ES2260913T3

ES2260913T3 - Aparato y procedimiento para la reparacion de un injerto implantado.

Info

Publication number: ES2260913T3
Application number: ES99925776T
Authority: ES
Inventors: George Frederick Muschler
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Current assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 1996-07-03
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2019-05-21
Also published as: EP1085842A2; AU755925B2; EP0912205B1; AU4199499A; WO1999059500A3; AU4271297A; JP2001502561A; EP0912205A2; EP1085842A4; CA2335851C; JP4184603B2; ATE319390T1; WO1998000174A2; WO1998000174A3; EP0912205A4; CA2335851A1; WO1999059500A2; JP2002515288A; DE69930257T2; DK1085842T3

Abstract

Equipo para la preparación de un injerto compuesto óseo a partir de una suspensión de aspirado de médula ósea, que comprende: (a) un sustrato implantable biocompatible poroso que presenta plaquetas sobre la superficie del mismo, que puede obtenerse pasando un concentrado de plaquetas que contiene un anticoagulante o un concentrado de plaquetas aislado a través de dicho sustrato; y (b) un recipiente para mantener dicho sustrato, estando dicho recipiente configurado para retener dicho sustrato y para permitir el flujo de la suspensión de aspirado de médula ósea a través del mismo, presentando dicho recipiente una superficie interna y dos extremos, definiendo cada uno de dichos extremos una abertura.

Description

Aparato y procedimiento para la reparación de un injerto implantado.

Antecedentes de la invención

La injertación ósea se utiliza ampliamente para tratar fracturas, no uniones y para inducir las artrodesis. El hueso canceloso autógeno, que se extrae de un sitio en la persona injertada y se implanta en otro sitio en la persona injertada, en la actualidad constituye el injerto óseo más efectivo. El hueso canceloso autógeno proporciona el andamiaje que da soporte a la distribución de la respuesta de cicatrización del hueso. El hueso canceloso autógeno también proporciona las células progenitoras del tejido conectivo que forman el nuevo cartílago o hueso. Sin embargo, la extracción de hueso autógeno da lugar en costes y morbilidad significativos, incluyendo cicatrices, pérdida de sangre, dolor, tiempos prolongados de operación y de rehabilitación y riesgo de infección. Además, en algunos contextos clínicos, el volumen del sitio del injerto puede exceder el volumen del autoinjerto disponible. Por consiguiente, se han desarrollado alternativas a los autoinjertos en un intento de reducir la morbilidad y el coste de los procedimientos de injertación ósea.

Se han investigado o desarrollado como sustitutos para los autoinjertos varios materiales purificados o sintéticos, incluyendo cerámicas, biopolímeros, hueso de aloinjerto procesado y matrices basadas en colágeno. La FDA ha autorizado una cerámica porosa de hidroxiapatita sintética derivada de coral para la utilización en defectos óseos. También se ha autorizado para fracturas agudas de huesos largos la utilización de un material compuesto de colágeno purificado/cerámica. Aunque estos materiales evitan la morbilidad que implica la extracción de autoinjertos de la persona injertada y elimina los problemas asociados a la limitada disponibilidad de autoinjerto, la efectividad clínica de los materiales sintéticos sigue siendo generalmente inferior a la de los autoinjertos.

Los materiales sintéticos de injerto también se han utilizado como portadores para las células de médula ósea. Al implantar estos materiales compuestos en defectos esqueléticos, las células progenitoras de tejido conectivo se diferenciaron en tejido esquelético. En algunos casos, los implantes compuestos se prepararon empapando el material sintético de injerto en una suspensión celular obtenida de una aspiración de médula ósea. Sin embargo, las células progenitoras de tejido conectivo, que presentan la capacidad de diferenciarse en cartílago, hueso y otro tejido conectivo, tal como tejido adiposo, muscular y fibroso, se encuentran presentes en la médula ósea en cantidades minúsculas. El número de estas células presente en 1 ml de médula ósea varía ampliamente entre sujetos, entre aproximadamente 100 y 20.000 células. Esto representa una media de entre aproximadamente una de entre 20.000 y una de entre 40.000 células nucleadas en la médula ósea. De esta manera, un implante compuesto preparado mediante empapamiento de un volumen dado de material de injerto con portador sintético en un volumen comparable de médula ósea fresca contiene relativamente pocas células progenitoras de tejido conectivo.

Por consiguiente, en el pasado se ha desarrollado una técnica para incrementar la concentración relativa de células progenitoras de tejido conectivo en los implantes compuestos. Esta técnica implica sembrar una suspensión de células de la médula ósea en placas de cultivo de tejido, cultivar las células en un medio de selección durante uno o más días hasta que aumente el número de células progenitoras de tejido conectivo en el cultivo, y después separar las células de las placas de cultivo de tejido, proporcionando una suspensión celular que contiene una población expandida por cultivo de células progenitoras de tejido conectivo. A continuación, se preparan los implantes compuestos empapando portadores cerámicos sintéticos en esta suspensión de células expandidas mediante cultivo. Por desgracia, este procedimiento para la preparación de implantes compuestos requiere mucho tiempo. Además, si las células expandidas mediante cultivo utilizadas en este procedimiento se derivan de aspirados de médula ósea obtenidos de la persona injertada, ésta debe someterse a múltiples procedimientos invasivos: uno para extraer su médula ósea y uno posteriormente para implantar el implante compuesto. Además, la persona injertada debe exponerse a anestesia en más de una ocasión.

Por consiguiente, resulta deseable disponer de un nuevo procedimiento para la preparación de un injerto compuesto de médula ósea que pueda llevarse a cabo intraoperatoriamente, es decir, al mismo tiempo que se extrae médula ósea de la persona injertada. Resulta especialmente deseable un procedimiento intraoperatorio para la preparación de un injerto compuesto de médula ósea que utilice un aspirado de médula ósea como fuente de células progenitoras de tejido conectivo y que de lugar a la formación de un injerto óseo compuesto que contenga una población enriquecida en células progenitoras de tejido conectivo.

La patente WO 98/00174 describe procedimientos para la preparación de un injerto óseo compuesto que comprende las etapas de: (a) proporcionar una suspensión de aspirado de médula ósea; y (b) pasar la suspensión de aspirado de médula ósea a través de un sustrato implantable biocompatible poroso, así como un equipo para la preparación de un injerto compuesto de médula ósea a partir de una suspensión de aspirado de médula ósea, que comprende: (a) un sustrato implantable biocompatible poroso; y (b) un recipiente para contener dicho sustrato, estando dicho recipiente configurado para retener dicho sustrato y para permitir el flujo de la suspensión de aspirado de médula ósea a través del mismo, presentando dicho recipiente dos extremos, definiendo cada uno de ellos una abertura. Las plaquetas derivadas de sangre periférica contaminante se indican como ejemplos de células nucleadas diferentes de las células progenitoras de tejido conectivo que se encuentran presentes en el injerto óseo (ver página 19, líneas 14 a 23, y página 6, líneas 11 a 14 en dicha patente).

Descripción resumida

Un aspecto de la presente invención se refiere a un equipo para la preparación de un injerto óseo compuesto a partir de una suspensión de aspirado de médula ósea, que comprende:

(a) un sustrato implantable biocompatible poroso que presenta plaquetas sobre la superficie del mismo, que puede obtenerse pasando un concentrado de plaquetas que contiene un anticoagulante o un concentrado aislado de plaquetas a través de dicho sustrato; y

(b) un recipiente para mantener dicho sustrato, estando dicho recipiente configurado para retener dicho sustrato y para permitir el flujo de la suspensión de aspirado de médula ósea a través del mismo, presentando dicho recipiente una superficie interna y dos extremos, definiendo cada uno de ellos una abertura.

En una realización, dicho sustrato presenta anticuerpos que se unen a antígenos de superficie expresados sobre la superficie de las células progenitoras de tejido conectivo o de las plaquetas, en el que dichos anticuerpos se encuentran unidos a una superficie accesible de dicho sustrato.

En una realización, dichos anticuerpos se seleccionan de entre STRO-1, SH-2, SH-3, SH-4, SB-10, SB-20, y los anticuerpos para-fosfatasa alcalina.

En una realización, dicho sustrato es estéril.

En una realización, dicho equipo comprende además:

un regulador de caudal de fluido que puede unirse a un extremo de dicho recipiente para la regulación de la velocidad de flujo de la suspensión de aspirado de médula ósea a través de dicho sustrato.

En una realización, dicho equipo comprende además:

(a) un reservorio para contener la suspensión de aspirado de médula ósea; y

(b) un regulador de caudal de fluido que puede unirse a dicho reservorio para la regulación del flujo de la suspensión de aspirado de médula ósea desde dicho reservorio hacia el interior de dicho recipiente.

En una realización, dicho equipo comprende además:

un receptor de efluente para la recepción de un efluente de la suspensión de aspirado de médula ósea desde dicho recipiente.

En una realización, dicho sustrato presenta dimensiones externas y un área superficial accesible total por lo menos cinco veces superior al área superficial de un objeto sólido que presenta las mismas dimensiones externas.

En una realización, dicho sustrato está formado de una cerámica que comprende fosfato de calcio o biovidrio.

En una realización, dicho sustrato está formado de un material seleccionado de entre: colágeno, hueso mineralizado y hueso desmineralizado.

En una realización, dicho sustrato está formado de ácido hialurónico o de un biopolímero sintético.

En una realización, dicho sustrato está formado de un biopolímero sintético.

En una realización, dicho sustrato está formado de ácido hialurónico.

En una realización, dicho sustrato presenta moléculas de adhesión celular unidas a una superficie del mismo.

En una realización, dicho sustrato presenta factores de crecimiento unidos a una superficie del mismo.

En una realización, dicho sustrato presenta poros o canales con un diámetro superior a 40 \mum.

En una realización, el recipiente comprende además un elemento poroso para retener el sustrato en el interior del recipiente.

En una realización, el recipiente está realizado de un material que es biocompatible.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un injerto compuesto de médula ósea, que comprende:

(a) un sustrato implantable biocompatible poroso que presenta plaquetas en la superficie del mismo, que puede obtenerse pasando un concentrado de plaquetas que contiene un anticoagulante o un concentrado aislado de plaquetas a través de dicho sustrato;

(b) una población heterogénea de células de médula ósea nucleadas; y

(c) una población enriquecida en células progenitoras de tejido conectivo.

La presente invención proporciona un procedimiento nuevo y mejorado para la preparación de un injerto implantable, particularmente de un injerto óseo compuesto. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la expresión "injerto óseo" se refiere a un injerto que comprende células progenitoras de tejido conectivo y que, por lo tanto, es capaz de diferenciarse en cartílago o hueso. El procedimiento comprende proporcionar una suspensión de aspirado de médula ósea y pasar la suspensión de aspirado de médula ósea a través de un sustrato implantable biocompatible poroso para proporcionar un injerto óseo compuesto que tiene una población enriquecida en células progenitoras de tejido conectivo. Debido a que el procedimiento se lleva a cabo preferentemente intraoperatoriamente utilizando un aspirado de médula ósea procedente de la persona injertada, se reduce el tiempo y el coste necesarios para la preparación del injerto y también el número de ocasiones en que debe volver la persona injertada a quirófano para someterse a procedimientos invasivos. El injerto óseo compuesto mejorado preparado mediante el presente procedimiento contiene una población enriquecida en células progenitoras de tejido conectivo y un mayor número de células progenitoras de tejido conectivo por unidad de volumen que el observado en el aspirado original de médula ósea.

La presente invención también se refiere a un injerto compuesto de médula ósea preparado según el presente procedimiento.

La presente invención también proporciona un equipo que comprende el aparato para la preparación de un injerto implantable, particularmente de un injerto óseo compuesto. El equipo comprende un sustrato biocompatible poroso y un recipiente configurado para retener dicho sustrato y para permitir el flujo de una suspensión celular, particularmente de una suspensión de aspirado de médula ósea, a través del mismo. Preferentemente, el sustrato es estéril.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación, algo esquemática, de un aparato utilizado para preparar un injerto óseo compuesto según la presente invención.

La figura 2a es un gráfico que muestra el efecto de incrementar la concentración de células nucleadas en la suspensión de aspirado de médula ósea sobre el número de células nucleadas retenidas sobre un injerto óseo compuesto que comprende un sustrato de hidroxiapatito. Los datos resumen los resultados de nueve sujetos humanos bajo condiciones idénticas.

La figura 2b es un gráfico que muestra el efecto de incrementar la concentración de células nucleadas en la suspensión de aspirado de médula ósea sobre el número de células progenitoras de tejido conectivo retenidas sobre un injerto óseo compuesto que comprende un sustrato de hidroxiapatito. Los datos resumen los resultados de nueve sujetos humanos bajo condiciones idénticas.

La figura 3a es un gráfico que muestra el efecto de incrementar la concentración de células nucleadas en la suspensión de aspirado de médula ósea sobre la concentración de células nucleadas retenidas en un injerto óseo compuesto que comprende un sustrato de matriz de hueso canceloso humano desmineralizado.

La figura 3b es un gráfico que muestra el efecto de incrementar la concentración de células nucleadas en la suspensión de aspirado de médula ósea sobre el número de células progenitoras conectivas retenidas sobre un injerto óseo compuesto que comprende un sustrato de matriz de hueso canceloso humano desmineralizado. Los datos resumen los resultados de tres sujetos humanos bajo condiciones idénticas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento nuevo y mejorado para la preparación de un injerto óseo compuesto. El procedimiento comprende obtener un aspirado de médula ósea de un donante, preferentemente en presencia de un anticoagulante, que proporciona una suspensión de aspirado de médula ósea, y pasar la suspensión de aspirado de médula ósea a través de un sustrato implantable biocompatible poroso. Preferentemente, el sustrato es estéril. Preferentemente, el procedimiento se lleva a cabo intraoperatoriamente utilizando un aspirado de médula ósea, preferentemente procedente de la persona injertada.

La presente invención también proporciona un procedimiento para la preparación de un injerto implantable que presenta plaquetas sobre la superficie del mismo. El procedimiento comprende pasar una suspensión de plaquetas a través de un sustrato implantable biocompatible poroso. Entre las suspensiones adecuadas se incluyen, a título de ejemplo, médula ósea, concentrado de plaquetas aislado, y sangre que contiene un anticoagulante.

Preparación de una suspensión de aspirado de médula ósea

El aspirado de médula ósea contiene plasma, células progenitoras nucleadas de tejido conectivo, células hematopoyéticas nucleadas, células endoteliales, y células derivadas de sangre periférica contaminante, incluyendo glóbulos rojos y plaquetas. Debido a que el aspirado de médula ósea también contiene sangre periférica, resulta preferente que la médula ósea se recoja con una jeringa que contenga un anticoagulante. Entre los anticoagulantes adecuados se incluyen, por ejemplo, heparina, citrato sódico, y EDTA. Preferentemente, el aspirado de médula ósea se mezcla con una solución isotónica estéril para proporcionar una concentración comprendida en el intervalo entre aproximadamente 10 millones y aproximadamente 300 millones de células nucleadas/ml, preferentemente entre aproximadamente 20 millones y aproximadamente 250 millones de células nucleadas/ml, más preferentemente entre aproximadamente 50 millones y aproximadamente 200 millones de células nucleadas/ml. Entre las soluciones isotónicas adecuadas se incluyen, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas isotónicas, tales como la solución salina equilibrada de Hank, y la solución salina tamponada con fosfato, y un medio de cultivo de tejidos, tal como medio mínimo esencial. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la expresión "suspensión de aspirado de médula ósea" se refiere a un aspirado de médula ósea que no se ha mezclado con una solución isotónica, y a un aspirado de médula ósea que se ha mezclado con una solución isotónica.

Sustrato

El sustrato está realizado en un material de injerto implantable biocompatible. Preferentemente, el material presenta una superficie cargada. Entre los ejemplos de materiales de injerto implantables biocompatibles que presentan una superficie cargada se incluyen las cerámicas que comprenden fosfato cálcico, tales como, por ejemplo, hidroxiapatito o fosfato tricálcico; así como matriz ósea desmineralizada; o matriz ósea mineralizada. Entre otros materiales de injerto adecuados se incluyen biopolímeros, tales como, por ejemplo, el ácido poliláctico, el ácido poliglicólico, el ácido poligaláctico, la policaprolactona, el óxido de polietileno, el óxido de polipropileno, la polisulfona, el polietileno y el polipropileno. Entre otros materiales de injerto adecuados se encuentran el ácido hialurónico, que puede purificarse con o sin reticulación, el biovidrio y el colágeno.

Más preferentemente, las moléculas de adhesión celular se encuentran unidas a la superficie del sustrato. La expresión "moléculas de adhesión celular" se refiere colectivamente a lamininas, fibronectina, vitronectina, moléculas de adhesión a células vasculares (V-CAM), moléculas de adhesión intercelular (I-CAM), tenascina, trombospondina, osteonectina, osteopontina, sialoproteína ósea y colágenos.

Opcionalmente, el sustrato presenta factores de crecimiento unidos a la superficie del mismo. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "factores de crecimiento" abarca cualquier producto celular que module el crecimiento o la diferenciación de otras células, particularmente células progenitoras de tejido conectivo. Entre los factores de crecimiento se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las isoformas de factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), los factores de crecimiento fibroblástico, los factores de crecimiento epitelial, las isoformas del factor beta de crecimiento transformante, los factores de crecimiento similares a insulina, y las proteínas morfogénicas óseas.

Opcionalmente, el sustrato presenta anticuerpos que presentan afinidad para las células madre progenitoras de tejido conectivo unidas a la superficie del mismo. Entre los anticuerpos adecuados se incluyen, a título de ejemplo, STRO-1, SH-2, SH-3, SH-4, SB-10, SB-20 y los anticuerpos anti-fosfatasa alcalina. Dichos anticuerpos se describen en Haynesworth et al., Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies, Bone 13:69-80, 1992a; Bruder, S. et al., Identification and characterization of a cell surface differentiation antigen on human osteoprogenitor cells, Trans. Ortho Res. Soc. 21:574, 1996; Haynesworth, S. E. et al., Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies, Bone 13:69-80, 1992; Stewart, K. et al., Co-expression of the STRO-1 antigen and alkaline phosphatase in cultures of human bone and marrow cells, J. Bone Miner. Res. 11(Suppl.):S142; 1996; Flemming, J.E. et al., Monoclonal Antibody Against Adult Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Recognizes Developing Vasculature in Embryonic Human Skin, Developmental Dynamics 212:119-132, 1998; y Bruder, S.P. et al., Monoclonal Antibodies Reactive with Human Osteogenic Cell Surface Antigens, Bone 21(3):225-235, 1997.

Preferentemente, el sustrato presenta un número suficiente de poros o canales de manera que el área superficial accesible total del sustrato sea por lo menos cinco veces superior a la de un objeto sólido con las mismas dimensiones externas. De esta manera, puede alcanzarse el área superficial total preferente mediante la utilización de un sustrato que comprenda una masa de polvos, una masa de gránulos, una masa de fibras, o un bloque altamente poroso de material de sustrato. Preferentemente, el tamaño de los poros en el sustrato es superior a 20 \mum, más preferentemente es superior a 40 \mum y todavía más preferentemente es superior a 100 \mum.

Entre los materiales de injerto particularmente adecuados se incluyen, por ejemplo, las secciones aisladas de hueso canceloso mineralizado, los polvos o gránulos de hueso mineralizado, las secciones de hueso canceloso desmineralizado, los polvos o gránulos de hueso desmineralizado, la matriz ósea desmineralizada extraída con guanidina-HCl, el hueso cortical o canceloso sinterizado, el hidroxiapatito coralino comercializado por Interpore bajo el nombre comercial Interpore 500, o Interpore 200, y cerámicas granulares, tales como las incorporadas en el sustituto de injerto óseo Collagraft comercializado por Zimmer, o esponjas filamentosas, tales como aquéllas fabricadas en colágeno por Orquest.

Recipiente de sustrato

Preferentemente, el sustrato se dispone en un recipiente configurado para mantener el sustrato dentro del recipiente y para permitir el flujo de fluido y de células de médula ósea a través del recipiente. Ello se consigue utilizando un recipiente con dos aberturas en cada extremo del mismo, y que comprende un elemento que presenta uno o más poros dispuestos entre el sustrato y una de las aberturas. Preferentemente, los poros del elemento presentan un diámetro de tamaño suficiente para permitir que el fluido y las células de la suspensión de aspirado de médula ósea fluyan a su través y para retener el sustrato en el interior del recipiente. Preferentemente, la longitud del recipiente es superior a la anchura del mismo para incrementar el tiempo de residencia de la suspensión en el sustrato.

Preferentemente, el recipiente está realizado en un material que es biocompatible y se encuentra libre de pirógenos. Entre los materiales de recipiente adecuados se incluyen, por ejemplo, vidrio, plástico o metal. Aunque el recipiente puede comprender dos limitadores de flujo de fluido bloqueando las aberturas en cada extremo del recipiente, preferentemente se une un regulador de flujo de fluido a por lo menos un extremo del recipiente con el fin de regular el flujo de suspensión de aspirado de médula ósea a través del sustrato.

Condiciones

Para permitir la implantación del injerto en un sujeto, resulta preferente que el sustrato sea estéril y que la superficie interna del recipiente que contiene el sustrato también sea estéril. Preferentemente, la suspensión de aspirado de médula ósea se permite que fluya a través del sustrato estéril bajo presión hidrostática, que puede generarse con fuerzas externas o por la fuerza de la gravedad. Preferentemente, la tasa lineal de elución de la suspensión a través del sustrato es de entre 2 y 500 mm/minuto, más preferentemente de entre 5 y 200 mm/minuto, todavía más preferentemente de entre 10 y 100 mm/minuto.

Opcionalmente, el efluente se recoge estérilmente en un colector de efluente y se recicla a través del sustrato una o más veces para incrementar el número de células progenitoras de tejido conectivo en el injerto óseo compuesto.

Opcionalmente, se pasa una solución de lavado a través del sustrato, tras el paso de la suspensión original de aspirado de médula ósea y de cualquier efluente. Preferentemente, la solución de lavado comprende una solución estéril isotónica tamponada con un intervalo de pH de entre 7,3 y 7,5. Entre las soluciones de lavado adecuadas se incluyen, por ejemplo, la solución salina tamponada con fosfato, la solución salina equilibrada de Hank y el medio mínimo esencial.

Opcionalmente, se añaden factores de crecimiento o células adicionales que secretan o presentan (es decir, expresan sobre su superficie) factores de crecimiento, al injerto óseo compuesto previamente a su utilización, es decir, antes, durante o después del momento en que se pasa a través del sustrato la suspensión de aspirado de médula ósea. Entre los factores de crecimiento que pueden añadirse se incluyen, por ejemplo, isoformas de factores de crecimiento derivados de plaquetas, los factores de crecimiento fibroblástico, los factores de crecimiento epitelial, el factor beta de crecimiento transformante, el factor o factores de crecimiento similares a insulina, la hormona paratiroidea (PTH) o péptidos relacionados con PTH, y las proteínas morfogénicas óseas. Preferentemente, se añaden factores de crecimiento pasando una solución que contiene los factores de crecimiento a través del sustrato tras el paso a través del mismo de todas las suspensiones y soluciones previas. Alternativamente, se añaden factores de crecimiento mediante incorporación en la solución de lavado. Las plaquetas, que es conocido que secretan factores de crecimiento y que se adhieren a superficies cargadas negativamente, se añaden al injerto mediante el paso de una suspensión de plaquetas, tal como sangre o un concentrado de plaquetas que contiene un anticoagulante, a través del sustrato.

Los ejemplos siguientes de procedimientos para la preparación de un injerto óseo compuesto pretenden ilustrar la presente invención, aunque sin limitarla:

Ejemplo 1

El presente procedimiento para la preparación de un injerto óseo compuesto se entenderá con mayor facilidad haciendo referencia a la figura 1, que ilustra una realización preferente del aparato para llevar a cabo el procedimiento. El aparato, señalado de manera general con el número de referencia 10, comprende un sustrato implantable biocompatible poroso 12, un recipiente 14 para contener el sustrato 12, un reservorio 16 para contener la suspensión de aspirado de médula ósea, un primer regulador de caudal de fluido 18, un segundo regulador de flujo de fluido 20, y un colector de efluente 22. Previamente a la preparación del injerto óseo compuesto, se esteriliza la totalidad de los componentes del aparato.

Tras retirar la tapa 23, se introduce en el reservorio 16 la suspensión de aspirado de médula ósea. A continuación, se abre el regulador de flujo de fluido 18 para permitir que la suspensión de aspirado de médula ósea fluya hacia el exterior del reservorio 16 y hacia el interior de la abertura 30 en la tapa extraíble 24 del recipiente 14 y sobre el sustrato 12.

A medida que la suspensión entra en el sustrato 12, el regulador de flujo de fluido 20 que se encuentra unido a la punta 34 del recipiente 14, se abre para permitir que la suspensión de aspirado de médula ósea fluya a través del elemento poroso 32, a través de la abertura 36 del recipiente 14 y hacia el interior del colector de efluente 22.

A continuación, se separan el reservorio 16 y la tapa extraíble 24 del recipiente 14, y seguidamente se extrae del recipiente 14 el injerto compuesto mejorado de médula ósea. El injerto óseo compuesto mejorado, que comprende el sustrato 12, una población enriquecida en células progenitoras de tejido conectivo y una población heterogénea de otras células nucleadas de médula ósea, células sanguíneas, y factores de crecimiento adherentes y moléculas de adhesión derivadas de médula y de sangre, se encuentra lista para su utilización como implante o in vitro.

Ejemplo 2

Se obtuvieron nueve discos cilíndricos de hidroxiapatito (HA) coralino que medían 13 mm de diámetro y 5 mm de grosor, de Interpore, Inc., Irvine, California. Se colocó cada disco en la punta de un tubo de jeringa de 10 cm^{3} montado verticalmente dotado de una llave de paso. Se extrajeron muestras de médula de la cresta ilíaca anterior de nueve sujetos humanos voluntarios mediante aspiración. Las muestras se recogieron utilizando una aguja de aspiración de médula ósea Lee-Lok y una jeringa de 10 cm^{3} que contenía 1 ml de solución salina normal y 1.000 unidades de heparina sódica. Se aspiraron dos ml de médula ósea de cada sitio. Las muestras de médula se suspendieron en \alpha-MEM para preparar una suspensión de células medulares que contenía 50 millones de células nucleadas por ml. Se introdujeron 2 ml de la suspensión de células medulares en la parte superior de la jeringa y se ajustó la llave de paso para permitir que la suspensión de células medulares se eluyese a través del disco a un caudal de 2 ml/minuto. Cada muestra de efluente se recicló tres veces a través del disco. Tras recoger el efluente, se lavó el disco con 6 ml de solución salina tamponada con fosfato a una tasa de elución de 2 ml/minuto para eliminar las células adheridas laxamente.

Se realizó un recuento del número de células nucleadas en la suspensión inicial, en los efluentes, y en los lavados, con un hemocitómetro con el fin de determinar el número de células nucleadas retenidas en los injertos óseos compuestos resultantes. Para determinar el número de células progenitoras de tejido conectivo retenidas en los injertos óseos compuestos resultantes, se sometieron a ensayo las células progenitoras de tejido conectivo en las suspensiones iniciales, en el efluente y en los lavados, mediante recuento de colonias sobre plástico de cultivo de tejidos. Para el recuento de colonias, se sembraron en placas, 500.000 células nucleadas de la suspensión original, los efluentes y la solución de lavado, en pocillos separados de cultivo de tejidos de 35 mm de diámetro y se cultivaron en \alpha-MEM que contenía dexametasona (10^{-8} M) y ascorbato (50 mg/ml) durante 9 días. A continuación, las células cultivadas se tiñeron para detectar la actividad de fosfatasa alcalina utilizando N',N'-dimetil naftol M-X fosfato como sustrato y rojo de Texas Fast como pigmento. La actividad de la fosfatasa alcalina es un marcador de la diferenciación osteoblástica. De esta manera, el número de colonias que se tiñen positivamente para actividad de fosfatasa alcalina refleja el número de células progenitoras de tejido conectivo presente en la suspensión original, en los efluentes y en la solución de lavado.

Se calculó el número de células nucleadas y de células progenitoras de tejido conectivo retenidas sobre el sustrato tras cada etapa mediante la substracción del número de células nucleadas y células progenitoras de tejido conectivo encontradas en los efluentes o en la solución de lavado respecto al número de células nucleadas y células progenitoras de tejido conectivo en la suspensión inicial. El número medio de células nucleadas y de células progenitoras de tejido conectivo retenidas en los nuevos injertos óseos compuestos y el porcentaje de células nucleadas y de células progenitoras de tejido conectivo en los injertos óseos compuestos se muestran en la Tabla 1.

Ejemplo 3

Se prepararon injertos óseos compuestos tal como se describe en el Ejemplo 2, excepto en que las muestras de médula ósea se extrajeron de la cresta ilíaca anterior de tres voluntarios humanos diferentes y los sustratos utilizados eran discos cilíndricos de matriz ósea cancelosa humana desmineralizada obtenidos de Life Net, Virginia Beach, Virginia.

Se determinó el número de células nucleadas y de células progenitoras de tejido conectivo en los injertos compuestos tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. El número medio de células nucleadas y de células progenitoras de tejido conectivo en los injertos óseos compuestos y el porcentaje de células nucleadas y de células progenitoras de tejido conectivo retenidas en los injertos óseos compuestos se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Retención de células en injertos óseos compuestos preparados a partir de discos de hidroxiapatita o de hueso canceloso desmineralizado humano

	Discos de HA	Hueso canceloso
Células nucleadas en suspensión original	100 x 10^{6}	100 x 10^{6}
Células nucleadas retenidas antes del lavado	56,45 x 10^{6}	40,00 x 10^{6}
Células nucleadas eliminadas con el lavado	9,12 x 10^{6}	15,78 x 10^{6}
Células nucleadas retenidas después del lavado	47,33 x 10^{6}	24,22 x 10^{6}
CTPC en suspensión original	7.800	11.100
CTPC retenidas tras el lavado	5.162	4.950
Porcentaje de total de células nucleadas retenidas	47%	24%
Porcentaje de total de CTPC retenidas	66%	44%
	Discos de HA	Hueso canceloso
Proporción de CTPC a células nucleadas	1,4	1,8
Concentración de CTPC en injerto óseo compuesto frente	2,8	1,3
a concentración de CTPC en suspensión original
CTPC = células progenitoras de tejido conectivo

Tal como se muestra en la Tabla 1, los injertos compuestos preparados con un sustrato de hidroxiapatito o con hueso canceloso humano desmineralizado retuvieron un porcentaje significativo de células nucleadas (el 47 y el 24%, respectivamente) y un porcentaje incluso mayor de células progenitoras de tejido conectivo (el 66% y el 44%, respectivamente) en la suspensión original. Asimismo, tal como se muestra en la Tabla 1, el lavado de sustratos de hueso canceloso o de hidroxiapatito coralino resultó en la eliminación de una media del 16,2% (intervalo de entre el 10% y el 33%) de las células nucleadas inicialmente retenidas en un sustrato de HA coralino y del 39,45% (intervalo de entre el 33% y el 86%) de las células retenidas en sustratos de matriz ósea cancelosa desmineralizada.

Tal como se muestra en la Tabla 1, los injertos compuestos preparados con hidroxiapatito o con huesos cancelosos humanos desmineralizados retuvieron selectivamente las células progenitoras de tejido conectivo en comparación con otras células nucleadas derivadas de la médula. Esta retención selectiva se ilustra con la proporción (>1) de % de células progenitoras de tejido conectivo retenidas frente al % de células nucleadas retenidas sobre el sustrato. De esta manera, los injertos óseos compuestos preparados con discos de hidroxiapatito o con discos de hueso canceloso humano desmineralizado comprenden una población enriquecida en células progenitoras de tejido conectivo.

Se ilustra que la concentración de células progenitoras de tejido conectivo es superior a la observada en la muestra original de médula ósea mediante la división del número de células progenitoras de tejido conectivo retenidas por el volumen de los discos (0,63 cm^{3}). Tal como se muestra en la Tabla 1, la concentración media de células progenitoras de tejido conectivo retenidas en los injertos óseos compuestos que comprenden discos de HA era 2,8 veces superior que la concentración en la muestra original de médula. De manera similar, la concentración media de células progenitoras de tejido conectivo retenidas en los injertos óseos compuestos que comprendían matriz ósea cancelosa desmineralizada era 1,3 veces superior a la de la muestra original de médula.

Ejemplo 4

Se prepararon cuarenta y cinco injertos óseos compuestos tal como se describe en el Ejemplo 2, excepto en que la concentración de células nucleadas en la suspensión de médula se varió entre 5, 10, 20, 40 y 50 millones de células/ml procedentes de cada uno de los nueve donantes humanos. Se determinó el número de células nucleadas y de células progenitoras de tejido conectivo retenidas en cada uno de los injertos óseos compuestos resultantes, tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se muestran los resultados en las figuras 2a y 2b.

Tal como se muestra en las figuras 2a y 2b, el número de células nucleadas y el número de células progenitoras de tejido conectivo retenidas en los injertos óseos compuestos se incrementó de una manera esencialmente lineal a medida que se incrementaba el número de células de médula que pasaba a través del sustrato de hidroxiapatito, indicando que no se había producido la saturación del sustrato de hidroxiapatito con las células derivadas de la médula en el intervalo evaluado de proporción células a volumen de sustrato.

Ejemplo 5

Se prepararon quince injertos óseos compuestos utilizando discos de matriz de hueso canceloso desmineralizado, tal como se describe en el Ejemplo 2, excepto en que la concentración de células nucleadas en la suspensión de médula se varió entre 5, 10, 20, 40 y 50 millones de células/ml de cada uno de los tres donantes humanos. Los datos que reflejan el número de células nucleadas y el número de colonias progenitoras de tejido conectivo retenidas en los injertos óseos compuestos resultantes se presentan en las figuras 3a y 3b.

Tal como se muestra en las figuras 3a y 3b, el número de células nucleadas y el número de células progenitoras de tejido conectivo retenidas en los injertos óseos compuestos se incrementó de una manera esencialmente lineal a medida que se incrementaba el número de células de médula que pasaban a través del sustrato de matriz de hueso canceloso desmineralizado, indicando que no se había producido la saturación del sustrato con las células derivadas de la médula a lo largo del intervalo evaluado de proporciones número de células a volumen de sustrato.

Ejemplo 6

Se preparó un injerto óseo compuesto tal como se describe en el Ejemplo 2 utilizando una suspensión de médula de 2 cm^{3} que contenía 5 millones de células nucleadas/ml, excepto en que el sustrato no se lavó con 6 ml de solución salina tamponada con fosfato tras la carga. En comparación con un disco idéntico cargado de manera idéntica que se lavó tal como en el Ejemplo 2, el disco no lavado retuvo el mismo número de células progenitoras de tejido conectivo (1.000 en el caso mostrado) y un número superior de células nucleadas derivadas de médula (2,2 millones frente a 1,2 millones en el ejemplo lavado). Tras el cultivo durante 24 días in vitro, la presencia de estas células adicionales resultó en una mayor proliferación y diferenciación de las células progenitoras de tejido conectivo. Ello se puso de manifiesto por una mayor área superficial cubierta por células que expresaban actividad de fosfatasa alcalina, que es un marcador de diferenciación osteoblástica.

Ejemplo 7

Se preparó un injerto óseo compuesto tal como en el Ejemplo 2, excepto en que se recicló la suspensión de médula ósea sobre el disco de hidroxiapatita únicamente en una ocasión, y no en tres ocasiones. Ello redujo el número de células y de células progenitoras de tejido conectivo que permanecían unidas al disco de hidroxiapatito coralino.

Ejemplo 8

Se prepararon tres injertos óseos compuestos tal como en el Ejemplo 2, excepto en que se incrementó la concentración de células nucleadas en la suspensión de médula de 100 a 150 millones de células nucleadas por ml. Este incremento del número de células pasadas a través de los discos de hidroxiapatito incrementó el número de células nucleadas y de células progenitoras de tejido conectivo retenidas en los injertos óseos compuestos en una media del 66,84 y del 52,0, respectivamente. Estas suspensiones altamente celulares mostraban una viscosidad incrementada y tasas de flujo de elución más reducidas.

Ejemplo 9

Se recogieron muestras de médula ósea humana heparinizada bajo consentimiento informado durante procedimientos ortopédicos electivos mediante aspiración repetida de muestras de 2 cm^{3} de sitios separados a lo largo de la cresta ilíaca anterior. Se cargaron muestras estériles de polvo de matriz de aloinjerto óseo humano (diámetro de entre 425 y 850 mm, volumen de 0,1 ml) (Musculoskeletal Transplant Foundation, USA) en jeringas de 1 ml. Un filtro retuvo las partículas en la jeringa. Se pasaron muestras de suspensiones de células de médula ósea a través de los polvos de aloinjerto a concentraciones y tasas de flujo definidas. Las muestras de médula se sometieron a ensayo para número de células y CFU-Os utilizando técnicas establecidas, antes y después del paso a través de la matriz. Se calculó el número de células y las CFU-Os en la matriz. También se calculó una proporción de selección para CFU-Os frente a células nucleadas (CFU-Os retenidas/CFU-Os cargadas, células retenidas/células cargadas). Una proporción de selección superior a 1,0 indica que las CFU-Os han sido positivamente seleccionadas sobre otras células nucleadas derivadas de la médula.

Los resultados indican que la retención de células y de CFU-O en polvo de aloinjerto desmineralizado se incrementó a medida que se incrementaba el número de células cargadas de 25 millones de células a 200 millones de células, cuando se produjo la saturación (caudal de 30 mm/minuto). Las matrices saturadas habían retenido una media de 80 x 10^{6} células nucleadas (intervalo de entre 20 y 140 x 10^{6}) y 3.800 CFU-Os (intervalo de entre 500 y 6.600). Esta concentración media de CFU-Os de 38.000/ml era 19 veces superior a la concentración media de CFU-Os en el aspirado original. La proporción media de selección a una densidad de carga de 25 millones de células era de 2,4, pero cayó a 1,4 a una densidad de carga de 200 millones de células, indicando que las CFU-Os aparentemente se unen selectivamente a la superficie de la matriz, pero que tras saturarse con células la superficie de la matriz, la acumulación posterior de células en los espacios vacíos de la matriz es mucho menos selectiva. La comparación entre tasas de flujo de 15 mm/min y de 60 mm/min reveló que la tasa de flujo no influía en este intervalo sobre el número de células o de CFU-Os que resultaban retenidos. El reciclado de las muestras a través de la matriz hasta tres veces no incrementó la retención de células o de CFU-Os. Tal como se muestra en este ejemplo, las células progenitoras osteoblásticas derivadas de médula ósea recogidas mediante aspiración pueden concentrarse en un factor de 19 en una matriz de aloinjerto mediante la utilización de un procedimiento rápido que resulta adecuado para la utilización intraoperatoria.

Estos procedimientos para la preparación de injertos compuestos de médula ósea típicamente requieren menos de sesenta minutos para completarse. De esta manera, estos procedimientos pueden completarse mientras el donante de médula ósea/persona injertada se encuentra en el quirófano. De acuerdo con ello, mediante la utilización de estos procedimientos puede reducirse el número de ocasiones en que la persona injertada debe someterse a procedimientos invasivos para recibir un injerto óseo compuesto.

Los injertos óseos compuestos mejorados preparados de acuerdo con estos procedimientos comprendían un sustrato implantable biocompatible y una población enriquecida en células progenitoras de tejido conectivo. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "población enriquecida en células progenitoras de tejido conectivo" significa que el porcentaje de células progenitoras de tejido conectivo en comparación con el total de células nucleadas de médula ósea es superior en el injerto compuesto de médula ósea que en el aspirado original de médula ósea. Además, la concentración de células progenitoras de tejido conectivo en los injertos compuestos mejorados de médula ósea era aproximadamente dos veces superior a la concentración de estas células en el aspirado original.

Los injertos óseos compuestos mejorados también comprendían una población de células nucleadas aparte de las células progenitoras de tejido conectivo que incluía células endoteliales y células hematopoyéticas derivadas de médula ósea, y una población de plaquetas derivadas de sangre periférica. Los glóbulos rojos y el plasma líquido en la suspensión de aspirado de médula ósea no resultaron selectivamente retenidos en los injertos compuestos óseos y, de esta manera, los injertos óseos compuestos mejorados típicamente contenían menos del cinco % de glóbulos rojos en la suspensión original. Las proteínas y moléculas de adhesión presentes en el plasma también se concentraron sobre la superficie del sustrato como una función combinada de su concentración en el plasma y su afinidad relativa por la superficie del sustrato.

El injerto óseo compuesto mejorado resulta adecuado para el implante en el donante del aspirado de médula o en un huésped inmunológicamente compatible. El injerto óseo compuesto mejorado también resulta útil para evaluar el efecto de las citoquinas, hormonas y otras moléculas bioactivas exógenas sobre la proliferación y la diferenciación in vitro de las células progenitoras de tejido conectivo.

Claims

1. Equipo para la preparación de un injerto compuesto óseo a partir de una suspensión de aspirado de médula ósea, que comprende:

(a) un sustrato implantable biocompatible poroso que presenta plaquetas sobre la superficie del mismo, que puede obtenerse pasando un concentrado de plaquetas que contiene un anticoagulante o un concentrado de plaquetas aislado a través de dicho sustrato; y

(b) un recipiente para mantener dicho sustrato, estando dicho recipiente configurado para retener dicho sustrato y para permitir el flujo de la suspensión de aspirado de médula ósea a través del mismo, presentando dicho recipiente una superficie interna y dos extremos, definiendo cada uno de dichos extremos una abertura.

2. Equipo según la reivindicación 1, para la preparación de un injerto compuesto óseo a partir de una suspensión de aspirado de médula ósea, que comprende:

(a) un sustrato implantable biocompatible poroso que presenta plaquetas sobre una superficie del mismo, que puede obtenerse pasando un concentrado de plaquetas que contiene un anticoagulante a través de dicho sustrato; y

3. Equipo según la reivindicación 1, para la preparación de un injerto compuesto óseo a partir de una suspensión de aspirado de médula ósea, que comprende:

(a) un sustrato implantable biocompatible poroso que presenta plaquetas sobre una superficie del mismo, que puede obtenerse pasando un concentrado de plaquetas aislado a través de dicho sustrato; y

4. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho sustrato presenta anticuerpos para unirse a antígenos de superficie expresados sobre la superficie de las células progenitoras de tejido conectivo o sobre plaquetas, en el que dichos anticuerpos se encuentran unidos a una superficie accesible de dicho sustrato.

5. Equipo según la reivindicación 4, en el que dichos anticuerpos se seleccionan de entre STRO-1, SH-2, SH-3, SH-4, SB-10, SB-20 y anticuerpos para-fosfatasa alcalina.

6. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho sustrato es estéril.

7. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además:

un regulador de caudal de fluido que puede unirse a un extremo de dicho recipiente para regular la velocidad del flujo de la suspensión de aspirado de médula ósea a través de dicho sustrato.

8. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además:

(a) un reservorio para mantener la suspensión de aspirado de médula ósea; y

(b) un regulador de flujo de fluido que puede unirse a dicho reservorio para regular el flujo de la suspensión de aspirado de médula ósea desde dicho reservorio hacia el interior de dicho recipiente.

9. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además:

un receptor de efluente para recibir un efluente de la suspensión de aspirado de médula ósea desde dicho recipiente.

10. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho sustrato presenta dimensiones externas y un área superficial accesible total por lo menos cinco veces superior al área superficial de un objeto sólido que presenta las mismas dimensiones externas.

11. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho sustrato está formado de una cerámica que comprende fosfato cálcico o biovidrio.

12. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho sustrato está formado de un material seleccionado de entre: colágeno, hueso mineralizado y hueso desmineralizado.

13. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho sustrato está formado de ácido hialurónico o de un biopolímero sintético.

14. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho sustrato está formado de un biopolímero sintético.

15. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho sustrato está formado de ácido hialurónico.

16. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicho sustrato presenta moléculas de adhesión celular unidas a una superficie del mismo.

17. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicho sustrato presenta factores de crecimiento unidos a una superficie del mismo.

18. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicho sustrato presenta poros o canales con un diámetro superior a 40 \mum.

19. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el recipiente comprende además un elemento poroso para retener el sustrato dentro del recipiente.

20. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que el recipiente se prepara a partir de un material que es biocompatible.

21. Injerto compuesto de médula ósea, que comprende.

(a) un sustrato implantable biocompatible poroso que presenta plaquetas sobre una superficie del mismo, que puede obtenerse pasando un concentrado de plaquetas que contiene un anticoagulante o un concentrado de plaquetas aislado a través de dicho sustrato;

(b) una población heterogénea de células nucleadas de médula ósea; y

(c) una población enriquecida en células progenitoras de tejido conectivo.