ES2261644T3

ES2261644T3 - Un procedimiento de extraccion de beta-amilasa.

Info

Publication number: ES2261644T3
Application number: ES02710923T
Authority: ES
Inventors: Pekka Kekki
Original assignee: Danisco Sugar Finland Oy
Current assignee: Nordic Sugar Oy
Priority date: 2001-02-06
Filing date: 2002-01-30
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2022-01-30
Also published as: EE200300354A; AU783947B2; DE60210586D1; RU2003127065A; AU9751301A; CZ303447B6; WO2002062980A8; FI109358B; RU2290440C2; ATE323155T1; US7399622B2; JP2004520830A; CA2370336A1; KR20020065361A; FR2820433A1; JP4092689B2; CZ20032036A3; DK1363999T3; CA2370336C; FI20010221A0

Abstract

Un procedimiento para la extracción de beta-amilasa desde cereal, caracterizado porque el cereal se extrae con un medio acuoso en la presencia de una preparación de enzima que comprende actividades de celulasa, hemicelulasa y beta-glucanasa para obtener un extracto que contiene beta-amilasa, seguido de recuperación de la citada beta-amilasa desde dicho medio.

Description

Un procedimiento de extracción de \beta-amilasa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la tecnología de enzimas. Más concretamente, la invención se refiere a un procedimiento de extracción de \beta-amilasa a partir de cereal y a la utilización de una enzima en la citada extracción.

Antecedentes de la invención

La \beta-amilasa es una enzima de degradación del almidón que hidroliza los enlaces alfa-1,4. Se encuentra, por ejemplo, en bacterias y plantas y escinde el almidón principalmente en maltosa en el extremo no reductor de la cadena de almidón. La \beta-amilasa es abundante, por ejemplo, en granos, donde convierte el almacén de nutrientes del cereal, es decir el almidón, en azúcar, si es necesario. En los cereales, el almidón se almacena principalmente en la forma de amilosa y amilopectina. La \beta-amilasa convierte toda la amilosa en maltosa, con lo que aproximadamente el 60% de la amilopectina se convierte en maltosa y el resto en dextrina.

La \beta-amilasa es una enzima comercialmente significativa que se utiliza, por ejemplo, en la industria del almidón para producir maltosa. Los productos que contienen grandes cantidades de maltosa se emplean, por ejemplo, en la industria de confitería y de alimentación. La \beta-amilasa ha sido aislada de bacterias y de plantas. Por ejemplo, ha sido obtenida a partir de bacterias Bacillus (Patente estadounidense 4 970 158 y Patente japonesa JP 60 126 080) y de bacterias Clostridium termoestables (Patente estadounidense 4 647 538). Además de la maltosa, las \beta-amilasas derivadas de bacterias producen cantidades considerables de maltotriosa, mientras que las \beta-amilasas basadas en plantas producen relativamente más maltosa y por eso son más adecuadas para procesos en los que el propósito es obtener productos lo más dulce y/o fermentables posible. Además, la producción a gran escala de \beta-amilasa de bacterias es difícil. La \beta-amilasa utilizada en la industria está basada en plantas, en cuyo caso se obtiene normalmente de cereales, en particular cebada o trigo, pero también la soja es utilizada como fuente de enzima.

Durante el crecimiento, la \beta-amilasa se forma en los granos, donde se almacena. Un grano consta de un germen y una endosperma que contiene almidón, es decir, un núcleo, componentes que están separados entre sí por el escutelo. La endosperma está rodeada por una capa de aleurona y el grano completo está rodeado por una capa, el pericarpio, una envoltura dura, la testa, y la cáscara propiamente dicha. El trigo no tiene propiamente cáscara, sino que el pericarpio y la testa forman una cáscara externa dura. La \beta-amilasa se acumula principalmente en la endosperma y el escutelo. Las cantidades mayores de \beta-amilasa se encuentran en las porciones más externas de la endosperma inmediatamente debajo de la capa de aleurona.

La \beta-amilasa de cebada ha sido estudiada a fondo. Esta \beta-amilasa y su producción están descritas en, por ejemplo, en las siguientes publicaciones: D. L. Briggs, Barley, Chapman & Hall, Londres, 1978; Cook, Barley and Malt, Academic Press, Londres, 1962; J.R.A. Pollock, Brewing Science, Academic Press, Londres 1979. El nombre sistemático de la enzima es 1,4-alfa-D-glucano maltohidrolasa (EC 3.2.1.2). Antes, la \beta-amilasa se separaba de cereal triturando o moliendo primero el grano y extrayendo luego la \beta-amilasa con agua o un agente tampón. La purificación de la enzima desde un extracto de esta clase es naturalmente difícil y laboriosa porque, además de la enzima buscada, el extracto contiene varios otros componentes del grano solubles. Se han realizado intentos para mejorar la separación de \beta-amilasa desde una solución que la contiene, por ejemplo por adsorción de la enzima con polímero en la presencia de sulfato de amonio (Patente estadounidense 5 294 341). Se han llevado a cabo experimentos de liberación de \beta-amilasa de gluten con proteasa (Patente japonea JP 63 079 590).

La \beta-amilasa ha sido aislada desde el líquido residual de la producción de almidón de trigo por adición de alginato de sodio y por recuperación de la enzima coagulada (Patente japonesa JP 60 027 383) o por formación de un gel de fosfato de calcio al que se adsorbe la enzima que se recupera entonces (Patente japonesa JP 63 248 389). El líquido de desecho de la producción de almidón no es una buena fuente de \beta-amilasa ya que está muy diluido y contiene grandes cantidades de otros componentes que hacen difícil la purificación y concentración y como resultado de ello, el rendimiento es bajo.

Para obtener un extracto de material de partida más puro y para evitar un procesado derivado difícil, se ha sugerido la extracción de la \beta-amilasa de los granos completos o parcialmente descascarillados. Cuando, por ejemplo, se descascarillan los granos de cebada de tal manera que no se rompe su endosperma, las capas más externas de la endosperma funcionan como una especie de filtro que evita el acceso de substancias insolubles al agua de maceración y restringe el acceso de substancias solubles. Es preferible llevar a cabo la extracción en la presencia de una substancia reductora que libera \beta-amilasa desde otras proteínas del grano (Patentes FI 61 516 y US 4 675 296).

La Patente estadounidense 4 675 269 se refiere a un método para preparar un producto de \beta-amilasa comercial a partir del grano de cebada completo o parcialmente descascarillado por extracción de los granos con agua. La Patente estadounidense US 3.492.203 se refiere a extracción de \beta-amilasa del salvado de trigo con agua. Ninguno de los documentos sugiere la utilización de una enzima que libera \beta-amilasa.

\newpage

Se ha descubierto ahora un procedimiento para extracción de \beta-amilasa a partir de cereal, que reduce el tiempo de extracción del cereal y mejora el rendimiento de la enzima. El procedimiento es sencillo de realizar y es particularmente adecuado para procesar el cereal descascarillado, facilitando además la purificación de la enzima.

Breve descripción de la invención

El procedimiento para extraer \beta-amilasa según la invención se caracteriza por la extracción del cereal en presencia de celulasa en un medio acuoso para obtener un extracto que contiene amilasa. La invención se refiere además a la utilización de celulasa en la extracción de \beta-amilasa desde el cereal.

La celulasa se utiliza, por ejemplo, en la producción de almidón a partir del cereal molido para reducir la viscosidad de la suspensión espesa y para separar el almidón de la proteína. Se ha encontrado sorprendentemente ahora que la adición de celulasa al agua de extracción de \beta-amilasa mejora el rendimiento de \beta-amilasa y permite la reducción del tiempo de extracción. Los modos de extracción preferidos de la invención son los señalados en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la influencia de la temperatura sobre el rendimiento de \beta-amilasa en función del tiempo.

Descripción detallada de la invención

El procedimiento de la invención es aplicable a la extracción de diferentes cereales que contienen \beta-amilasa, por ejemplo al procesado de trigo, cebada, centeno y soja. Se prefiere emplearla para la extracción de \beta-amilasa de trigo y de centeno y en particular la de cebada. Se emplea preferiblemente para extraer la \beta-amilasa de trigo y de centeno, y en particular de cebada. Los granos sin germinar no contienen cantidades significativas de enzimas distintas a \beta-amilasa, por cuya razón es útil extraer \beta-amilasa de tales granos. La enzima se puede extraer de granos sin descascarillar pero es preferible su extracción de granos descascarillados, molidos o descortezados. Es recomendable descascarillar el centeno y la cebada. Los mejores resultados se alcanzan por extracción de granos de cebada descascarillados.

Para evitar el acceso del almidón de la endosperma del grano al extracto, el descascarillado se lleva a cabo de manera que no se rompa el grano vivo presente. Sin embargo, la cáscara presente se ha de separar lo más cuidadosamente posible. La razón de esto es que la cáscara es tan densa que impide la penetración de \beta-amilasa. Cebada descascarillada significa, por tanto, que al grano de cebada que se le ha quitado la cáscara presente se le ha dejado la endosperma intacta. En la práctica esto significa que, como máximo, se separa por descascarillado aproximadamente un 20 del peso de un grano sin descascarillar. Normalmente se separa 10 a 20% como material de salvado. En este caso las capas más externas (pericarpio, testa y capa de aleurona) de la endosperma funcionan como una especie de ultrafiltro que evita el acceso de substancias insolubles y substancialmente también el de substancias solubles al agua de extracción. El extracto obtenido de los granos procesados por este método es relativamente puro, lo que facilita el posterior procesado, tal como purificación y concentración de la enzima. En los posteriores tratamientos se pueden emplear procesos conocidos generalmente en la industria de las enzimas, tales como filtración a presión y ultrafiltración.

El cereal se extrae en un medio acuoso, tal como agua, o es posible hacerlo en una solución tampón. Durante la extracción, el pH está normalmente entre 6,0 y 6,5. La extracción se lleva a cabo preferiblemente en condiciones reductoras. Se utiliza la actividad reductora suficiente para liberar la \beta-amilasa unida a la proteína estructural del grano. Las condiciones reductoras se establecen de la manera ya conocida, en la práctica frecuentemente con SO_{2} por ejemplo por adición de metabisulfito de sodio y/o solución de sulfito de sodio. La relación de granos descascarillados al medio acuoso está preferiblemente entre 5.8 y 2:3 (peso/volumen). El procedimiento de la invención es adecuado para procesos a escala industrial donde la extracción se lleva a cabo en un silo de acero al que, por ejemplo, se añaden 19 toneladas de cebada descascarillada y 29 m^{3} de agua que contiene 0,5% de metabisulfito de sodio y 0,5% de sulfito de sodio.

Por extracción de la cebada de la manera antes descrita, se puede obtener un rendimiento de extracción que incluye aproximadamente 45 a 50% del contenido total de \beta-amilasa de la cebada sin separación del agua que permanece dentro del grano. En este caso, el tiempo de extracción es de aproximadamente 72 horas. Cuando la celulasa se añade al agua de extracción, se puede extraer una cantidad tan alta como 65% de la cantidad total de \beta-amilasa del cereal mientras que el tiempo de extracción se reduce a aproximadamente 60 horas.

La celulosa es un polisacárido lineal de glucosa cuyas unidades de glucosa están unidas por enlaces \beta-1,4-glucosido. Se encuentra en paredes celulares de plantas donde está presente frecuentemente junto con lignina y hemicelulosa. Las enzimas que participan en reacciones de descomposición de celulosa se conocen como celulasas. Las celulasas se emplean industrialmente por ejemplo en la producción de almidón, procesado de pasta de papel, procesado de textiles, degradación de \beta-glucano en la industria cervecera y para mejorar la calidad de harinas en panadería. En el procedimiento según la presente invención, la celulasa rompe las estructuras de superficie bajo la cáscara de un grano vivo.

Los productos de celulasa comerciales derivan de bacterias tales como las del género Bacillus, o de hongos, tales como levaduras (por ejemplo Saccharomices) o mohos. Se han aislado grandes cantidades de celulasas a partir de hongos de mohos, en particular. Los mohos de producción de celulasa más comúnmente utilizados pertenecen al género Humicola, Fusarium, Myceliophthora, Aspergillus, Penicillium y Trichoderma. Algunas de las cepas de producción han sido modificadas genéticamente. En la presente invención se emplea preferiblemente celulasa derivada de hongos de mohos, en particular de mohos Trichoderma.

Las preparaciones comerciales de enzimas contienen varias actividades de enzima y sus cantidades y relaciones pueden variar ligeramente de un fabricante a otro. Es esencial para la invención que el producto contenga al menos actividades de celulasa, hemicelulasa y \beta-glucanasa. En otras palabras, en este contexto, celulasa se refiere a una preparación de enzima que descompone al menos celulosa, hemicelulosa y \beta-glucano. Todos los productos comerciales de celulasa ensayados por los solicitantes (producidos por Genencor International, Röhm Enzymer GmbH y Novo Nordisk) mejoraban el rendimiento de \beta-amilasa. Las actividades de celulasa, hemicelulasa y \beta-glucanasa están descritas por ejemplo en Novo's Handbook de Practical Biotechnology, 1986.

Las celulasas se pueden dividir por ejemplo en endocelulasas, exocelulasas, exocelobiohidrolasas y celobiasas. Las endocelulasas, es decir 1,4-\betaD-glucano glucanohidrolasas, escinden al azar enlaces \beta-1,4 de celulosa dentro de la molécula y forman oligosacáridos. Las exocelulasas, es decir, 1,4-\beta-D-glucano glucohidrolasas escinden los enlaces \beta-1,4 en el extremo de la molécula liberando glucosa. Su efecto sobre la celobiosa es lento. Las exocelobiohidrolasas, es decir 1,4-\beta-D-glucan celobiohidrolasas, escinden los enlaces antes mencionados en el extremo no reductor de la molécula, formando celobiosa, y las celobiasas, es decir \beta-D-glucosido glucohidrolasas, escinden la celobiosa en glucosa. La hidrólisis de celulosa en glucosa requiere endoglucanasa (1,4-\beta-D-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.4) que escinde el interior de la molécula y también substratos sustituidos, pero no degradan la celulosa cristalizada, celobiohidrolasa (1,4-\beta-D-glucan celobiohidrolasa, EC 3.2.1.91), que escinde la celulosa cristalizada, y \beta-glucosidasa (\beta-D-glucosido glucohidrolasa, EC 3.2.1.21), que es una celobiasa que escinde celobiosa y celo-oligosacáridos en glucosa.

Un grupo de enzimas que rompe la hemicelulosa, es decir, polisacáridos que se encuentran en la naturaleza y contienen pentosas, por ejemplo arabinanos, galactanos, mananos y xilanos, son las llamadas hemicelulasas Las \beta-glucanasas rompen los \beta-D-glucanos, es decir polímeros de glucosa que pueden estar ramificados y contienen ambos enlaces el \beta-1,3 y el \beta-1,4. El \beta-glucano se encuentra por ejemplo en las paredes celulares de las células de la endosperma en granos. La lichenasa es una endo-\beta-glucanasa (1,3.1,4-\beta-D-glucan-4-glucanohidrolasa) que escinde los enlaces \beta-1,4 de \beta-glucano que contiene enlaces \beta-1,3 y \beta-1,4. La laminarinasa (1,3-\beta-D-glucan-3-glucanohidrolasa) escinde \beta-glucano que contiene solamente enlaces \beta-1,3, tales como los enlaces \beta-1,3 de hidratos de carbono del tipo de laminarina, y la exoglucanasa (1,3-\beta-D-glucano glucohidrolasa) escinde enlaces \beta-1,3 de \beta-1,3-glucanos, formando principalmente glucosa.

En la extracción de \beta-amilasa se han alcanzado resultados prometedores por ejemplo con preparaciones de celulasa Spezyme CE y GC 440 producidas por Genencor International. La última mencionada deriva de una cepa de Trichoderma longibrachiatum genéticamente modificada que rompe la celulosa, hemicelulosa y \beta-glucano con particular eficacia. Su actividad se expresa como efecto sobre carboximetilcelulosa (RBB-CMC), en cuyo caso la actividad de RBB-CMC es de al menos 1400 UI/g. Además de la actividad de celulasa, la preparación GC 440 tiene actividad de \beta-glucanasa, \beta-glucosidasa, \beta-xilosidasa, xilanasa y acetilesterasa. Una partida típica de GC 440 contiene como media aproximadamente 7000 a 9000 U/ml de DNS/CMC, aproximadamente 6000 a 8000 U/ml de \beta-glucanasa, aproximadamente 80 a 90 U/ml de \beta-glucosidasa, aproximadamente 500 a 600 nkat/ml de \beta-xilosidasa, aproximadamente 1700 a 2000 nkat/ml de acetilesterasa, aproximadamente 700 a 1400 U/ml de RBB xilanasa y aproximadamente 1900 a 2100 U/ml de DNS xilanasa. Se han alcanzado muy buenos resultados utilizando celulasa producida por Röhm Enzyme GmbH, que se vende bajo el nombre de marca Rohalase®Sep. La preparación deriva de una cepa de Trichoderma reesei y contiene cantidades considerables de actividad \beta-1,4-endoglucanasa (al menos 4700 UC/g) y xilanasa (al menos 3000 XylH/g), y cantidades más pequeñas de actividad de celobiohidrolasa. También se incluye actividad de \beta-1,3-glucanasa, es decir laminarinasa. Cuando se utilizan preparaciones de enzima antes mencionadas, la cantidad adecuada de celulasa es de al menos 0,015%, preferiblemente de al menos 0,020%, por ejemplo 0,018 a 0,040 y particularmente 0,024 a 0,030% del peso del cereal.

La \beta-amilasa se puede extraer en la presencia de celulasa a una temperatura de 20 a 45°C. La temperatura es preferiblemente 25 a 32°C, por ejemplo, 29 a 31°C. El tiempo de extracción puede ser de 30 a 72 horas, normalmente al menos 48 horas, por ejemplo 48 a 66 horas y en particular 55 a 62 horas. Un tiempo de extracción adecuado a 30°C es aproximadamente 60 horas. Una vez completada la extracción, los granos, sémolas o harinas se separan del agua de extracción utilizando por ejemplo un tamiz y la \beta-amilasa es recuperada desde el agua de extracción, purificándose y/o concentrándose si se desea.

Después de la extracción, el cereal en el que se ha hecho la extracción y separación se puede utilizar para producir almidón, por ejemplo. Según la presente invención, se extrae la \beta-amilasa y el extracto se separa del cereal antes de fraccionar y separar el almidón del cereal. Si la enzima ha sido extraída de granos sin romper, los granos en que se ha hecho la extracción se muelen primero, después de lo cual se lleva a cabo el proceso de producción de almidón de la manera en sí conocida, es decir, los granos molidos se mezclan con agua y el cereal se fracciona utilizando tamizado y fuerza centrífuga. Durante el molido, se añade habitualmente la celulasa junto con \beta-glucanasa para reducir la viscosidad y separar el almidón de la proteína.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin que la limiten a los modos de realización descritos en ellos.

Ejemplo 1 Determinación de \beta-amilasa

Antes de la determinación de la cantidad total de \beta-amilasa del cereal, se separó cualquier cáscara del cereal que se iba a analizar, se molió cuando estaba seco hasta obtener harina fina y se colocaron 10 g de ésta en un matraz erlenmeyer de 100 ml. Se añadieron 100 ml de solución de sulfito de sodio al 0,5% (peso/volumen) y se mezclaron las substancias apropiadamente. Se dejó reposar la mezcla en el matraz durante 24 horas y se agitó sacudiéndola de vez en cuando. Después se mezcló apropiadamente y se filtró a través de papel de filtro fino (MN 640 W). El filtrado se diluyó a una relación de 1:50 con agua destilada y se determinó la actividad por el método descrito abajo. Este ensayo de enzima se utilizó también como tal para determinar el contenido de \beta-amilasa de soluciones de extracción en los ejemplos que se describen después.

En primer lugar, se determinó la \beta-amilasa como se describe en Food Chemical Codex IV, General Test and Apparatus, 485.

Una unidad DP (fuerza diastática) se define aquí como la cantidad de enzima en 0,1 ml de una dilución de muestra al 0,5% que produce una cantidad de azúcares reductores suficiente para la reducción de 5 ml de solución de Fehling de 100 ml de substrato a 20°C en 1 hora. (El método de determinación no corresponde a la definición de DP).

La actividad de enzima se determinó por hidrólisis de almidón a 20°C, pH 4,6, durante 30 minutos. Los azúcares reductores resultantes se determinaron por volumetría con ferricianuro alcalino. Para producir un substrato de almidón, se mezclaron 20 g (substancia seca) de almidón (Baker 1130) con aproximadamente 50 ml de agua. Aproximadamente se añadieron 500 ml de agua a ebullición y la mezcla se hirvió durante exactamente 2 minutos. Se añadieron 20 ml de tampón acetato (0,5 M, pH 4,6) a la solución de almidón enfriada y se diluyó con agua destilada hasta 1 litro. Se pasaron con pipeta 200 ml de substrato de almidón templado a 20°C a un matraz volumétrico de 250 ml, se añadieron 10 ml de muestra de enzima diluida y se mezclaron bien las substancias. La mezcla se incubó durante exactamente 30 minutos en baño maría a 20°C y se añadieron 20 ml de NaOH 0,5 N. Las substancias se mezclaron bien y se diluyeron a 250 ml. Se pasaron con la pipeta 10 ml de dilución de enzima y 20 ml de NaOH 0,5 N a un matraz volumétrico de 250 ml para una muestra-0. Se mezclaron las substancias bien y se añadieron 200 ml de substrato de almidón y se diluyeron a 250 ml.

El reactivo ferricianuro 0,05 N se preparó por disolución de 16,5 g de ferricianuro de potasio (K_{3}Fe(CN)_{6}) y 22 g de carbonato de sodio (Na_{2}CO_{3}) en agua y diluyendo hasta 1 litro. Se preparó una solución A-P-Z por disolución de 70 g de cloruro de potasio (KCl) y 20 g de sulfato de zinc (ZnSO_{4} x 7H_{2}O) en 700 ml de agua destilada, por adición de 200 ml de ácido acético concentrado y por dilución a un litro. Se preparó una solución de yoduro de potasio por disolución de 50 g de yoduro de potasio (KI) en 100 ml de agua destilada y por adición de 2 gotas de hidróxido de sodio (NaOH) al 50%. Se pasaron con la pipeta 10 ml de reactivo ferricianuro y 5 ml de muestra a un matraz volumétrico de 250 ml. Se mezcló bien todo y se calentó en un baño maría a ebullición durante exactamente 20 minutos. La solución se enfrió y se añadieron 25 ml de reactivo A-P-Z y 1 ml de solución de KI. La mezcla se valoró con solución de sulfato de sodio 0,05 N hasta que desapareció el color azul (azul oscuro \rightarrow blanco)

La actividad de \beta-amilasa se calcula con la fórmula

actividad = \frac{(V0 - V1)\ x\ 23\ x\ K}{100}\ DP^{o}/ml

donde:

V0 = consumo por muestra-0 en la valoración (ml)

V1 = consumo por muestra en la valoración (ml)

K = factor de dilución

Ejemplo 2

Se estudió el efecto de celulasa sobre el tiempo de extracción de \beta-amilasa. Se extrajo la \beta-amilasa de cebada sin celulasa y con celulasa. Se extrajeron 10 kg de cebada descascarillada con máquina de descascarillar en 15 litros de agua que contenía metabisulfito de sodio al 0,5% y sulfito de sodio al 0,5%. Además, se añadió celulasa GC440 producida por Genencor a la segunda partida, la cantidad de celulasa correspondiente a 0,029% del peso de cebada descascarillada. La extracción se llevó a cabo a 30°C. La actividad del grano utilizado en la extracción era de 155 DP°/g, que se determinó según el ejemplo 1. Los resultados se muestran en las tablas 1 y 2.

TABLA 1 Extracción sin celulasa

Tiempo, horas	Actividad de \beta-amilasa en DP°/ml de solución de extracción
10	20
24	47
30	55
48	83
60	92
66	98
72	102
96	86

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TABLA 2 Extracción con celulosa

Tiempo, horas	Actividad de \beta-amilasa en DP°/ml de solución de extracción
10	23
24	55
30	70
48	92
60	104
66	104
72	100
96	90

Los resultados muestran que la adición de celulasa al agua de extracción reduce el tiempo de extracción de \beta-amilasa.

Ejemplo 3

Se estudió el efecto de celulasa sobre el rendimiento de extracción. Se extrajeron 10 kg de cebada descascarillada con una actividad de \beta-amilasa de 155 DP°/g en 15 litros de agua que contenía metabisulfito de sodio al 0,5% y sulfito de sodio al 0,5%. La extracción se llevó a cabo a 30°C sin celulasa o en presencia de celulasa.

El tiempo de extracción sin celulasa fue de 72 horas. La actividad total de la cantidad de cebada utilizada fue de 1550 kDP°. Se obtuvieron 8175 ml de extracto con una actividad de 95 DP°/ml por separación del extracto con un tamiz. La actividad total del extracto obtenido fue así de 776,6 kDP° y el rendimiento de extracto 50,1%.

Se llevó a cabo la correspondiente extracción en presencia de celulasa por adición de una cantidad de GC440 correspondiente al 0,025% del peso e la cebada descascarillada. El tiempo de extracción fue de 60 horas. La actividad total de la cantidad de cebada utilizada fue de 1550 kDP°. Se obtuvieron 9825 ml del extracto con una actividad de 102 DP°/ml por separación del extracto con tamiz. La actividad total del extracto obtenido fue así de 1002,2 kDP° y el rendimiento de extracto de 64,7%.

Los resultados muestran que la adición de celulasa al agua de extracción aumenta considerablemente el rendimiento de \beta-amilasa.

Ejemplo 4

Se estudió el efecto de la temperatura sobre la extracción de \beta-amilasa. La cebada descascarillada se extrajo de la manera descrita en los ejemplos precedentes en la presencia de celulasa a diferentes temperaturas. La dosis de celulasa GC440 correspondía a 0,027% del peso de la cebada descascarillada y la temperatura de extracción fue de 20°C, 25°C, 30°C ó 40°C. Los resultados se muestran en la Figura 1. Los mejores resultados se alcanzaron a 30°C.

Ejemplo 5

Se estudió el efecto de celulasa sobre el rendimiento de \beta-amilasa de trigo. Se extrajeron 10 kg de trigo molido con una actividad de \beta-amilasa de 128 DP°/g en 15 litros de agua que contenía metabisulfito de sodio al 0,5% y sulfito de sodio al 0,5%. La extracción se llevó a cabo a 30°C ya sea sin celulasa o el presencia de celulasa.

El tiempo de extracción sin celulasa fue de 72 horas. La actividad total de la cantidad de trigo empleada fue de 1280 kDP°. Se obtuvieron 9175 ml de extracto con una actividad de 55 DP°/ml por separación del extracto con un tamiz. La actividad total del extracto obtenido era así de 504,6 kDP° y el rendimiento del extracto 39,4%.

Se llevó a cabo la extracción correspondiente en la presencia de celulasa por adición de una cantidad de celulasa GC440 correspondiente a 0,036% del peso de las sémolas al trigo molido. El tiempo de extracción fue de 60 horas. La actividad total de la cantidad de trigo utilizada fue de 1280 kDP°. Se obtuvieron 10080 ml de extracto con una actividad de 72 DP°/ml por separación del extracto con un tamiz. La actividad total de extracto obtenido era así de 725,8 kDP° y el rendimiento del extracto 56,7%.

Los resultados muestran que la adición de celulasa al agua de extracción aumenta considerablemente el rendimiento en \beta-amilasa.

Ejemplo 6

Se estudió el efecto de celulasa sobre el rendimiento de \beta-amilasa de trigo descortezado. El trigo se descortezó con máquina de descortezar arroz por rotura de la superficie y separación de la parte más externa, es decir, la mayor parte del pericarpio fué separado y la testa ligeramente rota. Se extrajeron 10 kg de trigo descortezado con actividad de \beta-amilasa de 128 DP°/g en 15 litros de agua que contenía metabisulfito de sodio al 0,5% y sulfito de sodio al 0,5%. La extracción se llevó a cabo a 30°C sin celulasa o en la presencia de celulasa.

El tiempo de extracción sin celulasa fue de 72 horas. La actividad total de la cantidad de trigo utilizada fue de 1280 kDP°/ml. Se obtuvieron 9780 ml del extracto con una actividad de 15 DP°/ml por separación del extracto con un tamiz. La actividad total del extracto obtenido era así 146,7 kDP° y el rendimiento del extracto 11,5%.

Se llevó a cabo la correspondiente extracción en la presencia de celulasa por adición de una cantidad de celulasa GC 440 que correspondía a 0,036% del peso del trigo descortezado a trigo molido. El tiempo de extracción fue de 60 h. La actividad total de la cantidad de trigo utilizada fue de 1280 kDP°. Se obtuvieron 9250 ml de extracto con una actividad de 35 DP°/ml por separación del extracto con un tamiz. La actividad total del extracto obtenido era así 323,8 kDP° y el rendimiento del extracto 25,3%.

Los resultados mostraban que la adición de celulasa al agua de extracción incrementaba considerablemente el rendimiento de \beta-amilasa.

Claims

1. Un procedimiento para la extracción de \beta-amilasa desde cereal, caracterizado porque el cereal se extrae con un medio acuoso en la presencia de una preparación de enzima que comprende actividades de celulasa, hemicelulasa y \beta-glucanasa para obtener un extracto que contiene \beta-amilasa, seguido de recuperación de la citada \beta-amilasa desde dicho medio.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la \beta-amilasa se extrae de cebada, trigo o centeno.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la \beta-amilasa se extrae de cebada descascarillada.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la \beta-amilasa se extrae de los granos de cereal que han sido tratados por un proceso seleccionado entre descascarillado, molido, triturado y descortezado.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la extracción se lleva a cabo en condiciones reductoras.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque las citadas condiciones reductoras se adaptan a la provisión de actividad reductora capaz de liberar la \beta-amilasa unida a una proteína estructural del grano.

7. El procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque las citadas condiciones reductoras se proporcionan por agua que contiene SO_{2}.

8. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la cebada descortezada se extrae con agua que contiene SO_{2} en una relación de 5:8 a 2:3, cebada descascarillada:agua que contiene SO_{2}.

9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la extracción se lleva acabo a una temperatura de 25 a 33°C, preferiblemente de 29 a 31°C.

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el tiempo de extracción es 48 a 66 horas, preferiblemente 55 a 62 horas.

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque la celulasa utilizada es celulasa de moho.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se utiliza la celulasa del moho Trichoderma.

13. El procedimiento según las reivindicaciones 1-11 caracterizado porque la celulasa comprende celulasa de los géneros seleccionados entre Humicola, Fusarium, Myceliophthora, Aspergillus, Penicillium y Trichoderma.

14. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la \beta-amilasa se extrae de granos molidos.

15. El procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la citada \beta-amilasa recuperada se trata por purificación y/o concentración.

16. Utilización de la preparación de enzimas que comprende actividades de celulasa, hemicelulasa y \beta-glucanasa en la extracción de \beta-amilasa de cereal.