ES2258553T3 - Regulacion del receptor acoplado a la proteina g humana del tipo p2y1. - Google Patents

Abstract

El uso de un método de muestreo, dicho método comprendiendo las etapas de (i) poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y (ii) detectar el enlazamiento de dicho compuesto de prueba a un polipéptido de (i), para la identificación de compuestos útiles en el tratamiento del asma.

Description

Regulación del receptor acoplado a la proteína G humana del tipo P2Y1.

Campo técnico de la invención

La invención se relaciona con el área de los receptores acoplados a la proteína G. Más particularmente, se relaciona con el área de receptores acoplados a la proteína G del tipo P2Y1 y su regulación.

Antecedentes de la invención Receptores Acoplados a la Proteína G

Muchos procesos biológicos médicamente significativos son mediados por rutas de transducción de señal que involucran proteínas G (Lefkowitz, Nature 351, 353-354, 1991). La familia de receptores acoplados a proteína G (GPCR) incluye receptores para hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, y virus. Ejemplos específicos de los GPCR incluye receptores para agentes tan diversos como dopamina, calcitonina, hormonas adrenérgicas, endotelina, cAMP, adenosina, acetilcolina, serotonina, histamina, trombina, cinina, hormona estimulante del folículo, opsinas, gen-1 de diferenciación endotelial, rodopsinas, odorizantes, citomegalovirus, proteínas G en sí mismas, proteínas efectoras tales como fosfolipasa C, adenil ciclasa, y fosfodiesterasa, y proteínas actuadotas tales como la proteína quinasa A y la proteína quinasa C.

Los GPCR poseen siete dominios de membrana conservados que conectan al menos ocho bucles hidrofílicos divergentes. Los GPCR (también conocidos como receptores 7TM) se han caracterizado por incluir estos siete alargamientos hidrófobos conservados de aproximadamente 20 a 30 aminoácidos, que conectan al menos a ocho bucles hidrofílicos divergentes. La mayoría de los GPCR tienen residuos únicos conservados de cisterna en cada uno de los primeros dos bucles extracelulares, que forman enlaces disulfuro que se cree que estabilizan la estructura funcional de la proteína. Las siete regiones transmembrana se denominan TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 y TM7. TM3 ha sido implicado en la transducción de señal.

La fosforilación y la lipidación (palmitilación y la farnesilación) de los residuos de cisteína pueden influenciar la transducción de algunos GPCR. La mayoría de los GPCR contienen sitios potenciales de fosforilación dentro del tercer bucle citoplasmático y/o el carboxi-terminal. Para diferentes GPCR, tales como el receptor \beta-adrenérgico, la fosforilación por medio de la proteína quinasa A y/o las quinasas receptoras específicas, median la desensibilización del receptor.

Para algunos receptores, se cree que los sitios de enlazamiento del ligando de los GPCR se cree que comprenden receptáculos hidrofílicos formados por diferentes dominios transmembrana de GPCR. Los receptáculos hidrofílicos están rodeados por residuos hidrófobos de los GPCR. El sitio hidrofílico de cada hélice transmembrana de GPCR está postulado para mirar hacia el interior y formar un sitio polar de enlazamiento del ligando. TM3 ha estado implicado en diferentes GPCR por tener un sitio de enlazamiento del ligando, tal como el residuo de aspartato TM3. Las serinas TM5, una asparagina TM6 y fenilalaninas o tirosinas TM6 o TM7 también están implicadas en el enlazamiento del ligando.

Los GPCR se acoplan dentro de la célula por medio de proteínas G heterotriméricas a diferentes enzimas intracelulares, canales iónicos y transportadores (ver Johnson y colaboradores, Endoc. Rev. 10, 317-331, 1989). Diferentes subunidades alfa de proteína G estimulan en forma preferencial a los efectores particulares para modular diferentes funciones biológicas en una célula. La fosforilación de residuos citoplasmáticos de los GPCR es un mecanismo importante para la regulación de algunos de los GPCR. Por ejemplo, en una forma de transducción de señal, el efecto del enlazamiento de la hormona es la activación dentro de la célula de la enzima, adenilato ciclasa. La activación de la enzima por las hormonas depende de la presencia del nucleótido GTP. GTP también influencia el enlazamiento de la hormona. Una proteína G conecta el receptor de la hormona a la adenilato ciclasa. La proteína G intercambia GTP por el GDP enlazado cuando es activada por medio de un receptor hormonal. La forma que transporta al GTP se enlaza entonces a la adenilato ciclasa activada. La hidrólisis de GTP a GDP, catalizada por la propia proteína G, retorna la proteína G a su forma basal inactiva. Así, la proteína G sirve un doble papel, como una intermediaria que retransmite la señal desde el receptor hasta el efector, y como un reloj que controla la duración de la señal.

Durante los últimos 15 años, se han introducido exitosamente en el mercado cerca de 350 agentes terapéuticos que dirigen a los GPCR. Esto indica que estos receptores tienen una historia probada establecida como objetivos terapéuticos. Claramente, existe una necesidad permanente para la identificación y la caracterización de otros GPCR que puedan jugar un papel en la prevención, mejoramiento, o corrección de disfunciones o enfermedades.

Receptores P2Y

La adenosina 5’-trifosfato (ATP) tiene muchas funciones fisiológicas diferentes en la célula. Por ejemplo, la ATP es la fuente de energía para muchas reacciones bioquímicas, un precursor para la síntesis del ácido ribonucleico (ARN), el precursor para la síntesis cíclica de AMP, etc. La ATP también funciona como un mensajero extracelular en tejidos neuronales y no neuronales. La ATP extracelular ejerce sus efectos sobre estos tejidos actuando a través de los purinoreceptores asociados a la membrana (Burnstock, G. Ann. NY Acad. Sci. (1990) 603:1-17). Los purinoreceptores pueden ser o canales de iones abiertos para los ligandos (Bean, B. P. (1992) Trends Pharmac. Sci. 12:87-90; Bean, B. P. y Fried, D. D. (1990) Ion Channels 2:169-203) a los cuales se hace referencia comúnmente como a receptores P2X, (pero también conocidos como: canales purinérgicos, canales P2X R, y canales abiertos para la ATP) o receptores acoplados a la proteína G (P2Y o P2V) (Barnard, E. A. y colaboradores, (1994) Trends Pharmac. Sci. 15:67-70). Ver la patente estadounidense No. 5.856.129.

Los receptores P2Y1 son abundantes en el cerebro (Filippov y colaboradores, Br. J. Pharmacol. 129, 1063-66, 2000) y se encuentran en diferentes sitios, incluido el músculo vascular liso (Erlinge y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 864-70, 2998), en los fibroblastos cardíacos de neonato de (Zheng y colaboradores, Cardiovasc. Res. 37, 718-28, 1998), y en los miocitos cardíacos de adultos y de recién nacidos (Webb y colaboradores, J. Auton. Pharmacol. 16, 303-07, 1996).

Debido a la amplia distribución de los GPCR con diferentes efectos biológicos, incluidos los receptores P2Y, existe una necesidad en el arte por identificar miembros adicionales de la familia GPCR cuya actividad pueda ser regulada para proveer efectos terapéuticos. Ayyanathan Kasirajan y colaboradores (Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 218, No. 3, 1996, 783-788) revelan un GPCR purinoceptor P2Y1 humano.

Banner K.H. y Page C.P. (European Respiratory Journal, vol. 8, No. 6, 1995, 996-1000) revelan el uso de un método de muestreo para la identificación de compuestos (por ejemplo, teofilina e inhibidores selectivos de fosfodiesterasa) útiles en el tratamiento del asma.

Resumen de la invención

Una modalidad de la invención es un método de muestreo para agentes potencialmente útiles en el tratamiento del asma. Se pone en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:

secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente 90% idénticos a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2; y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2.

Se detecta el enlazamiento entre el compuesto de prueba y el polipéptido del GPCR tipo P2Y1. Un compuesto de prueba que se enlaza al polipéptido del GPCR tipo P2Y1 es identificado así como un agente potencial para el tratamiento del asma. El agente puede funcionar disminuyendo la actividad del GPCR tipo P2Y1.

Otra modalidad de la invención es un método adicional de muestreo para agentes que son agentes potenciales para el tratamiento del asma. Un compuesto de prueba se pone en contacto con un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:

secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente 90% idénticas a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2; y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2.

Se detecta la actividad del polipéptido del GPCR tipo P2Y1. Un compuesto de prueba que incrementa la actividad del polipéptido del GPCR tipo P2Y1 con relación a la actividad del GPCR tipo P2Y1 en ausencia del compuesto de prueba es identificado así como un agente potencial para el tratamiento del asma. Un compuesto de prueba que disminuye la actividad del polipéptido del GPCR tipo P2Y1 con relación a la actividad del GPCR tipo P2Y1 en ausencia del compuesto de prueba es identificado así como un agente potencial para el tratamiento del asma.

Aún otra modalidad de la invención es un método adicional de muestreo para agentes que son potencialmente útiles para el tratamiento del asma. Un compuesto de prueba se pone en contacto con un producto de un polinucleótido del GPCR tipo P2Y1 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de:

secuencias de nucleótidos que codifican una proteína con al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos revelada por la SEQ ID NO:2.

Se detecta el enlazamiento del compuesto de prueba al producto GPCR tipo P2Y1. Un compuesto de prueba que se enlaza al producto GPCR tipo P2Y1 es identificado así como un agente potencial para el tratamiento del asma.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la secuencia de ADN que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 (SEQ ID NO: 1).

La Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN de la Fig. 1 (SEQ ID NO: 2).

La Fig. 3 muestra la secuencia de ADN que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 (SEQ ID NO: 3).

La Fig. 4 muestra la secuencia de ADN que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 (SEQ ID NO: 4).

La Fig. 5 muestra la secuencia de ADN que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 (SEQ ID NO: 5).

La Fig. 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína identificada por medio del SwissProt Accession No. P49650 (SEQ ID NO: 6).

La Fig. 7 muestra la alineación BLASTP del GPCR tipo P2Y1 (SEQ ID NO: 2) y la proteína identificada por medio del SwissProt Accession No. P49650 (SEQ ID NO: 6). Los dominios transmembrana sobre la secuencia están resaltadas en negrilla y subrayadas. Los receptores P2Y1 que tienen mutaciones F226A, K280A, o Q307A, no enlazan al antagonista, 2’-desoxi-N6-metiladenosina 3’, 5’-bisfosfato (MRS 2179), indicando que esos residuos son críticos para el enlazamiento de la molécula del antagonista. GPCR tipo P2Y1 está ausente de estos tres sitios. De los tres sitios que son críticos para el enlazamiento de ligandos en humanos, dos se conservan como lo muestran los residuos en negrilla, subrayados (sin itálicas) sobre la secuencia pregunta. Las mutaciones en cada uno de estos residuos conducen individualmente a la pérdida del enlazamiento. De este modo los residuos sobre la cara externa de TM3 y de TM7 son determinantes críticos del bolsillo de enlazamiento de ATP. El ATP puede ser cortado en el receptor, ambos dentro de la abertura de TM definida previamente y dentro de otras dos regiones del receptor, llamadas sitios de metaenlazamiento, definidos por medio de los bucles extracelulares. El primer sitio de metaenlazamiento se localiza por fuera del haz de TM, entre EL2 y EL3, y el segundo sitio de mayor energía se posiciona inmediatamente debajo de EL2. El enlazamiento tanto al sitio principal de enlazamiento de TM como a los sitios de metaenlazamiento de menor energía, afectan potencialmente la fuerza del ligando. En el sitio de metaenlazamiento I, la cadena lateral de Glu (EL2) (Negrilla, Itálica, Subrayada, entre el dominio 4 y 5 de TM) está dentro de la distancia del enlace de hidrógeno (2,8 A) de la ribosa O3’, y la Arg (EL3) (Negrilla, Itálica, Subrayada, entre el dominio 6 y 7 de TM) coordina tanto a los fosfatos alfa y beta de la cadena trifosfato.

La Fig. 8 muestra la expresión relativa del receptor acoplado a la proteína G tipo P2Y1 en diferentes tejidos humanos y la línea celular HL60 tipo neutrófilo.

La Fig. 9 muestra la expresión relativa del receptor acoplado a la proteína G tipo P2Y1 en células y tejidos respiratorios.

La Fig. 10 muestra la expresión relativa de GPCR tipo P2Y1 humano en diferentes tejidos humanos.

La Fig. 11 muestra la expresión relativa de GPCR tipo P2Y1 en trombocitos humanos de no fumadores y de fumadores, en arterias coronarias, en cerebro y en intestino delgado.

Descripción detallada de la invención

La invención se relaciona con el uso de un polinucleótido aislado que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 y que se selecciona del grupo que consiste de:

un polinucleótido que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos que son al menos 90% idénticas a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, y los polipéptidos codificados así para el muestreo por agentes potencialmente útiles para el tratamiento del asma.

Los desordenes tales como el asma pueden se tratados por medio de la regulación del GPCR tipo P2Y1. GPCR tipo P2Y1 también puede ser utilizado para muestrear los agonistas y antagonistas del GPCR tipo P2Y1.

Polipéptidos

Los polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 de acuerdo con la invención comprenden al menos 10, 12, 15, 20, 24, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325 o 350 aminoácidos contiguos seleccionados de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o una variante biológicamente activa de esa secuencia, como se define más adelante. Un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 de la invención puede ser por lo tanto una porción del GPCR tipo P2Y1, un GPCR tipo P2Y1 de longitud completa, o una proteína de fusión que comprende todo o una porción del GPCR tipo P2Y1.

Variantes Biológicamente Activas

Las variantes del polipéptido del GPCR tipo P2Y1 que son biológicamente activas, esto es, que retienen la capacidad de enlazarse a un ligando para producir un efecto biológico, tal como una formación cíclica AMP, movilización de calcio intracelular, o metabolismo fosfoinositida, también son polipéptidos del GPCR tipo P2Y1. Preferiblemente, las variantes del polipéptido del GPCR tipo P2Y1 de ocurrencia natural o no natural, tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 90, 96 ó 98% idénticas a una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma. El porcentaje de identidad entre una variante del polipéptido del GPCR tipo P2Y1 putativo y una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 se determina utilizando el programa de alineación
Blast2.

Las variaciones en el porcentaje de identidad pueden deberse, por ejemplo, a sustituciones de aminoácidos, inserciones, o supresiones. Las sustituciones de aminoácidos se definen como reemplazos de aminoácidos uno a uno. Ellos son conservativos por naturaleza cuando el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales y/o químicas similares. Ejemplos de reemplazos conservativos son las sustituciones de una leucina por una isoleucina o una valina, un aspartato por un glutamato, o una treonina por una serina.

Las inserciones o las supresiones de aminoácidos son cambios por o dentro de una secuencia de aminoácidos. Ellas caen típicamente aproximadamente en el rango de 1 a 5 aminoácidos. La guía para determinar que residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos, insertados, o suprimidos sin abolir la actividad biológica o inmunológica de un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 puede ser encontrada utilizando programas de computador bien conocidos en el estado de la técnica, tales como el software DNASTAR. Si un cambio de aminoácido resulta en un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 biológicamente activo, puede ser fácilmente determinado por medio del ensayo del enlazamiento a un ligando o conduciendo un ensayo funcional, como se describe por ejemplo, en los Ejemplos específicos, más adelante.

Polinucleótidos

Un polinucleótido del GPCR tipo P2Y1 puede ser de cadena sencilla o de cadena doble y comprende una secuencia de codificación o el complemento de una secuencia de codificación para un polipéptido del GPCR tipo P2Y1. Una secuencia de nucleótidos que codifican a la SEQ ID NO:2 se muestra en la SEQ ID NO: 5. Los extremos 5’ y 3’ del gen del GPCR tipo P2Y1 se muestran en las SEQ ID NOS: 1 y 3, respectivamente. La región promotora con el inicio ATG se muestra en la SEQ ID NO: 4.

Obtención de Polipéptidos

Los polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 pueden obtenerse, por ejemplo, por medio de purificación de células, por medio de expresión de polinucleótidos del GPCR tipo P2Y1, o por medio de síntesis química directa.

Purificación de Proteína

Los polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 pueden purificarse a partir de cualquier célula que exprese al receptor, incluidas las células huésped que han sido transfectadas con polinucleótidos del GPCR tipo P2Y1 que expresan a tales polipéptidos. Un polipéptido purificado del GPCR tipo P2Y1 se separa de otros compuestos que normalmente se asocian con el polipéptido del GPCR tipo P2Y1 en la célula, tal como ciertas proteínas, carbohidratos, o lípidos, utilizando métodos bien conocidos en el estado del arte. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de exclusión por tamaño, fraccionamiento con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y electroforesis preparativa sobre gel.

Un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 puede ser aislado convenientemente como un complejo con su proteína G asociada, como se describe en los ejemplos específicos, más adelante. Una preparación de polipéptidos purificados del GPCR tipo P2Y1 es al menos 80% pura; preferiblemente, las preparaciones son 90%, 95%, o 99% puras. La pureza de las preparaciones puede evaluarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica, tal como electroforesis sobre gel de poliacrilamida SDS.

Expresión de Polinucleótidos

Para expresar un polipéptido del GPCR tipo P2Y1, puede insertarse un polinucleótido del GPCR tipo P2Y1 dentro de un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Pueden utilizarse métodos que son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 y elementos adecuados de control transcripcional y de traducción. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis, y recombinación genética in vivo. Tales técnicas son descritas por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, (1989) y en Ausubel y colaboradores, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989.

Pueden utilizarse una variedad de sistemas vector/huésped de expresión para contener y expresar secuencias que codifican a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con un bacteriófago recombinante, plásmido, o vectores cósmidos de expresión de ADN; levadura transformada con vectores de expresión de levadura, sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión viral (por ejemplo, baculovirus), sistemas celulares de plantas transformados con vectores de expresión viral (por ejemplo, virus del mosaico del coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterial (por ejemplo, Ti o plásmidos pBR322), o sistemas celulares animales.

Los elementos de control o secuencias reguladoras son aquellas regiones no traducidas del vector -potenciadoras, promotoras, regiones 5’ y 3’ no traducidas- que interactúan con proteínas celulares del huésped para llevar acabo la transcripción y la traducción. Tales elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema vector y del huésped utilizado, pueden utilizarse cualquier número de elementos adecuados de transcripción y de traducción, incluidos los promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacteriales, pueden utilizarse promotores inducibles tales como el promotor híbrido lacZ del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, California) o el plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares. Puede utilizarse el promotor de polihedrina del baculovirus en células de insectos. Los promotores o potenciadores derivados de los genomas de células de plantas (por ejemplo, choque térmico, RUBISCO, y genes de proteína de reserva) o de virus de plantas (por ejemplo, promotores virales o secuencias líder) pueden ser clonados dentro del vector. Se prefieren los sistemas celulares de mamífero, promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1, pueden utilizarse vectores basados en SV40 o EBV, con un marcador seleccionable adecuado.

Sistemas de Expresión Bacteriales y de Levaduras

En sistemas bacteriales, pueden seleccionarse una multitud de vectores de expresión dependiendo el uso pretendido para el polipéptido del GPCR tipo P2Y1. Por ejemplo, cuando se necesita una gran cantidad de un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 para la inducción de anticuerpos, pueden utilizarse los vectores que dirigen la expresión de alto nivel de las proteínas de fusión que son fácilmente purificadas. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, los vectores multifuncionales de clonación y expresión de E. coli tales como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector BLUESCRIPT, una secuencia que codifica al polipéptido del GPCR tipo P2Y1 puede ligarse dentro del vector en el marco con secuencias para el Met aminoterminal y los subsiguientes 7 residuos de \beta-galactosidasa para que se produzca una proteína híbrida. Los vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509, 1989) o los vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) también pueden ser usados para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutationa S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser fácilmente purificadas a partir de células lisadas por medio de la adsorción a perlas de glutationa-agarosa seguido por la elución en presencia de glutationa libre. Las proteínas elaboradas en tales sistemas pueden ser diseñadas para incluir heparina, trombina, o sitios de escisión del factor Xa proteasa de modo que el polipéptido clonado de interés pueda ser liberado de la fracción GST a voluntad.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden utilizarse una cantidad de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, la alcohol oxidasa, y PGH. Para revisión, ver Ausubel y colaboradores (1989) y Grant y colaboradores, Methods Enzymol. 153, 516-544, 1987.

Sistemas de Expresión de Plantas e Insectos

Si se utilizan vectores de expresión de plantas, la expresión de las secuencias que codifican a los polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 puede ser conducida por cualquiera entre una cantidad de promotores. Por ejemplo, promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de CaMV pueden ser utilizados solos o en combinación con las secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6, 307-311, 1987). Alternativamente, pueden utilizarse los promotores de plantas tales como la pequeña subunidad de RUBISCO o los promotores de choque térmico (Coruzzi y colaboradores, EMBO J. 3, 1671-1680, 1984; Broglie y colaboradores, Science 224, 838-843, 1984; Winter y colaboradores, Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991). Estas construcciones pueden introducirse dentro de células de plantas por medio de transformación directa de ADN, o por medio de transfección mediada por un patógeno. Tales técnicas son descritas en una cantidad de revisiones generalmente disponibles (por ejemplo, Hobbs o Murray, en MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., págs. 191-196, 1992).

También puede utilizarse un sistema de insectos para expresar un polipéptido del GPCR tipo P2Y1. Por ejemplo, en uno de tales sistemas se utilizan un virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar a los genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en Trichoplusia larvae. Las secuencias que codifican a los polipéptidos del GPCR tipo P2Y1, pueden ser clonadas en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocadas bajo el control del promotor de la polihedrina. Las inserciones exitosas de polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 suministrarán al gen inactivo de polihedrina y producirán virus recombinante que carece de la proteína de recubrimiento. Los virus recombinantes pueden utilizarse entonces para infectar células de S. frugiperda o de Trichoplusia larvae en las cuales pueden expresarse los polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 (Engelhard y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224-3227, 1994).

Sistemas de Expresión en Mamíferos

Pueden utilizarse una cantidad de sistemas de expresión basados en virus para expresar a los polipéptido del GPCR tipo P2Y1 en células huésped de mamífero. Por ejemplo, si se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, las secuencias que codifican a los polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 pueden ligarse dentro de un complejo de transcripción/traducción de un adenovirus que comprende al promotor tardío y a la secuencia tripartita líder. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral, puede ser utilizada para obtener un virus viable que sea capaz de expresar a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 en células huésped infectadas (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659, 1984). Si se desea, pueden utilizarse potenciadores de transcripción, tales como el potenciador del virus de sarcoma Rous (RSV), para incrementar la expresión en células huésped de mamífero.

Los cromosomas artificiales humanos (HAC) también pueden ser utilizados para liberar fragmentos más grandes de ADN que puedan ser contenidos y expresados en un plásmido. Los HAC de 6M a 10M se construyen y se liberan a las células a través de métodos convencionales de liberación (por ejemplo, liposomas, polímeros amino policatiónicos, o vesículas).

Las señales especificas de iniciación también pueden ser utilizadas para lograr una traducción más eficiente de secuencias codifican a los polipéptidos del GPCR tipo P2Y1. Tales señales incluyen al codón de iniciación ATG y a las secuencias adyacentes. En los casos en donde las secuencias codifican a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1, su codón de iniciación, y las secuencias secuencia arriba se insertan dentro del vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control transcripcional o de traducción. Sin embargo, en los casos en donde solamente se inserta la secuencia de codificación, o un fragmento de la misma, deben suministrarse señales exógenas de control de traducción (incluyen al codón de iniciación ATG). El codón de iniciación debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción del inserto completo. Los elementos exógenos de traducción y los codones de iniciación pueden ser de diferentes orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede mejorarse por medio de la inclusión de potenciadores que son apropiados para el sistema celular particular que es utilizado (ver Scharf y colaboradores, Results Probl. Cell Differ. 20, 125-162, 1994).

Células Huésped

Una cepa de célula huésped puede ser escogida por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar al polipéptido del GPCR tipo P2Y1 en la forma deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. El proceso de post-traducción que escinde una forma "prepro" del polipéptido, también puede ser utilizada para facilitar la correcta inserción, el plegamiento y/o la función. Diferentes células huésped que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para las actividades de post-traducción (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38), están disponibles a partir de la American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209) y pueden ser escogidas para asegurar la correcta modificación y el procesamiento de la proteína foránea.

Se prefiere la expresión estable para una producción a largo plazo y alto rendimiento de proteínas recombinantes. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan en forma estable a los polipéptido del GPCR tipo P2Y1, pueden ser transformadas utilizando vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación viral y/o elementos de expresión endógena, y un gen marcador seleccionable sobre el mismo o sobre un vector separado. Después de la introducción del vector, se les permite a las células desarrollarse durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que ellas sean cambiadas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia para la selección, y su presencia permite el desarrollo y la recuperación de las células que expresan exitosamente las secuencias introducidas del GPCR tipo P2Y1. Los clones resistentes de células transformadas en forma estable, pueden ser proliferados utilizando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas al tipo celular. Ver, por ejemplo, ANIMAL CELL CULTURE, R.I. Freshney, ed., 1986.

Cualquier cantidad de sistemas de selección pueden ser utilizados para recobrar las líneas celulares transformadas. Estos incluyen, pero no se limitan a, la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler y colaboradores, Cell 11, 223-32, 1977) y a los genes de la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy y colaboradores, Cell 22, 817-23, 1980) que debe emplearse en células tk- o aprt-, respectivamente. También, pueden utilizarse resistencia antimetabolito, antibiótica, o herbicida como la base para selección. Por ejemplo, dhfr confiere resistencia al metotrexato (Wigler y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567-70, 1980), npt confiere resistencia a los aminoglyicosidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin y colaboradores, J. Mol. Biol. 150, 1-14, 1981), y als y pat confieren resistencia al clorsulfurón y a la fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murray, 1992, supra). Se han descrito genes adicionalmente seleccionables. Por ejemplo, trpB permite a las células utilizar indol en lugar de triptofano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047-51, 1988). Pueden utilizarse marcadores visibles tales como antocianinas, \beta-glucuronidasa y su substrato GUS, y luciferasa y su substrato luciferina, para identificar transformantes y para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema específico de vector (Rhodes y colaboradores, Methods Mol. Biol. 55, 121-131, 1995).

Detección de la Expresión de Polipéptidos

Aunque la presencia de la expresión del gen marcador sugiere que el polipéptido del GPCR tipo P2Y1 está también presente, su presencia y expresión puede necesitar ser confirmada. Por ejemplo, si una secuencia que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 se inserta dentro de una secuencia de un gen marcador, las células transformadas que contienen secuencias de codifican a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1, pueden ser identificadas por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, un gen marcador puede ser colocado en tándem con una secuencia que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 bajo el control de un promotor único. La expresión del gen marcador en respuesta a la inclusión o a la selección, usualmente indica la expresión del polinucleótido del GPCR tipo P2Y1.

Alternativamente, las células huésped que contienen un polinucleótido del GPCR tipo P2Y1 y que expresan a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1, pueden ser identificadas por medio de una cantidad de procedimientos conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y bioensayos de proteína o técnicas de inmunoensayo que incluyen tecnologías basadas en membrana, solución o chip para la detección y/o la cuantificación de ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, la presencia de una secuencia de polinucleótidos que codifican a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 puede ser detectada por medio de hibridación ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación utilizando sondas o fragmentos, o fragmentos de polinucleótidos que codifican a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1. Los ensayos basados en la amplificación de ácido nucleico involucran el uso de oligonucleótidos seleccionados entre las secuencias que codifican a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 para detectar transformantes que contienen un polinucleótido del GPCR tipo P2Y1.

Una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de un polipéptido del GPCR tipo P2Y1, utilizando ya sea anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el polipéptido, son conocidos en el arte. Los ejemplos incluyen ensayos con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), y distribución de células activadas por fluorescencia (FACS). Pueden utilizarse un inmunoensayo basado en dos sitios monoclonales usando anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopos que no interfieren sobre un polipéptido del GPCR tipo P2Y1, o puede emplearse un ensayo de enlazamiento competitivo. Estos y otros ensayos son descritos en Hampton y colaboradores, SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minn., 1990) y Maddox y colaboradores, J. Exp. Med. 158, 1211-1216, 1983).

Una gran variedad de marcadores y técnicas de conjugación son conocidas por aquellos entrenados en la técnica, y pueden ser utilizadas en diferentes ensayos de ácido nucleico y de aminoácidos. Los medios para producir hibridación marcada o sondas PCR para detectar secuencias relacionadas con los polinucleótidos que codifican a los polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 incluyen oligomarcación, traslado de mellas, marcación terminal, o amplificación por PCR utilizando un nucleótido marcado. Alternativamente, pueden clonarse secuencias que codifican a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 dentro de un vector para la producción de una sonda de ARNm. Tales vectores son conocidos en el arte, se encuentran comercialmente disponibles, y pueden ser utilizados para sintetizar sondas de ARN in vitro por medio de la adición de nucleótidos marcados y una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3 o SP6. Estos procedimientos pueden conducirse utilizando una variedad de kits comercialmente disponibles (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, y US Biochemical). Moléculas reporteras adecuadas o marcadores y pueden ser utilizados para una fácil detección incluyen radionúclidos, enzimas, y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.

Expresión y Purificación de Polipéptidos

Las células huésped transformadas con secuencias de nucleótidos que codifican a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1, pueden ser cultivadas bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína del cultivo celular. El polipéptido producido por una célula transformada puede ser secretado o contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector usado. Como lo comprenderán aquellos entrenados en la técnica, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican a los polipéptidos del GPCR tipo P2Y1, pueden ser diseñados para contener secuencias de señal que dirigen la secreción de polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 a través de una membrana de célula procariota u eucariota, o que dirigen la inserción a la membrana de un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 enlazado a la membrana.

Como se discutió antes, pueden utilizarse otras construcciones para unir una secuencia que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 a una secuencia de nucleótidos que codifican a un dominio de polipéptido que facilitará la purificación de proteínas solubles. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos metálicos de quelación tales como los módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). La inclusión de secuencias enlazadoras de escisión tales como aquellas específicas para el Factor Xa o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido del GPCR tipo P2Y1, también pueden ser utilizadas para facilitar la purificación. Uno de tales vectores de expresión provee la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 y 6 residuos de histidina precediendo a un sitio de escisión con tioredoxina o una enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación por medio de IMAC (cromatografía de afinidad por ión metálico inmovilizado, como lo describen Porath y colaboradores, Prot. Exp. Purif. 3, 263-281, 1992), mientras que el sitio de escisión por enteroquinasa provee un medio para purificar al polipéptido del GPCR tipo P2Y1 de la proteína de fusión. Los vectores que contienen proteínas de fusión son revelados por Kroll y colaboradores, DNA Cell Biol. 12, 441-453, 1993.

Síntesis Química

Las secuencias que codifican a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 pueden sintetizarse, totalmente o en parte, utilizando métodos químicos bien conocidos en el arte (ver Caruthers y colaboradores, Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Hom y colaboradores Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980). Alternativamente, un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 puede ser producido por sí mismo utilizando métodos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos, tal como por síntesis directa del péptido utilizando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge y colaboradores, Science 269, 202-204, 1995). La síntesis de proteína puede ser realizada utilizando técnicas manuales o automatizadas. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, utilizando el Sintetizador de Péptidos 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer). Opcionalmente, fragmentos de polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 pueden ser sintetizados separadamente y combinados utilizando métodos químicos para producir una molécula de longitud completa.

El péptido recientemente sintetizado puede ser purificado sustancialmente por medio de cromatografía líquida preparativa de alto rendimiento (por ejemplo, Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co., New York, N.Y., 1983). La composición de un polipéptido sintético del GPCR tipo P2Y1 puede ser confirmada por medio de análisis de aminoácidos o secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; ver Creighton, supra). Adicionalmente, cualquier porción de la secuencia de aminoácidos del polipéptido del GPCR tipo P2Y1 puede ser alterada durante la síntesis directa y/o combinada utilizando métodos químicos con secuencias de otras proteínas para producir una variante de polipéptido o una proteína de
fusión.

Producción de Polipéptidos Alterados

Como lo entenderán aquellos entrenados en la materia, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican al polipéptido del GPCR tipo P2Y1 se posee codones de ocurrencia no natural. Por ejemplo, los codones preferidos por un huésped procariota o eucariota particular, pueden seleccionarse para incrementar la velocidad de expresión de la proteína o para producir un transcrito de ARN que tenga propiedades deseables, tales como una vida media que sea mayor que aquella de un transcrito generado a partir de la secuencia de ocurrencia natural.

Las secuencias de nucleótidos reveladas aquí, pueden ser modificadas genéticamente utilizando métodos generalmente conocidos en el estado la técnica, para alterar las secuencias de codificación del polipéptido del GPCR tipo P2Y1 por una variedad de razones, incluidas pero no limitadas a, alteraciones que modifiquen la clonación, el procesamiento y/o la expresión del polipéptido o del producto de ARNm. La mezcla de ADN por medio de fragmentación aleatoria y el reensamblaje por PCR de fragmentos de genes y oligonucleótidos sintéticos pueden ser utilizados para modificar genéticamente las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio puede ser utilizada para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia del codón, producir variantes de empalme, introducir mutaciones, etc.

Genes Diferencialmente Expresados

Se describen aquí los métodos para la identificación de genes cuyos productos interactúan con el receptor acoplado a la proteína G tipo P2Y1. Tales genes pueden representar a genes que están diferencialmente expresados en desórdenes que incluyen, pero no se limitan a, desórdenes CNS, desórdenes cardiovasculares, asma, osteoporosis, diabetes, y COPD.

Además, tales genes pueden representar a genes que están en diferencialmente regulados en respuesta a manipulaciones relevantes para la progresión o el tratamiento de tales enfermedades. Adicionalmente, tales genes pueden tener una expresión temporalmente modulada, aumentada o disminuida en diferentes etapas de desarrollo del tejido u organismo. Un gen diferencialmente expresado puede tener también su expresión modulada bajo control versus las condiciones experimentales. Además, el gen receptor acoplado a la proteína G tipo P2Y1 humana o el producto génico pueden por sí mismos ser analizados por expresión diferencial.

El grado en el cual difiere la expresión en un estado normal versus un estado de enfermedad solamente necesita ser lo suficientemente grande para ser visualizado a través de técnicas estándar de caracterización tal como las técnicas de despliegue diferencial. Otras de tales técnicas estándar de caracterización por medio de las cuales pueden visualizarse las diferencias de expresión incluyen, pero no se limitan a, RT cuantitativo (transcriptasa inversa), PCR, y análisis Northern.

Identificación de Genes Diferencialmente Expresados

Para identificar a los genes preferencialmente expresados, se aísla el ARN total o, preferiblemente, el ARNm de los tejidos de interés. Por ejemplo, las muestras de ARN se obtienen a partir de los tejidos de sujetos experimentales y de los tejidos correspondientes de los sujetos de control. Puede utilizarse cualquier técnica de aislamiento de ARN quien no se seleccione contra el aislamiento de ARNm para la purificación de tales muestras de ARN. Ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. New York, 1987-1993. Pueden procesarse fácilmente grandes cantidades de muestras de tejido utilizando técnicas bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica, tales como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN en una sola etapa, de Chomczynski, patente estadounidense No. 4.843.155.

Los transcritos dentro de las muestras recolectadas de ARN que representan al ARN producido por los genes diferencialmente expresados, se identifican por medio de métodos bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, muestreo diferencial (Tedder y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 208-12, 1988), hibridación sustractiva (Hedrick y colaboradores, Nature 308, 149-53; Lee y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2825, 1984), y despliegue diferencial (Liang & Pardee, Science 257, 967-71, 1992; patente estadounidense No. 5.262.311), y micromatrices.

La información de expresión diferencial pueden por sí misma sugerir métodos relevantes para el tratamiento de desórdenes que involucran al receptor acoplado a la proteína G tipo P2Y1 humana. Por ejemplo, el tratamiento puede incluir una modulación en la expresión de los genes expresados diferencialmente y/o al gen que codifica al receptor acoplado a la proteína G tipo P2Y1 humana. La información de la expresión diferencial puede indicar si la expresión o la actividad del gen expresado diferencialmente o el producto génico o el gen receptor acoplado a la proteína G tipo P2Y1 humana o el producto génico están dispuestos hacia arriba o dispuestos hacia abajo.

Métodos de Muestreo

La invención provee ensayos para el muestreo de los compuestos de prueba que se enlazan a, modulan la actividad del polipéptido del GPCR tipo P2Y1, o un polinucleótido del GPCR tipo P2Y1. Un compuesto de prueba preferiblemente se enlaza a un polipéptido o polinucleótido del GPCR tipo P2Y1. Más preferiblemente, un compuesto de prueba disminuye o incrementa un efecto biológico mediado a través del GPCR tipo P2Y1 en al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, o 100% con relación a la ausencia del compuesto de prueba.

Compuestos de Prueba

Los compuestos de prueba pueden ser agentes farmacológicos ya conocidos en el estado la técnica, o pueden ser compuestos que anteriormente se desconocía que tenían alguna actividad farmacológica. Los compuestos pueden ser de ocurrencia natural o diseñados en el laboratorio. Pueden aislarse de microorganismos, animales, o plantas, y pueden ser producidos en forma recombinante, o ser sintetizados por medio de métodos químicos conocidos en el estado de la técnica. Si se desea, los compuestos de prueba pueden obtenerse utilizando cualquier de los numerosos métodos de genotecas para combinación conocidas en el estado la técnica, que incluyen pero no se limitan a, genotecas biológicas, genotecas en fases sólida paralela espacialmente direccionables o en fase de solución, métodos de genotecas sintéticas utilizando selección por medio de cromatografía de afinidad. La aproximación de la genoteca biológica se limita a genotecas de polipéptidos, mientras que otras cuatro aproximaciones son aplicables a polipéptidos, oligómeros no peptídicos, o a librerías de pequeñas moléculas de compuestos. Ver Lam, Anticáncer Drug Des. 12, 145, 1997.

Los métodos para la síntesis de genotecas moleculares son bien conocidos en el estado de la técnica (ver, por ejemplo, DeWitt y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb y colaboradores, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann y colaboradores, J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho y colaboradores, Science 261, 1303, 1993; Carell y colaboradores, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell y colaboradores, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop y colaboradores, J. Med. Chem. 37, 1233, 1994). Las genotecas de compuestos pueden presentarse en solución (ver, por ejemplo, Houghten, BioTechniques 13, 412-421, 1992), o sobre perlas (Lam, Nature 354, 82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364, 555-556, 1993), bacterias o esporas (Ladner, patente estadounidense No. 5.223.409), plásmidos (Cull y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992), o fagos (Scott & Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirla y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; y Ladner, patente estadounidense No. 5.223.409).

Muestreo de Alta Producción

Los compuestos de prueba pueden muestrearse por la capacidad de enlazarse a polipéptidos o polinucleótidos del GPCR tipo P2Y1 o para afectar la actividad de los GPCR tipo P2Y1 o la expresión génica de los GPCR tipo P2Y1, utilizando muestreo de alta producción. Usando el muestreo de alta producción, pueden analizarse en paralelo muchos compuestos discretos para que gran número de compuestos de prueba puedan ser rápidamente muestreados. Las técnicas más ampliamente establecidas utilizan placas de microtitulación de 96 pozos. Los pozos de las placas de microtitulación requieren típicamente de volúmenes de ensayo en el rango de 50 a 500 \mul. Además de las placas, se encuentran disponibles comercialmente muchos instrumentos, materiales, pipeteadores, robótica, lavadores de placas, lectores de placas que encajan con el formato de 96 pozos.

Alternativamente, pueden utilizarse "los ensayos de formato libre", o los ensayos que no tienen barreras físicas entre muestras. Por ejemplo, Jayawickreme y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19, 1614-18 (1994) describen un ensayo que utiliza células pigmentarias (melanocitos) en un ensayo homogéneo simple para genotecas de péptidos de combinación. Las células se colocan bajo agarosa en cajas de Petri, luego se colocan las perlas que transportan compuestos de combinación sobre la superficie de la agarosa. Los compuestos de combinación son liberados parcialmente de los compuestos de las perlas. Los compuestos activos pueden visualizarse como áreas de pigmentos oscuro ya que, mientras que los compuestos se difunden localmente dentro de la matriz del gel, los compuestos activos causan que las células cambien de color.

Otro ejemplo de un ensayo de formato libre es descrito por Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches", reportado en la First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening en Filadelfia, Pa. (Nov. 7-10, 1995). Chelsky colocó un ensayo de una enzima homogénea sencilla para anhidrasa carbónica dentro de un gel de agarosa de tal manera que la enzima en el gel causaría un cambio de color a través del gel. Después, las perlas que transportan a los compuestos para combinación a través de un fotoenlazador, fueron colocadas dentro del gel y los compuestos fueron parcialmente liberados por medio de luz UV. Los compuestos que inhibieron a la enzima fueron observados como zonas locales de inhibición que tenían menos cambio de color.

Otro ejemplo más es descrito por Salmon y colaboradores, Molecular Diversity 2, 57-63 (1996). En este ejemplo, las genotecas para combinación fueron muestreadas para los compuestos que tenían efectos citotóxicos sobre las células cancerosas que crecen en el agar.

Otro método de muestreo de alta producción es descrito por Beutel y colaboradores, patente estadounidense No. 5.976.813. En este método, las muestras de prueba son colocadas en una matriz porosa. Uno o más componentes del ensayo se colocan dentro, o sobre, o en el fondo de una matriz tal como un gel, una lámina plástica, un filtro, u otra forma de soporte sólido fácilmente manipulable.

Cuando las muestras se introducen a la matriz porosa, se difunden en una forma suficientemente lenta, como para que el ensayo pueda ser realizado sin que corran juntas las muestras de prueba.

Ensayos de Enlazamiento

Para los ensayos de enlazamiento, el compuesto de prueba es preferiblemente una molécula pequeña 13 enlazar a, y ocupa el sitio activo del polipéptido del GPCR tipo P2Y1, haciendo así al sitio de enlazamiento del ligando inaccesible para el sustrato de tal manera que se evita la actividad biológica normal. Ejemplos de tales moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños o moléculas tipo péptido. Los ligandos potenciales que pueden enlazarse a un polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, los ligandos naturales de los GPCR conocidos y de los análogos o derivados de los mismos. Los ligandos naturales de los GPCR incluyen adrenomedulina, amilina, proteína relacionada con el gen de la calcitonina (CGRP), calcitonina, anandamida, serotonina, histamina, adrenalina, noradrenalina, factor de activación plaquetaria, trombina, C5a, bradiquinina y quimoquinas.

En ensayos de enlazamiento, o el compuesto de prueba o el polipéptido del GPCR tipo P2Y1 pueden incluir una marca detectable, tal como una marca fluorescente, radioisotópica, quimiluminiscente, o enzimática, tal como la peroxidasa de rábano silvestre, la fosfatasa alcalina, o la luciferasa. La detección de un compuesto de prueba que se enlaza al polipéptido del GPCR tipo P2Y1, puede ser lograda entonces, por ejemplo, por medio del recuento directo de radioemisiones, por medio del recuento de centelleo, o por medio de la determinación de la conversión de un sustrato apropiado a un producto detectable.

Alternativamente, el enlazamiento de un compuesto de prueba a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 puede determinarse sin la marcación de cualquiera de los interactuantes. Por ejemplo, pueden utilizarse un microfisiómetro para detectar el enlazamiento de un compuesto de prueba con un polipéptido del GPCR tipo P2Y1. Un microfisiómetro (por ejemplo, Cytosensor^{TM}) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la cual una célula acidifica su medio ambiente utilizando un sensor potenciométrico direccionable por medio de luz (LAPS). Los cambios en esta velocidad de acidificación pueden ser utilizados como un indicador de la interacción entre un compuesto de prueba y un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 (McConnell y colaboradores, Science 257, 1906-1912, 1992).

La determinación de la capacidad de un compuesto de prueba para enlazarse al polipéptido del GPCR tipo P2Y1, puede lograrse también utilizando una tecnología tal como el Análisis de Interacción Bimolecular en tiempo real (BIA) (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345, 1991, y Szabo y colaboradores, Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705, 1995). BIA es una tecnología para estudiar interacciones biospecíficas en tiempo real, sin marcar a ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Los cambios en el fenómeno óptico de resonancia del plasmón superficial (SPR) pueden ser utilizados como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

En aún otro aspecto de la invención, un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 puede ser utilizado como una "proteína de carnada" en un ensayo doblemente híbrido o en un ensayo tres veces híbrido (ver, por ejemplo, patente estadounidense No. 5.283.317; Zervos y colaboradores, Cell 72, 223-232, 1993; Madura y colaboradores, J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel y colaboradores, BioTechniques 14, 920-924, 1993; Iwabuchi y colaboradores, Oncogene 8, 1693-1696, 1993; y Brent W094/10300), para identificar otras proteínas que se enlazan a, o interactúan con el polipéptido del GPCR tipo P2Y1 y modulan su actividad.

El ensayo doblemente híbrido se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consiste de los dominios separares de enlazamiento y activación de ADN. En resumen, el ensayo utiliza dos diferentes construcciones de ADN. Por ejemplo, en una construcción, el polinucleótido que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 puede fusionarse a un polinucleótido que codifica al dominio de enlazamiento de ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra construcción, una secuencia de ADN que codifica a una proteína no identificada ("presa" o "muestra") puede fusionarse a un polinucleótido que codifica al dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas de "carnada" y de "presa" son capaces de interactuar in vivo para formar un complejo dependiente de la proteína, los dominios de enlazamiento y de activación del ADN del factor de transcripción son traídos en estrecha proximidad. Esta proximidad permite la transcripción de un gen reportero (por ejemplo, LacZ), que se enlaza operativamente a un sitio transcripcional regulador responsable por el factor de transcripción. La expresión del gen reportero puede detectarse, y las colonias celulares que contienen al factor funcional de transcripción pueden ser aisladas y utilizadas para obtener la secuencia de ADN que codifica a la proteína de interactúa con el polipéptido del GPCR tipo P2Y1.

Puede ser deseable inmovilizar ya sea al polipéptido (o al polinucleótido) del GPCR tipo P2Y1, o al compuesto de prueba para facilitar la separación de las formas enlazada de la no enlazada de uno o ambos de los interactuantes, así como para acomodar la automatización del ensayo. Así, o el polipéptido (o el polinucleótido) del GPCR tipo P2Y1, o el compuesto de prueba pueden ser enlazados a un soporte sólido. Los soportes sólidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, portaobjetos de vidrio o de plástico, placas para cultivo de tejidos, pozos de microtitulación, tubos, chips de silicio, u partículas tales como cuentas (incluido, pero no limitado a, cuentas de látex, poliestireno, o vidrio). Cualquier método conocido en el arte puede ser utilizado para unir el polipéptido (o el polinucleótido) del GPCR tipo P2Y1 o el compuesto de prueba a un soporte sólido, incluyendo el uso de enlazamientos covalentes y no covalentes, absorción pasiva, o pares de fracciones de enlazamiento unidos respectivamente al polipéptido (o al polinucleótido) o al compuesto de prueba y al soporte sólido. Los compuestos de prueba se enlazan preferiblemente al soporte sólido en un orden, de modo que la ubicación de los compuestos individuales de prueba pueda ser rastreada. El enlazamiento de un compuesto de prueba a un polipéptido (o polinucleótido) del GPCR tipo P2Y1 puede lograrse en cualquier recipiente adecuado para contener a los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos ensayo, y tubos de microcentrífuga.

En una modalidad, el polipéptido del GPCR tipo P2Y1 es una proteína de fusión que comprende un dominio que permite al polipéptido del GPCR tipo P2Y1 enlazarse a un soporte sólido. Por ejemplo, las proteínas de fusión glutationa-S-transferasa pueden ser adsorbidas sobre cuentas de glutationa sefarosa (Sigma Chemical) o placas de microtitulación con glutationa derivatizada, que se combinan luego con el compuesto de prueba jugó el compuesto de prueba y el polipéptido del GPCR tipo P2Y1 no adsorbido; la mezcla se incuba luego bajo condiciones conductivas para la formación del complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para salinización y pH). Después de la incubación, las cuentas por los pozos de la placa de microtitulación se lavan para remover cualquier componente no enlazado. El enlazamiento de los interactuantes puede determinarse en forma directa o indirecta, como se describió antes. Alternativamente, los complejos pueden disociarse del soporte sólido antes de que se determine el enlazamiento.

Otras técnicas para la inmovilización de proteínas o de polinucleótidos sobre un soporte sólido, pueden ser utilizadas en los ensayos de muestreo de la invención. Por ejemplo, o un polipéptido (o polinucleótido) del GPCR tipo P2Y1, o un compuesto de prueba pueden inmovilizarse utilizando conjugación de biotina y estreptavidina. Los polipéptidos (o polinucleótidos) del GPCR tipo P2Y1 biotinilados, o los compuestos de prueba pueden prepararse a partir de biotina-NHS(N-hidroxisuccinimida) usando técnicas bien conocidas en el estado de la técnica (por ejemplo, el kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.) e inmovilizados en los pozos de placas de 96 pozos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, los anticuerpos que se enlazan específicamente a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1, polinucleótido, o un compuesto de prueba, pero que no interfiere con un sitio deseado de enlazamiento, tal como el sitio activo del polipéptido del GPCR tipo P2Y1, pueden derivatizarse en los pozos de la placa. El objetivo no enlazado o la proteína pueden ser atrapados en los pozos por medio de conjugación con el anti-
cuerpo.

Los métodos para detectar tales complejos, además de aquellos descritos antes para los complejos inmovilizados de GST, incluyen la inmunodetección de complejos utilizando anticuerpos que se enlazan específicamente al polipéptido del GPCR tipo P2Y1 o al compuesto de prueba, ensayos unidos a enzimas que dependen de la detección de una actividad del polipéptido del GPCR tipo P2Y1, y de la electroforesis en gel SDS bajo condiciones no reductoras.

El muestreo para los compuestos de prueba que se enlazan a un polipéptido o polinucleótido del GPCR tipo P2Y1 también puede ser llevado a cabo en una célula intacta. Cualquier célula que comprenda un polipéptido o polinucleótido del GPCR tipo P2Y1, puede ser utilizada en el sistema de ensayo basado en la célula. Un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 puede estar presente en forma natural en la célula o puede ser introducido usando técnicas tales como aquellas descritas anteriormente. El enlazamiento del compuesto de prueba a un polipéptido o polinucleótido del GPCR tipo P2Y1 se determina como se describió antes.

Ensayos Funcionales

Los compuestos de prueba pueden ser analizados por la capacidad para aumentar o para disminuir un efecto biológico de un polipéptido del GPCR tipo P2Y1. Tales efectos biológicos pueden determinarse utilizando los ensayos funcionales descritos en los ejemplos específicos, más adelante. Los ensayos funcionales pueden llevarse a cabo después de poner en contacto ya sea a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 purificado, a una preparación de membrana celular, o a una célula intacta con un puesto de prueba. Un compuesto de prueba que disminuye una actividad funcional de un GPCR tipo P2Y1 en al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, ó 100%, se identifica como un agente potencial para disminuir la actividad de GPCR tipo P2Y1. Un compuesto de prueba que incrementa la actividad del GPCR tipo P2Y1 en al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, ó 100%, se identifica como un agente potencial para incrementar la actividad de GPCR tipo P2Y1.

Un procedimiento de muestreo de este estilo involucra el uso de melanóforos que ese transfectan para expresar a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1. Una técnica de muestreo tal es descrita en WO 92/01810 publicada el 6 de febrero de 1992. Así, por ejemplo, un ensayo así puede ser empleado para muestrear un compuesto que inhibe la activación del polipéptido receptor por medio del contacto de las células melanóforas que comprenden al receptor, tanto con un ligando receptor como con un compuesto de prueba para ser muestreados. La inhibición de la señal generada por el ligando, indica que un compuesto de prueba es un antagonista potencial para el receptor, esto es, inhibe la activación del receptor. El muestreo puede ser empleado para identificar a un compuesto de prueba que activa al receptor por medio del contacto de tales células con los compuestos que van a ser muestreados, y determinar si cada compuesto de prueba genera una señal, esto es, activa al receptor.

Otras técnicas de muestreo incluyen el uso de células que expresan a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 humano (por ejemplo, células CHO transfectadas) en un sistema que mide los cambios del pH extracelular causados por la activación del receptor (ver, por ejemplo, Science 246, 181-296, 1989). Por ejemplo, los compuestos de prueba pueden ser puestos en contacto con una célula que expresa a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 humano y una segunda respuesta del mensajero, por ejemplo, transducción de señal o cambios de pH, puede ser medida para determinar si el compuesto de prueba activa o inhibe al receptor.

Otra técnica de muestreo implica introducir ARN que codifica a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 humano dentro de oocitos de Xenopus para expresar transitoriamente al receptor. Los oocitos transfectados pueden ser conectados entonces con el ligando del receptor y un compuesto de prueba para ser muestreado, seguido por la detección de la inhibición o la activación de una señal de calcio en el caso del muestreo para los compuestos de prueba que se piensa que inhiben la activación del receptor.

Otra técnica de muestreo implica la expresión de un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 humano en células en las cuales el receptor se enlaza a una fosfolipasa C o D. tales células incluyen células endoteliales, células de músculo liso, células embrionarias de riñón, etc. el muestreo puede ser logrado como se describió anteriormente, cuantificando el grado de activación del receptor a partir de los cambios en la actividad de la fosfolipasa.

Los detalles de los ensayos funcionales tales como aquellos descritos anteriormente, son suministrados en los ejemplos específicos, más adelante.

Indicaciones Terapéuticas y Métodos

Los GPCR son omnipresentes en el huésped mamífero y son los responsables de muchas funciones biológicas, incluidas muchas patologías. Por lo tanto, es deseable encontrar compuestos y drogas que estimulen por un lado a un GPCR, y por el otro que pueden inhibir la función de un GPCR. Por ejemplo, los compuestos que activan a un GPCR pueden ser empleados para propósitos terapéuticos, tales como el tratamiento del asma.

En general, los compuestos que inhiben la activación de un GPCR pueden ser utilizados para una variedad de propósitos terapéuticos, por ejemplo, para el tratamiento del asma.

El asma puede ser tratada por medio de la regulación del GPCR tipo P2Y1. Se piensa que el asma aparece como resultado de interacciones entre múltiples factores genéticos y ambientales, y se caracteriza por tres rasgos principales: 1) obstrucción intermitente y reversible de las vías aéreas, causada por broncoconstricción, incremento en la producción de moco, y engrosamiento de las paredes de las vías aéreas que conduce a un estrechamiento de las mismas, 2) hipersensibilidad de las vías aéreas causada por una disminución en el control del diámetro interior de las mismas, y 3) inflamación de las vías aéreas. Ciertas células son críticas para la reacción inflamatoria del asma e incluyen células T y a las células antigénicas presentes, células B que producen IgE, y mastocitos, basófilos, eosinófilos, y otras células que enlazan IgE. Estas células efectoras se acumulan en el sitio de la reacción alérgica en las vías aéreas y liberan productos tóxicos que contribuyen a la patología aguda y eventualmente a la destrucción del tejido relacionado con el desorden. Otras células residentes, tales como las células de músculo liso, células epiteliales pulmonares, células productoras de moco, y células nerviosas, pueden ser también anormales en individuos con asma, y pueden contribuir a la patología. Mientras que la obstrucción de las vías aéreas por el asma, que se presenta clínicamente como un resuello intermitente y respiración entrecortada, es generalmente el síntoma más apremiante de la enfermedad que requiere de tratamiento inmediato, la inflamación y la destrucción del tejido asociados con la enfermedad pueden conducir a cambios irreversibles que eventualmente hacen del asma un desorden crónico incapacitante que requiere manejo de largo plazo.

A pesar de importantes avances recientes en nuestra comprensión de la patofisiología del asma, la enfermedad parece estar aumentando en prevalencia y en severidad (Gergen y Weiss, Am. Rev. Respir. Dis. 146, 823-24, 1992). Se estima que entre un 30-40% de la población sufre de alergia atópica, y 15% de los niños y 5% de los adultos en la población sufren de asma (Gergen y Weiss, 1992). Así, se coloca una enorme carga sobre nuestros recursos dedicados a la salud. Sin embargo, tanto el diagnóstico como el tratamiento del asma son difíciles. La severidad de la inflamación del tejido pulmonar no es fácil de medir y los síntomas de la enfermedad son a menudo indistinguibles de aquellos de las infecciones respiratorias, desórdenes inflamatorios crónicos respiratorios, rinitis alérgica, u otros desórdenes respiratorios. A menudo, el alergeno incitante no puede ser determinado, haciendo difícil la remoción del agente ambiental causante. Los tratamientos farmacológicos comunes adolecen de sus propias desventajas. Los agentes terapéuticos comúnmente utilizados, tales como los agonistas beta, pueden actuar como mitigadores de los síntomas para mejorar transitoriamente la función pulmonar, pero no afecta la inflamación subyacente. Los agentes que pueden reducir la inflamación subyacente, tales como los esteroides aniinflamatorios, pueden tener desventajas importantes que van desde inmunosupresión hasta perdida de hueso (Goodman y Gilman’s THE PHARMACOLOGIC BASIS OF THERAPEUTICS, Seventh Edition, MacMillan Publishing Company, NY, USA, 1985). Además, muchas de las terapias actuales, tales como los corticosteroides inhalados, son de corta duración, inconvenientes para el uso, y deben ser utilizados a menudo periódicamente, en algunos casos de por vida, haciendo del descuido de los pacientes en el cumplimiento del tratamiento un problema principal y rediciendo por lo tanto su efectividad como tratamiento.

Debido a los problemas asociados con las terapias convencionales, se han evaluado estrategias alternativas de tratamiento. La glicoforina A (Chu y Sharom, Cell. Immunol. 145, 223-39, 1992), la ciclosporina (Alexander y colaboradores, Lancet 339, 324-28, 1992), y un fragmento nonapéptido de IL-2 (Zav’yalov y colaboradores, Immunol. Lett. 31, 285-88, 1992), todos inhiben la proliferación de linfocitos T dependientes de interleuquina-2; sin embargo, se sabe que tienen muchos otros efectos. Por ejemplo, la ciclosporina es utilizada como inmunosupresor después de un transplante de órgano. Mientras que estos agentes pueden representar alternativas a los esteroides en el tratamiento de los asmáticos, inhiben la proliferación de linfocitos T dependientes de interleuquina-2 y potencialmente las funciones inmunes potencialmente críticas asociadas con la homeostasis. Otros tratamientos que bloquean la liberación o actividad de los mediadores de broncoconstricción, tales como las cromonas o las anti-leucotrienas, han sido recientemente introducidos para el tratamiento de asma suave, pero son costosos y no son efectivos con todos los pacientes, y no es claro si tienen algún efecto sobre los cambios crónicos asociados con inflamación asmática. Lo que se necesita en el estado de la técnica es la identificación de un tratamiento que pueda actuar sobre las rutas críticas para el desarrollo del asma que bloquee los ataques episódicos del desorden y amortigüe preferencialmente la respuesta alérgica inmune hiperactiva sin comprometer inmunológicamente al paciente.

Relevancia potencial de los GPCR tipo P2Y para el asma

Los nucleótidos extracelulares inducen una gran variedad de respuestas en muchos tipos de células, incluida la contracción y la relajación muscular, vasodilatación, neurotransmisión, agregación plaquetaria, regulación en el transporte de iones, y crecimiento celular. Los efectos se ejercen a través de los receptores P2, que se clasifican en dos familias principales: receptores P2X que son canales iónicos abiertos para los ligandos, y receptores P2Y que son receptores acoplados a la proteína G. Se han clonado doce miembros distintos de la familia P2Y hasta la fecha en diferentes especies, al menos una de las cuales se sabe que enlaza a un no nucleótido, especialmente P2Y_{7} cuyo ligando es LTB_{4}. Los receptores P2Y que enlazan un nucleótido pueden ser subdivididos además en tres grupos de acuerdo a la especificidad del ligando: los P2Y activados por nucleótidos adenina, los P2Y activados por nucleótidos uridina, y los P2Y activados tanto por nucleótidos adenina como por nucleótidos uridina.

El GPCR tipo P2Y de la invención es una nueva molécula de siete dominios transmembrana tipo P2Y que tienen la más alta homología con P2Y_{1}. Originalmente fue encontrado en una búsqueda para homólogos de P2Y en las bases de datos de secuencias genómicas. Solo un EST ha sido reportado hasta la fecha para este gen, a partir de una genoteca de ADNc derivada de epitelio humano normal. Nuestro propio perfil de expresión de este gen muestra que se expresa en forma más alta en la tráquea, en las glándulas salivales, y en los riñones, y en menor medida en cerebro fetal, colon, placenta y pulmón.

Aunque el GPCR tipo P2Y humano es el más cercano en homología a P2Y, que enlaza nucleótidos adenina (ATP y ADP), también tiene significativa homología con P2Y_{2} y P2Y_{4}, que enlazan a ambos nucleótidos A y U, con P2Y_{3}, que enlaza nucleótidos U, y con receptores de leucotrienos, que enlazan LTB_{4}, LTC_{4} y LTD_{4}. Por lo tanto, aunque el rango más probable de ligandos que el GPCR tipo P2Y humano puede enlazar es relativamente limitado, el verdadero ligando de este receptor tendrá que ser determinado empíricamente.

En estudios de epitelio de vías aéreas, tanto el ATP como el UTP se ha encontrado que regulan en forma igualmente potente al electrolito epitelial y el transporte de agua, disparan mucha secreción, e incrementan la frecuencia del latido ciliar. En la tráquea, los nucleótidos pueden inducir a las células serosas de la glándula traqueal, que son responsables por la secreción de proteínas antibacteriales y antiproteolíticas, para producir un inhibidor de secreción de la leucocito proteinasa y para incrementar el transporte de suero. Los estudios en un ratón para bloqueo del receptor P2Y_{2} muestran que es el receptor dominante del nucleótido extracelular en el epitelio de las vías aéreas, pero que existen otros receptores de nucleótidos que funcionan en forma similar en el tracto respiratorio.

Nuestros estudios del perfil de expresión del GPCR tipo P2Y humano muestran que parece que son altamente expresados en tejidos del tracto respiratorio superior. Su alta expresión en las glándulas salivales y en la tráquea pueden indicar que juega un papel en la secreción exocrina, que en las vías aéreas tiene principalmente un papel protector. En asma, sin embargo, la sobre producción de mucina contribuye a los tapones de moco viscoso que ocluyen las vías aéreas asmáticas. Las glándulas submucosas en las vías aéreas mayores de los asmáticos también muestran frecuente-
mente evidencia de hiperplasia, que puede de algún modo ser debida a sobreestimulación por los mediadores externos.

No es claro por lo tanto en este punto, qué efecto agonista o antagonista del receptor del GPCR tipo P2Y tendría en asmáticos. Los agonistas pueden incrementar en forma beneficiosa la secreción de la proteína protectora, incrementar la velocidad del latido ciliar, y relajar al músculo liso, mientras que los antagonistas pueden mostrar producción de moco e hiperplasia glandular.

Ejemplo 1 Detección de la actividad del GPCR tipo P2Y

El polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 se inserta en el vector de expresión pCEV4 y el polipéptido obtenido del GPCR tipo P2Y1-pCEV4 del vector de expresión se transfecta dentro de las células 293 de riñón embriónico humano. Estas células son raspadas de un frasco de cultivo dentro de 5 ml de Tris HCl, EDTA 5 mM, pH 7,5, y lisadas por sonicación. Las células lisadas se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se centrifuga a 30.000 x g durante 20 minutos a 4°C. El precipitado se suspende en búfer de enlazamiento que contiene Tris HCl 50 mM, MgSO_{4} 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5, suplementado con BSA al 0,1%, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina, y 10 \mug/ml de fosforamidón. Las diluciones óptimas de suspensión de membrana, definidas como la concentración requerida de proteína para enlazar menos del 10% del radioligando añadido, son añadidas a las placas de microtitulación de polipropileno de 96 pozos que contienen ligando marcado con ^{125}I o un compuesto de prueba, péptidos no marcados, y búfer de enlazamiento hasta un volumen final de 250 \mul.

En los ensayos de enlazamiento de saturación en equilibrio, las preparaciones de membrana se incuban en presencia de concentraciones crecientes (0,1 nM a 4 nM) de ligando marcado con ^{125}I o del compuesto de prueba (actividad específica 2200 Ci/mmol). Las afinidades de enlazamiento de diferentes compuestos de prueba se determinan en ensayos de enlazamiento por competición en equilibrio, utilizando péptidos con ^{125}I 0,1 nM en presencia de doce diferentes concentraciones de cada uno de los compuestos de prueba.

Las mezclas de reacción de enlazamiento se incuban durante una hora a 30°C. La reacción se detiene por medio de filtración a través de filtros GF/B tratados con polietilenimina al 0,5%, utilizando un cosechador de células. La radioactividad se mide por medio del recuento de centelleo, y los datos se analizan por medio de un programa computarizado de regresión no lineal.

El enlazamiento no especificó se define como la cantidad de radioactividad que permanece después de la incubación de la proteína de la membrana en presencia de péptido no marcado 100 nM. La concentración de proteína se mide por medio del método Bradford utilizando Bio-Rad Reagent, con albúmina de suero bovino como patrón. Se muestra que el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 tiene una actividad de GPCR tipo P2Y1.

Ejemplo 2 Expresión de GPCR tipo P2Y1 humano

Se utiliza el vector de expresión pPICZB de Pichia pastoris (Invitrogen, SanDiego, CA) para producir grandes cantidades de polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 se deriva de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5. Antes de la inserción dentro del vector pPICZB, se modifica la secuencia de ADN por medio de métodos bien conocidos de tal forma que contenga en su extremo 5’ un codón de iniciación y en su extremo 3’ un sitio de escisión por enteroquinasa, una etiqueta del reportero His6 y un codón de terminación. Además, se añaden endonucleasas en ambas secuencias terminales de reconocimiento para restricción, y después de la digestión de los múltiples sitios de clonación de pPICZB con las correspondientes enzimas de restricción, la secuencia de ADN que codifica al polipéptido modificado se liga dentro de pPICZB. El vector de expresión se diseña para expresión inducible en Pichia pastoris, la expresión es conducida por medio de un promotor de levadura. Se utiliza el vector resultante pPICZ/md-His6 para transformar la levadura.

Las levaduras se cultivan bajo las condiciones usuales en frascos de agitación de 5 litros y la proteína producida en forma recombinante, aislada del cultivo por medio de cromatografía de afinidad (Ni-NTA-Resina) en presencia de urea 8 M. El polipéptido enlazado se eluye con búfer, pH 3,5, y se neutraliza. La separación del polipéptido del GPCR tipo P2Y1 de la etiqueta del reportero His6 se logra por medio de proteólisis específica para el sitio, utilizando enteroquinasa (Invitrogen, SanDiego, CA) de acuerdo con las instrucciones el fabricante. Se obtiene al polipéptido purificado del GPCR tipo P2Y1 humano.

Ejemplo 3 Ensayos de enlazamiento del radioligando

Las células 293 de riñón embriónico humano transfectadas con un polinucleótido que expresa al GPCR tipo P2Y1, se raspan de un frasco de cultivo en 5 ml de Tris HCl, EDTA 5 mM, pH 7,5, y lisadas por sonicación. Los lisados celulares se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se centrifuga a 30.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El precipitado se suspende en búfer de enlazamiento que contiene Tris HCl 50 mM, MgSO_{4} 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5, suplementado con BSA al 0,1%, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina, y 10 \mug/ml de fosforamidón. Las diluciones óptimas de suspensión de membrana, definidas como la concentración requerida de proteína para enlazar menos del 10% del radioligando añadido, son añadidas a las placas de microtitulación de polipropileno de 96 pozos que contienen ligando marcado con ^{125}I o un compuesto de prueba, péptidos no marcados, y búfer de enlazamiento hasta un volumen final de 250 \mul.

En los ensayos de enlazamiento de saturación en equilibrio, las preparaciones de membrana se incuban en presencia de concentraciones crecientes (0,1 nM a 4 nM) de ligando marcado con ^{125}I o del compuesto de prueba (actividad específica 2200 Ci/mmol). Las afinidades de enlazamiento de diferentes compuestos de prueba se determinan en ensayos de enlazamiento por competición en equilibrio, utilizando péptidos con ^{125}I 0,1 nM en presencia de doce diferentes concentraciones de cada uno de los compuestos de prueba.

Las mezclas de reacción de enlazamiento se incuban durante una hora a 30°C. La reacción se detiene por medio de filtración a través de filtros GF/B tratados con polietilenimina al 0,5%, utilizando un cosechador de células. La radioactividad se mide por medio del recuento de centelleo, y los datos se analizan por medio de un programa computarizado de regresión no lineal.

El enlazamiento no especificó se define como la cantidad de radioactividad que permanece después de la incubación de la proteína de la membrana en presencia de péptido no marcado 100 nM. La concentración de proteína se mide por medio del método Bradford utilizando Bio-Rad Reagent, con albúmina de suero bovino como patrón. Un compuesto de prueba que incrementa la radioactividad de la proteína de la membrana en al menos un 15% con relación a la reactividad de la proteína de la membrana que no fue incubada con un compuesto de prueba, se identifica como un compuesto que enlaza a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1.

Ejemplo 4 Efecto de un compuesto de prueba sobre la formación de AMP cíclico mediado por GPCR tipo P2Y1 humano

La inhibición mediada por el receptor de la formación de cAMP puede ser analizada en células huésped que expresan al GPCR tipo P2Y1 humano. Las células se siembran en placas de 96 pozos y se incuban en solución salina con búfer de fosfato de Dulbecco (PBS) suplementada con HEPES 10 mM, teofilina 5 mM, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina, y 10 \mug/ml de fosforamidón durante 20 minutos a 37ºC en 5% de CO_{2}. Se añade un compuesto de prueba y se incuba durante 10 minutos más a 37ºC. Se aspira el medio, y se detiene la reacción por medio de la adición de HCl 100 mM. Las placas se almacenan a 4ºC durante 15 minutos. Se mide el contenido de cAMP en la solución de detención por medio de radioinmunoensayo.

La radioactividad se cuantifica utilizando un contador gama equipado con un software para reducción de datos. Un compuesto de prueba que disminuye la radioactividad de los contenidos de un pozo con relación a la reactividad de los contenidos de un pozo en ausencia del compuesto de prueba, es identificado como un inhibidor potencial de la formación de cAMP. Un compuesto de prueba que incrementa la radioactividad de los contenidos de un pozo con relación a la reactividad de los contenidos de un pozo en ausencia del compuesto de prueba, es identificado como un mejorador potencial de la formación de cAMP.

Ejemplo 5 Efecto de un compuesto de prueba sobre la movilización de calcio intracelular

La concentración intracelular de calcio libre puede ser medida por medio de microespectrofluorometría utilizando el indicador de tinción fluorescente Fura-2/AM (Bush y colaboradores, J. Neurochem. 57, 562-74, 1991). Las células transfectadas en forma estable se siembran sobre una placa de cultivo de 35 mm que contiene un inserto de una lámina cubreobjetos de vidrio. Las células se lavan con HBS, se incuban con un compuesto de prueba, y se cargan con 100 \mul de Fura-2/AM (10 \muM) durante 20-40 minutos. Después de lavar con HBS para remover la solución de Fura-2/AM, se equilibran las células en HBS durante 10-20 minutos. Las células se visualizan luego bajo el objetivo 40X de un microscopio leite Fluovert FS.

La emisión de fluorescencia se determina a 510 nM, con longitudes de onda de excitación que se alternan entre 340 nM y 380 nM. Los datos en bruto de la fluorescencia son convertidos a concentraciones de calcio utilizando curvas patrón de concentraciones de calcio y técnicas de análisis por software. Un compuesto de prueba que incrementa la fluorescencia al menos en un 15% con relación a la fluorescencia en ausencia de un compuesto de prueba, se identifica como un compuesto que moviliza al calcio intracelular.

Ejemplo 6 Efecto de un compuesto de prueba sobre el metabolismo de la fosfoinositida

Las células que expresan en forma estable al ADNc del GPCR tipo P2Y1 humano se siembran en placas de 96 pozos y se cultivaron hasta confluencia. El día antes del ensayo, se cambia el medio de crecimiento por 100 \mul de medio que contiene suero al 1% y 0,5 \muCi de myoinositol ^{3}H. Las placas se incuban durante la noche en una incubadora de CO_{2} (5% de CO_{2} a 37ºC). Inmediatamente antes del ensayo, se remueve el medio y se lo reemplaza por 200 \mul de PBS que contienen Lic. 10 mM, y se equilibran las células con el medio nuevo durante 20 minutos. Durante este intervalo, las células se equilibran también con antagonista, añadido como una alícuota de 10 \mul de una solución concentrada 20 veces en PBS.

La acumulación de fosfato de inositol ^{3}H a partir del metabolismo del fosfolípido de inositol se inicia por medio de la adición de 10 \mul de una solución que contiene un compuesto de prueba. Al primer pozo se le añaden 10 \mul para medir la acumulación basal. Se ensayan once diferentes concentraciones del compuesto de prueba en los siguientes 11 pozos de cada fila de la placa. Los ensayos se realizan por duplicado repitiendo las mismas adiciones en dos filas consecutivas de la placa.

Las placas se incuban en una incubadora de CO_{2} durante una hora. La reacción se termina por medio de la adición de 15 \mul de ácido tricloroacético (TCA) al 50% v/v, seguido por incubación durante 40 minutos a 4ºC. Después de neutralizar al TCA con 40 \mul de Tris 1 M, se transfiere el contenido de los pozos a una placa filtrante Multiscreen HV (Millipore) que contiene Dowex AG1-X8 (200-400 mallas, forma formato). Las placas filtrantes se preparan por medio de la adición de 200 \mul de suspensión de Dowex AG1-X8 (agua:resina, 50% v/v) a cada pozo. Las placas filtrantes se colocan sobre un distribuidor de vacío para lavar o eluir el lecho de resina. Cada pozo es lavado 2 veces con 200 \mul de agua, seguido por 2 x 200 \mul de tetraborato de sodio 5 mM/formato de amonio 60 mM.

\newpage

Los IP ^{3}H se eluyen dentro de placas vacías de 96 pozos con 200 \mul de formato de amonio 1,2 M/ácido fórmico 0,1. El contenido de los pozos es añadido a 3 ml de un cóctel de centelleo, y se determina la reactividad por medio de recuento en centelleo líquido.

Ejemplo 7 Métodos de Enlazamiento del Receptor

Ensayos estándar de Enlazamiento. Los ensayos de enlazamiento se llevan a cabo en un búfer de enlazamiento que contiene HEPES 50 mM, pH 7,4, BSA al 0,5%, y MgCl_{2} 5 mM. El ensayo estándar para el enlazamiento del radioligando (por ejemplo, compuesto de prueba con ^{125}I) a los fragmentos de membrana que comprenden polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 se lleva a cabo como sigue, en placas de microtitulación de 96 pozos (por ejemplo, placas Dynatech Immunol II Removawell). El radioligando se diluye en búfer de enlazamiento + PMSF/Baci para el cpm deseado por 50 \mul, luego se añaden alícuotas de 50 \mul a los pozos. Para las muestras de enlazamiento no específico, se añaden también 50 \mul de ligando frío 40 \muM por pozo. El enlazamiento se inicia por medio de la adición de 150 \mul por pozo de membrana diluida hasta la concentración deseada (10-30 \mug de proteína de membrana/pozo) en búfer de enlazamiento + PMSF/Baci. Las placas se recubrieron entonces con sellantes de placa mylar Linbro (Flor Labs) y se colocaron sobre un Dynatech Microshaker II. Se permite que proceda el enlazamiento a temperatura ambiente durante 1-2 horas y se detiene por medio de centrifugación de la placa durante 5 minutos a 2.000 x g. Los sobrenadantes se decantan, y los precipitados de membrana se lavan una vez por medio de la adición de 200 \mul de búfer de enlazamiento enfriado en hielo, una breve agitación, y recentrifugación. Los pozos individuales se colocan en tubos de 12 x 75 mm y se hizo el recuento en un contador LKB Gammamaster (eficiencia del 78%). El enlazamiento específico por medio de este método es idéntico a aquel medido cuando se remueve el ligando libre por medio de filtración rápida (3-5 segundos) y se lava sobre filtros de fibra de vidrio recubiertos con polietilenimina.

Se usan también tres variaciones de ensayos de enlazamiento estándar.

1.

Los ensayos de enlazamiento competitivo de radioligando con un rango de concentración de ligando frío vs. Ligando marcado con ^{125}I se llevan a cabo como se describió anteriormente con una modificación. Todas las diluciones de los ligandos que son ensayadas se hacen en PMSF/Baci 40X a una concentración 40X como concentración final en el ensayo. Las muestras de péptido (5 \mul cada una) se añaden luego a cada pozo de microtitulación. Las membranas y los radioligandos se diluyen en búfer de enlazamiento sin inhibidores de proteinasa. Se añade el radioligando y se mezcla con ligando frío, y se inicia entonces el enlazamiento por medio de la adición de membranas.

2.

Se efectúa el entrelazamiento químico del radioligando con el receptor después de una etapa de enlazamiento idéntica a la del ensayo estándar. Sin embargo, la etapa de lavado se hace con búfer de enlazamiento menos BSA para reducir la posibilidad de entrelazamiento no específico del radioligando con BSA. La etapa de entrelazamiento se lleva a cabo como se describe más adelante.

3.

Los ensayos de enlazamiento a gran escala para obtener precipitados de membrana para los estudios sobre solubilización del complejo receptor:ligando y para la purificación del receptor también se llevan a cabo. Estos son identicos a los ensayos estándar excepto porque (a) el enlazamiento se lleva a cabo en tubos de polietileno en volúmenes de 1-250 ml, (b) la concentración de proteína de membrana es siempre 0,5 mg/ml, y (c) para la purificación del receptor, la concentración de BSA en el búfer de enlazamiento se reduce hasta el 0,25%, y la etapa de lavado se hace con búfer de enlazamiento sin BSA, que reduce la contaminación por BSA del receptor purificado.

Ejemplo 8 Entrelazamiento Químico del Radioligando al Receptor

Después de la etapa de enlazamiento del radioligando como se describió anteriormente, los precipitados de membrana se resuspenden en 200 \mul por pozo de la placa de microtitulación sobre búfer de enlazamiento enfriado con hielo sin BSA. Luego se añaden y se mezclan 5 \mul por pozo de N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida 4 mM (ANB-NOS, Pierce) en DMSO. Las muestras se mantienen sobre hielo e irradiadas con UV durante 10 minutos con una lámpara Mineralight R-52G (UVP Inc., San Gabriel, California) a una distancia de 5-10 cm. Luego se transfieren las muestras a tubos de microcentrífuga Eppendorf, se precipitan las membranas por centrifugación, se remueven los sobrenadantes y se solubilizan las membranas en un búfer para muestras SDS Laemmli por electroforesis sobre gel de poliacrilamida (PAGE). PAGE se lleva a cabo como se describe más adelante. Las proteínas radiomarcadas se visualizan por medio de autoradiografía de los geles secos con una película XAR de Kodak y pantallas intensificadoras de imagen de DuPont.

Ejemplo 9 Solubilización de la Membrana

La Solubilización de la membrana se lleva a cabo en búfer que contiene Tris 25 mM, pH 8, glicerol al 10% (p/v) y CaCl_{2} 0,2 mM (búfer de solubilización). Los detergentes altamente solubles incluyen Triton X-100, desoxicolato, desoxicolato:lisolecitina, CHAPS, y detergente zwiterión que se preparan en búfer de solubilización en concentraciones del 10% y se almacenan como alícuotas congeladas. La lisolecitina se prepara fresca debido a la falta de solubilidad por congelación-descongelación, y la digitonina se prepara fresca a concentraciones menores debido a su solubilidad más limitada.

Para solubilizar las membranas, se resuspenden los precipitados lavados después de la etapa de enlazamiento libres de partículas visibles por medio de pipeteo y agitación en vórtice en búfer de solubilización a 100.000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se remueven y se mantienen sobre hielo y se descartan los precipitados.

Ejemplo 10 Ensayo de Receptores Solubilizados

Después del enlazamiento de los ligandos con ^{125}I y la solubilización de las membranas con detergente, el complejo R:L intacto puede ser ensayado por cuatro diferentes métodos. Todos se realizan sobre hielo o en un cuarto frío entre 4-10ºC.

1.

Columna cromatográfica (Knuhtsen y colaboradores, Biochem. J. 254, 641-647, 1988). Las columnas Sefadex G-50 (8 x 250 mm) se equilibran con búfer de solubilización que contiene detergente a la concentración usada para solubilizar membranas y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. Las muestras de las membranas solubilizadas (0.2-0.5 ml) se aplican a las columnas y se eluyen con una velocidad de flujo aproximadamente de 0.7 ml/minuto. Se recolectan las muestras (0.18 ml). Se determina la radioactividad en un contador gama. Los volúmenes vacíos de las columnas se determinan por medio del volumen de elución de dextrano azul. La elución de radioactividad en el volumen vacío se considera enlazada a una proteína. La radioactividad que eluye después, en el mismo volumen como ligandos libres con ^{125}I, se considera no enlaza- da.

2.

Precipitación de polietilénglicol (Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 318-322, 1972). Para una muestra de 100 Pl de membranas solubilizadas en un tubo de polipropileno de 12 x 75 mm, se añaden 0.5 ml de gama globulina bovina al 1% (p/v) (Sigma) en búfer de fosfato de sodio 0.1 M, seguido por 0.5 ml de polietilénglicol al 25% (p/v) (Sigma) y mezcla. La mezcla se mantiene sobre hielo durante 15 minutos. Luego se añaden por muestra 3 ml de fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.4. Las muestras se filtran rápidamente (1-3 segundos) sobre filtros de fibra de vidrio Whatman GF/B y se lavan con 4 ml del búfer de fosfato. Receptor precipitado del PEG: complejo ligando con ^{125}I se determina por medio de recuento gama de los filtros.

3.

Enlazamiento del filtro GFB/PEI (Bruns y colaboradores, Analytical Biochem. 132, 74-81, 1983). Los filtros de fibra de vidrio Whatman GF/B se remojan en polietilenimina al 0,3% (PEI, Sigma) durante 3 horas. Las muestras de membranas solubilizadas (25-100 Pl) se reemplazan en tubos de polipropileno de 12 x 75 mm. Luego se añaden 4 ml de buffer de solubilización sin detergente por muestra y éstas son inmediatamente filtradas a través de los filtros GFB/PEI (1-3 segundos) y lavadas con 4 ml de búfer de solubilización. CPM del receptor: el complejo ligando-^{125}I adsorbido por los filtros se determina por medio de recuento gama.

4.

Carbón vegetal/Dextrano (Paul y Said, Peptides 7 [Suppl. 1], 147-149, 1986). Dextrano T70 (0.5 g, Pharmacia) se disuelve en 1 litro de agua, luego se añaden 5 g de carbón vegetal activado (Norit A, alcalino; Fisher Scientific). Se agita la suspensión durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se almacena a 4°C hasta su uso. Para medir el complejo R:L, se añaden 4 partes por volumen de suspensión de carbón vegetal/dextrano a 1 parte por volumen de membrana solubilizada. Las muestras se mezclan y se mantienen sobre hielo durante 2 minutos y luego se centrifugan durante 2 minutos a 11,000 x g en una microcentrífuga Beckman. El radioligando libre es adsorbido por el carbón vegetal/dextrano y descartado con el precipitado. Receptor: los complejos ligando-^{125}I permanecen en el sobrenadante y se determina por medio de recuento gama.

Ejemplo 11 Purificación del Receptor

El enlazamiento del receptor biotinilado a membranas GH_{4} C1 se lleva a cabo como se describió anteriormente. Las incubaciones son durante 1 hora a temperatura ambiente. En el protocolo estándar de purificación, las incubaciones de enlazamiento contienen Bio-S29 10 nM. El ligando ^{125}I se añade como un trazador en niveles de 5.000-100.000 cpm por mg de proteína de membrana. Las incubaciones de control contienen 10 \muM de ligando frío para saturar al receptor con ligando no biotinilado.

La solubilización del complejo receptor:ligando también se lleva a cabo como se describió anteriormente, con desoxicolato:lisolecitina en búfer de solubilización que contiene MgCl_{2} 0,2 mM, para obtener 100.000 x g sobrenadantes que contienen complejo R:L solubilizado.

La estreptavidina inmovilizada (estreptavidina entrelazada a 6% de agarosa en perlas, Pierce Chemical Co.; "agarosa-SA") se lava en búfer de solubilización y se añade a las membranas solubilizadas como 1/30 del volumen final. Esta mezcla se incuba con agitación constante por medio de rotación en tambor vertical durante 4-5 horas a 4-10ºC. Luego se aplica la mezcla a una columna y el material no enlazado es lavado a través suyo. El enlazamiento de radioligando a la agarosa-SA se determina por medio de la comparación cpm en el sobrenadante 100.000 x g con aquel en el efluente de la columna después de la adsorción a agarosa-SA. Finalmente, la columna se lava con 12-15 volúmenes de columna de búfer de solubilización + desoxicolato:lisolecitina al 0,15% + 1/500 (vol/vol) 100 x 4pase.

La columna de estreptavidina se eluye con búfer de solubilización + EDTA 0,1 mM + EGTA 0,1 mM + GTP-gama-S (Sigma) + desoxicolato:lisolecitina 0,15% (p/v) + 1/1000 (vol/vol) 100.veces.4pase. Primero, un volumen de columna de búfer de elución se pasa a través de la columna y se detiene el flujo durante 20-30 minutos. Entonces se pasan 3-4 veces más volúmenes de columna de búfer de elución a través suyo. Todos los elatos se reúnen.

Los eluatos de la columna de estreptavidina se incuban durante la noche (12-15 horas) con aglutinina de germen de trigo inmovilizado (agarosa WGA, vector Labs) para adsorber al receptor a través de la interacción del carbohidrato enlazado covalentemente con la lectina WGA. La relación (vol/vol) de agarosa WGA al eluato de la columna de estreptavidina es generalmente 1:400. También puede usarse un rango de 1:1000 a 1:200. Después de la etapa de enlazamiento, la resina se precipita por centrifugación, se remueve el sobrenadante y se guarda, y se lava la resina 3 veces (aproximadamente 2 minutos cada vez) en búfer que contiene HEPES 50 mM, pH 8, MgCl_{2} 5 mM, y desoxicolato:lisolecitina al 0,15%. Para eluir al receptor enlazado a WGA, se extrae la resina tres veces por medio de mezcla repetida (mezclador de vórtice a baja velocidad) durante un período de 15-30 minutos sobre hielo, con tres columnas de resina cada vez, de N-N’-N’’-triacetilquitotriosa en el mismo búfer HEPES usado para lavar la resina. Después de cada etapa de elución, la resina se centrifuga hacia abajo y el sobrenadante se remueve cuidadosamente, libre de precipitados de agarosa-WGA. Los tres eluatos recogidos contienen al receptor final purificado. El material no enlazado a WGA contiene subunidades de proteína G específicamente eluidas de la columna de estreptavidina, así como contaminantes no específicos. Todas estas fracciones se almacenan congeladas a -90ºC.

Ejemplo 12 Identificación de compuestos de prueba que se enlazan a polipéptidos del GPCR tipo P2Y1

Los polipéptidos purificados del GPCR tipo P2Y1 que comprenden una proteína glutationa-S-transferasa y absorbida sobre pozos derivatizados de glutationa de las placas de microtitulación de 96 pozos se ponen en contacto con compuestos de prueba de una genoteca de moléculas pequeñas a pH 7,0 en una solución búfer fisiológica. Los polipéptidos del GPCR tipo P2Y1 comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. los compuestos de prueba comprenden una etiqueta fluorescente. Las muestras se incuban durante 5 minutos a una hora. Las muestras de control se incuban en ausencia de un compuesto de prueba.

La solución búfer que contiene a los compuestos de prueba se lava de los pozos. El enlazamiento de un compuesto de prueba a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1 se detecta por medio de mediciones de fluorescencia de los contenidos de los pozos. Un compuesto de prueba que incrementa la fluorescencia en un pozo al menos en un 15% con relación a la fluorescencia de un pozo en el cual un compuesto de prueba no fue incubado, se identifica como un compuesto que se enlaza a un polipéptido del GPCR tipo P2Y1.

Ejemplo 13 Expresión específica en el tejido de GPCR tipo P2Y

Como una primera etapa para el establecimiento de un papel para el GPCR tipo P2Y1 en la patogénesis de COPD, se hizo el perfil de expresión del gen utilizando muestras de ARN con PCR cuantitativo en tiempo real de tejidos respiratorios humanos y células inflamatorias relevantes para COPD. El panel consistió de muestras de ARN total de pulmón (adulto y fetal), tráquea, células alveolares frescas tipo II aisladas en forma fresca, células epiteliales bronquiales humanas cultivadas, células epiteliales de las vías respiratorias menores cultivadas, células bronquiales de músculo liso cultivadas, células H441 cultivadas (tipo Clara), neutrófilos y monocitos aislados en forma fresca, y monocitos cultivados (tipo macrófago). La expresión de GPCR tipo P2Y también se evaluó en un rango d tejidos humanos utilizando paneles de ARN total obtenidos de Clontech Laboratories, Reino Unido, Ltd. Los tejidos fueron de glándula adrenal, médula ósea, cerebro, colon, corazón, riñón, hígado, pulmón, glándula mamaria, páncreas, próstata, glándula salival, músculo esqueletal, intestino delgado, bazo, estómago, testículo, timo, tráquea, tiroides y útero.

PCR cuantitativo en tiempo real. El perfil de expresión del gen objetivo fue realizado utilizando PCR cuantitativo en tiempo real, un desarrollo del análisis cinético de PCR descrito primero por Higuchi y colaboradores, BioTechnology 10, 413-17, 1992, y Higuchi y colaboradores, BioTechnology 11, 1026-30, 1993. El principio es que en cualquier ciclo dado dentro de la fase exponencial de PCR, la cantidad de producto es proporcional al número inicial de copias del molde.

La amplificación por PCR se lleva a cabo en presencia de una sonda de oligonucleótido (sonda TaqMan) que es complementaria a la secuencia objetivo y marcada con un tinte reportero fluorescente y un tinte sofocador. Durante la fase de extinción de PCR, la sonda se escinde por medio de la actividad de la endonucleasa 5’-3’ de una Taq ADN polimerasa, liberando al fluoróforo del efecto del tinte de sofocación (Holland y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7276-80, 1991). Debido a que la emisión de fluorescencia se incrementa en proporción directa a la cantidad del producto específico amplificado, la fase de crecimiento exponencial del producto PCR puede detectarse y utilizarse para determinar la concentración del molde inicial (Heid y colaboradores, Genome Res. 6, 986-94, 1996, y Gibson y colaboradores, Genome Res. 6, 995-1001, 1996).

El PCR cuantitativo en tiempo real fue hecho utilizando un Detector de Secuencia 7700 de ABI Prism. El valor C_{T} generado para cada reacción fue utilizado para determinar la concentración inicial del molde (número de copia) por medio de la interpolación en una curva estándar universal. El nivel de expresión del gen objetivo en cada muestra fue calculado con relación a la muestra con la expresión más baja del gen.

Extracción de ARN y preparación de ADNc. El ARN total de cada uno de los tejidos respiratorios y de los tipos de células inflamatorias enlistadas más arriba fue aislado utilizando el sistema RNeasy de Qiagen de acuerdo al protocolo del fabricante (Crawley, West Sussex, Reino Unido). La concentración de ARN purificado fue determinada utilizando un kit de cuantificación de ARN RiboGreen (Molecular Probes Europe, Países Bajos). Para la preparación de ADNc, se transcribió en forma inversa 1 \mug de ARN total en un volumen final de 20 \mul, utilizando 200 U de Transcriptasa Reversa RNase H^{-} SUPERSCRIPT^{TM} (Life Technologies, Paisley, Reino Unido), ditiotreitol 10 mM, 0.5 mM de cada dNTP y 5 PM de hexámeros aleatorios (Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, Reino Unido) de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Análisis cuantitativo TaqMan. Se diseñaron cebadores y sondas específicas de acuerdo a las recomendaciones de PE Applied Biosystems. La sonda fue marcada en el extremo 5’ con FAM (6-carboxifluoresceina). La cuantificación por PCR se realizó con 5 ng de ARN transcrito inverso a partir de cada muestra. Cada determinación se hizo por duplicado.

La mezcla de reacción del ensayo se hizo como sigue: Mezcla Maestra PCR TaqMan Universal 1X final (a partir del patrón 2X) (PE Applied Biosystems, CA); cebador hacia adelante 900 nM; cebador inverso 900 nM; sonda 200 nM; 5 ng de ADNc; y agua hasta 25 Pl.

Cada una de las siguientes etapas fue realizada una vez: pre PCR, 2 minutos a 50°C, y 10 minutos a 95°C. Las siguientes etapas se llevan a cabo 40 veces: desnaturalización, 15 segundos a 95°C, templado/extensión, 1 minuto a 60°C.

Todos los experimentos fueron realizados utilizando un Detector se Secuencias ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, CA). Al final del corrimiento, los datos de fluorescencia adquiridos durante la PCR fueron procesados como se describe en el manual del usuario del ABI Prism 7700 para lograr una mejor eliminación del fondo así como linealidad en la señal con la cantidad objetivo para el arranque.

Las Tablas 1 y 2 muestran los resultados del perfil de expresión para el GPCR tipo P2Y usando la célula indicada y las muestras d tejido. Para la Tabla 1, las células se definen como sigue: HBEC, células epiteliales bronquiales humanas; H441, una línea celular tipo Clara; SAE, células cultivadas epiteliales de las vías aéreas inferiores; SMC, células cultivadas de músculo liso de las vías aéreas; AII, células tipo II alveolares humanas aisladas en forma fresca; Neut, neutrófilos circulantes aislados en forma fresca; Mono, monocitos aislados en forma fresca, y CM, monocitos cultivados. Otras letras identifican al donante. Los resultados se muestran gráficamente en las Figs. 8 y 9.

TABLA 1

Tejido	Expresión Relativa
Pulmón	151.5354699
Tráquea	1107.743218
HBEC 1	4.685060463
HBEC 2	12.9520377
H441	1.202387631
SMC	1.41842932
SAE	1.749411592
AII	1
Pulmón fetal	26.72970095
COPD Neut 1	0.897587922
COPD Neut 2	0.76087585
COPD Neut 4	0
GAP Neut	1.694694812
AEM Neut	1.331087791

TABLA 1 (continuación)

Tejido	Expresión Relativa
AT Neut	0
KN Neut	0.987369255
SM Mono	0.891902539
DLF Mono	0.926568646
DS Mono	1.257087188
RLH CM	0
Útero	0

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TABLA 2

Tejido	Expresión Relativa
Glándula adrenal	9.189455584
Médula Ósea	5.852208398
Cerebro	149.621596
Colon	333.2508632
Corazón	1.093054592
HL60	4.424597636
Riñón	506.9221673
Hígado	1
Pulmón	190.4931147
Glándula mamaria	40.91893135
Páncreas	22.80291052
Próstata	58.4105483
Glándula salival	109.5837815
Músculo esqueletal	84.98460946
Intestino delgado	40.14618513
Bazo	71.58421767
Estómago	23.68924846
Testículo	41.70655162
Timo	22.94834038
Tiroides	63.44162273
Útero	4.125836209

Además, una expresión génica específica del GPCR tipo P2Y1 (III) se muestra en la Figura 10. En este experimento, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores oligonucleótidos LBRI119cds-L2 (ttcggatcgaatctcgcctgct) y LBRI119cds-R2 (tgcttgctcaaggttcccgctta) y las mediciones de la intensidad de luz emitida fueron tomadas siguiendo cada ciclo de la reacción cuando la reacción había alcanzado una temperatura de 82ºC.

Relevancia potencial del GPCR tipo P2Y1 para el asma

Los nucleótidos extracelulares incluyen una gran variedad de respuestas en muchos tipos de células, incluidas contracción muscular y relajación, vasodilatación, neurotransmisión, agregación plaquetaria, regulación en el transporte de iones, y crecimiento celular. Los efectos se ejercen a través de los receptores P2, que se clasifican dentro de dos familias principales: receptores P2X que son canales iónicos abiertos para los ligandos, y receptores P2Y que son receptores acoplados a la proteína G. Se han clonado doce miembros distintos de la familia P2Y hasta la fecha en diferentes especies, al menos una de las cuales se sabe que enlaza a un no nucleótido, especialmente P2Y_{7} cuyo ligando es LTB_{4}. Los receptores P2Y que enlazan un nucleótido pueden ser subdivididos además en tres grupos de acuerdo a la especificidad del ligando: los P2Y activados por nucleótidos adenina, los P2Y activados por nucleótidos uridina, y los P2Y activados tanto por nucleótidos adenina como por nucleótidos uridina.

El GPCR tipo P2Y1 es una nueva molécula de siete dominios transmembrana tipo P2Y que tienen la más alta homología con P2Y_{1}. Originalmente fue encontrado en una búsqueda para homólogos de P2Y en las bases de datos de secuencias genómicas. Solo un EST ha sido reportado hasta la fecha para este gen, a partir de una genoteca de ADNc derivada de epitelio humano normal. Nuestro propio perfil de expresión de este gen muestra que se expresa en forma más alta en la tráquea, en las glándulas salivales, y en los riñones, y en menor medida en cerebro fetal, colon, placenta y pulmón.

Aunque el GPCR tipo P2Y1 es el más cercano en homología a P2Y1, que enlaza nucleótidos de adenina (ATP y ADP), también tiene significativa homología con P2Y_{2} y P2Y_{4}, que enlazan a ambos nucleótidos A y U, con P2Y_{3}, que enlaza nucleótidos U, y con receptores de leucotrienos, que enlazan LTB_{4}, LTC_{4} y LTD_{4}. Por lo tanto, aunque el rango más probable de ligandos que el GPCR tipo P2Y1 humano puede enlazar es relativamente limitado, el verdadero ligando de este receptor tendrá que ser determinado empíricamente.

En estudios de epitelio de vías aéreas, tanto el ATP como el UTP se ha encontrado que regulan en forma igualmente potente al electrolito epitelial y el transporte de agua, disparan mucha secreción, e incrementan la frecuencia del latido ciliar. En la tráquea, los nucleótidos pueden inducir a las células serosas de la glándula traqueal, que son responsables por la secreción de proteínas antibacteriales y antiproteolíticas, para producir un inhibidor de secreción de la leucocito proteinasa y para incrementar el transporte de suero. Los estudios en un ratón para bloqueo del receptor P2Y_{2} muestran que es el receptor dominante del nucleótido extracelular en el epitelio de las vías aéreas, pero que existen otros receptores de nucleótidos que funcionan en forma similar en el tracto respiratorio.

Nuestros estudios del perfil de expresión del GPCR tipo P2Y1 humano muestran que parece que son altamente expresados en tejidos del tracto respiratorio superior. Su alta expresión en las glándulas salivales y en la tráquea pueden indicar que juega un papel en la secreción exocrina, que en las vías aéreas tiene principalmente un papel protector. En asma, sin embargo, la sobre producción de mucina contribuye a los tapones de moco viscoso que ocluyen las vías aéreas asmáticas. Las glándulas submucosas en las vías aéreas mayores de los asmáticos también muestran frecuentemente evidencia de hiperplasia, que puede de algún modo ser debida a sobreestimulación por los mediadores externos.

No es claro por lo tanto en este punto, qué efectos agonistas o antagonistas del receptor P2Y del GPCR tipo P2Y1 tendría en asmáticos. Los agonistas pueden incrementar en forma beneficiosa la secreción de la proteína protectora, incrementar la velocidad del latido ciliar, y relajar al músculo liso, mientras que los antagonistas pueden mostrar producción de moco e hiperplasia glandular.

Referencias

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<110> Bayer AG

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<120> REGULACIÓN DEL RECEPTOR ACOPLADO A LA PROTEÍNA G TIPO P2Y1 HUMANO

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<130> LIO131 Extranjero

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<150> US 60/224,989

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<151> 2000-08-14

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<160> 6

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 593

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

1

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<210> 2

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<211> 337

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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2

3

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4

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<210> 3

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<211> 673

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

5

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<210> 4

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<211> 2245

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (19174)..(1916)

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<223> codón de inicio

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<220>

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<221> promotor

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<222> (1112)..(1117)

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<223> caja TATA

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<400> 4

6

7

8

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<210> 5

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<211> 1014

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

9

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<210> 6

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<211> 373

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

10

11

12

Claims (3)

1. El uso de un método de muestreo, dicho método comprendiendo las etapas de

(i)

poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y

(ii)

detectar el enlazamiento de dicho compuesto de prueba a un polipéptido de (i),

para la identificación de compuestos útiles en el tratamiento del asma.

2. El uso de un método de muestreo, dicho método comprendiendo las etapas de

(i)

poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y

(ii)

detectar una actividad del polipéptido de (i),

para la identificación de compuestos útiles en el tratamiento del asma.

3. El uso de la Reivindicación 1 ó 2, en donde la etapa de poner en contacto es en, o sobre la superficie de, una célula.