ES2258489T3

ES2258489T3 - Proteinas relacionadas con el estres por pirofosfatasas y metodos de utilizacion en plantas.

Info

Publication number: ES2258489T3
Application number: ES00993487T
Authority: ES
Inventors: Stefan Henkes; Ruoying Chen; Nocha Van Thielen; Oswaldo Da Costa E Silva
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2006-09-01
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: EP1280397A2; WO2001045492A3; EP1280397B1; AU2734101A; DE60027772T2; DE60045115D1; US20090007296A1; EP1244349B1; US7220896B2; WO2001045493A3; WO2001045493A2; US20080052792A1; US20090089891A1; ATE357135T1; EP1251731B1; DE60034069D1; US7164057B2; US20070157343A1; DE60041277D1; AU2913601A

Abstract

Una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de una proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la planta a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta y en donde la PPSRP se define en SEQ ID NO: 3.

Description

Proteínas relacionadas con el estrés por pirofosfatasas y métodos de utilización en plantas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que están asociadas con respuestas de estrés abióticas y tolerancia abiótica al estrés en las plantas. En particular, esta invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que confieren a las plantas tolerancia a la sequía, al frío, y/o a la sal.

Antecedentes de la técnica

El estrés ambiental causa pérdidas importantes de cosechas. Las causas de estrés son numerosas y a menudo específicas de la cosecha y la localización. Las mismas incluyen sequía, salinidad alta, temperaturas extremadas, hipoxia, deficiencia en nutrientes minerales y radiación UV-B. La investigación en esta área está estimulada por la esperanza de mejorar el rendimiento de las cosechas en áreas deterioradas. Actualmente, se están realizando avances reales aunque lentos por los reproductores de cosechas y los profesionales agrónomos utilizando metodología probada y ensayada. Sin embargo, la biotecnología tendrá un papel creciente a medida que los genes implicados en la tolerancia al estrés sean clonados y se esclarezca su modo de acción (Quarrie SA, 1926 Plant Growth Reg. 20:167-178). Por mejora del rendimiento de una planta en respuesta a estados de estrés ambiental diferentes, las pérdidas en productividad y los riesgos para el agricultor pueden reducirse notablemente. La modificación de la tolerancia de una planta a las situaciones de estrés ambiental permite también cultivar una planta en regiones en las cuales una planta o una variedad de planta es típicamente incapaz de desarrollarse. (Bohnert y Jensen, 1996 (TIBTECH 14:89-97).

La base bioquímica y fisiológica para la tolerancia de las plantas al estrés no es bien conocida. Sin embargo, parece ser que el daño común por diferentes tipos de estrés (estrés por sequía, sal y frío) se debe en gran parte a la deshidratación (Smirnoff, 1998, Curr. Opin. Plant Biol. 9:214-219). La respuesta que distingue las especies tolerantes a la sequía y sensibles a la misma es evidentemente una acumulación espectacular de sustancias osmoprotectoras así como de iones que conduce a ajustes osmóticos (Bohnert y Jensen, 1996 (TIBTECH 14:89-97).

La sacarosa es un osmoprotector importante en condiciones de estrés por deshidratación (déficit de agua y estrés por heladas). La biosíntesis de la sacarosa comprende varios pasos de control (Stitt y Sonnewald, 1995 Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46:641-668) y el metabolismo del pirofosfato (PPi) juega un papel importante en este camino de biosíntesis (Stitt, 1998 Bot. Acta 111:167-175). El PPi se forma principalmente como sub-producto de la biosíntesis de macromoléculas tales como RNA, proteínas y celulosa en el alargamiento de las células (Nakanishi y Maeshima, 1998 Plant Physiol. 116:589-597). Existen tres actividades enzimáticas implicadas en el metabolismo de PPi en el citosol, dos reacciones reversibles catalizadas por PFP (Fructosa-6P fosfofructoquinasa dependiente de pirofosfato; Paul et al. 1995 Planta 196:277-283) y UGPasa (UDP-Glucosa-Pirofosforilasa; Zrenner et al. 1993 Planta 247-253), respectivamente, y el pirofosfato inorgánico unido a la membrana de los tonoplastos (PPasa, Rea et al. 1992 Tr. in Biochem. 17:348-353). Una pirofosfatasa inorgánica soluble existe únicamente en los cloroplastos, pero no en el citosol Weiner et al. 1987 Biochem. Biophys. Acta 893:13-21).

Se conocen hasta la fecha dos familias de pirofosfatasa inorgánica soluble. La familia I, que incluye la mayoría de las PPasas conocidas actualmente y la familia II, que incluye PPasas de ciertas especies bacterianas. Las dos familias no exhiben semejanza alguna de secuencia entre sí. Además de las PPasas solubles, las plantas (y ciertas bacterias) tienen una PPasa unida a la membrana que actúa como una bomba reversible. Las PPasas unidas a la membrana son mucho mayores y no tienen semejanza alguna de secuencia con ninguna de las dos familias de PPasa soluble. Las PPasas solubles de las plantas se asemejan a la PPasa procariota más estrechamente que las PPasas animales/fúngicas (Sivual et al. 1999 FEBS Letters 454:75-80).

Se ha demostrado que la expresión ectópica de una pirofosfatasa inorgánica soluble en el citosol desplaza el metabolismo del carbono hacia la síntesis de sacarosa en las plantas transgénicas debido a la eliminación de PPi como producto de la reacción de PFP y UGPasa. La sobre-expresión constitutiva (promotor 35S) de pirofosfatasa soluble de E. coli en el citosol de las células vegetales conduce a una acumulación de sacarosa en las hojas de las plantas transgénicas de tabaco (Jellito et al. 1992 Planta 188:238-244). Se obtuvieron los mismos efectos después de la expresión de la enzima únicamente en el floema (promotor rolC) indicando el papel esencial de PPi para la carga de sacarosa en el floema (Lerchl et al. 1995 Plant Cell 7:259-270). Adicionalmente, se reducía el crecimiento tanto de las plantas 35S como de las plantas rolC. Estos ejemplos muestran la importancia de PPi para el metabolismo y el crecimiento de las plantas. La alteración de la cantidad y/o disponibilidad de fosfato inorgánico en la célula tiene también efectos profundos sobre el metabolismo de los lípidos en las plantas (Haertel et al. 2000 PNAS 97:10649-10654), y por consiguiente puede conducir a cambios en la composición del plasmalema así como de las membranas de los orgánulos.

La respuesta de las plantas transgénicas que expresan una pirofosfatasa inorgánica soluble en el citosol a los estados de estrés ambiental como sequía, sal y heladas no ha sido determinada hasta ahora. Por esta razón, se hace necesaria la identificación de genes y proteínas codificados(as) por dichos genes que tengan actividad semejante a las pirofosfatasas y que estén implicados en la tolerancia de las plantas al estrés. El esclarecimiento de la función de genes expresados en las plantas tolerantes al estrés no sólo aumentará la comprensión de la adaptación y tolerancia de las plantas a los estados de estrés ambiental, sino que puede proporcionar también información importante en relación con el diseño de nuevas estrategias para mejora de las cosechas. Las plantas tolerantes al estrés de nueva generación presentarán muchas ventajas, tales como el aumento del intervalo en que las plantas de cosecha pueden ser cultivadas mediante, por ejemplo, disminución de los requerimientos de agua de una especie vegetal. Esta invención satisface en parte la necesidad de identificar nuevas pirofosfatasas singulares capaces de conferir tolerancia al estrés a las plantas por sobre-expresión.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de una proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta, y en donde la PPSRP se define en SEQ ID NO: 3.

La invención proporciona adicionalmente ejemplos específicos de PPSRP, y ácidos nucleicos codificantes de PPSRP, tales como PPasa-1.

La invención estipula en algunas realizaciones que la PPSRP y el ácido nucleico codificante son los encontrados en miembros del género Physcomitrella. En otra realización preferida, el ácido nucleico y la proteína proceden de una Physcomitrella patens. La invención estipula que el estrés ambiental puede ser estrés por salinidad, sequía, temperatura, metales, productos químicos, patógenos y oxidantes, o combinaciones de los mismos. En realizaciones preferidas, el estrés ambiental puede ser la sequía.

La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de PPSRP, en donde la semilla contiene la PPSRP como se ha definido arriba, y en donde la planta es progenie real para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica que expresa una PPSRP, en donde la planta es progenie real para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

La invención proporciona adicionalmente el uso de cualquiera de las plantas transgénicas arriba descritas para la fabricación de un producto agrícola. La invención proporciona adicionalmente una proteína aislada relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde la PPSRP es como se describe arriba. La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico codificante de una proteína aislada relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde el ácido nucleico codificante de la PPSRP codifica una PPSRP como se ha descrito arriba.

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico codificante de PPSRP como se ha descrito arriba, en donde la expresión del vector en una célula hospedadora da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora. La invención proporciona adicionalmente una célula hospedadora que contiene el vector. La invención proporciona adicionalmente una planta que contiene la célula hospedadora.

La invención proporciona adicionalmente un método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico codificante de proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende: (a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de PPSRP, y (b) generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta, en donde la PPSRP es como se describe arriba. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico codificante de PPSRP es como se describe arriba.

La presente invención proporciona adicionalmente un método de identificación de una nueva proteína relacionada con el estrés por las pirofosfatasas (PPSRP), que comprende (a) generar una respuesta específica de anticuerpo para una PPSRP, o fragmento de la misma, como se describe arriba; (b) investigar material supuesto de PPSRP con el anticuerpo, en donde la fijación específica del anticuerpo al material indica la presencia de una PPSRP potencialmente nueva; y (c) identificar a partir del material fijado una nueva PPSRP en comparación con PPSRP conocidas. Alternativamente, puede utilizarse hibridación con sondas de ácido nucleico como se ha descrito arriba para identificar nuevos ácidos nucleicos de PPSRP.

La presente invención proporciona también métodos para la modificación de la tolerancia al estrés de una planta que comprenden modificar la expresión de una proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasa-quinasas (PPSRP) en la planta, en donde la PPARP es como se describe más adelante. La invención estipula que este método puede realizarse de tal modo que la tolerancia al estrés se aumenta o se reduce.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con líneas PpPPasa-1 transgénicas y de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sal con líneas PpPPasa-1 transgénicas y de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La secuencia parcial de cDNA de PPasa-1 de Physcomitrella patens se muestra en SEQ ID NO: 1.

La secuencia de longitud total de cDNA de PPasa-1 de Physcomitrella patens se muestra en SEQ ID NO: 2.

La secuencia de aminoácidos deducida de PPasa-1 de Physcomitrella patens SEQ ID NO: 3.

Descripción detallada de la invención

La presente invención puede comprenderse más fácilmente por referencia a la descripción detallada siguiente de las realizaciones preferidas de la invención y los ejemplos incluidos en esta memoria. Sin embargo, antes de exponer y describir los presentes compuestos, composiciones y métodos, debe entenderse que esta invención no está limitada a ácidos nucleicos específicos, polipéptidos específicos, tipos de células específicas, células hospedadoras específicas, condiciones específicas, métodos específicos, etc., dado que los mismos pueden, por supuesto, variar, y las numerosas modificaciones y variaciones en ellos serán evidentes para los expertos en la técnica. Debe entenderse también que la terminología utilizada en esta memoria tiene por objeto únicamente describir realizaciones específicas y no pretende ser limitante. En particular, la designación de la frecuencia de aminoácidos como ``Proteínas Relacionadas con el Estrés por Pirofosfatasas (PPSRPs), no limita en modo alguno la funcionalidad de dichas
secuencias.

La presente invención proporciona una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de PPSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta y en donde la PPSRP se define en SEQ ID NO: 3. La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de PPSRP, en donde la semilla contiene el ácido nucleico codificante de PPSRP como se define más adelante, y en donde la planta es progenie real para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica que expresa una PPSRP, en donde la semilla contiene la PPSRP como se define más adelante, y en donde la planta es progenie real para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona adicionalmente el uso de cualquiera de las plantas transgénicas descritas anteriormente o más adelante, para la fabricación de un producto agrícola.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "variedad" hace referencia un grupo de plantas dentro de una especie que comparten caracteres constantes que las separan de la forma típica y de otras posibles variedades dentro de dicha especie. Si bien posee al menos un rasgo distintivo, una variedad se caracteriza también por cierta variación entre los individuos comprendidos en la variedad, basada fundamentalmente en la segregación mendeliana de rasgos entre la progenie de las generaciones sucesivas. Se considera que una variedad "es progenie real" para un rasgo particular si la misma es genéticamente homocigótica para dicho rasgo en tal grado que, cuando la variedad que se reproduce realmente se autopoliniza, no se observa una cantidad significativa de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la presente invención, el rasgo se origina por la expresión del transgén de una secuencia simple de DNA introducida en una variedad de planta.

La invención proporciona adicionalmente una PPSRP aislada como se define en SEQ ID NO: 3. Es un nuevo descubrimiento de la presente invención que esta pirofosfatasa está implicada en la tolerancia de las plantas al estrés, y que la expresión de esta proteína en una planta puede aumentar la tolerancia de la planta al estrés. La invención proporciona adicionalmente ejemplos específicos de PPSRP, y ácidos nucleicos codificantes de PPSRP, tales como PPasa-1, en donde la PPSRP es una pirofosfatasa-1 (PPasa-1) como se define en SEQ ID NO: 3, y homólogos de la misma. Homólogos de secuencias de aminoácidos se definen más adelante.

La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico codificante de PPSRP aislado en donde la PPSRP es una pirofosfatasa-1 (PPasa-1) como se define en SEQ ID NO: 3. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico codificante de PPSRP es ácido nucleico codificante de pirofosfatasa-1 (PPasa-1) como se define en SEQ ID NO: 2, y homólogos del mismo. Homólogos de secuencias de nucleótidos se definen más adelante. La presente invención incluye ácidos nucleicos codificantes de PPSRP que codifican PPSRPs como se describe en esta memoria.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico es un ácido nucleico codificante de pirofosfatasa-1 (PPasa-1) como se define en SEQ ID NO: 2. En una realización preferida, el ácido nucleico y la proteína se aíslan del género de plantas Physcomitrella. En otra realización preferida, el ácido nucleico y la proteína proceden de una planta Physcomitrella patens (P. patens).

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "estrés ambiental" hace referencia a cualquier condición de crecimiento sub-óptima e incluye, pero sin carácter limitante, condiciones sub-óptimas asociadas con salinidad, sequía, temperatura, metales, productos químicos, patógenos y oxidantes, o combinaciones de los mismos. En realizaciones preferidas, el estrés ambiental puede ser salinidad, sequía, y temperatura, o combinaciones de las mismas, y en particular, puede ser salinidad alta, contenido de agua bajo y temperatura baja. Debe entenderse también que, tal como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un" o "uno" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se utilice. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que puede utilizarse al menos una célula.

De acuerdo con los propósitos de esta invención, tal como se materializa y se describe ampliamente en esta memoria, esta invención, en un aspecto, proporciona un ácido nucleico aislado de un musgo codificante de una Proteína Relacionada con el Estrés (SRP), o una porción del mismo. En particular, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican PPSRPs con inclusión de la secuencia de ácido nucleico que se muestra en SEQ ID NO: 2. La presente invención proporciona también secuencias de aminoácidos de PPSRPs que incluyen la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 3. como se ha mencionado arriba, la presente invención describe por primera vez la proteína pirofosfatasa-1 (PPasa-1) de P. patens predicha. La presente invención describe también por primera vez que la proteína pirofosfatasa-1 (PPasa-1) de P. patens es útil para aumentar la tolerancia en plantas al
estrés.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, v.g., una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, o una porción de la misma, puede aislarse utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencias proporcionada en esta memoria. Por ejemplo, un cDNA de PPSRP de P. patens puede aislarse a partir de una genoteca de P. patens utilizando la totalidad o una parte de una de las secuencias de SEQ ID NO: 1 como sonda de hibridación y técnicas de hibridación estándar (v.g., como se describe en Sambrook et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Además, una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de la secuencia de SEQ ID NO: 1 puede aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores oligonucleotídicos diseñados basándose en esta secuencia (v.g. una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de la secuencia de SEQ ID NO: 1 puede aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores oligonucleotídicos diseñados basándose en esta misma secuencia de SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, puede aislarse mRNA a partir de células vegetales (v.g., por el procedimiento de extracción con tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al. 1979 Biochemistry 18:5294-5299) y puede prepararse cDNA utilizando transcriptasa inversa (v.g., transcriptasa inversa MLV de Moloney, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa de AMV, disponible de Seikagaku America, Inc. St. Petersburg, FL). Iniciadores oligonucleotídicos sintéticos para amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa puede diseñarse basándose en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 1. Una molécula de ácido nucleico de la invención puede amplificarse utilizando cDNA o, alternativamente, DNA genómico, como molde e iniciadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas estándar de amplificación por PCR. La molécula de ácido nucleico así amplificada puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de la secuencia de DNA. Adicionalmente, oligonucleótidos correspondientes a una secuencia nucleotídica de PPSRP pueden prepararse por técnicas de síntesis estándar, v.g., utilizando un sintetizador automático de DNA.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 2. La secuencia de SEQ ID NO: 2 corresponde al cDNA de PPSRP de Physcomitrella patens de la invención. Este cDNA comprende secuencias que codifican PPSRPs (es decir, la "región codificante", indicada en la Tabla 1), así como secuencias 5' no traducidas y secuencias 3' no traducidas. Por consiguiente, debe entenderse que SEQ ID NO: 2 comprende tanto regiones codificantes como regiones 5' y 3' no traducidas. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede comprender únicamente la región codificante de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 2, o puede contener fragmentos genómicos enteros aislados de DNA genómico. Una región codificante de estas secuencias se indica como "posición ORF".

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 2, o una porción de la misma. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria para la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 2 es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 2, de tal modo que puede hibridarse a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 2, formando con ello un dúplex estable.

En otra realización preferida adicional, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 50-60%, con preferencia al menos aproximadamente 60-70%, de modo más preferible al menos aproximadamente 70-80%, 80-90%, 90-95%, y de modo todavía más preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 2, o una porción de la misma. En una realización preferida adicional, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida (v.g., se hibrida en condiciones severas, a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 2, o una porción de la misma. Estas condiciones de hibridación incluyen lavado con una solución que tiene una concentración de sal de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 a aproximadamente 60ºC.

Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solamente una porción de la región codificante de la secuencia en SEQ ID NO: 2, por ejemplo un fragmento que puede ser utilizado como sonda o iniciador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de una PPSRP. Las secuencias de nucleótidos determinadas por la clonación de los genes PPSRP de P. patens permite la generación de sondas e iniciadores diseñados para uso en identificación y/o clonación de PPSRP homólogas en otros tipos de células y organismos, así como homólogos de PPSRP de otros musgos o especies afines. Por consiguiente, esta invención proporciona también compuestos que comprenden las moléculas de ácido nucleico descritas en esta memoria, o fragmentos de las mismas. Estos compuestos incluyen las moléculas de ácido nucleico unidas a un resto. Estos restos incluyen, pero sin carácter limitante, restos de detección, restos de hibridación, restos de purificación, restos de suministro, restos de reacción, restos de fijación, y análogos. La sonda/iniciador comprende típicamente un oligonucleótido sustancialmente aislado. El oligonucleótido comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas a al menos aproximadamente 12, con preferencia aproximadamente 25, de modo más preferible aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena de sentido de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 2, una secuencia anti-sentido de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 2, o mutantes de las mismas existentes naturalmente. Los iniciadores basados en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 pueden utilizarse en reacciones PCR para clonar homólogos de PPSRP. Sondas basadas en las secuencias nucleotídicas de PPSRP pueden utilizarse para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas, o proteínas homólogas. En realizaciones preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo marcador unido a ella, pudiendo ser el grupo marcador v.g. un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor enzimático. Tales sondas pueden utilizarse como parte de un kit de ensayo de marcadores genómicos para identificación de células que expresan una PPSRP, por ejemplo por medida del nivel de un ácido nucleico codificante de PPSRP en una muestra de células, v.g., detección de niveles de mRNA de PPSRP o determinación de si un gen genómico de PPSRP ha sufrido mutación o deleción.

En particular, un método útil para averiguar el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de mRNA disponible para traducción al producto génico) es la realización de una transferencia Northern (para referencia véase, por ejemplo, Ausubel et al. 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York, en el cual un iniciador diseñado para fijarse al gen de interés se marca con un identificador detectable (usualmente radiactivo o quimioluminiscente), de tal modo que cuando el RNA total de un cultivo del organismo se extrae, se pasa sobre gel, se transfiere a una matriz estable y se incuba con esta sonda, la fijación y la cantidad de fijación de la sonda indica la presencia y también la cantidad de mRNA para este gen. Esta información demuestra al menos parcialmente el grado de transcripción del gen transformado. El RNA celular total puede prepararse a partir de células, tejidos u órganos por varios métodos, todos ellos bien conocidos en la técnica, tales como el descrito en Bormann, E.R. et al. 1992 Mol. Microbiol. 6:317-326.

Para evaluar la presencia o cantidad relativa de proteína traducida a partir de este mRNA, pueden emplearse técnicas estándar, tales como una transferencia Western (véase, por ejemplo, Ausubel et al. 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York). En este proceso, las proteínas celulares totales se extraen, se separan por electroforesis en gel, se transfieren a una matriz tal como nitrocelulosa, y se incuban con una sonda, tal como un anticuerpo, que se fija específicamente a la proteína deseada. Esta sonda se marca generalmente con un identificador quimioluminiscente o colorimétrico que puede ser detectado fácilmente. La presencia y cantidad de identificador observada indica la presencia y cantidad de la proteína mutante deseada presente en la célula.

En una realización, la molécula del ácido nucleico de la invención codifica una proteína o porción de la misma que incluye una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 tal que la proteína o porción de la misma mantiene la misma función o una función similar que la secuencia de aminoácidos con la que se compara. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "suficientemente homóloga" hace referencia a proteínas o porciones de las mismas que tienen secuencias de aminoácidos que incluyen un número mínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes (v.g., un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar a un residuo de aminoácido en uno de los ORFs de una secuencia de SEQ ID NO: 3) a una secuencia de aminoácidos de PPSRP tal que la proteína o porción de la misma es capaz de participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente puede participar como una pirofosfatasa en caminos de transducción de señales implicados en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta Physcomitrella patens. Ejemplos de tales actividades se describen también en esta memoria. Ejemplos de actividades de PPSRP se indican en la Tabla 1.

En otra realización, la proteína es al menos aproximadamente 50-60%, con preferencia al menos aproximadamente 60-70%, y de modo más preferible al menos aproximadamente 70-80%, 80-90%, 90-95%, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia entera de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 3. En otra realización adicional, al menos aproximadamente 50-60%, con preferencia al menos aproximadamente 60-70%, y de modo más preferible al menos aproximadamente 70-80%, 80-90%, 90-95%, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia entera de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO: 2.

Las porciones de proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico PPSRP de la invención son con preferencia porciones biológicamente activas de una de las PPSRPs. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "porción biológicamente activa de una PPSRP" tiene por objeto incluir una porción, v.g., un dominio/motivo, de una PPSRP que participa en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente participa como una pirofosfatasa en caminos de transducción de señales implicados en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o tiene una actividad como la indicada en la Tabla 1. Para determinar si una PPSRP o una porción biológicamente activa de la misma puede participar como una fosfatasa en caminos de transducción de señales implicados en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, puede realizarse un análisis de estrés de una planta que expresa la PPSRP. Tales métodos de análisis son bien conocidos por los expertos en la técnica, como se detalla en el Ejemplo 7.

Fragmentos adicionales de ácido nucleico que codifican porciones biológicamente activas de una PPSRP pueden prepararse por aislamiento de una porción de una de las secuencias en SEQ ID NO: 3, expresión de la porción codificada de la PPSRP o péptido (v.g., por expresión recombinante in vitro) y evaluación de la actividad de la porción codificada de la PPSRP o péptido.

La invención abarca adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia nucleotídica que se muestra en SEQ ID NO: 2 (y porciones de la misma) debido a la degeneración del código genético y codifican por tanto la misma PPSRP que la codificada por las secuencias nucleotídicas que se muestran en SEQ ID NO: 2. En una realización adicional, la molécula de ácido nucleico de la invención codifica una proteína de Physcomitrella patens de longitud total que es sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos de un polipéptido representado en SEQ ID NO: 3.

Además de la secuencia nucleotídica de PPSRP de Physcomitrella patens que se muestra en SEQ ID NO: 2, será apreciado por los expertos en la técnica que polimorfismos de secuencia de DNA que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de PPSRPs pueden existir dentro de una población (v.g., la población de Physcomitrella patens). Dicho polimorfismo genético en el gen de PPSRP puede existir entre individuos dentro de una población debido a la variación natural. Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "gen" y "gen recombinante" hacen referencia a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica una PPSRP, preferiblemente una PPSRP de Physcomitrella patens. Tales modificaciones naturales pueden dar como resultado típicamente una variación del 1 al 5% en la secuencia de nucleótidos del gen de PPSRP. Cualquiera y la totalidad de tales variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes en una PPSRP que son el resultado de la variación natural y que no alteran la actividad funcional de las PPSRPs deben considerarse dentro del alcance de la invención.

Moléculas de ácido nucleico que corresponden a variantes naturales y homólogos no pertenecientes a Physcomitrella patens del cDNA de PPSRP de Physcomitrella patens de la invención pueden aislarse basándose en su homología con el ácido nucleico de PPSRP de Physcomitrella patens descrito en esta memoria utilizando el cDNA de Physcomitrella patens, o una porción del mismo, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación en condiciones de hibridación severas. De acuerdo con ello, en otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene al menos una longitud de 15 nucleótidos y se hibrida en condiciones severas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, el ácido nucleico tiene al menos una longitud de 30, 50, 100, 250 o más nucleótidos. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "se hibrida en condiciones severas" tiene por objeto describir condiciones para hibridación y lavado en las cuales secuencias de nucleótidos que son homólogas al menos en un 60% unas a otras se mantienen típicamente hibridadas unas a otras. Preferiblemente, las condiciones son tales que secuencias que son al menos aproximadamente 65%, de modo más preferible al menos aproximadamente 70%, y de modo todavía más preferible al menos aproximadamente 75% o más homólogas unas a otras se mantienen típicamente hibridadas unas a otras. Tales condiciones severas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). Un ejemplo no limitante preferido de condiciones severas de hibridación son hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en 0,2 x SSC, 0,1% SDS a 50-65ºC. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que se hibrida en condiciones severas a una secuencia de SEQ ID NO: 2 corresponde a una molécula de ácido nucleico existente naturalmente. Tal como se utiliza en esta memoria, una molécula de ácido nucleico "existente naturalmente" hace referencia a una molécula de RNA o DNA que tiene una secuencia de nucleótidos que existe en la naturaleza (v.g., codifica una proteína natural). En una realización, el ácido nucleico codifica una PPSRP de Physcomitrella patens.

Además de variantes de la secuencia de PPSRP existentes naturalmente que pueden existir en la población, el técnico experto apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios por mutación en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, conduciendo con ello a cambios en la secuencia de aminoácidos de la PPSRP codificada, sin alterar la capacidad funcional de la PPSRP. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en una secuencia de SEQ ID NO: 2. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse en la secuencia de tipo salvaje de la PPSRP (SEQ ID NO: 3) sin alterar la actividad de dicha PPSRP, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad de PPSRP. En cambio, otros residuos de aminoácidos (v.g. aquéllos que no están conservados o están sólo semi-conservados en el dominio que tiene actividad de PPSRP) pueden no ser esenciales para la actividad y por consiguiente son probablemente susceptibles de alteración sin alterar la actividad de PPSRP.

De acuerdo con ello, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican PPSRPs que contienen cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad de PPSRP. Tales PPSRPs difieren en secuencia de aminoácidos de una secuencia contenida en SEQ ID NO: 3, pero retienen al menos una de las actividades de PPSRP descritas en esta memoria. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 50% homóloga a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y es capaz de participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente participa como una pirofosfatasa en caminos de transducción de señales implicados en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta Physcomitrella patens, o tiene una o más actividades indicadas en la Tabla 1. Preferiblemente, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico es homóloga al menos en un 50-60% a una de las secuencias de SEQ ID NO: 3, de modo más preferible homóloga al menos aproximadamente en un 60-70% a una de las secuencias de SEQ ID NO: 3, de modo todavía más preferible homóloga al menos aproximadamente en un 70-80%, 80-90%, 90-95% a la secuencia de SEQ ID NO: 3, y de modo muy preferible homóloga al menos aproximadamente en un 96%, 97%, 98%, ó 99% a la secuencia de SEQ ID NO: 3.

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos (v.g., la secuencia de SEQ ID NO: 3 y una forma mutante de la misma) o de dos ácidos nucleicos, se alinean las secuencias para propósitos de comparación óptima (v.g., pueden introducirse lagunas en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para alineación óptima con la otra proteína o ácido nucleico). Se comparan luego los residuos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en una secuencia (v.g. la secuencia de SEQ ID NO: 3) está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la otra secuencia (v.g., una forma mutante de la secuencia seleccionada del polipéptido SEQ ID NO: 3), entonces las moléculas son homólogas en dicha posición (es decir, tal como se utiliza en esta memoria, "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de homología entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % homología = números de posiciones idénticas/números de posiciones totales x 100). Preferiblemente, la longitud de comparación de las secuencias es al menos 15 residuos de aminoácidos, más preferente al menos 25 residuos de aminoácidos, y muy preferiblemente al menos 35 residuos de aminoácidos.

Alternativamente, puede realizarse una determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido y no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877). Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAS de Altschul et al. (1990 J. Mol. Biol. 215:403-410). Las búsquedas de ácidos nucleicos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de ácido nucleico homólogas a las moléculas de ácido nucleico PPSRP de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, registro = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las PPSRPs de la presente invención. Para obtener alineaciones con lagunas para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al (1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden emplearse los parámetros por defecto de los programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS 1989). Un algoritmo de este tipo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparación de secuencias de aminoácidos, puede utilizarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad de laguna de 4 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las PPSRPs de la presente invención. Para obtener alineaciones con lagunas para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al (1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden emplearse los parámetros por defecto de los programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS 1989). Un algoritmo de este tipo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparación de secuencias de aminoácidos, puede utilizarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad de laguna de 4.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una PPSRP homóloga a una secuencia de proteína de SEQ ID NO: 3 puede crearse por introducción de una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en una secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 2 de tal modo que se introducen en la proteína codificada una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Pueden introducirse mutaciones en la secuencia de SEQ ID NO: 2 por técnicas estándar, tales como mutagénesis orientada y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se hacen sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos predichos de aminoácidos no esenciales. Una "sustitución conservadora de aminoácido" es una en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales ácidas (v.g., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidos (v.g., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares desprovistas de carga (v.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (v.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (v.g., treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (v.g., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en una PPSRP se reemplaza preferiblemente por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. alternativamente, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o una parte de una secuencia codificante de PPSRP, por ejemplo por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden investigarse respecto a una actividad de PPSRP descrita en esta memoria para identificar mutantes que retienen la actividad de PPSRP. Después de la mutagénesis de la secuencia de SEQ ID NO: 2, la proteína codificada puede expresarse recombinantemente y puede determinarse la actividad de la proteína por análisis de la tolerancia al estrés de una planta que expresa la proteína como se describe en el
Ejemplo 7.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican PPSRPs arriba descritas, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido respecto de ellas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "de sentido" que codifica una proteína, v.g., complementaria a la cadena codificante de una molécula de cDNA bicatenario o complementaria a una secuencia de mRNA. De acuerdo con ello, un ácido nucleico antisentido puede estar unido por enlaces de hidrógeno a un ácido nucleico de sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificante de PPSRP entera, o solamente a una porción de la misma. En una realización, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido para una "región codificante" de la cadena codificante de una secuencia nucleotídica que codifica una PPSRP. La expresión "región codificante" hace referencia a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos (v.g., la región codificante entera de ,,,,, comprende los nucleótidos 1 a ....). En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido para una "región no codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica PPSRP. La expresión "región no codificante" hace referencia a secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante que no se traducen en aminoácidos (es decir, a las que se hace referencia también como regiones 5' y 3' no traducidas).

Dadas las secuencias de cadena codificante que codifican PPSRP descritas en esta memoria (v.g., la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2), pueden diseñarse ácidos nucleicos antisentido de la invención de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificante entera de mRNA de PPSRP, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido para sólo una porción de la región codificante o no codificante de mRNA de PPSRP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario para la región que rodea el sitio de comienzo de la traducción de mRNA de PPSRP. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente una longitud de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos. Un ácido nucleico antisentido de la invención puede construirse utilizando síntesis química y reacciones de ligación enzimáticas empleando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (v.g., un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente utilizando nucleótidos existentes naturalmente o nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y de sentido, v.g., pueden utilizarse derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosil-queosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metil-tio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)-uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el RNA transcrito a partir de ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito ulteriormente en la subsección siguiente).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención se administran típicamente a una célula o se generan in situ de tal modo que las mismas se hibridan con o se fijan a mRNA celular y/o DNA genómico que codifica una PPSRP para inhibir con ello la expresión de la proteína, v.g., por inhibición de la transcripción y/o traducción. La hibridación puede realizarse por complementariedad convencional de nucleótidos para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se fija a dúplex de DNA, por interacciones específicas en la hendidura mayor de la doble hélice. La molécula antisentido puede modificarse de tal manera que la misma se fije específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una superficie seleccionada de la célula (v.g., por enlace de la molécula de ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo que se fija a un receptor o antígeno de la superficie celular. La molécula de ácido nucleico antisentido puede suministrarse también a células utilizando los vectores descritos en esta memoria. Para alcanzar concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren constructos de vectores en los cuales la molécula de ácido nucleico antisentido está puesta bajo el control de un promotor fuerte procariota, vírico, o eucariota (con inclusión de promotores vegetales).

En otra realización adicional, la molécula de ácido nucleico antisentido de la invención es una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos específicos bicatenarios con RNA complementario en los cuales, contrariamente a las unidades \beta usuales, las cadenas corren paralelas una a otra (Gaultier et al. 1987 Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender también un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue et al. 1987 Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo quimérico RNA-DNA (Inoue et al. 1987 FEBS Lett. 215:327-330).

En otra realización adicional, un ácido nucleico antisentido de la invención es una ribozima. Las ribozimas son moléculas catalíticas de RNA con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un mRNA, para el cual tienen aquéllas una región complementaria. Así, pueden utilizarse ribozimas (v.g., ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988 Nature 334:585-591)) para escindir catalíticamente transcritos de mRNA de PPSRP par inhibir con ello la traducción de mRNA de PPSRP. Una ribozima que tenga especificidad para un ácido nucleico codificante de PPSRP puede diseñarse basándose en la secuencia nucleotídica de un cDNA de PPSRP descrito en esta memoria (a saber, SEQ ID NO: 2) o basándose en una secuencia heteróloga que puede aislarse de acuerdo con métodos expuestos en esta invención. Por ejemplo, puede construirse un derivado de RNA de Tetrahymena IVS L-19 en donde la secuencia nucleotídica del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos a escindir en un mRNA codificante de PPSRP. Véase, v.g., Cech et al. Patente U.S. No. 4.987.071 y Cech et al. Patente U.S. No. 5.116.742. Alternativamente, puede utilizarse mRNA de PPSRP para seleccionar un RNA catalítico que tiene una actividad específica de ribonucleasa a partir de una agrupación de moléculas de RNA. Véase, v.g., Bartel, D. Y Szostak, J.W., 1993 Science 261:1411-1418.

Alternativamente, la expresión de genes de PPSRP puede inhibirse por direccionamiento de secuencias nucleotídicas complementarias a la región reguladora de una secuencia nucleotídica de PPSRP (v.g., un promotor y/o intensificador de PPSRP) para formar estructuras de triple hélice que previenen la transcripción de un gen de PPSRP en células diana. Véase generalmente, Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene C. et al. 1992 Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L.J. 1992 Bioassays 14(12):807-15.

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico como se describe arriba, en donde la expresión del vector en una célula hospedadora da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "vector" hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado la misma. Un tipo de vector es un "plásmido", término que hace referencia a un bucle circular de DNA bicatenario al cual pueden estar ligados segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el cual pueden estar ligados segmentos adicionales de DNA al genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una células hospedadora en donde se han introducido (v.g., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (v.g., vectores de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedadora por introducción en la célula hospedadora, y con ello se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. Se hace referencia en esta memoria a tales vectores como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de DNA recombinante se encuentran a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente, dado que el plásmido es la forma de vector utilizada más frecuentemente. Sin embargo, la invención tiene por objeto incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (v.g., retrovirus deficientes en replicación, aderovirus y virus adeno-asociados), que desempeñan funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión de ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedadoras a utilizar para la expresión, que está(n) enlazada(s) operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, el término "enlazado operativamente" tiene por objeto dar a entender que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la o las secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica (v.g., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector está introducido en la célula hospedadora). El término "secuencia reguladora" tiene por objeto incluir promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión (v.g., señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) o véase: Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, compiladores Glick y Thompson, capítulo 7, 89-108, CRC Press Boca Raton, Florida, con inclusión de las referencias citadas en dicho lugar. Secuencias reguladoras incluyen aquéllas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y aquéllas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en ciertas células hospedadoras o en ciertas condiciones. Será apreciado por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención puede introducirse en células hospedadoras para producir de este modo proteínas o péptidos, con inclusión de proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como los descritos en esta memoria (v.g., PPSRPs, formas mutantes de PPSRPs, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para la expresión de PPSRPs en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, pueden expresarse genes de PPSRP en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura y otras células fúngicas (véase Romanos, M.A. et al. 1192 Foreign Gene Expression in Yeast: a Review, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. 1991 Heterologous Gene Expression in Filamentous Fungi, en: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, compiladores, p. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J., 1991 Gene Transfer Systems and Vector Development for Filamentous Fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al. compiladores, p. 1-28: Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al. 1991 Marine Biotechnology 1(3): 239-251), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, y Stylonychia, especialmente del género Stylonychia lemnae con vectores siguiendo un método de transformación como se describe en el documento WO 98/01572 y células de plantas multicelulares (véase Schmidt, R. y Willmitzer, L., 1988 High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583-586); Plan Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, capítulo 6/7, S. 71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes, et al. Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants Vol. 1, Engineering and Utilization, compiladores Kung y R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1992 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42:205-225 y las referencias citadas en dicho lugar) o células de mamífero. Células hospedadoras adecuadas se exponen con mayor detalle en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.

Cinta No. 32-33

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo en la mayoría de los casos con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas, sean o no proteínas de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada en ellos, usualmente al término amino de la proteína recombinante, pero también al término C o fusionados dentro de regiones adecuadas en las proteínas. Tales vectores de fusión desempeñan típicamente tres finalidades: 1) aumentar la expresión de proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar a la purificación de la proteína recombinante por actuar como ligando en purificación por afinidad. A menudo, se introduce en los vectores de expresión de fusión un sitio de escisión proteolítico en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante de la proteína de fusión subsiguientemente a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Jonson, K.S., 1988 Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutatión-S-transferasa (GST), proteína E de fijación de maltosa, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana. En una realización, la secuencia codificante de la PPSRP se clona a un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica una proteína de fusión que comprende, desde el término N al término C, GSC-sitio de escisión de trombina-proteína X. la proteína de fusión puede purificarse por cromatografía de afinidad utilizando glutatión-resina de agarosa. La PPSRP recombinante no fusionada a GST puede recuperarse por escisión de la proteína de fusión con trombina.

Ejemplos de vectores de expresión de E coli inducibles adecuados que no son proteínas de fusión incluyen pTrc (Amann et al. 1988 Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión de un gen diana por el vector pTrc está basada en la transcripción por la RNA-polimerasa del hospedador a partir de un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión del gen diana por el vector pET 11d está basada en la transcripción de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediada por una RNA-polimerasa vírica co-expresada (T7 gn1). Esta polimerasa vírica es suministrada por las cepas hospedadoras BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago \lambda residente que alberga un gen T7 gn1 bajo el control de transcripción del promotor lacUV 5.

Una experiencia para maximizar la expresión de proteínas recombinantes es expresar la proteína en una bacteria hospedadora con una capacidad deteriorada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia consiste en alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión de tal modo que los codones individuales para cada aminoácido sean los utilizados preferentemente en la bacteria elegida para expresión, tal como C. glutamicum (Wada et al. 1992 Nucleic Acids Res. 20:2111-218). Una alteración de este tipo de las secuencias de ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo por técnicas estándar de síntesis de DNA.

En otra realización, el vector de expresión de PPSRP es un vector de expresión de levadura. Ejemplo de vectores para expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al. 1987 Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982 Cell 30:933-943, pJRY88 (Schultz et al. 1987 Gene 54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San diego, CA). Vectores y métodos para la construcción de vectores apropiados para uso en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen los detallados en: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) ``Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al. compiladores, p. 1-28, Cambridge University Press, Cambridge.

Alternativamente, las PPSRPs de la invención pueden expresarse en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Vectores de baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (v.g., células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith et al. 1983 Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989 Virology 170:31-39).

En otra realización adicional, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero utilizando vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B., 1987 Nature 329-840) y pMT2PC (Kaufman et al. 1987 EMBO J. 6:187-195). Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión son proporcionadas a menudo por elementos reguladores víricos. Por ejemplo, promotores utilizados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus 40 de los Simios. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como para células eucariotas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsh, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En otra realización, el vector de expresión recombinante de mamífero es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (v.g., se utilizan elementos reguladores específicos de tejidos para expresar el ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tejidos se conocen en la técnica. Ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejidos adecuados incluyen el promotor albúmina (específico del hígado; Pinkert et al. 1987 Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos linfoides (Calame y Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de las células T (Winoto y Baltimore, 1989 EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. 1983 Cell 33:729-740; Queen y Baltimore, 1983 Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (v.g., el promotor de neurofilamentos; Birne y Ruddle, 1989 PNAS 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund et al. 1985 Science 230:212-216), y promotores específicos de las glándulas mamarias (v.g., promotor de lactosuero; Patente U.S. No. 4.873.316 y Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 264166). Están abarcados también promotores regulados por el desarrollo, por ejemplo los promotores murinos hox (Kessel y Gruss, 1990 Science 249:374-379) y el promotor de fetoproteína (Campes y Tilghman, 1989 Genes Dev. 3:537-546).

En otra realización, las PPSRPs de la invención pueden expresarse en células de plantas unicelulares (tales como algas) (véase Falciatore et al. 1999 Marine Biotechnology 1(3):239-251 y la referencias citadas en dicho lugar) y células vegetales de plantas superiores (v.g., las espermatofitas, tales como plantas de cosecha). Ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen los detallados en: Becker, D. Kemper, E. Schell, J. y Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; y Bevan, M.W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, compiladores: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

Una casete de expresión de planta contiene preferiblemente secuencias reguladoras capaces de impulsar la expresión génica en células vegetales y que están enlazadas operativamente de tal manera que cada secuencia puede cumplir su función, por ejemplo, terminación de la transcripción por señales de poliadenilación. Señales de poliadenilación preferidas son aquéllas que proceden de t-DNA de Agrobacterium tumefaciens tales como el gen 3 conocido como ortopina-sintasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al. 1984 EMBO J. 3:835 o equivalentes funcionales del mismo pero también son adecuados todos los restantes terminadores funcionalmente activos en plantas.

Dado que en muchos casos la expresión de genes vegetales no está limitada a los niveles de la transcripción, una casete de expresión en plantas contiene preferiblemente otras secuencias enlazadas operativamente como intensificadores de la traducción, tales como la secuencia multiplicadora de la velocidad ("overdrive") que contiene la secuencia conductora 5' no traducida del virus del mosaico del tabaco que intensifica la relación de proteína por RNA (Gallie et al. 1987 Nucl. Acids Research 15:8693-8711).

La expresión de genes de plantas tiene que estar enlazada operativamente a un promotor apropiado que confiere la expresión génica de una manera oportuna específica de las células o los tejidos. Se prefieren promotores que dirigen la expresión constitutiva (Benfey et al. 1989 EMBO J. 8:2195-2202) como los derivados de virus de plantas tales como el CAMV 35S (Franck et al. 1980 Cell 21:285-294), el CaMV 19S (véase también la patente U.S. No. 5352605 y el documento WO 8402913) o promotores de plantas tales como los de la subunidad pequeña de Rubisco descrita en la patente U.S. No. 4962028.

Otras secuencias preferidas para uso en casetes de expresión de enes de plantas son secuencias de direccionamiento necesarias para dirigir el producto génico a su compartimiento celular apropiado (para revisión, véase Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15(4):285-423 y las referencias citadas en dicho lugar) tales como la vacuola, el núcleo, todos los tipos de plástidos tales como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, la mitocondria, el retículo endoplásmico, los cuerpos aceitosos, peroxisomas y otros compartimientos de las células vegetales. La expresión del gen vegetal puede ser facilitada también por un promotor inducible (para revisión, véase Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Son especialmente adecuados los promotores inducibles químicamente si se quiere que la expresión génica tenga lugar de una manera específica en el tiempo. Ejemplo de tales promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (documento WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al. 1992 Plant J. 2:397-404) y un promotor inducible por etanol (WO 93/21334).

Asimismo, promotores adecuados que responden a condiciones de estrés biótica o abiótica son aquéllos tales como el promotor del gen PRP1 inducible por patógenos (Ward et al. 1993 Plant Mol. Biol. 22:361-366), el promotor hsp80 del tomate inducible por calentamiento (patente U.S. No. 5187267), el promotor alfa-amilasa de la patata inducible por el frío (documento WO 96/12814) o el promotor pinII inducible por lesión (documento EP 375091). Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío, y sal, tales como el promotor RD29A, véase Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993 Mol. Gen. Genet. 236:332-340).

Se prefieren especialmente aquellos promotores que confieren expresión génica en tejidos y órganos específicos, tales como células de guarda y las células pilosas de la raíz. Promotores adecuados incluyen el promotor del gen napin de la colza (patente U.S. No. 5608152) el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al. 1991 Mol. Gen. Genet. 225(3), 459-67), el promotor oleosina de Arabidopsis (documento WO 9845461), el promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (patente US No. 5504200), el promotor Bce4 de Brassica (documento WO 9113980) o el promotor legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al. 1992 Plant Journal, 2(2):233-9) así como promotores que confieren la expresión específica de semillas en plantas monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Promotores adecuados a citar son el promotor del gen lpt2 o lpt1 de la cebada (documento WO 95/15389 y WO 95/23230) o los descritos en el documento WO 99/16890 (promotores del gen hordeína de la cebada, el gen glutelina del arroz, el gen oricina del arroz, el gen prolamina del arroz, el gen gliadina del trigo, el gen glutelina del trigo, el gen zeína del maíz, el gen glutelina de la avena, el gen kasirina del sorgo y el gen secalina del centeno).

Son también específicamente adecuados promotores que confieren expresión de genes específicos de plástidos, dado que los plástidos son el compartimiento en el que se sintetizan los precursores y algunos productos finales de la biosíntesis de los lípidos. Promotores adecuados son el promotor de RNA-polimerasa vírica descrito en WO 95/16783 y WO 97/06250 y el promotor c1pP de Arabidopsis descrito en el documento WO 99/46394.

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de DNA de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de DNA está enlazada operativamente a una secuencia reguladora de tal manera que permite la expresión (por transcripción de la molécula de DNA) de una molécula de RNA que es antisentido para el mRNA de PPSRP. Pueden seleccionarse secuencias reguladoras enlazadas operativamente a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación antisentido, que dirigen la expresión continua de la molécula de RNA antisentido en una diversidad de tipos de célula. Por ejemplo, pueden seleccionarse promotores y/o intensificadores víricos, o secuencias reguladoras que dirigen la expresión constitutiva, específica de tejido o específica de tipo de célula de RNA antisentido. El vector de expresión antisentido puede encontrarse en la forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en donde los ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia, cuya actividad puede ser determinada por el tipo de célula en el que se introduce el vector. Para una exposición de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido véase Weintraub H. et al. Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986 y Mol et al. 1990 FEBS Letters 268:427-430.

Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedadoras en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se utilizan intercambiablemente en esta memoria. Debe entenderse que dichos términos se refieren no sólo a la célula particular de que se trata, sino que se aplican también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Dado que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula originaria, pero está incluida todavía dentro del alcance del término tal como se utiliza en esta memoria.

Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una PPSRP puede expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto, células fúngicas o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células de plantas, hongos u otros microorganismos tales como C. glutamicum. Otras células hospedadoras adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica.

El DNA vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas por técnicas convencionales de transformación o transfección. Tal como se utiliza en esta memoria los términos "trasformación", "transfección", "conjugación" y "transducción", tienen por objeto hacer referencia a una diversidad de métodos reconocidos en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (v.g., DNA) en una célula hospedadora, con inclusión de coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia mediada por productos químicos y electroporación. Métodos adecuados para transformación o transfección de células hospedadoras con inclusión de células vegetales pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, vol. 44, Agrobacterium protocols, compilador: Gartland y Gavey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Dado que la tolerancia al estrés biótico y abiótico es un rasgo general que debe heredarse deseablemente en una gran diversidad de plantas tales como maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza y canola, mandioca, pimiento, girasol y tagetes, plantas solanáceas tales como patata, tabaco, berenjena, y tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacao, té), especies de Salix, árboles (palma de aceite, cocotero, hierbas perennes y cosechas de forraje forrajeras, estas plantas de cosecha son también plantas diana preferidas para ingeniería genética como una realización adicional de la presente invención.

En particular, la invención proporciona un método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico codificante de PPSRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende: (a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de PPSRP, y (b) generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta, en donde la PPSRP es como se ha descrito arriba. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico codificante de PPSRP es como se ha descrito arriba. La invención proporciona también un método de incrementar la expresión de un gen de interés en una célula hospedadora en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora, en donde el gen de interés se transcribe en respuesta a una PPSRP, que comprende: (a) transformar la célula hospedadora con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de PPSRP, y (b) expresar la PPSRP en la célula hospedadora, incrementando con ello la expresión del gen transcrito en respuesta a la PPSRP en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora. En realizaciones preferidas, la PPSRP es como se ha descrito arriba. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico codificante de la PPSRP es como se ha descrito arriba.

Para dicha transformación de plantas, pueden utilizarse vectores binarios tales como pBinAR (Höfgen y Willmitzer, 1990 Plant Science 66:221-230). La construcción de los vectores binarios puede realizarse por ligación del cDNA en orientación de sentido o antisentido en el T-DNA. 5-prima al cDNA un promotor de planta activa la transcripción del cDNA. Una secuencia de poliadenilación se localiza en posición 3-prima al cDNA. La expresión específica del tejido puede archivarse utilizando un promotor específico de tejido. Por ejemplo, la expresión específica de semillas puede archivarse por clonación del promotor napin o LeB4 o USP5-prima al cDNA. Asimismo, puede utilizarse cualquier otro elemento promotor de semillas específico. Para expresión constitutiva en la planta entera, puede utilizarse el promotor 35S de CaMV. La proteína expresada puede direccionarse a un compartimiento celular utilizando un péptido señal, por ejemplo para plástidos, mitocondria o retículo endoplásmico (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci., 1996 4(15): 285-243). El péptido señal se clona 5-prima en marco al cDNA para archivar la localización subcelular de la proteína de fusión.

La transformación de plantas mediada por Agrobacterium puede realizarse utilizando por ejemplo la cepa GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. La transformación puede realizarse por técnicas de transformación estándar (Deblaere et al. 1994 Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788). En una realización, pueden utilizarse promotores que son sensibles a estados de estrés abióticos con, tales como el promotor RD29A de Arabidopsis, las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria. Un experto en la técnica reconocerá que el promotor utilizado debería estar enlazado operativamente al ácido nucleico de tal modo que el promotor cause la transcripción del ácido nucleico, lo que da como resultado la síntesis de un mRNA que codifica un polipéptido. Alternativamente, el RNA puede ser un RNA antisentido para uso en afectar la expresión subsiguiente del mismo u otro gen o genes.

La transformación de plantas mediada por Agrobacterium puede realizarse utilizando técnicas estándar de transformación y regeneración (Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2ª edición.- Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1925. - en Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotrechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993. -360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, la colza puede transformarse por la vía de transformación de los cotiledones o el hipocotilo (Moloney et al. 1989 Plant Cell Report 8:238-242; De Block et al. 1989 Plant Physiol. 91:694-701). El uso de antibióticos para selección de plantas y Agrobacterium depende del vector binario y de la cepa de Agrobacterium utilizada para la transformación. La selección de colza se realiza normalmente utilizando kanamicina como marcador seleccionable plantas. La transferencia de genes al lino mediada por Agrobacterium puede realizarse utilizando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova et al, 1994 Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente, la transformación de la soja puede realizarse utilizando por ejemplo una técnica descrita en los documentos EP 0 424 047, patente US No 5322783 (Pioneer Hi-Bred International) o en los documentos EP 0 397 687, patente US No. 5376543, y patente US No. 5169770 (Universidad de Toledo).

La transformación de plantas utilizando bombardeo de partículas, absorción de DNA mediada por polietilenglicol o por vía de la técnica de Fibras de Carburo de Silicio ha sido descrita por ejemplo por Freeling y Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: Nueva York (1993) ISBN 3-540-97826-7. Un ejemplo específico de transformación de maíz se encuentra en el documento US 5.990.387, y un ejemplo específico de transformación de trigo puede encontrarse en el documento WO 93/07256.

Para transfección estable de células de mamífero, se sabe que dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, únicamente una pequeña fracción de células puede integrar el DNA extraño en su genoma. Con objeto de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (v.g., resistencia a antibióticos) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato o en plantas que confieren resistencia frente a un herbicida tal como glifosato o glufosinato. Moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable pueden introducirse en una célula hospedadora en el mismo vector que el que codifica una PPSRP o pueden introducirse en un vector separado. Las células transfectadas establemente con la molécula de ácido nucleico introducida pueden identificarse, por ejemplo, por selección de fármacos (v.g., las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Para crear un microorganismo recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen de PPSRP en donde se ha introducido una deleción, adición o sustitución para alterar con ello, v.g., desorganizar funcionalmente, el gen de PPSRP. Preferiblemente, este gen PPSRP es un gen PPSRP de Physcomitrella patens, pero puede ser un homólogo de una planta afín o incluso de una fuente de mamífero, levadura, o insecto. En una realización preferida, el vector se diseña de tal manera que, después de la recombinación homóloga, el gen PPSRP endógeno se desorganiza funcionalmente (es decir, ya no codifica una proteína funcional; a lo que se hace referencia también como un vector con un gen desactivado ("knock-out"). Alternativamente, el vector puede diseñarse de tal modo que, después de la recombinación homóloga, el gen PPSRP endógeno está mutado o alterado de cualquier otro modo pero codifica todavía proteína funcional (v.g., la región reguladora aguas arriba puede estar alterada para alterar con ello la expresión de la PPSRP endógeno). Para crear una mutación puntual por recombinación homóloga, pueden utilizarse híbridos DNA-RNA en una técnica conocida como quimeraplastia (Cole-Strauss et al. 1999 Nucleic Acids Research 27(5): 1323-1330 y Kmiec, 1999 Gene Therapy American Scientist. 87(3): 240-247). Procedimientos de recombinación homóloga en Physcomitrella patens son también bien conocidos en la técnica y se contemplan para uso en esta invención.

Considerando que en el vector de recombinación homóloga, la porción alterada del gen PPSRP está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por moléculas de ácido nucleico adicionales del gen PPSRP que hacen posible que tenga lugar la recombinación homóloga entre el gen PPSRP exógeno transportado por el vector y un gen PPSRP endógeno en un microorganismo o planta. La molécula de ácido nucleico de PPSRP flanqueante adicional tiene suficiente longitud para recombinación homóloga satisfactoria con el gen endógeno. Típicamente, se incluyen en el vector varios centenares de pares de bases hasta kilobases de DNA flanqueante (en ambos extremos 5' y 3') (véase v.g., Thomas, K.R., y Capecchi, M.R., 1987 Cell 51:503 para una descripción de vectores de recombinación homóloga o Strepp et al. 1998 PNAS, 95(8):4368-4373 para recombinación basada en cDNA de Physcomitrella patens). El vector se introduce en un organismo o célula vegetal (v.g., por DNA mediado por polietilenglicol) y se seleccionan las células en las cuales el gen de PPSRP introducido se ha recombinado homólogamente con el gen de PPSRP endógeno, utilizando métodos conocidos en la técnica.

En otra realización, pueden producirse microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen PPSRP en un vector, poniéndolo bajo control del operón lac permite la expresión de PPSRP únicamente en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en la técnica.

Una célula hospedadora de la invención, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede utilizarse para producir (es decir, expresar) una PPSRP. Un método alternativo puede aplicarse adicionalmente en plantas por la transferencia directa de DNA en flores en desarrollo por electroporación o transferencia de genes en medio de Agrobacterium. De acuerdo con ello, la invención proporciona adicionalmente métodos para producir PPSRPs utilizando las células hospedadoras de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la invención (en donde se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una PPSRP, o en cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica una PPSRP de tipo salvaje o alterada) en un medio adecuado hasta que se produce la PPSRP. En otra realización, el método comprende adicionalmente aislar PPSRPs del medio o la célula hospedadora.

Otro aspecto de la invención se refiere a PPSRPs aisladas, y porciones biológicamente activas de las mismas. Una proteína o porción biológicamente activa de la misma "aislada" o "purificada" está exenta de algo del material celular cuando se produce por técnicas de DNA recombinante, o de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de PPSRP en las cuales la proteína se separa de una parte de los componentes celulares de las células en las cuales se produce la misma natural o recombinantemente. En una realización, la expresión "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de PPSRP que tiene menos de aproximadamente 30% (expresado sobre peso seco) de material distinto de PPSRP (a lo que se hace referencia también en esta memoria como una "proteína contaminante"), de modo más preferible menos de aproximadamente 20% de material distinto de PPSRP, de modo todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de material distinto de PPSRP, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de material distinto de PPSRP. Cuando la PPSRP o la porción biológicamente activa del mismo se produce recombinantemente, la misma está también de modo preferible sustancialmente exenta de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, de modo más preferible menos de aproximadamente 10%, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína. La expresión "sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de PPSRP en las cuales la proteína está separada de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, la expresión "sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de PPSRP que tienen menos de aproximadamente 30% (expresado sobre peso seco) de precursores químicos o productos químicos distintos de PPSRP, de modo más preferible menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o productos químicos distintos de PPSRP, de modo todavía más preferido menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos distintos de PPSRP, de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos distintos de PPSRP. En realizaciones preferidas, las proteínas aisladas o porciones biológicamente activas de las mismas carecen de proteínas contaminantes del mismo organismo del que se deriva la PPSRP. Típicamente, tales proteínas se producen por expresión recombinante de, por ejemplo, una PPSRP de Physcomitrella patens en plantas distintas de Physcomitrella patens o microorganismos tales como C. glutamicum, ciliados, algas u hongos.

Una PPSRP aislada o una porción de la misma de la invención puede participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o, más particularmente, puede participar como una pirofosfatasa en caminos de transducción de señales implicados en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta Physcomitrella patens, o tiene una o más de las actividades expuestas en la Tabla 1. En realizaciones preferidas, la proteína o porción de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, de tal modo que la proteína o porción de la misma mantiene la capacidad para participar en el metabolismo de los compuestos necesarios para la construcción de membranas celulares en Physcomitrella patens, o en el transporte de moléculas a través de estas membranas. La porción de la proteína es preferiblemente una porción biológicamente activa como se describe en esta memoria. En otra realización preferida, una PPSRP de la invención tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otra realización preferida adicional, la PPSRP tiene una secuencia de aminoácidos que es codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida, v.g., se hibrida en condiciones severas, a una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. En otra realización preferida adicional, la PPSRP tiene una secuencia de aminoácidos que es homóloga al menos aproximadamente en un 50-60%, con preferencia al menos aproximadamente en un 60-70%, de modo más preferible al menos aproximadamente en un 70-80%, 80-90%, 90-95%, y todavía de modo más preferible al menos aproximadamente en un 96%, 97%, 98%, 99% o más a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Las PPSRPs preferidas de la presente invención poseen también preferiblemente al menos una de las actividades de PPSRP descritas en esta memoria. Por ejemplo, una PPSRP preferida de la presente invención incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida, v.g., se hibrida en condiciones severas, a una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y que puede participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente puede participar como una pirofosfatasa en caminos de transducción de señales implicados en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens, o que tiene una o más de las actividades expuestas en la
Tabla 1.

En otras realizaciones, la PPSRP es sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y retiene la actividad funcional de la proteína de SEQ ID NO: 3, pero difiere en secuencia de aminoácidos debido a la variación natural o mutagénesis, como se describe en detalle anteriormente. De acuerdo con ello, en otra realización, la PPSRP es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga al menos aproximadamente en un 50-60%, con preferencia al menos aproximadamente en un 60-70%, y de modo más preferible al menos aproximadamente en un 70-80%, 80-90%, 90-95%, y de modo muy preferible al menos aproximadamente en un 96%, 97%, 98%, 99% o más a una secuencia entera de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y que tiene al menos una de las actividades de PPSRP descritas en esta memoria. En otra realización, la invención se refiere a una proteína completa de Physcomitrella patens que es sustancialmente homóloga a una secuencia entera de aminoácidos codificada por un ácido nucleico de SEQ ID NO: 2.

Porciones biológicamente activas de una PPSRP incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una PPSRP, v.g., una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos de una proteína homóloga a una PPSRP, que incluyen menos aminoácidos que una PPSRP de longitud total o la proteína de longitud total que es homóloga a una PPSRP, y exhiben al menos una actividad de una PPSRP. Típicamente, porciones biológicamente activas (péptidos, v.g., péptidos que tienen, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 ó más amino-ácidos de longitud) comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de una PPSRP. Además, otras porciones biológicamente activas, en las cuales están delecionadas otras regiones de la proteína, pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse con respecto a una o más de las actividades descritas en esta memoria. Preferiblemente, las porciones biológicamente activas de una PPSRP incluyen uno o más dominios/motivos seleccionados o porciones de los mismos que tienen actividad biológica.

Las PPSRPs se producen preferiblemente por técnicas de DNA recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se clona en un vector de expresión (como se ha descrito arriba), se introduce el vector de expresión en una célula hospedadora (como se ha descrito arriba) y se expresa la PPSRP en la célula hospedadora. La PPSRP puede aislarse luego de las células por un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas. Como alternativa a la expresión recombinante, una PPSRP, un polipéptido o péptido puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos. Además, la PPSRP nativa puede aislarse de células (v.g., Physcomitrella patens), por ejemplo utilizando un anticuerpo anti-PPSRP, que puede producirse por técnicas estándar utilizando una PPSRP o fragmento de la misma de esta invención.

La invención proporciona también proteínas PPSRP quiméricas o de fusión. Tal como se utiliza en esta memoria, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" de PPSRP comprende un polipéptido PPSRP enlazado operativamente a un polipéptido distinto de PPSRP. Un "polipéptido PPSRP" hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una PPSRP, mientras que un "polipéptido distinto de PPSRP" hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la PPSRP, v.g. una proteína que es diferente de la PPSRP y que se deriva del mismo o un organismo diferente. Dentro de la proteína de fusión, el término "enlazado operativamente" tiene por objeto indicar que el polipéptido PPSRP y el polipéptido distinto de PPSRP están fusionados uno a otro de tal modo que ambas secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia utilizada. El polipéptido distinto de PPSRP puede fusionarse al término N o al término C del polipéptido PPSRP. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-PPSRP en donde las secuencias PPSRP están fusionadas al término C de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de PPSRPs recombinantes. En otra realización, la proteína de fusión es una PPSRP que contiene una secuencia señal heteróloga en su término N. En ciertas células hospedadoras (v.g., células hospedadoras de mamífero) la expresión y/o secreción de una PPSRP puede incrementarse por el uso de una secuencia señal heteróloga.

Preferiblemente, una proteína PPSRP quimérica o de fusión de la invención se produce por técnicas estándar de DNA recombinante. Por ejemplo, fragmentos de DNA que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas se ligan unos a otros en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando términos de extremos romos o extremos cohesivos para la ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar términos apropiados, rellenado de los extremos cohesivos en caso apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión indeseable y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de DNA automáticos. Alternativamente, la amplificación PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo utilizando iniciadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden reasociarse y re-amplificarse subsiguientemente para generar una secuencia de gen quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, compiladores Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, están disponibles comercialmente muchos vectores de expresión que codifican ya un resto de fusión (v.g., un polipéptido GST). Un ácido nucleico codificante de PPSRP puede clonarse en un vector de expresión de este tipo de tal modo que el resto de fusión está enlazado en marco a la PPSRP.

Homólogos de la PPSRP pueden generarse por mutagénesis, v.g., mutación de puntos discretos o truncación de la PPSRP. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "homólogo" hace referencia a una forma variante de la PPSRP que actúa como un agonista o antagonista de la actividad de la PPSRP. Un agonista de la PPSRP puede retener sustancialmente la misma, o un subconjunto, de las actividades biológicas de la PPSRP. Un antagonista de la PPSRP puede inhibir una o más de las actividades de la forma existente naturalmente de la PPSRP mediante, por ejemplo, fijación competitiva a un miembro citado aguas abajo o aguas arriba de la cascada metabólica de componentes de la membrana celular que incluye la PPSRP, o por fijación a una PPSRP que media el transporte de compuestos a través de tales membranas, impidiendo con ello que tenga lugar translocación.

En una realización alternativa, pueden identificarse homólogos de la PPSRP por investigación de genotecas combinatorias de mutantes, v.g., mutantes de truncación, de la PPSRP para actividad agonista o antagonista de PPSRP. En una realización, se genera una genoteca diversificada de variantes de PPSRP por mutagénesis combinatoria al nivel del ácido nucleico y se codifica por una genoteca de genes diversificada. Una genoteca diversificada de variantes de PPSRP puede producirse mediante, por ejemplo, ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes tales que puede expresarse una serie degenerada de secuencias potenciales de PPSRP como polipéptidos individuales, o alternativamente, como una serie de proteínas de fusión mayores (v.g., para presentación de fago) que contienen en ellas la serie de secuencias de PPSRP. Existen una diversidad de métodos que pueden utilizarse para producir genotecas de homólogos potenciales de PPSRP a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia de genes degenerada puede realizarse en un sintetizador automático de DNA, y el gen sintético se liga luego a un vector de expresión apropiado. El uso de una serie degenerada de genes permite la provisión, en una mezcla, de la totalidad de las secuencias que codifican la serie deseada de secuencias potenciales de PPSRP. Métodos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, v.g., Narang, S.A., 1983 Tetrahedron 39:3; Itakura et al. 1984 Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. 1984 Science 198:1056; Ike et al. 1983 Nucleic Acid Res. 11:477.

Adicionalmente, pueden utilizarse genotecas de fragmentos de la PPSRP codificante para generar una población diversificada de fragmentos de PPSRP para investigación y selección subsiguiente de homólogos de una PPSRP. En una realización, puede generarse una genoteca de fragmentos de secuencias codificantes por tratamiento de un fragmento PCR bicatenario de una secuencia codificante de PPSRP con una nucleasa en condiciones en las cuales ocurre mellado sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalización del DNA bicatenario, renaturalización del DNA para formar DNA bicatenario que puede introducir pares sentido/antisentido a partir de productos mellados diferentes, eliminación de porciones monocatenarias a partir de los dúplex reformados por tratamiento con nucleasa S1, y ligación de la genoteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por este método, puede derivarse una genoteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales, C-terminales e internos de diversos tamaños de la PPSRP.

Se conocen en la técnica varios métodos para la investigación de productos génicos de genotecas combinatorias preparadas por mutaciones puntuales o truncación, y para investigación de genotecas de cDNA para producto génicos que tengan una propiedad seleccionada. Dichos métodos son adaptables para investigación rápida de las genotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de homólogos de PPSRP. Las técnicas utilizadas más ampliamente, que son aptas para análisis de alta capacidad, para investigación de grandes genotecas de genes incluyen típicamente clonación de la genoteca de genes en vectores de expresión replicables, transformación de células apropiadas con la genoteca de vectores resultante, y expresión de los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se ha detectado. La mutagénesis recurrente de conjunto (REM), una nueva técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las genotecas, puede utilizarse en combinación con los ensayos de investigación para identificar homólogos de PPSRP (Arkin y Yourvan, 1992 PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. 1993 Protein Engineering 6(3): 327-331). En otra realización, pueden aprovecharse ensayos basados en células para analizar una genoteca diversificada de PPSRP, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. La presente invención proporciona adicionalmente un método de identificación de una nueva PPSRP, que comprende (a) generar una respuesta específica de anticuerpo para una PPSRP, o fragmento de la misma, como se ha descrito arriba; (b) investigar material PPSRP supuesto con el anticuerpo, en donde la fijación específica del anticuerpo al material indica la presencia de una PPSRP potencialmente nueva; y (c) analizar el material fijado en comparación con PPSRP conocida para determinar su novedad.

Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteínas, proteínas de fusión, iniciadores, vectores, y células hospedadoras descritas en esta memoria pueden utilizarse en uno o más de los métodos siguientes: identificación de Physcomitrella patens y organismos afines; mapeado de genomas de organismos afines a Physcomitrella patens; identificación y localización de secuencias de Physcomitrella patens de interés; estudios de evolución; determinación de regiones de PPSRP requeridas para la función; modulación de una actividad de PPSRP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares; modulación del transporte transmembranal de uno o más compuestos; y modulación de la resistencia al estrés.

El musgo Physcomitrella patens representa un miembro de los musgos. El mismo está relacionado con otros musgos tales como Ceratodon purpureus que es capaz de crecer en ausencia de luz. Musgos tales como Ceratodon y Physcomitrella comparten un alto grado de homología en la secuencia de DNA y al nivel de polipéptidos, lo que permite el uso de investigación heterólogo de moléculas de DNA con sondas que han evolucionado a partir de otros musgos u organismos, haciendo posible con ello la derivación de una secuencia de consenso adecuada para investigación heterólogo o anotación funcional y predicción de funciones génicas en terceras especies. La posibilidad de identificar tales funciones puede por consiguiente tener importancia relevante, v.g., predicción de especificidad de sustrato de enzimas. Adicionalmente, estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como puntos de referencia para el mapeado de genomas de musgos, o de genomas de organismos afines.

Las moléculas de ácido nucleico de PPSRP de la invención tienen una diversidad de usos. Es de gran importancia que las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de la presente invención pueden utilizarse para transformar plantas, induciendo con ello tolerancia a estados de estrés tales como sequía, salinidad alta y frío. La presente invención proporciona por tanto una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de PPSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta, y en donde la PPSRP se define en SEQ ID NO: 3. La planta transgénica puede ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea. La invención estipula adicionalmente que la planta transgénica puede seleccionarse de maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, palma de aceite, cocotero, hierba perenne y cosechas forrajeras, por ejemplo. En particular, la presente invención describe la utilización de la expresión de Ppasa-1 (SEQ ID NO: 3) para modificar por ingeniería genética plantas tolerantes a la sequía. Esta estrategia ha sido demostrada en esta memoria para Arabidopsis thaliana, colza/canola, soja, maíz y trigo, pero su aplicación no está restringida a estas plantas. De acuerdo con ello, la invención proporciona una planta transgénica que contiene una PPSRP, como se define arriba, con inclusión de homólogos, en donde el estrés ambiental es la sequía. Esta invención describe también el principio de la utilización de la sobre-expresión de Ppasa-1 (SEQ ID NO: 3) para modificar por ingeniería genética plantas tolerantes a la sal. Una vez más, esta estrategia ha sido demostrada en esta memoria para Arabidopsis thaliana, colza, canola, soja, maíz y trigo, pero su aplicación no está restringida a estas plantas. De acuerdo con ello, la invención proporciona una planta transgénica que contiene la PPSRP tal como Ppasa-1 como se define arriba, con inclusión de homólogos, en donde el estrés ambiental es la salinidad.

La presente invención proporciona también métodos de modificar la tolerancia al estrés de una planta que comprenden modificar la expresión de una PPSRP en la planta, en donde la PPSRP es como se describe arriba. La invención estipula que este método puede realizarse de tal manera que la tolerancia al estrés se incremente o se reduzca.

Adicionalmente, este método puede utilizarse en casos en que la planta es transgénica o no transgénica. En los casos en que la planta es transgénica, la planta puede transformarse con un vector que contiene cualquiera de los ácidos nucleicos codificantes de PPSRP arriba descritos, o la planta puede transformarse por un promotor que dirige la expresión de PPSRP nativa en la planta, por ejemplo. La invención estipula que un promotor de este tipo puede ser específico en cuanto a tejido. Adicionalmente, un promotor de este tipo puede regularse durante el desarrollo. Alternativamente, plantas no transgénicas pueden tener expresión de PPSRP nativa modificada por inducción de un promotor nativo. Adicionalmente, la invención estipula que la expresión de PPSRP puede modificarse por la administración de una molécula anti-sentido que inhibe la expresión de PPSRP.

La expresión de Ppasa-1 (SEQ ID NO: 3) en plantas diana puede realizarse, pero sin carácter limitante, por uno de los ejemplos siguientes: (a) promotor constitutivo, (b) promotor inducible por estrés, (c) promotor inducido por productos químicos, y (d) sobre-expresión de un promotor modificado por ingeniería genética con, por ejemplo, factores de transcripción derivados de dedos de cinc (Greisman y Pabo, 1997 Science 275:657). El último caso implica la identificación de los homólogos de Ppasa-1 (SEQ ID NO: 3) en la plana diana así como de su promotor. Factores de transcripción recombinantes que contienen dedos de cinc se modifican por ingeniería genética para interaccionar específicamente con el homólogo de Ppasa-1 (SEQ ID NO: 3), y se activa la transcripción del gen correspondiente.

Como se muestra en esta memoria y se describe con mayor detalle más adelante, la expresión de la PPSRP Ppasa-1 (SEQ ID NO: 3) en Arabidopsis thaliana confiere a la planta un alto grado de tolerancia a la sequía. Adicionalmente, la Ppasa-1 (SEQ ID NO: 3) confiere a esta planta tolerancia a altas concentraciones de sal.

Además de introducir las secuencias de ácido nucleico de PPSRP en plantas transgénicas, estas secuencias pueden utilizarse también para identificar un organismo como Physcomitrella patens o un pariente próximo del mismo. Asimismo, aquéllas pueden utilizarse para identificar la presencia de Physcomitrella patens o un pariente del mismo en una población mixta de microorganismos. La invención proporciona las secuencias de ácido nucleico de varios genes de Physcomitrella patens; por sonda del DNA genómico extraído de un cultivo de una población singular o mixta de microorganismos en condiciones severas con una sonda que abarca una región de un gen de Physcomitrella patens que es única para este organismo, puede determinarse si está presente este organismo.

Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico y proteína de la invención pueden servir como marcadores para regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no sólo en el mapeado del genoma, sino también en estudios funcionales de las proteínas de Physcomitrella patens. Por ejemplo, para identificar la región del genoma a la que se fija una proteína particular de fijación de DNA de Physcomitrella patens, podría digerirse el genoma de Physcomitrella patens, e incubarse los fragmentos con la proteína de fijación de DNA. Aquellos que fijan la proteína pueden sondarse adicionalmente con las moléculas de ácido nucleico de la invención, preferiblemente con marcadores fácilmente detectables; la fijación de una molécula de ácido nucleico de este tipo al fragmento del genoma permite la localización del fragmento al mapa del genoma de Physcomitrella patens, y, cuando se realiza múltiples veces con enzimas diferentes, facilita una determinación rápida de la secuencia de ácido nucleico a la que se fija la proteína. Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser suficientemente homólogas a las secuencias de especies afines de tal modo que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en musgos afines.

Las moléculas de ácido nucleico de PPSRP de la invención son útiles también para estudios de evolución y estructurales de proteínas. Los procesos metabólicos y de transporte en los cuales participan las moléculas de la invención son utilizados por una gran diversidad de células procariotas y eucariotas; por comparación de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención con aquéllas que codifican enzimas similares de otros organismos, puede evaluarse la interrelación evolutiva de los organismos. Normalmente, una comparación de este tipo permite una evaluación de cuáles son las regiones de la secuencia que se conservan y cuáles no lo son, lo que puede ayudar en la determinación de aquellas regiones de la proteína que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es valioso para estudios de ingeniería de proteínas y puede proporcionar una indicación de lo que puede tolerar la proteína en términos de mutagénesis sin pérdida de función.

La manipulación de las moléculas de ácido nucleico de PPSRP de la invención puede dar como resultado la producción de PPSRPs que tengan diferencias funcionales respecto a las PPSRPs de tipo salvaje. Estas proteínas pueden estar mejoradas en eficiencia o actividad, pueden estar presentes en mayores números en la célula de lo que es usual, o pueden tener eficiencia o actividad reducidas. Existen numerosos mecanismos por los cuales la alteración de una PPSRP de la invención puede afectar directamente a la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés. En el caso de plantas que expresan PPSRPs, el transporte incrementado puede conducir a un reparto mejorado de la sal y/o los solutos en el interior de los tejidos y órganos de la planta. Por aumento del número o la actividad de las moléculas transportadoras que exportan moléculas iónicas de la célula, puede ser posible afectar a la tolerancia de la célula a la sal.

El efecto de la modificación genética en plantas, C. glutamicum, hongos, algas, o ciliados sobre la tolerancia al estrés puede ser evaluado por cultivo del microorganismo o planta modificado en condiciones menos que adecuadas y análisis posterior de las características de crecimiento y/o metabolismo de la planta. Tales métodos de análisis son bien conocidos por las personas expertas en la técnica, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de proteínas, síntesis de carbohidratos, síntesis de lípidos, tasas de evapotranspiración, rendimiento de la planta y/o de la cosecha en general, floración, reproducción, producción de semillas, crecimiento de raíces, tasas de respiración, tasas de fotosíntesis, etc. (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al. 1993 Biotechnology, vol. 3, Chapter III: Product recovery and purification, page 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. y Cabral, J.M.S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. y Henry, J.D., 1988 Biochemical separations, en Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, page 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J. (1989) Separation and Purification Techniques in Biotechnology, Noyes Publications).

Por ejemplo, vectores de expresión de levadura que comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en Saccharomyces cerevisiae utilizando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes pueden ensayarse luego en cuanto a fallo o alteración de su tolerancia al estrés por sequía, sal, y temperatura. Análogamente, vectores de expresión en plantas que comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en una célula vegetal apropiada tal como Arabidopsis, soja, colza, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc., utilizando protocolos estándar. Las células y/o plantas transgénicas resultantes derivadas de las mismas pueden ensayarse luego respecto a fallo o alteración de su tolerancia al estrés por sequía, sal, y temperatura.

La modificación por ingeniería genética de uno o más genes de PPSRP de la invención puede dar también como resultado PPSRPs que tengan actividades alteradas que impactan directamente en la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés de algas, plantas, ciliados u hongos u otros microorganismos tales como C. glutamicum. Por ejemplo, los procesos bioquímicos normales de metabolismo dan como resultado la producción de una diversidad de productos (v.g., peróxido de hidrógeno y otras especies de oxígeno reactivas) que pueden interferir activamente con estos mismos procesos metabólicos (por ejemplo, es sabido que el peroxinitrito nitra las cadenas laterales de tirosina, desactivando con ello algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves, J.T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226-235). Si bien estos productos son excretados típicamente, las células pueden alterarse genéticamente para transportar más productos de lo que es típico para una célula de tipo salvaje. Por optimización de la actividad de una o más PPSRPs de la invención que están involucradas en la exportación de moléculas específicas, tales como moléculas de sal, puede ser posible mejorar la tolerancia de la célula al estrés.

Adicionalmente, las secuencias descritas en esta memoria, o fragmentos de las mismas, pueden utilizarse para generar mutaciones "knockout" en los genomas de diversos organismos, tales como bacterias, células de mamífero, células de levadura, y células de plantas. (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15:39-48). Las células "knockout" resultantes pueden evaluarse luego en cuanto a su aptitud o capacidad para tolerar diversas condiciones de estrés, su respuesta a diversas condiciones de estrés, y el efecto de la mutación sobre el fenotipo y/o el genotipo. Otros métodos de desactivación de genes se incluyen en la patente US No. 6400804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" y Puttaraju et al. 1999 Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17:246-252.

Las estrategias de mutagénesis arriba mencionadas para PPSRPs que dan como resultado una resistencia incrementada al estrés no deben entenderse como limitantes; variaciones en estas estrategias serán fácilmente evidentes para una persona experta en la técnica. Utilizando tales estrategias, e incorporando los mecanismos descritos en esta memoria, las moléculas de ácido nucleico y proteínas de la invención pueden utilizarse para generar algas, ciliados, plantas, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum que expresan moléculas mutadas de ácido nucleico y proteínas de PPSRP tales que la tolerancia al estrés está mejorada.

La presente invención proporciona también anticuerpos que se fijan específicamente a un polipéptido de PPSRP, o una porción del mismo, tal como se codifica por un ácido nucleico descrito en esta memoria o como se describe en esta memoria. Los anticuerpos pueden producirse por muchos métodos bien conocidos (véase, v.g. Harlow and Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1988)). Resumidamente, el antígeno purificado puede inyectarse en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para provocar una respuesta inmunológica. Los anticuerpos pueden, o bien purificarse directamente, o pueden obtenerse células de bazo a partir del animal. Las células pueden fusionarse luego con una línea de células inmortales y investigarse en cuanto a secreción de anticuerpos. Los anticuerpos pueden utilizarse para investigar genotecas de clones de ácido nucleico para células que secretan el antígeno. Los clones positivos pueden secuenciarse luego. (Véase, por ejemplo, Kelly et al. 1992 Bio/Technology 10:163-167; Bebbington et al. 1992 Bio/Technology 10:169-175).

Las expresiones "se fija selectivamente" y "se fija específicamente" con el polipéptido se refieren a una región de fijación que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros materiales biológicos. Así, en condiciones de inmunoensayo diseñadas, los anticuerpos especificados fijados a una proteína particular no se fijan en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La fijación selectiva a un anticuerpo en tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se seleccione por su especificidad para una proteína particular. Pueden utilizarse una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que se fijan selectivamente con una proteína particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos selectivamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow and Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que podrían utilizarse para determinar fijación selectiva.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedadores. Una descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales puede encontrarse en Stites et al. compiladores, "Basic and Clinical Immunology" (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., 4ª Edición) y las referencias citadas en dicho lugar, y en Harlow and Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1988).

A lo largo de esta solicitud se ha hecho referencia a diversas publicaciones. Las descripciones de todas estas publicaciones y las referencias incluidas en dichas publicaciones se incorporan en su totalidad por la presente por referencia en esta solicitud a fin de describir más plenamente el estado de la técnica a la que pertenece esta
invención.

Debe entenderse también que lo que antecede hace referencia a realizaciones preferidas de la presente invención y que pueden hacerse numerosos cambios en la misma sin apartarse del alcance de la invención. La invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos que siguen, que no deben interpretarse en modo alguno como limitantes del alcance de aquélla. Por el contrario, debe entenderse claramente que puede recurrirse a diversas otras realizaciones, modificaciones, y equivalentes de la invención que, después de la lectura de la presente descripción, pueden ser ideadas en sí mismas por los expertos en la técnica sin apartarse del alcance de las reivindicaciones del apéndice.

Ejemplos Ejemplo 1 Crecimiento de cultivos de Physcomitrella patens

Para este estudio, se utilizaron plantas de la especie Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. de la colección de la sección de estudios genéticos de la Universidad de Hamburgo. Las mismas proceden de la variedad 16/14 recogida por H.L.K. Whitehouse en Grandsden Wood, Huntingdonshire (Inglaterra), que fue subcultivada a partir de una espora por Engel (1968, Am. J. Bot. 55, 438-446). La proliferación de las plantas se llevó a cabo por medio de esporas y por medio de regeneración de los gametofitos. El protonema desarrollado a partir de la espora haploide es un cloronema rico en cloroplastos y caulonema pobre en cloroplastos, sobre el cual se formarán yemas después de aproximadamente 12 días. Éstas crecieron para dar gametóforos que llevaban anteridios y arquegonios. Después de la fertilización, resultó el esporofito diploide con una pequeña seta y la cápsula de esporas, en donde maduraron las meiosporas.

El cultivo se llevó a cabo en una cámara climatizada a una temperatura del aire de 25ºC y con una intensidad de luz de 55 micromol^{-lm2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y un cambio luz/oscuridad de 16/8 horas. El musgo se modificó en cultivo litio utilizando medio de Knop de acuerdo con Reski y Abel (1985, Planta 165:354-358) o se cultivó sobre medio Knop sólido utilizando agar oxoide al 1% (Unipath, Basingstoke, Inglaterra). Los protonemas utilizados para aislamiento de RNA y DNA se cultivaron en cultivos líquidos aireados. Los protonemas se trituraron cada 9 días y se transfirieron a medio de cultivo nuevo.

Ejemplo 2 Aislamiento de DNA total a partir de las plantas

Los detalles para el aislamiento de DNA total se refieren al tratamiento de un gramo de peso fresco de material vegetal. Los materiales utilizados incluyen los tampones siguientes: tampón CTAB: bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (CTAB) al 2% (p/v); Tris HCl 100 mM de pH 8,0; NaCl 1,4 M; EDTA 20 mM; tampón de N-laurilsarcosina: N-laurilsarcosina al 10% (p/v); Tris HCl 100 mM de pH 8,0; EDTA 20 mM.

El material vegetal se trituró bajo nitrógeno líquido en un mortero para dar un polvo fino y se transfirió a vasos Eppendorf de 2 ml. El material vegetal congelado se cubrió luego con una capa de 1 ml de tampón de descomposición (1 ml de tampón CTAB, 100 \mul de tampón de N-laurilsarcosina; 20 \mul de \beta-mercaptoetanol y 10 \mul de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60ºC durante una hora con agitación continua mediante sacudidas. El homogenizado obtenido se distribuyó en dos vasos Eppendorf (2 ml) y se extrajo dos veces por agitación mediante sacudidas con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamílíco (24:1). Para la separación de fases, se llevó a cabo la centrifugación a 8000 x g y a la temperatura ambiente durante 15 minutos en cada caso. El DNA se precipitó luego a -70ºC durante 30 minutos utilizando isopropanol enfriado con hielo. El DNA precipitado se sedimentó a 4ºC y 10.000 g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 \mul de tampón TE (Sambrook et al. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para purificación ulterior, el DNA se trató con NaCl (concentración final 1,2 M) y se precipitó de nuevo a -70ºC durante 30 minutos utilizando dos veces su volumen de etanol absoluto. Después de un paso de lavado con etanol al 70%, el DNA se secó y se recogió subsiguientemente en 50 \mul de H_{2}O + RNAsa (concentración final 50 mg/ml). El DNA se disolvió durante una noche a 4ºC se llevó a cabo subsiguientemente y la digestión con RNAsa a 37ºC durante 1 hora. El almacenamiento del DNA se realizó a 4ºC.

Ejemplo 3 Aislamiento de RNA total y RNA poli(A)^{+} y construcción de una genoteca de cDNA de Physcomitrella patens

Para la investigación de transcritos, se aislaron tanto RNA total como RNA poli-(A)^{+}. El RNA total se obtuvo a partir de protonemas de tipo salvaje de 9 días siguiendo el método GTC (Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet., 244:352-359). El RNA poli(A)^{+} se aisló utilizando Dyna Beads® (Dynal, Oslo, Noruega) siguiendo las instrucciones del protocolo de los fabricantes. Después de determinación de la concentración del RNA o del RNA poli(A)^{+}, se precipitó el RNA por adición de 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3M de pH 4,6 y 2 volúmenes de etanol y se guardó a -70ºC.

Para la construcción de la genoteca de cDNA, se realizó la síntesis de la primera cadena utilizando transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina (Roche, Mannheim, Alemania) e iniciadores oligo-d(T), y la síntesis de la segunda cadena por incubación con DNA-polimerasa I, enzima Klenow y digestión con RNAsaH a 20ºC (2 horas), 16ºC (1 hora) y 22ºC (1 hora). La reacción se paró por incubación a 65ºC (10 minutos) y se transfirió subsiguientemente a hielo. Las moléculas de DNA bicatenario se hicieron romas en los extremos con DNA-polimerasa T4 (Roche, Mannheim, Alemania) a 37ºC (30 minutos). Los nucleótidos se separaron por extracción con fenol-cloroformo y columnas de centrifugación Sephadex G50. Se ligaron adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) a los extremos del cDNA por medio de DNA-ligasa T4 (Roche, 12ºC, durante una noche) y se fosforilaron por incubación con polinucleótido-quinasa (Roche, 37ºC, 30 minutos). Esta mezcla se sometió a separación en un gel de agarosa de punto de fusión bajo. Las moléculas de DNA mayores que 300 pares de bases se eluyeron del gel, se extrajeron con fenol, y se concentraron en columnas Elutip-D (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania) y se ligaron a ramas de vector y se empaquetaron en fagos lambda ZAPII o fagos lambda ZAP-Express utilizando el Kit Gold GigaPack (Stratagene, Amsterdam, Países Bajos) utilizando material y siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 4 Secuenciación y anotación de la función de Physcomitrella patens ESTs

Se utilizaron genotecas de cDNA como se describe en el Ejemplo 3 para secuenciación de DNA de acuerdo con métodos estándar, y en particular, por el método de terminación de cadenas utilizando el Kit de Reacción Rápida de Secuenciación de Ciclo Terminador Big Dye ABI PRISM (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemania). Se llevó a cabo una secuenciación aleatoria subsiguiente a recuperación preparativa de plásmido a partir de genotecas de cDNA por escisión másica in vivo, retransformación, y extensión subsiguiente de DH10B en placas de agar (detalles de material y protocolo de Stratagene, Amsterdam, Países Bajos). Se preparó DNA plasmídico a partir de cultivos de E. coli que se habían dejado crecer durante una noche, producidos en medio Caldo Luria que contenía ampicilina (véase Sambrook et al. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) sobre un robot de preparación de DNA Qiagene (Qiagen, Hilden) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se utilizaron iniciadores de secuenciación con las secuencias nucleotídicas siguientes:

\newpage

5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'	SEQ ID No: 4
5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3'	SEQ ID No: 5
5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'	SEQ ID No: 6

Las secuencias se procesaron y anotaron utilizando el paquete de soporte lógico EST-MAX proporcionado comercialmente por Bio-Max (Munich, Alemania). El programa incorpora prácticamente todos los métodos bioinformáticos importantes para caracterización funcional y estructural de secuencias de proteínas. Para referencia, puede consultarse el sitio web en pedant.mips.biochem.mpg.de. Los algoritmos más importantes incorporados en EST-MAX son:

FASTA: Búsquedas de bases de datos de secuencias muy sensibles con estimaciones de importancia estadística; Pearson W.R. (1990) Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods Enzymol. 183: 63-98; BLAST: Búsquedas de bases de datos de secuencias muy sensibles con estimaciones de importancia estadística. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., y Lipman D.J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215: 403-10; PREDATOR: Predicción con gran exactitud de la estructura secundaria de secuencias simples y múltiples. Frishman, D. y Argos, P. (1997) 75% Accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins, 27: 329-335; CLUSTALW: Multiple sequence alignment. Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: Mejora de la sensibilidad de la alineación progresiva de secuencias múltiples por ponderación de la secuencia, penalidades por laguna específicas de la posición y elección de la matriz de ponderación. Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680; TMAP: Predicción de la región transmembranal de secuencias múltiples alineadas. Persson, B. y Argos, P. (1994) Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 237: 182-192; ALOM2: Predicción de la región transmembranal de secuencias simples. Klein, P., Kanehisa, M., y DeLisi, C. Prediction of protein function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta 787: 221-226 (1984). Version 2 by Dr. K. Nakai; PROSEARCH: Detección de los patrones de secuencia de proteínas PROSITE. Kolakowski L.f. Jr., Leunissen J.A.M., Smith J.E. (1992) ProSearch: Fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919-921; BLIMPS: Buscador de semejanzas contra una base de datos de bloques sin lagunas. J.C. Wallace and Henikoff S., (1992); PATMAT: A searching and extraction program for sequence, pattern and block queries and databases, CABIOS 8: 249-254. Escrito por Bill Alford.

Ejemplo 5 Identificación del ORF de Physcomitrella patens correspondiente a PpPPasa-1

Los cDNAs parciales de Physcomitrella patens (ESTs) que se muestran en la Tabla 1 siguiente se identificaron en el programa de secuenciación EST de Physcomitrella patens utilizando el programa EST-MAX con análisis BLAST. Los Números de Identificación de Secuencia correspondientes a estos ESTs son como sigue: PpPPasa-1 (SEQ ID No: 1). El acierto sobresaliente de BLAST es el ORF "proteína semejante a pirofosfatasa inorgánica" de Arabidopsis thaliana (Swiss-Prot.-Número de Acceso Q9LXC9). Véase también la Tabla 2 para más detalles.

TABLA 1

Categoría Funcional	Función	Código de Secuencia	Posición ORF	Nombre
Fosfatasa	Pirofosfatasa inorgánica	c_pp004077110r	1048-35	PpPPasa-1

TABLA 2 Grado de identidad y semejanza de aminoácidos de PpPPasa-1 y otras proteínas homólogas (se utilizó el programa Gap GCG; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

Swiss-Prot #	Q9LXC9	P13998	Q15181	Q18680	Q9PW32
Nombre de	Proteína afín a	Pirofosfatasa	Pirofosfatasa	Pirofosfatasa	Pirofosfatasa
proteína	pirofosfatasa	inorgánica	inorgánica	inorgánica	inorgánica
	inorgánica			probable
Especie	Arabidopsis	Kluyveromyces	Homo sapiens	Caenorhabditis	Torpedo marmorata
	thaliana (cresa de	lactis	(humana)	elegans	(raya eléctrica
	la oreja del ratón)	(levadura)			marmórea)
Identidad %	66%	34%	32%	35%	33%
Semejanza %	73%	42%	42%	43%	42%

Ejemplo 6 Clonación del cDNA de longitud total de Physcomitrella patens codificante de PpPPasa-1

Para aislar PpPPasa-1 de longitud total (SEQ ID No: 2), se realizó una PCR con un EST específico de gen como el DNA molde. Los iniciadores oligonucleotídicos sintéticos (MWG-Biotech) para la reacción fueron:

RC025:	ATCCCGGGTGACAATGGCGGCAGCAAGAGCT	SEQ ID No: 7
RC026	ATGAGCTCACACTAAACTCTAGCAAAACTGAAG	SEQ ID No: 8

Los iniciadores diseñados contenían un sitio XmaI en la región 5' y un sitio SacI en la región 3' para propósitos de clonación. Las condiciones para la reacción eran condiciones estándar con DNA-polimerasa PWO (Roche). La PCR se realizó de acuerdo con condiciones estándar y con los protocolos del fabricante (Sambrook et al. 1989, Termociclador T3 de Biometra). Los parámetros de la reacción eran: 5 minutos a 94ºC seguido por 5 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC y 1,5 minutos a 72ºC. Esto fue seguido por 25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 65ºC y 1,5 minutos a 72ºC. Estos parámetros generaron un fragmento de 0,9 kilobases que codificaba el ORF de la PpPPasa-1.

El fragmento se extrajo del gel de agarosa con un Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen) y se ligó al vector TOPO pCR 2.1 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los vectores recombinantes se transformaron en células Top10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar(Sambrook et al. 1989). Las células transformadas se seleccionaron en agar LB que contenía 100 \mug/ml de carbenicilina, 0,8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido) y 0,8 mg de IPTG (isopropiltio-\beta-D-galactosido) que se había dejado crecer durante una noche a 37ºC. Se seleccionaron las colonias blancas y se utilizaron para inocular 3 ml de LB líquido que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se extrajo utilizando el Kit Miniprep Spin QIAprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los análisis de los clones subsiguientes y el mapeado de restricción se realizaron de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook et al. 1989).

Ejemplo 7 Modificación por ingeniería genética de plantas de Arabidopsis tolerantes al estrés por sobreexpresión del gen PpPPasa-1 Construcción del vector binario: pGMSG

El vector pLMNC53 (Mankin, 2000, tesis PhD) se digirió con HindIII (Roche) y se rellenó de extremos romos con enzima Klenow y dNTPs 0,1 mM (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este fragmento se extrajo de un gel de agarosa con un Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento purificado se digirió luego con EcoRI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este fragmento se extrajo del gel de agarosa con un Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de 1,4 kilobases resultante, la casete de gentamicina, incluía el promotor nos, el gen aacCI y el terminador g7.

El vector pBlueScript se digirió con EcoRI y SmaI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento resultante se extrajo del gel de agarosa con un Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El vector pBlueScript digerido y los fragmentos de la casete de gentamicina se ligaron con DNA-ligasa T4 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, uniendo los dos sitios EcoRI respectivos y uniendo el sitio HindIII de extremos romos con el sitio SmaI.

El vector recombinante (pGMBS) se transformó en células Top10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar. Las células transformadas se seleccionaron en agar LB que contenía 100 \mug/ml de carbenicilina, 0,8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido) y 0,8 mg de IPTG (isopropiltio-\beta-D-galactosido), se cultivaron durante una noche a 37ºC. Se seleccionaron las colonias blancas y se utilizaron para inocular 3 ml de LB líquido que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se extrajo DNA plasmídico utilizando el Kit Miniprep Spin QIAprep (QIAgen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis de los clones subsiguientes y el mapeado de restricción se realizaron de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook et al. 1989 Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Subclonación de la PpPPasa-1 en el vector binario

El fragmento que contenía la pirofosfatasa de Physcomitrella patens (PpPPasa-1) se escindió del vector recombinante PCR2.1 TOPO por digestión con SacI y XmaI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento subsiguiente se escindió de gel de agarosa con un Kit Extraction Gel QIAquick (QIAgen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se ligó en los vectores binarios pGMSG, se escindió con XmaI y Ec1136II y se desfosforiló antes de la ligación. El pGMSG recombinante resultante contenía la PpPPasa-1 en la orientación de sentido bajo el super-promotor constitutivo.

Transformación de Agrobacterium

Los vectores recombinantes se transformaron en Agrobacterium tumefaciens C58C1 y PMP90 de acuerdo con condiciones estándar (Hoefgen y Willmitzer, 1990).

Transformación de Plantas

Se cultivaron y transformaron Arabidopsis thaliana ecotipo C24 de acuerdo con condiciones estándar (Bechtold 1993, Acad. Sci. París, 316:1194-1199; Bent et al 1994, Science 265:1856-1860).

Evaluación de las Plantas Transformadas

Se esterilizaron semillas T1 de acuerdo con protocolos estándar (Xiong et al. 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17:159-170). Las semillas se extendieron en placas sobre agar ½ MS 0,6% complementado con 1% de sacarosa, 150 \mug/ml de gentamicina (Sigma-Aldrich) y 2 \mug/ml de benomil (Sigma-Aldrich). Las semillas depositadas en las placas se sometieron a vernalización durante 4 días a 4ºC. Las semillas se germinaron en una cámara climatizada a una temperatura del aire de 22ºC y una intensidad de luz de 40 micromols^{lm2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y con un ciclo diario de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Las plantas de semillero transformadas se seleccionaron después de 14 días y se transfirieron a placas de agar 1/2 MS al 0,6% complementadas con 1% de sacarosa, y se dejó que se recuperaran durante 5 a 7 días.

Evaluación de la Tolerancia a la Sequía

Las plantas de semillero T1 se transfirieron a papel de filtro seco y estéril en una cápsula Petri y se dejaron desecar durante 2 horas a 80% RH (humedad relativa) en una Cabina de Crecimiento Sanyo MLR-350H, micromols^{-lm2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25). Se redujo luego la humedad relativa a 60% y las plantas de semillero se desecaron ulteriormente durante 8 horas. Se retiraron luego las plantas de semillero y se pusieron sobre placas de agar 1/2 MS al 0,6% complementado con 2 \mug/ml de benomil y se registraron después de 5 días.

Las líneas que sobre-expresaban PpPPasa-1 exhibían una tasa de supervivencia de 100% (23 supervivientes de 23 plantas estresadas), mientas que solamente sobrevivían el 21% de los controles sin transformar. Es digno de mención que los análisis de estas líneas transgénicas se realizaron con plantas T1; por consiguiente, los resultados serán mejores cuando se encuentre un expresante homocigótico fuerte.

Evaluación de la Tolerancia a la Sal

Las plantas de semillero se transfirieron a papel de filtro impregnado en 1/2 MS y se pusieron sobre agar 1/2 MS al 0,6% complementado con 2 \mug/ml de benomil la noche anterior a la investigación de tolerancia a la sal. Para la investigación de tolerancia a la sal, el papel de filtro con las plantas de semillero se desplazó a pilas de papel de filtro estéril impregnadas en NaCl 50 mM, en una cápsula Petri. Después de 2 horas, el papel de filtro con las plantas de semillero se desplazó a pilas de papel de filtro estéril impregnadas con NaCl 200 mM, en una cápsula Petri. Al cabo de 2 horas, el papel de filtro con las plantas de semillero se desplazó a pilas de papel de filtro estéril impregnadas en NaCl 600 mM, en una cápsula Petri. Al cabo de 10 horas, las plantas de semillero se desplazaron a cápsulas Petri que contenían agar 1/2 MS al 0,6% complementado con 2 \mug/ml de benomil. Las plantas de semillero se registraron al cabo de 5 días.

En condiciones de estrés por sal, las líneas que sobreexpresaban PpPPasa-1 exhibían una tasa de supervivencia de 27% (6 supervivientes de 22 plantas estresadas), mientras que sobrevivían únicamente el 10% de los controles no transformados. Es digno de mención que los análisis de estas líneas transgénicas se realizaron con plantas T1, por lo que los resultados serán mejores cuando se encuentre un expresante homocigótico fuerte.

Evaluación de la Tolerancia a la Helada

Las plantas de semillero se desplazaron a cápsulas Petri que contenían agar 1/2 MS al 0,6% complementado con 2% de sacarosa y 2 \mug/ml de benomil. Después de 4 días, las plantas de semillero se incubaron a 4ºC durante 1 hora y se cubrieron luego con hielo en virutas. Las plantas de semillero se pusieron luego en una Cámara Ambiental Environmental Specialist ES2000 y se incubaron durante 3,5 horas comenzando a -1,0ºC, y disminuyendo la temperatura -1ºC/hora. Las plantas de semillero se incubaron luego a -5ºC durante 24 horas y se dejaron descongelar a 5ºC durante 12 horas. Se eliminó el agua por vertido y las plantas de semillero se registraron al cabo de 5 días. Las plantas transgénicas se investigan luego en cuanto a su tolerancia mejorada al frío, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia al frío.

Ejemplo 8 Detección del transgén de PpPPasa-1 en las líneas transgénicas de Arabidopsis

Una hoja de una planta de tipo salvaje y una planta transgénica de Arabidopsis se homogeneizaron en 250 \mul de tampón de bromuro de hexadeciltrimetil-amonio (CTAB) (2% CTAB, NaCl 1,4 M, EDTA 8 mM y Tris 20 mM de pH 8,0) y 1 \mul de \beta-mercaptoetanol. Se incubaron las muestras a 60-65ºC durante 30 minutos y se añadieron luego 250 \mul de cloroformo a cada muestra. Las muestras se agitaron tumultuosamente durante 3 minutos y se centrifugaron durante 5 minutos a 18.000 x g. Se retiró el sobrenadante de cada muestra y se añadieron 150 \mul de isopropanol. Las muestras se incubaron a la temperatura ambiente durante 15 minutos, y se centrifugaron durante 10 minutos a 18.000 x g. Cada sedimento se lavó con etanol al 70%, se secó, y se resuspendió en 20 \mul de TE. Se utilizaron 4 \mul de la suspensión anterior en una reacción PCR de 20 \mul utilizando DNA-polimerasa Taq (Roche Molecular Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los iniciadores utilizados en las reacciones fueron:

5' GAATAGATACGCTGACACGC 3'	SEQ ID NO: 9
5' ATGAGCTCACACTAAACTCTAGCAAAACTGAAG 3'	SEQ ID NO: 10

El programa PCR era como sigue: un ciclo de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 75ºC y 3 minutos a 72ºC, seguido por 14 ciclos del mismo ciclo excepto que la temperatura de reasociación disminuía 1ºC cada ciclo hasta 62ºC; y luego 16 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 3 minutos a 72ºC. Se generó un fragmento de 1,3 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas T1. Como control positivo se utilizó un plásmido de vector binario con el gen de PpPPasa-1 clonado en pGMSG, y como control negativo se utilizó el DNA genómico de tipo salvaje C24 en las reacciones PCR. Se analizaron 10 \mul de la reacción PCR sobre gel de agarosa al 0,8%-bromuro de etidio.

Ejemplo 9 Detección del mRNA del Transgén de PpPPasa-1 en líneas transgénicas de Arabidopsis

La expresión del transgén se detectó utilizando RT-PCR. Se aisló el RNA total de las plantas tratadas en estrés utilizando un procedimiento adaptado de (Verwoerd et al. 1989 NAR 17:2362). Se recogieron muestras de hojas (50-100 mg) y se trituraron hasta un polvo fino en nitrógeno líquido. El tejido triturado se resuspendió en 500 \mul de una mezcla 1:1 a 80ºC de fenol a tampón de extracción (LiCl 100 mM, Tris 100 mM de pH 8, EDTA 10 mM, SDS al 1%), seguido por agitación tumultuosa breve para mezclar. Después de la adición de 250 \mul de cloroformo, cada muestra se agitó tumultuosamente durante un breve espacio de tiempo. Se centrifugaron luego las muestras durante 5 minutos a 12.000 x g. La fase acuosa superior se separó en un tubo Eppendorf nuevo. Se precipitó el RNA por adición de una décima parte de su volumen de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol al 95%. Las muestras se mezclaron por inversión y se dejaron en hielo durante 30 minutos. El RNA se redujo a un sedimento por centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se retiró y los sedimentos se secaron brevemente al aire. Los sedimentos de las muestras de RNA se resuspendieron en 10 \mul de agua tratada con DEPC. Para separar el DNA contaminante de las muestras, se trató cada una con DNasa exenta de RNasa (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El cDNA se sintetizó a partir del RNA total utilizando el kit de síntesis de cDNA de la primera cadena (Boehringer Mannheim) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La amplificación por PCR de un fragmento de 350 pares de bases a partir del cDNA sintetizado se realizó utilizando DNA-polimerasa Taq (Roche) e iniciadores diseñados específicamente para PpPPasa-1 en la reacción siguiente: 1X tampón PCR, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,2 \muM de cada iniciador, dNTPs 0,2 \muM, 1 unidad de polimerasa, 5 \mul de cDNA de la reacción de síntesis. Se utilizó la combinación de iniciadores siguiente:

RC870:	5'GCAGAGTATACCGTCAAGGAGGAAG3'	SEQ ID NO: 11
RC871:	5'GGCTTGCCTCTCCCCAATTTCAACA3'	SEQ ID NO: 12

La amplificación se realizó en las condiciones siguientes: desnaturalización, 95ºC, 1 minuto; reasociación, 62ºC, 30 segundos; extensión, 72ºC, 1 minuto, 35 ciclos; extensión, 72ºC, 5 minutos; mantenimiento, 4ºC, para siempre. Los productos PCR se pasaron sobre un gel de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron bajo luz UV utilizando el sistema de documentación de gel Quantity-One (Bio-Rad).

La expresión de los transgenes se detectó en la línea transgénica T1. Estos resultados indicaron que los transgenes se expresan en las líneas transgénicas y sugieren fuertemente que su producto génico aumentaba la tolerancia de la planta al estrés en las líneas transgénicas. De acuerdo con la exposición anterior, no pudo detectarse por este método expresión alguna de genes endógenos idénticos o muy similares. Estos resultados están de acuerdo con los datos del Ejemplo 7.

Ejemplo 10 Modificación por ingeniería genética de plantas de soja tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen de PpPPasa-1

Se utilizó el clon PpPPasa-1 (SEQ ID NO: 2) para transformar soja como se describe a continuación.

Se esterilizaron superficialmente semillas de soja con etanol al 70% durante 4 minutos a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas, seguido por 20% (volumen/volumen) de Clorox complementado con 0,05% (volumen/volumen) de Tween durante 20 minutos con agitación continua mediante sacudidas. A continuación, las semillas se lavaron cuatro veces con agua destilada y se pusieron sobre papel de filtro estéril mojado en una cápsula Petri a la temperatura ambiente durante 6 a 39 horas. Se desprendieron las cubiertas de las semillas, y se separaron los cotiledones del eje del embrión. Se examinó el eje del embrión para asegurarse de que la región meristemática no estaba deteriorada. Los ejes del embrión escindidos se recogieron en una cápsula Petri estéril entreabierta y se secaron al aire hasta un contenido de humedad menor que 20% (peso en fresco) en una cápsula Petri sellada hasta su uso ulterior.

Se preparó un cultivo de Agrobacterium tumefaciens a partir de una sola colonia en medio sólido LB más anti-bióticos apropiados (v.g. 100 mg/l de estreptomicina, 50 mg/l de kanamicina) seguido por crecimiento de la única colonia en medio LB líquido hasta una densidad óptica de 0,8 a 600 nm. A continuación, el cultivo de bacterias se redujo a un sedimento a 7000 rpm durante 7 minutos a la temperatura ambiente, y se resuspendió en medio MS (Murashige y Skoog, 1962), complementado con acetosiringona 100 \muM. los cultivos de bacterias se incubaron en este medio de pre-inducción durante 2 horas a la temperatura ambiente antes de su utilización. Los ejes de los embriones de las semillas cigóticas de soja a aproximadamente 15% de contenido de humedad se impregnaron durante 2 horas a la temperatura ambiente con el cultivo en suspensión de Agrobacterium pre-inducido. Se retiraron los embriones del cultivo de impregnación y se transfirieron a cápsulas Petri que contenían medio MS sólido complementado con 2% de sacarosa y se incubaron durante 2 días, en la oscuridad a la temperatura ambiente. Alternativamente, los embriones se pusieron encima de papel de filtro estéril humidificado (medio MS líquido) en una cápsula Petri y se incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente. Después de este período, los embriones se transfirieron a medio MS sólido o líquido complementado con 500 mg/l de carbenicilina o 300 mg/l de cefotaximo para destruir las agrobacterias. El medio líquido se utilizó para mojar el papel de filtro estéril. Los embriones se incubaron durante 4 semanas a 25ºC, bajo 150 \mumol m^{-2}s^{-1} y 12 horas de fotoperíodo. Una vez que las plantas de semillero produjeron raíces, se transfirieron las mismas a tierra estéril Metromix. El medio de las plantas in vitro se eliminó por lavado antes de transferir las plantas a la tierra. Las plantas se mantuvieron bajo una cubierta de plástico durante una semana para ofrecer el proceso de aclimatación. Se transfirieron luego las plantas a una sala de crecimiento en la que se incubaron a 25ºC, bajo 150 \mumol m^{-2}s^{-1} de intensidad de luz y 12 horas de fotoperíodo durante aproximadamente 80 días.

Las plantas transgénicas se evaluaron luego respecto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío de acuerdo con el método de evaluación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia al estrés.

Ejemplo 11 Modificación por ingeniería genética de plantas de colza/canola tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen PpPPasa-1

Se utilizó el clon de PpPPasa-1 (SEQ ID NO: 2) para transformar colza/canola como se describe a continuación.

El método de transformación de plantas descrito en esta memoria es aplicable también a Brassica y otras cosechas. Las semillas de canola se esterilizan superficialmente con etanol al 70% durante 4 minutos a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas, seguido por 20% (vol/vol) de Cloros complementado con 0,05% (vol/vol) de Tween durante 20 minutos, a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas. A continuación, las semillas se lavan 4 veces con agua destilada y se ponen sobre papel de filtro estéril humidificado en una cápsula Petri a la temperatura ambiente durante 18 horas. Se retiran luego las cubiertas de las semillas y las semillas se secan al aire durante una noche en una cápsula Petri estéril entreabierta. Durante este período, las semillas pierden aproximadamente 85% de su contenido de agua. Se guardan luego las semillas a la temperatura ambiente en una cápsula Petri sellada hasta su uso ulterior. Los constructos de DNA y la impregnación de los embriones son como se describe en el Ejemplo 10. Las muestras de las plantas transgénicas primarias (T0) se analizan por PCR para confirmar la presencia de T-DNA. Estos resultados se confirman por hibridación Southern en la cual el DNA se somete a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% y se transfiere a una membrana de nylon cargada positivamente (Roche Diagnostics). Se utiliza el Kit de Síntesis de Sonda PCR DIG (Roche Diagnostics) para preparar una sonda marcada con digoxigenina por PCR, y se utiliza de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Las plantas transgénicas se investigan luego respecto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia a la sequía.

Ejemplo 12 Modificación por ingeniería genética de plantas de maíz tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen PpPPasa-1

Se utilizó el clon PpPPasa-1 (SEQ ID NO: 2) para transformar maíz como se describe a continuación.

La transformación de maíz (Zea Mays L.) se realiza con el método descrito por Ishida et al. 1996. Nature Biotch 14745-50. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que llevan vectores "superbinarios", y las plantas transgénicas se recuperan por organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación comprendida entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se investigan luego en cuanto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío de acuerdo con el método de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia al estrés.

Ejemplo 13 Modificación por ingeniería genética de plantas de trigo tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen de PpPPasa-1

Se utilizó el clon PpPPasa-1 (SEQ ID NO: 2) para transformar trigo como se describe a continuación.

La transformación del trigo se realiza con el método descrito por Ishida et al. 1996 Nature Biotch. 14745-50. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que llevan vectores "super-binarios", y las plantas transgénicas se recuperan por organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación comprendida entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se investigan luego en cuanto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia a la sequía.

Ejemplo 14 Identificación de Genes Homólogos y Heterólogos

Pueden utilizarse secuencias génicas para identificar genes homólogos o heterólogos a partir de genotecas de cDNA o genómicas. Los genes homólogos (v.g. clones de cDNA de longitud total) pueden aislarse por hibridación de ácido nucleico utilizando por ejemplo genotecas de cDNA. Dependiendo de la abundancia del gen de interés, se extienden en placas 100.000 hasta 1.000.000 de bacteriófagos recombinantes y se transfieren a membranas de nylon. Después de desnaturalización con álcali, el DNA se inmoviliza sobre la membrana mediante, v.g., reticulación por UV. La hibridación se lleva a cabo en condiciones de alta severidad. En solución acuosa, la hibridación y el lavado se realizan con una concentración iónica de NaCl 1M y una temperatura de 68ºC. Se generan sondas de hibridación mediante, v.g., marcación por transcripción radiactiva de la mella (^{32}P) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania). Las señales se detectan por autorradiografía.

Los genes parcialmente homólogos o heterólogos que son afines pero no idénticos pueden identificarse de una manera análoga al procedimiento arriba descrito utilizando condiciones de hibridación y lavado a baja severidad. Para hibridación acuosa, la concentración iónica se mantiene normalmente a NaCl 1M, mientras que la temperatura se hace descender progresivamente desde 68 a 42ºC.

El aislamiento de secuencias génicas con homologías (o identidad/semejanza de secuencia) únicamente en un dominio distinto de (por ejemplo 10-20 aminoácidos) puede realizarse por utilización de sondas de oligonucleótidos sintéticos radiomarcados. Los oligonucleótidos radiomarcados se preparan por fosforilación del extremo 5-prima de dos oligonucleótidos complementarios con polinucleótido-quinasa T4. Los oligonucleótidos complementarios se reasocian y se ligan para formar concatémeros. Los concatémeros bicatenarios se someten luego a radiomarcación mediante, por ejemplo, transcripción de la mella. La hibridación se realiza normalmente en condiciones de baja severidad utilizando concentraciones altas de oligonucleótidos.

Solución de hibridación de oligonucleótidos:

: 6 x SSC

: fosfato de sodio 0,01 M

: EDTA 1 mM (pH 8)

: SDS al 0,5%

: 100 \mug/ml de DNA desnaturalizado de esperma de salmón

: 0,1% de leche desecada desnatada

Durante la hibridación, la temperatura se hace descender gradualmente hasta 5-10ºC por debajo del valor Tm estimado del oligonucleótido o hasta la temperatura ambiente, seguido por pasos de lavado y autorradiografía. El lavado se realiza con baja severidad tal como 3 pasos de lavado utilizando 4 x SSC. Detalles adicionales han sido descritos por Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, o Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.

Ejemplo 15 Identificación de Genes Homólogos por Evaluación de la Genotecas de Expresión con Anticuerpos

Pueden utilizarse clones de c-DNA para producir proteína recombinante, por ejemplo en E. coli (v.g. el sistema pQE QIAexpress de Qiagen). Las proteínas recombinantes se purifican luego normalmente por afinidad mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). Las proteínas recombinantes se utilizan luego para producir anticuerpos específicos, por ejemplo utilizando técnicas estándar para inmunización de conejos. Los anticuerpos se purifican por afinidad utilizando una columna Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante como ha sido descrito por Gu et al. 1994 BioTechniques 17:257-262. El anticuerpo puede utilizarse luego para investigar genotecas de expresión de cDNA a fin de identificar genes homólogos o heterólogos por la vía de una investigación inmunológica (Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F. M. et al. (1994) "Current Protocolos in Molecular Biology", John Wiley & Sons).

Ejemplo 16 Mutagénesis in Vivo

La mutagénesis in vivo de microorganismos puede realizarse por paso de DNA plasmídico (u otro vector) a través de E. coli u otros microorganismos (v.g. Bacillus spp. o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae) que están deteriorados en sus capacidades para mantener la integridad de su información genética. Las cepas mutantes típicas tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación de DNA (v.g., mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia véase Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, en: Escherichia coli and Salmonella, p. 2227-2294, ASM: Washington). Cepas de este tipo son bien conocidas por los expertos en la técnica. El uso de tales cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener, A. y Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34. La transferencia de moléculas de DNA mutado en plantas se realiza preferiblemente después de selección y ensayo en microorganismos. Se generan plantas transgénicas de acuerdo con diversos ejemplos dentro de la ilustración de este documento.

Ejemplo 17 Análisis in vitro de la Función de los Genes de Physcomitrella en Organismos Transgénicos

La determinación de las actividades y los parámetros cinéticos de las enzimas está bien establecida en la técnica. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima alterada dada tienen que adaptarse a la actividad específica de la enzima de tipo salvaje, lo cual está plenamente dentro de la capacidad de un experto en la técnica. Revisiones acerca de enzimas en general, así como detalles específicos concernientes a la estructura, cinética, principios, métodos, aplicaciones y ejemplos para la determinación de muchas actividades enzimáticas pueden encontrarse, por ejemplo, en las referencias siguientes: Dixon, M., y Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: Londres; Fersht, 1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: Nueva York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., compilador. (1983) The Enzymes, 3^{rd} ed. Academic Press: Nueva York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2^{nd} ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Gra\betaI, M., compiladores (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3^{rd} ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; y Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9 Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352-363.

La actividad de las proteínas que se fijan a DNA pueden medirse por varios métodos bien establecidos, tales como ensayos de desplazamiento de bandas de DNA (denominados también ensayos de retardo en gel). El efecto de tales proteínas sobre la expresión de otras moléculas puede medirse utilizando ensayos de genes informadores (tales como el descrito en Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 y las referencias citadas en dicho lugar). Sistemas de ensayo DE genes informadores son bien conocidos y están establecidos para aplicaciones en células tanto procariotas como eucariotas, utilizando enzimas tales como \beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde, y varias otras.

La determinación de la actividad de proteínas de transporte de membrana puede realizarse de acuerdo con técnicas tales como las descritas en Gennis, R.B. Pores, Channels and Transporters, en Biomembranes, Molecular Structure and Function, pp. 85-137, 199-234 y 270-322, Springer: Heidelberg (1989).

Ejemplo 18 Purificación del Producto Deseado a partir de Organismos Transformados

La recuperación del producto deseado a partir de material vegetal (a saber, Physcomitrella patens o Arabidopsis thaliana), hongos, algas, ciliados, células de C. glutamicum, u otras células bacterianas transformadas con las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria, o el sobrenadante de los cultivos arriba descritos, puede realizarse por diversos métodos bien conocidos en la técnica. Si el producto deseado no es secretado por las células, puede recogerse del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y las células pueden lisarse por técnicas estándar tales como fuerza mecánica o sonificación. Los órganos de las plantas pueden separarse mecánicamente de otros tejidos u órganos. Después de la homogeneización, los residuos celulares se separan por centrifugación, y la fracción sobrenadante que contiene las proteínas solubles se retiene para purificación ulterior del compuesto deseado. Si el producto es secretado por las células deseadas, entonces las células se separan del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y la porción sobrenadante se retiene para purificación ulterior.

La fracción sobrenadante de cualquier método de purificación se somete a cromatografía con una resina adecuada, en donde la molécula deseada queda retenida sobre una resina cromatográfica mientras que muchas de las impurezas contenidas en la muestra no lo son, o en donde las impurezas son retenidas por la resina mientras que la muestra no lo es. Tales pasos cromatográficos pueden repetirse en caso necesario, utilizando la misma o diferentes resinas cromatográficas. Un experto en la técnica estaría adecuadamente versado en la selección de resinas cromatográficas apropiadas y en su aplicación más eficaz para la purificación de una molécula particular. El producto purificado puede concentrarse por filtración o ultrafiltración, y guardarse a una temperatura a la cual se maximiza la estabilidad del producto.

Existe una serie amplia de métodos de purificación conocidos en la técnica y el método de purificación que antecede no debe considerarse limitante. Tales métodos de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: Nueva York (1986). Adicionalmente, la identidad y pureza de los compuestos aislados puede evaluarse por métodos estándar en la técnica. Éstos incluyen cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de tinción, cromatografía en capa delgada, NIRS, ensayo enzimático, o microbiológicamente. Dichos métodos de análisis se revisan en: Patek et al. 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. 1996 Biotekhnologiya 11:27-32; y Schmidt et al. 1998 Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996), vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, 575-581 y p. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17.

<110> BASF PLANT SCIENCE GMBH

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<120> PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL ESTRÉS POR PIROFOSFATASAS Y MÉTODOS DE UTILIZACIÓN EN PLANTAS

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<130> 16313-0006

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<140> PCT/US00/35100

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<141> 2000-12-22

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<150> 60/171.745

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<151> 1999-12-22

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<160> 12

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1243

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<212> DNA

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<213> Physcomitrella patens

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<220>

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<221> modified_base

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<222> (1)..(1243)

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<223> "n" representa a, b, c, g, otro o desconocido

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 1498

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<212> DNA

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<213> Physcomitrella patens

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<400> 2

2

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<210> 3

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<211> 305

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<212> PRT

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<213> Physcomitrella patens

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<400> 3

3

4

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<210> 4

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<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ctatgacc

\hfill

18

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<210> 5

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctaaagggaa caaaagctg

\hfill

19

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<210> 6

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<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgtaaaacga cggccagt

\hfill

18

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<210> 7

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador

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<400> 7

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atcccgggtg acaatggcgg cagcaagagc t

\hfill

31

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<210> 8

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgagctcac actaaactct agcaaaactg aag

\hfill

33

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<210> 9

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaatagatac gctgacacgc

\hfill

20

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<210> 10

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgagctcac actaaactct agcccccctg aag

\hfill

33

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<210> 11

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador

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<400> 11

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gcagagtata ccgtcaagga ggaag

\hfill

25

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<210> 12

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador

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<400> 12

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ggcttgcctc tccccaattt caaca

\hfill

25

Claims

1. Una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de una proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la planta a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta y en donde la PPSRP se define en SEQ ID NO: 3.

2. La planta transgénica de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codificante de PPSRP comprende un polinucleótido como se define en SEQ ID NO: 2.

3. La planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el ácido nucleico y la proteína son de una Physcomitrella patens.

4. La planta transgénica de la reivindicación 1, en donde la PPSRP tiene al menos 70% de identidad de secuencia con un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 3.

5. La planta transgénica de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codificante de PPSRP se hibrida en condiciones severas a un ácido nucleico como se define en SEQ ID NO: 2.

6. La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, ó 5, en donde el estrés ambiental es sequía, salinidad, o temperatura.

7. La planta transgénica de la reivindicación 6, en donde el estrés ambiental es sequía.

8. La planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la planta es una monocotiledónea.

9. La planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la planta es una dicotiledónea.

10. La planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la planta se selecciona de maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, palma de aceite, cocotero, hierbas perennes y cosechas forrajeras.

11. Una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de una proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde la semilla contiene la PPSRP de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6, ó 7, y en donde la planta es de progenie real para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

12. Una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de una proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde la semilla contiene el ácido nucleico codificante de PPSRP de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5, 6, ó 7, y en donde la planta es progenie real para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

13. Uso de una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una semilla de las reivindicaciones 11 ó 12 para la fabricación de un producto agrícola.

14. Una proteína aislada relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde la PPSRP es como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6, ó 7.

15. Un ácido nucleico aislado codificante de una proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde el ácido nucleico codificante de PPSRP codifica una PPSRP como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6, ó 7.

16. Un ácido nucleico aislado codificante de una proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde el ácido nucleico codificante de PPSRP es como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5,
6, ó 7.

17. Un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, en donde la expresión del vector en una célula hospedadora da como resultado una tolerancia incrementada a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora.

18. Una célula hospedadora que contiene el vector de la reivindicación 17.

19. La célula hospedadora de la reivindicación 18, en donde la célula pertenece a una planta.

20. Un método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico codificante de una proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP), en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado la tolerancia incrementada de la planta a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende,

(a): transformar una célula de la planta con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico codificante de PPSRP, y

(b): generar a partir de la célula de la planta una planta transgénica con una tolerancia incrementada a un estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta,

en donde la PPSRP es como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6, ó 7.

21. El método de la reivindicación 20, en donde el ácido nucleico codificante de PPSRP es como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5, 6, ó 7.

22. Un método de identificación de una nueva proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP) que comprende,

(a): generar una respuesta específica de anticuerpo para una PPSRP como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6, ó 7;

(b): investigar material PPSRP supuesto con el anticuerpo, en donde la fijación específica del anticuerpo al material indica la presencia de una PPSRP potencialmente nueva; y

(c): identificar el material fijado como una nueva PPSRP.

23. Un método de modificación de la tolerancia al estrés de una planta que comprende, modificar la expresión de una proteína relacionada con el estrés por pirofosfatasas (PPSRP) en la planta, en donde la PPSRP es como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6, ó 7.

24. El método de la reivindicación 23, en donde la tolerancia al estrés está incrementada.

25. El método de la reivindicación 23, en donde la tolerancia al estrés está disminuida.

26. El método de la reivindicación 23, en donde la planta no es transgénica.

27. El método de la reivindicación 23, en donde la planta es transgénica.

28. El método de la reivindicación 27, en donde la planta se transforma con un ácido nucleico codificante de PPSRP como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5, 6, 7, ó 9.

29. El método de la reivindicación 27, en donde la planta se transforma con un promotor que dirige la expresión de PPSRP nativa.

30. El método de la reivindicación 29, en donde el promotor es específico de un tejido.

31. El método de la reivindicación 29, en donde el promotor está regulado por el desarrollo.

32. El método de la reivindicación 23, en donde la expresión de PPSRP se modifica por administración de una molécula anti-sentido que inhibe la expresión de PPSRP.