ES2259809T3 - Transferencia de energia fluorescente mediante hibridacion competitiva. - Google Patents
Transferencia de energia fluorescente mediante hibridacion competitiva.Info
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Abstract
SE PROPONE UN METODO PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE NUCLEOTIDOS O VIGILAR LA AMPLIFICACION DE UN NUCLEOTIDO. UTILIZA TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE FLUORESCENCIA POR HIBRIDIZACION COMPETITIVA. LA HIBRIDIZACION COMPETITIVA SE CONSIGUE AL UTILIZAR SONDAS COMPLEMENTARIAS DE LONGITUD DESIGUAL QUE PRESENTAN UN FLUOROFORO EN UNA SONDA Y UN AMORTIGUADOR EN LA OTRA. EL FLUOROFORO Y EL AMORTIGUADOR ESTAN YUXTAPUESTOS DE MANERA TAL QUE LA PROXIMIDAD DEL AMORTIGUADOR RESPECTO AL FLUOROFORO PRODUCE EL AMORTIGUAMIENTO DE LA FLUORESCENCIA DEL FLUOROFORO.
Description
Transferencia de energía fluorescente mediante
hibridación competitiva.
Esta invención está relacionada con sondas
complementarias de longitud desigual que tienen un fluoróforo en una
sonda y un desactivador de fluorescencia en la otra. El fluoróforo y
el desactivador se encuentran yuxtapuestos de tal forma que la
proximidad del desactivador al fluoróforo desactiva la fluorescencia
del fluoróforo. Estas sondas son útiles en la detección de
nucleótidos con complementariedad de secuencia. Las capacidades de
detección residen en la hibridación competitiva resultante de la
utilización de sondas de longitud desigual y la consiguiente
disminución de la desactivación producida por esta hibridación
competitiva.
Las técnicas de amplificación de ácidos
nucleicos se han unido al conjunto de técnicas mediante las que se
pueden aumentar cantidades muy pequeñas de nucleótidos hasta
alcanzar una concentración que permita su detección por algún
método. Hay diversas técnicas de amplificación que ya están
disponibles. La técnica más extendida es la de la reacción en cadena
de la polimerasa o PCR, como se la denomina comúnmente en la
actualidad. Mientras las técnicas de amplificación aumentan el
número de secuencias nucleotídicas diana disponibles para su
detección, recuperación o uso, es necesario encontrar un método
sensible para detectar el producto de amplificación. Además, las
tecnologías de amplificación tienen la ventaja de disponer de un
seguimiento en tiempo real del proceso de amplificación lo cual
permite detectar series de amplificación no reactivas o
ineficiencias del proceso. La cuantificación de la carga
oligonucleotídica también se puede realizar mediante el seguimiento
en tiempo real si éste puede llevarse a cabo sin interferir con la
reacción de amplificación.
El procedimiento de esta invención se basa en la
transferencia de energía fluorescente entre una sonda marcada con
un fluoróforo y una sonda marcada con desactivador con
complementariedad de secuencia entre ellas. Las sondas utilizadas
son de longitud desigual favoreciendo así la hibridación de una
sonda con la secuencia del ácido nucleico diana frente a la
hibridación con su sonda complementaria. En ausencia de ácidos
nucleicos con secuencias complementarias o idénticas a las
secuencias de la sonda (secuencia diana), las dos sondas hibridarían
entre sí. Cuando las dos sondas están hibridadas entre sí la
proximidad del desactivador respecto al fluoróforo provoca la
desactivación de la fluorescencia del fluoróforo. En presencia de
ácido nucleico con secuencias complementarias o idénticas a la
secuencia de la sonda, algunas de las sondas marcadas con fluoróforo
hibridarán con el ácido nucleico de secuencia complementaria, serán
separadas del desactivador y producirán una fluorescencia aumentada
(activada). Esta diferencia de
fluorescencia se puede utilizar para la detección específica de la presencia de ácidos nucleicos con las
fluorescencia se puede utilizar para la detección específica de la presencia de ácidos nucleicos con las
\hbox{secuencias diana.}
En un primer aspecto, esta invención está
relacionada con un método de seguimiento de la amplificación de
ácidos nucleicos que comprende: la realización de la amplificación
de un polinucleótido diana en la que la amplificación se lleva a
cabo mediante cualquier método que utilice una primera sonda
oligonucleotídica y una segunda sonda oligonucleotídica más corta en
por lo menos dos pares de bases; la primera sonda presenta un
fluoróforo; la segunda es complementaria de la primera sonda y
presenta una molécula desactivadora capaz de desactivar la
fluorescencia de dicho fluoróforo, estando este último y el
desactivador unidos a sus sondas respectivas en una posición que
provoca que la molécula desactivadora desactive la fluorescencia del
fluoróforo cuando las sondas hibridan, caso en el que la sonda de
mayor longitud se une preferentemente al polinucleótido diana y,
cuando se encuentra en esta situación, la intensidad de
fluorescencia del fluoróforo es mayor que la del fluoróforo cuando
está hibridado con la segunda sonda; y el seguimiento de la
fluorescencia del fluoróforo, siendo la generación de fluorescencia
una consecuencia de la amplificación del ácido nucleico.
También está relacionada con un método de
detección de la presencia de un polinucleótido diana mediante las
sondas de longitud desigual.
Las sondas hibridadas con fluoróforo y
desactivador también forman parte de esta invención.
La figura 1 ilustra la señal de fluorescencia
obtenida a partir de una amplificación por PCR de RNA HVC diana
utilizando sondas de longitud diferente. La sonda de mayor longitud
contenía fluoróforo en el carbono 5' terminal y la sonda de menor
longitud, preparada por deleción de tres pares de bases del extremo
5' terminal de la sonda mayor, contenía un desactivador en el
carbono 3' terminal.
Esta invención se utiliza junto con la
amplificación de un polinucleótido diana mediante cualquier método.
Estas técnicas de amplificación incluyen la PCR, la reacción en
cadena de la ligasa (LCR), la "gap" LCR, la amplificación
mediada por transcripción (TAM), la amplificación de ácidos
nucleicos basada en la secuencia (NASBA) y la amplificación por
desplazamiento de cadenas (SDA).
La PCR es la técnica de mayor interés y aparece
descrita en muchas referencias bibliográficas como por ejemplo Innis
et al., editors, PCR Protocols (Academic Press, New york,
1989); Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition
(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989); y similares. El
sitio de unión de la sonda oligonucleotídica está situado entre los
cebadores de PCR utilizados para amplificar el polinucleótido diana.
Para llevar a cabo la PCR se puede utilizar cualquier polimerasa. Ya
que la intensidad de la señal de fluorescencia se intensifica a
medida que se generan más réplicas del polinucleótido diana,
cualquier polimerasa que aumente el número de polinucleótidos diana
servirá para este método. La PCR se lleva a cabo preferiblemente con
la utilización de una polimerasa termoestable. La enzima preferida
es una Taq DNA polimerasa, p. ej. Amplitaq™ (Perkin Elmer, Norwalk,
Conn., EEUU) o una DNA polimerasa termoestable equivalente. La
temperatura de hibridación de la PCR es de entre unos 5 y 10ºC por
debajo de la temperatura de fusión de las sondas oligonucleotídicas
empleadas. La polimerasa Pwo también se ha utilizado con éxito en
esta invención.
El término "oligonucleótido" tal como se
utiliza aquí incluye oligómeros lineales de monómeros o enlaces
naturales o modificados, entre los que figuran
desoxiribonucleósidos, ribonucleósidos y similares, capaces de
unirse específicamente a un polinucleótido diana según un patrón
regular de interacciones monómero a monómero, igual que el tipo de
emparejamiento de bases propuesto por Watson y Crick o similar. Los
monómeros se encuentran habitualmente unidos por enlaces
fosfodiéster, o análogos de los mismos, para formar oligonucleótidos
con un tamaño que oscila entre unas pocas unidades monoméricas, p.
ej. 3 o 4, y varias decenas de unidades monoméricas. Siempre que se
representa un oligonucleótido mediante una secuencia de letras, como
"ATGCCTG", se sobreentiende que los nucleótidos están en orden
5'\rightarrow3' de izquierda a derecha y que la "A" denota
desoxiadenosina, la "C" denota desoxicitidina, la "G"
denota desoxiguanosina y la "T" denota timidina, a no ser que
se indique lo contrario. Algunos análogos de los enlaces
fosfodiéster son fosforotioato, fosforoditioato, fosforanilidato,
fosforamidato y similares. De forma general, las sondas
oligonucleotídicas de la invención presentarán un número suficiente
de enlaces fosfodiéster adyacentes a su extremo 5' de manera que la
actividad exonucleasa 5'\rightarrow3' empleada pueda degradar de
forma eficiente la sonda unida para separar las moléculas
desactivadora e indicadora.
La expresión "perfectamente emparejados" en
referencia a un ácido nucleico bicatenario (dúplex) se refiere a que
las cadenas poli u oligonucleotídicas que constituyen el dúplex
forman una estructura de doble cadena en la que cada nucleótido de
cada cadena presenta un emparejamiento de bases
Watson-Crick con un nucleótido de la otra cadena. El
término también engloba el emparejamiento de análogos de
nucleósidos, como desoxinosina, nucleósidos con bases
2-aminopurina y similares, que pueden emplearse. De
forma contraria, un mal apareamiento en un dúplex entre un
polinucleótido diana y una sonda oligonucleotídica o cebador
significa que hay un par de nucleótidos en el dúplex que no consigue
el enlace Watson-Crick.
Las sondas oligonucleotídicas de la invención
pueden sintetizarse según diferentes aproximaciones, p. ej. Ozaki
et al., Nucleic Acids Research, 20:5205-5214
(1992); Agrawal et al., Nucleic Acids Research,
18:5419-5423 (1990) o similares. Las sondas
oligonucleotídicas de la invención se sintetizan convenientemente en
un sintetizador de DNA automático, p. ej. un Sintetizador de DNA/RNA
modelo 392 o 394 (Applied Biosystems, Inc. Foster City, Ca., EEUU),
utilizando sustancias químicas estándar como la fosforamidita,
revelada por ejemplo en las siguientes referencias: Beaucage and
Iyer, Tetrahedron, 48:2223-2311 (1992); Molko et
al., Patente estadounidense núm. 4.980.460; Koster et
al., Patente estadounidense núm. 4.725.677; Caruthers et
al., Patente estadounidense números 4.415.732, 4.458.066 y
4.973.679, y similares. Se pueden utilizar sustancias químicas
alternativas, que p. ej. dan lugar a grupos estructurales no
naturales como el fosforotioato, fosforoamidato y similares, siempre
y cuando no afecten negativamente a la eficiencia de hibridación de
los oligonucleótidos resultantes o a la eficiencia de la escisión
de la exonucleasa empleada. La longitud de la sonda
oligonucleotídica está preferiblemente en un rango de 15 a 60
nucleótidos. De manera más preferible, esta longitud se encuentra
entre los 18 y los 30 nucleótidos. La secuencia exacta y la longitud
de la sonda oligonucleotídica de la invención depende en parte de la
naturaleza del polinucleótido diana al que se une. La posición y la
longitud de la unión se puede variar para conseguir las propiedades
de hibridación y de fusión adecuadas para una realización
determinada. El nucleótido del extremo terminal 3' de la sonda
oligonucleotídica se encuentra preferiblemente bloqueado de manera
que una polimerasa de ácido nucleico no pueda expandir la secuencia.
Este bloqueo se realiza convenientemente adjuntando una molécula
indicadora o desactivadora al carbono 3' terminal de la sonda
oligonucleotídica mediante una porción de unión. Preferentemente las
moléculas indicadoras son derivados de colorantes orgánicos
fluorescentes destinados a unirse al carbono 3' terminal o al 5'
terminal de la sonda a través de una porción de unión. Las
moléculas desactivadoras también son preferentemente colorantes
orgánicos, fluorescentes o no dependiendo de la realización de la
invención. Por ejemplo, en una realización preferida de la
invención, la molécula desactivadora es fluorescente. En general,
tanto si la molécula desactivadora es fluorescente como si
simplemente libera la energía transferida desde el indicador
mediante degradación no radiactiva, la banda de absorción del
desactivador debería superponerse de manera considerable a la banda
de emisión fluorescente de la molécula indicadora. Las moléculas
desactivadoras no fluorescentes que absorben la energía de moléculas
indicadoras excitadas, pero que no liberan la energía de manera
radiactiva, aquí se denominan como moléculas cromogénicas. Se puede
encontrar una gran cantidad de consejos prácticos en las
publicaciones especializadas para seleccionar los pares de
indicador-desactivador adecuados para determinadas
sondas. Un ejemplo son las siguientes referencias: Clegg
"Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids",
Methods of Enzymology, 211: 353-389 (1992), Wu et
al "Resonance energy transfer: methods and applications",
Anal. Biochem. 218: 1-13 (1994); Pesce et
al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New
York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A
Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970) y similares. Las
publicaciones también incluyen referencias que proporcionan listados
exhaustivos de moléculas fluorescentes y cromogénicas y de sus
propiedades ópticas relevantes para la elección de los pares
indicador-desactivador, p. ej. Berlman, Handbook of
Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic
Press, New York, 1971); Griffiths, Colour and Constitution of
Organic Molecules (Academic Press, new York, 1976); Bishop, editor,
Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene,
1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience
Publishers, New York, 1949) y similares. Además, se puede encontrar
amplia orientación acerca de la obtención de derivados de moléculas
desactivadoras e indicadoras para la unión covalente a través de
grupos reactivos comunes que se pueden añadir a un oligonucleótido.
Un ejemplo son las siguientes referencias: Haugland (citado
anteriormente); Ullman et al, Patente estadounidense núm.
3.996.345; Khanna et al., Patente estadounidense núm.
4.351.760 y similares.
Se pueden seleccionar pares ejemplares de
indicador-desactivador a partir de colorantes
derivados de xanteno, fluoresceínas incluidas, y colorantes
derivados de la rodamina. Muchas formas apropiadas de estos
compuestos están disponibles comercialmente con sustituyentes en sus
fracciones fenilo aptos para ser utilizados como el sitio de unión o
como el lugar funcional de enlace para la unión con un
oligonucleótido. Otro grupo de compuestos fluorescentes son las
naftilaminas, que presentan un grupo amino en la posición alfa o
beta. Dentro de estos compuestos naftilamino se encuentran los
siguientes:
1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato,
1-anilino-8-naftalenosulfonato
y
2-p-touidinil-6-naftalenosulfonato.
Otros colorantes son:
3-fenil-7-isocianatocumarina,
acridinas como 9-isotiocianatoacridina y naranja de
acridina,
N-(p-(2-benzoxazolil)-fenil)-maleimida,
benzoxadiazoles, estilbenos, pirenos y similares. Preferiblemente
las moléculas indicadoras y desactivadoras son seleccionadas a
partir de la fluoresceína y de colorantes derivados de rodamina.
Estos colorantes y los métodos de enlace adecuados para la unión a
oligonucleótidos están descritos en muchas referencias, p. ej.
Khanna et al.(citado anteriormente); Marshall, Histochemical
J., 7:299-303 (1975); Menchen et al., Patente
estadounidense núm. 5.188.934; Menchen et al., Patente
europea núm. de solicitud 87310256.0 y Bergot et
al.,Solicitud internacional PCT/US90/05565. Los últimos cuatro
documentos se adjuntan de este modo mediante cita.
Existen muchas fracciones de unión y
metodologías para unir moléculas indicadoras o desactivadoras a los
extremos 5' o 3' terminales. Ejemplos de esto mismo se encuentran en
las siguientes referencias: Eckstein, editor, Oligonucleotides and
Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman
et al, Nucleic Acids Research, 15: 5305-5321
(1987)(grupo 3' tiol sobre el oligonucleótido); Sharma et al,
Nucleic Acids Research, 19:3019(1991)(3' sulfhidrilo); Giusti
et al., PCR Methods and Applications,
2:223-227 (1993) y Fung et al., Patente
estadounidense núm. 4.757.141 (grupo 5'fosfoamino mediante
Aminolink™. II comercializada por Applied Biosystems, Foster City,
Ca, EEUU); Stabinsky, Patente estadounidense núm. 4.739.044 (grupo
3'aminofosforilo); Agrawal et al. Tetrahedron Letters,
3:1543-1546 (1990) (unión mediante enlaces
fosforamidato); Sproat et al, Nucleic Acids Research, 15:4837
(1987)(grupo 5'mercapto); Nelson et al, Nucleic Acids
Research, 17:7187-7194 (1989)(grupo 3'amino) y
similares. Es preferible emplear fracciones de unión comercializadas
que puedan unirse a un oligonucleótido durante la síntesis, p. ej.
comercializadas por Clontech Laboratories (Palo Alto, Ca, EEUU).
Los colorantes de rodamina y fluoresceína
también se unen de manera conveniente al hidroxilo 5' de un
oligonucleótido al final de la síntesis en fase sólida mediante
colorantes derivados con una fracción fosforamidita, p. ej. Woo
et al., Patente estadounidense núm. 5.231.191 y Hobbs, Jr.,
Patente estadounidense núm. 4.997.928.
El técnico tiene la libre elección de
seleccionar los cebadores y sondas utilizados en esta invención.
Esta invención no establece ningún requisito o restricción especial
acerca de la elección del cebador o de la sonda. Estas elecciones
pertenecen al dominio de la técnica.
Las sondas pueden ser de cualquier longitud
siempre y cuando esta permita llevar a cabo la invención. Como línea
de partida la sonda de mayor longitud debe tener por lo menos tres
pares de bases, a nivel práctico la sonda de mayor longitud estará
constituida por más de tres pares de bases. Sin embargo, no existe
un límite superior ocasionado por el uso de la FETCH. La longitud de
la sonda mayor no viene indicada por la aplicación de la FETCH ya
que funcionará con una sonda de cualquier longitud, siempre que
cumpla el requisito de tener una longitud de por lo menos tres pares
de bases. A nivel práctico, la sonda mayor tendrá una longitud que
asegure su hibridación exclusiva con el polinucleótido diana y la
sonda menor. La sonda menor tendrá por lo menos dos pares de bases
menos que la sonda mayor. Esto constituye la norma básica para crear
la sonda de menor longitud. Por lo que respecta a la diferencia de
longitud entre las sondas se ha encontrado que se puede conseguir un
buen acoplamiento mediante el cálculo de la temperatura de
disociación de las sondas hibridadas. Por regla general la
temperatura de disociación de los cebadores debe ser mayor que unos
55ºC y menor que 90ºC. Un método accesible para realizar este
cálculo consiste en utilizar el software llamado Gene Runer
(Hastings Software, Inc.), por ejemplo la versión 3.04.
El gen de menor tamaño puede prepararse en forma
de gen truncado en 5' del gen mayor. O también en forma de gen
truncado en 3'. Una tercera opción es la de crear la sonda de menor
tamaño al truncar tanto el extremo 5' como el 3' del gen mayor.
Cualquiera de estas tres formas de la sonda más corta servirán. A
pesar de que se pueden utilizar dos o más formas truncadas, es más
sencillo utilizar una forma, preferiblemente la truncada en 5'.
El fluoróforo y el desactivador se pueden situar
en cualquier combinación de pares de bases siempre y cuando la
fluorescencia del fluoróforo sea desactivada de forma efectiva por
el desactivador cuando hibridan las dos sondas. El sistema más
sencillo consiste en introducir el fluoróforo en el nucleótido 5'
terminal de la sonda de mayor longitud y el desactivador en el
nucleótido 3' terminal de la sonda de menor longitud. De esta manera
se puede optimizar el efecto de las moléculas desactivadoras sobre
la fluorescencia del fluoróforo. Las moléculas de fluoróforo y
desactivadoras se encuentran preferiblemente unidas al carbono 5'
terminal y al carbono 3' terminal de la sonda a través de porciones
de unión 5' y 3'. Sin embargo, se ha demostrado, con al menos una
cierta cantidad de los fluoróforos utilizados aquí, que el
fluoróforo y el desactivador pueden situarse distantes entre sí y
todavía ser funcionales. Véase por ejemplo la Patente estadounidense
núm. 5.538.848, que revela que un fluoróforo y un desactivador
pueden estar separados por varios nucleótidos. La patente revela un
trabajo en el que un fluoróforo y un desactivador están separados
por al menos 15 nucleótidos o más y supuestamente demuestra su
utilidad. De igual forma, en el caso que nos ocupa se permite una
separación entre el fluoróforo y el desactivador de varios
nucleótidos, siempre que esta separación no reduzca de forma
importante la capacidad del desactivador de actuar sobre la señal
del fluoróforo cuando las dos sondas están hibridadas. El fluoróforo
y/o el desactivador podrían estar unidos a un nucleótido del
interior de las sondas, por supuesto, pero por razones de facilidad
de síntesis y para optimizar la hibridación de sonda con diana y
sonda con sonda, es preferible colocar el fluoróforo y el
desactivador en los extremos 5' y 3' terminales de las sondas, como
se ha indicado anteriormente. De hecho, si tanto el fluoróforo como
el desactivador están en los nucleótidos 5' o 3' terminales de sus
respectivos oligonucleótidos el ensayo será funcional. Una
disposición alternativa es colocar el fluoróforo en la sonda más
corta y el desactivador en la más larga. De nuevo, en esta
disposición la sonda más larga se unirá a la diana de forma
preferente por lo que quedará suficientemente separada de la sonda
con el fluoróforo y de este modo no podrá desactivar su
fluorescencia de manera efectiva. La construcción preferida, sin
embargo, consiste en disponer el fluoróforo en la sonda más
larga.
El ensayo se puede optimizar variando la
proporción de las sondas entre la de desactivador y la de
fluoróforo. Una relación de 1:1 dio buenos resultados, pero se
encontró que una relación 2:1 de la sonda con desactivador respecto
a la sonda con fluoróforo daba mejores resultados. Mientras este
aspecto de la invención no se ha optimizado, a pesar de haberse
encontrado, un experto en la materia podrá optimizar un determinado
ensayo mediante pruebas rutinarias con proporciones diferentes.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar la invención y no pretenden, ni deben entenderse así,
limitar el alcance de la invención reivindicada en manera
alguna.
El uso de transferencia de energía fluorescente
mediante hibridación competitiva (FETCH) se desarrolló como un
ensayo para la detección mediante PCR del virus de la hepatitis C
(VHC) en especímenes humanos. La sonda directa, la más larga,
incluía un colorante 6-FAM (carboxifluoresceína) en
la posición 5' y un grupo fosfato en la posición 3' (para evitar la
extensión durante la PCR). La sonda inversa, la más corta, incluía
un colorante TAMRA (N,N,N',N'
tetrametil-6-carboxirodamina) en la
posición 3' (como no presenta un OH 3' no es posible la extensión
durante la PCR). Se utilizó como fluoróforo FAM, un colorante
fluorescente frecuentemente utilizado. Como desactivador en este
caso se utilizó TAMRA, un colorante fluorescente con una banda de
absorción que se superpone a la banda de emisión del FAM.
A partir de trabajos publicados se identificaron
secuencias polinucleotídicas del VHC. Para poder tener un ensayo que
pudiera comprender todas las cepas conocidas del VHC, se
seleccionaron dos cebadores y dos sondas cuyas secuencias
polinucleotídicas eran comunes a todas las secuencias de RNA de
cepas descritas. Se seleccionaron los cebadores para que hibridaran
con todos las cepas conocidas de VHC y poseyeran unas
características satisfactorias como una temperatura de disociación
similar, una complementariedad 3' no extensiva entre ellas, etc. Los
cebadores escogidos, tal como se describe en las publicaciones,
rodean un segmento de 254 pb de la región no codificante 5' del VHC
desde el nucleótido número 3290 hasta el 3543. Los datos de
secuencia del VHC dependían de los cebadores y las sondas
seleccionadas que se identifican en las siguientes tablas
I-II y IV (adjuntas).
| Oligo | Secuencia cebador directo | Bases | PM | Marcador |
| HCV | 5'GCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCT | 26 | 8008 | Ninguno |
| Oligo | Secuencia cebador inverso | Bases | PM | Marcador |
| HCVR2 | 5'GGTGCACGGTCTACGAGACC3' | 20 | 6124 | Ninguno |
| Secuencia diana 3331-3350 | |
| Sonda C1 | 5'FAM CCGGGAGAGAGCCATAGTGGTC PO4 |
| Sonda C2 | 3'TAMRA GGCCCTCTCGGTATCAC |
\vskip1.000000\baselineskip
La presentación poco convencional de la
secuencia de C2 (desde 3' hasta 5') facilita la visualización de su
complementariedad con C1.
\vskip1.000000\baselineskip
| Bases | PM | Marcador | |
| Sonda C1 | 20 | 6914 | 6-FAM |
| Sonda C2 | 17 | 6065 | TAMRA |
\vskip1.000000\baselineskip
Cálculo de los pesos moleculares mediante Gene
Runer, versión 3.04 (Hastings Software, Inc.)
Se sintetizaron por encargo dos sondas en
TriLink Biotechnologies, Inc. (11585 Sorrento Valley Rd., Suite 105,
San Diego, CA 92121). Se prepararon de la siguiente manera:
Paso
1
El oligonucleótido se preparó en un soporte que
bajo desprotección producirá un grupo fosfato 3' (Glen Research
Catalog núm. 20-2913).
Paso
2
El oligonucleótido unido al soporte se hizo
reaccionar manualmente con 15 equivalentes de amidita
6-FAM (Glen Research Catalog núm.
10-5901) para asegurar una alta eficiencia.
Paso
3
El oligonucleótido marcado con FAM se
desprotegió durante 36 horas a temperatura ambiente con hidróxido
amónico fresco concentrado. Tras la desprotección se decantó el
reactivo, se aclararon las partículas magnéticas y se secaron las
soluciones combinadas.
Paso
4
El oligonucleótido marcado con FAM se purificó
mediante HPLC de fase inversa. El FAM solo se encontraba en el
material de longitud completa y constituía un asa lipofílica útil
permitiendo una buena separación. Tras la purificación, se secó el
compuesto para su precipitación. Se precipitó el compuesto a partir
de NaOAc 0,3 M utilizando EtOH. Se recuperó el producto mediante
centrifugación de alta velocidad y se lavó dos veces con EtOH.
\newpage
Paso
5
El producto seco se resuspendió en agua, se
cuantificó y se analizó su pureza con HPLC. Luego, el compuesto se
secó de nuevo para prepararlo para su administración.
El ensayo se llevó a cabo en forma de una
reacción en cadena de la polimerasa y transcripción inversa de un
solo paso. Se aisló y purificó RNA de VHC a partir de suero o plasma
humanos. Se realizó un lisado de la muestra de suero o plasma bajo
condiciones altamente desnaturalizantes para desactivar las RNAsas y
asegurar el aislamiento del RNA intacto. Se precipitó el RNA con
etanol y se transfirió a una columna spin QIAmp (Qiagen, Chatsworth,
CA, EEUU) de unión a RNA. Entonces se lavó la columna y el RNA se
eluyó con agua. El molde de RNA purificado (10 \mul) se mezcló con
mezcla de reacción de VHC (véase la tabla V)(40 \mul) y luego se
llevó a cabo su transcripción inversa a DNA, se amplificó mediante
PCR y se detectó mediante el sistema de análisis de secuencias
Perkin Elmer 7700 en el mismo tubo utilizado para la tabla VI.
Durante la PCR, algunas de las sondas marcadas con FAM y algunas de
las marcadas con TAMRA hibridaron con el producto de la PCR por lo
que redujeron la desactivación de la fluorescencia de FAM y
permitieron la detección de la fluorescencia aumentada. La
fluorescencia de FAM aumenta con el número creciente de
ci-
clos de termociclado, lo que corresponde a los aumentos en la cantidad de producto de PCR, como ilustra la
clos de termociclado, lo que corresponde a los aumentos en la cantidad de producto de PCR, como ilustra la
\hbox{figura
1.}
| Mezcla de reacción de VHC típica | ||
| Reactivos | 1 tubo \mul | Conc. final (40 \mul) |
| Agua libre de RNasa | 26,8 | - - - |
| Tampón 10X TaqMan™ | 5 | 1X |
| MgCl_{2} (25 mM) | 5 | 2,5 mM |
| dNTP5 (25 mM cada uno) | 0,6 | 300 mM |
| Cebador HCVC1 (100 \muM) | 0,25 | 500 nM |
| Cebador HCVC2 (100 \muM) | 0,25 | 500 nM |
| Sonda C1 (25 \muM) | 0,2 | 100 \muM |
| Sonda C2 (25 \muM) | 0,2 | 100 \muM |
| Inhibidor de RNasa (20 U/\mul) | 0,5 | 10 U |
| MU/V RT(50 U/\mul) | 0,5 | 25 U |
| Amplitaq Gold (5 U/\mul) | 0,5 | 2,5 U |
TaqMan es la marca registrada de Roch Molecular
Systems, Inc.
| Ciclo | Temperat. | Tiempo | Repet. | T. de incremento de temp. | Autoincremento |
| Espera | 48:00 | 60:00 | Auto | ||
| Espera | 95:00 | 10:00 | Auto | ||
| Ciclo | 93:00 | 0:15 | 40 | Auto | |
| 57:00 | 0:30 | ||||
| 72:00 | 0:30 |
Claims (12)
1. Un método de seguimiento de la amplificación
de ácidos nucleicos que comprende lo siguiente:
llevar a cabo la amplificación de ácidos
nucleicos sobre un polinucleótido diana utilizando cualquier método,
donde dicha amplificación es llevada a cabo en presencia de una
primera sonda oligonucleotídica y una segunda sonda
oligonucleotídica de menor longitud, por lo menos dos pares de bases
de diferencia, lo cual permite el seguimiento de la amplificación de
ácido nucleico;
la primera sonda presenta un fluoróforo;
la segunda sonda es complementaria de la primera
y presenta una molécula desactivadora capaz de desactivar la
fluorescencia del fluoróforo mencionado, estando el fluoróforo y el
desactivador unidos a sus sondas respectivas en unas posiciones que
provocan que el desactivador desactive la fluorescencia del
fluoróforo cuando las sondas están hibridadas entre sí,
donde la sonda de mayor longitud se une de
manera preferente al polinucleótido diana y, cuando se encuentra así
unida al polinucleótido diana, la intensidad de fluorescencia del
fluoróforo es mayor que la del fluoróforo cuando hibrida con la
segunda sonda
y realizar un seguimiento de la fluorescencia
del fluoróforo, que corresponde a la existencia de amplificación de
ácidos nucleicos.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la polimerasa de ácido nucleico es una polimerasa de ácido nucleico
termoestable.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
el fluoróforo de la primera sonda y la molécula desactivadora de la
segunda se encuentran sobre el mismo par de bases hibridado.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
el fluoróforo y las moléculas desactivadoras se encuentran a una
distancia entre sí de entre uno y tres pares de bases.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
en el que el fluoróforo y las moléculas desactivadoras se encuentran
a una distancia entre sí de tres o más pares de bases.
6. El método de la reivindicación 1, en el que
el fluoróforo se encuentra en el nucleótido 5' terminal de la
primera sonda y el desactivador en el nucleótido 3' terminal de la
segunda sonda.
7. El método de la reivindicación 1, en el que
el fluoróforo se encuentra en el nucleótido 3' terminal de la
primera sonda y el desactivador en el nucleótido 5' terminal de la
segunda sonda.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
la segunda sonda es complementaria de la primera sonda acortada por
la deleción de tres o más nucleótidos 5' terminales.
9. El método de la reivindicación 1, en el que
la segunda sonda es complementaria de la primera sonda acortada por
la deleción de tres o más nucleótidos 3' terminales.
10. El método de la reivindicación 1, en el que
la segunda sonda es complementaria de la primera sonda acortada por
la deleción de tres o más nucleótidos 5' terminales y por la
deleción de tres o más nucleótidos 3' terminales.
11. El método de la reivindicación 1, en el que
las sondas primera y segunda tienen una temperatura de disociación
que difiere en dos grados o más.
12. Un método de detección de la presencia de
secuencias de ácido nucleico específicas en una muestra preparada de
ácidos nucleicos que comprende lo siguiente:
colocar una muestra de ácidos nucleicos en una
solución adecuada e incubarla con una primera sonda
oligonucleotídica y una segunda sonda oligonucleotídica de menor
longitud, diferente en al menos dos pares de bases;
la primera sonda presenta un fluoróforo;
la segunda sonda es complementaria de la primera
y presenta una molécula desactivadora capaz de desactivar la
fluorescencia del fluoróforo mencionado, estando el fluoróforo y el
desactivador unidos a sus sondas respectivas en unas posiciones que
provocan que el desactivador actúe sobre la fluorescencia del
fluoróforo cuando las sondas están hibridadas,
\newpage
donde la sonda de mayor longitud se une de
manera preferente al polinucleótido diana y, cuando se encuentra así
unido al polinucleótido diana, la intensidad de fluorescencia del
fluoróforo es mayor que la del fluoróforo cuando hibrida con la
segunda sonda
y realizar un seguimiento de la fluorescencia
del fluoróforo, la generación de la cual corresponde a la presencia
de secuencias de ácido nucleico específicas.
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