ES2259987T3 - Procedimiento de produccion de burkholderia cepacia en un medio que contiene cobalto y su utilizacion para la degradacion de tba o de taa. - Google Patents
Procedimiento de produccion de burkholderia cepacia en un medio que contiene cobalto y su utilizacion para la degradacion de tba o de taa.Info
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Abstract
Procedimiento de producción de una bacteria Burkholderia cepacia CIP I-2052 en el cual se pone en cultivo la indicada bacteria en presencia de un medio que contiene al menos una fuente de nitrógeno, tertio-butanol (TBA) y/o alcohol tertio-amílico (TAA) en presencia de aire o de oxígeno, y se recupera un inóculo, caracterizado porque el indicado medio contiene al menos una sal de cobalto.
Description
Procedimiento de producción de Burkholderia
cepacia en un medio que contiene cobalto y su utilización para
la degradación de TBA o de TAA.
La invención se refiere a un procedimiento de
producción de microorganismos, Burkholderia cepacia (ex
Pseudomonas cepacia) CIP I-2052, el inóculo
producido y su aplicación en un procedimiento para degradar los
alcoholes producidos por ejemplo en la degradación de los éteres
llamados éteres-combustibles cuando se encuentran
contenidos en efluentes acuosos. Estos éteres son los siguientes:
el etil tertio-butil éter designado a continuación
bajo el término ETBE, el metil tertio-butil éter
designado a continuación bajo el término MTBE o el
tertio-amil metil éter designado a continuación
bajo el término TAME. Los alcoholes producidos en su degradación son
el tertio-butanol designado a continuación bajo el
término TBA o el alcohol tertio-amílico designado a
continuación bajo el término TAA.
La invención se aplica particularmente en la
industria del tratamiento del agua.
La técnica anterior se ilustra por el documento
"Transformation of carbon tetrachloride by Pseudomonas sp;
strain KC under denitrification conditions". Appl. Environ
Microbiol; vol 56, nº 11, No. 1990 (1990-11),
páginas 3240-3246, y por las patentes EP 0 237 002
A, FR 2 735 497 A y FR 2 766 478.
El TBA y el TAA son respectivamente los
productos de degradación de los éteres, MTBE y ETBE por una parte y
TAME por otra parte. Estos éteres se utilizan actualmente o son
susceptibles de ser utilizados como aditivos en las gasolinas los
cuales permiten aumentar el índice de octanaje. Su utilización es
masiva ya que, por ejemplo, el MTBE se añade a las gasolinas a
razón del 10 al 15% (v/v). Por este motivo, la presencia de estos
éteres en los acuíferos se nota cada vez más a menudo (Andrews C.,
1998, "MTBE-A Long-Term Threat to
Ground Water Quality", Ground Water, 36:
705-706)). La biodegradación parcial de estos
éteres-combustibles en los acuíferos, debida por
ejemplo a limitaciones en oxígeno disponible, puede por consiguiente
conducir a la acumulación de TBA y de TAA como contaminantes
secundarios.
Por otro lado, el TBA y el TAA pueden por si
mismos ser utilizados como aditivos en las gasolinas para aumentar
su índice de octanaje y en este caso su utilización puede producir
su dispersión en el medio ambiente como contaminantes
primarios.
La presencia de TBA o de TAA en las aguas de las
capas acuíferas que sirven para la alimentación de agua potable o
en las aguas residuales que llegan a las estaciones depuradoras
necesita la utilización de microorganismos especializados aptos
para degradar estos alcoholes que son relativamente resistentes a la
biodegradación debido a su estructura ramificada.
Según la patente US 4855051, bacterias aisladas
del sol, B. coagulans ATCC 53595, A. globiformis ATCC
53596 y P. stutzeri ATCC 53602 son susceptibles de degradar
el TBA adicionado a un medio mineral mínimo. Los consortia
bacterianos son igualmente susceptibles de degradar el TBA según la
patente US 5811010, pero los microorganismos que los constituyen no
han sido caracterizados. Por otro lado, según la patente US 5814514,
diferentes bacterias capaces de desarrollarse sobre propano son
capaces de degradar el TBA.
La Firma solicitante ha aislado una bacteria
aeróbia Burkholderia cepacia CIP I-2052 por
su capacidad en utilizar el TBA como fuente de carbono y de energía
degradándolo hasta en dióxido de carbono (mineralización). Esta
bacteria ha sido depositada por la Firma solicitante en la colección
del Institut Pasteur (CNCM, 25, rue du
Docteur-Roux, F-75724 PARIS). Esta
bacteria, según la solicitud de patente FR 2766478 de la Firma
solicitante, puede ser utilizada en cultivo mixto con bacterias
capaces de utilizar el ETBE como fuente de carbono y de energía
degradándolo hasta la fase del TBA que se acumula entonces en el
medio de cultivo; es por lo que la adición de un inóculo de
Burkholderia cepacia CIP I-2052, que tiene la
capacidad de activar el TBA así producido, permite obtener la
degradación total del ETBE en efluentes. Generalmente, el tiempo de
incubación de estos microorganismos sobre este sustrato es largo,
por ejemplo son precisas 400 h para degradar aproximadamente 700
mg/L de TBA, y se muestra indispensable a escala industrial producir
biomasa en cantidad suficiente.
El objeto de la presente invención es describir
una modificación aportada al medio de cultivo de la bacteria
Burkholderia cepacia CIP I-2052 que permite
mejorar de forma muy sencilla su crecimiento en presencia de TBA o
TAA proporcionado como única fuente de carbono y de energía
mediante adición de una sal de cobalto, sola o mezclada, en el medio
de cultivo.
Más precisamente, la invención se refiere a un
procedimiento de producción de una bacteria Burkholderia
cepacia CIP I-2052 en el cual se cultiva, en
presencia de aire u oxígeno, la indicada bacteria en presencia de un
medio que contiene al menos una fuente de nitrógeno,
tertio-butanol (TBA) y/o alcohol
tertio-amílico (TAA), y se recupera un inóculo,
caracterizado porque el indicado medio contiene al menos una sal de
cobalto. El cobalto se utiliza de preferencia en su forma
divalente.
Según una característica del procedimiento, la
sal de cobalto puede ser elegida entre el grupo formado por el ión
cloruro, el ión sulfato, el ión nitrato y su mezcla. Se ha observado
que el cloruro de cobalto hexahidratado tenía un efecto importante
sobre la biomasa producida por las bacterias.
Según otra característica de la invención, la
bacteria Burkholderia cepacia CIP I-2052
puede sembrarse en un medio de cultivo salino vitaminado al cual se
añade cloruro de cobalto, solo o en mezcla con otros oligoelementos,
a la concentración final en el medio de 0,01 a 4 mg/L,
ventajosamente de 0,03 a 2 mg/L y preferentemente de 0,05 a 0,1
mg/L. En estas condiciones, los sustratos carbonados de
Burkholderia cepacia CIP I-2052, es decir el
TBA o el TAA pueden ser adicionados a una concentración comprendida
entre 0,001 y 10 g/L de medio y de forma preferencial entre 0,2 y 5
g/L.
En estas condiciones, se produce un inóculo de
densidad celular más importante que lo que había sido observado
anteriormente y que es de una concentración en biomasa final, por
ejemplo, del orden de 0,6 g de peso seco/L de cultivo para una
concentración inicial de TBA de 1 g/L. El inóculo así preparado
podrá ser utilizado solo para tratar efluentes que contienen TBA o
TAA o podrá también ser utilizado en cultivo mixto con bacterias que
degradan el ETBE o el MTBE en TBA o el TAME en TAA.
Este inóculo así producido en gran cantidad por
el procedimiento según la invención podrá igualmente ser utilizado
directamente para depurar efluentes acuosos que contienen TBA o TAA
o la mezcla de TBA y de TAA. Más precisamente, la invención se
refiere a un procedimiento de degradación de TBA y/o de TAA,
contenido en efluentes acuosos en el cual se realiza en condiciones
aeróbias un inóculo producido por el procedimiento de producción de
una bacteria Burkholderia cepacia CIP
I-2052.
Según la solicitud de patente FR 98/16520 de la
firma solicitante, el TBA puede proceder de la degradación en
condiciones aerobias, de MTBE o de ETBE contenido en efluentes
acuosos, por al menos una bacteria que puede ser Gordona
térrea CIP I-1889 o Rhodococcus equi CIP
I-2053. Estas mismas bacterias pueden también
degradar en condiciones aerobias el TAME en TAA.
La invención se comprenderá mejor con miras a
figuras que ilustran la invención, entre las cuales:
- la figura 1 representa la degradación del TBA
mediante B. cepacia CIP I-2052 y su
desarrollo P(ufc.mL^{-1}) en presencia de la solución de
oligoelementos, en función del tiempo.
- la figura 2 muestra el efecto algunos
elementos minerales sobre la producción de biomasa por B.
cepacia CIP I-2052.
Ejemplos 1A y
1B
(Comparativo)
Se sembró la cepa B. cepacia CIP
I-2052 en medio mineral salino MM2 suplementado en
glucosa (500 mg.L^{-1}) como fuente de carbono y de energía. El
medio MM2 tiene la composición siguiente:
- KH_{2}PO_{4}
\dotl1,4 g
- K_{2}HPO_{4}
\dotl1,7 g
- NaNO_{3}
\dotl1,5 g
- MgSO_{4}, 7H_{2}O
\dotl0,5 g
- CaCl_{2}, 2H_{2}O
\dotl0,04 g
- FeCl_{3}, 6H
\dotl0,012 g
- Solución de vitaminas
\dotl1 mL
- H_{2}O
\dotlc.s.p.
\dotl1 litro
\vskip1.000000\baselineskip
La solución de vitaminas tiene la composición
siguiente por 1 litro de agua destilada.
- Biotina
\dotl200 mg
- Riboflavina
\dotl50 mg
- Ácido nicotinámico
\dotl50 mg
- Pantotenato
\dotl50 mg
- Ácido p-aminobenzóico
\dotl50 mg
- Ácido fólico
\dotl20 mg
- Tiamina
\dotl15 mg
- Cianocobalamina
\dotl1,5 mg
El cultivo obtenido después de 24 horas de
incubación a 30ºC se utilizará para sembrar matraces que contienen
200 mL de medio MM2 suplementado con TBA como fuente de carbono y de
energía a diferentes concentraciones y a las cuales se añade una
solución de oligoelementos, que contienen cloruro de cobalto
hexahidratado, a razón de 10 mL L^{-1} de medio MM2. A título
comparativo, no se añade a estos mismos matraces solución de
oligoelementos.
La solución de oligoelementos tiene la
composición siguiente:
| - Ácido nitrilotriacético | 1,5 g |
| - Fe(NH_{4})_{2}(SO_{4})_{2}, 6 H_{2}O | 0,2 g |
| - Na_{2}SeO_{3} | 0,2 g |
| - CoCl_{2}, 6H_{2}O | 0,1 g |
| - MnSO_{4}, 2H_{2}O | 0,1 g |
| - Na_{2}MoO_{4}, 2H_{2}O | 0,1 g |
| - ZnSO_{4}, 7H_{2}O | 0,1 g |
| - AlCl_{3}, 6H_{2}O | 0,04 g |
| - NiCl_{2}, 6H_{2}O | 0,025 g |
| - H_{3}BO_{3} | 0,01 g |
| - CuSO_{4}, 5H_{2}O | 0,01 g |
| c.s.p. 1 litro de agua destilada |
Cada matraz se sembró a partir del precultivo
obtenido al 3% (v/v) y se incubó a 30ºC en un incubador agitado.
De estos diferentes matraces, se realizaron
extracciones a intervalos regulares con el fin de dosificar el TBA
residual por cromatografía en fase gaseosa, se midió igualmente la
densidad óptica a 600 nm y por último cuando todo el TBA inicial ha
sido consumido, se realiza una medición de carbono orgánico total
(COT) que muestra el grado de mineralización del TBA.
Los resultados obtenidos con los diferentes
cultivos se indican en la tabla 1 que mostrando el efecto de la
adición de oligoelementos sobre el crecimiento de B. cepacia
CIP I-2052 en presencia de TBA como fuente de
carbono.
| Ej. | Suplementación | TBA | TBA | COT | Tiempo | D.O. | D.O. |
| realizada | inicial | final | final | (h) | inicial | final | |
| (mg. L^{-1}) | (mg. L^{-1}) | (mg. L^{-1}) | a 600 nm | a 600 nm | |||
| +oligoelementos | 346,5 | 0 | <10 | 72 | 0,116 | 0,54 | |
| 1A | +oligoelementos | 720 | 0 | <10 | 139 | 0,117 | 0,95 |
| +oligoelementos | 1000,5 | 0 | <10 | 139 | 0,122 | 1,1 | |
| -oligoelementos | 365,5 | 0 | <10 | 150 | 0,1 | 0,156 | |
| 1B | -oligoelementos | 755,1 | 77,5 | N.D.* | 400 | 0,1 | 0,132 |
| -oligoelementos | 986,8 | 156,2 | N.D.* | 400 | 0,1 | 0,076 | |
| * N.D. no determinado |
Como se aprecia en esta tabla, la adición de la
solución de oligoelementos que contienen cobalto permite obtener
una degradación total del TBA proporcionada hasta una concentración
por ejemplo de 1000 mg L^{-1} disminuyendo mucho el tiempo de
incubación necesario. Por otro lado, la biomasa producida es mucho
más importante como lo muestran las mediciones de densidad óptica.
La preparación de inóculos para procedimientos de tratamiento de
efluentes que contienen TBA en cantidad importante, por ejemplo
hasta varios g/L, se realiza así más fácilmente.
El desarrollo de la cepa B. cepacia CIP
I-2052 sobre TBA proporcionado como única fuente de
carbono fue seguido en fermentador de 4 L.
Se realizó un inóculo de 24 horas de P.
cepacia CIP I-2052 en 200 mL de medio MM2
conteniendo glucosa (1. g.L^{-1}) y se suplementó con
oligoelementos (1%, v/v) a 30ºC bajo agitación.
El medio de cultivo del fermentador fue el medio
MM2 descrito en el ejemplo 1 suplementado con la solución de
oligoelementos descrita en el ejemplo 1 a razón de un 1% (v/v). La
concentración inicial en TBA en el fermentador fue de 300
mg.L^{-1}. Después de la siembra, la D.O. fue de 0,05 y el
recuento, realizado por numeración de los extendidos en cajas de
medio Luria después de diluciones sucesivas, refleja una densidad
celular inicial de 2,9 x 10^{6} ufc.mL^{-1}.
Las condiciones operativas de esta fermentación
en tanda fueron las siguientes:
- Temperatura = 30ºC
- Aireación = 4L.L^{-1}.
- pH = 6,8.
La degradación del TBA fue seguida por
dosificado en CPG sobre sobrenadantes del cultivo y se siguió
igualmente la evolución de la población bacteriana por recuento en
cajas de medio Luria así como mediante medición de la densidad
óptica.
Los resultados se presentan en la figura 1 donde
las adiciones sucesivas de substrato se realizan a las 50 horas, 70
horas y 210 horas.
Después de 50 horas de cultivo, todo el TBA
inicialmente proporcionado fue consumido. Se realizaron entonces
una primera adición de TBA a la concentración de 450 mg.L^{-1}
luego, después del consumo, una segunda adición de 400 mg.L^{-1}
y una tercera adición de 380 mg L^{-1}.
La población final obtenida fue de 3,5 x
10^{9} ufc mL^{-1} para una D.O. a 600 nm final de 7,0.
En este ejemplo se aprecia bien que es posible
obtener fácilmente inóculos que pueden ser utilizados para fines de
tratamiento de efluentes contaminados por ejemplo después de la
fijación de las bacterias así obtenidas sobre un soporte, por
ejemplo sobre un soporte mineral sobre el cual se realiza una
percolación de los efluentes a tratar, para una realización del
tipo "biofiltro", descrita en la solicitud de patente FR 2 787
783 de la Firma solicitante.
Se sembró la cepa B. cepacia CIP
I-2052 en medio mineral salino MM2 descrito en el
ejemplo 1 y suplementado en glucosa (500 mg.L^{-1}) como fuente
de carbono y de energía. Este primer cultivo se utilizará para
sembrar 200 mL de medio MM2 sin adición de oligoelementos y se
suplementó con TBA (750 mg.L^{-1}. Este precultivo, sin adición
de oligoelementos, permitió agotar el medio en elementos minerales
con el fin de no llevar trazas de oligoelementos en el cultivo
final, lo que falsearía los resultados obtenidos.
El precultivo así obtenido después de 96 horas
de incubación a 30ºC se utilizará para sembrar matraces que
contienen 200 mL de medio MM2 suplementado con TBA como fuente de
carbono y de energía a la concentración de 750 mg.L^{-1}. A cada
uno de los matraces se añadió uno y uno solo de los elementos que
entran en la composición de la solución de oligoelementos descrita
en el ejemplo 1 a la misma concentración final que en la
utilización de la solución propiamente dicha.
Cada matraz se sembró a partir del precultivo
obtenido al 3% (v/v) luego se incubó a 30ºC en un incubador
agitado.
En estos diferentes matraces, se midió la
densidad óptica a 600 nm después de 72 horas de incubación.
Los resultados obtenidos con los diferentes
cultivos se indican en la figura 2.
Así como se aprecia en esta figura, la adición
de la solución de oligoelementos tiene el efecto positivo indicado
en los ejemplos 1 y 2. La adición de cloruro de cobalto
hexahidratado a la concentración final en el medio de 1 mg.L^{-1}
muestra un efecto importante sobre el crecimiento ya que la densidad
óptica obtenida con la adición de cloruro de cobalto solo es
aproximadamente 2 veces superior a la obtenida con la solución de
oligoelementos, descrita en el ejemplo 1.
\newpage
Se realizó el mismo ensayo que en el ejemplo 3,
pero en lugar de utilizar el TBA como fuente de carbono y de
energía para la cepa B. cepacia CIP I-2052,
se utilizó el TAA en la misma proporción que en el ejemplo 3. Los
resultados obtenidos se indican en la tabla 2 y son idénticos a los
ya descritos en el ejemplo precedente.
| Ej. | Suplementación | TAA | TAA | Tiempo | D.O. | D.O. |
| realizada | inicial | final | (h) | inicial | final | |
| (mg.L^{-1}) | (mg.L^{-1}) | a 600 nm | a 600 nm | |||
| 4A | +oligoelementos | 700 | 0 | 96 | 0,117 | 0,85 |
| 4B | -oligoelementos | 725 | 90 | 400 | 0,1 | 0,132 |
Claims (10)
1. Procedimiento de producción de una bacteria
Burkholderia cepacia CIP I-2052 en el cual se
pone en cultivo la indicada bacteria en presencia de un medio que
contiene al menos una fuente de nitrógeno,
tertio-butanol (TBA) y/o alcohol
tertio-amílico (TAA) en presencia de aire o de
oxígeno, y se recupera un inóculo, caracterizado porque el
indicado medio contiene al menos una sal de cobalto.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el cual la sal se selecciona entre el grupo formado por ión
cloruro, ión sulfato, ión nitrato y su mezcla.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 y 2, en el cual la sal de cobalto es un cloruro
de cobalto hexahidratado.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 y 2, en el cual la sal se introduce a una
concentración final en el medio de 0,01 a 4 mg/L y de preferencia
de 0,05 a 0,1 mg/L.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, en el cual el tertio-butanol
o alcohol tertio-amílico se encuentra a una
concentración de 0,001 a 10 g/L de medio.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, en el cual la indicada bacteria se utiliza
en cultivo mixto.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, en el cual el cobalto es divalente.
8. Inóculo que comprende Burkholderia
cepacia CIP I-2052 producido por un
procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Procedimiento de degradación de
tertio-butanol y/o de alcohol
tertio-amílico contenido en efluentes acuosos en el
cual se cultiva en condiciones aerobias un inóculo de
Burkholderia cepacia CIP I-2052 según la
reivindicación 8 o producido por un procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el cual el tertio-butanol es el producto de la
degradación del metil tertio-butil éter y del etil
tertio-butil éter y el alcohol
tertio-amílico es el producto de degradación del
tertio-amil metil éter, en condiciones aerobias, por
al menos una bacteria seleccionada entre el grupo formado por
Gordona térrea CIP I-1889 y Rhodococcus
equi CIP I-2053.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| FR9914212 | 1999-11-09 | ||
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