ES2259712T3 - Medio de cultivo para la deteccion y/o la discriminacion de los enterococos. - Google Patents

Medio de cultivo para la deteccion y/o la discriminacion de los enterococos.

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Abstract

Medio de cultivo para la detección y/o la discriminación de los enterococos caracterizado porque presenta, en un medio de cultivo para enterococos, Cristal Violeta a una concentración que permite el crecimiento de los enterococos y la inhibición del crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas, siendo dicha concentración superior a 0, 1 mg/l e inferior a 1 mg/l.

Description

Medio de cultivo para la detección y/o la discriminación de los enterococos.
La presente invención se refiere a un medio de cultivo cromógeno destinado a poner de manifiesto la presencia de enterococos.
En el campo clínico, la detección de los enterococos resulta extremadamente importante, a causa de la aparición de cepas resistentes a los antibióticos, principalmente a la vancomicina, el antibiótico más utilizado para tratar las infecciones. Dichas infecciones nosocomiales pueden asimismo poner en peligro la vida de los pacientes afectados.
Los estreptococos aislados del intestino o estreptococos del grupo D se han diferenciado clásicamente en dos grupos según sus características fisiológicas:
- los "enterococos" (Streptococcus faecium y Streptococcus faecalis) capaces de crecer en unas condiciones hostiles;
- los "estreptococos del grupo D no-enterococos" (Streptococcus bovins y Streptococcus equinus) incapaces de multiplicarse en unas condiciones hostiles.
En 1982 y en 1983, los estudios genómicos (hibridaciones ADN-ARNr, establecimiento de unos diccionarios de los oligonucleótidos del ARNr 16S) han demostrado que los "enterococos" y los "estreptococos del grupo D no-enterococos" pertenecen a dos géneros diferentes.
En 1984, Schleifer y Kilpper-Bälz al estudiar los resultados de las hibridaciones ADN-ARNr 23S y de las hibridaciones ADN-ADN confirman los resultados anteriores y dichos dos autores proponen la transferencia de los "estreptococos del grupo de los enterococos" en el género Enterococcus, diferente del género Streptococcus (Int. J. Syst. Bacterial., 1984, 34, 31-34).
Se puede encontrar un estudio muy bueno sobre los enterococos en el sitio www.bacterio.cict.fr/bacdico/ee/
enterococcus.html, o bien en el sitio www.life.umd.edu/classroom/bsci424/PathogenDescriptions/Enterococcus.html, o en el sitio www.enterococcus.ouhsc.edu/lab_methods.asp.
Por lo tanto es importante disponer de un ensayo fiable y rápido que permita detectar las contaminaciones por dichas bacterias, debiendo dicho ensayo ser a la vez sensible y específico.
Los enterococos crecen de forma general en unos intervalos de temperaturas comprendidos entre 10º y 45ºC, el crecimiento óptimo está aproximadamente a 35 ºC, en un medio no selectivo (agar a base de sangre o agar chocolate). Sin embargo, dicho medio permite asimismo el crecimiento de otras bacterias y no permite distinguir eficazmente los enterococos.
Existen actualmente algunos medios de cultivo para la detección de los enterococos, principalmente el medio de agar MacConkey, sin Cristal Violeta, suministrado por Difco. El Cristal Violeta es un compuesto que inhibe el crecimiento de las bacterias Gram positivas, de lo que se considera que inhibe el crecimiento de los enterococos y de los estafilococos (recordemos que los enterococos son unos cocos Gram positivo, que se presentan de forma aislada o bien en pares o en cadenas cortas.). El "Difco Manual", 11ª Edicion, pág. 288, indica "MacConkey Agar w/o CV (Crystal Violeta) is a differential medium that is less selective than MacConkey Agar. The lack of crystal violet permits the growth of Staphylococcus and Enterococcus".
Dicho medio contiene asimismo otros inhibidores del crecimiento, tales como las sales biliares. Estos otros inhibidores son eficaces para inhibir el crecimiento de bacterias Gram positivas, pero no de los enterococos.
En efecto, las bacterias enterocócicas pueden crecer igualmente en unos medios que contienen unas sales biliares, las colonias no se disuelven después de la exposición a la bilis. Se puede asimismo hacer crecer las bacterias enterocócicas en un medio que contiene una concentración de 6,5% en NaCl, los estreptococos no presentan dicha propiedad.
A partir de dichas constataciones de que los medios para enterococos no contienen Cristal Violeta, sino que contienen más bien otros inhibidores, se puede concluir que, en diversas condiciones, el Cristal Violeta es un inhibidor del crecimiento de los enterococos. Dicha hipótesis se refuerza por el hecho de que entre los diferentes medios MacConkey, el que se utiliza para detectar los enterococos no contiene Cristal Violeta, pero contiene unas sales biliares. Sin embargo, dicho medio permite también el crecimiento de los estafilococos.
Debe apreciarse que el método utilizado más habitualmente para la detección de los enterococos consiste en una técnica de filtración en un medio selectivo (tal como el medio m-Enterococcus agar = medio de Slanetz y Bartley o el medio de ácido oxolínico-esculina-azida = medio OAA) seguida de una confirmación mediante cultivo en una gelosa de bilis-esculina incubada durante 48 horas a una temperatura de 44 ºC. El efecto selectivo se puede reforzar incubando el medio de Slanetz y Bartley a una temperatura de 41 ºC. Más frecuentemente, la identificación no se realiza y sólo se realiza la búsqueda de la catalasa con el fin de eliminar determinadas cepas de estafilococos capaces de desarrollarse en los medios utilizados.
Conviene por lo tanto disponer de un medio que permita la detección de los eneterococos que permite asimismo diferenciarlos de los estafilococos, que crecen en general en los medios de cultivo de los enterococos.
En el marco de la presente invención, se ha demostrado que es posible ajustar la concentración de Cristal Violeta de tal manera que éste conserve su papel de inhibición del crecimiento para la mayoría de las bacterias Gram positivas, y principalmente de los estafilococos, permitiendo al mismo tiempo el crecimiento de los enterococos.
De este modo, los medios de la técnica anterior (principalmente el medio MacConkey Agar suministrado por los laboratorios Difco) utilizan generalmente una concentración de Cristal Violeta igual a 1 mg/l. Se ha demostrado que la adición de Cristal Violeta a una concentración de 0,1 hasta aproximadamente 1,5 mg/l permite mantener el crecimiento de los enterococos, principalmente cuando el medio no contiene otros inhibidores del crecimiento para bacterias Gram positivas.
Se ha demostrado asimismo que la adición de Cristal Violeta permite evitar la utilización de la azida sódica presente muy frecuentemente en los medios de detección de los enterococos (por sus propiedades inhibidoras del crecimiento de determinadas bacterias, pero que es muy tóxica para los humanos). De forma preferida, un medio según la invención no contendrá por lo tanto azida sódica.
Dicho resultado, y particularmente principalmente el hecho de que la concentración de Cristal Violeta pueda ser superior a 1 mg/l en determinadas condiciones permitiendo al mismo tiempo el crecimiento de los enterococos, no se podía prever a la luz de los conocimientos descritos en la técnica anterior, particularmente que se pueda suprimir también la azida sódica.
De este modo, la presente invención tiene como objeto un medio de cultivo para la detección y/o la discriminación de los enterococos, caracterizado porque presenta, en un medio de cultivo para enterococos, Cristal Violeta a una concentración que permite el crecimiento de los enterococos y la inhibición del crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas.
Dicha concentración es superior a 0,1 mg/l, de forma más preferida, superior a 0,25 mg/l, o superior a 0,5 mg/l. De este modo, se observa una inhibición del crecimiento de una cantidad importante de bacterias Gram positivas después de la adición de Cristal Violeta a una concentración tan baja como 0,1 mg/l.
Dicha concentración es inferior a 1 mg/l. Cuando la concentración de Cristal Violeta es de aproximadamente 1 mg/l, resulta por lo tanto conveniente reducir, intentar suprimir los otros inhibidores de bacterias Gram positivas, principalmente las sales biliares. Está al alcance del experto en la materia ajustar las concentraciones de los inhibidores en función de la concentración de Cristal Violeta añadida en el medio según la invención.
En otra forma de realización de la invención, la concentración de Cristal Violeta es inferior a 0,8 mg/l, de forma más preferida, inferior a 0,7 mg/l. A dichas concentraciones, se pueden volver a añadir eventualmente otros inhibidores de bacterias Gram positivas.
El experto en la materia como la expresión "medio de cultivo para enterococos", es decir un medio de cultivo que contiene los nutrientes necesarios para permitir el crecimiento de dichas bacterias. Se cita principalmente la peptona de caseína, de soja, de carne, del extracto de levadura o de buey, dextrosa....
De forma preferida, el medio según la invención comprende además por lo menos un agente cromógeno, sustrato de una enzima de fermentación de los azúcares, siendo dicha enzima, preferentemente, una glucosidasa, principalmente \beta-glucosidasa, o una galactosidasa, principalmente \beta-galactosidasa.
El hecho de que se puede añadir un agente cromógeno es completamente inesperado, en la medida en la que el Cristal Violeta ya colorea los medios según la invención, lo que disuade por lo tanto de volver a añadir un elemento que aporte un color, tal como un agente cromógeno.
Preferentemente, dicho agente cromógeno libera, por hidrólisis, un cromóforo precipitable seleccionado de entre los derivados indoxilo, halógeno-indoxilo (bromo-indoxilo, cloro-indoxilo, fluoro-indoxilo, yodo-indoxilo, dicloro-indoxilo, cloro-bromo-indoxilo, tri-cloro-indoxilo), metil-indoxilo, o hidroxi-quinolina, en particular los derivados siguientes: 6-cloro-indoxilo, 5-bromo-indoxilo, 3-bromo-indoxilo, 6-fluoro-indoxilo, 5-yodo-indoxilo, 4,6-dicloro-indoxilo, 6,7-dicloro-indoxilo, 5-bromo-4-cloro-indoxilo, 5-bromo-6-cloro-indoxilo, 4,6,7-tricloro-indoxilo, N-metil-indoxilo u 8-hidroxi-quinolina.
Preferentemente, dicho agente cromógeno sustrato de la \beta-glucosidasa es un indoxilo-glucósido, principalmente el 5-bromo-4-cloro-3-indoxilo-\beta-glucosidasa y/o dicho agente cromógeno sustrato de la \beta-galactosidasa es un indoxilo-galactósido, principalmente el 5-bromo-6-cloro-3-indoxilo-\beta-galactosidasa.
Con el fin de permitir la mejor detección de los enterococos, se pueden asimismo volver a añadir, en el medio de cultivo según la invención, unos inhibidores de crecimiento para las bacterias Gram negativas, tales como el ácido nalidíxico o la colistina.
Con el fin de detectar los enterococos atípicos resistentes a determinados antibióticos, y responsables en gran parte de las infecciones nosocomiales, se pueden volver a añadir asimismo dichos antibióticos en los medios según la invención. Se volverá a añadir asimismo vancomicina a una concentración de aproximadamente 6 mg/l. Destacamos que se puede detectar la proporción de bacterias resistentes en una muestra efectuando una siembra en una caja de antibióticos y una caja que los comprende y comparando el número de colonias identificadas como enterococos en cada caja.
La invención se refiere asimismo a la utilización de un medio de cultivo según la invención para la detección y/o la discriminación de los enterococos, así como a un procedimiento para la detección y/o la discriminación de los enterococos en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas que consisten en:
a.
inocular un medio de cultivo según la invención con dicha muestra o un inóculo derivado de la muestra.
b.
Detectar la presencia de enterococos en dicho medio de cultivo.
Se detecta la presencia de los enterococos mediante el crecimiento de las colonias en el medio, y se ayuda mediante su coloración después de la liberación del cromóforo a partir del cromógeno sustrato del enzima.
Se selecciona preferentemente un cromóforo que presenta una longitud de onda diferente de la longitud de onda del Cristal Violeta, con el fin de identificarlo más fácilmente. Sin embargo, el medio según la invención permite asimismo la utilización y la detección de cromóforos que presentan una longitud de onda próxima a la longitud de onda del Cristal Violeta.
De forma general, la invención se refiere asimismo a un medio de cultivo para la detección de bacterias Gram positivas o Gram negativas, comprendiendo, además de unos factores de crecimiento para dichas bacterias Gram positivas o Gram negativas, un agente cromógeno y Cristal Violeta, estando el Cristal Violeta presente a una concentración que permite el crecimiento de dichas bacterias que se intentan detectar y la inhibición diferencial del crecimiento de las bacterias Gram positivas, estando dicha concentración está comprendida preferentemente entre 0,1 y 1,0 mg/l.
La invención ha demostrado por lo tanto que se puede añadir un colorante en un medio cromógeno, conservando al mismo tiempo las propiedades del cromógeno.
El cromógeno se selecciona de manera que el cromóforo liberado presenta una longitud de onda diferente de la del Cristal Violeta o del colorante utilizado en el medio cromógeno.
Ejemplos Ejemplo 1
Un medio preferido para la utilización de la invención comprende (para un litro):
- Agar 15 g
- Extracto de levadura y peptonas 9 g
- NaCl 5 g
- Ácido Nalidíxico 50 mg
- Colistina 5 g
- Cristal Violeta 0,5 mg
- 5-bromo-4-cloro-3-indoxilo-\beta-glucósido 50 mg
Ejemplo 2
La siembra de bacterias sobre el medio según la invención ha proporcionado los resultados siguientes (24 horas de incubación a una temperatura de 37 ºC).
Crecimiento Color
Enterococos + Azul- lila
Estafilococos - - - - - - - - - - - - - 
\newpage
La utilización del medio según la invención permite por lo tanto detectar los enterococos, y discriminarlos de los estafilococos.
Ejemplo 3
Ejemplos de los medios para los enterococos que se pueden utilizar en el marco de la presente invención, añadiéndoles Cristal Violeta y suprimiendo eventualmente la azida sódica, o bien añadiendo unos agentes cromógenos, y eventualmente la vancomicina, para detectar las cepas resistentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio bilis- esculina (composición en gramos por litro)
Extracto de carne: 3,0
Peptona de carne: 5,0
Bilis de buey: 40,0
Esculina: 1,0
Citrato de hierro: 0,5
Agar: 14,5
Dicho medio se puede enriquecer con 5 p. ciento de suero de caballo.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio bilis-esculina-azida (composición en gramos por litro)
Triptona: 17,0
Peptona: 3,0
Extractos de levadura: 5,0
Esculina: 1,0
NaCl: 5,0
Citrato de hierro amoniacal: 0,5
Citrato sódico: 1,0
Azida de amonio: 0,25
Bilis de Buey: 10,0
Agar: 13,5 
\vskip1.000000\baselineskip
Medio de Slanetz y Bartley o agar m-Enterococcus (composición en gramos por litro)
Triptona: 15,0
Peptona: 5,0
Extractos de levadura: 0,5
Glucosa: 2,0 ó 5,0
K_{2}HPO_{4}: 4,0
Azida sódica: 0,4
Cloruro de 2,3,5 trifeniltetrazolio (solución al 1 por ciento): 10,0
Agar: 10 
\vskip1.000000\baselineskip
Medio ácido oxolínico-esculina-azida o medio OAA (composición en gramos por litro)
Triptona: 20,0
Extractos de levadura: 5,0
Glucosa: 1,0
NaCl: 5,0
Citrato de hierro amoniacal: 0,5
Citrato sódico: 1,0
Azida sódica: 0,4
Ácido oxilínico: 0,005
Agar: 10,0
Gelosa esculina-azida-kanamicina (composición en gramos por litro)
Triptona: 20,0
Extractos de levadura: 5,0
Glucosa: 1,0
NaCl: 5,0
Citrato de hierro amoniacal: 0,5
Citrato sódico: 1,0
Azida sódica: 0,15
Sulfato de Kanamicina: 0,02
Agar: 10,0

Claims (13)

1. Medio de cultivo para la detección y/o la discriminación de los enterococos caracterizado porque presenta, en un medio de cultivo para enterococos, Cristal Violeta a una concentración que permite el crecimiento de los enterococos y la inhibición del crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas, siendo dicha concentración superior a 0,1 mg/l e inferior a 1 mg/l.
2. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además por lo menos un agente cromógeno, sustrato de una enzima de fermentación de los azúcares, seleccionado de manera que el cromóforo liberado presente una longitud de onda diferente de la del Cristal Violeta.
3. Medio según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha enzima es una glucosidasa, particularmente la \beta-glucosidasa o una galactosidasa, principalmente la \beta-galactosidasa.
4. Medio de cultivo según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque dicho agente cromógeno libera, por hidrólisis, un cromóforo precipitable seleccionado de entre los derivados indoxilo, halógeno-indoxilo (bromo-indoxilo, cloro-indoxilo, flúor-indoxilo, yodo-indoxilo, dicloro-indoxilo, cloro-bromo-indoxilo, tri-cloro-indoxilo), metil-indoxilo, o hidroxi-quinolina, en particular los derivados siguientes: 6-cloro-indoxilo, 5-bromo-indoxilo, 3-bromo-indoxilo, 6-fluoro-indoxilo, 5-yodo-indoxilo, 4,6-dicloro-indoxilo, 6,7-dicloro-indoxilo, 5-bromo-4-cloro-indoxilo, 5-bromo-6-cloro-indoxilo, 4,6,7-tricloro-indoxilo, N-metil-indoxilo o 8-hidroxi-quinolina.
5. Medio de cultivo según la reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque dicho sustrato de la \beta-glucosidasa es un indoxilo-glucósido, y/o dicho sustrato de la \beta-galactosidasa es un indoxilo-galactosidasa.
6. Medio de cultivo según la reivindicación 5, caracterizado porque el sustrato de la \beta-glucosidasa es el 5-bromo-4-cloro-indoxilo-\beta-glucósido, y/o el sustrato de la \beta-galactosidasa es el 5-bromo-6-cloro-3-indoxilo-\beta-galactosidasa.
7. Medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque contiene asimismo unos inhibidores de crecimiento para las bacterias Gram negativas.
8. Medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende (por un litro):
- Agar 15 g - Extracto de levadura y peptonas 9 g - NaCl 5 g - Ácido Nalidíxico 50 mg - Colistina 5 mg - Cristal Violeta 0,5 mg - 5-bromo-4-cloro-3-indoxilo-\beta-glucósido 50 mg
9. Medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que contiene además unos antibióticos.
10. Medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque no contiene azida sódica.
11. Utilización de un medio de cultivo tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la detección y/o la discriminación de los enterococos.
12. Procedimiento para la detección y/o la discriminación de los enterococos en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas que consisten en:
a.
inocular un medio de cultivo tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 con dicha muestra o un inóculo derivado de la muestra,
b.
detectar la presencia de enterococos en dicho medio de cultivo.
13. Medio de cultivo para la detección de bacterias Gram positivas o Gram negativas, que comprende además de unos factores de crecimiento para dichas bacterias Gram positivas o Gram negativas, un agente cromógeno y cristal violeta, a una concentración que permite el crecimiento de dichas bacterias que se quiere detectar y la inhibición diferencial de crecimiento de las bacterias Gram positivas, siendo dicha concentración superior a 0,1 mg/l e inferior a 1 mg/l, siendo dicho cromógeno seleccionado de manera que el cromóforo liberado presenta una longitud de onda diferente de la del Cristal Violeta.
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