ES2259220T3

ES2259220T3 - Celulas precursoras neurales, procedimiento para su produccion y utilizacion de las mismas en la terapia de defectos neurales.

Info

Publication number: ES2259220T3
Application number: ES98966817T
Authority: ES
Inventors: Oliver Prof. Dr. Brustle
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-18
Publication date: 2006-09-16
Anticipated expiration: 2018-12-18
Also published as: DK1040185T3; JP4090692B2; EP1040185A2; IL136833A; DE19756864C5; CA2315538C; US7968337B2; WO1999032606A3; IL136833A0; AU2510699A; EP1637592A1; EP1040185B9; CA2315538A1; ATE318301T1; DE59813404D1; EP1040185B1; WO1999032606A2; EP1040185B2; US20080213888A1; JP2001526884A

Abstract

Composición no tumorigénica de células obtenida a partir de células madre embrionarias de mamífero, que contiene: a) por lo menos el 85% de células precursoras neurales aisladas con la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales o gliales, y b) no más del 15% de células embrionarias primitivas y de células no neurales, que se pueden obtener mediante las etapas siguientes: (a) proliferación de células ME; (b) cultivo de las células ME de la etapa (a) para formar células precursoras neurales; (c) proliferación de las células precursoras neurales en medio libre de suero que contiene factor de crecimiento; (d) proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (c) en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento, y aislamiento de las células precursoras neurales purificadas; y (e) proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (d) en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento, y aislamiento de las células precursoras purificadas que presentan la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales y gliales, en la que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de la etapa (d) comprende bFGF y EGF, y en el que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de la etapa (e) comprende bFGF y PDGF.

Description

Células precursoras neurales, procedimiento para su producción y utilización de las mismas en la terapia de defectos neurales.

La presente invención se refiere a células precursoras neurales purificadas derivadas de células madre embrionarias (células ME), a procedimientos para la preparación de estas células precursoras en cantidades ilimitadas, y a su utilización para la terapia de defectos neurales, particularmente en mamíferos, preferentemente en seres humanos, y asimismo para la generación de polipéptidos.

El trasplante de células neurales en los sistemas nerviosos de mamíferos representa un procedimiento prometedor para el tratamiento de numerosas enfermedades neurológicas. En estudios animales, se han injertado con éxito una diversidad de poblaciones celulares en el cerebro y en la médula espinal (Björklund, en: Molecular and Cellular Approaches to the Treatment of Neurological Disease, Raven Press, New York, 1993; Brüstle & McKay, Curr. Opinion Neurobiol. 6:688-695, 1996). Recientemente, también se ha aplicado el trasplante neural en el tratamiento clínico de enfermedades seleccionadas, por ejemplo para el tratamiento de pacientes con la enfermedad de Parkinson (Lindvall, en: Neural transplantation in Parkinson's disease, Raven Press, New York, 1994; Olanow et al., TINS 19:102-109, 1996).

En contraste con muchos otros órganos, el sistema nervioso maduro de los mamíferos muestra sólo un potencial de regeneración muy limitado. Ello se debe al hecho de que las células precursoras requeridas para regenerar el tejido neural se encuentran, con pocas excepciones, restringidas al desarrollo del sistema nervioso. La disponibilidad de células precursoras es un requisito previo importante para la reparación basada en el trasplante, de defectos en el sistema nervioso maduro. De esta manera, las células donantes para los trasplantes neurales se derivan en gran parte del cerebro embrionario. Por ejemplo, se requiere tejido cerebral procedente de hasta siete embriones humanos para obtener una cantidad suficiente de tejido donante para el trasplante en un solo paciente de Parkinson. Ello conlleva enormes problemas éticos, y es discutible que este enfoque resulte viable para el tratamiento de un número elevado de pacientes.

Recientemente, se han realizado numerosos esfuerzos para salvar la limitada disponibilidad de células cerebrales embrionarias de mamífero mediante la proliferación in vitro de células precursoras previamente al trasplante. Se han utilizado dos estrategias principales. Un procedimiento comprende la inmortalización de células precursoras utilizando oncogenes. La mayoría de los genes utilizados en este enfoque se han aislado originalmente de tejido tumoral. Estos "genes tumorales" se insertan en el genoma de las células y provocan el crecimiento continuo e incontrolado (Lendahl & McKay, TINS 13:132-137, 1990).

Algunas variaciones controladas más recientes y mejoradas de dicha técnica utilizan oncogenes sensibles a la temperatura. Este enfoque permite la proliferación in vitro de las células bajo una temperatura "permisiva". Si se selecciona una temperatura no permisiva igual a la temperatura corporal típica, ello resultará en la inestabilidad del producto génico y se terminará la proliferación una vez realizado el trasplante (Renfranz et al., Cell 66:713-729, 1991). Sin embargo, el oncogén permanece en las células trasplantadas, y no puede excluirse por completo la posibilidad de una actividad reducida o de la reactivación en un momento posterior. Algunas nuevas estrategias se han destinado a la extracción del oncogén tras completar la etapa de proliferación utilizando herramientas biológicas moleculares (Westerman & Leboulch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8971-8976, 1996). Al igual que con todas las líneas celulares, las células precursoras inmortalizadas con oncogenes muestran una elevada susceptibilidad a las aberraciones cromosómicas.

Otro procedimiento conocido para la proliferación in vitro de las células precursoras previamente al trasplante implica la estimulación de la proliferación celular utilizando factores de crecimiento (Cattaneo & McKay, Nature 347:762-765, 1990; Reynolds & Weiss, Science 255:1707-1710, 1992; Richards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8591-8595, 1992; Ray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3602-3606, 1993; Kilpatrick & Bartlett, Neuron 10:255-265, 1993; Ray & Gage, J. Neurosci. 6:3548-3564, 1994; Davis & Temple, Nature 372:263-266, 1994; Vicario-Abejon et al., Neuron 15:105-114, 1995; Gosh & Greenberg, Neuron 15:89-103, 1995; Gritti et al., J. Neurosci. 16:1091-1100, 1996). En la actualidad no está claro en qué grado los factores de crecimiento realmente permiten una expansión in vitro de los precursores neurales. Los primeros estudios de trasplantes con células tratadas con factor de crecimiento han proporcionado resultados no concluyentes. Mientras que algunos científicos han observado una capacidad reducida de estas células de integración en tejidos del huésped (Svendsen et al., Exp. Neurol. 137:376-388, 1996), otros estudios sugieren que las células tratadas con factor de crecimiento pueden incorporarse con éxito en el tejido cerebral receptor (Gage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11879-11883, 1995).

En resumen, en la actualidad se desconoce cuál es el orden de magnitud de la proliferación mediada por factor de crecimiento de las células precursoras neurales y el comportamiento biológico de estas células proliferadas tras el trasplante en un sistema nervioso huésped. Las estrategias de expansión celular mediadas por oncogenes comportan un riesgo elevado con respecto a aberraciones cromosómicas y la potencial inducción de tumores. La desventaja más notable de dichas estrategias conocidas es el hecho de que dependen de la disponibilidad de tejido cerebral que mayoritariamente se deriva de donantes embrionarios.

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Las células madre embrionarias (en la presente memoria, "células ME") proporcionan perspectivas completamente nuevas para generar células donantes destinadas al trasplante. Las células ME se describieron por primera vez en ratones en 1981 (Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7634-7638, 1981; Evans & Kaufman, Nature 292:154-156, 1981). Las células ME pueden derivarse, por ejemplo, de la masa celular interna de embriones de 3,5 días de edad. Las células ME son totipotentes y presentan el potencial de generar todos los tejidos y tipos celulares. Ello queda mejor reflejado por el hecho de que las células ME inyectadas en otro blastocito pueden participar en la generación de todos los tejidos, incluyendo la línea germinal, produciendo de esta manera animales quiméricos (Bradley et al., Nature 309:255-256, 1984). Una característica única de las células ME es que, en presencia de factor inhibidor de leucemia (LIF), pueden mantenerse y proliferarse en una etapa totipotente (Smith et al., Nature 336:688-690, 1988). En la actualidad, con frecuencia esta observación se aprovecha para modificar genéticamente las células ME. La inyección en blastocitos de estas células ME manipuladas seguidamente se utiliza para generar animales transgénicos (Robertson et al., Nature 323:445-448, 1986). Con menos frecuencia, se han utilizado las células ME para estudios de diferenciación in vitro. Esta técnica permite el estudio y manipulación experimental del desarrollo temprano de tejidos bajo condiciones controladas in vitro. Al mismo tiempo, se han aislado células madre embrionarias a partir de un gran diversidad de especies, incluyendo la rata (Iannaconne et al., Dev. Biol. 163:288-292, 1994), el hámster (Doetschman et al., Dev. Biol. 127:224-227, 1988), aves (Pain et al., Development 122:2339-2348, 1996), peces (Sun et al., Mol. Mar. Biol. Biotechno. 4:193-199, 1995), cerdos (Wheeler, Reprod. Fertil. Dev. 6:563-568, 1994), vacas (First et al., Reprod. Fertil. Dev. 6:553-562) y primates (Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844-7848, 1995). Varios meses después de la presentación de la solicitud de patente alemana nº 197 56 864.5, dos equipos de investigación consiguieron aislar células ME y células madre similares a células ME a partir de tejido embrionario humano (Thomson et al., Science 282:1145-1147, 1998; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726-13731, 1998). Otros estudios recientes indican que los embriones y las células madre embrionarias pueden generarse mediante el trasplante de núcleos procedentes de células de mamífero embrionarias y maduras en oocitos enucleados (Campbell et al., Nature 380:64-66, 1996; Wilmut et al., Nature 385:810-813,
1997).

Durante los últimos pocos años, varios grupos de investigación han tenido éxito en la diferenciación in vitro de células ME en células del sistema nervioso. En la mayoría de casos, se inició la diferenciación neural mediante el tratamiento de células ME agregadas con ácido retinoico (Bain et al., Dev. Biol. 168:342-357, 1995; Strübing et al., Mech. Dev. 53:275-287, 1995; Fraichard et al., J. Cell Sci. 108:3181-3188, 1995; Finley et al., J. Neurosci. 16:1056-1065, 1996). Algunas de las células diferenciadas de esta manera manifestaban propiedades de neuronas (Bain et al., Dev. Biol. 168:342-357, 1995; Strübing et al., Mech. Dev. 53:275-287, 1995; Fraichard et al., J. Cell Sci. 108:3181-3188, 1995; Finley et al., J. Neurosci. 16:1056-1065, 1996) y de células gliales (Fraichard et al., J. Cell Sci. 108:3181-3188, 1995). Sin embargo, la inducción mediada por ácido retinoico de la diferenciación neural adolece de dos desventajas principales. En primer lugar, la diferenciación neural se produce únicamente en una fracción del total de células. De esta manera, hasta el momento no ha resultado posible llevar a cabo una purificación suficiente de estas células neurales. En segundo lugar, el ácido retinoico es un fuerte inductor de la diferenciación de las células ME. Las neuronas y células gliales diferenciadas en presencia de ácido retinoico generalmente se han desarrollado más allá de la etapa de precursor, entrando en una etapa post-mitótica. Por lo tanto, estas células resultan de valor limitado para las estrategias de enriquecimiento celular y trasplante.

Se ha informado de un procedimiento alternativo para la generación de precursores neurales a partir de células ME (Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Las células ME que se agregaron formando cuerpos embrioides se sembraron en placas y se cultivaron en medio libre de suero durante varios días. Durante este tiempo, se observó la muerte celular masiva, particularmente entre las células no neurales. Al final de esta etapa, más del 80% de las células expresan nestina, un filamento intermedio que se encuentra típicamente en las células precursoras neurales (Frederiksen & McKay, J. Neurosci. 8:1144-1151, 1988; Lendahl et al., Cell 60:585-595, 1990). Estas células precursoras pueden expandirse adicionalmente en forma de cultivo monocapa en presencia de factor básico de crecimiento fibroblástico (bFGF) y, tras retirar el bFGF, las células se diferencian formando neuronas y astrocitos (Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Sin embargo, la capacidad de estas células de proliferar en presencia de bFGF es limitada, y con frecuencia se observa una diferenciación astrocítica creciente tras sólo unos cuantos subcultivos (Okabe, en: Current Protocols in Neuroscience, John Wiley, New York, 1997). Tras estos cortos periodos de proliferación, los cultivos todavía contienen numerosas células embrionarias no diferenciadas, así como células no neurales diferenciadas. Las poblaciones celulares que contienen estos contaminantes no resultan adecuadas para los trasplantes reconstructivos. Las células ME no diferenciadas pueden generar tumores (teratocarcinomas) y las células no neurales donantes pueden formar tejido no neural dentro del injerto. Hasta el momento, no existe ningún procedimiento conocido que permita la generación de células derivadas de células ME que presenten propiedades neuronales o gliales con la pureza necesaria para los trasplantes no tumorigénicos en el sistema nervioso y que presenten actividad funcional in vivo, tal como, por ejemplo, la remielinización o sustitución de neuronas perdidas con recuperación del comportamiento anormal provocado por la pérdida neuronal.

La generación de un número suficiente de células precursoras neurales definidas en la actualidad constituye uno de los problemas clave de las técnicas actuales de trasplante neural. En la actualidad, las células precursoras típicamente se aíslan a partir de cerebro embrionario de mamífero. Por ejemplo, se requiere material de hasta siete embriones humanos para el trasplante en un solo paciente de Parkinson. Esta estrategia se asocia con problemas mayores y no resulta adecuada para el tratamiento a largo plazo de un número elevado de pacientes de Parkinson. Los esfuerzos por proliferar células neurales in vitro previamente al trasplante hasta el momento no han conducido a mejoras significativas. La inmortalización mediada por oncogenes comporta riesgos considerables para la introducción de un gen tumorigénico en las células donantes. El orden de magnitud de la proliferación mediada por factor de crecimiento de las células precursoras no resulta suficiente para una potencial aplicación clínica. Además, en la actualidad se desconoce con exactitud cuál es la capacidad de las células expandidas de incorporarse en los tejidos del huésped tras el trasplante (Suendren et al., Exp. Neurol. 137:376-388, 1996).

Las células ME representan una interesante fuente donante alternativa para el trasplante neural. La ventaja clave asociada con estas células es que pueden multiplicarse durante largos periodos de tiempo en un estado totipotente no diferenciado (Slack, en: From Egg to Embryo, Cambridge University Press, Cambridge, 1991). Durante la proliferación, las células ME mantienen su capacidad de diferenciarse para formar todos los tipos de tejido, incluyendo el tejido neural. Sin embargo, hasta el momento no ha resultado posible diferenciar selectivamente las células ME para formar células precursoras. Los intentos para inducir la diferenciación neural utilizando ácido retinoico siempre han producido poblaciones celulares mixtas, en las que las células neurales representaban únicamente una fracción del total de células (Bain et al., Dev. Biol. 168:342-357, 1995; Strübing et al., Mech. Dev. 53:275-287, 1995; Fraichard et al., J. Cell Sci. 108:3181-3188, 1995; Finley et al., J. Neurosci. 16:1056-1065, 1996). Además, se ha informado de la formación inducida por ácido retinoico de neuronas derivadas de células ME, aunque no de la formación de precursores neurales inducida por ácido retinoico. En un estudio de Dinsmore et al., dichas poblaciones celulares mixtas se injertaron en el cerebro de ratas lesionadas con ácido quinolínico. El ácido quinolínico es una neurotoxina que daña y destruye neuronas. Tras el trasplante, algunas de las células injertadas mantuvieron su fenotipo neuronal. Sin embargo, en estos experimentos no se observó la innervación funcional del cerebro del huésped ni la reconstitución de las funciones cerebrales perdidas (Dinsmore et al., Cell Transplant. 5:131-143, 1996). El procedimiento de cultivo descrito por Okabe et al., comprende la siembra en placa de cuerpos embrioides en medio ITSFn y no depende del ácido retinoico. Mediante la utilización de este procedimiento, hasta el 85% del número total de células producidas expresaba el marcador de célula precursora neural llamado nestina (Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Sin embargo, la pureza de estas poblaciones celulares, además, no resultaba suficiente para su utilización con fines reconstructivos. Por ejemplo, los precursores injertados derivados de células ME cultivados en medio ITSFn se ha demostrado que forman estructuras neuroepiteliales primitivas, así como tejido no neural, tal como cartílago y tejido adenoide. Resulta posible proliferar adicionalmente células cultivadas en ITSFn en presencia de bFGF. Sin embargo, estas células pierden rápidamente su totipotencia y, en unos pocos subcultivos, se diferencian para formar predominantemente astrocitos. En este breve periodo de tiempo, hasta el momento no ha resultado posible separar las células no neurales de las células precursoras neurales. Otra desventaja importante de este paradigma particular es la falta de una generación eficiente de oligodendrocitos. Por ejemplo, Okabe et al. no observaron diferenciación oligodendroglial tras la simple diferenciación inducida por retirada de factor de crecimiento. Incluso tras la adición de la hormona T3 del tiroides, sólo se detectaron antígenos oligodendrogliales en el 1% a 2% de las células (Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Respecto a la diferenciación neuronal, los estudios informados por Okabe et al. no proporcionan evidencia de la generación de neuronas que expresen tirosina hidroxilasa, colina acetiltransferasa o serotonina, compuestos que presentan una gran importancia para la transducción de señales entre neuronas individuales. Además, estos estudios no proporcionan evidencia de neuronas que expresen periferina. La periferina se expresa típicamente en neuronas periféricas y en neuronas del tallo cerebral y de la médula espinal.

De esta manera, el objetivo de la presente invención es proporcionar células precursoras no tumorigénicas purificadas y aisladas, derivadas de células ME, que presenten propiedades neuronales o gliales, especialmente neuronas y células gliales purificadas, así como procedimientos para la producción de estas células precursoras en cantidades virtualmente ilimitadas. La generación de estas células precursoras purificadas permite su trasplante en el sistema nervioso sin que se formen tumores, así como proporcionar actividad funcional in vivo, por ejemplo la remielinización o la sustitución de neuronas perdidas con la recuperación del comportamiento anormal provocado por la pérdida neuronal, y una terapia mejorada para los defectos neurales. Estos retos se consiguen mediante las reivindicaciones de la patente, la descripción de la invención, y las figuras adjuntas.

Definiciones

El término "astrocito" se refiere a una célula glial del sistema nervioso. Los astrocitos participan en el funcionamiento de la barrera hematocefálica, que separa el flujo sanguíneo sistémico de los líquidos que circulan en el interior del cerebro. Se conoce poco acerca de otros aspectos funcionales relacionados con este tipo celular.

El término "autólogo" significa que se origina en el mismo organismo.

El término "bFGF" significa "factor básico de crecimiento fibroblástico", que es un factor de crecimiento que estimula la separación (proliferación) de células precursoras neurales.

El término "CNTF" se refiere al "factor neutrófico ciliar".

El término "DMEM/F12" se refiere a medio de Eagle modificado por Dulbecco/mezcla nutritiva F12 (1:1) y es un medio de cultivo celular disponible comercialmente que puede utilizarse para el cultivo celular libre de suero (por ejemplo de Life Technologies, nº 11320).

El término "EGF" se refiere a "factor de crecimiento epidérmico", que es un factor de crecimiento que estimula la separación (proliferación) de las células precursoras neurales.

La expresión "cuerpos embrioides" se refiere a agregados celulares que crecen en suspensión. Por ejemplo, pueden generarse cuerpos embrioides mediante el cultivo de células ME en placas de cultivo bacteriano. Debido a que estas células muestran similitudes con los embriones de etapas tempranas y pueden generar una diversidad de diferentes tejidos, se denominan cuerpos embrioides.

La expresión "células ME" se refiere a células madre embrionarias. Estas células pueden aislarse a partir de embriones tempranos en la etapa de blastocito. Representan células totipotentes que son capaces de generar todos los tejidos y tipos celulares. En cultivo celular pueden mantenerse en un estado totipotente durante muchos subcultivos. Las células ME también pueden definirse como células similares a células ME obtenibles a partir de células germinales embrionarias.

La expresión "células de soporte" se refiere a una población celular que da soporte al crecimiento de otra población celular. Las células ME, por ejemplo, con frecuencia se cultivan en una capa de soporte de fibroblastos embrionarios.

Los términos "ITSFn" y "N3FL" se refieren a medios de cultivo celular derivados de medios DMEM/F12 (Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996).

El término "LIF" se refiere al "factor inhibidor de la leucemia", que es un factor que inhibe la diferenciación de las células ME.

La expresión "precursor neural" se refiere a una célula inmadura del sistema nervioso que presenta el potencial de desarrollarse para formar una célula del sistema nervioso maduro, tal como una neurona (células nerviosas) o una célula glial (incluyendo, por ejemplo, astrocitos y oligodendrocitos).

La expresión "esferoides neurales" se refiere a agregados celulares, obtenidas mediante la proliferación de células precursoras neurales en un medio de cultivo celular que contiene factor de crecimiento y en placas no recubiertas de cultivo celular.

El término "oligodendrocito" se refiere a una célula del sistema nervioso que está subordinada a la denominada célula glial. La función conocida más importante de estas células es el aislamiento de los procesos de las células nerviosas (axones). Los axones se encuentran aislados mediante una vaina (mielina) formada colectivamente por los oligodendrocitos. Los defectos en la formación de mielina resultan típicamente en un estado de enfermedad desmielinizante. Una de las enfermedades desmielinizantes más conocidas es la esclerosis múltiple (EM).

El término "PDGF" se refiere a "factor de crecimiento derivado de plaquetas", que es un factor de crecimiento que puede, por ejemplo, en combinación con otros factores de crecimiento, estimular la separación de células precursoras neurales (proliferación). El PDGF se encuentra en forma de los dímeros AA, AB y se describe como PDGF-AA, PDGF-A o PDGF-BB.

Las expresiones "células totipotentes", "células pluripotentes", "células multipotentes" y "células bipotentes" se refiere a células precursoras que presentan el potencial de diferenciarse para formar todos (toti-), o muchos (pluri- y multipotentes) o dos (bipotentes) tipos celulares maduros diferentes. En el campo de la neurobiología, las células bipotenciales con frecuencia se refieren a células precursoras que pueden generar astrocitos y oligodendrocitos.

De esta manera, la invención se refiere a una composición celular no tumorigénica obtenida a partir de células madre embrionarias de mamífero, que contiene

a) por lo menos el 85% de células precursoras neurales aisladas con la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales o gliales, y

b) no más del 15% de células embriónicas primitivas y no neurales.

Las células pueden obtenerse mediante las etapas siguientes: (a) proliferación de las células ME, (b) cultivo de las células ME de la etapa (a) para formar células precursoras neurales, (c) proliferación de las células precursoras neurales en medio libre de suero que contiene factor de crecimiento, (d) proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (c) en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento, y aislamiento de las células precursoras neurales purificadas, y (e) proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (d) en otro medio libre de suero que contiene otro factor de crecimiento y aislamiento de las células precursoras purificadas con la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales y gliales, en las que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento en la etapa (d) comprende bFGF y EGF, y en las que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de la etapa (e) comprende bFGF y PDGF. En una forma de realización preferida, las células se cultivan como monocapas o esferoides. En una forma de realización particularmente preferida, las células muestran propiedades neuronales, astrocíticas y/o oligodendrogliales. En otra forma de realización preferida, las células precursoras se derivan de células ME aisladas a partir de blastocitos que se generaron mediante trasplante nuclear en oocitos. En otra forma de realización preferida, las células precursoras se derivan de células madre embrionarias generadas a partir de células germinales embrionarias. En otra forma de realización preferida, las células precursoras se derivan de células ME de mamífero o de oocitos de mamífero. En otra forma de realización preferida, las células precursoras se derivan de ratón, rata, hámster, ovejas, cerdos, vacas, primates no humanos y seres humanos. En una forma de realización particularmente preferida, las células precursoras se modifican genéticamente. En otra forma de realización particularmente preferida, las células precursoras se mantienen en estado congelado. En otra forma de realización particularmente preferida, las células precursoras se utilizan para generar bibliotecas celulares que comprenden células precursoras autólogas y no autólogas.

La invención se refiere además a un procedimiento para la generación de células precursoras purificadas con la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales o gliales, que comprende las etapas siguientes: (a) proliferación de las células ME, (b) cultivo de las células ME de la etapa (a) para formar células precursoras neurales, (c) proliferación de las células precursoras neurales en medio libre de suero que contiene factor de crecimiento, (d) proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (c) en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento y aislamiento de las células precursoras neurales purificadas, y (e) proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (d) en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento y aislamiento de las células precursoras purificadas con la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales o gliales, en las que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento en la etapa (d) comprende bFGF y EGF, y en el que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento en la etapa (e) comprende bFGF y PDGF.

En una forma de realización preferida, las células ME de (a) se proliferan para formar agregados, especialmente cuerpos embrioides. En otra forma de realización preferida de la invención, el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento en (c) contiene bFGF. En otra forma de realización preferida, las células precursoras neurales purificadas se transfieren a un medio adecuado para la inyección.

La invención también se refiere a un procedimiento para la generación de células precursoras neurales purificadas con la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales o gliales, que comprende las etapas siguientes: (a') proliferación de las células ME, (b') cultivo de las células ME de la etapa (a') para formar células precursoras neurales, (c') proliferación de las células precursoras neurales en medio libre de suero que contiene factor de crecimiento, (d') proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (c') en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento para formar esferoides neurales con potencial de diferenciación neuronal y glial, y aislamiento de los esfereoides neurales, y (e') proliferación de los esferoides neurales de la etapa (d') en medio libre de suero que contiene factor de crecimiento hasta la generación de una monocapa de células precursoras gliales, y aislamiento de las células precursoras purificadas que presentan la capacidad de diferenciarse para formar células gliales, en las que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de la etapa (d'), (e') comprende bFGF y/o EGF, con la condición de que el procedimiento no incluya la destrucción de embriones humanos. En otra forma de realización preferida, el factor neurotrófico ciliar (CNTF), y la hormona tiroidea (T3) se utilizan en la etapa (f') para estimular la diferenciación astrocítica y oligodendroglial, respectivamente. En otra forma de realización preferida, las células precursoras neurales purificadas se transfieren a un medio adecuado para la inyección.

Las células precursoras neurales obtenidas mediante la invención pueden utilizarse como herramienta terapéutica (fármaco) para el tratamiento médico. Una aplicación preferida de las células precursoras neurales purificadas es la generación de herramientas terapéuticas (fármaco) para el tratamiento de defectos neurales. Una aplicación particularmente preferida es la reconstitución de células neuronales, o la remielinización de células nerviosas desmielinizadas, especialmente dentro de áreas desmielinizadas del sistema nervioso, mediante trasplante celular en el sistema nervioso.

Entre las aplicaciones preferidas se incluyen la reconstitución de las células neuronales que resultan dañadas o perdidas como resultado de un trastorno traumático, isquémico, degenerativo, genético, hipóxico, metabólico, infeccioso, neoplásico o tóxico que implica el sistema nervioso. Entre las aplicaciones particularmente preferidas se incluyen la reconstitución de las células neurales en lesiones traumáticas que implican el cerebro y la médula espinal, los infartos isquémicos y hemorrágicos, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer, los trastornos atróficos hereditarios del cerebelo y del tallo cerebral, las enfermedades de las neuronas motoras y las atrofias musculares medulares. Entre las aplicaciones preferidas se incluyen además la reconstitución de las células neuronales que resultan perdidas o dañadas debido a cambios relacionados con la edad. Una aplicación particularmente preferida es la remielinización de las áreas desmielinizadas del sistema nervioso, particularmente en enfermedades tales como la esclerosis múltiple (EM), la adrenoleucodistrofia y la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher.

Otra aplicación preferida de las células precursoras neurales derivadas de células ME es la transferencia génica al sistema nervioso mediada por células. Entre las aplicaciones preferidas para la transferencia génica mediada por células se incluyen los trastornos metabólicos hereditarios debidos a deficiencias enzimáticas y los trastornos neoplásicos del sistema nervioso. Las células precursoras neurales derivadas de células ME obtenidas a través de la presente invención también pueden utilizarse para la producción in vitro de otros factores, por ejemplo polipéptidos, que resultan útiles para aplicaciones clínicas y comerciales.

La presente invención se explicará con mayor detalle a partir de las figuras.

La figura 1 es una representación esquemática de la generación de precursores neurales derivados de células ME. (A) Proliferación de células ME (círculos vacíos) en una capa de soporte de fibroblastos embrionarios (cuadrados pequeños). Tras la proliferación, las células ME pueden propagarse adicionalmente, o alternativamente pueden congelarse en nitrógeno líquido. (B) Células ME en cultivo en placas de cultivo celular recubiertas con gelatina sin células de soporte. (C) Cuerpos embrioides con diferenciación incipiente en las células neurales (círculos negros). (D) Cuerpos embrioides en placas cultivadas en medio ITSFn. Este medio favorece la supervivencia de las células neurales (círculos negros). (E) Células precursoras neurales derivadas de células ME que proliferan en un medio libre de suero que contiene factor de crecimiento en presencia de bFGF (medio N3FL). (F) Células precursoras neurales derivadas de células ME que proliferan en un medio libre de suero que contiene factor de crecimiento en presencia de bFGF y de EGF (medio N3EFL). (G) Células precursoras neurales derivadas de células ME que proliferan en un medio libre de suero que contiene factor de crecimiento en presencia de bFGF y de PDGF (medio N2FP). Tras dos subcultivos en medio N2FP, las células resultan útiles para la remielinización de trasplantes. Alternativamente, pueden congelarse en medio de congelación libre de suero para la utilización posterior.

La figura 2 es una representación esquemática (esquema de flujo) de la generación de esferoides neurales y de poblaciones celulares derivadas de esferoides a partir de células ME. Las etapas (A) a (E) son idénticas a las ilustradas en la figura 1. (F) Esferoides neurales generados a partir de cultivos N3FL, que proliferan en medio libre de suero que contiene factor de crecimiento en presencia de bFGF y de EGF (medio N2EF). Las células en esta etapa pueden conservarse criogénicamente. (G) Diferenciación in vitro de esferoides neurales derivados de células ME inducidas por la retirada de factor de crecimiento. Los esferoides dan lugar a neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. (H) Trasplante de esferoides neurales derivados de células ME en el sistema nervioso. (I) Generación de células precursoras gliales a partir de esferoides neurales derivados de células ME en placa (conocidas como "cultivos touch-down"). Los esferoides neurales derivados de células ME se propagan en presencia de factores de crecimiento hasta que empiezan a adherirse a las placas de cultivo celular no recubierto. En este punto, las células precursoras gliales migran fuera de los esferoides hacia la placa de cultivo celular. (K) Tras la extracción de los esferoides, los precursores gliales derivados de esferoides se proliferan adicionalmente en presencia de los factores de crecimiento. Las células generadas en (I) y en (K) pueden conservarse criogénicamente; las células precursoras gliales obtenidas en (K) resultan útiles para el trasplante en el sistema nervioso. (L) y (M) muestran que la adición de CNTF y de T3 durante la retirada del factor de crecimiento estimula la diferenciación astrocítica (L) y oligodendroglial (M) de los precursores gliales derivados de células ME.

La figura 3 muestra cultivos de células precursoras neurales tras la proliferación y diferenciación in vitro de las células ME. (A-B) Fotografías de contraste de fases de células precursoras neurales derivadas de células ME J1 que proliferan en medio N2FP. (C-D) Diferenciación oligodendroglial de cultivos N2FP cuatro días después de la retirada de bFGF y de PDGF. Numerosas células expresan el marcador antigénico oligodendroglial O4. Se ilustran las fotografías de inmunofluorescencia y de contraste de fases correspondientes en C y en D, respectivamente. (E-F) muestran la diferenciación astrocítica de los cultivos en N2FP. Cuatro días después de la retirada del factor de crecimiento, se detectaron numerosos astrocitos positivos para GFAP. En E y en F se muestran las fotografías correspondientes de inmunofluorescencia y de contraste de fases. (G-H) Diferenciación neuronal de cultivos en N2FP. Además de los oligodendrocitos y astrocitos, las neuronas pueden detectarse tras la retirada del factor de crecimiento. Muestran procesos largos y expresión prominente del marcador antigénico neuronal beta-III-tubulina. En G y en H se muestran las fotografías correspondientes de inmunofluorescencia y de contraste de fases, respectivamente.

La figura 4 muestra unas secciones de vibratomo obtenidas de un cerebro receptor tras el trasplante de los precursores gliales derivados de células ME. Tras el trasplante en un cerebro fetal de rata, las células precursoras gliales se diferencian en oligodendrocitos y astrocitos. Los oligodendrocitos derivados de células ME se mielinizan en el cerebro huésped. (A) Tras el trasplante intraventricular en un cerebro fetal de rata, los astrocitos derivados del donante migran hacia el tejido cerebral. En este experimento se inyectaron en el sistema ventricular de embriones de rata de 17 días de edad, suspensiones de células individuales de cultivos en N2FP. Se analizaron los animales receptores tres semanas después del nacimiento. Se utilizó un anticuerpo contra el antígeno glial M2 específico de ratón para detectar las células derivadas del donante. El tercer ventrículo resulta visible en la mitad superior del campo microscópico. (B) Incorporación de células gliales derivadas de células ME en el córtex cerebral de una rata recién nacida. Las células se implantaron en el ventrículo del huésped en el día embrionario 16. Se llevó a cabo el análisis de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo contra el antígeno M6 específico de ratón. Las células mostraban una morfología astroglial característica. (C) Incorporación de oligodendrocitos derivados de células ME en el tectum (colliculus inferior) de una rata deficiente en mielina de 22 días de edad, que había recibido una inyección intraventricular de un cultivo en N2FP el día embrionario 17. Las células del donante se identificaron mediante la hibridación in situ de ADN con una sonda de ADN que hibrida con ADN satélite de ratón (marcaje nuclear negro). Las células incorporadas habían iniciado la mielinización del cerebro huésped. Debido a que las ratas deficientes en mielina carecen de inmunorreactividad para PLP en el sistema nervioso central, la mielinización puede detectarse con facilidad utilizando un anticuerpo contra PLP (procesos oscuros). (D) Vista de elevada magnificación de un oligodendrocito mielinizante derivado de célula ME tras la incorporación en el hipotálamo de un animal receptor de 22 días de edad. La célula muestra una señal de hibridación nuclear y procesos positivos para PLP en una orientación paralela típica.

La figura 5 muestra unos cultivos de esferoides neurales derivados de células ME y poblaciones celulares derivadas de esferoides. (A) Esferoides neurales de 5 días de edad derivados de la línea J1 de células ME. Los esferoides en esta etapa pueden utilizarse para el trasplante en el sistema nervioso. (B) Se tiñeron con un anticuerpo contra la nestina, un filamento intermedio que se expresa típicamente en las células precursoras neurales, esferoides neurales de dos semanas de edad derivados de las células ME J1. En esta etapa los esferoides neurales son visibles macroscópicamente (fotografía de inmunofluorescencia). (C-D) Se sembraron en placas de cultivo celular con poliornitina y fibronectina, esferoides neurales de cinco días de edad derivados de células ME CJ7, y se cultivaron durante cinco días adicionales en ausencia de factores de crecimiento. Los esferoides se desintegraron y se diferenciaron para formar células neurales. (D) ilustra un análisis de doble inmunofluorescencia con anticuerpos contra el antígeno neuronal beta-III-tubulina (señal brillante) y el marcador de células precursoras neurales llamado nestina (señal oscura, flechas). La comparación con la fotografía de contraste de fases correspondiente (C) revela que todas las células ilustradas en este campo expresan uno de los dos marcadores. (E-F) El cultivo de esferoides neurales derivados de células ME de 5 días de edad (derivados de la línea J1 de células EM) se diferenció durante 7 días adicionales con poliornitina y fibronectina en ausencia de factores de crecimiento y se tiñó con anticuerpos contra el marcador neuronal llamado proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2, E) y el neurotransmisor GABA (F). Estas micrografías de inmunofluorescencia muestran que numerosas neuronas expresan el neurotransmisor GABA. Las poblaciones celulares enriquecidas con células GABAérgicas pueden utilizarse para el trasplante neural de pacientes con la enfermedad de Huntington. (G-H) muestras células del mismo experimento de cultivo celular, teñidas con anticuerpos contra el marcador neuronal MAP2 (G) y el neurotransmisor glutamato (H; G y H son micrografías de inmunofluorescencia). Numerosas neuronas expresan el neurotransmisor glutamato. (I) muestra un cultivo de esferoides neurales derivados de células ME de 5 días de edad (derivadas de la línea J1 de células ME) diferenciado durante 2 semanas adicionales con poliornitina y fibronectina en ausencia de factores de crecimiento y marcado doblemente con anticuerpos contra los marcadores neuronales antígenos beta-III-tubulina (tinción filamentosa de los procesos celulares) y la sinapsina (señal punteada asociada con los procesos celulares). Con el fin de dar soporte a la diferenciación neuronal, las células se trataron con la neurotrofina factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF; 20 ng/ml) durante los últimos 5 días de diferenciación in vitro. La fotografía demuestra que las neuronas generadas a partir de los esferoides neurales derivados de células ME desarrollan morfologías maduras y expresan proteínas sinápticas importantes para la señalización neuronal. (K) Cultivo de esferoides neurales derivados de células ME de 5 días de edad (derivadas de la línea J1 de células ME) diferenciados en poliornitina y fibronectina en ausencia de factores de crecimiento y marcadas con un anticuerpo contra la tirosina hidroxilasa. Las neuronas que expresan la tirosina hidroxilasa se utilizan para el trasplante en pacientes con la enfermedad de Parkinson. Este análisis de inmunofluorescencia demuestra que numerosas neuronas derivadas de células ME expresan este enzima. (L) Cultivo de un esferoide neural derivado de células ME de 11 días de edad (derivada de la línea J1 de células ME) diferenciada durante una semana adicional en poliornitina y fibronectina en ausencia de factores de crecimiento y marcada con un anticuerpo contra el antígeno astroglial proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Este análisis de inmunofluorescencia demuestra que los esferoides neurales derivados de células ME también dan lugar a astrocitos. (M) Cultivo de esferoides neurales derivados de células ME de 5 días de edad (derivadas de la línea J1 de células ME) diferenciadas durante 5 días adicionales en poliornitina y fibronectina en ausencia de factores de crecimiento y marcadas con un anticuerpo contra el marcador oligodendroglial O4. Este análisis de inmunofluorescencia demuestra que los esferoides neurales derivados de células ME también dan lugar a oligodendrocitos.

La figura 6 muestra unas células precursoras gliales generadas a partir de los esferoides neurales derivados de células ME. (A) Ejemplo típico de un "cultivo touch-down". Los esferoides neurales derivados a partir de la línea J1 de células ME se adhieren a placas de cultivo celular no recubiertas y generan una arborización de las células gliales. Los esferoides adherentes pueden extraerse con facilidad mediante agitación, dejando una monocapa de células precursoras gliales purificadas. (B) Análisis de inmunofluorescencia de una población de células precursoras gliales generadas como cultivo touch-down a partir de esferoides neurales derivados de células ME (derivadas de la línea J1 de células ME). Este análisis de inmunofluorescencia demuestra que las células precursoras gliales expresan el antígeno neural A2B5.

La figura 7 muestra la diferenciación dirigida de los precursores gliales derivados de células ME mediante la adición de factores únicos. Se trató con CNTF (10 ng/ml) o T3 (3 ng/ml) un cultivo touch-down generado a partir de esferoides neurales derivados de células ME (derivadas de la línea J1 de células ME) y se proliferó en presencia de EGF y de bFGF. Dos días después, se retiraron los factores EGF y bFGF, aunque las células continuaron recibiendo CNTF o T3. Tras 5 días de retirada de los factores de crecimiento, las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpos contra el antígeno astrocítico GFAP y contra el antígeno oligodendroglial O4. Las fotografías correspondientes de inmunofluorescencia y de contraste de fases demuestran que la adición de CNTF o de T3 influye sobre la diferenciación de las células precursoras derivadas de células ME. En presencia de CNTF, la mayoría de las células adquiere una morfología astrocítica y expresan el marcador astrocítico GFAP. En presencia de T3, las células adquieren una morfología oligodendroglial multipolar y expresan el marcador oligodendroglial O4.

La figura 8 muestra la diferenciación neuronal de esferoides neurales derivados de células ME (derivadas a partir de la línea J1 de células ME) in vitro (A-B) y tras el trasplante en el sistema nervioso de ratas lesionadas con ácido iboténico, un modelo animal de la enfermedad de Huntington (C-D). Se injertaron esferoides neurales de cinco días de edad en el striatum de ratas adultas lesionadas con ácido iboténico. Simultáneamente, se diferenció una alícuota de esferoides neurales mediante la retirada in vitro de factor de crecimiento a lo largo de 5 días y posteriormente se tiñó con un anticuerpo dirigido contra el neurotransmisor GABA (A, inmunofluorescencia; B, imagen correspondiente de contraste de fases). Las figuras ilustran que numerosas neuronas derivadas de células ME expresan el neurotransmisor GABA. Siete semanas después del trasplante, se detectó un trasplante vital que mostraba diferenciación neuronal en el cerebro adulto de rata (C y D). (C) Vista de baja magnificación de un trasplante identificado mediante la utilización de un anticuerpo contra el antígeno neural M6 específico de ratón (inmunofluorescencia). El injerto muestra tinción homogénea y se encuentra bien integrado en el cerebro receptor. Este animal también manifestaba una mejora funcional con normalización del comportamiento de rotación inducido por la lesión con ácido iboténico. (D) Ilustra axones derivados de células donantes que han crecido a partir del trasplante en el cerebro huésped circundante; la tinción de inmunofluorescencia se llevó a cabo utilizando un anticuerpo contra M6.

Con el fin de iniciar la generación de células precursoras neurales, pueden proliferarse células madre embrionarias, por ejemplo originadas en el ratón, hasta el número deseado en un medio que contenga suero en una capa de soporte de fibroblastos embrionarios no mitóticos de acuerdo con procedimientos estándar (Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, New York, 1994). Además de las líneas celulares ME de ratón establecidas, tales como la J1 (Li et al., Cell 69:915-926, 1992), la R1 (Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8424-8428, 1993) y la CJ7 (Swiatek & Gridley, Genes Dev. 7:2071-2084, 1993), también pueden obtener células ME a partir de embriones, por ejemplo a partir de blastocitos de ratón de 3 a 4 días de edad (Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo", Cold Spring Harbor Press, New York, 1994). Las células ME también pueden obtenerse de otras especies, tales como la rata (Iannaconne et al., Dev. Biol. 163:288-292, 1994), el hámster (Doetschman et al., Dev. Biol. 127:224-227, 1988), aves (Pain et al., Development 122:2339-2348, 1996), peces (Sun et al., Mol. Mar. Biol. Biotechno. 4:193-199, 1995), cerdos (Wheeler, Reprod. Fertil. Dev. 6:563-568, 1994), vacas (First et al., Reprod. Fertil. Dev. 6:553-562), primates (Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844-7848, 1995) o de tejido embrionario humano. Varios meses tras la presentación de la solicitud de patente alemana nº 197 56 864.5, dos equipos de investigación tuvieron éxito en el aislamiento de células ME y células madre similares a células ME, procedentes de tejido embrionario humano (Thomson et al., Science 282:1145-1147, 1998; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726-13731,
1998).

Las líneas celulares ME dependientes de células de soporte pueden sembrarse en placas de cultivo celular recubiertas con gelatina y posteriormente agregarse en placas de Petri no recubiertas en ausencia de LIF con el fin de formar cuerpos embrioides (Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996). A continuación, pueden sembrarse cuerpos embrioides de tres a cuatro días de edad en placas de cultivo celular y cultivarse durante cuatro a ocho días en medio libre de suero (medio ITSFn; Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Durante este tiempo, puede detectarse una pronunciada muerte celular entre las células no neurales.

Tras cuatro a ocho días en medio ITSFn, las células pueden convertirse en una suspensión de células individuales utilizando una pipeta de boca estrecha y después transferirse a medio N3FL. N3FL es un medio libre de suero que contiene bFGF (Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Se utiliza bFGF para promover la proliferación de las células precursoras neurales.

Tras incubar durante un periodo de 4 a 8 días en medio N3FL, se inicia la generación de poblaciones de células precursoras gliales y neuronales. En contraste con los precursores neuronales, los precursores gliales muestran un pronunciado potencial proliferativo. El procedimiento dado a conocer en la presente invención explota este potencial proliferativo. Las células derivadas de cultivos N3FL se propagan secuencialmente a través de diferentes medios libres de suero que contienen factor de crecimiento. Durante esta etapa, puede observarse un enriquecimiento sustancial en precursores bipotentes que presentan capacidad de diferenciación astrocítica y oligodendroglial. Concomitantemente, se diferencian y eliminan de los cultivos las células embrionarias primitivas y las células no neurales. Para conseguir lo anterior, las células cultivadas en medio N3FL se recolectan mecánicamente, se trituran hasta formar una suspensión de células individuales y se transfieren a medio libre de suero que pueden contener los factores de crecimiento bFGF y EGF (medio N3EFL). En este medio, las células se propagan en forma de monocapa hasta ser subconfluentes.

Tras aproximadamente dos subcultivos, las células cultivadas en este medio pueden utilizarse con fines de trasplante. Para una purificación adicional, puede incluirse una etapa más.

Las células cultivadas en medio N3FL pueden recolectarse mecánicamente, triturarse hasta formar una suspensión de células individuales y sembrarse nuevamente en placa en un medio libre de suero que contenga una segunda combinación de factores de crecimiento, por ejemplo bFGF y PDGF.

Las células obtenidas mediante dicho procedimiento pueden propagarse adicionalmente mediante subcultivos adicionales en el mismo medio. Tras aproximadamente dos subcultivos, el cultivo consiste en células precursoras neurales purificadas que pueden utilizarse directa o alternativamente, tras el aislamiento, por ejemplo para trasplantes remielinizantes. En esta etapa, las células forman una capa homogénea que presenta una morfología entre bipolar y multipolar. Pueden congelarse y descongelarse en esta etapa o incluso en etapas anteriores sin perder sus propiedades de célula precursora. Si los factores de crecimiento no se añaden durante varios días, la retirada de ellos induce la diferenciación de las células in vitro. En este caso, los análisis inmunohistoquímicos revelan la presencia de antígenos marcadores para los oligodendrocitos (por ejemplo O4) y los astrocitos (por ejemplo GFAP), además de los marcadores de las células precursoras neurales (por ejemplo la nestina). Las células positivas para O4 y para GFAP pueden suponer de 20% a 40%, y de 30% a 70% de las poblaciones celulares, respectivamente. Además, también pueden encontrarse en estos cultivos células que expresan antígenos neuronales.

La generación de células precursoras neuronales y gliales en la forma de esferoides neurales también se inicia tras un periodo de 4 a 8 días en medio N3FL.

Para el enriquecimiento en células neurales, las células cultivadas en medio N3FL se recolectan mecánicamente, se trituran en una suspensión de células individuales y se propagan adicionalmente en placas de cultivo celular no recubiertas en medio libre de suero que puede contener los factores de crecimiento bFGF y EGF. En unos pocos días, las células forman agregados celulares (es decir, esferoides neurales) que se encuentran compuestas principalmente de células precursoras neurales positivas para la nestina. Los esferoides neurales pueden propagarse adicionalmente en forma de un cultivo en suspensión. En contraste, las células neurales diferenciadas y las células no neurales tienden a adherirse a la superficie de las placas de cultivo celular.

Tras la formación de estos esferoides de tamaño reducido, se extraen del cultivo y se transfieren a nuevas placas de cultivo celular no recubiertas. En unos pocos días (por ejemplo 5 a 7), los esferoides pueden utilizarse con fines de trasplante. En este caso, los precursores neurales dentro de los esferoides se diferencian para formar células neurales maduras que después pueden inervar el cerebro del huésped. Los esferoides neurales no diferenciados de tamaño reducido pueden congelarse en nitrógeno líquido en un medio de congelación libre de suero y posteriormente descongelarse y diferenciarse en el futuro.

La presente invención también se refiere a células neurales diferenciadas en una composición de esferoides que puede resultar adecuada para el trasplante. Estas células pueden obtenerse mediante diferenciación in vitro de las células precursoras derivadas de células ME con propiedades neuronales o gliales, tal como se describe en la presente memoria. Con el fin de inducir la diferenciación in vitro, se extraen los factores de crecimiento y los esferoides, compuestos de células precursoras neurales no diferenciadas, se siembran en placa, por ejemplo en placas de cultivo celular recubiertas con poliornitina y con fibronectina. Bajo estas condiciones, los esferoides se adhieren rápidamente a la superficie de la placa de cultivo celular y, además de los precursores neurales positivos para la nestina, estos esferoides pueden producir neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Las neuronas adherentes pueden diferenciarse adicionalmente para expresar una diversidad de marcadores neuronales, incluyendo MAP2, beta-III-tubulina, sinapsina, colina acetiltransferasa, tirosina hidroxilasa, GABA, glutamato, serotonina, periferina y calbindina. La maduración y supervivencia de las neuronas diferenciadas puede incrementarse mediante la adición de neurotrofinas, tales como BDNF o neurotrofina 3 (NT-3).

En medio libre de suero que contiene factores de crecimiento tales como, por ejemplo, bFGF y EGF, los esferoides neurales derivados de células ME pueden mantenerse en cultivo en suspensión durante varias semanas. En esta etapa, los esferoides pueden crecer hasta un tamaño mayor que resulte fácilmente detectable al ojo desnudo. Bajo estas condiciones, puede observarse un nivel creciente de diferenciación celular dentro de los esferoides neurales. De esta manera, estos esferoides pueden utilizarse para el trasplante de neuronas derivadas de células ES incluso en un estado avanzado de diferenciación. Ello no resulta posible utilizando neuronas diferenciadas derivadas de células ME en un cultivo en monocapa, debido a que la recolección de estas células invariablemente conducirá a daños importantes de los procesos neuronales y a la destrucción de los cuerpos celulares neuronales.

A lo largo de los últimos años, se han identificado numerosos factores que pueden influir sobre la diferenciación de las poblaciones de células neuronales. Estos factores pueden, por ejemplo, conducir a la polarización dentro del tejido neural. Por ejemplo, se ha demostrado que el producto del gen Sonic hedgehog induce un fenotipo ventral en el tejido neural (Ericson et al., Cell 81:747-756, 1995). Es previsible que estos factores también influyan sobre la diferenciación de las células neurales generadas artificialmente a partir de células ME. Para el experto en la materia, resulta evidente que la aplicación de estos factores permite la generación de neuronas y células gliales con fenotipos específicos. Por ejemplo, la inducción de un fenotipo mesencefálico ventral puede dar lugar a células adecuadas para el trasplante en pacientes de Parkinson. En fragmentos cultivados de tejido neural, ya se ha demostrado que el producto del gen Sonic hedgehog puede inducir las neuronas mesencefálicas ventrales dopaminérgicas (Wang et al., Nature Med. 1:1184-1188, 1995).

Para generar células precursoras gliales a partir de esferoides neurales derivados de células ME, los esferoides se propagan en suspensión en medio libre de suero que contiene factor de crecimiento hasta que empiezan a adherirse a la superficie no recubierta de la placa de cultivo celular. Durante esta etapa, puede utilizarse bFGF y EGF, (individualmente o en combinación), como factores de crecimiento. Tras la adhesión de los esferoides, las células con morfología glial migran de los esferoides y sobre la superficie de la placa de cultivo celular (es decir, son "células touch-down"). El desarrollo preciso de esta población celular no se entiende por completo. Presumiblemente la creciente diferenciación celular dentro de los esferoides conduce a la formación de precursores gliales que muestran adhesión y comportamiento de migración incrementados. Los esferoides que producen células touch-down pueden utilizarse para generar precursores gliales. Con el fin de conseguir lo anterior, los esferoides que producen precursores gliales se cultivan únicamente durante periodos cortos de tiempo (por ejemplo < 1 día) en placas de cultivo celular no recubiertas. Tras la adhesión de las células gliales, los esferoides se desenganchan mecánicamente de la placa y se transfieren a una segunda placa de cultivo. Ello produce monocapas con forma de anillo de los precursores gliales, que pueden proliferarse adicionalmente en presencia de factores de crecimiento, incluyendo por ejemplo bFGF y EGF, que pueden aplicarse individualmente o en combinación.

Las "células touch-down" producidas de esta manera expresan el antígeno neural A2B5 (Eisenbarth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4913-4917, 1979) y, tras la retirada del factor de crecimiento, se diferencian para formar astrocitos y oligodendrocitos. Mediante la utilización de procedimientos inmunohistoquímicos, pueden detectarse antígenos marcadores de oligodendrocitos (por ejemplo O4) y astrocitos (por ejemplo GFAP) en estas células diferenciadas. Las células touch-down no diferenciadas pueden congelarse en nitrógeno líquido en medio de congelación libre de suero sin perder su potencial de proliferación y de diferenciación. Las células precursoras gliales generadas de esta manera también resultan adecuadas para el transplante en el sistema nervioso.

Puede influirse sobre la diferenciación de los precursores gliales derivados de células ME mediante la adición de factores individuales. Por ejemplo, la adición de CNTF (factor neurotrófico ciliar) poco antes y durante la retirada del factor de crecimiento, promueve la diferenciación astrocítica. La adición de la hormona tiroidea T3 durante esta etapa resulta en la diferenciación incrementada de oligodendrocitos. La adición de medio que contiene suero durante o después del tratamiento con factor de crecimiento resulta en un incremento significativo del número de células astrocíticas en estos cultivos.

Para el experto en la materia, resulta evidente que las células precursoras neurales congeladas pueden, tras la descongelación, utilizarse también para el trasplante. Las células congeladas en etapas anteriores del proceso de diferenciación in vitro pueden descongelarse de una manera estándar y propagarse adicionalmente hasta obtener una población homogénea de células bipolares y multipolares.

Los procedimientos descritos en la presente memoria pueden combinarse además con técnicas conocidas de separación celular y de clasificación celular. Por ejemplo, las subpoblaciones neurales pueden separarse en puntos definidos del tiempo utilizando la separación celular activada por fluorescencia (FACS), el inmunopanning u otros procedimientos relacionados. Una separación detallada y la subclasificación pueden permitir la generación de células de sustitución (incluyendo las células de sustitución genéticamente modificadas) que pueden adaptarse específicamente a las necesidad de los pacientes individuales. Debido a que tanto las células ME como las células precursoras neurales derivadas de células ME indicadas en la presente memoria pueden congelarse y descongelarse sin perder sus propiedades, resulta posible establecer bancos celulares individuales, incluyendo bancos celulares autólogos.

La metodología descrita en la presente memoria permite la generación de células precursoras neurales, por ejemplo células neuronales, astrocíticas y oligodendrogliales, en una pureza y cantidad deseadas según se requiera, por ejemplo que resulten útiles para la reparación de defectos del sistema nervioso. Las células generadas mediante la metodología dada a conocer contienen, por ejemplo, pocas o ninguna célula embrionaria primitiva o célula no neural. La pureza de las células precursoras neurales de la invención excede ampliamente la pureza de aproximadamente el 85%, indicada anteriormente por Okabe et al. (Mech. Dev. 59:89-102, 1996). La metodología tal como se describe en la presente memoria permite la generación de células precursoras neurales con una pureza de hasta el 100%. Además, la metodología dada a conocer permite la generación de un gran número de células precursoras neurales sin depender de la presencia de tejido cerebral. Estas células precursoras neurales pueden obtenerse a partir de células ME derivadas de diversas especies, por ejemplo del ratón, rata, hámster, aves, peces, cerdos, vacas, primates no humanos o seres humanos. Pueden utilizarse tanto las líneas de células ME establecidas como las células ME derivadas de embriones. Además, las células ME pueden derivarse oocitos proliferados. Los oocitos pueden enuclearse y después implantarse con un núcleo celular derivado de, por ejemplo, tejido diferenciado, permitiendo de esta manera la generación de oocitos autólogos y células ME. Las células ME y las células similares a ME también pueden obtenerse a partir de células germinales embrionarias. Las células ME pueden modificarse genéticamente utilizando procedimientos estándar. Por ejemplo, puede sustituirse un gen defectivo por su contrapartida de tipo salvaje "normal" utilizando recombinación homóloga. Además, los genes pueden eliminarse totalmente utilizando procedimientos conocidos. Estos procedimientos se han utilizado extensamente en ratones y, por lo tanto, se encuentran comprendidos en el estado de la
técnica.

El amplio potencial de migración de las células precursoras neuronales y gliales permite la repoblación de grandes áreas del sistema nervioso con células precursoras modificadas genéticamente que podrían sustituir factores faltantes, o secretar polipéptidos adecuados para actividades de neuroprotección u otras aplicaciones. Las células también pueden modificarse genéticamente para eliminar genes que codifican aquellos antígenos de superficie que podrían estar implicados en el rechazo del trasplante. Esta estrategia puede permitir una amplia aplicación clínica de las células precursoras derivadas de células ME sin la necesidad de técnicas de inmunosupresión adicionales.

Las células precursoras neurales indicadas en la presente memoria también pueden utilizarse como herramienta médica terapéutica para el tratamiento de defectos neurales. Un ejemplo típico para esta aplicación de las células precursoras neurales es la reconstitución de neuronas perdidas o funcionalmente alteradas mediante el trasplante de las células precursoras neurales.

Con el fin de sustituir las neuronas perdidas y también para mejorar los déficits neurológicos asociados con esta pérdida, los esferoides neurales indicados en la presente memoria pueden, por ejemplo, cultivarse durante 4 a 7 días en suspensión antes de implantarse en una región cerebral que muestre pérdidas neuronales. Seis semanas tras el trasplante, pueden observarse neuronas diferenciadas que inervan el cerebro del huésped. Los axones derivados del donante que se extienden hacia el interior del tejido cerebral del huésped pueden, por ejemplo, detectarse con anticuerpos contra antígenos neurales específicos del donante. La reconstitución neuronal también resulta en la mejora funcional. Esta mejora puede ilustrarse mediante pruebas de comportamiento en ratas lesionadas con ácido iboténico antes y después del trasplante. Específicamente, se destruyen grandes números de neuronas estriatales mediante la inyección estereotáxica de la neurotoxina ácido iboténico. El defecto resultante muestra similitudes con lesiones asociadas con la enfermedad de Huntington. Este modelo experimental, por lo tanto, se utiliza con frecuencia como modelo animal para esta enfermedad. Tras una lesión unilateral con ácido iboténico, los animales afectados muestran una asimetría funcional y un comportamiento de rotación anormal cuantificable que puede inducirse mediante determinados agentes farmacéuticos, por ejemplo la anfetamina. Un trasplante rico en células neuronales puede actuar normalizando el comportamiento de rotación. Esta normalización aparentemente depende particularmente del número de neuronas GABAérgicas que contiene el trasplante celular. El modelo de lesión con ácido iboténico y la evaluación funcional de los trasplantes neurales a través del análisis del comportamiento de rotación se han descrito extensamente (Björklund et al., en: Functional Neural Transplantation, páginas 157-195, Raven Press, New York, 1994). El trasplante de esferoides neurales descrito en la presente memoria en el cerebro de ratas lesionadas con ácido iboténico resulta en una mejora postoperatoria significativa del comportamiento anormal de rotación inducido por la lesión con ácido iboténico. Los trasplantes de, por ejemplo, células neurales en el sistema nervioso humano ya se están llevando a cabo en pacientes (Olanow et al., TINS 19:102-109, 1996).

Las células precursoras gliales que se dan a conocer en la presente memoria, obtenidas a partir de esferoides neurales o a partir de cultivos en monocapa, resultan adecuadas para el tratamiento de defectos neurales. Un ejemplo típico para esta aplicación de estas células precursoras gliales es la remielinización de las regiones cerebrales desmielinizadas que se consigue mediante el trasplante celular. Debido a que las células precursoras gliales muestran un pronunciado potencial migratorio, pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes que abarcan áreas sustanciales del SNC. En este caso, una inyección localizada de las células puede resultar suficiente para repoblar y para remielinizar dichas áreas afectadas del SNC. Un ejemplo típico de una enfermedad que puede tratarse de esta manera es la esclerosis múltiple (EM), una enfermedad de origen desconocido que se asocia típicamente con múltiples focos de desmielinización en diferentes regiones del SNC. El trasplante de los precursores neurales de la invención puede resultar útil para remielinizar estos defectos, es decir, el pronunciado potencial de migración de las células precursoras neurales puede explotarse con facilidad a partir de un solo sitio de implantación o de una pluralidad de ellos con el fin de reconocer y reparar numerosas áreas afectadas por la desmielinización.

Con el fin de mielinizar cualquier región cerebral deficiente en mielina, las células derivadas de cultivos en monocapa (capas de células) o de esferoides neurales derivados de células ME pueden propagarse en medio que contiene factor de crecimiento, recolectarse mecánicamente y triturarse hasta formar una suspensión de células individuales. El trasplante de estas suspensiones celulares en regiones cerebrales deficientes en mielina típicamente proporciona astrocitos y oligodendrocitos derivados del donante que resultan fácilmente detectables transcurridas aproximadamente tres semanas desde el trasplante. Las células trasplantadas típicamente envuelven los axones del huésped con una cubierta de vaina de mielina. Mediante la utilización de procedimientos inmunohistoquímicos, pueden detectarse con facilidad proteínas mielínicas, tales como la proteína básica de la mielina (MBP) y la proteína proteolipídica (PLP) en estas nuevas vainas de mielina.

Los precursores neurales derivados de células ME descritos en la presente memoria también pueden utilizarse para la generación in vitro de polipéptidos para numerosas aplicaciones clínicas y comerciales.

Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar la presente invención y no se deben entender a título limitativo.

Ejemplo 1 1.1. Proliferación de células ME

Las células ME (línea J1, Li et al., Cell 69:915-926, 1992) se proliferan sobre una capa de fibroblastos embrionarios no mitóticos de ratón en medio DMEM (Life Technologies nº 11965) que contiene suero de feto bovino al 20% (FBS, Life Technologies nº 10119) y 1.000 U/ml de LIF (Life Technologies nº 13275) de acuerdo con procedimientos estándar (Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, New York, 1994). Además de FBS y de LIF, este medio contiene concentraciones estándar de aminoácidos no esenciales (Life Technologies nº 11140; Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996), adenosina (Sigma nº A-4036), guanosina (Sigma nº G-6264), citidina (Sigma nº C-4654), uridina (Sigma nº U-3003), timidina (Sigma nº T-1895), además de 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Sigma nº M-7522), L-glutamina 10 mM (Sigma nº G-5763) y HEPES 25 mM (Sigma nº H-0763). Durante esta etapa y todas las etapas posteriores, las células se cultiva en un incubador humidificado (es decir, humedad >85%) a 37ºC en 5% de CO_{2}.

1.2.- Extracción de las células de soporte

Tras alcanzar las células ME la subconfluencia, se lavan una vez con EDTA al 0,04% en PBS y después se recolectan mediante la adición de tripsina al 0,05% (Life Technologies nº 35400) y EDTA al 0,04% en PBS. Las células se trituran varias veces a través de una pipeta Pasteur con el fin de obtener una suspensión de células individuales. A continuación, la tripsina se neutraliza mediante la adición de una cantidad igual del medio que contiene suero utilizado para la proliferación de las células ME. Tras la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a TA, las células se siembran en placa sobre placas de cultivo celular recubiertas con gelatina al 0,2% (Sigma nº G-2500) a una densidad de aproximadamente 6 x 10^{6} células/placa de 6 cm y se cultivan adicionalmente bajo la presencia de LF (100 U/ml).

1.3.- Generación de cuerpos embrioides

Tras alcanzar las células la subconfluencia (es decir, tras aproximadamente 2 a 3 días), se desenganchan de la gelatina mediante la adición de tripsina al 0,05% y EDTA al 0,04% en PBS (aproximadamente, 1,5 ml por placa de 6 cm). Tras la separación, la tripsina se neutraliza mediante la adición de FBS al 10% en DMEM (aproximadamente 6,5 ml por placa de 6 cm; este medio es equivalente al medio utilizado en la etapa 1.2 pero contiene únicamente 10% de FBS y nada de LIF). La suspensión celular seguidamente se siembra en placa, por ejemplo, sobre 8 placas de Petri no recubiertas (Nunc nº 240045) y se propagan adicionalmente en DMEM/FBS al 10% (por ejemplo 4 ml por placa de 6 cm).

1.4.- Siembra en placa de cuerpos embrioides

Tras 3 a 4 días, los cuerpos embrioides se transfieren a un tubo de 50 ml y se recogen por sedimentación (1 x g; 5 minutos). Se descarta el sobrenadante y los cuerpos embrioides se siembran en placas de cultivo celular de 10 cm. Los cuerpos embrioides en placa idealmente deberían cubrir aproximadamente el 50% de la superficie de la placa de cultivo celular. Típicamente, los cuerpos embrioides recogidos de 4 a 6 placas de Petri resultarán suficientes para sembrarse en una placa de 10 cm. Los cuerpos embrioides se cultivan durante la noche en DMEM/FBS al 10% (10 ml por placa de 10 cm).

1.5.- Transferencia al medio ITSFn

Un día después de la siembra en placa (tal como se ha descrito anteriormente), los cuerpos embrioides que se encuentran enganchados a la placa de cultivo celular se lavan 3 veces en DMEM/F12 (medio de Eagle modificado por Dulbecco/mezcla nutriente F12 (1:1); Life Technologies nº 11320). A continuación, se añaden 10 ml de medio ITSFn a cada placa de 10 cm. Este medio contiene DMEM/F12, 5 \mug/ml de insulina (Intergen nº 540101), 50 \mug/ml de apotransferrina (Intergen nº 445275) cloruro de selenio 30 nM (Sigma nº S-5261), 5 \mug/ml de fibronectina (Life Technologies nº 33010) y penicilina/estreptomicina (100 IU/ml/100 \mug/ml; Life Technologies nº 15140). Las células se propagan en este medio durante 4 a 7 días; el medio se sustituye cada dos días. Durante este tiempo, puede observarse la muerte celular masiva entre las células no neurales. Además, aparecen células precursoras neurales y forma agrupaciones celulares de tamaño reducido. Este procedimiento para establecer los cultivos en ITSFn se ha descrito con anterioridad (Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996).

1.6.- Transferencia a medio N3FL

Los cultivos celulares en medio ITSFn se recolectan con tripsina al 0,05% y EDTA al 0,04% en PBS. La tripsina se neutraliza mediante la adición de una cantidad equivalente de medio que contiene suero (DMEM/FBS al 10%). Tras la centrifugación (300 x g; 5 minutos, TA), las células se resuspenden en solución salina tamponada de Hank libre de calcio y de magnesio (CMF-HBSS, Life Technologies nº 14180) que contiene ADNasa al 0,1% (Worthington nº 2139). Puede resuspenderse en un volumen total de 3 ml un pellet celular obtenido de una placa de 10 cm. A continuación, las células se trituran hasta formar una suspensión de células individuales utilizando pipetas Pasteur pasadas por una llama de tamaño de poro decreciente (por ejemplo, 0,8 mm, 0,5 mm y 0,2 mm). Las agrupaciones celulares restantes se recogieron mediante sedimentación (1 x g, 5 minutos) y se descartaron. Tras la centrifugación (300 x g, 5 minutos, TA), las células se sembraron en placas a una densidad de aproximadamente 30.000 células/cm^{2} sobre placas de cultivo celular recubiertas de poliornitina con DMEM/F12 (1:1; Life Technologies nº 11320), 25 \mug/ml de insulina, 50 \mug/ml de apotransferrina humana, progesterona 20 nM (Sigma nº P-8783), putrescina 100 \muM (Sigma nº P-5780), cloruro de selenio 30 nM, laminina 1 \mug/ml (Life Technologies nº 23017), penicilina/estreptomicina (100 IU/ml/100 \mug/ml) y 10 ng/ml de bFGF recombinante humano (R&D Systems nº 233-FB). Este medio es equivalente al medio N3FL descrito por Okabe et al. (Okabe et al., Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Con el fin de conseguir el recubrimiento de poliornitina, se rellenaron placas de cultivo celular con 15 \mug/ml de poliornitina (Sigma nº P-3655) en H_{2}O durante por lo menos 2 horas. A continuación, se extrajo la solución de poliornitina y las placas se lavaron 3 veces con PBS. Durante el cultivo en medio N3FL, se añadió diariamente bFGF hasta una concentración final de 10 ng/ml. El medio N3FL se sustituyó cada dos días.

Ejemplo 2 Generación de células precursoras neurales 2.1.- Transferencia a medio N3EFL

Tras 4 a 5 días en medio N3FL, las células se recolectaron mecánicamente utilizando un raspador celular (Costar nº 3008). Tras el raspado, las células se lavaron 3 veces con CMF-HBSS conteniendo el último lavado ADNasa al 0,1%. Se trituraron hasta formar una suspensión de células individuales con pipetas Pasteur pasadas por una llama, tal como se ha indicado en la sección 1.6 anteriormente. Tras la centrifugación (300 x g, 5 minutos, TA), las células recolectadas de una placa de 10 cm se sembraron en aproximadamente 5 placas de 10 cm recubiertas con poliornitina con medio N3EFL. Este medio contiene DMEM/F12 (1:1), 25 \mug/ml de insulina, 100 \mug/ml de transferrina, progresterona 20 nM, putrescina 100 \muM, cloruro de selenio 30 nM, laminina 1 \mug/ml, penicilina/estreptomicina (100 IU/ml/100 \mug/ml), 10 ng/ml de bFGF recombinante humano y 20 ng/ml de EGF recombinante humano (R&D Systems nº 236-EG). Se añadieron diariamente bFGF y EGF hasta una concentración final de 10 ng/ml y 20 ng/ml, respectivamente. La adición de laminina opcionalmente puede omitirse tras el segundo cambio de medio.

2.2.- Transferencia a medio N2FP

Tras alcanzar las células una confluencia del 90% (por ejemplo tras 1 a 2 semanas), se recolectan utilizando un raspador de células en ausencia de tripsina y después se trituran hasta formar una suspensión de células individuales utilizando pipetas Pasteur pasadas por una llama. Tras la centrifugación (300 x g, 5 minutos, TA), las células se recolectan de una placa de 10 cm y se siembran en aproximadamente 5 placas de 10 cm recubiertas de poliornitina con medio N2FP. Este medio contiene DMEM/F12 (1:1), 25 \mug/ml de insulina, 100 \mug/ml de transferrina, progesterona 20 nM, putrescina 100 \muM, cloruro de selenio 30 nM, penicilina/estreptomicina (100 IU/ml/100 \mug/ml), 10 ng/ml de bFGF recombinante humano y 10 ng/ml de PDGF-AA recombinante humano (R&D Systems nº 221-AA). Se añadieron diariamente bFGF y PDGF-AA y el medio se sustituyó cada dos días.

2.3.- Subcultivo de las células en medio N2FP

Tras alcanzar las células la subconfluencia, se recolectaron utilizando un raspador de células sin utilizar tripsina y se subcultivaron a una proporción de 1:5. Típicamente no resulta necesaria una etapa adicional de trituración para obtener una suspensión de células individuales. Tras por lo menos 2 subcultivos en medio que contiene bFGF y PDGF, las células representan una población de precursores que pueden utilizarse para trasplantes remielinizantes. Alternativamente, las células pueden recolectarse con un raspador de células en ausencia de tripsina y conservarse criogénicamente en medio de congelación libre de suero (Sigma nº C-6295) para su utilización en el futuro. Los precursores neurales purificados también pueden aislarse y transferirse a un medio adecuado para su inyección, por ejemplo CMF-HBSS (Life Technologies nº 14180).

2.4.- Diferenciación in vitro de células precursoras neurales

Para conseguir la diferenciación in vitro, se recolectan las células precursoras neurales utilizando un raspador de células en ausencia de tripsina y se siembran en placas de cultivo celular recubiertas con poliornitina con el fin de conseguir una confluencia de aproximadamente el 50%. Las células se propagan durante 4 a 7 días adicionales en el medio indicado anteriormente (ver la sección 2.2), aunque sin la adición de bFGF y de PDGF. El medio se sustituye cada dos días. A continuación, los cultivos se fijan en paraformaldehído al 4% (Sigma nº P-6148) en PBS y se someten a análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra el antígeno oligodendroglial O4 (Boehringer nº 1518925, dilución 1:10) y el antígeno astrocítico GFAP (Chemicon, nº AB1980, dilución 1:100). Mediante la utilización de esta técnica, los presentes inventores observaron que hasta el 32% de las células mostraban una morfología oligodendroglial típica con expresión de O4 tras cuatro días de retirada de factor de crecimiento. Además, hasta el 49% de las células expresaban GFAP. Además, estos cultivos contenían células que eran inmunorreactivas frente a un anticuerpo contra el antígeno neuronal beta-III-tubulina (BabCO, nº MMS-435P-250, dilución 1:500).

Ejemplo 3 Generación de esferoides neurales y precursores neurales de los mismos 3.1.- Generación de esferoides neurales en medio N2EF

Tras 4 a 5 días en medio N3FL (ver la sección 1.6 anteriormente), las células se recolectaron mecánicamente utilizando un raspador de células (Costar nº 3008). Antes del raspado, las células se lavaron 3 veces con CMF-HBSS conteniendo el último lavado ADNasa al 0,1%. A continuación, se trituraron hasta formar una suspensión de células individuales con una pipeta Pasteur pasada por una llama, tal como se ha descrito en la sección 1.6 anteriormente. Tras la centrifugación (300 x g, 5 minutos, TA), las células se sembraron en placas de cultivo celular no recubiertas, a una densidad de entre 1.200 y 12.000 células/cm^{2} en medio N2EF. Este medio contiene DMEM/F12 (1:1), 25 \mug/ml de insulina, 100 \mug/ml de transferrina, progesterona 20 nM, putrescina 100 \muN, cloruro de selenio 30 nM, penicilina/estreptomicina (100 IU/ml/100 \mug/ml), 20 ng/ml de bFGF recombinante humano y 20 ng/ml de EGF recombinante humano (R&D Systems nº 236-EG). Se añadieron bFGF y EGF diariamente hasta una concentración final de 20 ng/ml cada uno, y el medio se sustituyó cada dos días. Con el fin de evitar cualquier pérdida de los esferoides flotantes durante los cambios de medio, las células se sedimentaron a 150 x g durante 3 minutos a TA. Seguidamente, el pellet se resuspendió en medio fresco y se sembró nuevamente en nuevas placas de cultivo celular no recubiertas.

3.2.- Diferenciación in vitro de esferoides neurales derivados de células ME

Para conseguir la diferenciación in vitro, pueden sedimentarse esferoides neurales de cinco días de edad derivadas de células ME a 150 x g durante 3 minutos a TA, sembrarse en placas de cultivo celular recubiertas con poliornitina y con fibronectina, y después cultivarse en el medio indicado en la sección 3.1, aunque sin la adición de bFGF y de EGF. El doble recubrimiento con poliornitina y con fibronectina se lleva a cabo recubriendo en primer lugar las placas con poliornitina tal como se ha indicado en la sección 1.6 anteriormente. A continuación, las placas se lavan 3 veces con PBS y se incuban adicionalmente durante 2 a 12 horas con PBS que contiene 1 \mug/ml de fibronectina. Los esferoides pueden sembrarse en placas inmediatamente después de la extracción de la solución de fibronectina. Un día después de la siembra, los esferoides neurales típicamente se han enganchado a la placa de cultivo celular. Tras la extracción del sobrenadante, los esferoides enganchados se lavan 3 veces con medio fresco o con CMF-HBSS. El medio se añade a los cultivos y posteriormente se sustituye cada dos días.

Un análisis de inmunofluorescencia llevado a cabo sobre esferoides neurales fijados cinco días después de la siembra en placa proporcionó el perfil de expresión siguiente de los antígenos neurales (porcentaje medio de células marcadas \pm SEM): células precursoras neurales positivas para nestina: 66 \pm 3% (anticuerpo obtenido de M. Marvin y R.D.G. McKay, NIH, Bethesda, USA, dilución 1:1.000); neuronas positivas para beta-III-tubulina: 34 \pm 3% (anticuerpo obtenido de BabCO, nº MMS-435P-250, dilución 1:500); astrocitos positivos para GFAP: 30 \pm 2% (anticuerpo obtenido de Chemicon, nº AB1980, dilución 1:100); células positivas para O4 con morfología oligodendroglial: 6,2 \pm 1,7% (anticuerpo obtenido de Boehringer, nº 1518925, dilución 1:10).

Además, las neuronas generadas a partir de esferoides neurales diferenciados durante 5 días derivados de células ME expresaban la proteína 2 asociada a los microtúbulos (MAP-2, anticuerpos obtenidos de Sigma, nº M 4403 y nº M 1406, dilución 1:200) además de los neurotransmisores GABA (anticuerpo obtenido de Sigma, nº A-2052, dilución 1:700) y glutamato (anticuerpo obtenido de Sigma, nº G-6642, dilución 1:700). En algunas de las preparaciones, hasta el 60% de las neuronas mostraba un fenotipo GABAérgico. Los análisis de inmunofluorescencia de esferoides neurales derivados de células ME diferenciados en ausencia de factores de crecimiento durante más de 10 días también revelaron neuronas que expresaban tirosina hidroxilasa (anticuerpo obtenido de Eugene, nº TE101, dilución 1:200), colina acetiltransferasa (anticuerpo obtenido de Chemicon, nº MAB305, dilución 1:250), serotonina (anticuerpo obtenido de Eugene, nº NT102, dilución 1:200), sinapsina (anticuerpo obtenido del Dr. M.B. Kennedy, Pasadena, CA, USA, dilución 1:1.000), periferina (anticuerpo obtenido de Chemicon, nº AB1530, dilución 1:1.000) y calbindina (anticuerpo obtenido de Sigma, nº C-8666, dilución 1:100). La diferenciación y supervivencia de las neuronas derivadas de esferoides podía estimularse mediante la adición de las neurotrofinas factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF; 20 ng/ml, Pepro Tech Inc., nº 450-02) y/o neurotrofina 3 (NT-3; Pepro Tech. Inc., nº 450-03). Los esferoides neurales derivados de células ME diferenciadas durante más de 10 días también contenían oligodendrocitos que se diferenciaban y que eran inmunorreactivos con un anticuerpo contra el nucleótido cíclico 3'-fosfodiesterasa (CNPasa; anticuerpo obtenido de Sigma, nº C-5922, dilución 1:200).

3.3.- Generación de precursores gliales a partir de esferoides neurales derivados de células ME ("cultivos touch-down")

Para generar células precursoras gliales, se mantuvieron esferoides propagados en medio que contenía factor de crecimiento, tal como se describe en la sección 3.1 anteriormente, hasta que empezaron a adherirse a la superficie no recubierta de las placas de cultivo de tejidos. Esta adherencia habitualmente se produce entre los días 10 y 14 del cultivo de los esferoides. Inmediatamente tras detectar la arborización en forma de anillo alrededor de los esferoides individuales, éstos se desengancharon de la placa de cultivo celular mediante agitación suave y después se extrajeron de los cultivos utilizando una pipeta. Estos esferoides desenganchados seguidamente pueden sembrarse en nuevas placas de cultivo celular no recubiertas con el fin de generar colonias adicionales en forma de anillo de células precursoras gliales. Las colonias de células precursoras gliales obtenidas de esta manera se proliferan adicionalmente en el mismo medio que contiene factor de crecimiento. Al alcanzar el 80% de confluencia, las células se recolectaron con un raspador de células sin utilizar tripsina y se sembraron en placa nuevamente a una proporción de 1:5. Un análisis de inmunofluorescencia reveló que las células precursoras gliales generadas de esta manera mostraban una expresión fuerte del antígeno neural A2B5 (anticuerpo obtenido de Boehringer, nº 1300016, dilución 1:200). Las células pueden congelarse en nitrógeno líquido en medio de congelación libre de suero (Sigma nº C-6295) y someterse a proliferación, trasplante o diferenciación adicionales en el futuro.

3.4.- Diferenciación dirigida de precursores gliales derivados de células ME

La diferenciación dirigida de precursores gliales derivados de células ME por factores individuales se verificó mediante el experimento siguiente.

Se recolectaron mecánicamente precursores gliales que proliferaban en presencia de bFGF (20 ng/ml) y de EGF (20 ng/ml) tal como se ha descrito en la sección 3.3, se subcultivaron en placas de cultivo celular recubiertas con poliornitina y se propagaron hasta que las células alcanzaron aproximadamente el 50% de confluencia. A continuación, las células se propagaron durante dos días más y se agruparon bajo las condiciones siguientes:

1. Continuación del cultivo en presencia de EGF y de bFGF

2. Continuación del cultivo en presencia de EGF y de bFGF

3. continuación del cultivo en presencia de EGF y de bFGF con un suplemento diario de CNTF (Regeneron Inc., concentración final: 10 ng/ml)

4. continuación del cultivo en presencia de EGF y de bFGF con un suplemento diario de T3 (Sigma nº T 6397; concentración final: 3 ng/ml).

Tras 2 días, se extrajeron bFGF y EGF de los grupos 2, 3 y 4, y las células se propagaron adicionalmente durante 5 a 7 días con cambios de medio cada dos días. Todos los cultivos se fijaron en paraformaldehído al 4% (Sigma, nº P-6148) en PBS y se sometieron a un análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos dirigidos contra el marcador antigénico O4 oligodendroglial y el antígeno astrocítico GFAP. Se obtuvieron los perfiles de expresión siguientes para los grupos individuales (medias \pm SEM):

\vskip1.000000\baselineskip

\bullet	células positivas para O4 con morfología oligodendroglial:	< 1%
	células positivas para GFAP:	< 1%
	células positivas para O4 con morfología oligodendroglial:	8,2 \pm 2,6%

\bullet	células positivas para GFAP:	28 \pm 6%
	células positivas para O4 con morfología oligodendroglial:	2,6 \pm 1,8%

\bullet	células positivas para GFAP:	78 \pm 2,5%
	células positivas para O4 con morfología oligodendroglial:	17 \pm 3,6%

\bullet	células positivas para GFAP:	39 \pm 5,7%

\vskip1.000000\baselineskip

Estos datos indican que CNTF y T3 pueden utilizarse con éxito para guiar la diferenciación de los precursores gliales derivados de células ME hacia los linajes astrocítico y oligodendroglial, respectivamente.

Ejemplo 4 Trasplante de precursores oligodendrogliales/astrocíticos 4.1.- Generación de una suspensión celular para el trasplante

El potencial de mielinización de los precursores gliales derivados de células ME se verificó mediante el experimento siguiente:

los cultivos subconfluentes obtenidos tal como se ha descrito en la sección 2.3 anteriormente se recolectaron utilizando un raspador de células en ausencia de tripsina, se sedimentaron mediante centrifugación a 300 x g durante 5 minutos y se resuspendieron en CMF-HBSS que contenía ADNasa al 0,1%. Las células se trituraron hasta formar una suspensión de células individuales utilizando pipetas Pasteur pasadas por una llama, se contaron en un hemocitómetro, se sedimentaron nuevamente mediante centrifugación y se resuspendieron a una concentración de aproximadamente 50.000 a 100.000 células/\mul en CMF-HBSS que contenía 2 g/l de glucosa (Sigma, nº G-7021). Esta suspensión celular se mantuvo en hielo hasta completar el experimento de trasplante (es decir, 4 a 6 horas).

4.2.- Trasplante intraventricular en el cerebro embrionario de rata

Se utilizaron ratas deficientes en mielina (Ian Duncan, Department of Medical Sciences, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin-Madison, 2015 Linden Drive West, Madison, Wisconsin 53706, USA) como receptores de trasplante. Una ventaja clave del trasplante embrionario es que los xenotrasplantes pueden llevarse a cabo sin provocar rechazo del trasplante. Los animales receptores deficientes en mielina ofrecen la ventaja de que puede detectarse con facilidad la mielina derivada del donante. Una ventaja de este paradigma de xenoinjerto es que las células trasplantadas pueden identificarse fácilmente y con fiabilidad utilizando sondas de ADN específicas de especie (Brüstle et al., Neuron 15:1275-1285, 1995). El procedimiento de trasplante intrauterino en el cerebro embrionario está bien establecido (Brüstle et al., Neuron 15:1275-1285, 1995; Brüstle et al., en: Current Protocols in Neuroscience, John Wiley, New York, 1997).

Para el trasplante, se anestesiaron ratas preñadas mediante inyección intraperitoneal de cetamina (80 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) en el día 16 ó 17 de gestación. Tras la laparotomía, se identificaron embriones individuales bajo transiluminación utilizando una fuente de luz de fibra óptica. Las células donantes se cargaron en un capilar de vidrio de tamaño reducido (tamaño de poro: 50 a 100 \mum) y se introdujo el capilar a través de la pared uterina y el cráneo embrionario, específicamente en el ventrículo lateral del embrión receptor tal como se encuentra descrito (Brüstle et al., Current Protocols in Neuroscience, John Wiley, New York, 1997). Se inyectaron dos a nueve \mul de la suspensión celular (que contenía 100.000 a 900.000 células) en el sistema ventricular. Tras el trasplante en varios embriones o en todos ellos, se cerró el abdomen con sutura quirúrgica, continuando después la madre con la gestación, y los cachorros se extrajeron tras un parto vaginal espontáneo. Debido a que la deficiencia en mielina de acuerdo con este modelo animal es un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, se ven afectados aproximadamente el 50% de los cachorros macho. Los animales afectados desarrollan un fuerte temblor llegada la tercera semana de edad y habitualmente mueren en su cuarta semana postnatal.

4.3.- Análisis histológico de los receptores de trasplante

Con el fin de detectar la formación de mielina derivada de donante, se anestesiaron animales receptores en la tercera o cuarta semana postnatal y se perfundieron transcardíacamente con paraformaldehído al 4% (Sigma, nº P-6148) en PBS de acuerdo con procedimientos estándar. Se separó el tejido cerebral del cráneo, se fijó durante la noche a 4ºC en el mismo fijador y seguidamente se cortó en secciones de 50 \mum utilizando un vibratomo. Las células donantes se detectaron mediante hibridación in situ de ADN con una sonda que hibrida con el ADN satélite de ratón (Hörz & Altenburger, Nucl. Acids Res. 9:683-696, 1981; Brüstle et al., Neuron 15:1275-1285, 1995). La mielina derivada de células donantes se visualizó con anticuerpos contra proteínas de mielina, tales como la proteína básica de mielina (MBP; Boehringer nº 1118099) o proteína proteolipídica (PLP; cortesía de Ian Griffiths, Department of Veterinary Clinical Studies, University of Glasgow, Bearsden, Escocia). Las secciones marcadas con anticuerpos contra proteínas de la mielina seguidamente se sometieron a hibridación in situ de ADN utilizando una sonda que hibridaba con ADN satélite de ratón (Brüstle et al., Neuron 15:1275-1285, 1995). Este procedimiento de doble marcaje permite la identificación inequívoca de mielina derivada de células del donante. Estos experimentos demuestran que las células donantes implantadas en el ventrículo migran hacia una gran diversidad de regiones cerebrales telencefálicas, diencefálicas y mesencefálicas (14 animales receptores analizados). Las células hibridadas se encontraron en, por ejemplo, córtex, hipocampo, septo, striatum, bulbo olfativo, tálamo, hipotálamo, tectum, cerebelo, así como en el cuerpo calloso, comisura anterior, tracto óptico y en el nervio óptico. No se observaron agrupaciones ocupantes de espacio de células donantes tras el trasplante en el sistema ventricular. De los 35 embriones trasplantados, 11 cachorros macho mostraban síntomas de deficiencia de mielina. Ochos de estos habían recibido trasplantes intraventriculares con éxito. En seis de estos ocho animales, se verifió la formación de mielina derivada del donante mediante doble marcaje de células hibridadas utilizando anticuerpos contra MBP o contra PLP. En los 2 animales restantes, el número de células incorporadas era excesivamente reducido para una evaluación fiable de la formación de mielina derivada del donante con los procedimientos de doble marcaje. Sin embargo, el cribado inmunohistoquímico de secciones de estos animales con el anticuerpo M2 específico de ratón (Zhou et al., J. Comp. Neurol 292:320-330, 1990) también demostró la incorporación de células gliales derivadas del donante en el tejido huésped. La formación de mielina derivada del donante era más pronunciada en los tractos de fibras, tales como el cuerpo calloso, la comisura anterior y las fibras comisurales en el tectum. Además, las células donantes mielinizantes se detectaron en regiones de materia gris, tales como el córtex, septum, tálamo, hipotálamo y tectum. Siete de ocho animales trasplantados con éxito también demostraron la incorporación de astrocitos derivados de células ME. Los astrocitos derivados del donante se detectaron mediante inmunohistoquímica con anticuerpos contra los antígenos M2 específicos de ratón (Zhou et al., J. Comp. Neurol. 292:320-330, 1990) y los antígenos M6 (Lund et al., Neurosci. Lett. 61:221-226, 1985) o mediante doble marcaje de células hibridadas con una sonda de ADN específica de ratón utilizando un anticuerpo dirigido contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP; ICN, nº 69-110).

Ejemplo 5 Trasplante de esferoides neurales derivados de células ME 5.1.- Trasplante de esferoides neurales derivados de células ME en ratas lesionadas con ácido iboténico

Con el fin de evaluar el potencial de los precursores derivados de células ME dados a conocer en la presente memoria para la reconstitución anatómica y funcional de células neuronales, se generaron esferoides neurales de 5 días de edad a partir de la línea J1 de células ME, tal como se describe en la sección 3.1 anteriormente. Estos esferoides se implantaron en el striatum de ratas Sprague-Dawley adultas que se habían sometido previamente a una inyección estereotáxica de la neurotoxina ácido iboténico con el fin de inducir una degeneración neuronal unilateral en el striatum. Este modelo de lesión se encuentra bien caracterizado, y el protocolo de lesión utilizado para estos experimentos se ha publicado anteriormente (Brüstle et al., en: Current Protocols in Neuroscience, unidad 3.10, John Wiley, New York, 1997). Para el trasplante, se extrajeron los esferoides flotantes de la placa de cultivo celular y se transfirieron a una probeta de 50 ml. Tras la adición de ADNasa hasta una concentración final del 0,1%, los esferoides se sedimentaron a 150 x g durante 5 minutos a TA y seguidamente se transfirieron a una probeta de 0,5 ml que contenía 2 g/l de glucosa (Sigma, nº G-7021) en CMF-HBSS. Los esferoides suspendidos de esta manera se mantuvieron sobre hielo hasta completar el experimento de trasplante (hasta 4 horas). Los animales receptores se anestesiaron y los esferoides se inyectaron estereotáxicamente en el striatum. Se utilizó un capilar de vidrio con un tamaño de poro de entre 0,25 mm y 0,75 mm para llevar a cabo la inyección. Este protocolo de trasplante se encuentra bien caracterizado y ha sido publicado en detalle (Brüstle et al., en: Current Protocols in Neuroscience, unidad 3.10, John Wiley, New York, 1997). Se utilizó un total de 6 animales receptores para este experimento. Los esferoides que se habían acumulado en el fondo de la probeta se cargaron en el capilar de vidrio. Utilizando un marco estereotáxico (Stoelting, nº 51600), seguidamente se inyectaron las células en el striatum. Se administraron los esferoides en 2 (n=3) a 5 (n=3) sitios diferentes dentro del striatum lesionado. Se utilizaron las coordenadas estereotáxicas siguientes para llevar a cabo la inyección:

\vskip1.000000\baselineskip

Para 2 sitios de implantación:

Sitio 1:	soporte para los dientes	-2,3 mm
	orientación anteroposterior:	+0,2 mm (respecto a bregma)
	orientación mediolateral:	3,0 mm (respecto a la sutura sagital)
	profundidad de la inyección:	5,5 mm (respecto a la dura)

Sitio 2:	soporte para los dientes:	-2,3 mm
	orientación anteroposterior:	+0,2 mm (respecto a bregma)
	orientación mediolateral:	3,0 mm (respecto a la sutura sagital)
	profundidad de la inyección:	4,0 mm (respecto a la dura)

Para 5 sitios de implantación:

Sitio 1:	soporte para los dientes:	-2,3 mm
	orientación anteroposterior:	+0,2 mm (respecto a bregma)
	orientación mediolateral:	3,0 mm (respecto a la sutura sagital)
	profundidad de la inyección:	6,5 mm (respecto a la dura)

Sitio 2:	soporte para los dientes:	-2,3 mm
	orientación anteroposterior:	+0,2 mm (respecto a bregma)
	orientación mediolateral:	3,0 mm (respecto a la sutura sagital)
	profundidad de la inyección:	5,3 mm (respecto a la dura)

Sitio 3:	soporte para los dientes:	-2,3 mm
	orientación anteroposterior:	+0,2 mm (respecto a bregma)
	orientación mediolateral:	3,0 mm (respecto a la sutura sagital)
	profundidad de la inyección:	4,0 mm (respecto a la dura)

Sitio 4:	soporte para los dientes:	-2,3 mm
	orientación anteroposterior:	+1,5 mm (respecto a bregma)
	orientación mediolateral:	2,5 mm (respecto a la sutura sagital)
	profundidad de la inyección:	6,0 mm (respecto a la dura)

Sitio 5:	soporte para los dientes:	-2,3 mm
	orientación anteroposterior:	+1,5 mm (respecto a bregma)
	orientación mediolateral:	2,5 mm (respecto a la sutura sagital)
	profundidad de la inyección:	4,5 mm (respecto a la dura)

Se trasplantaron 10 \mul de la suspensión de esferoides en cada sitio.

Con el fin de evitar el rechazo de los xenoinjertos, los animales receptores se sometieron a protocolos de inmunosupresión. Desde un día antes del trasplante, los animales receptores recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de ciclosporina (Sandimmun, Sandoz; 20 mg/kg de peso corporal). Con el fin de evitar las infecciones oportunistas que se producen con frecuencia durante la inmunosupresión, se suplementó el agua de bebida con tetraciclina (Acromicina, Lederle; concentración final: 100 mg/l).

5.2.- Análisis de la mejora funcional de los receptores trasplantados

De los 6 animales injertados, 4 animales sobrevivieron durante más de 4 semanas después del trasplante. El análisis del comportamiento de rotación inducido por anfetamina en estos animales proporcionó los valores siguientes (número medio de rotaciones por minuto):

Animal nº 200:	34 días antes del trasplante:	9,7
	37 días después del trasplante:	13,9

Animal nº 201:	24 días antes del trasplante:	13,5
	37 días después del trasplante:	1,3

Animal nº 204:	43 días antes del trasplante:	12,7
	50 días después del trasplante:	0,5

Animal nº 205:	86 días antes del trasplante:	9,0
	42 días después del trasplante:	1,0

Con el fin de evaluar el comportamiento de rotación, los animales receptores recibieron una inyección intraperitoneal de sulfato de D-anfetamina (Sigma, nº A-3278, 5 mg/kg de peso corporal). Desde los 5 minutos posteriores a la inyección, se cuantificó el número de rotaciones inducidas a lo largo de un periodo de 90 minutos. La evaluación del comportamiento de rotación inducido por anfetamina es un procedimiento establecido para el análisis funcional de los trasplantes estriatales y se ha publicado ampliamente (Brüstle et al., en: Current Protocols in Neuroscience, unidad 3.10, John Wiley, New York, 1997). Los datos revelaron que 3 de los 4 animales mostraba una clara reducción de las rotaciones inducidas por lesión.

5.3.- Análisis histológico de los receptores de trasplante

Para el análisis histológico, se anestesiaron animales receptores 5 a 9 semanas después del trasplante y se perfundieron transcardíacamente con paraformaldehído al 4% en PBS de acuerdo con procedimientos estándar. A continuación, se extrajeron los cerebros del cráneo, se fijaron durante la noche a 4ºC en el mismo fijador y posteriormente se cortaron en secciones de 50 \mum utilizando un vibratomo. Se detectaron las células del donante mediante hibridación in situ de ADN utilizando una sonda dirigida al ADN satélite de ratón (Hörz y Altenburger, Nucl. Acids Res. 9:683-696, 1981; Brüstle et al., Neuron 15:1275-1285, 1995). Las células donantes hibridadas se detectaron en los sitios de implante de la totalidad de los cuatro animales que se habían sometido a análisis de comportamiento (ver la sección 5.2 anteriormente). Algunas de las células del donante habían migrado desde el sitio del implante hacia regiones cerebrales contiguas del huésped, particularmente hacia el cuerpo calloso. En el animal nº 200, el trasplante se localizó en el interior del ventrículo lateral agrandado. En este animal particular, la inyección de ácido iboténico había resultado en una atrofia estriatal pronunciada con un agrandamiento concurrente del ventrículo lateral. Debido a estos cambios anatómicos observados, se determinó que las células trasplantadas ase habían administrado en el ventrículo en lugar de en el striatum. Esta localización incorrecta del trasplante explica la falta de mejora funcional observada en los análisis de rotación observados para este animal.

Además de proporcionar una señal positiva de hibridación, las células trasplantadas también manifestaron una expresión significativa del antígeno neural M6 específico de ratón. La expresión de este antígeno es particularmente pronunciada en los axones (Lund et al., Neurosci. Lett. 61:221-226; el anticuerpo M6 fue generosamente proporcionado por C. Lagenaur, Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 818A Scaife Hall, Pittsburgh, Pennsylvania 15261, USA, y se utilizó a una dilución de 1:10). En los cerebros receptores, se descubrió que numerosos axones positivos para M6 derivados del donante se proyectaban desde el injerto hacia el tejido cerebral contiguo del huésped. Estas observaciones indican que las neuronas derivadas de esferoides neurales injertados derivados de células ME inervan con éxito el cerebro del huésped.

Claims

1. Composición no tumorigénica de células obtenida a partir de células madre embrionarias de mamífero, que contiene:

b) no más del 15% de células embrionarias primitivas y de células no neurales, que se pueden obtener mediante las etapas siguientes:

(a): proliferación de células ME;

(b): cultivo de las células ME de la etapa (a) para formar células precursoras neurales;

(c): proliferación de las células precursoras neurales en medio libre de suero que contiene factor de crecimiento;

(d): proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (c) en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento, y aislamiento de las células precursoras neurales purificadas; y

(e): proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (d) en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento, y aislamiento de las células precursoras purificadas que presentan la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales y gliales,

en la que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de la etapa (d) comprende bFGF y EGF, y en el que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de la etapa (e) comprende bFGF y PDGF.

2. Composición de células según la reivindicación 1, en la que las células ME de la etapa (a) se proliferan para formar agregados celulares, particularmente cuerpos embrioides.

3. Composición no tumorigénica de células obtenida a partir de células madre embrionarias de mamífero, que contiene:

a) por lo menos 85% de células precursoras neurales aisladas que presentan la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales o gliales, y

b) no más de 15% de células embrionarias primitivas y de células no neurales, obtenibles mediante las etapas siguientes:

(a'): proliferación de células ME;

(b'): cultivo de las células ME de la etapa (a') para formar células precursoras neurales,

(c'): proliferación de las células precursoras neurales en medio libre de suero que contiene factor de crecimiento;

(d'): proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (c') en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento para formar esferoides neurales, y aislamiento de los esferoides neurales; y

(e'): proliferación de los esferoides neurales de la etapa (d') en un medio libre de suero que contiene factor de crecimiento hasta la generación de una monocapa de células precursoras gliales, y aislamiento de las células precursoras purificadas que presentan la capacidad de diferenciarse para formar células gliales,

en la que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de la etapa (d'), (e') comprende bFGF y/o EGF, con la condición de que el procedimiento no incluya la destrucción de embriones humanos.

4. Composición de células según la reivindicación 3, en la que las células ME de la etapa (a') se proliferan para formar agregados celulares, particularmente cuerpos embrioides.

5. Composición de células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dichas células crecen en forma de monocapa de células.

6. Composición de células según una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dichas células crecen en forma de esferoides.

7. Composición de células según una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende células que presentan la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales, astrogliales y/o oligodendrogliales.

8. Composición de células según una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que las células madre embrionarias se obtuvieron a partir de células germinales embrionarias.

9. Composición de células según una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que las células se han aislado de entre el grupo constituido por ratón, rata, hámster, oveja, cerdo, vaca, primate y ser humano.

10. Composición de células según una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que las células precursoras se han modificado genéticamente.

11. Composición de células según una de las reivindicaciones 1 a 10 en estado congelado.

12. Biblioteca de células que comprende células autólogas y no autólogas según una de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Esferoides, que comprenden células neurales diferenciadas a partir de las células precursoras según una de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Esferoides según la reivindicación 13, obtenidos mediante inducción in vitro de la diferenciación de las células precursoras según una de las reivindicaciones 1 a 5.

15. Procedimiento para la generación de células precursoras purificadas que presentan la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales o gliales, que comprende las etapas siguientes:

(a): proliferación de células ME;

(c): proliferación de las células precursoras neurales en un medio libre de suero que contiene factor de crecimiento;

(d): proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (c) en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento y aislamiento de las células precursoras neurales purificadas; y

(e): proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (d) en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento y aislamiento de las células precursoras purificadas que presentan la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales o gliales,

en el que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de la etapa (d) comprende bFGF y EGF, y en el que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de (e) comprende bFGF y PDGF.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que las células ME de la etapa (a) se proliferan para formar agregados celulares, particularmente cuerpos embrioides.

17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, en el que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de la etapa (c) comprende bFGF.

18. Procedimiento para la generación de células precursoras neurales purificadas que presentan la capacidad de diferenciarse para formar células neuronales o gliales, que comprende las etapas siguientes:

(a'): proliferación de células ME;

(b'): cultivo de las células ME de la etapa (a') para formar células precursoras neurales;

(d'): proliferación de las células precursoras neurales de la etapa (c') en otro medio libre de suero que contiene factor de crecimiento para formar esferoides con potencial de diferenciación neuronal y glial, y aislamiento de los esferoides; y

(e'): proliferación de los esferoides neurales de la etapa (d') en medio libre de suero que contiene factor de crecimiento hasta la generación de una monocapa de células precursoras gliales, y aislamiento de las células precursoras purificadas que presentan la capacidad de diferenciarse para formar células gliales,

en el que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de la etapa (d'), (e') comprende bFGF y/o EGF.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que las células ME de la etapa (a') se proliferan para formar agregados celulares, particularmente cuerpos embrioides.

20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, que comprende además la etapa siguiente:

(f): control de la diferenciación de las células precursoras gliales de la etapa (e') en una dirección astrocítica u oligodendroglial, y aislamiento de las células precursoras que presentan la capacidad de diferenciarse para formar células astrocíticas u oligodendrogliales,

21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 18 a 20, en el que el medio libre de suero que contiene factor de crecimiento de la etapa (c') comprende bFGF.

22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 21, en el que el medio de la etapa (f') comprende CNTF ó T3.

23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 15 a 22, en el que el procedimiento se combina con procedimientos de separación y de clasificación celular.

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 15 a 23, en el que las células precursoras purificadas se incorporan en un medio de inyección.

25. Utilización de las células precursoras según una de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al trasplante en el sistema nervioso.

26. Utilización de los esferoides según la reivindicación 13 ó 14 para la preparación de una composición farmacéutica para el trasplante en el sistema nervioso.

27. Utilización de las células precursoras según una de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la terapia de defectos neurales.

28. Utilización de las células precursoras según una de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de una composición farmacéutica para la reconstitución de células neuronales.

29. Utilización de las células precursoras según una de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la remielinización de áreas desmielinizadas del sistema nervioso.

30. Utilización de las células precursoras según una de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de una composición farmacéutica o transferencia génica mediada por células al sistema nervioso.

31. Utilización de las células precursoras según una de las reivindicaciones 1 a 12 para la producción in vitro de polipéptidos.

32. Composición farmacéutica que contiene células precursoras según una de las reivindicaciones 1 a 12 para la terapia de defectos neurales.