ES2260755T3 - Sistema de union a membrana periplasmica para detectar intereacciones proteina-proteina. - Google Patents

Abstract

Una célula hospedadora que comprende: (a) una proteína de fusión de transmembrana que tiene (i) una región toxR codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ IC Nº: 2, y (ii) una región periplásmica capaz de formar un dímero espontáneamente o tras la unión del ligando; y (b) una molécula de ácido nucleico que tiene un gen indicador unido operativamente al operón ctx: en la que la formación de dímero se señala mediante la expresión del gen indicador.

Description

Sistema de unión a membrana periplásmica para detectar interacciones proteína-proteína

Esta invención se refiere a ensayos para interacciones proteína-proteína, proteínas de fusión, y células hospedadoras modificadas para comprender tales proteínas.

La información sobre el ambiente extracelular se comunica al interior de una célula mediante los llamados sistemas de transducción de señal. Schlessinger, J., TIBS 13: 443-7 (1988); Stock, J. B., y col., Microbiol. Rev. 53: 450-490 (1989). Varias clases de transductores de señal son capaces de "transmitir" una señal sin internalización de la señal primaria. tal transmisión de señal se puede producir por la unión de un ligando a un receptor unido a membrana, induciendo un cambio conformacional en el receptor.

Uno de tales transductores de señal es el sistema toxR-ctx en Vibrio cholerae. Ctx es el gen para la toxina de cólera. La proteína ToxR es una proteína de transmembrana con un dominio de unión a ADN en su extremo amino, un dominio transmembrana fuertemente hidrófobo, y un dominio formador de dímero, regulado ambientalmente en su extremo carboxilo. Miller, V. L., y col., Cell 48: 271-279 (1984). De acuerdo con las creencias actuales, la región transmembrana hidrófoba dirige el extremo carboxilo al periplasma mientras que el extremo amino permanece en el citoplasma. Un cambio en la osmolaridad o temperatura en el periplasma se cree que afecta a la capacidad de la proteína toxR para formar dímeros con su extremo carboxilo. Los dímeros carboxilo a su vez modulan la capacidad del extremo amino de toxR de unirse a secuencias repetitivas en el promotor ctx y, por lo tanto, modulan la capacidad de la ARN polimerasa de iniciar la transcripción en el promotor ctx. Id.

Para probar la hipótesis de que la proteína toxR es una proteína de membrana, Miller y col., fusionaron la proteína toxR con la fosfatasa alcalina (phoA). Cell 48: 271-279 (1984). La enzima phoA existe de forma natural como un dímero en el periplasma y la proteína de fusión phoA-toxR era constitutivamente funcional con respecto a tanto la activación de la actividad de la fosfatasa como de toxR de ctx. Este resultado demuestra que toxR era capaz de dirigir la fosfatasa alcalina al periplasma donde era activa, y que la capacidad de dimerización de la fosfatasa alcalina podría dirigir la proteína toxR para activar la transcripción de ctx.

En un experimento de fusión similar, Mekalanos y col., fusionaron la toxR a un mutante phoA que requiere Zn^{2+} para la dimerización y actividad (comunicación personal). Esta actividad de fosfatasa de las proteínas de fusión era dependiente de Zn^{2+}, como se esperaba, pero también era la activación de ctx. Este resultado es consistente con el modelo de transducción de señal para la acción de toxR.

Los sistemas de transducción de señal quiméricos se han construido en células procarióticas con diferentes sistemas bacterianos (Utsumi. J., y col., Science 245: 1246-1249), en células de cultivos de tejidos con diferentes receptores eucarióticos de hormonas (Riedel, H., y col., EMBO J. 8: 2943-2954 (1989)), y en células de cultivos de tejidos con un dominio bacteriano de unión a aspartato y el receptor de insulina Moe, G. E., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 5683-7 (1989)). Sin embargo, hasta la fecha, ninguno de tales sistemas ha empleado el receptor de toxR para V. cholerae.

La presente invención se refiere a células hospedadoras que comprenden (a) una proteína de fusión de membrana que tiene (i) un dominio de dimerización periplásmico (por ejemplo, un dominio de unión a ligando) y (ii) una región toxR que tiene una región de unión a ADN de toxR y una región transmembrana de toxR, y (b) una molécula de ácido nucleico que tiene un gen indicador unido operativamente al operón ctx, en el que la formación de dímero, que puede o no puede implicar la unión de ligando, está señalada por la expresión del gen indicador.

La presente invención también se refiere a la proteína de fusión anteriormente mencionada, una molécula de ácido nucleico correspondiente, y un vector de expresión correspondiente que tiene un promotor inducible. Además la invención, incluye un procedimiento para detectar la dimerización (por ejemplo, como resultado de la unión de un ligando) de una proteína de unión a membrana, que comprende el tratamiento de un cultivo de las células hospedadoras de esta invención con un ligando y selección para la expresión del gen indicador.

La presente invención se puede usar para generar una señal a partir de una diversidad de dominios a ligando. La presencia de un ligando elegido puede estar indicada por la resistencia a antibióticos o un sencillo ensayo colorimétrico para la producción de una enzima. Las regiones periplásmicas de la proteína de transmembrana podrían incluir los dominios terapéuticamente relevantes, de manera que pueden estar indicadas interacciones biológicamente pertinentes mediante una señal que se puede medir fácilmente. Tales proteínas de fusión de transmembrana deben también contribuir a nuestro entendimiento de dimerización de dominios, dominios de unión a ligandos, secuencias de proteínas de extensión de membrana, transducción de señal.

La figura 1 es una representación esquemática del mecanismo empleado por la presente invención. Como se muestra en al figura 1, la proteína de unión a ligando LBP está localizada dentro de la membrana interna IM y la membrana externa OM de la célula. Cuando el nivel de expresión de la proteína toxR alcanza un cierto nivel crítico, se producirá la dimerización. Como alternativa cuando un ligando L se une al dominio de unión a ligando de una proteína de fusión toxR, puede provocar la dimerización. En cualquier caso, la dimerización induce un cambio conformacional en de el dominio citoplasmático la proteína de fusión de tipo salvaje o toxR que induce la unión a la región promotora P del gen indicador r. La unión a ADN permite que la ARN polimerasa transcriba el gen indicador, de esta manera señalando la dimerización que se puede producir por la capacidad la capacidad o bien espontánea o inducida por ligando del dominio periplásmico a asociar.

La figura 2 muestra vectores de control y de fusión. "LACp" designa el promotor lac; "AmpR", el gen de resistencia a ampicilina; "Spec", el gen de resistencia a espectinomicina; "LacZ", el gen de \beta-galactosidasa; "CTXp", el promotor de la toxina de cólera; "CAT", el gen la cloranfenicol transferasa; (A) pTOX3. Este vector de control de toxR de tipo salvaje incluye un clon de la PCR de toxR (SEQ ID. No. 1) a partir de V. cholerae genómico en el vector de expresión pSPORT1. El gen toxR se coloca en el control del promotor lac, haciéndolo inducible mediante tratamiento con ITPG. Los transductores deseados se pueden seleccionar mediante tratamiento con ampicilina. El origen de ColEI es compatible con el origen de pSC101. (B) pTOX5. Este vector de fusión de toxR incluye un clon de PCR de toxR truncado (SEQ ID N0 2) a partir del V. cholerae genómico en el vector pSPORT1. pTOX5 permite la clonación en fase de dominios foráneo y se puede usar para generar familias de fusiones basándose en al supresión unidireccional. El pTOX5 truncado no activa el promotor de ctx y cualesquiera señales encontradas en las proteínas quiméricas que se producen por la capacidad del dominio condensado de dimerizarse. (C) Este vector del gen indicador incluye el promotor de la toxian de cólera, ctx (SEQ ID. No. 3), amplificado por PCR a partir de p3083 (Infection and Immunology, 58, páginas 4142-4144, 1990) y se clona en un vector de lacZ sin promotor novedoso. Esta construcción expresa la \beta-galactosidasa como una función de la dimerización de toxR o proteínas de fusión de toxR. El origen de pSC101 es compatible con el origen de ColEi. Los transformantes deseados se pueden seleccionar mediante tratamiento con espectinomicina. (D) pCTX4. Este vector incluye un gen de CAT sin promotor a partir de pCaMCVCN insertado en el LacZ de pCTX3. Como el vector pCTX3 a partir del que se deriva, pCTX4 también proporciona selección de espectinomicina y expresa la cloranfenicol transferasa como una función de la dimerización de las proteínas toxR o de fusión de toxR.

La figura 3 muestra los resultados del gen toxR de tipo salvaje, el toxR truncado de 'TOX5, y una fusión génica en fase de toxR. La fusión en el ejemplo es el dominio de dimerización de cremallera de leucina de la proteína toxRGCN4 de levaduras, un dominio de dimerización bien estudiado que representa un control importante. (A) Co-rtransfección con el gen indicador lacZ. Para los plásmidos pTOX3, pTOX5, y pTOX5GCN4, esta figura muestra la cantidad de \beta-galactosidasa producida (medida en unidades Miller) en presencia de cero (primera barra), 50 (segunda barra), y 200 (tercera barra) \muM IPTG. Estos resultados muestran que la expresión de la \beta-galactosidasa depende de la inducción del gen toxR de tipo salvaje de pTOX3 por IPTG, y demuestran que el producto toxR truncado en pTOX5 falla para activar la expresión incluso después de la inducción. Los resultados indicados para pTOX5-GCN4 demuestran que un dominio de dimerización foráneo puede restablecer la activación inducible. (B) Cotransfección con el gen reportero de CAT. Los resultados proporcionados en la parte B muestran la activación del gen de resistencia a cloranfenicol a partir de pCTX4 como se espera para las cepas que expresan toxR de tipo salvaje y toxR-GCN4 quimérico. La cantidad de cloranfenicol usado se indica en la parte superior de cada columna en \mug/ml. "J4" indica la cepa JM101 según se transfecta con pCTX4. "R" significa resistencia a clorafenicol; "S" sensibilidad. Las células se hicieron crecer en presencia de IPTG como se indica en los materiales y procedimientos; cuando IPTG se omite, no se observa resistencia a cloranfenicol.

La figura 4 muestra un procedimiento para generar supresiones unidireccionales, según se aplica a una fusión toxR-trkC. TRC es un miembro de la clase de tirosina quinasa de receptores e interactúa con el factor de crecimiento nervioso NT3 (Cell, 66, páginas 967-979, 1991). Un clon de ADNc de trkC de longitud completa se colocó cadena a bajo del den toxR truncado en el vector de fusión pTOX5 y el sitio de escisión NotI. Después de la digestión con Sflt y NotI, este vector se trató con exonucleasa III (ExoIII), que proporciona supresiones direccionales 5' a 3' comenzando en el sitio de escisión Sflt. Los plásmidos tratados con ExoIII se digirieron posteriormente con núcleos de habas orientales. Tras al ligación, este tratamiento da como resultado una familia de fusiones entre fragmentos de toxR y trkC de longitud variable.

La figura 5 muestra los resultados APRA las fusiones toxR-trkC preparadas mediante el procedimiento de la figura 4. (A) Ensayo de la \beta-galactosidasa. La actividad de toxR de diversas fusiones se midió mediante la expresión de la \beta-galactosidasa. Los ensayos se realizaron en medio rico (columna LB) y en medio mínimo (columna min.) ambos en presencia de (100 \muM) y ausencia de IPTG. (B) Secuenciación de la parte trkC. La tabla mostrada en la parte B reseña el tamaño (en pares de bases) y los límites de la secuencia suprimida en la fusión según se determina comparando la secuencia del mutante de supresión con la de las secuencias trkC y toxR conocidas. (C). Mapa de las fusiones toxR-trkC. Los datos en al tabla en la parte B se expresan de manera gráfica con las casillas huecas que indican los pares de bases suprimidos en al fusión indicada.

La figura 6 muestra los resultados obtenidos con fusiones de HSV ICP35 y VIH integrasa a la supresión de toxR de pTOX5. (A, B) Actividad de la \beta-galactosidasa inducida por fusiones de toxR. Se muestran los resultados durante una inducción de 4 horas en fondo DH5\alpha (B). El eje y muestra la actividad de la \beta-galactosidasa en unidades Miller; el eje x, la concentración de IPTG en micromoles. Estos resultados confirman la activación de ctx por unas proteína de fusión toxR - viral e implican la dimerización dirigida por el dominio viral. (C) Resistencia a cloranfenicol inducida por las fusiones de toxR. Como se indica en la figura 3, la dimerización se demuestra mediante la resistencia a cloranfenicol, reseñada en \mug/ml. "D4" se refiere a la cepa DH5\alpha como una cepa hospedadora y los términos restantes como se define en la figura 3.

ToxR codifica una proteína de transmembrana que posee un dominio de unión a ADN en su extremo amino. El dominio intracelular tiene la capacidad de activar la expresión del operón ctx. La transactivación depende de la dimerización de la proteína toxR, que está dirigida por el dominio carboxilo extracelular de la proteína. El sistema toxR-ctx puede tomar la señal primaria de la asociación proteína-proteína y translucirlo en el mensaje secundario de la expresión génica. La localización de la membrana natural de la proteína toxR, que está dirigida por su segmento transmembrana, lo hace un huésped atractivo para la formación de quimera que implica proteínas de membrana. Este confinamiento de membrana también tiene la característica intrigante de la difusión de proteína de restricción a un plano de lípido de 2 dimensiones. La colocación del dominio de dimerización en el espacio periplásmico extracelular lo hará accesible a agentes exógenos que podrían afectar al equilibrio del dímero.

Definición de términos

Las siguientes definiciones se aplican a los términos usados a lo largo de esta memoria descriptiva, salvo que se limite otra cosa en los casos específicos.

Los términos "dominio de dimerización" y "región capaz de formar un dímero" se refieren a una secuencia de polipéptidos capaz de formar un autodímero, o bien espontáneamente o como resultado de la unión a ligando y similar. Los dominio de dimerización ejemplares se pueden derivar de trkC, GCN4, la proteína estructural de VSH ICP35, integrasa de VIH, y similares.

El término gen "indicador" se refiere a cualquier gen cuya expresión proporciona una señal medible. Los genes indicadores ejemplares incluyen los genes para la \beta-galactosidasa y cloranfenicol transefrasa. Los expertos en la técnica conocen otros diversos genes indicadores.

Procedimiento de preparación Construcciones génicas

Los ácidos nucleicos usados en la presente invención se pueden preparar mediante procedimientos de ácidos nucleicos recombinantes. Véase, por ejemplo lo procedimientos de ADN recombinante de Nelles y col., J. Biol. Chem., 262, 10855 (1987). Las cepas ejemplares que comprenden tales construcciones son RFM2016 supE thi \Delta (pro-lac)/F' (traD36 proAB^{+} lacI^{Q} lacZ\DeltaM15)/pTOX5/pCTX4 (Nº de acceso de ATCC 69.403) y RFM2063 supE thi supE thi \Delta (pro-lac)/degP :: Tn5/F' (traD36 proAB^{+} lacI^{Q} lacZ\DeltaM15)/pTOX5/pCTX5trkC12/pCTX3 (nº de acceso de ATCC 69.404). ("ATCC" se refiere a la colección americana de cultivos tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776.

Las secuencias de ADN se pueden derivar a partir de una diversidad de fuentes, incluyendo ADN genómico, ADN subgenómico, ADNc, ADN sintético, y las combinaciones de los mismos. ADN genómico y ADNc se pueden obtener de numerosas formas. Las células que codifican la secuencia deseada se pueden aislar, el ADN genómico fragmentado (por ejemplo, mediante tratamiento con una o más endocnucleasas de restricción), y los fragmentos resultantes clonados, identificados con una sonda complementaria a la secuencia deseada, y seleccionada para la presencia de una secuencia que codifica la actividad deseada.

Para ADNc, el ADNc se puede clonar y el clon resultante se selecciona con una sonda para ADNc que codifica la región deseada. Tras el aislamiento del clon deseado, el ADNc se puede manipular sustancialmente de la misma manera que el ADN genómico.

Para expresar las secuencias de ADN, son necesarias las señales de transcripción y de traducción reconocidas por un huésped apropiado. Se prefiere que la secuencia del gen toxR está unida de manera operativa a un promotor inducible (por ejemplo, el promotor lac), que proporciona un control para el sistema.

Como alternativa, la región promotora del ADN genómico se puede obtener en asociación con la secuencia de ADN para la región toxR u otra para la proteína de fusión. En el grado de que las células hospedadoras reconocen las señales reguladoras de la transcripción y de inicio de la traducción asociadas a la región de toxR, la región 5' adyacente a la secuencia codificadora puede estar retenida y emplearse para la regulación de la transcripción y traducción. Esta región típicamente incluirá las secuencias implicadas en el inicio de la transcripción y traducción, tal como la casilla TATA, secuencia introductora, secuencia CAAT, y similares. Típicamente esta región, será de al menos aproximadamente 150 pares de bases de largo, más típicamente aproximadamente 200 pares de bases, y raramente excediendo de aproximadamente 1 a 2 kb.

La región en 3' no codificadora puede estar retenida, así como, especialmente para sus secuencias reguladoras de terminación de la transcripción, tal como la señal de parada y región poliadenilada. Además, la región no codificadora 3' también puede contener un potenciador. Cuando las señales de terminación de la transcripción no son satisfactoriamente funcionales en una célula hospedadora, entonces una región 3' funcional de un gen diferente puede estar sustituida. En este procedimiento, la elección de la región 3' sustituida dependería del sistema de células elegido para la expresión.

Se puede utilizar una amplia diversidad de secuencias reguladoras de la transcripción y traducción, dependiendo de la naturaleza del huésped. Las secuencias reguladoras de la transcripción y traducción pueden estar derivadas de fuentes virales (por ejemplo, adenovirus, virus de papiloma bovino, virus de simio, y similares) cuando las señales reguladoras se derivan de un gen que tiene un alto nivel de expresión en el huésped. Como alternativa, se pueden emplear promotores de productos de expresión de mamíferos (por ejemplo, actina, colágeno, miosina, y similares). Las señales reguladoras del inicio de la transcripción se pueden seleccionar de manera que permitan la represión o activación, de manera que se pueda modular la expresión de genes. Una de tales técnicas de modulación controlable es el uso de señales reguladoras que son sensibles a la temperatura, de manera que al expresión pueda estar representada o iniciada cambiando la temperatura. Otra técnica de modulación controlable es el uso de señales reguladoras que son sensibles a ciertos compuestos químicos.

Para formar las construcciones génicas quiméricas toxR o ctx, se pueden ligar fragmentos de ADN de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en al técnica. Tales técnicas incluyen el uso de enzimas de restricción para convertir los fragmentos de extremos adherentes a fragmentos ciegos (o vive - versa), polimerasas y nucleótidos que se llenan en extremos adhesivos para formar extremos ciegos, fosfatasa alcalina para evitar ligaduras no deseadas, y ligasas para unir fragmentos.

Las construcciones para toxR y su pareja de fusiones pueden unir juntas para formar un solo segmento de ADN o se pueden mantener como segmentos separados por ellos mismos o junto con vectores. Las construcciones se pueden introducir en una célula mediante la transformación junto con un gen después de la selección cuando la construcción se llegará a integrar en el genoma del huésped. Usualmente, la construcción será parte de un vector que tiene un sistema de replicación reconocido por la célula hospedadora.

Expresión de vectores

Los vehículos de expresión para la producción de las moléculas de la invención incluyen plásmidos u otros vectores. En general, tales vectores contienen secuencias de control que permiten la expresión en diversos tipos de huéspedes, que incluyen, pero no se limitan a procariotas, levaduras, hongos, plantas y eucariotas superiores. Los vectores de expresión adecuados que contienen las secuencias codificadoras y de control deseadas se pueden construir usando técnicas de ADN recombinantes convencionales conocidas en al técnica, muchas de las cuales se describen en Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprong harbor, NY, (1989).

Un vector de expresión como se contempla en al presente invención es al menos capaz de dirigir la replicación de la construcción del gen indicador y al replicación y la expresión de la construcción de proteína de fusión de transmembrana. Una clase de vectores utiliza elementos de ADN que proporcionan plásmidos que se replican de manera autónoma derivados de virus animales (por ejemplo, virus de papiloma bovino, poliomavirus, adenovirus, o SV40). Una segunda clase de vectores se basa en la integración de la secuencia génica deseada en el cromosoma de células hospedadoras.

Los vectores de expresión útiles en la presente invención típicamente contienen un origen de replicación, un promotor localizado en 5' (es decir, cadena arriba de) la secuencia de ADN a expresar, y una secuencia de terminación de la transcripción. Los orígenes adecuados de replicación incluyen, por ejemplo, los orígenes de replicación ColE1, pSC101, SV4O y M13. Las secuencias de terminación adecuadas incluyen, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus, el promotor lacZ, el promotor gal 10 y el promotor polihedral AcMNPV. La secuencia promotora también puede ser inducible, que permite la modulación de al expresión (por ejemplo, mediante la presencia o ausencia de nutrientes u otros inductores en el medio de crecimiento). Un ejemplo es el operón lac obtenido de bacteriofago lambda plac5, que puede estar inducido por IPTG.

Los vectores de expresión también pueden incluir otras secuencias reguladoras para la expresión óptima del producto deseado. Tales secuencias incluyen secuencias guías de estabilidad, que proporcionan la estabilidad del producto de expresión; secuencias guía secretoras, que proporcionan la secreción del producto de expresión; potenciadores, que regulan hacia arriba la expresión de la secuencia de ADN; y las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción, que proporcionan sitios para al escisión por las endonucleasas de restricción. Todos estos materiales se conocen en la técnica o están comercialmente disponibles. Véase, por ejemplo, Okayama, Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983).

Un vector de expresión adecuado también puede incluir secuencias marcadoras, que permiten la selección fenotípica de células hospedadoras transformadas. Tal marcador puede proporcionar fototropía a un huésped autotrófico, resistencia biocida (por ejemplo, resistencia a antibióticos) y similares. El gen marcador seleccionable se puede o bien unir directamente a las secuencias génicas de ADN a expresar, o introducirse en la misma célula mediante cotransfección. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen resistencia a neomicina, ampicilina, higromicina y similares.

Las características del vector de expresión real usado debe ser compatible con al célula hospedadora que se va a emplear. Para un huésped mamífero, por ejemplo, el vector de expresión puede contener promotores aislados a partir del genoma de células de mamíferos, (por ejemplo, promotor de metalotionien de ratón), o a partir de virus que crecen en estas células (por ejemplo, promotor de 7,5 K de virus vaccinia).

Los vectores de expresión comercialmente disponibles adecuados en los que las secuencias de ADN de la presente invención se pueden insertar incluyen pSPORT (que se prefiere), pBluescripIISK, los vectores de expresión de mamíferos pcDNAI o pcDNA/Neo, el vector de expresión de baculovirus pBlueBac, el vector de expresión procariótico pcDNAII y el vector de expresión de levadura pYes2, todos los cuales se pueden obtener de Invitrogen Corp., San Diego, California.

Células hospedadoras

La presente invención adicionalmente se refiere a células hospedadoras, que contienen vectores de expresión que comprenden secuencias de ADN para las construcciones génicas de toxR y ctx.

Las células hospedadoras adecuadas incluyen tanto células procarióticas como eucarióticas. Las células hospedadoras procarióticas adecuadas incluyen, por ejemplo, cepas de E. coli HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 y JM101. Las células hospedadoras eucarióticas adecuadas incluyen, por ejemplo, células de insecto de Spodoptera frugiperda, células Cos-7, fibroblastos humanos y células de Saccharomyces cerevisiae.

Las células de mamífero que pueden ser útiles como huéspedes incluyen células de origen fibroblástico (por ejemplo, VERO o CHO-K1= o de origen linfático (por ejemplo, SP2/0-AG14, o Pex63Sg8) o los derivados de los mismos. Las células hospedadoras de mamíferos preferidas incluyen SP2/0 y J558L. Varias líneas celulares secretan uroquinasa y se pueden usar para la transfección, tales como células de carcinoma de riñón cultivadas y células 3T3. Ferrivalo y col., J. Cell Physiol, 121, 363 (1984); Belin y col., EMBO J., 3, 190 (1984).

Otro huésped preferido es levadura. La levadura proporciona ventajas sustanciales por que también puede llevar a cabo modificación peptídico post-traduccional, incluyendo la glicosilación. Existe un número de estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras fuertes y un gran número de copias de plásmidos que se pueden utilizar para la producción de las proteínas deseadas en levadura. La levadura reconoce secuencias guías sobre productos génicos de mamíferos clonados y secreta péptidos que llevan secuencias guías.

Las células inmortalizadas, particularmente células de mieloma o linfoma, son también células hospedadoras adecuadas. Estas células se pueden desarrollaren un medio nutriente adecuado en matraces de cultivo o inyectarse en un huésped sinérgico (por ejemplo, ratón o rata) o un huésped inmunodeficiente o sitio hospedador (por ejemplo, ratón desnudo o bolsa de hámster). En particular, las células se pueden introducir en la cavidad abdominal para la producción de fluido de ascites y recoger la molécula quimérica. Como alternativa, las células se pueden inyectar por vía subcutánea y los anticuerpos recoger a partir de la sangre del huésped. Las células se pueden usar de la mema manera que las células de hibridoma. Véase, Dioamond y col., N. Eng. J. Med., 304, 1344 (1981); Monoclonal Antibodies; Hybridomas - A New Dimensión in Bilogic Análisis (Kennatt, y col., eds.) Plenum (1980).

Los vectores de expresión se pueden introducir en células hospedadoras mediante diversos procedimientos conocidos en al técnica. Por ejemplo, transfección de células hospedadoras con vectores de expresión se pueden llevara cabo mediante el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio. Sin embargo, otros procedimientos para introducir vectores de expresión en células hospedadoras, por ejemplo, también se puede emplear electroporación, fusión liposomal, inyección nuclear, e infección de fagos viral o de fagos.

Las células hospedadoras que contienen un vector de expresión se pueden identificar mediante uno o más de los seis siguientes planteamientos generales: (a) hibridación ADN-ADN; (b) la presencia o ausencia de funciones geícas marcadoras; (c) determinar el nivel de transcripción según se mide por la producción de transcripciones de ARNm que codifican las construcciones génicas en la célula hospedadora; (d) detección del producto génico de manera inmunológica; (e) ensayo enzimático; y (f) PCR.

En el primer planteamiento, la presencia de una secuencia de ADN codificadora para las construcciones génicas se pueden detectar mediante la hibridación ADN-ADN o ARN-ADN usando sondas complementarias a la secuencia de ADN.

En el segundo planteamiento, el sistema hospedador del vector de expresión recombinante se puede identificar y seleccionar basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones génicas marcadoras (por ejemplo, actividad de la timidina quinasa, resistencia a antibióticos, etc.). Un gen marcador se puede colocar ene. mismo plásmido como al secuencia de proteínas de fusión o construcción reportera bajo la regulación del mismo o diferente promotor o indicador.. La expresión del gen marcador indica la transfección del vector que tiene la secuencia de ADN para la proteína de fusión o gen reportero.

En el tercer planteamiento, la producción de transcripciones de de ARNm que codifican la proteína de fusión o indicador se puede determinar mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, ARN poliadenilado se puede aislar y analizar mediante transferencia de Northern o un ensayo de protección de nucleasa que usa una sonda complementaria a al secuencia de ARN. Como alternativa, el ARN total de la célula hospedadora se puede extraer y ensayar para la hibridación de tales sondas.

En un cuarto planteamiento, la expresión de la proteína de fusión o reportero se puede determinar de manera inmunológica, por ejemplo, mediante inmunotransferencia con anticuerpo a la proteína de fusión o una de sus regiones (Transferencia de Western). Como alternativa, esta técnica se puede llevara acabo con el epítope conocido de la región variable de anticuerpo.

En el quinto planteamiento, la expresión de la proteína de fusión o indicador se puede determinar ensayando para evaluar esta actividad (véase más adelante).

En el sexto planteamiento, cebadores de oligonucleótidos homólogos a las secuencias presentes en el sistema de expresión (es decir, secuencias de vectores de expresión, secuencias génicas de proteínas de fusión, o secuencias génica indicadoras) se usan en una PCR para producir un fragmento de ADN de longitud predicha, que indica la incorporación del sistema de expresión en al célula hospedadora.

Los vectores de expresión y moléculas de ADN de la presente invención también se pueden secuenciar. Se conocen en la técnica diversos procedimientos de secuenciación. Véase, por ejemplo, el procedimiento de terminación de cadena didesoxi descrito en Sanger y col., Proc. natl. Acad.Sci. USA, 74, 5463-7 (1977) y el procedimiento de Maxam-Gilbert descrito en Proc. natl. Acad. Sci. USA 74, 560-4 (1977).

Una vez que se ha introducido un vector de expresión en una célula hospedadora adecuada, la célula hospedadora se puede cultivar en condiciones que permiten la expresión de grandes cantidades de la proteína deseada.

La proteína de fusión se puede aislar y purificar de acuerdo con condiciones convencionales, tales como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis, y similares. El procedimiento preferido es cromatografía de afinidad con o bien el heptapéptido terminal amino de la cadena \beta de fibrina, que se une al sitio antifibrina, o benzamidina, que se une al sitio catalítico activador de plasminógeno.

Naturalmente, se debe entender que no todos los vectores de expresión y secuencias reguladoras de ADN funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Ninguna de todas las células hospedadoras funcionarán de manera igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, los expertos en al técnica pueden hacer una selección entre vectores de expresión, secuencias reguladoras de ADN, y células hospedadoras que usan la guía proporcionada en esta memoria descriptiva sin experimentación excesiva y sin salirse del alcance y espíritu de la presente invención.

Realizaciones preferidas

Más adelante se detallan descripciones de realizaciones específicas de la presente invención. estas realizaciones son ejemplares y sirven para ilustrar la amplia aplicabilidad de la presente invención.

Los presentes inventores colocaban el gen de toxR de longitud completa de V. cholerae detrás del promotor lac inducible del vector pSPORT. Esto proporciona un control para caracterizar el comportamiento de este sistema en E. coli. Para explotar este sistema, los inventores clonaron un gen de toxR truncado inmediatamente cadena arriba del sitio de multiclonación en el mismo vector parenteral (figuras 1 y 2).

Fusiones de TRC

Las fusiones toxR-trkC se prepararon como se describe en la figura 4. un gran número de fusiones con segmentos trkC de longitud variable se seleccionaron para la función de toxR (actividad de \beta-galatosidasa a alta IPTG en una cepa huésped que alberga el vector pCTX3). Los clones con actividad toxR se caracterizaron adicionalmente y los resultados se muestran en la figura 5.

Estas funciones demuestran que las secuencias de trkC foráneo (sin su propio segmento de transmembrana) son capaces de restablecer niveles variables de la unción de toxR, que depende de la fusión. Las supresiones que eliminan cualesquiera porciones pequeñas de trkC proporcionan una proteína de fusión que muestra una señal de toxR a altos niveles de expresión (altos niveles de IPTG). Además un número de fusiones que eliminan grandes segmentos de trkC muestran capacidad potenciada formadora de dímeros, como se demuestra por la actividad de toxR a bajos niveles de expresión (sin IPTG). De hecho, las fusiones de trkC son más competentes como en al activación de ctx que es la proteína toxR de tipo salvaje con su propio dominio formadora de dímeros. Un modelo posible sugiere que las secuencias en el extremo amino trkC de tipo salvaje oscurecen una capacidad muy fuerte formadora de dímeros. En este modelo, la unión de NT3 en la proteína trkC de tipo salvaje podría causar cambios conformacionales que no cubren este dominio del dominio fuerte de auto asociación.

Las células hospedadoras modificadas permiten una selección para ligandos de trkC con actividad similar a NT3, usando resistencia a cloranfenicol o \beta-galactosidasa como indicador. La actividad de ligando se señalará mediante la aparición de resistencia a cloranfenicol o actividad de \beta-galactosidasa a un nivel de expresión de fusión inferior que la que proporciona la actividad independiente de ligando.

Otras fusiones

Además de trkC y asociación de toxR dirigida por GNC-4, tanto la proteína estructural de VSH ICP35 como la proteína de la VIH integrasa son competentes para dirigir la función de toxR (véase la figura 6). Otras regiones de unión periplásmicas adecuadas para esta invención incluyen los receptores de quimiotaxis bacterianos tar (aspartato) o tsr (serina), receptor humano de insulina y VIH proteasa. Todas estas funciones permitirán la selección para identificar los inhibidores específicos a sus dominios de dimerización respectivos.

Materiales y procedimientos Cepas

La cepa 569B rpf de Vibrio cholerae, biotipo clásico, serotipo Inaba (cortesía de H. Smith), número de colección de cultivo de BMS SC15307) se usó para todos los aislamientos de ADN de Vibrio cholerae.

La cepa de E. coli JM101 (Messing 1979) se usó en todos los experimentos de transactivación de ctx. Las cepas de E. coli DH5\beta (gibco-BRL) y JM 101 se usaron para el mantenimiento general y amplificación de plásmidos.

Medio

Cepas de Vibrio se desarrollaron en NB (caldo nutritivo) suplementado con NaCl al 0,5% a 30ºC. Las cepas de E. coli se desarrollaron en caldo LB (Luria-Bertani) a 37ºC. Cuando se requería selección de plásmidos, se usó ampicilina a 50 \mug/ml y estreptomicina a 50 \mug/ml. Se usó cloranfenicol a concentraciones variables como se describe en el texto.

Técnicas genéticas

Se usaron procedimientos convencionales para el aislamiento y manipulación de ADN de plásmido (Maniatis, T., Fritsch, E. F. y DSambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A laboratory Manual (Cold spring Harbor Lab., Plainview, NY). Se preparó ADN genómico de Vibrio como se describe en Clark, J. M. y Switzer, R. L. (1977) Experimental Biochemistry, p. 230(W. H. Freeman Co., NY).

Se formaron supresiones unidireccionales usando ExoIII, nucleasa de habas orientales, ligasa de ADN de T4 a partir de un kit de supresión unidireccional (Stratagene) de acuerdo con los protocolos suministrados por el fabricante. En resumen, el plásmido pTOX5TRKC se digirió con las endonucleasas de restricción SfiI y NotI antes de la adición de ExoIII. Se tomaron alícuotas a intervalos de un minuto durante 5 minutos a partir de mezcla de ExoIII y los extremos de plásmidos se purgaron con nucleasa de habas orientales y después se ligaron para crear las supresiones en la parte trkC de la quimera toxR-trkC. Estos plásmidos se transformaron en JM101/pCTX3 (J3) y se ensayaron para evaluar la \beta-galactosidasa como una medida de la capacidad de transactivar ctx-LACZ. Las fusiones activas tales como pTOX5TRKC \Delta12 se secuenciaron después (B. Keinzle) sobre un secuenciador de ADN de ABI para definir los puntos finales de supresión y verifican que se generó una fusión en fase.

El ADN se amplificó mediante PCR usando un ciclador 480 de ADN térmico CETUR de Perkin-Elmer y un kit de amplificación de ADN Gene Amp. La mezcla de reacción contenía tampón 1 C Amplitaq con cloruro de magnesio 1,5 mM, 200 mM de cada dNTP, 2,5 U Amplitaq polimerasa, cebadores de 5' y 3' 1,0 \muM y 10-100 ng de ADN de molde en un volumen total de \mul. En general la amplificación consistía de un ciclo de 5 minutos a 94ºC, 35 ciclos constituidos por un minuto a 94ºC seguido de 2 minutos a 52ºC después 3 minutos a 72ºC y se completó con un ciclo final de 8 minutos a 72ºC. Los productos de PCR se analizan sobre geles de agarosa al 0,8% y después se digirieron con endonucleasas de restricción (en los sitios modificados por ingeniería genética en los cebadores) antes del ligamiento en el vector huésped.

Se usaron procedimientos convencionales para SDS-PAGE e inmunotransferencia de las proteínas de fusión toxR (Maniatis, T., Fritsch, E. F. y Sambrook J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Lab., Plainview, NY. En general, se cargaron proteínas de células enteras o proteína purificada en minigel Daiichi de SDS al 10% y se desarrolló electroforesis a una corriente constante de 40 mA en tampón 1 X Laemmli durante una hora. Después de la electroforesis, la proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa soportada en un tanque de transferencia de Hoeffer durante una o dos horas en una corriente constante de 375 mA. Se llevó a cabo análisis de Western usando una dilución 1 : 1000 del anticuerpo primario (suero policlonal anti-GSTTOX5 de conejo) seguido de una segunda incubación con dilución 1 : 3000 del anticuerpo secundario (anticuerpos monoclonales anti-conejo de ratón o de cabra, BioRad) conjugado a fosfatasa alcalina. La membrana se bloqueó con leche desnatada en polvo al 5% en solución salina tamponada con Tris (blotto) antes de la adición del anticuerpo primario y se lavó tres veces con blotto después de la adición de cada anticuerpo. Se visualizaron proteínas antigénica usando sustrato estabilizado con azul de Western para fosfatasa alcalina (Promega).

Vectores de plásmidos

pCTX3 y pCTX4. El plásmido pCTX3 se construyó mediante digestión de pMLB1109 con PstI y BalI, i aislando el fragmento apropiado de 5 kb. Este fragmento se ligó después a PstI de 5,7 Kb y el fragmento SmaI de pMS421. El plásmido resultante, pCTX2, se digirió parcialmente con EcoRI para suprimir la región de 1,7 Kd lacI^{Q}. Los extremos EcoRI del parcial se cargaron con polimerasa Klenow y dNTPa, y después se ligaron para producir el vector pSLAC2. El plásmido pCTX3 se construyó clonando un fragmento de PCR flanqueado por EcoRI-BamHI del promotor CTX de p3083 (R. Finklestein) en pSLAC2 digerido por EcoRI y BamHI para producir el plásmido de 9,1 Kb. El plásmido pCTX4 se generó insertando el fragmento de pCAMVCN digerido por BamHI y CLAI (oharmacia) que contiene el gen CAT en pCTX3 digerido por BamHI y CLAI.

pTOX3, pTOX4 y pTOX5. El plásmido pTOX3 se construyó mediante amplificación por PCR de la región codificadora toxR con un sitio de restricción PstI en 5' que contiene el cebador de PCR y un sitio de restricción SfiI en 3' que alberga el cebador de PCR que usa ADN preparado genómico a partir de la cepa 569B rpf de V. cholerae obtenida a partir de H. Smith. Los fragmentos de PCR resultantes se clonaron en pSPORT1 digerido por PstI-y SfiI (BRL).

El plásmido pTOX4 se construyó mediante amplificación por PCR, a a partir del ADN de V. cholerae genómico, la región codificadora de toxR truncada en 989 pares de bases de la fase de lectura toxR usando un cebador de PCR con un sitio de restricción PstI en 5' y un segundo cebador con tanto sitios de restricción SfiI en 3' como codones de parada. ERl fragmento de PCR resultante se clonó en pSPORT1 digerido por PstI y SfiI (BRL).

El plásmido pTOX5 se construyó mediante amplificación por PCR de una versión truncada de la región codificadora de toxR en 827 pares de bases del marco de lectura toxR de una manera estrictamente análoga a la usada en la construcción pTOX4.

pTOX5ICP35. El plásmido pTOX5ICP35 se desarrolló mediante digestión de pT71CP35K (I. Deckman) con KpnI y NcoI produciendo un fragmento que contiene la región codificadora de ICP35 de VSH. El sitio NcoI de este fragmento se cargó con Taq polimerasa y dNTPs. Esta inserción modificada se clonó en pTOX5 digerida con KpnI y StuI proporcionando una fusión del marco de lectura ICP35 alineado con el del gen truncado de toxR.

pTOX5TRKC+TM. El plásmido pTOX5TRKC+TM se construyó generando un fragmento de PCR de 1,3 kb de la región codificadora trkC a partir de la posición 32 a la posición de 1391 de pares de bases de la fase de lectura trkC de pFL19 (M, Barbacid) que contiene los extremos XbaI en 3' y HindIII en 5' con codones de parada derivados de los cebadores de PCR. Después este fragmento se clonó (no en fase) en pTOX5 digerido por XbaI y HindIII para crear un vector que se podría usar para preparar las supresiones unidireccionales de trkC truncado justo pasado el dominio transmembrana condensado a toxR.

pTOX5TRKC+TM. El plásmido pTOX5TRKC+TM se generó de la misma manera que pTOX5TRKC+TM, pero el fragmento generado por PCR de 1,3 kb (posición 32 a 1318 trkC) no contenían el dominio transmembrana trkC.

pTOX5TRKC+TM del 12. El plásmido pTOX5TRKC-TM \Delta12 se creó tratando con pTOX5TRKC+TM digerido con ExoIII, SfiI y NotI. El tratamiento de ExoIII se detuvo a intervalos de un minuto, y se añadió nucleasa de haba orienta para purgar los extremos antes de la reunión de las supresiones de plásmido con ligasa de T4. El número de supresión 12 se secuenció y mostró que estaba en un segmento toxR-trkC de supresión en fase de pTOX5TRKC-TM. La unión de la supresión contiene los restos de aminoácidos TG del extremo del gen toxR truncado con el engarce de intervención RSRSE unido a la metionina inicial de la secuencia trkC.

pTOX5HIVPROT. El plásmido pTOX5HIVPROT se fabricó a partir del gen de proteasa de VIH amplificado por PCR de 300 pares de bases flanqueado por SfiI (P-F. Lin) clonado en fase en pTOX5 digerido por SfiI.

pTOX5HIVINT. El plásmido pTOX5HIVINT se formuló insertando un producto de PCR de 896 pares de bases del gen de la integrasa de VIH, con un sitio SfiI en el extremo 5' y el sitio XbaI en el extremo 3' derivado de los cebadores (P-F. Lin), en pTOX5 digerido por SfiI y XbaI para producir una fusión en fase de la integrasa de VIH con toxR.

pTOX5GCN4. El plásmido pTOX5LINK se estableció para permitir la clonación en fase de las cremalleras de leucina de la proteína reguladora de levadura GCN4 con los extremos SalI y BamHi. este vector se creó mediante digestión de pTOX5 con SalI y BamHi, y clonando en dos oligonucleótidos hibridazos (secuencias 5' a 3' GTCGACG y GTACCGTCGACCTC). El plásmido pTOX5GCN4 se originó liberando un fragmento de 129 pares de bases de pJH370 digerido por SalI y BamHi (J. Hu) y clonando esta pieza en pTOX5LINK digerido por SalI y BamHi.

pTOX5LP19, pTOX5LV19, pTOX5LY19, pTOX5LI19, pTOX5LN19, pTOX5LK19. Los plásmidos pTOX5LP19, pTOX5LV19, pTOX5LY19, pTOX5LI19, pTOX5LN19, pTOX5LK19 se modificaron por ingeniería genética de manera idéntica a pTOX5GCN4 pero incluía los fragmentos SalI y BamHi de pJH524, pJH505, pJH506, pJH518, pJH521, pJH528 (J. Hu) respectivamente.

pGSTTOX5. El plásmido pGSTTOX5 se preparó digiriendopGEX-3X (Pharamcia) con SalI y BamHi y clonando en toxO truncado amplificado por PCR a partir de pTOX5 con extremos compatibles.

Ensayos

Los ensayos de \beta-galactosidas se realizaron esencialmente como se describe por Menzel (Analytical Biochemistry 181, p. 40-50 1989.)

Los ensayos en placas de agar para la activación de ctx basándose en al resistencia a cloranfenicol se realizaron con cepas JM101 que contienen el plásmido pCTX4 y cualquiera de los siguientes plásmidos de activación; pTOX3, pTOX5, pTOX5GCN4, pTOX5ICP35, o pTOX5VININT. Los cultivos de una noche se desarrollaron en LB con IPTG 100 \muM. Uno a dos microlitros del cultivo de una noche se distribuyeron por motas sobre placas de agar LB con IPTG 100 \muM y los niveles de cloranfenicol se indicaron en el texto. La actividad de toxR se puntuaron basándose en la capacidad de desarrollarse sobre niveles no mostraron ninguna resistencia a cloranfenicol.

Las abreviaturas usadas en esta memoria descriptiva se definen como sigue.

AcMNPV

Virus de polihedrosis de núcleos múltiples de Autographa californica

bp

pares de bases

CAT

cloranfenicol transferasa

ADNc

ADN complementario

ADN

Ácido desoxirribonucleico

VIH

Virus de inmunodeficiencia humana

VSH

Virus herpes simplex

IPTG

isopropiltiogalactósido

kb, kbp

kilo pares de abses

NT

neurotrofina

PCR

reacción en cadena de la polimerasa

phoA

fosfatasa alcalina

ARN

Ácido ribonucleico

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Menzel, Rolf

\hskip3.9cm

Taylor. Scout T.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SISTEMA DE UNIÓN A MEMBRANAS PERIPLÁSMICAS PARA LA DETECCIÓN DE INTERACCIONES PROTEÍNA-PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Burton Rodney

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: P.O. Box 4000

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

LOCALIDAD: Princeton

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Nueva Jersey

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO: 08543-4000

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS(MS-DOS)

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0 versión nº 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFROMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Gaul, Timothy J.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33.111

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: DC28

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (609) 252-5901

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (609) 252-4526

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1105 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 843 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 145 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

3

Claims (12)

1. Una célula hospedadora que comprende

(a)

una proteína de fusión de transmembrana que tiene

(i)

una región toxR codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ IC Nº: 2, y

(ii)

una región periplásmica capaz de formar un dímero espontáneamente o tras la unión del ligando; y

(b)

una molécula de ácido nucleico que tiene un gen indicador unido operativamente al operón ctx:

en la que la formación de dímero se señala mediante la expresión del gen indicador.

2. Una proteína de fusión de transmembrana, que comprende

(a)

una región toxR codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ IC Nº: 2, y

(b)

una región periplásmica capaz de formar un dímero espontáneamente o tras la unión de un ligando.

3. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de transmembrana de la reivindicación 2.

4. Un vector de expresión, que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 3.

5. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la que la región periplásmica forma un dímero tras la unión de un ligando.

6. Un procedimiento para detectar la unión de un ligando a una región periplásmica capaz de formar un dímero tras la unión de un ligando, que comprende:

(a)

tratar un cultivo de las células hospedadoras de la reivindicación 5 con un ligando, y

(b)

seleccionar para la expresión del gen indicador.

7. La célula hospedadora de la reivindicación 1, designada ATCC 69.403 o ATCC 69.404.

8. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la que la región periplásmica comprende la región de unión de ligando de trkC.

9. La célula hospedadora de la reivindicación 2, en la que la región periplásmica comprende la región de unión de ligando de trkC.

10. El ácido nucleico de la reivindicación 3, en la que la región periplásmica comprende la región de unión de ligando de trkC.

11. El vector de expresión de la reivindicación 4, en la que la región periplásmica comprende la región de unión de ligando de trkC.

12. El procedimiento de la reivindicación 6, en al que la región periplásmica comprende la región de unión de ligando de trkC.