ES2260334T3 - Procedimiento de analisis de la predisposicion genetica de un paciente a la diabetes insulino-dependiente, dispositivo y conjunto de cebadores. - Google Patents
Procedimiento de analisis de la predisposicion genetica de un paciente a la diabetes insulino-dependiente, dispositivo y conjunto de cebadores.Info
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Abstract
Procedimiento de análisis de la predisposición genética de un paciente a una enfermedad autoinmunitaria, que consiste en poner una muestra líquida que contiene al menos un tipo de amplicones, resultantes de la amplificación de al menos una región polimórfica de interés en relación con la enfermedad investigada, a saber la diabetes insulinodependiente, en presencia simultáneamente de sondas elegidas de la manera siguiente ¿ al menos una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0201 y HLA-DQB1*0202 y HLA-DQB1*0302 para la susceptibilidad, ¿ al menos una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0301, HLA-DQB1*0602 y HLA-DQB1*0603 para la protección, y ¿ al menos una sonda específica de otros alelos HLA-DQB1* asociados con la diabetes insulino-dependiente para la neutralidad.
Description
Procedimiento de análisis de la predisposición
genética de un paciente a la diabetes
insulino-dependiente, dispositivo y conjunto de
cebadores.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de análisis de la predisposición genética de un
paciente al menos a una enfermedad llamada diabetes
insulino-dependiente.
La diabetes de tipo 1 (o diabetes
insulino-dependiente) es una enfermedad
caracterizada por la desaparición de las células \beta de
Langerhans productoras de insulina en el páncreas, resultante de un
procedimiento autoinmunitario que se desarrolla en los individuos
genéticamente predispuestos. Junto a factores medioambientales se
observa un componente genético de predisposición.
Cada individuo dispone de un patrimonio genético
propio, heredado de sus ascendientes. Este contexto genético
particular puede a veces participar activamente con la aparición
y/o el desarrollo de ciertas afecciones: infecciones por un agente
patógeno (virus del SIDA por ejemplo), enfermedades
autoinmunitarias (enfermedades reumáticas por ejemplo).
Los genes del complejo mayor de
histocompatibilidad (CMH) particularmente los genes que codifican
para los antígenos HLA ("Human Leukocyte Antigens"
"Antígenos Leucocitarios Humanos"), desempeñan un papel
preponderante en el desarrollo de las patologías
autoimmunitarias:
- \bullet
- no específicas de órganos, por ejemplo articulares tal como la poliartritis reumatoide (Lawrence, 1970; Stastny, 1978; Khan, 1979; Stastny, 1983; Gregersen, 1986; Gregersen, 1987; Stastny, 1988; Todd, 1988; Wordsworth, 1989; Nepom, 1989; Hiraiwa, 1990; Nepom, 1991) o la espondiloartritis anquilosante (Brewerton, 1973; Schlosstein, 1973; Benjamin, 1990), o
- \bullet
- específicas de órganos y más precisamente de glándulas endocrinas tal como el páncreas asociado con la diabetes insulino-dependiente (Komulainen, 1999; Kulmala, 2000).
Ha podido asociarse una parte importante de la
componente genética de la susceptibilidad a la diabetes
insulino-dependiente al marcador principal
vinculado al locus HLA permiten actualmente considerar los alelos
más corrientes entre los cuarenta y cinco (45) alelos
HLA-DQB1 descritos en la nomenclatura
internacional, como alelos de susceptibilidad (alelos S), alelos de
protección (alelos P), alelos neutros (alelos N)
(www.anthonynolan.com/HIG/seq/nuc; octubre de 2000). Se trata
esencialmente de datos validados para poblaciones caucásicas. Por
el momento, la explicación molecular reside en el polimorfismo
observado al nivel del aminoácido 57 de la cadena \beta de la
proteína HLA-DQ (Todd et al., 1988). La
siguiente tabla 1 resume el estado de la diabetes
insulino-dependiente en función de la naturaleza de
este aminoácido en posición 57.
| Estado de la diabetes | Alelos HLA-DQB1* | Aminoácido en posición 57 |
| insulino-dependiente | ||
| S | 02 | Alanina (A) |
| 0302 | ||
| P | 0301 | Ácido aspártico (D) |
| 0602 | ||
| 0603 | ||
| N | Otros | Valina (V) o Serina (S) |
Cada genotipo corresponde a una combinación de
dos alelos. Así, a cada muestra corresponde un genotipo de
predisposición a la diabetes de tipo 1: SS, PP, NN, SP, SN o NP.
Esta explicación molecular también es coherente con la observación
de una gravedad gradual de la enfermedad cuando el genotipo
comprende ningún, uno o dos alelos de susceptibilidad, llamado
comúnmente efecto dosis.
Actualmente en lo que se refiere a la diabetes
insulino-dependiente, un artículo de Cinek et
al. "Screening for the IDDM high-risk
genotype. A rapid microtitre plate method using serum as source of
DNA", Tissue Antigens, 2000, 56, 4, 344-349,
describe un método de análisis. Esta publicación subraya el interés
de desarrollar una prueba de análisis de predisposición genética a
la diabetes insulino-dependiente. Este equipo eligió
un enfoque a partir de suero con una técnica en dos etapas que
resulta completa con respecto a los alelos referidos (algunos
alelos HLA-DQB1 pero también algunos alelos
HLA-DQA1 y algunos alelos HLA=DRB1*04).
El uso de suero es mucho menos cómodo que un
protocolo a partir de una mácula de sangre secada. Además, su
técnica es compleja puesto que:
- \bullet
- se realiza un análisis sobre varios tipos de alelos. Además, se trata de un análisis en dos tiempos de alelos HLA-DQB1 y HLA-DQA, luego de alelos HLA-DRB1*04,
- \bullet
- se utiliza una tecnología complicada para la inmovilización de sondas de captura, con una temperatura de hibridación de 63ºC, lavados a 63ºC luego de 18 a 25ºC y revelado en dos tiempos con estreptavidina peroxidasa (SPOD).
Igualmente, esta técnica no permite de ningún
modo detectar el efecto de la dosis que tiene, sin embargo, una
influencia considerable sobre la predisposición genética de un
paciente a la diabetes insulino-dependiente.
En resumen, estas pruebas sólo pueden realizarse
por los centros especializados en el estudio de los genes HLA,
tales como los centros de transfusiones sanguíneas o ciertos
hospitales especializados. Así pues, esta identificación necesita el
envío de una muestra y el uso de una tecnología bastante difícil.
Por consiguiente, las consecuencias negativas son numerosas, tales
como:
- \bullet
- los riesgos de pérdida de la muestra,
- \bullet
- una larga duración de esta identificación,
- \bullet
- el coste relativamente elevado de dicha identificación, y
- \bullet
- la ausencia de control por el solicitante sobre el prestatario de servicios.
El procedimiento de análisis reivindicado
permite un análisis simplificado en el terreno práctico, más
rápido, de menos de dos horas, tras la preparación de los
amplicones, y poco costoso.
Un artículo de SJOROOS M ET AL:
"Triple-Label Hybridization Assay for
Type-1 Diabetes-Related HLA
Alleles.", BIOTECHNIQUES, vol. 18, nº 5, 1995, páginas
870-877, expone un método de detección de alelos de
tipo 1, dos alelos de susceptibilidad (DQB1*0201 y DQB1*0302) y dos
alelos de protección (DQB1*0602/*0603 y DQB1*0301) para la diabetes
insulino-dependiente. Por eso, se usan en dos
compartimentos diferentes, dos sondas específicas de dos alelos de
susceptibilidad (WO243 y WO248), y dos sondas especificas de tres
alelos de protección (WO329 y WO212). Ninguna sonda permite
detectar toda o parte de los alelos neutros u otros alelos
eventuales de susceptibilidad. Así pues, no es posible analizar la
predisposición de un paciente a una enfermedad autoinmunitaria, tal
como la diabetes insulino-dependiente.
Igualmente, el artículo de TISCH ROLAND ET
AL: "Insulin-dependent diabetes mellitus",
CELL, vol. 85, nº 3, 1996, páginas 291-297 divulga
el uso de sólo algunos alelos de tipo DQB1, a saber: tres alelos de
susceptibilidad, a saber DQB1*0201, DQB1*0302, y DQB1*0502, y tres
alelos de protección, a saber DQB1*0301, DQB1*0303, y DQB1*0602.
Este documento sugiere un método de detección de la diabetes
insulino-dependiente que además de la detección de
alelos DQB1 requiere la detección de alelos de tipo DRB1. Así pues,
este documento no permite tampoco detectar los alelos neutros u
otros alelos eventuales de susceptibilidad y basa estos métodos de
detección en alelos de tipo diferente, a saber
HLA-DQB1 y HLA-DRB1, lo que complica
el método de análisis.
El artículo de TANG ET AL "Primers and
probes for HLA class II typing" THIRTEENTH INTERNATIONAL
HISTOCOMPATIBILITY WORKSHOP del 4 de abril de 2000, extraído de
internet: <URL: http://WWW.ihwg.org/
protocols/ppclassii3.pdf>, corresponde a un manual que describe el conjunto de cebadores y sondas para el tipado del HLA y especialmente del HLA-DQB1, sin precisión adicional. No se describen la existencia de alelos de susceptibilidad, de protección y de neutralidad, el vínculo entre estos alelos ni enfermedades autoinmunitarias. Además, este documento basa igualmente los procedimientos de análisis en la detección de tipos de alelos diferentes de los alelos HLA-DQB1.
protocols/ppclassii3.pdf>, corresponde a un manual que describe el conjunto de cebadores y sondas para el tipado del HLA y especialmente del HLA-DQB1, sin precisión adicional. No se describen la existencia de alelos de susceptibilidad, de protección y de neutralidad, el vínculo entre estos alelos ni enfermedades autoinmunitarias. Además, este documento basa igualmente los procedimientos de análisis en la detección de tipos de alelos diferentes de los alelos HLA-DQB1.
El documento WO 98 37237 A divulga también un
método de detección de alelos HLA-DQB1, a saber
tres grupos de alelos: los alelos de susceptibilidad
(DQB1*0201/*0202, y DQB1*0302/*0303) y un alelo de protección
(DQB1*0602) para la diabetes insulinodependiente. Además, el método
descrito en este documento necesita la detección del alelo DRA. Así
pues, el documento WO 98 37237 A no permite detectar el conjunto de
alelos relativos a la insulinodependencia y describe un método
complejo. El documento FR 2 749 308 A propone sondas de tipado del
HLA DQB1, que pueden servir especialmente como indicador de la
sensibilidad a ciertas enfermedades, tales como la diabetes
insulinodependiente. Sin embargo, estas sondas no permiten detectar
una susceptibilidad, una protección ni una neutralidad con respecto
a una enfermedad autoinmunitaria, y, especialmente, la diabetes
insulinodependiente.
Con este objeto, la presente invención se
refiere a un procedimiento de análisis de la predisposición
genética de un paciente a una enfermedad autoinmunitaria, y que
consiste en poner una muestra líquida que contiene al menos un tipo
de amplicones, resultantes de la amplificación de al menos una
región polimórfica de interés con respecto a la enfermedad buscada,
a saber la diabetes insulinodependiente, en presencia
simultáneamente de sondas elegidas de la manera siguiente:
- \bullet
- al menos una sonda específica de alelos HLA-DQB1*0201 y HLA-DQB1*0202 y HLA-DQB1*0302 para la susceptibilidad,
- \bullet
- al menos una sonda específica de alelos HLA-DQB1*0301, HLA-DQB1*0602 y HLA-DQB1*0603 para la protección; y
- \bullet
- al menos una sonda específica de otros alelos asociados con la diabetes insulino-dependiente para la neutralidad.
Según una variante de realización, las sondas
usadas para detectar la diabetes
insulino-dependiente se definen como a
continuación:
- \bullet
- al menos una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0201, HLA-DQB1*0202, HLA-DQB1*0203, HLA-DQB1*0302, HLA-DQB1*0304, HLA-DQB1*0305, HLA-DQB1*0307 y HLA-DQB1*0308 para la susceptibilidad,
- \bullet
- al menos una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*03011, HLA-DQB1*03012, HLA-DQB1*03032, HLA-DQB1*03033, HLA-DQB1*0304, HLA-DQB1*0306, HLA-DQB1*0308, HLA-DQB1*0309, HLA-DQB1*0310, HLA-DQB1*0602, HLA-DQB1*0603, HLA-DQB1*0608, HLA-DQB1*0610, HLA- DQB1*06111, HLA-DQB1*06112, HLA-DQB1*0612, HLA-DQB1*0613, HLA-DQB1*0614 y HLA-DQB1*0616 para la protección, y
- \bullet
- al menos una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0306, HLA-DQB1*0401, HLA-DQB1*0402, HLADQB1*05011, HLA-DQB1*05012, HLA-DQB1*0502, HLA-DQB1*05031, HLA-DQB1*05032, HLA-DQB1*06011, HLA-DQB1*06012, HLA-DQB1*06013, HLA-DQB1*06051, HLA-DQB1*06052, HLA-DQB1*0606, HLA-DQB1*0609, HLA-DQB1*06112 y HLA-DQB1*0612 para la neutralidad.
Más precisamente, y en cada variante mencionada
anteriormente, las sondas usadas para detectar la susceptibilidad
con respecto a la diabetes insulino-dependiente se
definen como a continuación:
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0201, HLA-DQB1*0202 y HLA-DQB1*0203, y
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0302, HLA-DQB1*0304, HLA-DQB1*0305, HLA-DQB1* 0307 y HLA-DQB1*0308.
Según este último caso, las sondas usadas para
detectar la susceptibilidad con respecto a la diabetes
insulino-dependiente están constituidas por al
menos diez (10) nucleótidos sucesivos tomados de las secuencias
siguientes:
- \bullet
- SEQ ID NO 5 (TCTTgTgAgCAgAAgC), y
- \bullet
- SEQ ID NO 6 (CCgCCTgCCgCCgA).
Más precisamente y en cada variante mencionada
anteriormente, las sondas usadas para detectar la protección con
respecto a la diabetes insulino-dependiente se
definen como a continuación:
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*03011, HLA-DQB1*03012, HLA-DQB1*0304 y HLA-DQB1*0309,
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*03011, HLA-DQB1*03012, HLA-DQB1*03032, HLA-DQB1*03033, HLA-DQB1*0306, HLA-DQB1*0309 y DQB1*0310, y
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0308, HLA-DQB1*0602, HLA-DQB1*0603, HLA-DQB1* 0608, HLA-DQB1*0610, HLA-DQB1*06111, HLA-DQB1*06112, HLA-DQB1*0612, HLA-DQB1* 0613, HLA-DQB1*0614 y HLA-DQB1*0616.
Según este último caso, las sondas usadas para
detectar la protección con respecto a la diabetes
insulino-dependiente están constituidas por al menos
diez (10) nucleótidos sucesivos tomados de las secuencias
siguientes:
- \bullet
- SEQ ID NO 7 (AggggACCCgggCggA),
- \bullet
- SEQ ID NO 8 (gACgTggAgTgTACC), y
- \bullet
- SEQ ID NO 9 (gCCgCCTgACgCCg).
Más precisamente y en cada variante mencionada
anteriormente, las sondas usadas para detectar la neutralidad con
respecto a la diabetes insulino-dependiente se
definen como a continuación:
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0306, HLA-DQB1*040 y HLA-DQB1*0402,
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*05011, HLA-DQB1*05012, HLA-DQB1*0502, HLA-DQB1*05031 y HLA-DQB1*05032,
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*06011, HLA-DQB1*06012 y HLA-DQB1*06013, y
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*06051, HLA-DQB1*06052, HLA-DQB1*0606, HLA-DQB1*0609, HLA-DQB1*06112 y HLA-DQB1*0612.
Según este último caso, las sondas usadas para
detectar la neutralidad con respecto a la diabetes insulino-
dependiente están constituidas por al menos diez (10) nucleótidos sucesivos tomados de las secuencias siguien-
tes:
dependiente están constituidas por al menos diez (10) nucleótidos sucesivos tomados de las secuencias siguien-
tes:
- \bullet
- SEQ ID NO 10 (ggggCCCgggCgTC).
- \bullet
- SEQ ID NO 11 (AggAggACgTgCgC),
- \bullet
- SEQ ID NO 12 (TCTTgTAACCAgATAC), y
- \bullet
- SEQ ID NO 13 (ggTggACACCgTATgCAg).
En todos los casos de ejemplo, se usa al menos
una sonda de control positivo, que puede hibridarse con el conjunto
de genes HLA-DQB1, para permitir la detección de
todos los alelos HLA-DQB1.
Además, se sustituye a lo sumo un 38,89%,
preferiblemente a lo sumo un 20%, de las bases de una misma sonda
por al menos una base análoga, tal como la inosina. Tales valores
pueden deducirse de una solicitud de patente anterior presentada
por el solicitante con el número PCT FROO/01385 con prioridad de 20
de junio de 1999 y de 6 de diciembre de 2000. Se da una definición
de una base análoga en el desarrollo de la descripción.
Antes del procedimiento de análisis de la
predisposición genética de un paciente a una enfermedad
autoinmunitaria, tal como la descrita anteriormente, se realiza al
menos una amplificación del gen HLA-DQB1.
Preferiblemente, los cebadores de amplificación
son biotinilados, de modo que los amplicones también son
biotinilados.
Antes de la amplificación, se trata la muestra
biológica extraída, preferiblemente en forma de mácula de sangre
secada, con vista a la extracción de ácidos nucleicos.
Esta extracción de los ácidos nucleicos se
realiza en una mezcla reactiva que ya contiene los
desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTP), que luego se usarán en
el momento de la amplificación, y eso antes de la incubación.
En este último caso, después de la incubación,
se añaden en la mezcla reactiva, desoxirribonucleótidos trifosfatos
(dNTP), que se usarán también en el momento de la amplificación
posterior.
La invención se refiere también a un dispositivo
que permite poner en práctica un procedimiento tal como el descrito
anteriormente, en el que según una primera variante de
realización, se fija cada tipo de sondas DBQ1 específicas de la
susceptibilidad, de la protección de la neutralidad en un
compartimiento independiente, tal como un pocillo de una placa de
microtitulación, independientemente de otras sondas. Según una
segunda variante de realización, se fija cada tipo de sondas usadas
para detectar la susceptibilidad o la protección con respecto a la
diabetes insulino-dependiente en un compartimiento
independiente, tal como un pocillo de una placa de microtitulación,
independientemente de otras sondas usadas para detectar esta
susceptibilidad o esta protección, y se fijan todos o parte de los
diferentes tipos de sondas usadas para detectar la neutralidad con
respecto a la diabetes insulino-dependiente al menos
en un pocillo de una placa de microtitulación.
También pueden fijarse dos tipos de sondas
específicas diferentes en un mismo compartimento independiente, tal
como un mismo pocillo de una placa de microtitulación, sin
interacción entre ellas.
Según otra variante de realización, se fija el
conjunto de tipos de sondas usadas para detectar la susceptibilidad
o la protección o la neutralidad con respecto a la diabetes
insulino-dependiente en un único y mismo
compartimento, tal como un pocillo de una placa de
microtitulación.
En el caso de que un compartimento, tal como un
mismo pocillo de una placa de microtitulación, contenga un único
tipo de sondas usadas para detectar la susceptibilidad o la
protección, se efectúa el procedimiento de revelado de las
hibridaciones realizadas con el dispositivo mediante un revelado
colorimétrico no localizado poniendo en juego una reacción
enzimática. Por ejemplo, puede tratarse de un revelado de las
hibridaciones realizadas entre cada tipo de sonda y los amplicones
mediante la peroxidasa.
En el caso de que un compartimento, tal como un
mismo pocillo de una placa de microtitulación, contenga al menos
dos tipos de sondas usadas para detectar la susceptibilidad o la
protección, se efectúa el procedimiento de revelado de las
hibridaciones realizadas con un dispositivo mediante un revelado
localizado. Por ejemplo, puede tratarse de un revelado de las
hibridaciones realizadas entre cada tipo de sonda y los amplicones
mediante fluorescencia o radioactividad.
Además, se fijan las sondas de captura que
permiten la hibridación de secuencias que corresponden al gen
HLA-DQB1, con vista al análisis de la
predisposición genética de un paciente a la diabetes
insulino-dependiente, en el fondo de un pocillo de
una placa de microtitulación o sobre una perla mediante un brazo
aminado o de biotina situado(a) en posición 5' de las
sondas.
Los ejemplos adjuntos se dan a título de ejemplo
explicativo y no tienen ningún carácter limitativo. Permitirán la
mejor comprensión de la invención.
Los ejemplos adjuntos se dan a título de ejemplo
explicativo y no tienen ningún carácter limitativo. Permitirán la
mejor comprensión de la invención.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de detección de las enfermedades genéticas que
resulta rápido y barato. Esta nueva tecnología puede utilizarse con
todas las enfermedades genéticas y en particular con la
poliartritis reumatoide, la espondiloartritis anquilosante, la
diabetes insulino-dependiente y otras enfermedades
autoinmunitarias, tales como las colagenosis (lupus, escleroderma,
...) que se encuentran también en el momento de la consulta de
reumatología.
Se trata de un procedimiento dedicado al
análisis de predisposiciones genéticas de un individuo a ciertas
enfermedades, mediante una técnica de biología molecular que
permite el análisis simultáneo al menos de un gen. Este
procedimiento puede aplicarse ventajosamente al análisis de las
predisposiciones genéticas de un individuo, para una enfermedad o
un conjunto de enfermedades emparentadas, asociada(s) a uno o
varios genes. Este procedimiento puede aplicarse al análisis de
las predisposiciones de un individuo a ciertas enfermedades
autoinmunitarias, es decir la diabetes
insulino-dependiente, relativa a un órgano, en el
caso presente el páncreas.
El interés de este procedimiento es obtener en
una etapa, con una prueba múltiple pero única, un conjunto completo
de informaciones pertinentes de interés clínico (diagnóstico,
pronóstico y de orientación terapéutica). El procedimiento se
descompone en varias etapas:
- 1)
- extracción de ácidos nucleicos a partir de una muestra biológico del individuo,
- 2)
- amplificación de las regiones de interés, para las que se ha descrito un polimorfismo asociado con una predisposición genética a una patología, y
- 3)
- análisis simultáneo de los amplicones, usando un conjunto de reacciones de hibridación poniendo en práctica un juego de sondas moleculares que permite el análisis preciso de alelos o de grupos de alelos dados.
Por compartimiento, debe entenderse cada soporte
sólido plano o cóncavo, es decir formando una cubeta, que permite
alojar o bien:
- \bullet
- en un primer caso, una cantidad de un líquido sin que este líquido tenga interacción con otras partes alícuotas de este líquido u otros líquidos presentes al nivel de compartimiento(s) eventual(es) adyacente(s),
- \bullet
- en un segundo caso, varias cantidades iguales o diferentes entre si mismas de un mismo líquido o de líquidos diferentes sin que este líquido o líquidos tenga(n) interacción con otras partes alícuotas de este líquido u otros líquidos presentes al nivel de compartimiento(s) eventual(es) adyacente(s).
Un dispositivo que permite realizar estos
depósitos de cantidades de líquido(s), que pueden ir de
algunos cientos de microlitros, en el primer caso, a 0,5
nanolitros, en el segundo caso, así como el procedimiento puesto en
práctica mediante un dispositivo tal y los soportes realizados con
el procedimiento mediante el dispositivo ya se describieron bien en
una solicitud de patente presentada el 15 de noviembre de 2000 por
el solicitante, con el número FR00/
14691.
14691.
En el segundo caso, las diferentes cantidades de
líquido(s) repartidas en un único compartimiento son
volúmenes muy bajos, generalmente inferiores al microlitro y forman
puntos ("spots") en la superficie de dicho compartimiento. El
volumen de disolución por gota está comprendido entre 0,5
nanolitros y 1 microlitro, preferiblemente entre 1 nanolitro y 200
nanolitros.
El término soporte sólido, tal como se utiliza
en la definición anterior, incluye todos los materiales sobre los
que puede inmovilizarse un analito, y en nuestro caso un ácido
nucleico. Pueden utilizarse materiales naturales, de síntesis,
modificados o no químicamente como soporte sólido, especialmente
polímeros tales como poli(cloruro de vinilo), polietileno,
poliestireno, poliacrilato, poliamida, o copolímeros a base de
monómeros vinil-aromáticos, ésteres alquílicos de
ácidos \alpha-insaturados o
\beta-insaturados, esteres de ácidos carboxílicos
insaturados, cloruro de vinilideno, dienos o compuestos que
presentan funciones nitrilo (acrilonitrilo); polímeros de cloruro
de vinilo y de propileno, polímero de cloruro de vinilo y acetato
de vinilo, copolímeros a base de estirenos o derivados sustituidos
del estireno; fibras sintéticas tales como el nylon, la
nitrocelulosa; materiales inorgánicos tales como sílice, vidrio,
cerámica, cuarzo; látex; partículas magnéticas; derivados
metálicos.
El soporte sólido según la invención puede
estar, sin limitación, en forma de una placa de microtitulación, de
una lámina, de un tubo, de un pocillo, de partículas o de un
soporte plano como una pastilla, generalmente llamada oblea
("wafer"), de sílice o silicio. Preferiblemente, al menos una
parte del soporte es plano como una oblea de silicio o el fondo de
un pocillo de una placa de microtitulación. Preferiblemente, este
compartimiento está constituido por un pocillo de placa de
microtitulación.
El soporte sólido es hidrófilo y/o hidrófobo en
función de las aplicaciones y de la naturaleza de la disolución que
contiene el o los analitos. Por ejemplo, se utilizan zonas
hidrófilas para el depósito, estando delimitadas dichas zonas
hidrófilas por zonas hidrófobas lo que permite controlar mejor el
diámetro de los puntos.
Mediante revelado de una hibridación, debe
entenderse que se usa un polinucleótido marcado por un reactivo de
marcación. Por reactivo de marcación, se entiende un trazador que
genera directamente o indirectamente una señal detectable.
Una lista no limitativa de estos trazadores
sigue a continuación:
- \bullet
- las enzimas, como la peroxidasa de rábano, la fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que producen un señal detectable en presencia de un sustrato adaptado, que se añade, por ejemplo, mediante colorimetría, fluorescencia, luminescencia, o
- \bullet
- los cromóforos como los compuestos fluorescentes, luminiscentes, colorantes, o
- \bullet
- los agrupamientos con densidad electrónica detectable mediante microscopía electrónica o por su propiedad eléctrica como la conductividad, la amperometría, la voltametría, las medidas de impedancia, o
- \bullet
- los agrupamientos detectables mediante métodos ópticos como la difracción, la resonancia de plasmón superficial, la variación de ángulo de contacto o físicos como la espectroscopia de fuerza atómica, el efecto túnel, o
- \bullet
- las moléculas radiactivas como el ^{32}P, el ^{35}S o el ^{125}I
Preferiblemente, el trazador es un compuesto
fluorescente de impedimento estérico débil como la fluoresceína, el
dansilo, los cromóforos del tipo IR (Li-COR Inc,
Lincoln NE, EE.UU. de América), Cy5 y Cy3 (Randolph J.B. y al,
Nucleic Acids Res., 25(14), págs. 2923-2929,
1997) y sus derivados. Por impedimento estérico débil, se entiende
un peso molecular inferior a 1000 g/mol.
El procedimiento de detección de un ácido
nucleico diana en una muestra en la que se pone en contacto este
ácido nucleico diana, eventualmente pretratado, con además el
nucleótido funcionalizado con objeto de generar un polinucleótido
funcionalizado, y marcar dicho polinucleótido con el reactivo de
marcación, después detectar dicho polinucleótido marcado.
Por pretratamiento, se entiende las diferentes
etapas de tratamiento de la muestra para hacer accesible el ácido
nucleico diana, como por ejemplo, la lisis, la fluidificación, la
concentración.
Por "al menos una sonda específica de otros
alelos asociados con la diabetes
insulino-dependiente para la neutralidad", debe
entenderse al menos una sonda específica de todos o parte de los
alelos que constituyen el HLA-DQB1, alelos que no
se han definido como que constituyen alelos de susceptibilidad o de
protección a la diabetes insulinodependiente. Generalmente, se
eligen las sondas en función de la prevalencia de alelos
reconocidos; así cuanto más prevalerte es un alelo más se implica
al nivel de las sondas específicas de neutralidad.
Puede tratarse también, sola o en combinación
con al menos una de las sondas anteriores, de al menos una sonda
específica de todos o parte de los alelos que constituyen el
HLA-DR3 y/o el HLA-DR4. Así,
numerosos artículos ponen en evidencia que esos haplotipos pueden
tener un impacto:
\bulletPark Y.S., She J.X.,
Noble J.A., Erlich H.A. y Einsenbarth G.S.,
Tissue Antigens 2001: 57: 185-191:
"Transracial evidence for the influence of the homologous HLA
DR-DQ haplotype on transmission of HLA DR4
haplotypes to diabetic children",
\bulletKockum I., Sanjeevi
C.B., Eastman S., Landin-Olsson M.,
Dahlquist G., Lernmark A. et al., European
Journal of Immunogenetics 26, 361-372:
"Complex interaction between HLA DR and DQ in conferring risk for
childhood type 1 diabetes",
\bulletUndlien D.E., Kockum I.,
Ronningen K.S., Lowe R., Sanjeevi C.B.,
Graham J., Lie B.A., Akselsen H.E.,
Lernmark A. y Thorsby E., Tissue Antigens
1999: 54, 543-551: "HLA associations in
type A diabetes among pacients not carrying
high-risk DR3-DQ2 or
DR4-DQ8 haplotypes",
\bulletDonner H., Seidl C., Van
der Auwera B., Braun J., Siegmund T.,
Herwig J., Weets I., The Belgian Diabetes Registry,
Usadel K.H. et Badenhoop K., Tissue Antigens 2000: 55:
271-274: "HLA-DRB1*04 and
susceptibility to type 1 diabetes mellitus in a Gennan/Belgian
family and German case-control study",
\bulletRedondo M.J., Kawasaki
E., Mulgrew C.L., Noble J.A., Erlich H.A.,
Freed B.M., Lie B.A., Thorsby E.,
Einsenbarth G.S., Undlien D.E., Kockum I. y
Ronningen K.S., The Journal of Clinical Endocrinology
& Metabolism, 2000: Vol. 55, Nº 10:
3793-3797: "DR- and DQ-Associated
Protection from Type lA Diabetes: Comparison of DRB1*1401 and DQA1
*0102-DQB1*0602"
Por amplificación, debe entenderse que los
polinucleótidos funcionalizados se generan por una reacción de
amplificación enzimática que actúa sobre el ácido nucleico diana que
sirve de matriz. Los artículos de Lewis (1992. Genetic Engineering
News, 12, págs. 1-9) por una parte, y de Abramson y
Myers (1993. Curr. Opin. Biotechnol., 4, págs.
41-47), por otra parte, dan ejemplos de
amplificación de diana. La técnica de amplificación enzimática se
selecciona, por ejemplo, de entre las técnicas NASBA ("Nucleic
Acid Sequence Based Amplification" "Amplificación Basada en
Secuencia de Ácido Nucleico"), TMA ("Transcription Mediated
Amplification" "Amplificación Mediada por Transcripción")
RT-PCR ("Reverse
Transcriptase-Polimerase Chain Reaction"
"Reacción en Cadena de la Polimerasa-Transcriptasa
Inversa"), PCR ("Polimerase Chain Reacción" "Reacción en
Cadena de la Polimerasa"), SDA ("Strand Displacement
Amplification" "Amplificación por Desplazamiento de la
Cadena") o LCR ("Ligase Chain Reaction" "Reacción en
Cadena de la Ligasa").
Por base análoga, debe entenderse un nucleótido
modificado que generalmente se incorpora en un polinucleótido. Se
constituye un polinucleótido por encadenamiento de al menos dos
desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que comprenden
eventualmente al menos un nucleótido modificado, por ejemplo al
menos un nucleótido que comprende una base modificada, tal como la
inosina, la metil-5-desoxicitidina,
la dimetilamino-5-desoxiuridina, la
desoxiuridina, la
diamino-2,6-purina, la
bromo-5-desoxiuridina, la nebularina
o cualquier otra base modificada que permita la hibridación. Este
polinucleótido también puede modificarse a nivel:
- \bullet
- de la unión internucleotídica, como por ejemplo los fosforotioatos, los H-fosfonatos, los alquil-fosfonatos, o
- \bullet
- del esqueleto, como por ejemplo los \alpha-oligonucleótidos (documento FR-A-2.607.507) o los PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 114, págs. 1895-1897, 1992 o los 2'-O-alquil-ribosa.
Todas estas modificaciones pueden tomarse en
combinación.
El polinucleótido puede ser un oligonucleótido,
un ácido nucleico natural o uno de sus fragmentos como un ADN,_ un
ARN ribosómico, un ARN mensajero, un ARN de transferencia, un ácido
nucleico obtenido por una técnica de amplificación enzimática.
Pueden utilizarse los distintos protocolos
clásicos de extracción de ADN a partir de muestras de sangre
completa sacada con un anticoagulante, como EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético) o pueden utilizarse citrato o heparina.
Así, puede tratarse de un protocolo con una etapa de extracción con
fenol o con etapas de lisis de glóbulos rojos y luego de glóbulos
blancos (Kimura et al., 1992).
En la práctica y según el modo de realización,
esta extracción se realiza de manera totalmente clásica. De hecho,
puede utilizarse cualquier técnica de extracción de ADN, que
permita obtener material susceptible de ser amplificado
posteriormente por un procedimiento de amplificación como la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Esas técnicas de lisis
de células, con la extracción y luego purificación de los ácidos
nucleicos son las que habitualmente se recomiendan para los
análisis genéticos o las técnicas rápidas que utilizan productos
comerciales, tales como el kit de Sangre QIAmp (Marca registrada)
de QIAGEN S.A.
En la bibliografía se describen diferentes
protocolos de extracción de ADN a partir de sangre secada.
En primer lugar hay una primera técnica de Jinks
et al., Hum. Genet. 1989, 81: 363-366. Ésta
consiste en depositar sangre sobre papel Schleicher & Schuell
nº 903. Las máculas se secan a una temperatura comprendida entre 18
y 25ºC, durante varias horas. Se cortan cuatro pastillas de 3 mm de
diámetro, y se sitúan en un tubo de 1,5 ml y se fijan por adición de
30 \mul de metanol, luego se efectúa una evaporación. A
continuación se añaden 60 \mul de agua y se lleva a ebullición
durante 15 minutos. Después se centrifuga 15 minutos a 10.000 g.
Finalmente se saca el sobrenadante para la etapa siguiente, la
amplificación por PCR.
La segunda técnica es la de de Hezard et
al., Thrombosis Research, 1997, 88, 1, 59-66.
Se recoge sangre con EDTA o con citrato o con heparina, y se
deposita sobre un papel de filtro (Guthrie). Se sitúa directamente
una pastilla de 1 mm de diámetro en 50 \mul de mezcla de reacción
para la amplificación posterior. Se incuba 15 minutos a 94ºC. Y
finalmente, se adiciona Taq polimerasa, y luego se amplifica por
PCR.
Finalmente, desde el año 2000, la sociedad
Molecular Innovations Inc. comercializa un sistema de extracción de
ADN, que constituye la tercera técnica, situado en el interior
mismo del tubo de amplificación (Xtra Amp (marca registrada)
Extraction System, Molecular Innovations Inc. Ref. 660). Se ha
evaluado este producto, con vista a extraer el ADN a partir de la
mácula de sangre. Se recoge la sangre con EDTA o ACD, se deposita
sobre papel Schleicher & Schuell ref. 322187. Se sitúa una
pastilla de 3 mm de diámetro en un microtubo de 1,5 ml que contiene
75 \mul de tampón de lisis ("Lysis Buffer"). Se incuba 10
minutos a una temperatura comprendida entre 18 y 25ºC. Luego, se
centrifuga 5 minutos a 12.000 g. A continuación se saca el
sobrenadante y se transfiere a un tubo Xtra Amp (marca registrada).
Se aspira y se expulsa varias veces y luego se elimina el
sobrenadante. Se lava tres veces con 200 \mul de tampón de lavado
("Wash Buffer"). Después se añaden 45 \mul de mezcla de
reacción para la amplificación por PCR y 5 \mul de tampón de
intensificación de la amplificación ("Amp Enhance Buffer").
Finalmente, se procede a la amplificación añadiendo tres ciclos al
programa de amplificación habitual.
Con los tres protocolos descritos anteriormente,
se ha observado una amplificación del HLA-DQB1, con
buenos resultados que pueden explotarse para la prueba ELOSA
("Enzyme Linked OligoSorbent Assay" "Ensayo de Oligosorbente
ligado a Enzimas") puesto a punto según la presente invención,
en aproximadamente un 50% de los casos. Esta técnica ELOSA se
describe bien en la patente
EP-B-0.486.661 del solicitante o en
el artículo de F. Mallet et al., Journal of Clinical
Microbiology, Junio de 1993, págs. 1444-1449.
Sin embargo, conviene desarrollar un protocolo
de extracción a partir de máculas de sangre, un protocolo que sea
robusto e indispensable para las aplicaciones de análisis de
rutina. Así el solicitante ha desarrollado una cuarta técnica que
consiste en:
- \bullet
- recoger la sangre con EDTA, depositado sobre papel Schleicher & Schuell nº 903 (ref. 322187),
- \bullet
- recortar la mácula de sangre con la ayuda de una perforadora de Schleicher & Schuell (pastilla de 3 mm de diámetro),
- \bullet
- descontaminar la perforadora con la ayuda de HCl 0,25 N durante 5 minutos (despurinación del ADN), después de cada mácula de sangre,
- \bullet
- colocar la pastilla en un tubo de PCR de 0,5 ml,
- \bullet
- añadir 50 \mul de una mezcla reacción que contiene 5 \mul de tampón de amplificación concentrado diez veces (10 X), 0,5 \mul de mezcla de dNTP (200 mM) y H_{2}O en cantidad suficiente hasta 50 \mul,
- \bullet
- incubar 15 minutos a 100ºC (se recomienda utilizar un termociclador),
- \bullet
- retirar la pastilla,
- \bullet
- centrifugar brevemente a 1.000 g por una centrifugadora de mesa de laboratorio clásica, y
- \bullet
- sacar 25 \mul de sobrenadante para la reacción de amplificación.
De manera sorprendente, el medio reactivo que va
a retomar la sangre presente sobre cada pastilla contiene los
desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTP), es decir los dATP, dCTP,
dGTP y dTTP. Se trata de moléculas biológicas que el experto en la
técnica trata, más bien, de proteger de las temperaturas elevadas.
Ahora bien, se comprueba que en el protocolo puesto a punto por el
solicitante, se somete a continuación dicho medio de reacción a una
temperatura de 100ºC durante 15 minutos. Los resultados de
amplificación que se obtienen más tarde con los ácidos nucleicos
extraídos según esta técnica son mucho más eficaces que los
obtenidos con las tres primeras técnicas expuestas.
En todos los casos de ejemplo, los cebadores
utilizados son los cebadores utilizados en la bibliografía (XIth
HLA Workshop Primers; Kimura, 1992). La siguiente tabla 2 expone
los dos cebadores que permiten la amplificación locus de interés
que corresponde al gen HLA-DQB1. Así pues, estos
dos cebadores encuadran a este gen.
| Nº de secuencia | Secuencia (5' > 3') | Denominación |
| científica | ||
| SEQ ID NO 1 | CATgTgCTACTTCACCAACgg | DQBAMP-A |
| SEQ ID NO 2 | CTggTAgTTgTgTCTgCACAC | DQBAMP-B |
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de reacción contiene los siguientes
constituyentes diferentes:
- \bullet
- tampón 10X (Perkin Elmer, ref. N 808-0171) 5 \mul,
- \bullet
- dNTP 200 mM (Pharmacia, ref. 27-2094 0,5 \mul (0,2 mM final),
- \bullet
- mezcla de cebadores (30 \muM de cada uno) 0,5 \mul (0,3 \muM final),
- \bullet
- Taq polimerasa (AmpliTaq, Perkin Elmer, ref. N 808-0171, 5 U/\mul) 0,3 \mul (1,5 U),
- \bullet
- ADN (aproximadamente 100 ng/\mul) 5 \mul (aproximadamente 500 ng), y
- \bullet
- H_{2}O en cantidad suficiente hasta 50 \mul.
Además, el programa de amplificación es el
siguiente:
- \bullet
- 2 minutos a 95ºC, luego
- \bullet
- 35 ciclos sucesivos con las etapas siguientes para cada ciclo:
- \sqbullet
\hskip0,1cm
. 30 segundos a 95ºC,
- \sqbullet
\hskip0,1cm
. 30 segundos a 55ºC, y
- \sqbullet
\hskip0,1cm
. 30 segundos a 72ºC,
- \bullet
- 7 minutos a 72ºC.
A continuación, si se desea conservar el
producto de reacción, se mantiene el tubo que contiene los
amplicones que acaban de obtenerse a la temperatura de 9ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de reacción contiene los siguientes
constituyentes diferentes:
- \bullet
- tampón 10X (Perkin Elmer, ref. 27-2094) 5 \mul,
- \bullet
- dNTP 200 mM (Pharmacia, ref. N 808-0171) 0,5 \mul,
- \bullet
- mezcla de cebadores (30 \muM de cada uno) 0,5 \mul (0,3 \muM final),
- \bullet
- Taq polimerasa (AmpliTaq, Perkin Elmer, ref. N 808-0171, SU/\mul) 0,3 \mul (1,5 U),
- \bullet
- ADN 25 \mul, y
- \bullet
- H_{2}O en cantidad suficiente hasta 50 \mul.
Además, el programa de amplificación es el
siguiente:
- \bullet
- 2 minutos a 95ºC, luego
- \bullet
- 35 ciclos sucesivos con las etapas siguientes para cada ciclo:
- \sqbullet
\hskip0,1cm
. 30 segundos a 95ºC,
- \sqbullet
\hskip0,1cm
. 30 segundos a 55ºC, y
- \sqbullet
\hskip0,1cm
. 30 segundos a 72ºC,
- \bullet
- 7 minutos a 72ºC.
A continuación, si se desea conservar el
producto de reacción, se mantiene el tubo que contiene los
amplicones que acaban de obtenerse a la temperatura de 9ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha realizado un dispositivo basado en el
principio de la prueba ELOSA para el análisis del marcador
HLA-DQB1, con forma de una tira de ocho pocillos
sacada de una placa de microtitulación, con una sonda de detección
acoplada a la peroxidasa (POD) para el revelado colorimétrico.
Se han utilizado en cada uno de esos ocho
pocillos de las sondas específicas. de captura. Estas sondas son,
de hecho, oligonucleótidos sintetizados con un brazo aminado en 5',
tales como las descritas en las patentes
US-A-5.510.084 y
EP-B-0.549.776 presentadas por el
solicitante. Es este brazo aminado en 5', de estructura particular,
el que permite la fijación de las sondas en el fondo de la placa.
Así pues, debe entenderse que el extremo 5' de las sondas
utilizadas poseen este brazo, aunque no se precise a
continuación.
La distribución de las sondas de captura a nivel
de los pocillos se precisa en la tabla 3, mientras que los alelos
dianas posibles para cada sonda de captura de la tabla 3 se
precisan en la siguiente tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
| Nº de secuencia | Secuencia (5' > 3') | Denominación |
| bioMérieux | ||
| SEQ ID NO 3 | CgCTTCgACAgCgACgTgggg | C+ |
| SEQ ID NO 4 | TATgAAACTTATggggATAC | C- |
| SEQ ID NO 5 | TCTTgTgAgCAgAAgC | 26c |
| SEQ ID NO 6 | CCgCCTgCCgCCgA | 57f |
| SEQ ID NO 7 | AggggACCCgggCggA | 70b |
| SEQ ID NO 8 | gACgTggAggTgTACC | 45a |
| SEQ ID NO 9 | gCCgCCTgACgCCg | 57e |
| SEQ ID NO 10 | ggggCCCgggCgTC | 70a |
| SEQ ID NO 11 | AggAggACgTgCgC | 37b |
| SEQ ID NO 12 | TCTTgTAACCAgATAC | 26b |
| SEQ ID NO 13 | ggTggACACCgTATgCAg | 70c |
| Nº de secuencia | Especificidad HLA-DQB1* | Sensibilidad/enfermedad |
| SEQ ID NO 3 | Todos | Ninguna |
| SEQ ID NO 4 | Ninguno | Ninguna |
| SEQ ID NO 5 | 0201, 0202, 0203 | Susceptibilidad |
| SEQ ID NO 6 | 0302, 0304, 0305, 0307, 0308 | Susceptibilidad |
| SEQ ID NO 7 | 0602,0603,0608,0610,06111,06112, 0612, | Protección |
| 0613, 0614, 0616, 0308 | ||
| SEQ ID NO 8 | 03011, 03012, 0304, 0309 | Protección |
| SEQ ID NO 9 | 03011, 03012, 03032, 03033, 0306, 0309, 0310 | Protección |
| SEQ ID NO 10 | 05011, 05012, 0502, 05031, 05032 | Neutralidad |
| SEQ ID NO 11 | 06011,06012,06013 | Neutralidad |
| SEQ ID NO 12 | 06051, 06052, 0606, 0609, 06112, 0612 | Neutralidad |
| SEQ ID NO 13 | 0306, 0401, 0402 | Neutralidad |
En la tabla 3, el pocillo C+ comprende un
control positivo (SEQ ID NO 3), que permite la detección de todos
los alelos del gen HLA-DQB1*, lo que permite
controlar que la amplificación ha afectado a la región de interés
comprendida entre los cebadores de SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2
descritas en la tabla 1. El control negativo (SEQ ID NO 4) no tiene
objetivo diagnóstico, está presente sólo para responder a ciertas
normas. Esta secuencia no es en absoluto específica del HLA, y
corresponde a una secuencia aleatoria que no se encuentra en los
genes HLA.
Las otras sondas, comprendidas entre SEQ ID NO 5
y SEQ ID NO 13, tienen por el contrario un fin diagnóstico de la
predisposición genética de un paciente a una enfermedad, y más
precisamente a la diabetes insulino-dependiente.
Se observa que la sonda SEQ ID NO 5 es una sonda
que detecta una susceptibilidad a la enfermedad, es decir a la
diabetes insulino-dependiente. Es específica de
alelos importantes de esta susceptibilidad a esta enfermedad, a
saber los alelos HLA-DQB1*0201 y
HLA-DQB1*0202. En la tabla 4 se representan en
negrita estos alelos importantes.
Igualmente, la sonda SEQ ID NO 6 es una sonda
que detecta también una susceptibilidad a la diabetes
insulinodependiente. Es específica de un alelo importante de esta
susceptibilidad a esta enfermedad, a saber el alelo
HLA-DQB1*0302.
La sonda SEQ ID NO 7 es una sonda que detecta
una protección contra la enfermedad, es decir contra la diabetes
insulino-dependiente. Ésta es específica de alelos
importantes de esta protección contra esta enfermedad, a saber los
alelos HLA-DQB1*0602 y
HLA-DQB1*0603.
Igualmente, la sonda SEQ ID NO 8 es una sonda
que detecta también una protección contra la diabetes
insulinodependiente. Ésta es específica de un alelo importante de
esta protección contra esta enfermedad; a saber el alelo
HLA-DQB1*0301, ya esté éste en su forma
HLA-DQB1*03011 y HLA-DQB1*03012.
La sonda SEQ ID NO 9 es una sonda que detecta
también una protección contra la diabetes insulinodependiente,
puesto que permite también detectar el alelo
HLA-DQB1*0301, ya esté este en su forma
HLA-DQB1*03011 o HLA-DQB1*03012. El
interés de esta sonda es que permite la detección del alelo
HLA-DQB1*03032, que es bastante frecuente y debe
ser protector con respecto a su secuencia a nivel de la posición
57.
Debe observarse que las dos sondas SEQ ID NO 6 y
SEQ ID NO 7, una de susceptibilidad y otra de protección con
respecto a la diabetes insulino-dependiente,
permiten detectar el alelo HLA-DQB1*0308. Conviene
precisar que este alelo es muy raro. Así pues, las posibilidades de
encontrarlo son ínfimas y las posibilidades de encontrar un
homocigoto de HLA-DQB1*0308 y
HLA-DQB1*0308 son casi nulas. Asimismo, puede
aplicarse el mismo razonamiento para las dos sondas SEQ ID NO 6 y
SEQ ID NO 8, una de susceptibilidad y otra de protección con
respecto a la diabetes insulino-dependiente. Ambas
permiten detectar el alelo HLA-DQB1*0304. Este
alelo también es muy raro.
En estos dos casos, no existe ningún problema
para que estas dos sondas, una de susceptibilidad y otra de
protección, puedan detectarlos, porque la prevalencia es muy
baja.
Se trata de un oligonucleótido con brazo aminado
en 5', acoplado a la peroxidasa (POD). La tabla 5 precisa su
estructura.
\vskip1.000000\baselineskip
| Nº de secuencia | Secuencia (5' > 3') | Denominación |
| bioMérieux | ||
| SEQ ID NO 14 | TggAACAgCCAgAAggA | D4-POD |
\vskip1.000000\baselineskip
Por supuesto esta sonda de detección se
selecciona para que sea complementaria al conjunto de amplicones
diana que pudieran enganchar las sondas de captura SEQ ID NO 3 y
SEQ ID NO 5 a la SEQ ID NO 13, presentadas en las tablas 3 y 4.
En primer lugar, la preparación de las dianas
consiste en:
- \bullet
- transferir la totalidad de los amplicones (50 \mul) en un microtubo de 1,5 ml,
- \bullet
- añadir 5 \mul de reactivo R2 (NaOH 2 N),
- \bullet
- homogeneizar bien,
- \bullet
- incubar durante 5 minutos a una temperatura comprendida entre de 18 a 25ºC,
- \bullet
- añadir 1 ml de tampón de hibridación, cuya constitución se precisa a continuación en el presente documento,
- \bullet
- añadir 50 \mul de sonda de detección, cuya constitución se precisa a continuación en el presente documento, y
- \bullet
- homogeneizar bien.
El tampón de hibridación está constituido
por:
- \bullet
- fosfato de sodio 0,1 M pH 6,8,
- \bullet
- NaCl 0,5 M, polietilenglicol 4000 al 2% (p/v),
- \bullet
- tween 20 al 0,65% (p/v), gelatina al 0,1% (p/v),
- \bullet
- 0,14 g/l de ADN sonicado de esperma de salmón,
- \bullet
- 0,2 g/l de BND (biocida o Bromo-Nitro-Dioxano), y
- \bullet
- 0,01 g/l de ciprofloxacino.
Se diluye la sonda de detección SEQ ID NO 14
(D4-POD) en tampón fosfato 5 mM a un pH de 7,0, en
presencia de albúmina sérica bovina al 0,5% (p/v) y fenol al 0,5%
(p/v).
En segundo lugar, se realiza la hibridación de
las dianas de la siguiente manera:
- \bullet
- distribuir 100 \mul de la mezcla, en cada uno de los ocho pocillos de la tira R1,
- \bullet
- recubrir con una lámina autoadhesiva, e
- \bullet
- incubar durante 1 hora a 37ºC (37 \pm 1ºC).
En tercer lugar, el lavado que permite eliminar
las dianas eventuales que no se han hibridado, y consiste en lavar
tres veces con 500 \mul del tampón de lavado de Color 0, diluido
al 1/20 en H_{2}O. Por "Color 0", debe entenderse una
disolución de PBS concentrada veinte (20) veces, a la que se ha
añadido tween 20 al 1% (p/v).
En cuarto lugar, el revelado tiene como fin
determinar qué sondas de captura han hibridado un oligonucleótido
diana. Éste se realiza de la siguiente manera:
- \bullet
- añadir 100 \mul de disolución de sustrato preparado de manera extemporánea - 1 pastilla de Color 1 en 5 ml de Color 2, en cada uno de los pocillos,
- \bullet
- incubar durante 20 minutos a una temperatura de 18 a 25ºC, en oscuridad,
- \bullet
- añadir 50 \mul de Color 3, y
- \bullet
- leer la absorbancia a 492 nm.
Por "Color 1", debe entenderse
diclorhidrato de O-fenilendiamina (OPD); por
"Color 2", debe entenderse fosfato de sodio 0,1 M, ácido
cítrico 0,05 M, H_{2}O_{2} al 0,03%, y por "Color 3", debe
entenderse H_{2}SO_{4} 1,8 N.
En quinto lugar, la interpretación permite, en
función del revelado que se ha establecido en el capítulo anterior,
determinar la predisposición genética real de un paciente a la
diabetes insulino-dependiente. Esta verificación
propone:
- \bullet
- por una parte, verificar la positividad del control positivo de SEQ ID NO 3 (C+), en el que la densidad óptica (D.O.) debe ser superior a 0,8, y verificar la negatividad del control negativo de SEQ ID NO 4 (C-), en el que la D.O. debe ser inferior a 0,05),
- \bullet
- por otra parte, determinar el genotipo que corresponde a los dos alelos identificados con la ayuda de las sondas de SEQ ID NO 5 a SEQ ID NO 13.
En el caso mencionado anteriormente en el
presente documento, la peroxidasa es una enzima que permite revelar
para cada sonda si se ha realizado la hibridación con un
oligonucleótido si ésta está en presencia de un sustrato adecuado,
el OPD, por ejemplo. Por el hecho de que este sustrato es soluble,
habrá una extensión de la señal. En este caso, hace falta, para
poder determinar si un paciente es homocigoto o heterocigoto o si
sus alelos son susceptibles, protectores y/o neutros con respecto a
la diabetes insulinodependiente, implantar una sonda de capture por
compartimiento o, de manera más fácil, por pocillos. Esto es verdad
para las sondas a las que concierne la susceptibilidad (SEQ ID NO 5
y 6) o la protección (SEQ ID NO 7, 8 y 9) con respecto a la
diabetes insulino-dependiente. Mientras que, para
las sondas a las que concierne la neutralidad (SEQ ID NO 10, 11, 12
y 13) con respecto a esta enfermedad, es totalmente posible
reagruparlas.
Esto no es verdad si el sustrato utilizado
precipita o si la sonda de detección (SEQ ID NO 14) es
fluorescente. En este caso, pueden implantarse varias sondas en un
compartimiento o pocillo idéntico, aunque sean sondas de
susceptibilidad (SEQ ID NO 5 y 6) y/o de protección (SEQ ID NO 7, 8
y 9). De hecho, en su configuración la más compacta, todas las
sondas de susceptibilidad, de protección y de neutralidad pueden
estar en el mismo compartimiento o pocillo, eso sólo depende de la
facilidad con la que el operario es capaz de agrupar los diferentes
tipos de sondas, sin que haya solapamiento entre los bloques de
oligonucleótidos de captura. Como se precisó anteriormente, ya se
ha descrito bien un dispositivo de este tipo que permite realizar
tales soportes en una solicitud de patente presentada el 15 de
noviembre de 2000 por el solicitante, con el número FR00/14691.
La tabla 6 de a continuación presenta los
resultados obtenidos con una tira R1 en la que cada pocillo ha
recibido una alícuota de una muestra de un primer paciente a
analizar.
| Tira R1 | D. O. x 1000 | +/- |
| SEQ ID NO 3 (C+) | > 2500 | + |
| SEQ ID NO 4 (C-) | 0 | - |
| SEQ ID NO 5' (S) | 1245 | + |
| Tira R1 | D. O. x 1000 | +/- |
| SEQ ID NO 6 (S) | 126 | + |
| SEQ ID NO 7 (P) | 7 | - |
| SEQ ID NO 8 (P) | 9 | - |
| SEQ ID NO 9 (P) | 1 | - |
| SEQ ID NO 10 a 13 (N) | 8 | - |
El análisis es el siguiente
- -
- la sonda SEQ ID NO 3 es positiva: la amplificación del gen HLA-DQB1 y la prueba de hibridación han funcionado correctamente,
- -
- la sonda SEQ ID NO 5 es positiva: un alelo HLA-DQB1*0201 o HLA-DQB1*0202 o HLA-DQB1*0203 está presente,
- -
- la sonda SEQ ID NO 6 es positiva: un alelo HLA-DQB1*0302 o HLA-DQB1*0304 o HLA-DQB1*0305 o HLA-DQB1*0307 o HLA-DQB1*0308 está presente, y
- -
- las otras sondas son negativas.
En conclusión, hay muchas posibilidades de que
este paciente tenga dos alelos de susceptibilidad con respecto a la
diabetes insulinodependiente. Por muchas posibilidades, debe
entenderse que la prevalencia del alelo
HLA-DQB1*0302 de susceptibilidad es mucho más
importante que la de los alelos HLA-DQB1*0304 o
HLA-DQB1*0305 o HLA-DQB1*0307 o
HLA-DQB1*0308, que son alelos de neutralidad.
Estos dos alelos HLA-DQB1 se han
identificado a nivel genérico, el tipado de HLA de esta primera
muestra es, en realidad:
- -
- HLA-DQB1*02, y
- -
- HLA-DQB1*0302.
La tabla 7 de a continuación presenta los
resultados obtenidos con una tira R1 en la que cada pocillo ha
recibido una alícuota de una muestra de un segundo paciente a
analizar.
| Tira R1 | D. O. x 1000 | +/- |
| SEQ ID NO 3 (C+) 3 | 1685 | + |
| SEQ ID NO 4 (C-) | 5 | - |
| SEQ ID NO 5 (S) | 708 | + |
| SEQ ID NO 6 (S) | 22 | - |
| SEQ ID NO 7 (P) | 7 | - |
| SEQ ID NO 8 (P) | 143 | + |
| SEQ ID NO 9 (P) | 41 | - |
| SEQ ID NO 10 a 13 (N) | 11 | - |
El análisis es el siguiente:
- -
- la sonda SEQ ID NO 3 es positiva: la amplificación del gen HLA-DQB1 y la prueba de hibridación han funcionado correctamente,
- -
- la sonda SEQ ID NO 5 es positiva: un alelo HLA-DQB1*0201 o HLA-DQB1*0202 o HLA-DQB1*0203 está presente,
- -
- la sonda SEQ ID NO 8 es positiva: un alelo HLA-DQB1*03011 o HLA-DQB1*03012 o HLA-DQB1*0304 o HLA-DQB1*0309 está presente, y
- -
- las otras sondas son negativas.
En conclusión, hay muchas posibilidades de que
este paciente tenga un alelo de susceptibilidad y un alelo de
protección con respecto a la diabetes
insulino-dependiente. Por muchas posibilidades,
debe entenderse que la prevalencia de los alelos
HLA-DQB1*03011 y HLA-DQB1*03012 de
susceptibilidad es mucho más importante que la de los alelos
HLA-DQB1*0304 o HLA-DQB1*0309, que
son alelos de neutralidad.
Estos dos alelos HLA-DQB1 se han
identificado a nivel genérico, el tipado HLA de esta primera
muestra es en realidad:
- -
- HLA-DQB1*02, y
- -
- HLA-DQB1*0301.
La tabla 8 de a continuación presenta los
resultados obtenidos con una tira R1 en la que cada pocillo ha
recibido una alícuota de una muestra de un tercer paciente a
analizar.
| Tira R1 | D. O. x 1000 | +/- |
| SEQ ID NO 3 (C+) 3 | >2500 | + |
| SEQ ID NO 4 (C-) | 0 | - |
| SEQ ID NO 5 (S) | 1790 | + |
| SEQ ID NO 6 (S) | 27 | - |
| SEQ ID NO 7 (P) | 31 | - |
| SEQ ID NO 8 (P) | 19 | - |
| SEQ ID NO 9 (P) | 15 | - |
| SEQ ID NO 10 a 13 (N) | 829 | + |
El análisis es el siguiente:
- -
- la sonda SEQ ID NO 3 es positiva: la amplificación del gen HLA-DQB1 y la prueba de hibridación han funcionado correctamente,
- -
- la sonda SEQ ID NO 5 es positiva: un alelo HLA-DQB1*0201 o HLA-DQB1*0202 o HLA-DQB1*0203 es presente,
- -
- las sondes SEQ ID NO 10 a 13 son positivas: un alelo HLA-DQB1*0306 o HLA-DQB1*0401 o HLA-DQB1*0402 o HLA-DQB1*05011 o HLA-DQBO1*05012 o HLA-DQB1*0502 o HLA-DQB1*05031 o HLA-DQB1*05032 o HLA-DQB1*06011 o HLA-DQB1*06012 o HLA-DQB1*06013 o HLA-DQB1* 06051 o HLA-DQB1*06052 o HLA-DQB1*0606 o HLA-DQB1*0609 o HLA-DQB1*06112 o HLA-DQB1*0612 es presente, y
- -
- las otras sondas son negativas.
En conclusión, es seguro que este paciente tiene
un alelo de susceptibilidad y un alelo de neutralidad con respecto
a la diabetes insulino-dependiente. A partir del
momento en el que se sabe que hay a un alelo de neutralidad, es
poco importante determinarlo más precisamente en el marco del
análisis según la presente invención.
Estos dos alelos HLA-DQB1 se han
identificado a nivel genérico, el tipado de HLA de esta primera
muestra es, en realidad:
- -
- HLA-DQB1*02, y
- -
- HLA-DQB1*0501.
También es posible explotar el conjunto de
sondas específicas de captura utilizado para el dispositivo de
análisis de la predisposición genética de un paciente a la diabetes
insulino-dependiente (capítulo III, 1º)), con los
amplicones de PCR biotinilados por incorporación de cebadores
biotinilados en 5', ver la siguiente tabla 9.
| Nº de secuencia | Secuencia (5' > 3') | Denominación |
| científica | ||
| Biotina-SEQ ID NO 1 | Biotina-CATGTGCTACTTCACCAACGG | DQBAMP-A-Biotina |
| Biotina-SEQ ID NO 2 | Biotina-CTGGTAGTTGTGTCTGCACAC | DQBAMP-B-Biotina |
Si las condiciones de amplificación son
idénticas a las descritas anteriormente, el modo operativo es
diferente.
En primer lugar, la preparación de las dianas
consiste en:
- \bullet
- transferir la totalidad de los amplicones (50 \mul) en un microtubo de 1,5 ml,
- \bullet
- añadir 5 \mul de reactivo de NaOH a 2 N,
- \bullet
- homogeneizar bien,
- \bullet
- incubar durante 5 minutos a una temperatura comprendida de entre de 18 a 25ºC,
- \bullet
- añadir 1 ml de tampón de hibridación, cuya constitución ya se ha precisado anteriormente en el presente documento, y
- \bullet
- homogeneizar bien.
El tampón de hibridación está constituido
por:
- \bullet
- fosfato de sodio 0,1 M pH 6,8,
- \bullet
- Nacl 0,5 M, polietilenglicol 4000 al 2% (p/v),
- \bullet
- tween 20 al 0,65% (p/v), gelatina al 0,1% (p/v),
- \bullet
- 0,14 g/l de ADN sonicado de esperma de salmón,
- \bullet
- 0,2 g/l de BND (biocida o Bromo-Nitro-Dioxano), y
- \bullet
- 0,01 g/l de ciprofloxacino.
La sonda de detección SEQ ID NO 14
(D4-POD) está diluida en tampón fosfato 5 mM a un
pH de 7,0, en presencia de albúmina sérica bovina al 0,5% (p/v) y
fenol al 0,5% (p/v).
En segundo lugar, se realiza la hibridación de
las dianas de la siguiente manera:
- \bullet
- distribuir 100 \mul de la mezcla, en cada uno de los ocho pocillos de la tira R1,
- \bullet
- recubrir con una lámina autoadhesiva, e
- \bullet
- incubar durante 1 hora a 37ºC (37 \pm 1ºC).
En tercer lugar, el lavado que permite eliminar
las dianas eventuales que no se han hibridado, consiste en lavar
tres veces con 500 \mul de tampón de lavado de Color 0, diluido al
1/20 en H_{2}O.
En cuarto lugar, el revelado tiene como fin
determinar qué sondas de captura han hibridado un oligonucleótido
diana. Éste se realiza de la siguiente manera:
- \bullet
- añadir 100 \mul de disolución de conjugado de estreptavidina acoplada a la peroxidasa (SPOD, Roche, ref. 1089153) diluida al 1/10.000 en tampón PBS con Tween 20 al 0,1%, albúmina sérica bovina al 0,02%, a un pH de 7,2,
- \bullet
- incubar durante 30 minutos a una temperatura comprendida entre 18 y 25ºC, en oscuridad,
- \bullet
- lavar tres veces con 500 \mul de tampón de lavado - Color 0, diluido al 1/20 en H_{2}O
- \bullet
- añadir 100 \mul de sustrato preparado de manera extemporánea - 1 pastilla de Color 1 en 5 ml de Color 2, en cada uno de los pocillos
- \bullet
- incubar durante 20 minutos a una temperatura comprendida entre 18 y 25ºC, en oscuridad,
- \bullet
- añadir 50 \mul de Color 3, y
- \bullet
- leer la absorbancia a 492 nm.
El "Color 0", "Color 1", "Color
2" y "Color 3" son idénticos a los descritos en un párrafo
anterior.
En quinto lugar, la interpretación permite, en
función del revelado que se ha establecido en el capítulo anterior,
determinar la predisposición genética real de un paciente a la
diabetes insulino-dependiente. Esta verificación
propone:
- \bullet
- por una parte, verificar la positividad del control positivo de SEQ ID NO 3 (C+), en el que la densidad óptica (D.O.) debe ser superior a 0,8, y verificar la negatividad del control negativo de SEQ ID NO 4 (C-), en el que la D.O. debe ser inferior a 0,05,
- \bullet
- por otra parte, determinar el genotipo correspondiente a los dos alelos identificados con la ayuda de las sondas SEQ ID NO 5 a SEQ ID NO 13.
Este protocolo es más largo y poco más complejo,
puesto que hay una etapa suplementaria, pero se observan señales
más intensas para las sondas débiles, especialmente para SEQ ID NO
6.
La tabla 10 de a continuación muestra por otra
parte los diferentes resultados obtenidos entre los amplicones
biotinilados y no biotinilados.
| Sondas | Amplicones no | Amplicones |
| biotinilados | biotinilados | |
| SEQ ID NO 3 (C +) | > 2500 | > 2500 |
| SEQ ID NO 4 (C -) | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 5 (S) | 1 | 14 |
| SEQ ID NO 6 (S) | 134 | 324 |
| Sondas | Amplicones no | Amplicones |
| biotinilados | biotinilados | |
| SEQ ID NO 7 (P) | 15 | 54 |
| SEQ ID NO 8 (P) | 11 | 34 |
| SEQ ID NO 9 (P) | 19 | 35 |
| SEQ ID NO 10 a 13 (N) | 603 | 1322 |
Debe observarse que ya no se utiliza, para los
amplicones biotinilados, el brazo aminado en 5', que permite la
fijación de las sondas de detección en el fondo de la placa, tal
como se describió anteriormente, puesto que se utiliza la
estreptavidina asociada con la peroxidasa, que va a poder fijarse
la Biotina presente en los amplicones que se capturan.
Con el fin de aumentar las señales específicas
para los pocillos en los que está presente, por ejemplo, la sonda
de la secuencia SEQ ID NO 6, es posible utilizar un revestimiento,
también llamado "coating" ("recubrimiento"), con una
suspensión de 100 \mul de perlas de poliestireno de 0,1 mm de
diámetro. Estas perlas proceden de la sociedad Polysciences
(Warrington (PA) en los Estados Unidos de América - ref.: 00876),
están recubiertas por moléculas de avidina fabricadas por la
sociedad Sigma (Saint-Louis (MO) en los Estados
Unidos de América - ref.: A9275), sensibilizadas por el
oligonucleótido específico de captura SEQ ID NO 6, preparado bajo
la forma biotinilada en 5'. En este caso, debido a la presencia de
la biotina, el oligonucleótido específico de captura SEQ ID NO 6 no
comprende el brazo de unión.
Conviene:
- \bullet
- diluir 2,5 \mul de disolución de avidina a la concentración de 5 mg/ml, en 100 \mul de tampón de borato 50 mM a pH de 9,3,
- \bullet
- añadir 7,4 \mul de suspensión de perlas, e
- \bullet
- incubar durante 30 minutos a la temperatura de 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Hace falta además:
- \bullet
- añadir 5.10^{15} moléculas de sonda SEQ ID NO 6 biotinilada, e
- \bullet
- incubar durante 30 minutos a la temperatura de 37ºC.
A continuación se utiliza, una dilución de la
suspensión de perlas sensibilizadas, al 1/10 en tampón de
revestimiento (PBS 3X), a razón de 100 \mul por pocillo. Las
condiciones de revestimiento utilizadas para las sondas aminadas,
es decir 2 horas a una temperatura de 37ºC o 15 horas a una
temperatura comprendida entre 18 y 25ºC, permanecen invariables con
respecto a la fijación en el fondo del pocillo.
Este procedimiento también permite aumentar las
señales en ciertos pocillos, por ejemplo, en los que está presente
la sonda de secuencia SEQ ID NO 6, y así facilitar el análisis del
pocillo que concierne. Por otra parte los valores de D.O. (x 1000)
obtenidos para la sonda SEQ ID NO 6, con una línea homocigótica
HLA-DQB1*0302, da los siguientes resultados:
- \bullet
- sin perlas: 172, y
- \bullet
- con perlas: 689.
Pero en el caso de la utilización de la
peroxidasa para efectuar el revelado de las hibridaciones de
oligonucleótidos diana sobre los oligonucleótidos de captura, puede
utilizarse el pocillo único para la determinación de "neutralidad
de los alelos" con respecto a la diabetes
insulino-dependiente. Comprende entonces un
conjunto de cuatro sondas específicas de captura (SEQ ID NO 10 a
13) cada una de las cuales posee, individualmente, una buena
especificidad.
Tal como se evocó anteriormente, el desarrollo
de un procedimiento de depósitos múltiples en el fondo de un mismo
pocillo de una placa de microtitulación, por ejemplo, en formato de
noventa y seis (96) pocillos, permite realizar el depósito separado
para las cuatro sondas anteriormente mencionadas en un solo y único
pocillo.
El desarrollo de un procedimiento de depósitos
múltiples en el fondo de un pocillo, de una placa de
microtitulación, permite el depósito de once (11) sondas no
específicas (SEQ ID NO 3 y 4) y específicas (SEQ ID NO 5 a 13) de
captura, descritas anteriormente en las tablas 3 y 4, en un mismo
pocillo. La realización de la etapa de hibridación de los
amplicones en un pocillo único, aporta diferentes ventajas:
- \bullet
- ventaja de seguridad para la prueba, puesto que las once (11) sondas encuentran simultáneamente todos los amplicones de la muestra con la ausencia de riesgo de un falso negativo,
- \bullet
- ventaja de sensibilidad para la prueba, pues las once (11) sondas encuentran la totalidad de los amplicones de la muestra, y
- \bullet
- ventaja de poder realizar grandes series de pruebas con la posibilidad de tratar noventa y seis (96) muestras por placa, lo que es particularmente interesante para las aplicaciones de detección sistemática.
Tal como se evocó anteriormente, este enfoque
necesita, en cambio, un revelado puntual de las hibridaciones
específicas en el fondo de los pocillos. A título de ejemplo, es
posible utilizar la fluorescencia para la detección de los
amplicones que han incorporado una molécula fluorescente o que
puede revelarse con la ayuda de un marcador fluorescente.
También se han realizado ensayos de viabilidad
de explotación de diversos depósitos en un mismo pocillo, con un
revelado colorimétrico.
Los ensayos con cuatro (4) depósitos manuales,
de sondas específicas de captura (SEQ ID NO 10 a 13, en versión
aminada), con los depósitos de 1 y 5 \mul, a
400-1000 pmoles/ml en tampón de revestimiento o
recubrimiento (PBS 3X). Se incuba de entre 15 minutos y 2 horas a
la temperatura de 37ºC, o durante 15 horas a una temperatura
comprendida entre 18 y 25ºC.
Se efectúa mediante Color 0 diluido.
Se preparan los amplicones de PCR tal como se
describió en un párrafo anterior (III - 1º) - C).
En el tubo de amplificación, se efectúan las
siguientes etapas:
- \bullet
- desnaturalización de 50 \mul de amplicones mediante adición de 1 \mul de NaOH 2 N,
- \bullet
- incubación durante 5 minutos a una temperatura comprendida entre 18 y 25ºC,
- \bullet
- adición de 40 \mul de tampón de hibridación (SSPE 15X, PEG 4000 al 2%, tween 20 al 1,5%, gelatina al 0,22%, ADN sonicado al 0,032%, biocidas),
- \bullet
- adición de 6 \mul de disolución de conjugado D4-POD (50 pmoles/ml; tampón fosfato 5 mM pH 7,0 - ASB al 0,5% (p/v) - fenol al 0,5% (p/v)).
Se transfiere la totalidad de la mezcla de
reacción en un pocillo sensibilizado con los cuatro (4) depósitos y
se incuba durante una hora a la temperatura de 37ºC a ± 1ºC.
Se efectúa mediante Color 0 diluido.
Se efectúan las siguientes etapas sucesivas:
- \bullet
- adición de 100 \mul de disolución de sustrato (Color 1 diluido en Color 2),
- \bullet
- desarrollo sin perturbación, durante 20 minutos, a una temperatura comprendida entre 18 y 25ºC, en oscuridad,
- \bullet
- observar la aparición de coloración en el lugar de la sonda positiva,
- \bullet
- para cuantificar la señal, adición de 50 \mul de Color 3,
- \bullet
- homogeneizar agitando suavemente, y
- \bullet
- leer a 492 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> bioMérieux S.A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de análisis de la
predisposición genética de un paciente a la diabetes
insulino-dependiente, dispositivo adaptado a su
puesta en práctica y conjunto de cebadores de amplificación
adaptado a tal procedimiento
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> HLADID
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgtgctac ttcaccaacg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggtagttg tgtctgcaca c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcttcgaca gcgacgtggg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatgaaactt atggggatac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttgtgagc agaagc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgcctgccg ccga
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggggacccg ggcgga
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgtggaagg tgtacc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgcctgac gccg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggcccggq cgtc
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggaggacgt gcgc
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttgtaacc agatac
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtggacacc gtatgcag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggaacagcc agaagga
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Procedimiento de análisis de la
predisposición genética de un paciente a una enfermedad
autoinmunitaria, que consiste en poner una muestra líquida que
contiene al menos un tipo de amplicones, resultantes de la
amplificación de al menos una región polimórfica de interés en
relación con la enfermedad investigada, a saber la diabetes
insulino-dependiente, en presencia simultáneamente
de sondas elegidas de la manera siguiente
- \bullet
- al menos una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0201 y HLA-DQB1*0202 y HLA-DQB1*0302 para la susceptibilidad,
- \bullet
- al menos una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0301, HLA-DQB1*0602 y HLA-DQB1*0603 para la protección, y
- \bullet
- al menos una sonda específica de otros alelos HLA-DQB1* asociados con la diabetes insulino-dependiente para la neutralidad.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las sondas se seleccionan de la manera
siguiente:
- \bullet
- al menos una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0201, HLA-DQB1*0202, HLA-DQB1*0203, HLA-DQB1*0302, HLA-DQB1*0304, HLA-DQB1*0305, HLA-DQB1*0307 y HLA-DQB1*0308 para la susceptibilidad,
- \bullet
- al menos una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*03011, HLA-DQB1*03012, HLA-DQB1*03032, HLA-DQB1*03033, HLA-DQB1*0304, HLA-DQB1*0306, HLA-DQB1*0308, HLA-DQB1*0309, HLADQB1*0310, HLA-DQB1*0602, HLA-DQB1*0603, HLA-DQB1*0608, HLA-DQB1*0610, HLA-DQB1*06111, HLA-DQB1*06112, HLA-DQB1*0612, HLA-DQB1*0613, HLA-DQB1*0614 y HLA-DQB1*0616 para la protección, y
- \bullet
- al menos una sonda específica de los alelos HLA-DQ131*0306, HLA-DQB1*0401, HLA-DQB1*0402, HLA-DQB1*05011, HLA-DQB1*05012, HLA-DQB1*0502, HLA-DQB1*05031, HLA-DQB1*05032, HLADQB1* 06011, HLA-DQB1*06412, HLA-DQB1*06013, HLA-DQB1*06051, HLA-DQB1*06052, HLADQB1*0606, HLA-DQB1*0609, HLA-DQB1*06112 y HLA-DQB1*0612 para la neutrali- dad.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque las sondas usadas para detectar la
susceptibilidad con respecto a la diabetes
insulino-dependiente se definen cono sigue:
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0201, HLA-DQB1*0202 y HLA-DQB1*0203, y
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0302, HLA-DQB1*0304, HLA-DQB1*0305, HLA- DQB1*0307 y HLA-DQB1*0308.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque las sondas usadas para detectar la
susceptibilidad con respecto a la diabetes
insulino-dependiente están constituidas por al
menos diez (10) nucleótidos sucesivos tomados de las siguientes
secuencias:
- \bullet
- SEQ ID NO 5 (TCTTgTgAgCAgAAgC), y
- \bullet
- SEQ ID NO 6 (CCgCCTgCCgCCgA).
5. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque las sondas usadas para detectar la
protección con respecto a la diabetes
insulino-dependiente se definen como sigue:
- \bullet
- una sonda específica de los alelos MLA-DQB1*03011, HLA-DQB1*03012, HLA-DQB1*0304 y HLADQB1*0309,
- \bullet
- una sonda específica de alelos HLA-DQB1*03011, HLA-DQB1*03012, HLA-DQB1*03032, HLADQB1* 03033, HLA-DQB1*0306, HLA-DQB1*0309 y DQB1*0310, y
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0308, HLA-DQB1*0602, HLA-DQB1*0603, HLA-DQB1* 0608, HLA-DQB1*0610, HLA-DQB1*06111, HLA-DQB1*06112, HLA-DQB1*0612, HLA-DQB1* 0613, HLADQB1*0614 y HLA-DQB1*0616.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque las sondas usadas para detectar la
protección con respecto a la diabetes
insulino-dependiente están constituidas por al
menos diez (10) nucleótidos sucesivos tomados de las siguientes
secuencias:
- \bullet
- SEQ ID NO 7 (AggggACCCgggCggA),
- \bullet
- SEQ ID NO 8 (gACgTggAggTgTACC), y
- \bullet
- SEQ ID NO 9 (gCCgCCTgACgCCg).
7. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque las sondas usadas para detectar la
neutralidad con respecto a la diabetes
insulino-dependiente se definen como sigue:
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*0306, HLA-DQB1*0401 y HLA-DQB1*0402,
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*05011, HLA-DQB1*05012, HLA-DQB1*0502, HLA-DQB1*05031 y HLA-DQB1*05032,
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*06011, HLA-DQB1*06012 y HLA-DQB1*06013, y
- \bullet
- una sonda específica de los alelos HLA-DQB1*06051, HLA-DQB1*06052, HLA-DQB1*0606, HLA-DQB1*0609, HLA-DQB1*06112 y HLA-DQB1*0612.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque las sondas usadas para detectar la
neutralidad con respecto a la diabetes
insulino-dependiente están constituidas por al menos
diez (10) nucleótidos sucesivos tomados de las siguientes
secuencias:
- \bullet
- SEQ ID NO 10 (ggggCCCgggCgTC),
- \bullet
- SEQ ID NO 11 (AggAggACgTgCgC),
- \bullet
- SEQ ID NO 12 (TCTTgTAACCAgATAC), y
- \bullet
- SEQ ID NO 13 (ggTggACACCgTATgCAg).
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se usa al
menos una sonda de control positivo, que puede hibridarse con el
conjunto de genes HLA-DQB1, para permitir la
detección de todos los alelos HLA-DQB1.
10. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 4, 6, 8 ó 9, caracterizado porque se
sustituye a lo sumo un 38,89%, preferiblemente a lo sumo un 20 de
las bases de una misma sonda por al menos una base análoga, tal
como la inosina.
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque, previamente,
se efectúa al menos una amplificación del gen
HLA-DQB1.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque los cebadores de amplificación están
biotinilados, de modo que los amplicones también están
biotinilados.
13. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque, antes de la
amplificación, se trata la muestra biológica sacada,
preferiblemente en forma de mácula de sangre secada, con vista a la
extracción de ácidos nucleicos.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque la extracción de ácidos nucleicos se
efectúa en una mezcla de reacción que ya contiene los
desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTP), que luego se usarán en
el momento de la amplificación, y eso antes de la incubación.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque después de la incubación, se añaden en
la mezcla de reacción, desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTP),
que se usarán también en el momento de la amplificación
posterior.
16. Dispositivo que permite la puesta en
práctica de un procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque se fija cada
tipo de sondas DQB1 específicas de la susceptibilidad, de la
protección y de la neutralidad en un compartimento
independiente.
17. Dispositivo que permite la puesta en
práctica de un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque se fija cada
tipo de sondas usadas para detectar la susceptibilidad o la
protección con respecto a la diabetes
insulino-dependiente en un compartimento
independiente, independientemente de otras sondas usadas para
detectar esta susceptibilidad o esta protección, y porque se fijan
todos o parte de los diferentes tipos de sondas usadas para
detectar la neutralidad con respecto a la diabetes
insulino-dependiente en al menos un pocillo de una
placa de microtitulación.
18. Dispositivo que permite la puesta en
práctica de un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque se fija el
conjunto de tipos de sondas usadas para detectar la susceptibilidad
o la protección o la neutralidad con respecto a la diabetes
insulino-dependiente en un solo y mismo
compartimento.
19. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, en el que se fijan las sondas en el fondo
de un pocillos de una placa de microtitulacíón o sobre una perla
por medio de un brazo aminado o de biotina situado(a) en
posición 5' de las sondas.
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