra antirratón IgG + IgM (Tago) en PBS/BSA.
Las placas fueron lavadas a continuación y dotadas de recubrimiento
con 3% de suero fetal bobino en PBS durante 30 minutos a 20ºC y se
lavó nuevamente. Se sometieron a tinción células LNC de Lewis con
anticuerpos monoclonales antirrata de ratón (Serotec/Bioproducts)
para CD3 (MRC, 0X/38), CD4 (W 3/25), o CD8 (0X/8) diluido en 1/100
en PBS. Las células fueron sometidas a tinción durante 30 minutos
sobre hielo, se lavaron y se sembraron sobre los platillos petri
con prerecubrimiento, 15 millones de células/5 ml PBS/placa, a 4ºC.
El sobrenadante conteniendo células no adherentes fue aspirado
suavemente 60 minutos más tarde y centrifugado dos veces antes del
examen y contaje de las células. Este protocolo facilita
poblaciones de células con una pureza aproximada de
85-95%, examinadas en el clasificador de células
activado por fluorescencia al examinar la inmunofluorescencia de la
membrana.
Experimentos de transferencia adoptiva:
ratas donantes fueron alimentadas con MBP o BSA, 1 mg x 5 veces, con
un intervalo de 3-4 días y se sacrificaron 4 días
después de la administración final. Se recogieron células LNC
mesentéricas y células de bazo, y se inyectaron por vía
intraperitoneal de forma inmediata o después de activación con
concavalina-A (Con-A), 1,5
\mug/ml, en medios de proliferación durante 48 horas. El número
de células inyectadas para experimentos de transferencia adoptiva
fueron las siguientes: 120 x 10^{6} para la población completa de
LNC, activada o no; 60 x 10^{6} para LNC agotadas de CD3; 80 x
10^{6} para la población agotada de CD4; y 95 x 10^{6} para LNC
agotadas de CD8. Las ratas Lewis receptoras fueron inmunizadas con
BP/CFA 4 horas más tarde para la inducción de EAE.
Niveles de suero de anticuerpos: se
utilizó un ensayo inmunoabsorbente (ELISA) de fase sólida, enlazado
con encimas, para determinación de concentraciones de anticuerpos
contra MBP y OVA. Se incubaron placas de microtitulación con 0,1 ml
por pocillo de 10 \mug de antígeno/ml en agua destilada doble. Se
incubaron placas durante 18 horas a 25ºC. Después de 3 lavados con
PBS/tween-20 (Bio-Rad), pH 7,5, las
placas fueron incubadas con 3% BSA/PBS durante 2 horas a 37ºC, se
lavaron dos veces y se añadió por cuadruplicado 100 \mul de suero
diluido. Las placas fueron incubadas durante 2 horas a 37ºC.
Después de tres lavados con PBS/tween-20, se
incubaron placas con 100 \mul/pocillo de anticuerpo IgG antirrata
de cabra conjugado de peroxidasa (Tago, USA), diluido 1:1000 en 1%
BSA/PBS durante 1 hora a 25ºC. Se obtuvo reacción de color por
exposición a D-fenilenediamina (0,4 mg/ml fosfato)
tampón citrato, pH 5,0) conteniendo 30% H_{2}O_{2}. La reacción
fue interrumpida por añadidura de 0,4N H_{2}SO_{4} y OD 492 nm
y fue leída en un lector ELISA.
Medición in vitro de producción de
anticuerpos: se obtuvieron células LCN poplíteas y esplénicas de
ratas tratadas, en estado natural y atacadas, y fueron sembradas a
una concentración de 10^{7} células por ml de platillo petri
solas o irradiadas (2000 Rads) junto con otras células PLNC, tal
como se ha indicado. Los cultivos fueron mantenidos en medios de
proliferación, con o sin antígeno (20 \mug/ml), durante 3 días en
un incubador, y a continuación se recogieron. Los sobrenadantes
diluidos fueron utilizados para examinar la producción in
vitro y secreción de anticuerpo IgG, y se sometieron a medición
en cuanto a producción de anticuerpos utilizando una prueba ELISA,
como se ha descrito anteriormente.
Identificación de diferentes regiones de la
molécula de proteína básica de mielina, responsable de la supresión
de EAE: se sintetizaron fragmentos solapados de la región
1-37 de la proteína base de mielina de cobaya,
utilizando técnica de péptido de fase sólida. Houghten, R.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:5131-5135 (1985). Estos fragmentos fueron
administrados a continuación por vía oral en concentraciones
equimolares a 15 mg de proteína básica de mielina completa. Se
administraron en los días -7, -5 y -2 antes de la inmunización. Los
animales fueron atacados a continuación con proteína básica en
adyuvante de Freund, de acuerdo con procedimientos establecidos, y
se sometieron a evaluación.
Demostración de que la ruta oral de
administración de antígeno de proteína determina el fragmento en el
que existe respuesta inmune: los animales recibieron proteína
básica de mielina completa, inmunizada en la pata con adyuvante de
Freund o por administración oral. De siete a 10 días posteriormente
se retiraron células de nodo de linfa y de bazo y se reestimularon
in vitro con diferentes fragmentos de la molécula de proteína
básica de mielina.
Colágenos y adyuvante: se obtuvo colágeno
de tipo II de pollo en forma soluble de la firma Genzyme
Corporation, Boston, MA. Se compró colágeno de tipo III bovino de
la firma Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL,
mientras que el colágeno de tipo I fue un regalo del Dr. D.
Trentham, Beth: Israel Hospital, Boston, MA. Mycobacterium
tuberculosis y adyuvante incompleto de Freund (IFA) fueron
adquiridos de Difco Laboratories, Detroit, Ml. Se preparó adyuvante
de Freund completo (CFA) mezclando IFA y MT molido hasta polvo
fino.
Protocolo de administración oral: se
administraron oralmente antígenos en un volumen de 1 ml con
intermedio de una jeringa dotada de una aguja con punta de bola
(18G) tres veces (en los días -7, -5 y -2) antes de la inducción de
la enfermedad. Se disolvieron colágenos en fosfato potásico tampón
(pH 7,6), mientras que se suspendió MT en suspensión salina con
tampón fosfato (PBS) para las administraciones.
Inducción de artritis: Se indujo artritis
adyuvante en animales por inyección intradérmica en la base de la
cola con 0,1 ml de CFA conteniendo 10 mg/ml de M.
tuberculosis.
Evaluación de artritis: la incidencia de
artritis fue definida como el número de ratas que tenían evidencia
clínica de artritis dentro de 35 días después de la inducción de la
enfermedad. La severidad de la artritis fue evaluada de acuerdo con
metodología estándar(Trentham, D.E. y otros, J. Exp. Med.
146:857 (1977)). Cada una de las cuatro garras fue evaluada del
modo siguiente: 0 = normal, 1 = sólo enrojecimiento, 2 =
enrojecimiento más hinchamiento ligero, 3 = hinchamiento fuerte, 4
= deformidad de la articulación. La evaluación de artritis para
cada animal fue la suma de la valoración para cada una de las cuatro
garras. La valoración máxima de artritis fue la valoración máxima
de un animal individual durante la totalidad de la enfermedad. Todas
las evaluaciones fueron llevadas a cabo de forma ciega sin
conocimiento del grupo de tratamiento.
Ensayo de proliferación de linfocitos: se
cebaron ratas con 0,1 ml de CFA conteniendo 1 mg/ml de MT en la
base de la cola. Nueve días más tarde, se retiraron los nodos de
linfa drenantes y se prepararon suspensiones de células
individuales. Después de dos lavados, las células fueron
resuspendidas en RPMI 1640 conteniendo 1% de glutamina, 1% de
penicilina/estreptomicina, 1% de aminoácidos no esenciales, 5% de
suero fetal de vaca y 5 x 10^{-5} M
2-mercaptoetanol. Las células fueron luego sembradas
en una placa de 96 pocillos de fondo plano por cuadruplicado a una
concentración de 2,5 x 10^{5} células/pocillo y fueron cultivadas
con diferentes concentraciones de MT a 37ºC con 5% de CO_{2}
durante 72 horas. A continuación, se añadió timidina tritiada al
cultivo a 1 \muCi/pocillo. Las células fueron cosechadas 6
horas más tarde después de la pulsación y se determinó la
proliferación mediante incorporación de timidina tritiada con
medición mediante contaje de centelleo líquido.
Respuestas de hipersensibilidad de tipo
retardado (DTH): se midieron respuestas DTH 30 días después de
la inmunización. Las ratas fueron inyectadas por vía subcutánea en
ambas orejas con 10 \mug de MT o 20 \mug CII en 50 \mul PBS.
El hinchamiento de las orejas consistió en la diferencia de grosor
de la oreja medido antes y 48 horas después de la inyección
utilizando una galga micrométrica. Las respuestas de DTH fueron
llevadas a cabo también en animales inmunizados y animales
alimentados con CII solamente.
Transferencia adoptiva de supresión: se
alimentaron ratas donantes tres veces con 3 \mug de CII a
intervalos de 2-3 días. Sus bazos fueron retirados
7 días después de la última alimentación y se preparó una suspensión
de células única. Después de lisis de las células rojas con
tris-NH_{4}Cl, ph 7.26, los esplenocitos fueron
lavados dos veces en solución salina equilibrada de Hank (HBSS). En
algunos experimentos los esplenocitos fueron separados
adicionalmente en poblaciones enriquecidas de células T o B
utilizando columnas de lana de nylon. Se inyectaron
intraperitonealmente 1 x 10^{8} células a cada receptor, que se
inyectaron posteriormente con CFA para inducir artritis al mismo
día o 2 días más tarde. Esplenocitos de ratas normales no tratadas
sirvieron como control.
Se estudió en ratas Lewis el efecto de
administración de MBP y sus fragmentos pépticos sobre la
susceptibilidad y gravedad de EAE monofásico agudo. Los resultados
muestran que esta ruta natural de inducción de tolerancia suprime
tanto el desarrollo de la enfermedad como respuestas inmunes a
MBP.
Para inducir oralmente la supresión de EAE, se
alimentaron ratas Lewis con MBP purificado a partir de cerebro de
cobayas (Diebler, G., y otros, Prep. Biochem.2:139 (1972))
utilizando una jeringa dotada de una aguja de punta de bola 20 G.
Se alimentaron animales de control con cantidades iguales de
albúmina de suero bovino (BSA) o solución salina sola. Se indujo
EAE por inmunización con 50 \mug de MBP emulsionado en adyuvante
de Freund completo (CFA) conteniendo 200 \mug de Mycobacterium
tuberculosis por inyección en las patas traseras. La enfermedad
se caracterizó por parálisis de extremidades e incontinencia,
usualmente entre los días 12 y 15 después de la inmunización y, en
todos los casos, las ratas se recuperaron en el día 16. La primera
serie de experimentos investigó el efecto del número de
administraciones y dosis de MBP en la expresión de la enfermedad.
Se suministraron a las ratas diferentes cantidades de MBP una vez 7
días antes (día -7) del día de inmunización (día 0) o tres veces en
los días -14, -7 y 0. Los resultados (tabla II) demuestran que la
alimentación de MBP a las ratas suprime EAE y que la supresión
inducida oralmente depende de la dosis. Las múltiples
alimentaciones de 500 \mug tuvieron como resultado la supresión
completa de la enfermedad y fueron más efectivas que una
alimentación única a esta dosis. Además de la manifestación clínica
de EAE, se examinaron pruebas histológicas de enfermedad en las
ratas. Dieciséis días después de la inmunización las ratas fueron
sacrificadas y sus cerebros retirados y fijados en solución de
formalina. La solución de fijación era una solución de 100 ml de
etanol al 70%, 10 ml de formalina al 37% y 5 ml de ácido acético
glacial. Se prepararon placas de tejidos embebidos de parafina de
cada rata y se sometieron a tinción con hematoxilina y eosina. Se
cuantificaron focos inflamatorios perivasculares en placas
codificadas por procedimientos establecidos (Sobel, R. y otros,
J.Immunol. 132:2393 (1984)). Tal como se ha mostrado en la
tabla I, la administración a las ratas de 500 \mug de MBP en los
días -14, -7 y 0 provocó una marcada disminución del número de
lesiones inflamatorias en el cerebro. Se observó una disminución
moderada en los animales con administración de 100 \mug y no se
observó reducción significativa de inflamación en ratas alimentadas
con 25 \mug de MBP.
Una segunda serie de experimentos investigó el
efecto de alimentación de MBP antes o después de la inmunización
con MBP para determinar si la eficacia de la supresión inducida
oralmente es afectada por la exposición anterior a antígeno. Para
estos experimentos se alimentaron animales con 500 \mug de MBP
tres veces antes o después de la inducción activa de enfermedad
(inmunización con MBP). Los resultados (tabla II) demuestran que la
expresión clínica de enfermedad es suprimida tanto si los animales
recibieron administración de MBP antes o después de la
sensibilización, siendo el efecto más completo cuando se administró
antígeno antes de la inmunización. No obstante, el examen
histológico reveló una notable reducción de infiltrados
perivasculares en ratas alimentadas con MBP antes o después de la
sensibilización con MBP. También tuvo lugar una supresión superior
al 60% en la enfermedad cuando las ratas recibieron tres
administraciones empezando en los días +5 o +7 después de la
inmunización (no se muestran datos).
Además, se llevaron a cabo experimentos en los
que las ratas recibieron una administración de 100 \mug de MBP
varias veces antes y después de la inmunización con MBP. Tal como se
ha mostrado en la tabla III, la supresión de la enfermedad se
aprecia con alimentaciones individuales antes o después de la
inmunización.
Se examinaron también los efectos de
administración oral de MBP en respuestas celulares y humorales
inmunes a MBP. Se estudiaron las respuestas proliferativas a MBP
después de alimentar ratas con diferentes dosis de MBP y después de
la alimentación en diferentes momentos con respecto a la
inmunización. Diez días después de la inmunización, las ratas
fueron sacrificadas y se prepararon suspensiones de células únicas
de nodos de linfa drenante (poplíteo). Las células fueron
cultivadas en micropocillos durante cuatro días, añadiéndose en las
24 horas finales ^{3}H-timidina. Se añadió un
volumen de 0,2 ml conteniendo 4 x 10^{5} células en RPMI 1640
conteniendo 2% de glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 5 x
10^{-5} M 2-mercapto-etanol y 5%
de suero fetal de vaca a cada micropocillo y se añadió MBP a 50
ug/ml. Los pocillos fueron pulsionados con 1 \muCi de timidina
tritiada, se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio utilizando
un multirrecolector y se contaron utilizando técnicas de centelleo
líquido estándar.
Los resultados (tablas I y II) demuestran que la
alimentación de MBP provoca una disminución pronunciada
(75-92%) de respuestas proliferativas a MBP. La
supresión de proliferación, a diferencia de la supresión de la
enfermedad, tuvo lugar a todas las dosis y regímenes de
alimentación sometidos a prueba, incluyendo la alimentación después
de inmunización. La supresión inducida oralmente de la respuesta
proliferativa a MBP es específica de antígeno, tal como se muestra
en la figura 1. De manera específica, la alimentación de MBP no
suprime la respuesta proliferativa a derivado de proteína
purificado (PPD), un antígeno derivado de M. tuberculosis que
induce una respuesta proliferativa como consecuencia de
inmunización con CFA. La alimentación de un antígeno irrelevante,
BSA, no afecta la respuesta proliferativa a PPD y solamente suprime
de manera ligera la respuesta proliferativa a MBP.
El efecto de alimentación de MBP en la producción
de anticuerpos a MBP fue también examinado. Se inmunizaron ratas
alimentadas con MBP y se retiró sangre por punción cardíaca 16 días
después de la inmunización. Se midieron los niveles de anticuerpo
anti-MBP en el suero por ELISA. Se añadió un volumen
de 0,1 ml de solución de MBP (0,05 mg/ml en PBS) por micropocillo y
se incubó durante 3 h a 37ºC. Los pocillos fueron lavados con PBS
conteniendo 0,05% de Tween (PBST) y se bloquearon durante una noche
a 4ºC con 5% de BSA en PBS, pH 9,0. Después de lavar los pocillos
con PBST, se añadieron sueros de rata diluidos y se incubaron
durante 3 h a temperatura ambiente después de lavado con anticuerpo
secundario PBST (anti-rata de cabra conjugado de
peroxidasa) durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadió sustrato
y la reacción se interrumpió con NaFl 0,1 M. Se leyeron las placas
a 450 nm en un multiescáner Titertek. También se determinó
Abs^{450} para suero de ratas inmunizadas solamente con CFA y se
restó de todos los valores como fondo.
A diferencia de la supresión de respuestas
proliferativas que tuvieron lugar virtualmente en todas las dosis y
regímenes de administración comprobados, la supresión de la
producción de anticuerpos se observó solamente cuando los animales
fueron alimentados con la mayor dosis comprobada (500 \mug) en los
días -14, -7 y 0 (66% de supresión, tabla I). Se debe observar la
falta de supresión en ratas alimentadas con 500 \mug de MBP en
los días -7, -5 y -2 (tabla II) sugiriendo que la secuencia temporal
en la que se alimenta una dosis idéntica de MBP es importante en la
supresión de respuestas de anticuerpos.
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Se llevaron a cabo otros experimentos para
determinar la persistencia de la protección inducida oralmente
contra EAE. Después de la administración en los días -7, -5 y -2 de
500 \mug MBP, las ratas fueron inmunizadas en varios periodos de
tiempo después de la última administración. El EAE quedó
completamente suprimido en ratas hasta cuatro semanas después de la
administración, y durante ocho semanas el 50% de las ratas con
administración de MBP fueron susceptibles nuevamente de enfermedad.
Los resultados se muestran en la Tabla IV, que indica que la
tolerancia a la enfermedad se mantiene durante un mínimo de cuatro
semanas después de la última administración, con susceptibilidad a
la inducción de enfermedad evidente a las ocho semanas después de la
administración.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Es sabido que la región encefalitogénica de MBP
de cobaya en ratas es una secuencia específica de decapéptidos
situada en los residuos 75-84, que por sí misma
puede inducir EAE, mientras que otras regiones de la molécula no
son encefalitogénicas (Hashim, G., Myelin: Chemistry and
Biology, Alan R. Liss, N.Y. (1980)). Además, para otros
antígenos, se ha informado que existen determinantes supresores
distintivos en lugares distintos de determinantes inmunogénicos
(Yowell, R., y otros, Nature 279:70 (1979)). Se investigó,
por lo tanto, si los fragmentos encefalitogénicos y no
encefalitogénicos de MBP podían prevenir EAE por administración
oral. Se generaron fragmentos de MBP de cobaya por digestión de
pepsina limitada y se separaron por cromatografía de columna.
(Whitaker, J., y otros, J. Biol. Chem. 250:9106:(1975)). Los
tres fragmentos distintos fueron administrados a ratas, y a
continuación los animales fueron inmunizados con MBP completo. Se
observó que tanto el fragmento inductor de enfermedad (fragmento
44-89) como los fragmentos no encefalitogénicos
(fragmentos 1-37 y 90-170) de
péptidos suprimieron EAE cuando se alimentaron a ratas, siendo más
eficaces los fragmentos no encefalitogénicos en la supresión de la
enfermedad que el fragmento encefalitogénico (Tabla V). Se sintetizó
un decapéptido (S79) que difiere de la secuencia encefalitogénica
(residuos 75-84) por sustitución de un solo
aminoácido y se ha indicado que induce supresión cuando se inyecta
en ratas con CFA (Kardys, E., y otros, J. Immunol. 127:862
(1981)). Cuando se administró a animales S79
(Ala-Gln-Gly-His-Arg-Pro-Gln-Asp-Glu-Gly)
también se observó que se suprimía EAE (Tabla V). La MBP bovina,
que difiere del MBP de cobayas en varios lugares incluyendo la
secuencia encefalitogénica y no es encefalitogénica en ratas en
dosis que son encefalitogénicas para MBP de cobaya (Holoshitz, J.,
y otros, J. Immunol. 131:2810 (1983)), suprimió
también la enfermedad cuando se administró a animales antes de la
inmunización.
Se indujo artritis adyuvante en ratas Lewis
hembra por inmunización con 0,1 ml de 10 mg/ml de adyuvante de
Freund completo en la base de la cola. Se administró a los animales
2,0 mg de Mycobacteria tuberculosis en una solución salina
con tampón fosfato en los días -7, -5, y -2 antes de la inmunización
en el día 0 e inmunización subsiguiente en los días +7 y +14. Se
cuantificó la artritis midiendo el hinchamiento de las
articulaciones durante 3 semanas después de la inmunización (Tabla
VI y figura 2). Los estudios subsiguientes han indicado que si bien
los resultados mostrados en la figura 2 se obtienen ocasionalmente,
en la mayor parte de casos, la artritis adyuvante no se suprimió al
administrar a los animales Mycobacteria tuberculosis. Por lo
tanto, la capacidad de suprimir la artritis adyuvante con la
administración de Mycobacteria tuberculosis es muy variable.
La razón de esta variabilidad es desconocida.
Un modelo reproducible y practicable de relapso
adoptivo de EAE fue establecido en ratones SJL. El protocolo para
este modelo fue adoptado de Mokhtarian, y otros, Nature
309:356 (1984). Este protocolo está mostrado gráficamente en la
figura 3. De forma breve, los animales donantes son inmunizados con
una emulsión que contiene 400 \mug de MBP y 30 \mug de M.
tuberculosis en CFA. Diez días más tarde, se retiraron nodos de
limfa drenante y se cultivaron con 50 ug/ml de MBP durante cuatro
días, se lavaron extensamente, y se inyectaron 4-6
x 10^{7} células viables por vía intravenosa en animales hembra
receptores. Los animales son evaluados en cuanto a EAE clínico,
utilizando escalas estándar, y se evalúan patológicamente utilizando
análisis histológicos H & E normales (Brown, A., y otros,
Lab. Invest. 45:278 (1981), Lublin, F., y otros, J.
Immunol. 126:819 (1981), y Bernard, C. y otros, Eur. J.
Immunol. 16:655 (1976)). Los animales son controlados durante un
mínimo de 100 días después de transferencia, de manera que se puede
determinar el número de relapsos.
La alimentación de 400 \mug de MBP uno de cada
dos días durante dos semanas (total de siete administraciones
separadas) antes de inmunización con 400 \mug MBP en CFA (0,6
mg/ml M. tuberculosis) suprime la proliferación de células
de nodos de linfa en respuesta a la inmunización de MBP. Los
resultados se muestran en la figura 4. Esta figura muestra los
resultados de control con respecto a los resultados de alimentación
como función de la proliferación inducida por MBP dividida por el
fondo (índice de estimulación).
La invención no está limitada a los nodos y
realizaciones de esta solicitud y a las realizaciones que se han
descrito anteriormente. Comprende cualesquiera modificaciones que
resultan de la supresión de enfermedades autoinmunes, tal como se
indica en la presente invención. Estos equivalentes se incluyen
dentro del sector de la protección que se define por las
reivindicaciones.
Las ratas donantes recibieron administración de
MBP ó BSA, 1 mg x 5 veces, a intervalos de 3-4 días
y se sacrificaron 4 días después de la administración final. Se
cosecharon células de nodos de linfa mesentérico (LNC) y células de
bazo, y se inyectaron intraperitonealmente de forma inmediata o
después de la activación con concanavalina-A
(Con-A), 1,5 \mug/ml, en medios de proliferación
durante 48 horas. El número de células inyectadas para experimentos
de transferencia adoptiva fue el siguiente: 120 x 10^{6} para la
población completa de LNC, activada o no; 60 x 10^{6} para LNC
con agotamiento de CD3; 80 x 10^{6} para la población con
agotamiento de CD4; y 95 x 10^{6} para LNC agotada de CD8. Las
ratas Lewis receptoras fueron inmunizadas con MBP/CFA 4 horas más
tarde para la inducción de EAE. La capacidad de transferir
resistencia al desarrollo de EAE de ratas donantes con
administración a ratas receptoras singénicas naturales es la que se
muestra en la Tabla VII. Las células LNC obtenidas a partir de
ratas sin administración o de ratas donantes con administración de
suero de albúmina bobina (BSA) no transfirió protección contra EAE.
No obstante, tanto las células de bazo como las células de nodos de
linfa mesentéricos (MES) obtenidas de donantes con administración de
MBP fueron capaces de trasferir protección relativa contra EAE
inducida en las ratas receptoras, demostrando una supresión de 50%
y 57% de la enfermedad, respectivamente. La gravedad máxima promedio
de la enfermedad se redujo también notablemente en las ratas
receptoras de células de bazo o células de nodos de linfa
mesentérico, obtenidas a partir de ratas donantes con
administración de MBP. Estos resultados demuestran que la tolerancia
oral a la inducción de EAE es de origen celular y que las células
responsables para protección se observa que se concentran tanto en
los nodos de linfa mesentérico como en el bazo.
\vskip1.000000\baselineskip
| Ratas con | Fuente de donantes | EAE en ratas receptoras | |
| administración de | de LNC | ||
| Incidencia | Gravedad máx. | ||
| promedio | |||
| Ninguno | \hskip1cm SPC | 6/7 | 2,5\pm0,3 |
| \hskip1cm Mes. LNC | 5/5 | 2,6\pm0,4 | |
| BSA | \hskip1cm SPC | 4/4 | 2,4\pm0,2 |
| \hskip1cm Mes. LNC | 5/5 | 2,6\pm0,3 | |
| MBP | \hskip1cm SPC | 4/8* | 1,6\pm0,2* |
| \hskip1cm Mes. LNC | 4/7* | 1,7\pm0,2* |
Se administró a las ratas Lewis MBP ó BSA cinco
veces, 1 mg por cada administración a intervalos de 3 días, o se
dejaron sin tratamiento. Las ratas fueron sacrificadas a
continuación, y sus bazos y nodos de linfa mesentérico fueron
retirados. Las células LNC fueron recogidas y activadas durante 48
horas en presencia de Con-A. Los linfoblastos
fueron recogidos, lavados tres veces, e inyectados por vía
intraperitoneal en ratas singénicas naturales. Las ratas receptoras
fueron atacadas 4 horas con MBP/CFA para la inducción de EAE. La
enfermedad fue evaluada diariamente desde el día 10 (*los
resultados fueron estadísticamente significativos, p<0,05).
Las células de bazo activadas con
Con-A (SPC) obtenidas de ratas donantes con
administración de MBP fueron transferidas a ratas singénicas
naturales antes o después del agotamiento de células T, linfocitos
helper T (CD4) o linfocitos T supresores/citotóxicos (CD8). Para el
agotamiento de poblaciones CD3, CD4 y CD8 de células de bazo, se
utilizó selección negativa. Se recubrieron platillos petri durante
una noche a 4ºC con 10 ml de 1/1000 anticuerpos IgG + IgM
antirratón de cabra (Tago) en PBS/BSA. Las placas fueron lavadas a
continuación y recubiertas con 3% de suero fetal bobino en PBS
durante 30 minutos a 20ºC y se lavaron nuevamente. Las células de
LNC de ratas Lewis fueron sometidas a tinción con anticuerpos
monoclonales antirrata de ratón (Serotec/Bioproducts) para CD3
(MRC, 0X/38), CD4 (W3/25) o CD8 (0X/8) diluidos 1/100 en PBS. Estas
células fueron sometidas a tinción durante 30 minutos sobre hielo,
se lavaron y se sembraron sobre los platillos petri, previamente
recubiertos, 15 millones de células/5 ml de PBS/placa a 4ºC. El
sobrenadante conteniendo células no adherentes fue aspirado
suavemente 60 minutos más tarde y centrifugado dos veces antes del
examen de las células y de su contaje. Este protocolo produce
poblaciones de células con una pureza aproximada de
85-95%, según examen mediante clasificador de
células activado de fluorescencia por examen de inmunofluorescencia
de membrana. Los resultados se muestran en la Tabla VIII. Los
resultados muestran que las células SPC son capaces de transferir
protección contra EAE (incidencia 50%), mientras que las células
SPC con agotamiento de células T perdieron su capacidad de proteger
las ratas receptoras (grupo 2). Por lo tanto, parece que las células
de bazo que son capaces de transferir protección son los linfocitos
T. No obstante, el agotamiento de las células CD8 (grupo 4) tiene
como resultado el fallo de transferir protección, mientras que las
células SPC con agotamiento de CD4+ mostraron capacidad
significativa de proteger ratas contra EAE. Por lo tanto, queda
demostrado que los linfocitos T específicos de antígenos que son
generados después de administración oral de MBP y que median la
resistencia a la inducción de la enfermedad son del subconjunto
supresor/citotóxico.
| Grupo | Células SPC retiradas de donantes | EAE en ratas receptoras | |
| con administración de MBP | |||
| Incidencia | Gravedad máx. | ||
| promedio | |||
| 1 | Población completa | 2/4 | 1,7\pm0,2* |
| 2 | Agotamiento de CD3 | 6/6 | 2,6\pm0,4* |
| 3 | Agotamiento de CD4 | 2/6* | 1,2\pm0,2* |
| 4 | Agotamiento de CD8 | 6/7 | 2,2\pm0,3 |
Las ratas donantes recibieron una administración
de MBP, y fueron tratadas tal como se ha indicado en las leyendas
de la Tabla 1. Las células SPC activadas con Con-A
fueron inyectadas en ratas receptoras naturales antes (grupo 1) o
después del agotamiento de cierta subpoblación (grupos
2-4). El agotamiento de linfocitos CD3, CD4 o CD8
fue realizado por acoplamiento de anticuerpos IgG monoclonales a las
células SPC y efectuando recubrimiento. Las ratas recipientes
fueron inmunizadas con MBP/CFA y se registró EAE a partir del día 10
(*Resultados estadísticamente significativos, p<0,05).
Se inmunizaron ratas con MBP/CFA y sus nodos de
linfa drenantes poplíteos con cebado (PLNC) fueron recogidos nueve
días más tarde. Se preparó una suspensión de células únicas al
prensar los nodos de linfa a través de una rejilla de acero
inoxidable. Se cultivó un total de 10^{5} células LNC con el
número indicado de células LNC irradiadas (2000 Rads) o intactas,
procedentes de ratas con administración por cuadriplicado, en una
placa de 96 pocillos de fondo redondo (Costar). Se añadieron MBP y
Mycobacteruim tuberculosis, 50 \mug/ml, al cultivo en un
volumen de 20 \mul. Los cultivos fueron incubados durante 80 horas
y fueron pulsionados con 1
\muCi[^{3}H]TdR/pocillo durante las últimas 16
horas de cultivo. Los cultivos fueron recogidos en un colector de
células automático y se leyeron en un contador de centelleo líquido
normal.
El porcentaje de supresión de la proliferación de
células LNC (PLNC) con cebado se calculó por la fórmula
siguiente:
% Supresión =
100 x 1- \frac{\text{cpm (LNC irradiadas de ratas con
administración + PLNC + antígeno)}}{\text{cpm (LNC irradiadas de
ratas sin tratamiento + antígeno de
PLNC)}}
Las células PLNC fueron cultivadas junto con
células SPC o LNC mesentéricas obtenidas de ratas con administración
de MBP o ratas naturales, en presencia de MBP o de Mycobacterium
tuberculosis. Las células LNC obtenidas a partir de ratas
donantes con administración de MBP fueron examinadas en días
distintos después de la última administración. Los resultados se
muestran en la figura 5. Se observa que dentro del marco de tiempo
del experimento, las células LNC obtenidas a partir de ratas con
administración no afectaron las respuestas de PLNC a
Mycobacterium tuberculosis. No obstante, tanto las células
SPC como las células LNC mesentéricas obtenidas a partir de ratas
administradas fueron capaces de suprimir la proliferación de PLNC a
MBP. La supresión de respuestas PLNC, específicas de antígeno, fue
superior utilizando SPC que con la utilización de LNC mesentéricas.
La supresión es evidente desde el día 5 a día 36, después de la
última administración de MBP, indicando que la inducción de la
supresión se consigue pronto después de la administración y se
mantiene durante un periodo de tiempo relativamente largo.
Por lo tanto, parece que las células LNC
obtenidas de ratas que se han hecho tolerizadas a la inducción de
EAE son linfocitos específicos de antígeno, que son capaces de
suprimir respuestas inmunes celulares solamente al antígeno
utilizado para la administración.
Para examinar la subpoblación de SPC responsable
de la supresión se obtuvieron células SPC de ratas con
administración de MBP 20 días después de la última administración,
con eliminación de ciertas poblaciones de linfocitos, irradiadas y
mezcladas con células PLNC obtenidas a partir de ratas inmunizadas
con MBP/CFA junto con MBP. Se sembraron células LNC de bazo y
poplíteas con una concentración de 10^{7} células por ml de
cápsula petri solas o irradiadas (2000 Rads) junto con otras
células PLNC tal como se ha indicado. Los cultivos fueron mantenidos
en medios de proliferación con o sin antígeno (20 \mug/ml)
durante 3 días en una incubadora y luego se cosecharon. Los
sobrenadantes diluidos fueron utilizados para examinar la producción
in vitro y secreción de anticuerpo IgG y fueron medidos en
cuanto a la producción de anticuerpos utilizando la prueba ELISA. Se
incubaron placas de microtitulación con 0,1 ml por pocillo de 10
\mug de antígeno/ml en agua doblemente destilada. Las placas
fueron incubadas durante 18 horas a 25ºC. Después de tres lavados
con PBS/tween-20 (Bio-Rad), pH 7,5,
las placas fueron incubadas con 3% BSA/PBS durante 2 horas a 37ºC,
se lavaron dos veces y se añadieron 100 \mul de suero diluido por
cuadruplicado. Las placas fueron incubadas durante dos horas a 37ºC.
Después de tres lavados con PBS/tween-20, las
placas fueron incubadas con 100 \mul/pocillo de anticuerpo IgG
antirrata de cabra conjugada de peroxidasa (Tago, USA) diluido
1:1000 en 1% de BSA/PBS durante una hora a 25ºC. La reacción de
color fue obtenida por exposición a D-fenilendiamina
(0,4 mg/ml de tampón citrato fosfato, pH 5,0) conteniendo 30% de
H_{2}O_{2}. La reacción fue interrumpida añadiendo 0,4N
H_{2}SO_{4} y se leyó OD 492 nm en un lector ELISA. Los
resultados mostrados en la tabla IX representan la supresión
porcentual de la proliferación de antígeno de PLNC en presencia de
SPC obtenidas a partir de ratas con administración de MBP en
comparación con sus respuestas a MBP en presencia de SPC obtenidas
de ratas intactas. Se ha demostrado que las células SPC obtenidas
de ratas con administración de MBP (grupo 1) suprimen las respuestas
de PLNC a MBP (70%). El agotamiento de células T (grupo 2) o
linfocitos T supresores/citotóxicos (grupo 3) cancela la supresión.
No obstante el agotamiento de linfocitos helper T (CD4, grupo 4)
incrementa la inhibición de la respuesta de proliferación anti MBP
de las células PLNC. Diluyendo las células SPC con agotamiento de
CD4 tiene como resultado la disminución de la supresión desde 96%
(en proporción 1:1) a 18% (en proporción 1:100 de SPC:PLNC).
Estos resultados sugieren que las células
responsables tanto para la inhibición de la enfermedad como para las
respuestas celulares específicas de antígeno in vitro son de
origen de células T y que son linfocitos T
supresores/citotóxicos.
| Grupo | SPC retiradas de ratas | Proporción SPC:PLNC | % de supresión de |
| con administración de MBP | respuestas de PLNC a BMP | ||
| 1 | \hskip0.6cm Población completa | 1:1 | 70 |
| 2 | \hskip0.6cm Agotada CD3 | 1:1 | -13 |
| 3 | \hskip0.6cm Agotada CD8 | 1:1 | -30 |
| 4 | \hskip0.6cm Agotada CD4 | 1:1 | 96 |
| \hskip0.6cm \square\square''\square\square'' | 1:10 | 32 | |
| \hskip0.6cm \square\square''\square\square'' | 1:50 | 35 | |
| \hskip0.6cm \square\square''\square\square'' | 1:100 | 18 |
Se retiraron bazos de ratas Lewis con
administración de MBP y a continuación las células fueron recogidas,
irradiadas y sembradas junto con células PLNC responder retiradas
de ratas singenéicas inmunizadas con MBP/CFA. Las células SPC
fueron utilizadas como células no tratadas o linfocitos T con
agotamiento de CD3, CD4 o CD8 utilizando los anticuerpos
monoclonales apropiados para acoplamiento y efectuando a
continuación recubrimiento. Los resultados se expresan en forma de
supresión porcentual de respuestas de PLNC a MBP y se relacionan con
las respuestas de PLNC en presencia de células SPC irradiadas
retiradas de ratas sin administración.
Se administró MBP a ratas Lewis o éstas se
dejaron sin tratamiento y luego se atacaron con MBP con mezcla de
ovoalbúmina (OVI) emulsionada en CFA. Las ratas fueron sangradas a
continuación a diferentes intervalos y los sueros fueron examinados
en cuanto a anticuerpos anti-OVA o
anti-MBP. Tal como se ha mostrado en la figura 6a,
los niveles de suero de IgG a OVA no quedaron afectados en las ratas
con administración de MBP, mientras que los niveles de suero IgG a
MBP disminuyeron en ratas con administración de MBP (6b).
Se administró MBP a ratas Lewis o se dejaron
éstas sin administración y fueron inmunizadas a continuación con
MBP+OVA/CFA. Las células PLN fueron retiradas 12 días más tarde y
las PLNC fueron cultivadas durante 3 días en presencia de MBP u
OVA, se recogieron los sobrenadantes, se diluyeron 1:20 y se
examinaron en cuanto a su contenido de IgG. Tal como se ha mostrado
en la tabla X, las células PLNC que fueron obtenidas a partir de
ratas con administración (grupo 2) y cultivadas in vitro con
MBP, respondieron en menor medida en términos de producción de IgG
a MBP en comparación con las células PLNC obtenidas a partir de
ratas sin administración (grupo 1,45% de supresión). La producción
de IgG anti-OVA en PLNC de las mismas ratas no quedó
afectada (grupo 4 con respecto a 5). Además, mezclando PLNC
irradiadas obtenidas de MBP con administración y ratas inmunizadas
con PLNC de ratas inmunizadas cultivadas junto con MBP, disminuyó la
producción de anticuerpos de esas últimas (grupo 3, supresión 35%),
mientras que las concentraciones de anticuerpos con respecto a OVA
no quedaron afectadas (grupo 6). Además, la eliminación de células
CD8+ canceló la supresión de anticuerpos anti-MBP
demostrando que, igual que en respuestas de transferencia adoptiva
y proliferativas, las células CD8+ eran responsables de la
supresión.
| Grupo | Células | Células | Niveles IgG en sobrenadantes | ||
| responder | moduladoras | ||||
| Estimulación | Valores 0.0.492 | % supresión de | |||
| In vitro | +/- desviación | producción de IgG | |||
| estándar | |||||
| 1 | Inmunizadas | - - | MBP | 0,56\pm0,06 | - - |
| 2 | Con administración | - - | MBP | 0,31\pm0,01 | 45 |
| MBP e inmunizadas | |||||
| 3 | Inmunizadas | Con administración | MBP | 0,36\pm0,04 | 35 |
| MBP e inmunizadas | |||||
| 4 | Inmunizadas | Con administración | MBP | 0,55\pm0,04 | 0 |
| MBP e inmunizadas | |||||
| con agotamiento de C08* | |||||
| 5 | Inmunizadas | - - | OVA | 0,17\pm0,03 | |
| 6 | Con administración | - - | OVA | 0,18\pm0,02 | 0 |
| MBP e inmunizadas | |||||
| 7 | Inmunizadas | Con administración | OVA | 0,21\pm0,04 | 0 |
| MBP e inmunizadas |
Las ratas fueron inmunizadas con MBP+OVA y CFA
(unos 3 días después de la quinta administración de MBP). Doce días
más tarde se retiraron sus PLNC y se cultivaron conjuntamente con
MBP (grupos 1-4) o con OVA (grupos
5-7) durante tres días. En algunos grupos las
células PLNC irradiadas obtenidas a partir de ratas con
administración de MBP e inmunizadas fueron irradiadas y cultivadas
junto con células PLNC inmunizadas en presencia de MBP (grupo 3) o
en presencia de OVA (grupo 7). Los sobrenadantes de estas
estimulaciones fueron recogidos, diluidos y se determinaron los
niveles IgG por ensayo ELISA.
Los fragmentos solapados del fragmento de
aminoácidos 1-37 de proteína básica de mielina de
cobaya fueron sintetizados utilizando técnicas de péptidos de fase
sólida. Houghten, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:5131-5135 (1985). Estos fragmentos fueron
administrados a continuación oralmente en concentraciones
equimolares a 15mg de proteína básica de mielina completa. Se
administraron en los días -7, -5 y -2 antes de la inmunización. Los
animales fueron atacados a continuación con proteína básica en
adyuvante de Freund de acuerdo con los procedimientos establecidos
y se evaluaron.
Los animales fueron evaluados en cuanto a
mortalidad, presencia de enfermedad y gravedad de la enfermedad.
Tal como se muestra en la tabla XI 6/6 animales de control
enfermaron con una mortalidad de 3/6. En animales que recibieron
los fragmentos de péptidos solapados se observó una disminución de
la mortalidad utilizando todos los fragmentos excepto en el
fragmento 1-10. Cuando se observa en términos de
gravedad la enfermedad, la región de la molécula entre los
aminoácidos 5 y 20 muestra la disminución más pronunciada de la
enfermedad. Este resultado demuestra que en la región de
aminoácidos 1-37 que en si misma es un fragmento
supresogénico, las regiones específicas de la molécula pueden ser
más o menos protegidas cuando se administran oralmente.
\vskip1.000000\baselineskip
| Fragmento | Incidencia de enfermedad | EAE mediada por MBP/CFA | |
| Evaluación | Mortalidad | ||
| Máxima promedio | |||
| Control (PBS) | 6/6 | 3,8 | 3/6 |
| 1-10 | 5/5 | 3,8 | 4/5 |
| 5-15 | 4/5 | 2,1 | 1/5 |
| 11-20 | 4/5 | 2,0 | 0/5 |
| 16-25 | 4/5 | 2,6 | 0/5 |
| 21-30 | 5/5 | 3,0 | 1/5 |
| 26-36 | 4/6 | 2,6 | 1/6 |
| 31-37 | 5/6 | 3,3 | 0/6 |
Se sintetizaron fragmentos solapados de la región
1-37 de la proteína básica de mielina de cobaya,
utilizando técnicas de péptidos de fase sólida. Estos fragmentos
fueron administrados a continuación por vía oral en concentraciones
equimolares a 15 mg de proteína básica de mielina completa. Se
administraron en los días -7, -5 y -2 antes de dar inmunización. A
continuación se atacaron los animales con proteína básica en
adyuvante de Freund de acuerdo con los procedimientos establecidos y
se calificaron.
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales recibieron proteína básica de
mielina completa inmunizada en la pata con adyuvante de Freund o
por administración oral. De siete a 10 días después se retiraron
células del bazo y del nodo de linfa y se estimularon in
vitro con diferentes fragmentos de la molécula de proteína
básica.
Tal como se ha mostrado en la Tabla XII, cuando
se administra periféricamente proteína básica de mielina en
adyuvante de Freund, la respuesta primaria es a la región
encefalitogénica 44-89 según mediciones por
proliferación. No obstante, tal como se muestra en la tabla XIII,
cuando se administra oralmente, la respuesta primaria es al
fragmento 1-37, supresor no encefalitogénico
determinante.
| Contajes por minuto | Índice de estimulación | |
| Fondo | 3,292 | - - |
| MBP Completo | 10,142 | 3,1 |
| Fragmento 1-37 de MBP | 3,360 | 1,0 |
| Fragmento 44-89 de MBP | 10,054 | 3,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales fueron inmunizados en las patas
traseras con 50 \mug MBP en CFA. Diez días más tarde se retiraron
nodos de linfa y se estimularon in vitro con 10 \mug de MBP
o cantidades equimolares de fragmentos de MBP.
\vskip1.000000\baselineskip
| Procedencia de LNC | MBP Completo | 1-37 | 44-89 |
| SPC | 5,10\pm1,6 | 5,05\pm1,8 | 2,41\pm0,9 |
| Mes.LNC | 8,61\pm1,9 | 9,88\pm1,5 | 3,53\pm0,8 |
| Cervicales | 4,58\pm1,3 | 6,42\pm0,9 | 2,51\pm0,6 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se administró a los animales 1 mg de MBP
completo x3, a continuación se retiraron células de varios órganos
15 días después de la administración y se midió la proliferación.
Los resultados se expresan en forma de cambio en cpmx10^{-3} en
comparación con células cultivadas solas.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que AA se induce por CFA conteniendo M.
tuberculosis, un enfoque inicial en el estudio del problema fue
administrar a animales diferentes dósis de MT. De manera inesperada,
no se observó supresión de la enfermedad según medición de la
incidencia de extremidades artríticas, día de inicio, o calificación
máxima de artritis con respecto a una amplia gama de dosis, en la
que se administraron 3 \mug, 30 \mug, 300 \mug o 3 mg de MT
en los días -7, -5 y -2 antes de la inmunización. Se muestran en la
figura 7A datos representativos de los animales pretratados con 3
\mug.
Basándose en investigaciones que han indicado el
desarrollo de autoinmunicidad al colágeno en ratas con AA
(Trentham, D.E. y otros, J. Clin. Invest, 66:1109 (1980)), se
estudió el efecto de la administración oral de colágeno de tipo II
en AA. Tal como se ha mostrado en la figura 7B y en la Tabla XIV, la
alimentación previa de ratas con CII suprimió significativamente AA
en forma dependiente de dosis, apreciándose los efectos más
pronunciados en los grupos con administración de 3 \mug o 30
\mug de CII. La supresión ocasional se apreció en 300 \mug. En
animales con administración de 3 \mug o 30 \mug, la incidencia
de extremidades atléticas fue menor y la enfermedad fue más suave
que la medida por la valoración de artritis máxima. El inicio de la
enfermedad se retrasó también en animales con administración de 3
\mug de CII. Para determinar si la administración oral de CII
tenía efectos supresores no específicos en enfermedades autoinmunes
experimentales se administró una gama de dosis idéntica de CII a
animales inmunizados con proteína básica de mielina en CFA para la
inducción de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE)
(Higgins, P.J. y otros, J. Immunol. 140:440 (1988)). No se
observó efecto de desarrollo de EAE después de la
administración
de CII.
de CII.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha informado que se desarrolla inmunidad tanto
a CII como MT en AA (Trentham, D.E. y otros, J. Clin. Invest.
66:1109 (1980)). Se llevaron a cabo respuestas DTH para determinar
el efecto de la administración de CII en respuestas de células T
in vivo, tanto a MT como a CII. Tal como se ha mostrado en la
figura 8A, animales inmunizados con CA desarrollan DTH a CII si
bien no es tan pronunciada como DTH a MT (figura 8B). Además, la
administración oral de CII reduce la respuesta DTH a CII en animales
con AA, mientras que no hay efecto en la respuesta DTH a MT. La
gama de respuesta de dosis para supresión de DTH por CII fue
idéntica a la supresión de la enfermedad con CII, es decir, la
supresión más importante se apreció en 3 \mug y 30 \mug. Se
debe observar que no hubo sensibilización a CII en animales que
recibieron solamente 3 \mug sin inmunización subsiguiente. La
supresión de respuestas celulares inmunes a MT después de
administración oral del antígeno se examinó a continuación. Tal
como se ha mostrado en la figura 9, las respuestas proliferativas a
MT fueron suprimidas en animales con administración de 3 \mug y 30
\mug de MT. Se observó una supresión similar medida por respuestas
DTH.
\newpage
Se ha demostrado previamente que la supresión de
EAE después de la administración oral de proteína básica de mielina
puede ser transferida adoptivamente por células T del bazo de
animales con administración (Lider, 0., y otros, J. Immunol,
142:748-752 (1989)), y se han obtenido resultados
similares en el modelo de uveitis autoinmune. Tal como se ha
mostrado en la Tabla XV, la protección contra AA fue transferida
adoptivamente a ratas naturales por células T del bazo de ratas
tolerizadas oralmente a CII. La protección fue más pronunciada
cuando se transfirieron esplenocitos en el día -2 y cuando se
transfirieron células T de bazo con respecto a células B.
A efectos de determinar si la administración de
CII podría mejorar AA ya establecida, se administraron animales con
CII después del inicio de la enfermedad. Los signos iniciales de la
artritis aparecieron 13-14 días después de la
inducción de la enfermedad con CFA. En el día 17, se separaron unos
animales en dos grupos, con severidad correspondiente de la
enfermedad. El grupo de control permaneció sin tratamiento, mientras
que el grupo tratado recibió por vía oral 3 \mug de CII tres
veces por semana a intervalos de un día de cada dos. Los animales
de ambos grupos fueron evaluados en cuanto a artritis hasta el día
34. Tal como se ha mostrado en la figura 10, los animales tratados
con CII desarrollaron artritis ligera y se recuperaron antes que los
controles.
Aunque la estructura molecular de CII es muy
próxima a la de otros colágenos, tales como el tipo I (CI) y el
tipo III (CIII), la distribución de estos colágenos es muy distinta
(Seyer, J.M., y otros, In: Textbook of Rheumatology,
3rd ed. (Kelly y otros, eds.), p.22, Saunders, Philadelphia
(1989)). Mientras que el colágeno CII se encuentra habitualmente
presente en los cartílagos de las articulaciones, los colágenos de
tipo I y tipo III se encuentran principalmente en los huesos, piel,
y otros tejidos blandos. Tal como se ha mostrado en la Tabla XVI,
los inventores han descubierto que la administración oral de CI
suprimía AA, tal como se ha determinado con la incidencia de
extremidades artríticas y gravedad de la enfermedad, en la misma
gama de dosis que CII. Se observó un retraso en el inicio de la
enfermedad en animales por administración de CIII, pero no se
observó efecto significativo alguno en la gravedad de la enfermedad.
La administración oral de un antígeno de proteína irrelevante,
proteína básica de mielina, no suprimió AA.
La proliferación de lifoncitos y los experimentos
DTH anteriores indican que la administración oral de MT suprime las
respuestas inmunes celulares contra MT sin inhibición de la
enfermedad clínica. No obstante, la inmunidad celular a MT no se
suprimió profundamente por tolerancia oral y puede ser que los
regímenes que tenían un mayor efecto en la supresión de inmunidad
MT suprimirían la enfermedad. A este respecto, otros han mostrado
supresión de AA por administración de 65 kd de HSP en aceite
(Billingham, M.E.J., y otros, J. Exp. Med. 171:339 (1990) o
por administración de MT por vía intratérmica o intravenosa
(Larsson, P., y otros., J. Cell. Biochemistry 40:49 (1989);
Gery, I., y otros, Int. Arch. Allergy 31:57 (1967)).
La supresión de AA por administración oral de CII
sugiere que se desarrolla inmunidad patogénica a CII en AA o que
hay epítopos de reacción cruzada entre MT y CII. Se debe observar
que las líneas de células T de CII se indicó que tenían un efecto
menor en la mejora de AA por vacuna mediante células T (Holoshitz,
J., y otros, Science 219:56 (1983) y se produjo una ligera
supresión de CIA por los 65 kd de HSP (Billingham, M.E.J., y
otros, J. Exp. Med. 171:339 (1990)). Algunos investigadores han
informado sobre la supresión de AA por administración intravenosa de
CII (Phadke, K., y otros, Artritis Rheum. 27:797 (1984)) si
bien esto no ha sido determinado de manera uniforme (Cremer, M.A.,
y otros, J. Immunol. 131:2995 (1983)). Los estudios de los
inventores sugieren que la incapacidad de los investigadores en
demostrar la supresión de AA por administración i.v. de CII
(Cremer, M.A., y otros, J. Immunol. 131:2995 (1983)) se puede
relacionar con la utilización de una dosis demasiado grande, es
decir, 1 mg. En experimentos preliminares, se ha encontrado una
cierta reactividad cruzada entre MT y CII en ensayos de
proliferación, si bien queda sin definir si la supresión de AA por
administración oral de CII se refiere a la reactividad cruzada entre
MT y CII. La homología de la secuencia de aminoácidos entre el
colágeno de tipo II de pollo y los péptidos 180-188
de la proteína de choque térmico de MT de 65 kd, que se ha
informado que estimula los clones que median la artritis en ratas
(van Eden, W., y otros, Nature 331:171 (1988)) no ha sido
hallada. Recientemente, una secuencia de 26 aminoácidos procedentes
de CII se ha informado que suprime artritis inducida por colágeno
(Myers, L.K., y otros, J. Exp. Med. 170:1999 (1989)), no
obstante, no se pueden localizar homologías entre este péptido y el
péptido de 65 kd. De manera clara, dadas las dimensiones de MT y
CII, pueden existir epítopos con reactividad cruzada que no se
identifican fácilmente. De manera alternativa, MT puede inducir
daños en las articulaciones que llevan a respuesta inmune patogénica
a CII.
Se ha demostrado que la supresión activa es
generada después de administración oral de antígeno (Ngan, J., y
otros, J. Immunol. 120:861 (1978); Mattingly, J.A., y otros,
J. Immunol. 125:1044 (1980); Mattingly, J.A., Cell. Immunol.
86:46 (1984); Zhang, Z., y otros, Cell. Immunol. 104:426
(1987)), y que EAE se puede suprimir por transferencia adoptiva de
células de CD8^{+}T de animales tolerizados oralmente (Lider, O.,
y otros, J. Immunol. 142:748-752 (1989)).
Los medicamentos utilizados para el tratamiento
son un extracto de mielina bovina, preparado por Biopure, Boston,
Massachusetts. La mielina bovina no es tóxica cuando se administra a
animales, y es eficaz en la mejora del relapso crónico de EAE. La
mielina bovina de Biopure es preparada en un rediente de sacarosa
con intermedio de centrifugación por densidad utilizando una
centrifugadora Sharples y es analizada por electroforesis SDS page.
La mielina es extraída de cerebro bovino obtenido de mataderos
locales de Massachusetts y es comprobada en cuanto a pureza y
normalización lote a lote por electroforesis de gel de agarosa,
determinación de proteína, análisis de lípidos, determinación de
aminoácidos y reactividad inmunológica. También se comprueba en
cuanto a presencia de bacterias y virus.
La mielina es administrada a pacientes con
esclerosis múltiples en cápsulas de 100 mg, administradas tres veces
al día con una dosis total de 600 mg/día.
El colágeno de tipo II utilizado para el
tratamiento es un preparado CII obtenido de la empresa Genzyme
Corporation, Boston Massachusetts (colágeno de tipo II de pollo,
soluble). Este preparado es eficaz en la mejora de artritis
adyuvante.
El CII es administrado por vía oral a pacientes
con artritis autoinmune con una dosis de 10 \mug a 100 mg por
día. El CII es administrado en forma seca o disuelto en un líquido
(y volumen) que el paciente puede tolerar. En una realización
preferente, se administra una dosis total de 100 \mug hasta 30 mg
por día. Esta dosificación puede ser administrada en dosis
múltiples, a efectos de proporcionar al paciente la dosis diaria
total. En una realización preferente, esta dosificación múltiple es
de tres veces al día.
Claims (29)
1. Utilización de colágeno o de un fragmento
biológicamente activo de colágeno o un análogo estructuralmente
relacionado con el colágeno en la preparación de un medicamento para
administración oral o entérica en el tratamiento de artritis
reumatoide humana.
2. Utilización, según la reivindicación 1, que
comprende la utilización de colágeno de tipo II o un fragmento
biológicamente activo del colágeno de tipo II o un análogo
estructuralmente relacionado con el colágeno de tipo II en la
preparación de dicho medicamento.
3. Utilización, según la reivindicación 2, en la
que el colágeno de tipo II está destinado a una administración de
una dosis diaria comprendida entre 10 \mug y 100 mg.
4. Utilización, según la reivindicación 2, en la
que dicho colágeno de tipo II, dicho fragmento y dicho análogo
adoptan una forma que es soluble en el medio acuoso.
5. Utilización, según la reivindicación 2, en la
que dicho colágeno de tipo II y dicho fragmento se encuentran
sustancialmente libres de contaminantes naturales.
6. Utilización, según la reivindicación 2, en la
que dicho colágeno de tipo II, dicho fragmento y dicho análogo están
purificados.
7. Utilización, según la reivindicación 2, en la
que dicho colágeno de tipo II, dicho fragmento y dicho análogo son
aislados a partir de una fuente de origen natural.
8. Utilización, según la reivindicación 2, en la
que dicho medicamento contiene colágeno de tipo II purificado.
9. Utilización, según la reivindicación 1, que
comprende la utilización de colágeno de tipo I o un fragmento
biológicamente activo de colágeno tipo I o un análogo
estructuralmente relacionado con el colágeno del tipo I en dicho
medicamento.
10. Utilización, según la reivindicación 9, en la
que dicho colágeno de tipo I y dicho fragmento se encuentran
sustancialmente libres de contaminantes naturales.
11. Utilización, según la reivindicación 9, en la
que dicho colágeno de tipo I, dicho fragmento, y dicho análogo están
purificados.
12. Utilización, según la reivindicación 9, en la
que dicho colágeno de tipo I, dicho fragmento, y dicho análogo son
aislados a partir de una fuente de origen natural.
13. Utilización, según la reivindicación 9, en la
que dicho medicamento contiene colágeno de tipo I purificado.
14. Utilización, según la reivindicación 1, que
comprende la utilización de colágeno de tipo III o un fragmento
biológicamente activo de tipo III o un análogo estructuralmente
relacionado con el colágeno de tipo III en dicho medicamento.
15. Utilización, según la reivindicación 14, en
la que dicho colágeno de tipo III y dicho fragmento se encuentran
sustancialmente libres de contaminantes naturales.
16. Utilización, según la reivindicación 14, en
la que dicho colágeno de tipo III, dicho fragmento y dicho análogo
son purificados.
17. Utilización, según la reivindicación 14, en
la que dicho colágeno de tipo III, dicho fragmento y dicho análogo
son aislados a partir de una fuente de origen natural.
18. Utilización, según la reivindicación 14, en
la que dicho medicamento contiene colágeno de tipo III
purificado.
19. Medicamento para el tratamiento de artritis
reumatoide, que comprende colágeno de tipo I, o un fragmento
biológicamente activo de dicho colágeno de tipo I o un análogo
estructuralmente relacionado con dicho colágeno de tipo I en una
forma de dosificación para administración oral o entérica, con la
condición de que el medicamento no comprende colágeno de tipo
II.
20. Medicamento, según la reivindicación 19, en
el que dicho colágeno de tipo I y dicho fragmento se encuentran
sustancialmente libres de contaminantes naturales.
21. Medicamento, según la reivindicación 19, en
el que dicho colágeno de tipo I, dicho fragmento y dicho análogo son
purificados.
22. Medicamento, según la reivindicación 19, en
el que dicho colágeno de tipo I, dicho fragmento y dicho análogo son
aislados a partir de una fuente de origen natural.
23. Medicamento, según la reivindicación 19, en
el que dicho medicamento contiene colágeno de tipo I purificado.
24. Medicamento para el tratamiento de artritis
reumatoide, que comprende colágeno tipo III o un fragmento
biológicamente activo de dicho colágeno de tipo III o un análogo
estructuralmente relacionado con dicho colágeno de tipo III en una
forma de dosificación para administración oral o entérica, con la
condición de que el medicamento no comprende colágeno de tipo
II.
25. Medicamento, según la reivindicación 24, en
el que dicho colágeno de tipo III y dicho fragmento se encuentran
sustancialmente libres de contaminantes naturales.
26. Medicamento, según la reivindicación 24, en
el que dicho colágeno de tipo III, dicho fragmento y dicho análogo
son purificados.
27. Medicamento, según la reivindicación 24, en
el que dicho colágeno de tipo III, dicho fragmento y dicho análogo
son aislados a partir de una fuente de origen natural.
28. Medicamento, según la reivindicación 24, en
el que dicho medicamento contiene colágeno de tipo III
purificado.
29. Utilización, según la reivindicación 2, en la
que el colágeno de tipo II es para administración en una dosis
diaria de 10 \mug a 1 mg.
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