ES2260010T3 - Polipeptido aislado del stratum corneum y su utilizacion. - Google Patents
Polipeptido aislado del stratum corneum y su utilizacion.Info
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Abstract
Polipéptido natural o sintético purificado, caracterizado por el hecho de que comprende la secuencia de ácidos aminados SEC ID NO: 1: Met Ala GIy Glu Leu Thr Pro Glu Glu Glu 10 Ala GIn Tyr Lys Lys Ala Phe Ser Ala Va¡ 20 Asp Thr Asp GIy Asn GIy Thr ¡le Asn Ala 30 Gin Glu Leu GIy Ala Ala Leu Lys Ala Thr 40 GIy Lys Asn Leu Ser Glu Ala Gin Leu Arg 50 Lys Leu Ile Ser Glu Val Asp Ser Asp Gly 60 Asp Gly Glu Ile Ser Phe GIn Glu Phe Leu 70 Thr Ala Ala Arg Lys Ala Arg Ala Gly Leu 80 Glu Asp Leu Gin Val Ala Phe Arg Ala Phe 90 Asp Gin Asp GIy Asp GIy His ¡le Thr Val 100 Asp Glu Leu Arg Arg Ala Met Ala GIy Leu 110 Gly Gin Pro Leu Pro GIn Glu Glu Leu Asp 120 Ala Met ¡le Arg Glu Ala Asp Val Asp GIn 130 Asp GIy Arg Val Asn Tyr Glu Glu Phe Ala 140 Arg Met Leu Ala Gin Glu 146
Description
Polipéptido aislado del Stratum corneum y
su utilización.
La invención tiene por objeto un polipéptido
aislado, de la familia de las proteínas que fijan el calcio, una
mezcla de polipéptidos procedentes de la proteolisis del polipéptido
aislado, las composiciones que los contienen, las utilizaciones de
dicho polipéptido y un procedimiento de tratamiento cosmético
destinado para tratar las pieles secas, la hiperqueratosis, la
paraqueratosis, la psoriasis, la ictiosis, las neoplasias.
La invención tiene igualmente por objeto una
secuencia de ácido desoxirribonucleico codante para el indicado
polipéptido y las utilizaciones de la indicada secuencia de ácido
desoxirribonucleico.
El papel clave de los flujos de calcio en las
funciones celulares ha sido ampliamente descrito desde hace más de
20 años. Así, el calcio es un mensajero intracelular de primera
importancia. Numerosas hormonas y mensajeros extracelulares ejercen
su efecto por un aumento del porcentaje intracelular de calcio. Ha
quedado rápidamente demostrado que la mayor parte de los efectos
del calcio estaban determinados por una extensa familia
relativamente homogénea de proteínas que ligan el calcio. Entre
esta familia las Calmodulinas son las más ubicuitarias. El papel de
la Calmodulina es reconocer los cambios en la concentración en iones
cálcicos citosólicos y transmitir la información a las proteínas
intracelulares.
La transmisión de la señal se realiza cuando la
Calmodulina liga el calcio en un aumento del porcentaje celular de
éste. Ello produce cambios de conformación de la proteína lo cual
aumenta de forma considerable su afinidad por la proteína
blanco.
En términos de configuración, la Calmodulina
libre de calcio contiene dos ámbitos globulares conectados por un
brazo flexible. Cada ámbito contiene dos unidades
"Hélice-Boucle-Hélice" bien
definidas conocidas bajo el nombre de
"EF-Hands" y que son responsables de la unión
con el calcio. La unión con el calcio induce a un cambio de
conformación muy importante. Este cambio de conformación se traduce
por una exposición de la parte hidrófoba globular de la proteína
que permite a la Calmodulina reconocer y unirse a ciertas proteínas
con una elevada afinidad. La unión de la Calmodulina con su proteína
blanco conduce entonces a la creación de un complejo activo.
La Calmodulina es conocida por interactuar con
numerosas proteínas o enzimas así como con numerosos fármacos
hidrófobos o también con péptidos de origen natural o sintético.
A este respecto se pueden citar
- algunas proteína-quinasas
implicadas en la homeostasis celular y en algunas funciones
celulares críticas tales como el metabolismo, la motilidad, la
transcripción de los genes y la división celular, la
proliferación;
- la calcineurina que es una fosfatasa que tiene
un papel en la regulación de las enzimas y proteínas implicadas en
la transducción de la señal cálcica;
- la fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos, la
guanidilciclasa y la adenililciclasa que regula así de forma
positiva y/o negativa los porcentajes de los segundos mensajeros
AMPcíclico y GMPcíclico en el mecanismo de acción de ciertas
hormonas;
- las tres isoformas de la
NO-sintasa que intervienen en la producción de NO y
así en la relajación vascular, la acción citotóxica de los
macrofagos, la suelta de neurotransmisores, de neuropépticos y/o de
hormonas;
- ciertas proteínas de citoestructura vitales en
el control de la forma de las células, de su rigidez y de su
adhesión como por ejemplo la miosina;
- la caldesmon, las espectrinas, la aducina,
proteínas que unen la actina;
- la desmocalmina, una proteína del desmosoma
que interactúa con las queratinas;
- el plasma-membrana
Ca^{2+}-ATPasas que intervienen en el
mantenimiento de la concentración intracelular en ión;
- la ornitina descarboxilasa, ciertas
fosfolipasas A2 y ciertas transglutaminasas han sido citadas como
siendo dependientes de la calmodulina.
Por otra parte, algunos estudios sugieren que la
Calmodulina tiene un papel en los fenómenos de reparación del ácido
desoxirribonucleico y que estaría potencialmente implicada en el
envejecimiento cutáneo.
Una secuencia parcial de ARNm procedente de
tejido de seno canceroso y utilizado como EST ha sido ya
identificado por Strausberg y col. (AI 791495). Por otro lado, es
conocido que la calmodulina humana purificada a partir de epidermis
activa las transglutaminasas (Clinical research, Vol.30, nº1, 1982,
pA159).
Se sabe por último que si la Calmodulina es una
proteína bien definida, la misma es de hecho el prototipo de una
amplia familia de proteínas de las cuales todos los individuos no
han sido aún descritos.
Así, después de largos y laboriosos trabajos la
Firma solicitante ha puesto en evidencia, entre las proteínas de la
epidermis, aislada y purificada por técnicas bioquímicas, un
polipéptido expresado en los epitelios cornificados. Este
polipéptido, llamado de distinto modo por otro lado en el texto
"CLSP" (para proteína de la piel similar a la Calmodulina:
Calmodulin Like Skin Protein) se expresa en la epidermis. Se sabe
que en los epitelios cornificados la grandísima mayoría de las
proteínas expresadas está constituida por las queratinas. Así, solo
elaborando un método de extracción particular que elimine las
queratinas, como la Firma solicitante ha podido por otra parte
purificar la CLSP.
La Firma solicitante ha determinado entonces
para ello la secuencia primaria en ácidos aminados.
La invención tiene por consiguiente por objeto
un polipéptido aislado y purificado que pertenece a la familia de
las proteínas que fijan el calcio (CaBP: calcium binding protein),
caracterizado por el hecho de que responde a la secuencia de ácidos
aminados SEC ID NO: 1 siguiente:
El polipéptido de la invención puede ser origen
natural o sintético. Por sintético se entiende aquí todo polipéptido
obtenido químicamente o por producción en un organismo después de
introducción en este organismo de los elementos necesarios para
esta producción.
El polipéptido de la invención puede proceder de
cualquier origen posible a saber ya sea animal, en particular de
mamíferos, y también más particularmente humano, o vegetal, bien sea
de micro-organismos (virus, fagos, bacterias entre
otros) o también de hongos, si prejuzgar el hecho de que estén
presentes de forma natural o no en el indicado organismo de
origen.
Preferentemente, el polipéptido de la invención
es de origen natural, purificado a partir de tejidos de mamíferos,
particularmente a partir de piel de mamíferos.
Preferentemente, el polipéptido de la invención
se purifica a partir de piel humana y también más preferentemente a
partir de epidermis humana.
Se sabe que en un polipéptido, uno o varios
residuos de ácido aminado pueden cambiar por residuos de ácido
aminado que tienen un índice hidropático similar sin cambiar por
ello las propiedades biológicas del polipéptido. El índice
hidropático es un índice atribuido a los ácidos aminados en función
de su hidrofobicidad y de su carga (Kyte y col. (1982), J. Mol.
Biol., 157: 105).
Así la invención tiene igualmente por objeto un
polipéptido tal como se ha descrito anteriormente en el cual un
residuo de ácido aminado al menos ha sido cambiado por un residuo de
ácido aminado con un índice hidropático similar.
Se sabe que en general los polipéptidos maduros
que se encuentran en las células provienen de la maduración de
precursores que contienen en su secuencia la secuencia del
polipéptido maduro.
Así, la invención se refiere igualmente a
cualquier polipéptido, natural o sintético, cuya secuencia esté en
parte constituida por la secuencia del polipéptido de la
invención.
Es conocido que los polipéptidos pueden
experimentar modificaciones post-traduccionales como
la formación de enlaces disulfuros, las escisiones proteolíticas
específicas, la adición de glúcidos (glucosilación), la
fosforilación en particular a nivel de las serinas y/o de las
treoninas y/o de las tirosinas, y/o la asociación a lípidos.
El polipéptido de la invención puede haber
experimentado una o varias modificaciones
post-traduccionales.
Así la invención se refiere también al
polipéptido de la invención que ha experimentado o no modificaciones
post-traduccionales:
Se sabe clasificar los polipéptidos en función
de su punto isoeléctrico.
El punto isoeléctrico teórico del polipéptido de
la invención puede deducirse de su encadenamiento en ácidos
aminados. El polipéptido de la invención es un polipéptido
teóricamente ácido.
Así, la invención tiene por objeto un
polipéptido cuyo punto isoeléctrico teórico está comprendido entre 1
y 6, particularmente entre 3 y 5. El polipéptido de la invención
tiene un punto isoléctrico teórico de 4,075.
Se sabe que la secuencia primaria en ácidos
aminados así como las diversas modificaciones
post-traduccionales experimentadas por un
polipéptido hacen que el indicado polipéptido pueda ser
caracterizado por su peso molecular aparente expresado en
kilodaltons.
Se entiende por peso molecular aparente, el peso
molecular obtenido para el polipéptido por comparación de la
movilidad electroforética de este con la de las proteínas
convencionales de pesos moleculares conocidos sobre gel de
poliacrilamida/sodio dodecilsulfato, o también por comparación del
volumen de elución del polipéptido con el de proteínas
convencionales de pesos moleculares conocidos en cromatografía de
exclusión (según las técnicas descritas en "Protein
Purification", J-C. Janson y L. Ryden, VCH
Publisher Inc. N.Y., 1989).
El conocimiento del encadenamiento en ácidos
aminados del polipéptido de la invención permite determinar con
ello el peso molecular teórico.
La invención se refiere por consiguiente a un
polipéptido que tiene un peso molecular teórico comprendido entre
13 y 17 kilodaltons (kD), particularmente entre 14 y 16 kilodaltons
(kD).
Muy particularmente el polipéptido de la
invención tiene un peso molecular teórico de 15,9 kilodaltons
(kD).
Por otro lado es conocido que la secuencia
primaria en ácidos aminados de un polipéptido determina
emplazamientos específicamente reconocidos por proteasas que una
vez el reconocimiento de estos emplazamientos es efectivo, con o
sin fijación al indicado polipéptido, inducirán su escisión por
proteolisis.
Así, la invención se refiere igualmente al menos
a una mezcla de polipéptidos procedentes de la proteolisis del
polipéptido de la invención.
Se comprende pues que en el texto y sin
indicación contraria, por polipético es preciso entender el
polipéptido natural o sintético de la invención tal como se ha
descrito anteriormente o al menos uno de sus fragmentos, ya sea
obtenido por proteolisis o de forma sintética o también cualquier
polipéptido natural o sintético cuya secuencia esté total o
parcialmente constituida por la secuencia del polipéptido
anteriormente descrito.
El análisis de la secuencia primaria en ácidos
aminados del polipéptido de la invención muestra que ésta contiene
emplazamientos particulares reconocidos como participantes, en los
polipéptidos que fijan el calcio, en la elaboración del o de los
emplazamientos de fijación del calcio. La fijación del calcio por el
polipéptido de la invención está por otro lado confirmada por los
resultados de los ensayos presentados por otro lado en los
ejemplos.
El polipéptido de la invención es un polipéptido
que fija el calcio.
Se ha visto por otro lado en el texto la
importancia de la presencia en el organismo de las proteínas de la
familia de la Calmodulina. Se comprende entonces la importancia de
poder proporcionar al organismo una proteína de la familia de la
Calmodulina con el fin de modificar los efectos de esta. Las
aplicaciones potenciales cubren por consiguiente todas las vías de
transducción de la señal calcio-dependiente.
Por ejemplo en cosmética la proteína de la
invención puede ser utilizada con el fin de regular los
disfuncionamientos de la proliferación o de la diferenciación
epidérmica, normales o patológicos (pieles secas, hiperqueratosis,
paraqueratosis, psoriasis, ictiosis, neoplasia...), en el
tratamiento del envejecimiento, particularmente del envejecimiento
cutáneo, en el tratamiento de los daños cutáneos relacionados con la
exposición a las radiaciones ultravioleta.
Así, otro objeto de la invención es por
consiguiente proporcionar composiciones que comprenden, en un medio
fisiológicamente aceptable, al menos un polipéptido tal como se ha
descrito anteriormente.
Un medio fisiológicamente aceptable es según la
invención un medio cosméticamente y/o farmacéuticamente aceptable,
compatible con la piel, las mucosas, las uñas, los cabellos.
Las composiciones de la invención pueden ser
composiciones cosméticas o farmacéuticas.
De preferencia, las composiciones de la
invención se aplican sobre la piel o las mucosas.
El polipéptido de la invención puede ser
utilizado como agente que regula los disfuncionamientos de la
proliferación o de la diferenciación epidérmica, normales o
patológicos particularmente en el tratamiento de las pieles secas,
de la hiperqueratosis, de la paraqueratosis, de la psoriasis, de las
ictiosis, de las neoplasias. El polipéptido de la invención puede
así ser introducido en una composición destinada para el cuidado y/o
el maquillaje de la piel, de las mucosas y/o de las fibras
queratínicas.
La composición de la invención está también
destinada para luchar contra los signos del envejecimiento cutáneo
y/o para luchar contra los efectos de la radiación ultravioleta,
particularmente de tipo A ó B.
Otro objeto de la invención es por consiguiente
una composición destinada para tratar los disfuncionamientos de la
proliferación o de la diferenciación epidérmica, las pieles secas,
la hiperqueratosis, la paraqueratosis, la psoriasis, las ictiosis
y/o las neoplasias.
Se refiere también a una composición que
comprende al menos un polipéptido de la invención para luchar contra
los signos del envejecimiento cutáneo y/o luchar contra los efectos
de la radiación ultravioleta, particularmente del tipo A ó B.
Otro objeto de la invención se refiere a la
utilización de al menos un polipéptido de la invención en una
composición o para la preparación de una composición, estando el
polipéptido o la composición destinados para tratar los
disfuncionamientos de la proliferación o de la diferenciación
epidérmica, las pieles secas, la hiperqueratosis, la
paraqueratosis, la psoriasis, las ictiosis y/o las neoplásias.
Se refiere también a la utilización de al menos
un polipéptido de la invención como agente para tratar los signos
del envejecimiento cutáneo y/o luchar contra los efectos de la
radiación ultravioleta, particularmente de tipo A ó B.
Otro objeto de la invención es también un
procedimiento de tratamiento cosmético destinado para luchar contra
los signos cutáneos de los disfuncionamientos de la proliferación
y/o de la diferenciación epidérmica como las pieles secas, la
hiperqueratosis, la paraqueratosis, la psoriasis, las ictiosis y/o
las neoplasias, los signos del envejecimiento cutáneo y/o los
efectos de la radiación ultravioleta, particularmente de tipo A ó
B, caracterizado por el hecho de que se aplica sobre la piel, las
mucosas y/o las fibras queratínicas una composición cosmética que
comprende al menos un polipéptido de la invención.
El procedimiento de tratamiento de la invención
es un procedimiento cosmético destinado para mejorar el aspecto
estético del individuo que experimenta trastornos de la
proliferación y/o de la diferenciación epidérmica.
La cantidad de polipéptido contenida en la
composición de la invención es, bien entendido, función del efecto
buscado y puede por consiguiente variar en una amplia medida.
Para proporcionar una orden de magnitud, la
composición puede contener el polipéptido de la invención en una
cantidad que representa del 0,00001% al 50% del peso total de la
composición y preferentemente en una cantidad que representa de un
0,001% a un 10% del peso total de la composición y aún más
preferentemente en una cantidad que representa del 0,1% al 1% del
peso total de la composición.
La invención tiene igualmente por objeto la
utilización del polipéptido de la invención o de sus fragmentos de
proteolisis y de cualquier péptido sintético deducido de su
secuencia, para preparar o purificar, eventualmente a partir de la
epidermis, toda molécula, estructural o funcional, susceptible de
unirse específicamente al indicado polipéptido aislado o a los
indicados fragmentos de proteolisis aislados o al mencionado péptido
sintético.
A este respecto, LA Firma Solicitante ha
demostrado que el polipéptido de la invención puede por ejemplo
unirse a por lo menos un blanco protéico seleccionado entre las
transglutaminasas, particularmente la transglutaminasa 3, la
galectina 7, las anexinas, particularmente la anexina 2, la MRP14 o
calgranulina B, las heparanasas, la HSP 27, la SCCE o también la
proteína L9 ribosomal de 60S.
En la medida en que se sabe que las
transglutaminasas juegan un papel importante en la formación de las
envueltas corneas, se puede suponer que la CLSP juega un papel
regulador de la formación de envueltas córneas a través de la
fijación a la transglutaminasa.
Así, la invención tiene por objeto la
utilización del polipéptido de la invención o de sus fragmentos de
proteolisis y de cualquier péptido sintético deducido de su
secuencia para regular las transglutaminasas, particularmente la
transglutaminasa 3 y así regular la formación de la capa cornea de
la epidermis.
En la medida en que el polipéptido de la
invención pertenezca a la familia de las Calmodulinas y que se sepa
que los polipéptidos de esta familia son en general segundos
mensajeros que responden a un estímulo (el porcentaje de calcio
intracelular) por medio de una fijación en su proteína blanco, es
posible utilizar el polipéptido de la invención para preparar o
purificar, eventualmente a partir de la epidermis, toda molécula,
estructural o funcional, susceptible de modular la interacción
entre el polipéptido de la invención y sus eventuales ligandos.
Así, la invención tiene por objeto la
utilización del polipéptido de la invención o de sus fragmentos de
proteolisis y de cualquier péptido sintético deducido de su
secuencia, para preparar o purificar, eventualmente a partir de la
epidermis, toda molécula, estructural o funcional, susceptible de
modular la interacción entre el polipéptido de la invención y sus
eventuales ligandos.
La invención tiene igualmente por objeto la
utilización del polipéptido de la invención o de sus fragmentos de
proteolisis y de todo péptido sintético deducido de su secuencia,
para preparar antisueros y/o anticuerpos monoclonales específicos,
que tratan particularmente de purificar esta proteína y sus
fragmentos. Por extensión, la invención tiene igualmente por objeto
toda utilización de la indicada secuencia para producir anticuerpos
o fragmentos de anticuerpos recombinantes, sea cual fuere el sistema
biológico utilizado para producir estos últimos.
La invención tiene también por objeto un
anticuerpo poli- o monoclonal caracterizado por el hecho de que
reconoce específicamente el polipéptido de la invención.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo preparado
por inmunización de toda especie animal utilizable a este fin,
particularmente el conejo. El anticuerpo puede ser preparado por
inmunización con ayuda del polipéptido de la invención ya sea de
origen natural o sintético, purificado o no.
Se sabe que una proteína se sintetiza en las
células a partir de una matriz de ácidos desoxirribonucleicos
codantes para la indicada proteína. Se sabe igualmente que el código
genético se degenera. Así, la secuencia de ácidos aminados del
polipéptido de la invención puede proceder de diferentes secuencias
de ácidos desoxirribonucleicos, naturales o sintéticos. Por
secuencia de ácidos desoxirribonucleicos sintética, se entiende aquí
toda secuencia obtenida químicamente o por manipulación
genética.
Las indicadas secuencias de ácidos
desoxirribonucleicos pueden proceder de cualquier origen posible a
saber bien sea animal, en particular de mamíferos y aún más
particularmente humano, o vegetal, bien sea de microorganismos
(virus, fagos, bacterias entre otros) o también de hongos, sin
prejuzgar el hecho de que estén presentes de forma natural o no en
el indicado organismo de origen.
La Firma solicitante ha aislado, purificado y
secuenciado por técnicas de biología molecular, en particular el
cribado de bancos de expresión de ácidos desoxirribonucleicos
complementarios preparados a partir de la epidermis humana, un
fragmento de ácidos desoxirribonucleicos codante para el polipéptido
de la invención.
La invención tiene por consiguiente igualmente
por objeto una composición cosmética o farmacéutica que comprende,
en un medio fisiológicamente aceptable, todas las secuencias de
ácidos desoxirribonucleicos, naturales o sintéticas de las cuales
la totalidad o parte codifican para la secuencia primaria de ácidos
aminados del polipéptido de la invención.
En el transcurso de estos trabajos, la Firma
solicitante ha podido aislar y purificar una secuencia de ácidos
desoxirribonucleicos codantes para la secuencia primaria de ácidos
aminados del polipéptido de la invención a partir de la piel
humana.
\newpage
La invención tiene por objeto un fragmento de
ácido desoxirribonucleico aislado y purificado que corresponde a la
secuencia nucleotídica codante SEC ID NO: 2 siguiente:
La invención tiene también por objeto cualquier
fragmento ácido desoxirribonucleico aislado y purificado que
comprende al menos la secuencia nucleotídica codante SEC ID NO:
2.
La invención tiene igualmente por objeto todo
polinucleótido, ácido ribonucleico o desoxirribonucleico, sentido o
antisentido, correspondientes al menos a la secuencia nucleotídica
codante SEC ID NO: 2.
El fragmento de ADN correspondiente a la
secuencia SEC ID NO: 2 puede ser introducido en un vector de
expresión que permita así la síntesis de una proteína llamada
recombinante correspondiente a la CLSP.
Por proteína recombinante se entiende aquí todo
elemento peptídico correspondiente a toda o parte de la secuencia
peptídica de la CLSP, obtenido de forma artificial después de la
introducción y expresión de la totalidad o parte del ADN
complementario de la CLSP en un vector cualquiera de expresión, sea
cual fuere el organismo que permita esta expresión.
Particularmente según la invención, la CLSP o
una parte de la CLSP, puede ser producida después de la introducción
de la totalidad o parte de la secuencia nucleotídica codante SEC ID
NO: 2 en un vector de expresión como por ejemplo el vector
pGex-2T (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) y
expresión en E. Coli.
La invención tiene igualmente por objeto un
vector de expresión recombinante que contiene la totalidad o parte
de la secuencia nucleotídica codante SEC ID NO: 2.
La invención tiene también por objeto una
proteína recombinante correspondiente a la totalidad o parte de la
secuencia SEC ID NO: 1, particularmente la obtenida por expresión de
un vector de expresión pGex-2T que contiene la
totalidad o parte de la secuencia codante SEC ID NO: 2.
La invención tiene igualmente por objeto una
composición cosmética o farmacéutica que comprende, en un medio
fisiológicamente aceptable, al menos un fragmento ácido
desoxirribonucleico aislado y purificado que comprende al menos la
secuencia nucleotídica codante SEC ID NO: 2.
La invención tiene igualmente por objeto una
composición cosmética o farmacéutica que comprende, en un medio
fisiológicamente aceptable, una secuencia de ácidos ribonucleicos
sentido o antisentido correspondientes a la indicada secuencia SEC
ID NO: 2.
La invención tiene igualmente por objeto la
utilización de las indicadas secuencias de ácidos
desoxirribonucleicos para la producción del polipéptido de la
invención o de un ácido ribonucleico correspondiente por cualquier
técnica conocida como por ejemplo la síntesis in vitro, a
partir de medios reconstituidos o la síntesis mediante organismos o
microorganismos.
Sea cual fuere su naturaleza, las composiciones
de la invención pueden ser ingeridas, inyectadas o aplicadas sobre
la piel (sobre toda zona cutánea del cuerpo) o las mucosas (bucal,
malar, gingival, genital, conjuntival,...).
Según un modo de administración, las
composiciones según la invención pueden presentarse bajo todas las
formas galénicas normalmente utilizadas.
Para una aplicación tópica sobre la piel, la
composición puede tener la forma particularmente de solución acuosa
o aceitosa o de dispersión del tipo loción o suero, de emulsiones de
consistencia líquida o semi-líquida del tipo de
leche, obtenidas por dispersión de una fase grasa en una fase acuosa
(H/E) o a la inversa (E/H), o de suspensiones o emulsiones de
consistencia blanda del tipo crema o gel acuoso o anhidros, o
también de microcápsulas o micropartículas, o de dispersiones
vesiculares de tipo iónico y/o no iónico o de espumas o también en
forma de composiciones para aerosol que comprenden igualmente un
agente propulsor bajo presión. Estas composiciones se preparan
según los métodos usuales.
Para la inyección, la composición puede
presentarse en forma de loción acuosa, aceitosa o en forma de suero.
Para los ojos, la misma puede presentarse en forma de gotas y para
la ingestión, la misma puede presentarse en forma de cápsulas, de
granulados, de jarabes o de comprimidos.
Las cantidades de los diferentes constituyentes
de las composiciones según la invención son las clásicamente
utilizadas en los ámbitos considerados.
Estas composiciones constituyen particularmente
cremas de limpieza, de protección, de tratamiento o de cuidado para
la cara, para las manos, para los pies, para las grandes arrugas
anatómicas o para el cuerpo (por ejemplo cremas de día, cremas de
noche, cremas desmaquillantes, cremas de maquillaje de fondo, cremas
anti-solares), maquillajes de fondo fluidos, leches
de desmaquillaje, leches corporales de protección o de cuidado,
leches anti-solares, leches para después de tomar
el sol, lociones, geles o espumas para el cuidado de la piel, como
lociones de limpieza, lociones anti-solares,
lociones para después del sol, lociones de bronceado artificial,
composiciones para el baño, composiciones desodorantes que
comprenden un agente bactericida, geles o lociones para después del
afeitado, cremas depilatorias, composiciones contra las picaduras de
insectos, composiciones anti-dolor, composiciones
para tratar ciertas enfermedades de la piel como el eczema, el acné
rosácea, la psoriasis, los líquenes, los pruritos severos,
la
ictiosis.
ictiosis.
Las composiciones según la invención pueden
igualmente consistir en preparaciones sólidas que constituyen
jabones o pastillas de limpieza.
Las composiciones pueden también acondicionarse
en forma de composición para aerosol incluyendo igualmente un
agente propulsor bajo presión.
La composición según la invención puede también
ser una composición para los cuidados del cuero cabelludo, y
particularmente un champú, una loción de marcado, una loción
tratante, una crema o un gel de peinado, una composición de tintes
(particularmente tintes por oxidación) eventualmente en forma de
champúes colorantes, lociones reestructurantes para los cabellos,
una composición de permanente (particularmente una composición para
el primer tiempo de una permanente), una loción o un gel anticaída,
un champú antiparasitario, las composiciones antipeliculares,
etc.
La composición puede también ser de uso
buco-dental, por ejemplo una pasta dentífrica. En
este caso la composición puede contener adyuvantes y aditivos
usuales para las composiciones de uso bucal y particularmente
agentes tensioactivos, agentes espesantes, agentes humectantes,
agentes de pulido tales como la sílice, diversos ingredientes
activos como los fluoruros, en particular el fluoruro de sodio, y
eventualmente agentes edulcorantes como el sacarinato de sodio.
Cuando la composición es una emulsión, la
proporción de la fase grasa puede oscilar entre un 5% y un 80% en
peso, y de preferencia entre un 5% y un 50% en peso con relación al
peso total de la composición. Los aceites, las ceras, los
emulsionantes y los coemulsionantes utilizados en la composición en
forma de emulsión son elegidos entre los clásicamente utilizados en
el ámbito cosmético. El emulsionante y el coemulsionante se
encuentran presentes, en la composición, en una proporción que va
del 0,3% al 30% en peso, y de preferencia del 0,5 al 20% en peso
con relación al peso total de la composición. El emulsionante puede,
además, contener vesículas lipídicas.
Cuando la composición es una solución o un gel
aceitoso, la fase grasa puede representar más de un 90% del peso
total de la composición.
De forma conocida, la composición cosmética
puede contener igualmente adyuvantes habituales en el ámbito
cosmético, tales como los gelificantes hidrófilos o lipófilos, los
aditivos hidrófilos o lipófilos, los conservantes, los
antioxidantes, los disolventes, los perfumes, las cargas, los
filtros, los absorbedores de olor y las materias colorantes. Las
cantidades de estos diferentes adyuvantes son las clásicamente
utilizadas en el ámbito cosmético, y por ejemplo del 0,01% al 10%
del peso total de la composición. Estos adyuvantes, según su
naturaleza, pueden ser introducidos en la fase grasa, en la fase
acuosa y/o en las esférulas lipídicas.
Como aceites o ceras utilizables en la
invención, se pueden citar los aceites minerales (aceite de
vaselina), los aceites vegetales (fracción líquida de manteca de
caridad, aceite de girasol), los aceites animales
(perhidroescualeno), los aceites de síntesis (aceite de Purcellin),
los aceites o ceras siliconadas (ciclometicona) y los aceites
fluorados (perfluoropoliéteres), las ceras de abeja, de carnauba o
de parafina. Se pueden añadir a estos aceites alcoholes grasos y
ácidos grasos (ácido esteárico).
Como emulsionantes utilizables en la invención,
se pueden citar por ejemplo el estearato de glicerol, el polisorbato
60 y la mezcla de
PEG-6/PEG-32/Glicol Estearato
vendido bajo la denominación de Tefose^{R}63 por la Sociedad
Gattefosse.
Como disolventes utilizables en la invención, se
pueden citar los alcoholes inferiores, particularmente el etanol y
el isopropanol, el propilenglicol.
Como gelificantes hidrófilos utilizables en la
invención, se pueden citar los polímeros carboxivinílicos
(carbomero), los copolímeros acrílicos tales como los copolímeros de
acrilatos/alquilacrilatos, las poliacrilamidas, los polisacáridos
tales como la hidroxipropilcelulosa, las gomas naturales y las
arcillas, y, como gelificantes lipófilos, se pueden citar las
arcillas modificadas como las bentonas, las sales metálicas de
ácidos grasos como los estearatos de aluminio y la sílice
hidrófoba, etilcelulosa, polietileno.
La composición puede contener otros agentes
activos hidrófilos como las proteínas o los hidrolizados de
proteínas, los ácidos aminados, los polioles, la urea, la
alantoinas, los azúcares y los derivados de azúcar, las vitaminas
hidrosolubles, los extractos vegetales y los hidroxiácidos.
Como agentes activos lipófilos, se puede
utilizar el retinol (vitamina A) y sus derivados, el tocoferol
(vitamina E) y sus derivados, los ácidos grasos esenciales, las
ceramidas, los aceites esenciales, el ácido salicílico y sus
derivados.
derivados.
Según la invención la composición puede asociar
al menos un extracto de al menos una Iridácea con otros agentes
activos destinados particularmente a la prevención y/o al
tratamiento de las afecciones cutáneas. Entre estos agentes
activos, se pueden citar a título de ejemplo:
- los agentes que disminuyen la diferenciación
y/o la proliferación y/o la pigmentación cutánea tales como el
ácido retinóico y sus isómeros, el retinol y sus ésteres, la
vitamina D y sus derivados, los estrógenos tales como el estradiol,
el ácido cojico o la hidroquinona;
- los antibacterianos tales como el fosfato de
clindamicina, la eritromicina o los antibióticos de la clase de las
tetraciclinas;
- los antiparasitarios, en particular el
metronidazol, el crotamiton o los piretrinoides;
- los antifúngicos, en particular los compuestos
que pertenecen a la clase de los imidazoles tales como el econazol,
el cetoconazol o el miconazol o sus sales, los compuestos polienos,
tales como la anfotericina B, los compuestos de la familia de las
alilaminas, tales como la terbinafina, o también el octopirox;
- los agentes antivirales tales como el
aciclovir;
- los agentes anti-inflamatorios
esteroidianos, tales como la hidrocortisona, el valerato de
betametasona o el propionato de clobetasol, o los agentes
anti-inflamatorios no esteroidianos como por ejemplo
el ibuprofeno y sus sales, el diclofenac y sus sales, el ácido
acetilsalicílico, el acetaminofeno o el ácido glicirrizico;
- los agentes anestésicos tales como el
clorhidrato de lidocaína y sus derivados;
- los agentes antipruriginosos como la
tenaldina, la trimeprazina o la ciproheptadina;
- los agentes queratolíticos tales como los
ácidos \alpha- y \beta-hidroxicarboxílicos o
\beta-cetocarboxílicos, sus sales, amidas o
ésteres y más particularmente los hidroxiácidos tales como el ácido
glicólico, el ácido láctico, el ácido salicílico, el ácido cítrico
y de forma general los ácidos de frutas, y el ácido
n-octanoil-5-salicílico;
- los agentes hidratantes como el glicerol y sus
derivados;
- los agentes anti-radicales
libres, tales como el \alpha-tocoferol o sus
ésteres, las superóxido dismutasas, ciertos quelatantes de metales
o el ácido ascórbico y sus ésteres;
- los anti-seborréicos tales
como la progesterona;
- los antipeliculares como el octopirox o la
piritiona de zinc;
- los antiacnéicos como el ácido retinóico o el
peróxido de benzoilo;
- los extractos de origen vegetal o
bacteriano.
Así, según un modo particular, la composición
según la invención comprende igualmente al menos un agente
seleccionado entre los agentes antibacterianos, antiparasitarios,
antifúngicos, antivirales, anti-inflamatorios,
antipruriginosos, anestésicos, queratolíticos,
anti-radicales libres,
anti-seborréicos, antipeliculares, antiacnéicos y/o
los agentes que disminuyen la diferenciación y/o la proliferación
y/o la pigmentación cutánea.
La biblioteca de ADNc de queratinocitos clonada
en \lambdagt11 (origen de los ARNm = queratinocitos de prepucios
humanos adultos) proviene de Clontech (Palo Alto, CA, Usa).
Los oligómeros utilizados en los diferentes
ensayos se indican a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
| Nombre del oligómero | Deducido de | Posición | Secuencia 5' a 3' |
| sc5 (sentido) | CLSP | 168/191 | GC(N)GT(N)GA(Y)AC(N)GA(Y)GG(N)AA(Y)GG(N) |
| sc10 (antisentido) | CLSP | 535/554 | TCACTCCTGGGCGAGCATC |
| sc16 (antisentido) | CLSP | 533/555 | TTGAATTCTCACTCCTGGGCGAGCATCCTC |
| (+ RS) | |||
| sc21 (antisentido) | CLSP | 240/257 | CTGGGCCTCCGAGAGGTT |
| sc29 (sentido) | CLSP | 113/140 | GATAGGATCCATGGCCGGTGAGCTGACTCCTGAGGAG |
| (+ RS) | |||
| sc7 es el oligómero "SK-primer" vendido por la Sociedad Stratagene, | |||
| Not I-(dT)_{18} es un "primer" vendido por la Sociedad Amersham Pharmacia Biotech | |||
| N=A, C, G ó T | |||
| Y=C ó T | |||
| (+ RS): emplazamiento(s) de restricción añadido(s) a la secuencia, en el oligómero. |
\vskip1.000000\baselineskip
El oligómero degenerado sc5 está basado en la
secuencia de ácidos aminados SEC ID NO:1. Todos los demás oligómeros
deducidos de la CLSP y su posición se deducen de la secuencia
nucleotídica SEC ID NO:2.
Not I-(dT)_{18} se concibe para fijarse
en las largas series de A, por ejemplo las poliA+. Utilizadas en
las reacciones de transcripción inversa, Not I-(dT)_{18} se
fija en poliA+.
\newpage
Tampones:
I: SDS 0,3%; tris-HCl 28 mM;
tris-base 22mM
2D : 8M urea; 2% CHAPS
(3-(3-colamidopropil)dimetilamonio-1-propano-sulfonato);
ditiotreitol 20 mM; 0,5% Imobilin pH gradient Buffer (Amersham
Pharmacia Biotech, pH=3;
Para la purificación de la CLSP, se prepararon
extractos acetónicos de stratum corneum según el método
descrito por Lundstrom y Egelrüd en Acta Derm. Venerol., 1991, 71:
471-474.
78 mg de polvo acetónico fueron así
preparados.
2,5 ml de tampón I fueron añadidos a los 78 mg
de polvo acetónico y se metió todo en una vasija, se llevó a
ebullición durante 10 minutos y luego se volvió a meter en vasija.
La solución se centrifugó entonces a 10000 g durante10 minutos. El
sobrenadante se recogió y se filtró a 0,22 M. Se obtuvieron así 2 ml
de sobrenadante SI.
Se añadió entonces al sobrenadante SI 10 ml de
acetona fría (10V/2V). Se dejó 10 minutos en frío (hielo picado) y
se centrifugó a 9400 g durante 20 minutos a 4ºC.
El sobrenadante se eliminó entonces y el residuo
se seco a temperatura ambiente durante 20 minutos. El residuo se
recuperó entonces en 300 l de tampón 2D. Se obtuvo así el extracto
El.
La separación en 2 dimensiones de las proteínas
contenidas en el extracto El se realizó en un aparato de marca
Pharmacia (modelo multiphor) según las recomendaciones del
proveedor.
La coloración de las manchas, la recuperación de
estas y el secuenciado de los polipéptidos que contenían se
realizaron según las técnicas convencionales descritas en "gel
electrophoresis of proteins" (IRL press), o también "a
practical guide to protein and peptide purification for
microsequencing, (Paul Matsudaira editor", secunda edición
1993).
Los ARN totales de queratinocitos de un
equivalente de epidermis (Episkin) se prepararon con la ayuda de un
kit de preparación RNeasy Kit y purificaron con la ayuda de un kit
QIAshredder column de la marca Qiagen según las prescripciones del
proveedor.
Los ADN complementarios de los ARN así
preparados se sintetizaron con la ayuda de un kit First strand cDNA
Synthesis kit marca Amersham Pharmacia Biotech según las
prescripciones del proveedor utilizando para ello el oligómero
NotI-d(T)18.
Un ADNc de 775 pares de bases así obtenido se
amplificó mediante reacciones de polimerización en cadena (PCR) en
un aparato de ciclos térmicos marca Perkin-Elmer
(modelo Thermocycler) utilizando una polimerasa pfu marca
Stratagene y el par de oligómeros
sc5/NotI-d(T)18. Un secuenciado de
este fragmento ha permitido determinar con ello el encadenamiento
en nucleótidos.
Con el fin de obtener la secuencia completa del
ADNc de la CLSP, se realizaron las reacciones de PCR con la ayuda
de los pares de oligómeros siguientes sc10/sc7, sc7/sc21, sc16/sc29
en condiciones de ensayo convencionales, en un banco de ADN
complementarios de queratinocitos clonados en el fago gt11
(Stratagene).
Las investigaciones homológicas se realizaron
por medio del programa WU-Blast en el emplazamiento
Internet Expasy Swissprot, la detección de eventuales
emplazamientos de escisión se realizó por medio del programa Omiga
1.1 PC (Oxford Molecular, Oxford, U.K.).
El ADNc de la CLSP se introdujo en el vector
pGex-2T (Pharmacia Biotech Inc.) mediante corte
ligadura en los emplazamientos de restricción
BamH-1/EcoRI. La construcción para la cual la
secuencia codante de la CLSP se encuentra en fase con la secuencia
de la glutationa S-transferasa contenido en el
vector, se introdujo entonces en la bacteria E. Coli BL21.
La proteína recombinante expresada por las bacterias puede ser
cortada por la trombina, siendo la construcción tal que la proteína
de fusión obtenida lleva un emplazamiento de corte por esta
proteasa. El conjunto de estos ensayos se realizó aplicando
estrictamente los diferentes protocolos de los proveedores.
La proteína de fusión obtenida anteriormente se
depositó sobre un gel de tipo SDS-PAGE en presencia
o en ausencia de etileno diamina tetraacetato (EDTA), agente
quelador de los iones de calcio, según el protocolo descrito por
Burgess y col. (BBA, 623 (1980), 257-270).
Columnas de cromatografía de afinidad se
realizaron con 1ml de bolas.
El polipéptido de la invención se inmovilizó
sobre bolas de sefarosa activadas con bromuro de cianógeno
procedentes de Amersham Pharmacia Biotech y según las
recomendaciones del fabricante utilizando 1,3 mg de polipéptido por
mililitro de bolas.
La eficacia de copulación fue de 0,95 mg de
polipéptido por mililitro de bolas.
De la epidermis humana (0,83 g de piel de
abdomen procedente de plastias quirúrgicas y 100 g de stratum
corneum plantar) se homogeneizaron en politron en 10 ml y 120
ml respectivamente de tampón Hepes 10 mM, pH de 7,4, conteniendo
150 mM de cloruro de sodio, 0,1% (peso/volumen) de triton X100 y una
mezcla de inhibidores de proteasas (Complete^{TM}
EDTA-free de Roche Molecular adicionado con 1 M de
pepstatin).
La suspensión se centrifugó entonces a 10000 g
durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se filtró a 0,22 y se
ajustó a 2,5 mM de cloruro de calcio antes del paso a temperatura
ambiente en la columna de afinidad. Las columnas se lavaron
entonces con 10 volúmenes de tampón Hepes 10 mM, pH 7,4, conteniendo
150 mM de cloruro de sodio, 0,1% (peso/volumen) de triton X100 y
una mezcla de inhibidores de proteasas. La elución se realizó
utilizando el mismo tampón conteniendo 5 mM de EDTA en lugar de 2,
mM de cloruro de calcio.
Las proteínas eluídas se sometieron a una
electroforesis en gel desnaturalizante (SDS-PAGE) y
después de la migración, se colorearon con plata con la ayuda del
kit de coloración de plata de la Sociedad Amersham Pharmacia
Biotech y según las recomendaciones del fabricante.
Entre todos las manchas analizadas a partir del
gel bidimensional, la secuencia deducida de una de las manchas ha
proporcionado una homología de secuencia con la Calmodulina
suficientemente importante para que sea retenido pero lo
suficientemente diferente para que su análisis sea seguido.
A partir de los elementos de secuencia en ácidos
aminados obtenidos y por las técnicas de biología moleculares
indicadas anteriormente, ha sido posible aislar y purificar la
secuencia SEC ID NO: 1.
Las homologías de secuencia entre esta proteína
y la Calmodulina dan que pensar que esta proteína debe tener
propiedades similares a las de la Calmodulina.
Cuatro emplazamientos de enlace con el calcio
puede ser evidenciados en esta secuencia, a saber los emplazamientos
comprendidos entre los ácidos aminados 21 y 32, 57 y 68, 91 y 102,
y 127 y 138.
Los ensayos de migración electroforética,
particularmente con la proteína recombinante, realizados en
presencia o en ausencia de iones calcio confirman que la proteína
fija el calcio.
Esta secuencia corresponde por consiguiente a
una proteína completa, que fija el calcio, que no es la Calmodulina
y que está presente en el stratum corneum de la epidermis
humana.
Por las técnicas anteriormente descritas, un ADN
de 858 pares de bases, fue aislado. Este fragmento de ADN comprende
la secuencia codante integral de la CLSP, del codón ATG en posición
114 hasta el codón stop en posición 552.
El secuenciado de una de las proteínas retenida
en la columna de afinidad realizada con el polipéptido de la
invención ha revelado que se trata de una transglutaminasa y
particularmente de la transglutaminasa 3.
Otros ensayos han revelado que la galectina 7,
las anexinas, particularmente las anexinas 2, la MRP14 o
calgranulina B, las heparanasas particularmente la heparinaza III,
la EAT SOC P 27, la SCCE o también la proteína L9 ribosomal de 60S
se unen igualmente al polipéptido de la invención.
<110> L'OREAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polipéptido aislado del stratum
corneum y su utilización
\vskip0.400000\baselineskip
<130> OA99236
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 858
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (26)
1. Polipéptido natural o sintético purificado,
caracterizado por el hecho de que comprende la secuencia de
ácidos aminados SEC ID NO: 1:
2. Polipéptido según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que se purifica a partir de
piel humana.
3. Polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que se purifica a partir de la epidermis humana.
4. Polipéptido natural o sintético cuya
secuencia responde a la secuencia de ácidos aminados SEC ID NO 1
según la reivindicación 1.
5. Polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que tiene un punto isoeléctrico teórico de 4.075.
6. Polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que tiene un peso molecular teórico de 15.9 kilodaltons (kD).
7. Polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que presenta en su secuencia primaria al menos un emplazamiento de
fijación del calcio.
8. Polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que fija el calcio.
9. Composición caracterizada por el hecho
de que comprende en un medio fisiológicamente aceptable, al menos
un polipéptido tal como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
10. Composición según la reivindicación 9,
caracterizada porque se trata de una composición cosmética o
farmacéutica.
11. Utilización de al menos un polipéptido tal
como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8
para preparar una composición destinada para tratar los
disfuncionamientos de la proliferación o de la diferenciación
epidérmica, normales o patológicas.
12. Utilización de al menos un polipéptido tal
como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8, para preparar una composición destinada para tratar las pieles
secas, la hiperqueratosis, la paraqueratosis, la psoriasis, las
ictiosis, las neoplasias.
13. Utilización de al menos un polipéptido según
una de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizada por el
hecho de que la composición está destinada para una aplicación
cosmética o farmacéutica.
14. Utilización de al menos un polipéptido tal
como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8, para preparar una composición destinada para regular la
transglutaminasa 3.
15. Utilización de al menos un polipéptido tal
como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8, para preparar una composición destinada para regular la formación
de la capa córnea de la epidermis.
16. Utilización de al menos un polipéptido para
preparar una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 15, caracterizada porque la indicada
composición es una composición cosmética para aplicación tópica.
17. Fragmento de ácido desoxirribonucleico
aislado codante para el polipéptido tal como se ha definido en una
de las reivindicaciones 1 a 8.
18. Fragmento de ácido desoxirribonucleico
aislado que comprende al menos la secuencia nucleotídica codante
SEC ID NO: 2 siguiente:
19. Composición cosmética o farmacéutica,
caracterizada por el hecho de que comprende, en un medio
fisiológicamente aceptable, al menos una secuencia nucleotídica tal
como la descrita en la reivindicación 18.
20. Utilización de al menos una secuencia de
ácido desoxirribonucleico tal como la descrita en la reivindicación
18 para preparar un polipéptido o una mezcla de polipéptidos.
21. Vector de expresión recombinante que
contiene la secuencia nucleotídica codante SEC ID NO: 2.
\newpage
22. Composición cosmética o farmacéutica,
caracterizada porque comprende, en un medio fisiológicamente
aceptable, una proteína recombinante correspondiente a la secuencia
SEC ID NO: 1.
23. Utilización de al menos una secuencia de
ácido desoxirribonucleico tal como se ha descrito en la
reivindicación 18 para preparar un ácido ribonucleico.
24. Utilización de al menos un polipéptido
aislado o de cualquier péptido sintético tal como se ha descrito en
las reivindicaciones 1 a 8, para preparar o purificar toda molécula
susceptible de ligarse específicamente al indicado polipéptido
purificado o al mencionado péptido sintético.
25. Utilización de al menos un polipéptido
aislado o de cualquier péptido sintético tal como se ha descrito en
las reivindicaciones 1 a 8, para preparar o purificar antisueros o
anticuerpos monoclonales específicos.
26. Anticuerpos poli- o monoclonal
caracterizado por el hecho de que reconoce específicamente el
polipéptido tal como se ha descrito en las reivindicaciones 1 a
8.
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|---|---|---|---|
| FR9909615 | 1999-07-23 | ||
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