ES2260817T3 - Metodo para determinar el grosor de una muestra optica. - Google Patents
Metodo para determinar el grosor de una muestra optica.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE AL CAMPO DE LA MICROESPECTROSCOPIA CUANTITATIVA, Y EN PARTICULAR A UN METODO PARA DETERMINAR EL GROSOR EXACTO DE UNA MUESTRA MICROSCOPICA OPTICA.
Description
Método para determinar el grosor de una muestra
óptica.
La presente invención se refiere al campo de la
microespectroscopia cuantitativa, y en particular a un método para
determinar el grosor exacto de una muestra microscópica óptica.
En muchos campos de la ciencia y tecnología hay
que determinar la concentración de sustancias químicas en muestras
pequeñas. Un método para determinar la concentración de una
sustancia es la microespectroscopia cuantitativa. En este caso se
mide la absorbancia óptica, A(\lambda,c), que se refiere a
la concentración, c, mediante la ecuación simple (1):
(1)A(\lambda,c)=a(\lambda)cz
donde \lambda es la longitud de
onda óptica, a(\lambda) es el coeficiente de absorción
dependiente de la longitud de onda, y z es el grosor de la
muestra.
El error al determinar la concentración viene
dado por la ecuación (2):
(2)dc =
\left(\frac{dc}{dA}\right)dA+\left(\frac{dc}{da}\right)da+\left(\frac{dc}{dz}\right)dz.
El error en la medición de absorbancia se puede
mantener sumamente bajo, usando equipo moderno de optoelectrónica y
electrónica. Para una sustancia dada, el coeficiente de absorción,
a(\lambda), se puede determinar exactamente con
anterioridad utilizando muestras grandes con un grosor en el rango
de 1 mm a 10 mm. En consecuencia, el error al determinar la
concentración, c, en muestras pequeñas que tienen un grosor en el
rango submilimétrico está dominado por el error al medir el grosor
de muestra, y viene dado por la ecuación (3):
(3)\frac{dc}{c} =
\frac{dz}{z}
De la ecuación (3) se deduce que determinar la
concentración de una sustancia química dentro de una micromuestra de
10 \mum de grosor con una exactitud de 1% requeriría el
conocimiento del grosor de muestra con una exactitud de 1%, es decir
con una exactitud de 100 nm.
Producir recipientes de micromuestras con una
precisión en el grosor de la muestra de 100 nm sería posible, pero
cabe esperar que sea muy costoso. Además, es probable que tales
recipientes de micromuestras se deformen durante su permanencia en
almacén durante el almacenamiento, o que se deformen debido a carga
de la muestra. Es evidente que es práctico determinar el grosor
exacto de la muestra al tiempo de uso, después de cargar la muestra
en el recipiente. En consecuencia, se necesita un método y aparato
para determinar exactamente el grosor de muestras ópticas finas.
JP 09068404A describe un microscopio que tiene
un sistema para alinear marcadores dispuestos en una pluralidad de
portaobjetos. Se enfoca una marca de alineación en la parte
superficial superior de un portaobjetos, seguido del ajuste del
enfoque a una marca de alineación en la superficie inferior del
portaobjetos. Esto se repite varias veces hasta que un portaobjetos
deseado dentro de la pila de portaobjetos está en enfoque. No se
indica en este documento que el enfoque en marcas de alineación
podría ser útil en un método de medir el grosor de un recipiente de
muestra.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un método para determinar exactamente el grosor de
muestras ópticas al tiempo en que se realizan una medición de
absorbancia u otras mediciones espectroscópicas en esta muestra.
Según la presente invención, el objeto anterior
se logra previendo un recipiente de muestra incluyendo una primera y
una segunda ventana ópticamente transparente, por lo que la
superficie interior de la primera ventana tiene primeros marcadores
ópticos, y la superficie interior de la segunda ventana tiene
segundos marcadores ópticos, el recipiente de muestra se carga en un
microscopio óptico, el recipiente de muestra se desplaza hasta que
uno de los primeros marcadores ópticos se ha identificado y situado
dentro del campo de visión, la muestra se mueve después hasta que el
primer marcador óptico está enfocado exactamente, se registra la
primera posición de enfoque, después se desplaza el recipiente de
muestra hasta que uno de los segundos marcadores ópticos se ha
identificado y situado dentro del campo de visión, la muestra se
desplaza hasta que el segundo marcador óptico está enfocado
exactamente, se registra la segunda posición de enfoque, y
finalmente, se calcula la diferencia entre las posiciones de enfoque
primera y segunda, que se puede usar para determinar el grosor de
muestra teniendo en cuenta el índice de refracción de la
muestra.
muestra.
En una realización preferida de la invención, el
microscopio está equipado con un receptor de formación de imágenes
que está conectado a un procesador de imagen y un ordenador que
realizan un procedimiento de reconocimiento de formas. La platina de
muestra de microscopio está conectada a un controlador de platina y
el ordenador que permiten un procedimiento de autoenfoque. De esta
forma, toda la determinación del grosor de la muestra se puede
realizar como un procedimiento automatizado. Para identificación y
diferenciación, los primeros y los segundos marcadores ópticos son
diferentes. Es ventajoso que los marcadores estén dispuestos en una
configuración regular a través de toda el área de ventana. Muchas
formas diferentes de marcadores son posibles y caen dentro del
alcance de la invención. Los marcadores pueden ser de tamaño
limitado tal como cuadrados y triángulos, pero también puede ser de
tamaño ilimitado tal como líneas, ondas cuadradas, u otras "formas
de onda". Además, tipos diferentes de marcadores, en base a la
absorción, reflexión, dispersión u otros efectos ópticos se puede
emplear y todavía caerían dentro del alcance de la invención.
La figura 1 muestra esquemáticamente un aparato
microespectroscópico según la presente invención.
La figura 2 muestra dos tipos de marcadores
ópticos dispuestos en las dos ventanas como se ve a través del
microscopio, por lo que los marcadores no se solapan entre sí.
La figura 3 muestra dos tipos de marcadores
ópticos dispuestos en las dos ventanas como se ve a través del
microscopio, por lo que los marcadores se solapan entre sí.
La figura 4 ilustra marcadores ópticos en forma
de líneas de trazos.
La figura 5 ilustra marcadores ópticos en forma
de líneas continuas finas.
La presente invención se refiere, en una
realización, a un método para determinar exactamente el grosor de
muestras ópticas al tiempo en que se realizan una medición de
absorbancia u otras mediciones espectroscópicas en dicha(s)
muestra(s), incluyendo:
(a) disponer un recipiente de muestra incluyendo
una primera y una segunda ventana ópticamente transparente, por lo
que la superficie interior de la primera ventana tiene primeros
marcadores ópticos, y la superficie interior de la segunda ventana
tiene segundos marcadores ópticos;
(b) depositar una muestra óptica en el
recipiente de muestra;
(c) cargar el recipiente de muestra en un
microscopio óptico;
(d) mover el recipiente de muestra hasta que uno
de los primeros marcadores ópticos se identifica y sitúa dentro del
campo de visión, y mover después la muestra hasta que el primer
marcador óptico está enfocado, y registrar la primera posición de
enfoque;
(e) mover después el recipiente de muestra hasta
que uno de los segundos marcadores ópticos se identifica y sitúa
dentro del campo de visión, y mover la muestra hasta que el segundo
marcador óptico está enfocado exactamente, y registrar la segunda
posición de enfoque;
(f) calcular la diferencia entre las posiciones
de enfoque primera y segunda; y
(g) determinar el grosor de la muestra
óptica.
Según la presente invención, y como se ilustra
en la figura 1, se facilita un recipiente de muestra 1 para
deposición de una muestra, incluyendo una primera ventana
ópticamente transparente 2 y una segunda ventana ópticamente
transparente 3, por lo que las dos ventanas están separadas por una
pared 4 que determina el grosor de una muestra óptica situada entre
las ventanas 2 y 3. La superficie interior de la primera ventana 2
tiene primeros marcadores ópticos, y la superficie interior de la
segunda ventana 3 tiene segundos marcadores ópticos.
Para identificación y diferenciación, los
primeros y los segundos marcadores ópticos son diferentes. Es
ventajoso que los marcadores estén dispuestos en una configuración
regular a través de toda el área de ventana. Muchas formas
diferentes de marcadores son posibles y caen dentro del alcance de
la invención. Los marcadores pueden ser de tamaño limitado tal como
cuadrados y triángulos, pero también pueden ser de tamaño ilimitado
tal como líneas, ondas cuadradas, u otras "formas de onda".
Además, tipos diferentes de marcadores, basados en absorción,
reflexión, dispersión u otros efectos ópticos se pueden emplear y
todavía caerían dentro del alcance de la invención. Para generar
marcadores ópticos, se puede aplicar diferentes tecnologías que son
comunes a la industria de semiconductores y en micromaquinado.
La figura 2 muestra, por ejemplo, dos tipos de
marcadores ópticos que están dispuestos en las dos ventanas de
recipiente de muestra 1 como se ve a través del microscopio 100. En
este caso, marcadores en forma de círculo 101 están dispuestos en la
primera ventana 2, y marcadores de forma cuadrada 102 están
dispuestos en la segunda ventana 3. Los marcadores no se solapan
entre sí.
La figura 3 muestra dos tipos de marcadores
ópticos dispuestos en las dos ventanas como se ve a través del
microscopio 200, por lo que los marcadores se solapan entre sí. En
este caso, un círculo abierto 201 hace del primer marcador, y un
cuadrado lleno 202 hace del segundo marcador. Esto permite diseñar
software que pueda separar los dos tipos de marcadores aunque estén
solapados.
La figura 4 ilustra marcadores ópticos en forma
de líneas de trazos como se ve a través del microscopio 300. Las
líneas 301 orientadas en dirección "oeste-este"
están dispuestas en la primera ventana 2 del recipiente de muestra
1, y las líneas 302 orientadas en la dirección
"norte-sur" están dispuestas en la segunda
ventana 3 del recipiente de muestra 1.
La figura 5 ilustra marcadores ópticos en forma
de líneas continuas como se ve a través del microscopio 400. Las
líneas 401 orientadas en la dirección
"oeste-este" están dispuestas en la primera
ventana 2 del recipiente de muestra 1, y las líneas 402 orientadas
en la dirección "norte-sur" están dispuestas en
la segunda ventana 3 del recipiente de muestra 1.
Como se ilustra en la figura 1, el recipiente de
muestra 1 se carga sobre la platina de muestra 5 de un microscopio
óptico 8. La platina de muestra 5 se controla en la dirección X, Y y
Z mediante una unidad controladora de platina 6 por un ordenador del
sistema 7. Las direcciones X, Y y Z se exponen en la figura 1. En el
campo de la microscopia, la dirección Z siempre significa movimiento
en la dirección vertical. Para poder realizar la medición de
absorbancia dentro de la muestra, el microscopio 8 está equipado con
una fuente de luz 9. Esta fuente también se puede utilizar si se
emplean marcadores absorbentes o de dispersión. La muestra dentro
del recipiente de muestra 1 también puede ser iluminada en
configuración epi usando una segunda fuente de luz 10 en unión con
un divisor de haz 11. La fuente de luz 10 también se emplea si se
utilizan marcadores reflectores.
Una realización preferida de un aparato según la
presente invención también incluye un receptor de formación de
imágenes 12 tal como un dispositivo de acoplamiento de carga (cámara
CCD), que está conectado a un procesador de imagen 13 y ordenador de
sistema 7. El grupo funcional del receptor 12, el procesador de
imagen 13, el ordenador 7 y el controlador de platina 6 permite
ejecutar un programa de reconocimiento de formas después de cargar
una muestra en la platina 5. Este grupo también permite ejecutar un
programa de autoenfoque, después de haber identificado un marcador
particular.
En la operación, se deposita una muestra óptica
en el recipiente de muestra 1. Después, el recipiente de muestra 1,
que está en la platina 5, es desplazado por el controlador de
platina 6 en la dirección X y Y hasta que uno de los primeros
marcadores ópticos se identifica y sitúa dentro del campo de visión,
preferiblemente cerca del centro. En un paso siguiente, el
recipiente de muestra 1 que está unido a la platina 5 es movido
posteriormente en la dirección Z hasta que el primer marcador óptico
está enfocado exactamente. Después de conseguirlo, se registra en el
ordenador la primera posición de enfoque. A continuación, el
recipiente de muestra 1 es desplazado por el controlador de platina
6 en la dirección X y Y hasta que uno de los segundos marcadores
ópticos se identifica y sitúa dentro del campo de visión,
preferiblemente cerca del centro. De nuevo, el recipiente de muestra
1 es desplazado por el controlador de platina 6 hasta que el segundo
marcador óptico esté enfocado exactamente, y se registra la segunda
posición de enfoque.
Finalmente, se calcula la diferencia entre las
posiciones de enfoque primera y segunda. Este valor puede ser
utilizado posteriormente para determinar el grosor de muestra
teniendo en cuenta el índice de refracción óptica de la muestra. En
la mayoría de los casos prácticos, se puede despreciar el efecto que
la concentración de muestra tiene en el índice de refracción
óptica.
Combinar los pasos de deposición de marcadores,
identificación de marcadores mediante reconocimiento de formas, y
autoenfoque sobre los dos tipos de marcadores ópticos según la
presente invención proporciona unos medios de automatizar el proceso
de determinación del grosor de muestras. Además, este método permite
determinar el grosor de muestra en una región que casi es idéntica a
la región donde se lleva a cabo una medición de absorbancia en una
muestra fina y pequeña. En consecuencia, se puede realizar una
medición precisa de la concentración. Por ejemplo, experimentos de
viabilidad preliminares han revelado que el grosor de un líquido de
200 \mum de grosor se puede determinar con una exactitud de ±0,051
\mum.
El método según la presente invención se puede
utilizar para determinar el grosor de muestras líquidas, así como
muestras de gel, y muestras gaseosas o de vapor. Sin embargo, el
método de la presente invención no pretende limitarse a tales
muestras.
\newpage
El método de la presente invención también puede
ser aplicado a muestras sólidas ópticamente transparentes que tienen
al menos dos o más de dos superficies pulidas. En este aspecto de la
presente invención, no se requiere ningún recipiente de muestra
porque la muestra sólida se puede unir o colocar directamente sobre
el portaobjetos de un microscopio. Además, los marcadores ópticos se
depositarían directamente en las dos o más de dos superficies de
interés de la muestra. Por lo tanto, este aspecto de la presente
invención se refiere más en particular a un método para determinar
exactamente el grosor de muestras sólidas ópticas transparentes al
tiempo en que se realizan una medición de absorbancia u otras
mediciones espectroscópicas en la(s) muestra(s),
incluyendo:
a) proporcionar un portaobjetos de
microscopios;
b) depositar sobre el portaobjetos una muestra
sólida óptica transparente que tiene una primera superficie y una
segunda superficie, por lo que la primera superficie tiene primeros
marcadores ópticos, y la segunda superficie tiene segundos
marcadores ópticos;
c) cargar el portaobjetos de microscopio sobre
un microscopio óptico;
d) mover el portaobjetos de microscopio hasta
que uno de los primeros marcadores ópticos se identifica y sitúa
dentro del campo de visión, y después mover la muestra hasta que el
primer marcador óptico está enfocado exactamente, y registrar la
primera posición de enfoque;
e) mover después el portaobjetos de microscopio
hasta que uno de los segundos marcadores ópticos se identifica y
sitúa dentro del campo de visión, y mover la muestra hasta que el
segundo marcador óptico está enfocado exactamente, y registrar la
segunda posición de enfoque;
f) calcular la diferencia entre las posiciones
de enfoque primera y segunda; y
g) determinar el grosor de la muestra óptica
sólida.
Así, el uso del método según la presente
invención permitirá no sólo determinar con gran exactitud el grosor
absoluto de la muestra, sino también determinar qué paralelas son
las superficies de la muestra. Sin que importe si se miden muestras
líquidas, de gel, de vapor o sólidas, no hay límite con respecto al
grosor de la muestra, si se utiliza una lente objetivo apropiada en
el microscopio.
En una realización de la invención, se ha
descrito una platina controlada por ordenador y el movimiento de la
muestra. Sin embargo, también está dentro del espíritu de la
presente invención mover la muestra manualmente en la dirección X, Y
y Z y efectuar observaciones visuales con respecto al tipo de
marcador óptico hallado y con respecto a la colocación enfocada.
Claims (5)
1. Un método para determinar el grosor de
muestras ópticas al tiempo que se realizan una medición de
absorbancia u otras mediciones espectroscópicas en dicha muestra,
incluyendo:
(a) disponer un recipiente de muestra (1)
incluyendo una primera (2) y una segunda (3) ventana ópticamente
transparente, por lo que la superficie interior de la primera
ventana (2) tiene primeros marcadores ópticos (101), y la superficie
interior de la segunda ventana (3) tiene segundos marcadores ópticos
(102);
(b) depositar una muestra óptica en el
recipiente de muestra (1);
(c) cargar el recipiente de muestra (1) en un
microscopio óptico (8);
(d) mover el recipiente de muestra (1) hasta que
uno de los primeros marcadores ópticos (101) se identifica y sitúa
dentro del campo de visión, y mover después la muestra hasta que el
primer marcador óptico está enfocado, y registrar la primera
posición de enfoque;
(e) mover después el recipiente de muestra (1)
hasta que uno de los segundos marcadores ópticos (102) se identifica
y sitúa dentro del campo de visión, y mover la muestra hasta que el
segundo marcador óptico está en enfoque, y registrar la segunda
posición de enfoque;
(f) calcular la diferencia entre las posiciones
de enfoque primera y segunda; y
(g) determinar el grosor de la muestra
óptica.
2. El método de la reivindicación 1, donde en
dicho recipiente de muestra, dichos primeros marcadores ópticos
(101) se distribuyen uniformemente a través de toda el área de la
primera ventana, y dichos segundos marcadores ópticos (102) se
distribuyen uniformemente a través de toda el área de la segunda
ventana.
3. El método de la reivindicación 1, donde se
deposita una muestra líquida en el paso (b).
4. El método de la reivindicación 1, donde se
deposita una muestra de gel en el paso (b).
5. El método de la reivindicación 1, donde se
deposita una muestra gaseosa o de vapor en el paso (b).
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