ES2260794T3 - Estimulacion de los mecanismos de defensa del huesped contra los tumores. - Google Patents

Abstract

UN PROCEDIMIENTO PARA TRATAR LA ENFERMEDAD NEOPLASTICA EN UN MAMIFERO, POR LA ADMINISTRACION AL MAMIFERO DE UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA DE UN INTERFERON, POR CONTACTO NASOMUCOSO. LA CANTIDAD DE INTERFERON ADMINISTRADO ES MENOR QUE UNA CANTIDAD QUE INDUZCA UNA RESPUESTA PATOLOGICA CUANDO SE ADMINISTRA PARENTERALMENTE.

Description

Estimulación de los mecanismos de defensa del huésped contra los tumores.

La presente invención se refiere a procedimientos de estimulación de mecanismos de defensa del huésped contra enfermedades patológicas en un mamífero huésped mediante la administración de interferón a través la oromucosa. En particular, la invención puede aplicarse a procedimientos para el tratamiento del cáncer.

Antecedentes de la invención

Los interferones alfa se utilizan ampliamente para el tratamiento de un gran número de tumores malignos hematológicos, incluyendo la leucemia de células pilosas, la leucemia mielogénica crónica, los linfomas de grado bajo, los linfomas cutáneos de células T y los tumores sólidos, tales como por ejemplo el carcinoma de células renales, el melanoma, los tumores carcinoides y el sarcoma de Kaposi asociado al SIDA (Gutterman, J.U., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 1198-1205; WO 8803411). Los efectos antitumorales se observan habitualmente a elevadas dosis, a menudo del orden de decenas de millones de unidades de interferón-\alpha (IFN-\alpha), administradas mediante inyección parenteral. El interferón-\alpha es un interferón de Tipo I, una clase que también incluye los interferones \beta y \omega. Aunque se han utilizado habitualmente diversas rutas de administración para la administración de interferones de tipo I, incluyendo la inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular, tópica e intralesional, la ruta oral no se ha utilizado de forma general porque los interferones son proteínas que se consideran que son inactivadas por las enzimas proteolíticas y que no se absorben de forma apreciable en su forma nativa en el tracto gastrointestinal. De hecho, diversos estudios han sido incapaces de detectar interferones en sangre después de su administración oral (Cantell y Pyhäla, J. Gen. Virol., 1973, 20: 97-104; Wills et al., J. IFN Res., 1984, 4: 399-409; Gilson et al., J. IFN Res., 1985, 5: 403-408).

Ha habido varios informes anecdóticos sobre la eficacia de dosis bajas de interferón administrado como un spray nasal o como una formulación líquida oral en el tratamiento de una diversidad de enfermedades, en particular la influenza. En una serie de documentos de patente se ha descrito la utilización de dosis bajas de interferón de origen de especies heterólogas administrado oralmente para el tratamiento de la rinotraqueitis infecciosa ("fiebre de embarque") en el ganado y de la leucemia felina y también para el tratamiento de otras enfermedades, para el aumento de la eficacia de vacunas; para mejorar la eficacia de la utilización de comida; y para la prevención de la teileriosis bovina. Véase la patente EEUU Nº. 4.462.985, la patente australiana Nº. 608519, la patente australiana Nº. 583332 y la patente EEUU Nº. 5.215.741, respectivamente. Adicionalmente, la patente EEUU Nº. 5.017.371 describe la utilización de interferón de esta manera para el tratamiento de los efectos secundarios de la quimioterapia o radioterapia del cáncer. En estos documentos, el interferón utilizado era interferón-\alpha humano preparado mediante el procedimiento de Cantell, administrado en una solución salina tamponada de fosfato a una dosis de 0,41 a 5 IU por libra de peso corporal. Aunque dichos documentos sugieren que dichas dosis bajas de interferón administrado en la mucosa orofaríngea, preferentemente en una forma adaptada para un contacto prolongado con la mucosa oral, pueden ser eficaces para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades, incluido el cáncer, la evidencia experimental en el caso de enfermedades diferentes de la fiebre de embarque, de la leucemia felina, del parvovirus canino y de la teileriosis es muy anecdótica. En particular, no se presenta ningún ensayo controlado adecuado de dicho tratamiento en ningún modelo animal para los cánceres humanos.

En cambio, la invención descrita en el presente documento se basa en el primer estudio controlado en un modelo animal de la eficacia del interferón administrado vía oromucosal para el tratamiento del cáncer.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para el tratamiento del cáncer en un humano a través de la administración al humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de un interferón a través del contacto oromucosal. La cantidad de interferón administrado es menor que la cantidad que induce una respuesta patológica cuando se administra por vía parenteral. En particular, la invención proporciona un procedimiento para el tratamiento del mieloma múltiple, la leucemia de células pilosas, la leucemia mielogénica crónica, el linfoma de grado bajo, el linfoma cutáneo de células T, los tumores carcinoides, el cáncer cervical, los sarcomas, incluyendo el sarcoma de Kaposi, los tumores de riñón, los carcinomas, incluyendo el carcinoma de células renales, el carcinoma celular hepático, el carcinoma nasofaríngeo, los tumores malignos hematológicos, el cáncer colorectal, el glioblastoma, los papilomas laríngeos, el cáncer de pulmón, el cáncer de colon, el melanoma maligno o los tumores cerebrales, incluyendo tumores cerebrales malignos. En una realización de la invención, el procedimiento puede aplicarse de forma general para el tratamiento de tumores de etiología no vírica.

La administración oromucosal puede implicar administrar una dosis efectiva de interferón en una dosis única o la dosis efectiva puede administrarse en varias dosis más pequeñas durante un período de tiempo suficiente para obtener una estimulación del sistema de defensa del huésped equivalente a la de una dosis única. Asimismo, la dosis efectiva de interferón puede administrarse de forma continua durante un período de tiempo suficiente para obtener una estimulación del sistema de defensa del huésped equivalente a la de una dosis única.

El procedimiento se pone en práctica administrando desde aproximadamente 1 x 10^{4} IU hasta aproximadamente 20 x 10^{6} IU de interferón, más preferentemente desde aproximadamente 1 x 10^{4} IU hasta aproximadamente 1 x 10^{6} IU de interferón, siempre y cuando la dosis seleccionada sea tal que no induzca una respuesta patológica parenteral, tal y como se define en la presente invención, o que sea menor que la cantidad que induce una respuesta patológica si se administra por vía parenteral. Dichos intervalos de dosis se refieren en general al interferón homólogo \alpha en el hombre. Para otro tipo de interferones, la dosis que inducirá una respuesta patológica puede diferir de la inducida mediante el interferón homólogo \alpha en el hombre. Un médico que trate un paciente con un tipo particular de interferón será capaz de identificar fácilmente el intervalo de dosis adecuada para el paciente a tratar.

Una composición farmacéutica para su administración oromucosal puede comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de cómo mínimo un interferón. La composición puede proporcionarse como una disolución, comprimido, pastilla, gel, jarabe, pasta o mediante un sistema de entrega oromucosal de liberación controlada. Opcionalmente, la composición puede contener tampones, estabilizadores, agentes espesantes, potenciadores de la absorción, potenciadores de la viscosidad y similares.

La composición farmacéutica puede proveerse en una forma de unidad de dosificación que tenga de 1 x 10^{4} IU a 20 x 10^{6} IU de interferón, más preferentemente de 1 x 10^{4} IU a 1 x 10^{6} IU de interferón.

El procedimiento puede llevarse a la práctica como la única aproximación terapéutica o como adyuvante a una quimioterapia o radioterapia o junto a otras citoquinas, tales como la interleucina-2, 12 ó 15 o con inductores de IFN.

El procedimiento se lleva a cabo utilizando un interferón de Tipo I ó II, seleccionado entre \alpha, \beta, \gamma, \omega e interferones consenso, más preferentemente con un IFN-\alpha recombinante.

Descripción detallada de la invención

La invención se describe a continuación en detalle sólo a modo de referencia utilizando las siguientes definiciones y ejemplos. Todas las patentes y publicaciones a las cuales se hace referencia en el presente documento se han incorporado expresamente como referencia.

Definiciones

Tal y como se utiliza en la presente invención, "interferón" se refiere a un interferón de Tipo I o de Tipo II, incluyendo aquéllos designados comúnmente como \alpha, \beta, \gamma \omega, y las mezclas de los mismos, incluyendo la secuencia consenso. Los interferones pueden adquirirse en una amplia variedad de fuentes comerciales y se han aprobado para el tratamiento de numerosas indicaciones. El interferón puede ser de fuentes naturales, pero es preferentemente un producto recombinante. Para los objetivos de la invención, el término "interferón" incluye también los fragmentos polipeptídicos que tienen actividad de interferón y las formas quiméricas o mutantes del interferón en las cuales se han introducido modificaciones en la secuencia, por ejemplo, para aumentar la estabilidad, sin afectar la naturaleza de su actividad biológica, tal y como se describe en las patentes EEUU Nº. 5.582.824, 5.593.667 y 5.594.107, entre
otras.

Opcionalmente, el interferón puede administrarse al mismo tiempo que un inductor de la síntesis y liberación de interferón. El inductor puede administrarse junto al interferón o puede administrarse separadamente. Entre los inductores de interferón se incluyen, por ejemplo, los polinucleótidos tipo poli I:C; se utiliza preferentemente un interferón administrable oralmente de bajo peso molecular. En el estado de la técnica se han descrito algunos inductores adecuados, por ejemplo la Tilorona (patente EEUU Nº. 3592819; Albrecht et al., J. Med. Chem., 1974, 17: 1150-1156) y el derivado de la quinolona Imiquimod (Savage et al., Brit. J. Cáncer, 1996, 74: 1482-1486).

Los procedimientos y composiciones de la invención pueden utilizarse opcionalmente conjuntamente con uno o más tratamientos diferentes para la enfermedad específica, y el médico o veterinario asistente será capaz de seleccionar fácilmente dichos otros tratamientos que sean apropiados según las circunstancias.

En una realización, la invención proporciona un procedimiento para el tratamiento del cáncer en un humano, que comprende la etapa de administración de interferón tal y como se ha descrito anteriormente. El cáncer puede ser un cáncer en metástasis.

Aunque el procedimiento de la invención puede utilizarse sin un tratamiento simultáneo con otros agentes, se contempla que esta realización de la invención será particularmente útil en los siguientes marcos:

a)

como terapia adyuvante, después de cirugía, de quimioterapia o radioterapia realizadas mediante protocolos estándares

b)

para el tratamiento de cánceres sensibles a interferón, el procedimiento de la invención se utiliza aisladamente o conjuntamente con quimioterapia o radioterapia convencional; y

c)

para el tratamiento de cánceres resistentes a interferón, el procedimiento de la invención se utiliza aisladamente o más preferentemente conjuntamente con quimioterapia o radioterapia convencional.

Los procedimientos indicados anteriormente se dirigen a la inducción y/o mantenimiento de la remisión de la enfermedad. Por "conjuntamente con otro tratamiento" se entiende que el interferón se administra antes, durante y/o después de la radioterapia u otra quimioterapia. El protocolo más adecuado dependerá de diversos factores, tal y como se describe posteriormente.

En particular, se contempla que el procedimiento de la invención se utilizará preferentemente conjuntamente con como mínimo un tratamiento diferente seleccionado entre el grupo que consiste en quimioterapia utilizando fármacos citoestáticos, una o más citoquinas diferentes que tengan actividad anti-cáncer pero que tengan un mecanismo de acción diferente del interferón, agentes anti-angiogénicos y agentes que potencien la actividad del interferón. Preferentemente, la segunda citoquina es interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-12 (IL-12), o interleucina-15 (IL-15); preferentemente el inhibidor de la angiogénesis es AGM-1470 [éster (3R-(3\alpha, 4\alpha(2R*, 3R*), 5\beta, 6\beta))-5-metoxi-4-(2-metil-3-(3-metoxi-2-butenil)oxiranil)-1-oxaspiro(2,5)oct-6-ílico del ácido(cloroacetil)-carbámico]; preferentemente el tratamiento potenciador del interferón es la hipertermia o el butirato de arginina.

Entre los fármacos citoestáticos preferidos para administrar conjuntamente con el interferón se incluyen, pero no se limitan a, ciclofosfamida, cisplatino, carboplatino, carmustina (BCNU; N,N-bis(2-cloroetil)-N-nitrosourea), metotrexato, adriamicina, \alpha-difluorometilomitina y 5-fluorouracilo.

Los cánceres susceptibles a dicho procedimiento incluyen, pero no se limitan a, cánceres que responden a la administración parenteral de elevadas dosis de IFN-\alpha, tales como tumores malignos hematológicos, por ejemplo, el mieloma múltiple, la leucemia de células pilosas, o la leucemia mielogénica crónica, los linfomas de grado bajo, el linfoma de células T cutáneas, los tumores sólidos tales como el carcinoma de células renales y el melanoma, los tumores carcinoides o el sarcoma de Kaposi asociado al SIDA, en particular los tumores de etiología no vírica.

En la preparación de las composiciones farmacéuticas utilizadas en la presente invención, pueden utilizarse diversos vehículos y excipientes para el IFN, de manera evidente para un experto en la materia. Una tecnología de formulación representativa se explica, inter alia, en Rémington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995 y sus ediciones predecesoras. La formulación de IFN puede comprender potenciadores de la estabilidad, tales como la glicina o la alanina, tal y como se describe en la patente EEUU Nº. 4.496.537 y/o uno o más transportadores, tales como la proteína transportadora. Por ejemplo, para el tratamiento en humanos, se utiliza normalmente la albúmina del suero humano de grado farmacéutico, opcionalmente junto a una disolución salina tamponada de fosfato como diluyente. Si el excipiente de IFN es la albúmina del suero humano, ésta puede derivarse del suero humano o puede ser de origen recombinante. Normalmente, cuando se utiliza la albúmina del suero, será de origen homólogo.

El IFN puede administrarse mediante cualquier medio que proporcione un contacto del IFN con la cavidad oromucosal del receptor. Así pues, se entenderá claramente que la invención no se limita a cualquier tipo particular de formulación. El presente documento describe la administración de IFN de forma profunda en la cavidad oromucosal; esto puede conseguirse con líquidos, sólidos o aerosoles, así como con gotas nasales o sprays nasales. Así pues, la invención incluye, pero no se limita a, líquido, spray, jarabe, pastilla, comprimidos bucales y formulaciones nebulizadoras. Un experto en la materia reconocerá que para las formulaciones para aerosol o nebulizador, el tamaño de partícula de la preparación puede ser importante, y será consciente de procedimientos adecuados según los cuales puede modificarse el tamaño de partícula.

Según un aspecto de la invención, el interferón se administra en una única dosis diaria. Alternativamente, el interferón se administra en diversas dosis más bajas, distribuidas a lo largo del tiempo, de manera que el efecto neto es equivalente a la administración de la dosis única mayor. Una aproximación para dicho modo de entrega es a través de la disposición de un aparato para la liberación sostenida o controlada adherido o implantado en la cavidad oromucosal y diseñado para liberar interferón a lo largo del tiempo en una cantidad equivalente a la de una única dosis elevada.

Entre las formulaciones representativas del interferón para su Utilización oromucosal se incluyen las siguientes (todos los % son en peso/peso):

Comprimido: dextrosa BP 45%; gelatina BP 30%; almidón de trigo BP 11%; carmelosa de sodio 5%; albúmina de huevo BPC 4%; leucina USP 3%; propilenglicol BP 2%; y IFN-\alpha2 1 x 10^{6} IU. El comprimido puede utilizarse tal cual y dejar que se disuelva lentamente en la boca o puede disolverse en agua y mantenerse en la boca en contacto con la oromucosa, según sea necesario.

Puede prepararse una pasta de interferón, tal y como se describe en la patente EEUU Nº. 4.675.184, a partir de glicerina 45%, CMC sódica 2%, tampón citrato (pH 4,5) 25%, agua destilada hasta el 100% y 1x 10^{6} IU de IFN-\alpha2. La pasta de interferón puede adherirse a la mucosa bucal.

Asimismo, puede preparase una formulación para hacer gárgaras o un jarabe añadiendo la cantidad deseada de interferón a una formulación de enjuague bucal comercial o a una formulación de jarabe para la tos comercial.

Dentro de los intervalos de dosificación específicos a los que se ha hecho referencia anteriormente, el tratamiento óptimo en cualquier caso individual dependerá de la naturaleza de la enfermedad en cuestión, el estadio de la enfermedad, la terapia previa, otra terapia en continuación, el estado general de salud del paciente, la sensibilidad del sujeto al interferón, etc, y por lo tanto, será a criterio del médico, teniendo en cuenta dichas circunstancias. La extensión del tratamiento variará, evidentemente, dependiendo de la enfermedad que se está tratando, por ejemplo, el tratamiento de un cáncer de crecimiento lento, tal como cáncer de próstata, se espera que implicará un curso de tratamiento diferente que el tratamiento de un cáncer con crecimiento rápido, tal como el carcinoma celular hepático.

La dosis efectiva descrita en el presente documento es aquella que no genera una respuesta patológica en el paciente cuando se administra vía parenteral. Una respuesta patológica puede ser aguda, crónica o cumulativa y puede manifestarse por cambios en la química de la sangre, como la leucopenia, por una depresión de la médula ósea y otros parámetros histológicos. En el sentido utilizado en el presente documento, una respuesta patológica incluye efectos secundarios adversos, como fiebre, malestar o síntomas similares a la gripe, reacciones vasculares, como la flebitis y reacciones de inflamación local en el sitio de inyección. Dichas respuestas variarán considerablemente entre la población de pacientes dependiendo de las variaciones individuales en la sensibilidad al interferón. Un análisis simple para identificar una dosis baja aceptable de interferón para la terapia individual es inyectar al paciente la dosis aceptable putativa, basada en consideraciones de edad, peso, indicación, progresión, etc. y determinar si la inyección produce una respuesta patológica tal como se ha definido en el presente documento, siendo la irritación local en el sitio de inyección el criterio más fácil de establecer. Si no se observa respuesta adversa, puede administrarse la misma dosis vía oromucosal. Si hay una respuesta no deseada, el proceso se repite a una dosis inferior, hasta que se identifica una dosis no patológica.

Para muchos pacientes, se espera que las dosis oromucosales serán aproximadamente las mismas que las que se sabe que son bien toleradas y efectivas en protocolos parenterales existentes aprobados. Por lo tanto, para los objetos de especificidad, una dosis baja aceptable de interferón será de aproximadamente 1 x 10^{4} IU a aproximadamente
20 x 10^{6} IU de interferón por día, más preferentemente de aproximadamente 1 x 10^{4} IU a aproximadamente 1 x 10^{6} IU de interferón por día, siempre y cuando la dosis sea tal que no induzca una respuesta patológica si se administra vía parenteral. En una realización de la invención, la dosis total puede administrarse en múltiples dosis más bajas a lo largo del tiempo, o puede entregarse de forma continua o de forma pulsátil a partir de un aparato de entrega controlada adherido o implantado en la oromucosa.

Interferones y formulaciones de interferón IFN-\alpha/\beta de ratón

Se preparó IFN-\alpha/\beta de ratón (Mu IFN-\alpha/\beta) a partir de cultivos de células C243-3 inducidas con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) y se purificaron tal y como se ha descrito previamente (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1974, 146: 809-815). La preparación utilizada en este estudio tenía una valoración de 4 x 10^{6} Unidades Internacionales (IU)/ ml y una actividad específica de 5 x 10^{7} IU/mg de proteína, ensayado sobre células 929 de ratón estimuladas con el virus de la estomatitis vesicular (VSV), tal como se ha descrito previamente (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1974, 146: 809-815). La preparación se estandarizó contra la preparación de referencia internacional de IFN-\alpha/\beta murino de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) (G-002-9004-541).

IFN-\alpha-1-8 humano

Se preparó IFN-\alpha 1-8 humano recombinante (Hu IFN-\alpha; BDBB lote nº. CPG 35269-1, Ciba-Geigy, Basilea, Suiza) y se purificó tal y como se ha descrito previamente (Meister et al., J. Gen. Virol., 1986, 67: 1633-1643). La preparación utilizada en este estudio tenía una valoración de 70 x 10^{6} IU/ml sobre células WISH humanas homólogas estimuladas con VSV tal como se ha descrito previamente (Tovey et al.,Nature, 1977, 267: 455-457) y una valoración de 1 x 10^{6}
IU/ml sobre células L929 de ratón heterólogas. La preparación se estandarizó contra la preparación de referencia internacional NIH de IFN-\alpha humano (G-023-901-527) y contra el estándar NIH IFN-\alpha/\beta murino (G-002-9004-5411). La actividad específica de la preparación IFN era de 2 x 10^{8} IU/mg.

Interferón-\alpha murino recombinante

Se compró interferón-\alpha murino recombinante en Life Technologies Inc. La preparación utilizada en este estudio (lote nº. HKK404) tenía una valoración de 6 x 10^{6} IU/ml y una actividad específica de 6 x 10^{8} IU/mg de proteína, ensayado sobre células 929 de ratón estimuladas con el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1974, 146: 406-415).

Interferón \beta murino recombinante

Se compró interferón \beta murino recombinante en R&D Systems, Inc. La preparación utilizada en este estudio (lote nº. 1976-01S) tenía una valoración de 3,2 x 10^{4} IU/ml y una actividad específica de 8 x 10^{6} IU/mg de proteína, ensayado sobre células 929 de ratón estimuladas con el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1974, 146: 406-415).

Interferón \gamma murino recombinante

Se compró interferón-\gamma murino recombinante en R&D Systems Inc. La preparación utilizada en este estudio (2580-03SA) tenía una valoración de 2 x 10^{5} IV/ml y una actividad específica de 1 x 10^{7} IU/mg de proteína, ensayado sobre células 929 de ratón estimuladas con el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1974, 146: 406-415).

Todas las preparaciones de interferón se valoraron simultáneamente en el mismo ensayo y se estandarizaron contra la preparación de referencia internacional de interferón \alpha/\beta murino de los Institutos Nacionales de la Salud(G-002-9004-5411).

Tanto el interferón \alpha/\beta murino como los interferones murinos recombinantes se diluyeron en el excipiente Fe-
rimmune^{TM} antes de su administración.

Excipiente

Las preparaciones de interferón se diluyeron en solución salina tamponada de fosfato (PBS) que contenía albúmina del suero bovino (BSA). La fracción V de la albúmina del suero bovino (grado RIA; libre de inmunoglobulinas; número de catálogo A7888; Sigma; EEUU) se disolvió hasta una concentración final de 100 \mug/ml en PBS (pH 7,4) y se esterilizó por filtración (0,2 \mu, Millex-GV, Millipore, EEUU).

En los experimentos descritos en la presente patente, las preparaciones de interferón se diluyeron en un excipiente apropiado. El excipiente utilizado es como sigue, proporcionado en forma de comprimidos (Ferimmune^{TM}, Pharma Pacific):

	\hskip0,4cm % peso/peso	mg/comprimido
Dextrosa (Glucosa) BP**	\hskip0,9cm 44,67***	55,84
Gelatina BP**	30,06		37,58
Almidón de trigo BP**	11,31		14,14
Carmelosa de sodio BP**	4,96		6,20
Albúmina de huevo BPC**	4,03		5,04
Leucina USP	3,00		3,75
Propilenglicol BP	1,88		2,35
Dextrano 40** (como inyección de Dextrano 40 BP)	0,06		0,08
Fosfato de sodio BP	0,03		0,04
Cloruro de sodio BP	0,01		0,01
Fosfato ácido de sodio BP	0,01		0,01
Total	100,02		125,04
** \, Calculado sobre una base anhidra
*** Derivado de:
\hskip1,5cmDextrosa (Glucosa) BP (anhidra) \hskip2,14cm 44,64%
\hskip1,5cmGlucosa BP (como inyección de Dextrano 40 BP) 0,03%.

Se disolvió un único comprimido en 1,5 ml de una solución salina tamponada de fosfato, centrifugada a 16.000 g durante 15 min, y entonces se filtro en condiciones estériles (0,2 \mu, Millex-GV, Millipore, EEUU) y se almacenó a 4ºC antes de su utilización. El excipiente se preparó el día antes de su utilización.

Sistema de entrega de interferón

Algunos experimentos preliminares mostraron que la aplicación de 5 \mul de cristal violeta a cada ventana de la nariz de un ratón adulto normal utilizando una micropipeta Eppendorf P20 provocó una distribución casi inmediata del tinte a lo largo de la superficie completa de la cavidad orofaríngea. La tinción de la cavidad orofaríngea todavía era evidente 30 minutos aproximadamente después de la aplicación del tinte. Se obtuvieron resultados esencialmente similares utilizando IFN-\alpha 1-8 humano recombinante marcado con ^{125}I aplicado de la misma manera. Este procedimiento de administración se utilizó por tanto en todos los experimentos posteriores.

Para los objetos de los experimentos animales descritos en la presente descripción, se entiende claramente que las expresiones "oromucosal" u "orofaríngea" o "intranasal/oral" o "intranasal más oral" o "in/or" en relación a la ruta de administración del IFN deben significar la administración profunda de la preparación IFN en la cavidad nasal, de manera que se distribuya rápidamente en la cavidad oromucosal, es decir, la boca y la garganta del mamífero receptor, de manera que haga contacto con la mucosa que recubre dicha cavidad.

Células de eritroleucemia de Friend

Se obtuvo el clon IFN-\alpha/\beta resistente, 3C18, o las células de eritroleucemia de Friend (FLC) a partir de Dr. E. Affabris, Roma y se describe con detalle en Affabris et al., 1982, (Virology, 120: 441-452). Dichas células se mantuvieron posteriormente mediante pasajes in vivo. Brevemente, se inoculó aproximadamente 100 LD_{50} de células 3C18 a ratones DBA/2, mediante inyección peritoneal (ip) y una semana después, se recolectaron las células tumorales a partir del peritoneo del ratón, se contaron y se inoculó de nuevo otros ratones con 100 LD_{50} de células 3C18. Dicho procedimiento se repitió de 60 a 100 pasajes. Se ha mostrado que las células 3C18 utilizadas en el pasaje in vivo
60 a 100 son altamente metastáticos para el hígado y el bazo (Gresser et al., Int. J. Cáncer, 1987, 39: 789-792). El fenotipo de la resistencia IFN se confirmó rutinariamente cultivando in vitro en presencia de IFN-\alpha/\beta las células sometidas a los pasajes in vivo (Belardelli et al., Int. J. Cáncer, 1982, 30: 813-820).

Las composiciones de interferón de la presente invención también son activas contra el clon L1210R6 de las células de linfoma L1210 aisladas en nuestro laboratorio (Gresser et al., 1974, Interferon and cell división - interferón y división celular -. IX. Interferon-resistant L1210 cells: Characteristics and Origin - células L1210 resistentes a interferón: características y origen -. J. Nat. Cáncer Inst., 52: 553-559) y contra el tumor transplantable EL4 derivado de ratones inoculados con el carcinógeno químico 1-2 dimetilbenzantreína (Gorer, P.A., 1950, Br. J. Cáncer, 4: 372-381).

Animales

Los ratones utilizados en el presente estudio se obtuvieron a partir de una colonia específica libre de patógenos (IFFA CREDO, Francia). Se albergaron en una instalación animal específica libre de patógenos en el Institut Federatif CNRS en Villejuif, según los estándares EEC.

Bioensayo de interferón

Se ensayó el interferón según un procedimiento convencional. Brevemente, se diluyeron muestras (20 \mul) en 80 \mul
de Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM) (Gibco, Francia) que contenía un 2% de Suero de Ternero Fetal inactivado por calor (FCS) (Gibco, Francia) y se añadió a cada pozo de una placa de microvaloración (Falcon, número de catálogo 3072) utilizando una micropipeta multicanal (Finnpipette, Labsystem, 50-300 \mul). Se añadieron células WISH o células L929 (2 x 10^{4} células/pozo) en 100 \mul de MEM que contenía un 2% de FCS y se incubó durante una noche a 37ºC en una atmósfera de aire con un 5% de CO_{2} (incubador de CO_{2} Forma 3029). Se examinó entonces la presencia de cualquier señal de toxicidad en las células utilizando un microscopio invertido Olympus IM GLDW equipado con un objetivo 10X. Las muestras que no mostraron una toxicidad detectable se sometieron entonces a diluciones al doble en serie empezando por una dilución inicial 1:10 en un volumen total de 200 \mul de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS, transfiriendo 100 \mul de material diluido con una micropipeta multicanal en un microplato que contenía 100 \mul por pozo de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS. También se prepararon diluciones a la mitad en serie apropiadas del estándar de referencia NIH IFN-\alpha humano (G-023-901-527) o el estándar de referencia NIH IFN-\alpha/\beta murino (G-002-9004-5411). Entonces, si era apropiado se añadió a cada placa las células WISH o las células L929 (2 x 10^{4} células/pozo) en 100 \mul de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS y se incubó durante una noche a 37ºC en una atmósfera de aire con un 5% de CO_{2}. Entonces se comprobó cualquier señal de toxicidad las monocapas celulares y en el caso de ausencia de cualquier toxicidad aparente, el cultivo se aspiró y se substituyó por 200 \mul de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS que contenía 100 TCID50 de VSV (2 x 10^{-4} VSV23 para las células WISH o 10-5 VSV23 para las células L929). Entonces se incubaron las placas durante una noche a 37ºC en una atmósfera de aire con un 5% de CO_{2}. Entonces se examinó el efecto citopático vírico en las monocapas celulares utilizando un microscopio invertido Olympus IM ULWD. Se determinaron las valoraciones de interferón a partir del recíproco de la dilución, que dio un 50% de protección contra el efecto citopático vírico específico y se expresó en unidades de referencia internacional/ml (IU/ml).

Ejemplo 1

Actividad anti-tumor del interferón-\alpha administrado vía oromucosal en ratones estimulados con células de eritroleucemia de Friend

Para establecer si el IFN-\alpha administrado por la ruta intranasal / oral (in/or) aumenta la supervivencia de ratones estimulados con células FLC altamente metastásicas, se estimularon vía intravenosa (iv) grupos de seis ratones macho DBA/2 de 7-8 semanas de edad con 1 x 10^{5} FLC en el día 0.

Cada grupo de ratones se trató dos veces por día durante 10 días consecutivos mediante la ruta in/or con 104 IU de una mezcla natural de subtipos IFN-\alpha murinos múltiples (Mu IFN-\alpha) en 10 \mul BSA-PBS o con un volumen igual de una preparación simulada de IFN, la cual se obtuvo y se purificó de la misma manera que la preparación e IFN excepto por la omisión del inductor de virus. La preparación simulada de IFN no mostró actividad IFN detectable cuando se ensayó en paralelo con la preparación Mu IFN-\alpha purificada. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

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TABLA 1

Grupo	Tratamiento	Día de muerte	Día medio de muerte \pm SE
1	IFN-\alpha Mu simulado	9, 9, 10, 10, 10, 10	9,6 \pm 0,2
2	IFN-\alpha Mu 10^{4} IU	28, 31, 36, >100, >100	31,7 \pm 2,3**
** Calculado sólo para los animales muertos.

La detección oromucosal de 104 IU de IFN-\alpha Mu dos veces al día aumentó dramáticamente el tiempo de supervivencia de ratones a los que se les había inyectado FLC. De hecho, 2 de 5 ratones se curaron efectivamente, ya que estaban vivos y se encontraban bien 100 días después de su estimulación con 2 x 10^{4} LD_{50} de FLC, a pesar de cesar el tratamiento de IFN-\alpha después de sólo 20 días. Los resultados de varios análisis controlados en grupos de 10 ratones DBA/2 adultos infectados con 2 x 10^{4} LD_{50} de FLC y tratados vía oromucosal con 10^{3} IU de IFN-\beta murino recombinante ó 10^{3} IU de IFN-\gamma murino recombinante fueron similares.

Ejemplo 2

Ensayo más amplio de la actividad anti-tumoral del interferón-\alpha a baja dosis vía oromucosal en ratones inyectados con células de eritroleucemia de Friend

Para confirmar los resultados del Ejemplo 1, se llevó a cabo un ensayo más amplio. Ciento cincuenta ratones DBA/2 hembra de 8 semanas de edad se estimularon iv con 1 x 10^{5} FLC (2 x 10^{4} FLC LD_{50}) en el día 0. Los ratones se trataron con el tipo y dosis de IFN indicado, administrado mediante la ruta in/or en un volumen de 10 \mul dos veces al día
durante 10 días consecutivos. Eran 10 ratones en cada grupo de tratamiento. Los resultados se recogen en la Tabla 2.

TABLA 2

Grupo	Tratamiento	Dosis	Excipiente	Día medio de muerte \pm SE
1	Ninguno	-	Ninguno	9,5 \pm 0,2
2	IFN-\alpha Mu simulado	-	BSA/PBS	9,6 \pm 0,2
3	IFN-\alpha Mu	10^{4} IU	BSA/PBS	29,4 \pm 25,6%*
4	IFN-\alpha Mu	10^{3} IU	BSA/PBS	11,6 \pm 0,2
5	IFN-\alpha Mu	10^{2} IU	BSA/PBS	10,3 \pm 0,2
6	IFN-\alpha 1-8 Hu	10^{4} IU	BSA/PBS	18,2 \pm 0,8
7	IFN-\alpha 1-8 Hu	10^{3} IU	BSA/PBS	13,1 \pm 0,8
8	IFN-\alpha 1-8 Hu	10^{2} IU	BSA/PBS	11,4 \pm 0,5
IU: unidades de referencia internacional
BSA/PBS: 100 \mug/ml de BSA en PBS pH 7,4
IFN-\alpha Mu: mezcla natural de los subtipos de IFN-\alpha murinos
IFN-\alpha Hu: único isotipo de IFN-\alpha humano recombinante
*: algunos de los animales de este grupo todavía estaban vivos 100 días después del tratamiento

IFN-\alpha administrado mediante la ruta in/or muestra una marcada actividad anti-tumoral en ratones estimulados iv con FLC. De hecho, algunos ratones tratados con IFN pueden considerarse curados, dado que todavía estaban vivos más de 100 días después de la inoculación de 100.000 FLC en un sistema en el cual de 4 a 5 células FLC son suficientes para matar al animal.

Las preparaciones puras de una sola subespecie de IFN-\alpha recombinante, IFN-\alpha 1-8, de una mezcla natural de múltiples subtipos de IFN-\alpha, de IFN-\alpha Mu, de IFN-\beta murino recombinante y de IFN-\gamma murino recombinante muestran una marcada actividad anti-tumoral en este modelo si se administran mediante la ruta in/or, lo cual sugiere fuertemente que la actividad anti-tumoral observada de las preparaciones de IFN administradas por vía oromucosal se debe, de hecho, al componente IFN de dichas preparaciones.

Ejemplo 3

Efecto de la ruta de administración del interferón sobre la actividad anti-tumoral

El efecto de IFN administrado in/or se comparó con el de IFN administrado mediante rutas convencionales. Se estimularon ratones DBA/2 hembra de ocho semanas de edad iv con 1 x 10^{5} FLC (2 x 10^{4} FLC LD_{50}) en el día 0. Los ratones se trataron dos veces al día durante 10 días consecutivos con 10^{4} IU de IFN-\alpha Mu (la dosis óptima es como se ha determinado en el Ejemplo 2) administrado mediante la ruta indicada. Habían 6 ratones en cada grupo d tratamiento y en cada caso, el excipiente para el IFN-\alpha Mu era BSA en PBS. Los resultados se recogen en la Tabla 3.

TABLA 3

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Grupo	Tratamiento	Ruta	Día medio de muerte \pm SE
1	Ninguno	-	9,6 \pm 0,2
2	IFN-\alpha Mu	Intranasal / oral	30 \pm 25,85%*
3	IFN-\alpha Mu	oral	18,5 \pm 2,0
4	IFN-\alpha Mu	gástrica	13,5 \pm 1,3
5	IFN-\alpha Mu	subcutánea	23,5 \pm 1,6
6	IFN-\alpha Mu	intramuscular	23,7 \pm 1,8
7	IFN-\alpha Mu	intravenosa	25,0 \pm 1,2
8	IFN-\alpha Mu	intraperitoneal	26,7 \pm 4,1
IU: unidades de referencia internacional
BSA/PBS: 100 \mug/ml de BSA en PBS pH 7,4
*: \begin{minipage}[t]{150mm}algunos de los animales de este grupo todavía estaban vivos 100 días después de la inoculación de las células FLC\end{minipage}

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La ruta de administración oromucosal (ó in/or) es como mínimo tan efectiva como las rutas parenterales utilizadas comúnmente, como por ejemplo iv, inyección intramuscular (im) y subcutánea (sc), si no es más efectiva. La ruta in/or era de hecho tan efectiva como la inyección ip, la cual se considera la ruta más efectiva en ratones estimulados iv con FLC. En contraste con lo anterior, la administración de la misma dosis de IFN directamente en la boca mostró ser menos efectivo que la administración combinada intranasal y oral, mientras que la introducción de IFN directamente en el estómago de los animales mediante un tubo era considerablemente menos efectiva.

Ejemplo 4

Efecto del interferón oromucosal sobre la expresión de las proteínas celulares

Se sabe que el IFN-\alpha induce la expresión de diversas proteínas celulares después de la unión de la proteína a su receptor de la superficie celular. Se piensa que dichas proteínas proporcionan un marcador útil de la acción del IFN.

Evaluamos el efecto de IFN-\alpha administrado vía la ruta in/or sobre la expresión de tres proteínas inducidas por IFN, los antígenos MHC de clase I, el antígeno Ly 6A/E y la 2'-5'-oligoadenilato sintetasa.

El tratamiento de los ratones DBA-2 (H-2K^{d}) con hasta 20.000 IU de IFN-\alpha Mu mediante la ruta in/or no aumentó significativamente la expresión de H-2-K^{d} en los linfocitos, monocitos o granulocitos de la sangre periférica en condiciones en las cuales una cantidad tan pequeña como 20 IU de IFN-\alpha Mu administrado ip aumentó marcadamente la expresión de los antígenos H-2-K^{d} tanto sobre los monocitos como sobre los granulocitos de la sangre periférica. De hecho, la expresión de los monocitos se suprimió ligeramente.

De forma similar, el tratamiento de ratones con hasta 20.000 IU de IFN-\alpha vía la ruta in/or no tuvo un efecto significativo sobre la expresión de los antígenos Ly6 A/E, la expresión de los cuales aumenta marcadamente sobre la superficie de un a diversidad de células linfoides después del tratamiento parenteral con IFN tipo I (Dumont et al., J. Immunol., 1986, 137: 201-210). Se obtuvieron resultados similares con 200 ó 200.000 IU de IFN-\alpha Mu o IFN-\alpha 1-8 Hu vía la ruta in/or.

El tratamiento de ratones Swiss o DBA/2 con una cantidad tan pequeña cono 20 IU de IFN-\alpha Mu inyectado ip dio como resultado un aumento marcado en la actividad 2'-5'-oligoadenilato sintetasa tanto en las células mononucleares periféricas como en los esplenocitos. En contraste con lo anterior, en el mismo experimento, el tratamiento de ratones con hasta 20.000 IU de IFN-\alpha Mu vía la ruta in/or no aumentó significativamente la expresión de la actividad 2'-5'-oligoadenilato sintetasa. Además, el tratamiento con 200 ó 200.000 IU de IFN-\alpha Mu o IFN-\alpha 1-8 Hu mediante la ruta in/or no tuvo un efecto significativo sobre la actividad 2'-5'-oligoadenilato sintetasa en cualquiera de los tiempos analizados hasta 10 días después del inicio del tratamiento con IFN.

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Ejemplo 5

Biodisponibilidad de interferón después de la administración oromucosal

Para examinar la biodisponibilidad y la farmacocinética de IFN, se trataron ratones que tenían la relación en volumen fármaco-sangre más favorable para dichos estudios, con una única dosis elevada de IFN-\alpha recombinante marcado hasta la radioactividad específica más alta posible con ^{125}I.

Se disolvió una preparación pura de 70 x 10^{6} IU de IFN-\alpha 1-8 Hu en 1,4 ml de PBS y se yodinó tal y como se ha descrito en Mogensen et al. (Int. J. Cáncer., 1981, 28: 575-582) utilizando una modificación del procedimiento de la cloramina-T descrito por Hunter y Greenwood (Nature, 1962, 194: 495-496).

El IFN-\alpha 1-8 Hu marcado con ^{125}I (lote nº. CGP35269-1) mostró una actividad biológica de 2 x 10^{7} IU/ml cuando se ensayó sobre las células WISH humanas estimuladas con VSV y 1 x 10^{6} IU/ml cuando se ensayó sobre las células de ratón L929 estimuladas con VSV.

Se inyectaron iv, ip o se trataron in/or ratones Swiss hembra de seis a siete semanas de edad con 2 x 10^{7} IU, equivalente a 1 x 10^{6} IU murino, de IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I (1,0369 x 10^{7} cpm/ratón). En los tiempos indicados, se sacrificaron tres ratones por grupo, se extrajo la sangre y se determinó el volumen. Se extrajo riñón, hígado, pulmón, bazo y estómago/esófago, se secó y se pesó con una precisión de \pm 1,0 \mug. La radiactividad de cada muestra se determinó individualmente utilizando un contador gamma. Entonces se separó la sangre completa mediante centrifugación (800 g x 10 min., 4ºC), se recogió el suero, se contó y se congeló a -80ºC. Entonces se analizó el contenido de IFN en suero utilizando un bioensayo estándar sobre células humanas WISH y sobre células de ratón L929, tal y como se ha descrito más arriba. A continuación, el material radioactivo presente en las muestras de suero se aisló mediante inmunoprecipitación de afinidad y se analizó mediante SDS-PAGE.

Se detectaron niveles de radioactividad muy altos (> 2 x 10^{6} cpm/ml) en la sangre periférica de los animales 5 minutos después de la inyección de 1,0369 x 10^{7} cpm/ratón de IFN-\alpha 1-8 Hu marcado con ^{125}I mediante iv bolus. Entonces, la cantidad de radioactividad presente en la sangre completa declinó progresivamente a 15 y 30 minutos. Los niveles de radioactividad detectados en la sangre periférica de los animales 5 minutos después de la inyección ip de 1,0369 x 10^{7} cpm de IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I era aproximadamente veinte veces menor que los niveles detectados después de una inyección iv bolus. Los niveles de radioactividad aumentaron entonces progresivamente a 15 y 30 minutos después de la inyección. Los niveles de radioactividad detectados en la sangre de los animales a 5, 10 ó 15 minutos después de la administración in/or de IFN-\alpha 1-8 ^{125}I fueron significativamente menores que los detectados a un tiempo determinado después de la inyección ip de la misma cantidad de IFN radiomarcado. Por las tres rutas de administración, se detectaron mayores niveles de radioactividad en el suero que en la sangre completa después de la administración in/or de IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I. Los niveles menores de radioactividad detectados por ml de sangre completa en comparación con el mismo volumen de suero reflejan un volumen efectivamente mayor de suero contado después de la separación del componente celular de la sangre completa.

Se analizó la presencia de IFN biológicamente activo en las muestras de suero de todos los ratones del estudio utilizando un bioensayo estándar, tal como se ha descrito más arriba, y mostró niveles fácilmente detectables de IFN biológicamente activo en el suero de todos los animales que se habían inyectado bien iv o ip con IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I en todos los tiempos analizados. En contraste con lo anterior, no se detectó IFN biológicamente activo en el suero de cualquiera de los animales en cualquier tiempo analizado después de la administración in/or de IFN, a pesar de la presencia de niveles relativamente elevados de radioactividad en el suero de dichos animales.

Para determinar si el material radioactivo detectado en el suero de los animales tratados con IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I representa de hecho el IFN nativo, las muestras se inmunoprecipitaron con proteína A-G azarosa, para precipitar las inmunoglobulinas presentes en las muestras, tratadas con un anticuerpo policlonal purificado por afinidad anti-IFN-\alpha y se volvieron a inmunoprecipitar. Entonces se sometieron las muestras a una electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) tal como se ha descrito más arriba.

El análisis SDS-PAGE del material radioactivo en el suero después de la inyección iv o ip de IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I reveló una sola banda homogénea que migraba con una movilidad electroforética idéntica a la correspondiente sin inyección de IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I. El peso molecular aparente del material se estimó aproximadamente de 20000 Daltons, que corresponde exactamente al peso molecular del IFN-\alpha 1-8 Hu nativo. En contraste con lo anterior, ninguna de las muestras de suero de ratón tratadas in/or con IFN-\alpha 1-8 ^{125}I contenía material con un peso molecular aparente similar al del IFN nativo, incluso cuando se cargó una cantidad idéntica de material radioactivo en cada
gel.

La distribución en tejido del material radiomarcado reveló niveles muy altos de radioactividad en los riñones, elevados niveles en el hígado, pulmón y bazo de los animales 5 minutos después de la inyección iv de IFN-\alpha 1-8 ^{125}I. Se descubrió entonces que el nivel de radioactividad presente en cada uno de dichos cuatro órganos disminuía progresivamente a los 15 y 30 minutos. En contraste con lo anterior, el nivel de radioactividad en el estómago aumentó progresivamente a los 15 y 30 minutos, hasta alcanzar un nivel comparable al presente en el suero de los animales 30 minutos después de una inyección iv bolus.

La administración de IFN-\alpha 1-8 ^{125}I mediante inyección ip dio como resultado picos de radiactividad en todos los tejidos examinados a los 15 minutos, seguido por una declinación a los 30 minutos. De forma similar, la administración in/or de IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I dio como resultado picos de radioactividad en todos los tejidos estudiados después de 15 minutos, con cierta declinación en los niveles de radioactividad presente a los 30 minutos. Los niveles de radioactividad presente en el estómago/esófago eran de un orden de magnitud mayor que los detectados en cualquier otro órgano después de la administración in/or de IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I y era marcadamente mayor que los niveles presentes en dichos tejidos después de la administración parenteral de la misma cantidad de IFN-\alpha 1-8 Hu radiomarcado tanto por la ruta iv como por la ruta ip.

Ejemplo 6

Farmacocinética del interferón después de la administración intranasal/oral

Para la determinación precisa de la farmacocinética de IFN-\alpha 1-8 Hu, se trataron ratones iv, ip o in/or con 1,0369 x 10^{7} cpm/ratón de IFN-\alpha 1-8 Hu marcado con ^{125}I y se determinaron los niveles de radioactividad presentes en la sangre completa y en el suero a una serie de tiempos a lo largo de un período de 24 horas.

El perfil farmacocinética de IFN-\alpha 1-8 Hu marcado con ^{125}I presente en la sangre de los ratones después de una inyección iv bolus seguía estrechamente una curva de eliminación logarítmica. Lo anterior estaba de acuerdo con los resultados de un estudio previo realizado en ratones utilizando una molécula muy relacionada, \alpha humano A/D (Bgl) humano recombinante (Bohoslawed et al., J. IFN Res., 1986, 6: 207-213). La cantidad de material biodisponible, calculado a partir del área bajo la curva de concentración versus tiempo, era también similar a la de \alpha A/D humano. Se observó una curva de eliminación con consumo de tiempo bifásica después de una inyección iv bolus de IFN-\alpha 1-8 ^{125}I, lo cual es característico de las substancias que se eliminan a través de los riñones, de acuerdo con los resultados del Ejemplo 4. La farmacocinética de IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I después de la inyección ip se asemejaba mucho a la descrita previamente para IFNs administrados im.

Se encontraban presentes en el suero de todos los animales niveles fácilmente detectables de IFN biológicamente activo después de una inyección iv bolus o de una inyección ip de IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I.

El modelo de eritroleucemia de Friend constituye un análisis preclínico severo de la actividad anti-tumoral, dado que FLC es altamente maligno y conlleva metástasis de hígado y bazo cuando se inyecta iv. De hecho, los resultados obtenidos utilizando este modelo fueron la base para la adopción de la inyección parenteral de IFN-\alpha para el tratamiento de los cánceres humanos. Así pues, en todos los experimentos llevados a cabo en este estudio, todos los animales no tratados y los animales tratados con preparaciones control murieron entre 10 y 11 días después. La inyección de sólo 4 ó 5 células FLC mataría un ratón si no se proporciona ningún tratamiento. En contraste con lo anterior, algunos animales tratados con RFN-\gamma murino mediante la ruta oromucosal todavía vivían más de 100 días después de la inoculación de 10^{5} FLC y pueden considerarse curados.

De hecho, a juzgar por los trabajos previos, el IFN-\alpha administrado mediante la ruta oromucosal parece ser más efectivo que la ciclofosfamida, el 5-fluorouracilo o el metotrexato administrados por vía parenteral, aumentando el tiempo de supervivencia sólo algunos días en animales inyectados con FLC (Gresser et al., J. Natl. Cáncer Inst., 1988, 80: 126-131). Otros fármacos, por ejemplo el cisplatino, la vincristina, la doxorubicina, la bleomicina o el etoposido no son efectivos contra este tumor (Gresser et al., J. Natl. Cáncer Inst., 1988, 80: 126-131).

De forma similar, IFN-\alpha administrado mediante la ruta oromucosal parece ser más efectivo contra FLC que otras citoquinas como IL-1\beta, IL-2 y TNF-\alpha administrados sistémicamente, que exhiben muy poca actividad en este
modelo.

Trabajos previos han mostrado que IFN administrado vía parenteral es uno de los fármacos anti-tumorales más activos en este modelo y que la terapia con IFN es efectiva incluso cuando se inicia después de que las metástasis de tumor ya estén presentes en el hígado (Gresser et al., Int. J. Cáncer, 1987, 39: 789-792). Los presentes resultados muestran que la administración de IFN mediante la ruta oromucosal es igual o incluso más efectiva.

Las inyecciones diarias de IFN-\alpha administrado junto a una dosis única de ciclofosfamida aumentó marcadamente la supervivencia de ratones AKR que presentaban linfoma en comparación con animales tratados con cualquier agente aislado, si la terapia empezaba antes del diagnóstico del linfoma (Gresser et al., Eur. J. Cáncer, 1978, 14: 97-99). También se ha descrito en varios modelos de tumor animal pre-clínicos una terapia de combinación exitosa utilizando IFN-\alphaZ\beta y BCNU, cis-DDP (cisplatino), metotrexato, adriamicina y \alpha-difluorometil ornitina. También se ha descrito que la terapia de combinación con 5-fluorouracilo (5-FU) e IFN es beneficiosa en el tratamiento del cáncer de colon metastático en humanos (Ernstoff et al., Journal of Clinical Oncology, 1989, 7: 1764-1765). Sin embargo, existen otros estudios que han descrito una actividad anti-tumoral disminuida si se combinaba la terapia IFN con la utilización de ciclofosfamida (Marquet et al., Int. J. Cáncer, 1983, 31: 223-226; Lee et al., Biochem. Pharmacol., 1984, 33: 4339-3443), adriamicina (Blackwill et al., Cáncer Res., 1984, 44: 904-908) o 5-FU (Marquet et al., 1985, 109: 156-158), es decir, precisamente los mismos fármacos que han mostrado ejercer un efecto beneficioso al utilizarse en combinación con la terapia IFN parenteral. Las combinaciones entre IFN y otros agentes de quimioterapia pueden analizarse fácilmente utilizando los procedimientos descritos en la presente invención.

La terapia combinada interleucina-1 (IL-1) y IFN-\alpha/\beta da como resultado un efecto anti-tumor sinergístico en ratones a los que se les ha inyectado FLC (Belardelli et al., Int. J. Cáncer, 1991, 49: 274-278). El mismo tratamiento ejerce también un efecto anti-tumoral marcado contra una variante metastásica (p11-R-Eb) del linfoma Eb, contra el cual cualquier agente solo no es efectivo (Gabriele et al., Invasión Metástasis, 1993, 13: 147-162). De todas las citoquinas analizadas, se encontró que IL-1 es la más efectiva si se combina con la terapia de IFN de Tipo I parenteral.

La terapia combinada con el inhibidor de la angiogénesis AGM-1470 [éster (3R-(3\alpha, 4\alpha(2R*, 3R*), 5\beta, 6\beta))-5-metoxi-4-(2-metil-3-(3-metoxi-2-butenil)oxiranil)-1-oxaspiro(2.5)oct-6-ílico del ácido(cloroacetil)-carbámico] administrado junto a IFN-\alpha/\beta dio como resultado un efecto anti-tumor marcadamente aumentado en comparación con el observado con cualquier agente solo (Brem et al., J. Pediatric Surgery, 1993, 28: 1253-1257).

Se ha demostrado que la hipertermia aumenta la acción anti-tumor del IFN-\alpha/\beta contra el carcinoma de pulmón de Lewis (Yerushalmi et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1982, 169: 413-415). El butirato de arginina también ha mostrado potenciar la acción anti-tumor del IFN-\alpha (Chany y Cerutti, Int. J. Cáncer, 1982, 30: 489-493).

La comparación del grado de protección obtenido cuando se administra un tipo y una dosis determinados de IFN mediante la ruta oromucosal en comparación con los resultados obtenidos siguiendo la administración sistémica (inyección ip) mostró que la administración parenteral de IFN en algunos casos era marginalmente más efectiva y en otros casos no más efectiva que la administración oromucosal.

Los resultados del estudio piloto con biomarcador mostraron bastante claramente que ninguno de los tres biomarcadores analizados (antígeno MHC clase I, antígeno Ly6 A/E y actividad 2'-5'-oligoadenilato sintetasa) refleja adecuadamente la muy marcada actividad antitumoral que exhibe IFN-\alpha administrado mediante la ruta oromucosal.

Es destacado el contraste entre el muy marcado aumento en la expresión de las tras proteínas inducidas por IFN observado en todos los experimentos llevados a cabo después de la inyección ip de una cantidad tan pequeña como 20 IU de IFN-\alpha y la ausencia de cualquier efecto detectable después de la administración de hasta 20.000 IU de IFN-\alpha vía la ruta oromucosal.

Aunque no podemos excluir la posibilidad de observar en un tiempo más temprano o intermedio un efecto sobre uno u otro de los biomarcadores, esto parece ser improbable, ya que IFN actúa sobre la trascripción de los genes que codifican dichas proteínas y por lo tanto no se espera observar un efecto sobre cualquiera de dichos biomarcadores hasta varias horas después del tratamiento con IFN.

De nuevo, aunque no podemos excluir la posibilidad de observar un efecto sistémico sobre una u otra de las numerosas proteínas inducidas por IFN después del tratamiento con IFN-\alpha mediante la ruta oromucosal, esto parece improbable, dado que esto implicaría una regulación diferencial sobre la expresión de ciertos genes inducidos por IFN. Sin embargo, es completamente posible que pueda observarse localmente un efecto sobre un biomarcador de IF, por ejemplo en los linfocitos nasales, después de la administración de IFN-\alpha vía la ruta oromucosal.

De acuerdo con la ausencia de un efecto detectable sobre los biomarcadores estudiados, no se observó ningún efecto consistente sobre cualquiera de los parámetros químicos hematológicos o de la sangre monitorizados durante la terapia IFN oromucosal, incluso en animales tratados con hasta 20.000 IU de IFN-\alpha.

Se encontraron niveles fácilmente detectables de material radiomarcado tanto en sangre completa como en el suero de los animales después de la administración oromucosal de IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I. Estos resultados contrastan con los resultados de los estudios previos, los cuales no fueron capaces de detectar IFN en el suero de los animales incluso después de la administración oral de grandes cantidades de IFN no marcado. Sin embargo, el material radioactivo detectado tanto en sangre completa como en el suero después de la administración oromucosal era biológicamente inactivo. Además, los resultados del análisis SDS-PAGE mostraron que este material era de bajo peso molecular y que más probablemente reflejaba la absorción de los productos de degradación después de la digestión de IFN en el estómago y en el intestino delgado. El análisis de la distribución de tejido del material radiomarcado después de la administración oromucosal reveló niveles marcadamente mayores de radioactividad en el estómago que en cualquiera de los otros órganos analizados. Nuestros resultados muestran bastante claramente que aunque el IFN biológicamente activo no se absorbió después de la administración oromucosal, sin embargo este tratamiento ejerce una actividad antitumoral estadísticamente significativa in vivo.

Sin pretender limitarse a cualquier mecanismo propuesto para el efecto beneficioso observado, nuestros resultados sugieren que el IFN administrado vía oromucosal ejerce su efecto contra las células cancerígenas vía un novedoso mecanismo no definido actualmente, el cual no implica una acción directa del IFN administrado exógenamente o la inducción de IFN endógeno. Esto queda respaldado por la ausencia de niveles detectables de IFN circulante o de los tres biomarcadores analizados, Parece que este mecanismo puede actuar al menos parcialmente mediante la estimulación del abundante tejido linfoide que rodea las cavidades nasofaríngeas y la cavidad oral. Dado que hemos demostrado que el IFN oromucosal es como mínimo de eficacia comparable al IFN administrado sistémicamente, nuestros resultados proporcionan un fuerte soporte para la administración de IFN mediante la ruta oromucosal en el tratamiento del cáncer. Esto puede tener importantes implicaciones para la utilización clínica del IFN.

Claims (15)

1. Utilización de interferón humano para la preparación de un medicamento en el tratamiento del cáncer en un humano mediante la administración por contacto con el recubrimiento mucoso de la boca y la garganta del humano receptor de desde 10^{4} IU hasta 20 x 10^{6} IU de interferón por día.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la cual dicho cáncer es un mieloma múltiple, una leucemia de células pilosas, una leucemia mielogénica crónica, un linfoma de grado bajo, un linfoma cutáneo de células T, un tumor carcinoide, un cáncer cervical, los sarcomas, incluyendo el sarcoma de Kaposi, el tumor de riñón, los carcinomas, incluyendo el carcinoma de células renales, el carcinoma celular hepático, el carcinoma nasofaríngeo, los tumores malignos hematológicos, el cáncer colorectal, el glioblastoma, el papiloma laríngeo, el cáncer de pulmón, el cáncer de colon, el melanoma maligno o los tumores cerebrales, incluyendo el tumor cerebral maligno.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la cual el medicamento comprende una única dosis de interferón.

4. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la cual el medicamento comprende un conjunto de dosis más pequeñas de interferón suficientes para obtener una respuesta equivalente a la de una dosis única, sin inducir una respuesta patológica.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en la cual el medicamento proporciona una administración continua de una dosis de interferón durante un período de tiempo suficiente para obtener una respuesta antineoplástica equivalente a la de una dosis única, sin inducir una respuesta patológica.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en la cual el medicamento comprende otra citoquina o un inductor de interferón.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la cual el medicamento se adapta a la administración de 1 x 10^{4} a 1 x 10^{6} IU de interferón por día.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la cual el medicamento incluye otro agente terapéutico para la terapia simultánea, separada o secuencial.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la cual el agente terapéutico se selecciona entre el grupo que consiste en agentes citostáticos, agentes anti-cáncer y agentes anti-angiogénicos.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la cual el interferón es un interferón de Tipo I.

11. Utilización según la reivindicación 10, en la cual el interferón se selecciona entre el grupo que consiste en
IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\omega, IFN consenso y mezclas de los mismos.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la cual el interferón de Tipo I es IFN-\alpha.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9 en la cual el interferón es un interferón de Tipo II.

14. Utilización según la reivindicación 13, en la cual el interferón de Tipo II es IFN-\gamma.

15. Utilización según la reivindicación 10 ó 13, en la cual el interferón es un material recombinante.