ES2261708T3

ES2261708T3 - Aislamiento de complejos especificos de ligandos unidos a membrana.

Info

Publication number: ES2261708T3
Application number: ES02756793T
Authority: ES
Inventors: Aya Jakobovits; Pia M. Challita-Eid
Original assignee: Agensys Inc
Current assignee: Agensys Inc
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-29
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2022-07-29
Also published as: CA2454133C; EP1419277A4; US6960447B2; DE60211714T2; US20030040026A1; US20030036099A1; WO2003012047A2; EP1419277B1; WO2003012047A3; JP2005500359A; IL160053A; IL160053A0; EP1419277A2; ATE327256T1; DE60211714D1; AU2002322776B2; CA2454133A1

Abstract

Un método para aislar y caracterizar un receptor unido a membrana junto con su microentorno; tal método comprende (a) proporcionar un soporte sólido acoplado a un ligando que una específicamente dicho receptor, en el que dicho ligando es un agente de unión afín distinto de lectina; (b) tratar dicho soporte sólido con una muestra que comprende células nucleadas u orgánulos de las mismas que comprenden dichos receptores unidos a membrana, y tales células u orgánulos no se han tratado en su superficie, en el que se forma un complejo entre dicho receptor unido a membrana y el ligando, generando de este modo un complejo ligando/receptor que comprende el receptor y su microentorno, tal complejo está acoplado al soporte sólido a través del ligando; (c) separar el soporte sólido del resto de la muestra; (d) someter al soporte sólido separado a una fuerza suficiente para disociar el receptor y su microentorno de la membrana, pero insuficiente para romper el complejo ligando/receptor; obteniendo de este modo el soporte sólido acoplado a un complejo ligando/receptor por medio del cual el receptor retiene su microentorno, pero se separa de la membrana; (e) obtener dicho complejo ligando/receptor aislado al eliminar el complejo ligando/receptor que comprende el receptor y su microentorno del soporte sólido; y, opcionalmente, (f) analizar el microentorno del receptor.

Description

Aislamiento de complejos específicos de ligandos unidos a membrana.

Campo del invento

El invento se refiere a métodos para aislar complejos unidos a membrana en los que se preserva el microentorno de una proteína unida a membrana, que está unida mediante un ligando específico. Más específicamente, el invento se interesa en preparar y aislar de forma no destructiva receptores unidos a membrana, especialmente de la superficie celular, junto con las moléculas con las que están asociados.

Antecedentes de la técnica

Una multitud de procedimientos para aislar proteínas están disponibles, y se practican, en la técnica. Para proteínas solubles, como las que se encuentran en el citoplasma, es posible aplicar directamente estas técnicas, ya que es innecesario tomar medidas para liberar estas proteínas de su ambiente. Sin embargo, las proteínas o lípidos que están unidas a la membrana, han precisado un tratamiento más duro para desprenderlos de la membrana. Una técnica empleada habitualmente es la solubilización empleando detergentes u otros reactivos duros tales como los agentes caotrópicos u otros compuestos desnaturalizantes como la urea. Véase, por ejemplo, Molloy MP, et al. Electrophoresis (1998) 19:837-834; Chevallet M, et al. Electrophoresis (1998) 19:1901-1909. Un inconveniente de tales métodos es que el procedimiento de aislamiento se extralimita, es decir, la proteína se recupera esencialmente por sí misma y no está acompañada por los componentes de la membrana celular que normalmente están asociados con ella y que son a menudo cruciales para su función biológica. La elucidación del papel biológico de tales proteínas requiere el conocimiento de las sustancias implicadas en la transducción de señales resultante de la unión de la proteína a su ligando específico. Por eso, sería extremadamente valioso recuperar estas proteínas de membrana junto con sus sustancias corolario, de modo que la naturaleza de estas sustancias y el papel biológico de la proteína y sus sustancias asociadas puedan determinarse. Se señalará que las sustancias corolario pueden asociarse ellas mismas con la membrana o pueden asociarse con el receptor en el citoplasma.

Otro inconveniente de los métodos de la técnica anterior es que, en algunas ocasiones, las membranas se desorganizan tanto por los reactivos duros que se exhiben receptores crípticos y al mismo tiempo se unen a los ligandos de interés. De este modo, el profesional es descarriado a analizar un receptor con respecto a un ligando cuando de hecho el receptor es irrelevante para la función biológica del ligando en cuestión.

Una descripción de un método para obtener receptores de lectina a partir de eritrocitos sin el empleo de detergentes se describió por Jakobovits A, et al. Biochem Biophys Res Commun (1981) 100:1484-1490. En este método, los eritrocitos se trataron con neuraminidasa y luego con bolas de sefarosa recubiertas de lectina, es decir, recubiertas de aglutinina de cacahuete, dando así como resultado el acoplamiento de los eritrocitos a las bolas a través de una interacción entre la lectina y los receptores afines sobre la superficie celular. Las células sin unir se eliminaron y el sedimento de bolas cubiertas de eritrocitos se pipetearon vigorosamente con una pipeta Pasteur. Entonces, se lavaron las bolas para eliminar cualquier eritrocito que se hubiese partido y se determinó que la mayoría de los eritrocitos podían eliminarse al repetir este tratamiento. Cualquier célula que permanezca ligada se podría eliminar por agitación vorticial rápida y subsecuente lavado. Mientras los eritrocitos se eliminaron, los receptores unidos a lectina permanecieron unidos a las bolas de sefarosa. Estos receptores "extraídos" se desprendieron entonces de las bolas mediante ebullición o por elución competitiva con galactosa.

La elución de los componentes ligados dio como resultado la recuperación de los componentes unidos a lectina, designados asialoglicoforinas. Este trabajo mostró que las células que carecen de núcleos, cuando se tratan para exponer los azúcares relevantes, podrían estar ligadas a aglutininas (es decir, lectinas) a través de carbohidratos de sus superficies y que los restos que contienen carbohidratos ligados a las aglutininas se podrían eliminar de las membranas celulares por disociación mecánica. No se proporcionó una descripción de cualquier componente asociado de forma no covalente eliminado junto con los receptores de glicoproteína per se. Además, no hay descripción de células que no hayan sido tratadas para exponer los azúcares relevantes, ni tampoco hubo una sugerencia para emplear ligandos distintos de las lectinas. Según se señala abajo, las lectinas son relativamente inespecíficas y, por eso, se unirán a una multitud de proteínas glicosiladas, algunas de cuyas funciones biológicas son irrelevantes para la naturaleza específica de la lectina.

Un experimento adicional en el que los receptores de lectina se "extrajeron" a partir de timocitos de ratón se describió en un capítulo incluido en una tesis presentada en apoyo de la adjudicación de un PhD de la Escuela de Graduación Feinberg al inventor de este invento y que se aprobó por el Consejo Científico del Instituto Weizmann de Ciencia el 6 de Junio de 1983. En este experimento, los timocitos se marcaron de formas diversas y se trataron con bolas derivatizadas de lectina de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Esto dio como resultado la recuperación de un patrón complejo de proteínas marcadas, muchas de las cuales representaban receptores que incluyen azúcares unidos por las lectinas empleadas, demostrando de este modo una ausencia relativa de especificidad para extraer receptores relevantes al emplear la lectina como un agente de unión.

En tanto que la unión eficaz de las células puede llevarse a cabo más fácilmente a través del uso de lectinas que a través de ligandos específicos del presente invento, el resultante no proporciona información al respecto de receptores relevantes biológicamente debido a la inespecificidad de unión a la lectina. Algunas lectinas sí producen respuestas biológicas, y las lectinas son específicas con respecto a los carbohidratos a los que se unen, pero las dianas de carbohidratos individuales son promiscuas con respecto a los receptores en los que residen. De este modo, en lo que respecta a los receptores individuales, se pierde la especificidad de unión.

Descripción del invento

Actualmente se ha encontrado que los receptores de superficie que comprenden proteína, en particular en las células nucleadas, pueden eliminarse junto con componentes complejos asociados de forma no covalente mediante la unión específica de estos receptores a ligandos complemento y la subsiguiente rotura de la mayor parte de la célula o de la membrana relevante del complejo ligando/receptor. En general, este procedimiento puede referirse como "desplazamiento" del receptor y de su microentorno. Si se desea, el receptor, junto con sus componentes celulares asociados, puede disociarse del ligando específico empleando, por ejemplo, unión competitiva por el receptor mismo, sus análogos o muchas otras técnicas.

El invento proporciona un método para aislar rápida y específicamente componentes unidos a la membrana, tales como receptores de la superficie celular en sus conformaciones nativas y en sus microentornos nativos, bajo condiciones en las que se preserva el estatus del componente o del receptor, permitiendo así profundizar en la función del receptor que no están disponibles cuando se emplean métodos convencionales para el aislamiento. Tales métodos convencionales incluyen típicamente detergentes o agentes caotrópicos que distorsionan y/o rompen la membrana y el entorno citoplásmico que rodea al receptor y, por tanto, destruyen información referente al entorno y la función del receptor en sí. De este modo, el método del invento proporciona información que identifica y caracteriza las dianas de la superficie celular que interaccionan con los estímulos/ligandos y para identificar y diseñar las moléculas que interaccionan con estas dianas. La identificación y diseño de las moléculas que interaccionan con estas dianas, incluidas las moléculas que las inhiben, se informa además por la comprensión disponible por los métodos del invento que elucidan la forma de funcionar y los componentes celulares adicionales asociados con las dianas.

De este modo, en un aspecto, el invento está dirigido a un método para aislar un receptor ligado a la membrana, tal como un receptor de superficie celular junto con su microentorno, cuyo método comprende proporcionar un soporte sólido acoplado a un ligando específico para el receptor deseado, al cual se han ligado las membranas que llevan el receptor a través de la asociación con el ligando para formar un complejo ligando/receptor, y entonces romper las células del complejo ligando/receptor. El "ligando" puede ser, por ejemplo, una hormona o factor de crecimiento o puede ser un anticuerpo o un fragmento relevante del mismo siempre que sea específico para la proteína fijada. El receptor así recuperado permanecerá asociado con su microentorno. El microentorno, por supuesto, puede no incluir de hecho ningún componente celular asociado y el receptor se recuperará solo. Esto también constituye información valiosa referente a la naturaleza del receptor. Opcionalmente, esto puede seguirse por disociación del complejo ligando/receptor (que comprende el receptor y su microentorno) a partir del soporte sólido y/o disociación del ligando a partir del receptor/microentorno para recuperar el receptor/microentorno en sí mismo. En cualquier caso, en la medida en que el microentorno permanece asociado con el receptor puede incluirse dentro del invento una etapa adicional para analizar el microentorno para determinar qué, si alguno, componentes contiene. Numerosos métodos están disponibles para tal análisis, incluidos, por ejemplo, análisis cromatográfico, espectroscopía de masas, geles en 2 dimensiones y transferencias Western.

En el método del invento, el ligando es específico para el receptor per se y no tiene reacción cruzada con receptores irrelevantes para la actividad biológica del receptor diana. Tal como se define más abajo en esta memoria, en una realización los ligandos específicos para los receptores no incluyen lectinas, en su mayor parte. Las lectinas, en general, carecen de la capacidad indispensable de unirse sólo a receptores únicos biológicamente significativos. Las lectinas, generalmente, son capaces de unirse a carbohidratos asociados con proteínas, y de este modo tienen reactividad cruzada con las proteínas glicosiladas en general. Las lectinas se incluyen dentro de la definición de "ligandos" en esta memoria sólo si son lo suficientemente específicas como para efectuar el desplazamiento de un receptor particular, al contrario que su comportamiento típicamente genérico. En general, las lectinas se unen a densidades más elevadas de receptores en las células que ligandos más específicos, tales como anticuerpos. Debería señalarse que los anticuerpos o fragmentos de éstos empleados como ligandos pueden en sí mismos, aunque no necesitan, dar como resultado cualquier respuesta biológica; sin embargo, específicamente fijan receptores cuyos ligandos sí producen una respuesta.

Además, las lectinas, para unirse, pueden requerir el tratamiento previo de la superficie de la membrana para exponer los restos de carbohidratos a los que se unen. Un método preferido del invento utiliza membranas que no han estado sometidas a ningún tratamiento de superficie que modifique los carbohidratos expuestos sobre la superficie celular. En un método preferido, una ventaja es que la membrana se emplea en un estado nativo más realista. En este método preferido, no existe tratamiento de la superficie de las membranas antes de que éstas contacten con el ligando específico.

Sin embargo, en una realización preferida, las lectinas pueden emplearse como al menos parte del tratamiento. Donde se entiende que la distribución de carbohidratos será diferente en un tipo particular de célula, pueden proporcionarse lectinas que son específicas a un receptor de la superficie celular y, en este caso especial, tales lectinas pueden emplearse como ligandos. Por ejemplo, se entiende que los receptores asociados con células tumorales tienen diferentes patrones de glicosilación de los asociados con células normales. Allá donde la diferencia en la asociación de carbohidratos sea suficiente para diferenciar un receptor particular, por ejemplo, en una célula tumoral, incluso si se necesita tratar la célula para exponer el carbohidrato diferenciador, puede emplearse una lectina específica para este carbohidrato como un ligando suficientemente específico.

En aún otra realización preferida, las membranas están asociadas con o derivadas a partir de una célula nucleada o una célula bacteriana, preferiblemente una célula nucleada. Las células nucleadas son representantes de virtualmente todas las células eucariotas típicas con la excepción de las células rojas de la sangre. Las membranas de la superficie, o contenidas en las células nucleadas, son inherentemente más complejas que aquellas asociadas con, por ejemplo, las células rojas de la sangre. Además, las células nucleadas llevan a cabo funciones metabólicas más complejas que las células rojas sanguíneas y, de este modo, ofrecen un sustrato más fértil para la recuperación de receptores.

En aún otra realización preferida, el método del invento incluye las etapas activas descritas anteriormente para analizar el microentorno en el que el receptor está contenido. El microentorno puede residir en la membrana misma o en la proximidad del receptor en el citoplasma. Según se ha expuesto anteriormente, el microentorno puede que no contenga ningún componente estrechamente asociado y, por tanto, el método del invento dará como resultado el aislamiento del receptor per se.

En otro aspecto, el invento está dirigido a un método para obtener una librería de receptores unidos a membrana, tal método comprende proporcionar soportes sólidos acoplados a multitud de ligandos; contactando los soportes sólidos con una muestra de membranas, preferiblemente a partir de o asociadas con células nucleadas, bajo condiciones por medio de las cuales los receptores en dichas membranas o en dichas células están acoplados a uno o más de los ligandos en dichos soportes sólidos, de modo que un ligando forma un complejo con su receptor afín. Las membranas o células se disocian entonces de sus complejos ligando/receptor, los cuales comprenden el receptor y el microentorno. Los receptores derivados de membrana (con los microentornos) se recuperan de forma opcional, bien solos o junto con sus ligandos, a partir del soporte sólido. El receptor/microentorno puede entonces analizarse para determinar qué componentes, si alguno, están asociados con el receptor aislado.

En aspectos adicionales, el invento esta dirigido a receptores aislados asociados con microentornos preparados por el método del invento y a receptores nuevos identificados de tal modo. Los receptores recuperados pueden emplearse en ensayos de escrutinio para identificar compuestos agonistas o antagonistas. Los receptores recuperados pueden, además, si los receptores se identifican como asociados con células indeseadas o enfermas, emplearse en el diseño de anticuerpos, fármacos o vacunas dirigidas a estas células. Los receptores pueden recuperarse tanto a partir de células normales como enfermas.

El invento también incluye perfiles de receptores de membrana o de muestras celulares. Según se describe abajo, el método del invento puede emplearse en un sistema de alto rendimiento para determinar patrones de receptores de la superficie celular o contenidos en la membrana.

De este modo, un aspecto importante del invento es la capacidad para caracterizar interacciones con receptores y las redes celulares asociadas con sus funciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los resultados de citometría de flujo para detectar EGFR en la superficie de las células A431. Las células A431 se tiñeron con 1 \mug de IgG control de ratón o anticuerpo IgG2a\kappa de ratón anti-EGFR 528 durante 30 minutos a 4ºC. Las células se lavaron entonces en PBS + 1% de suero bovino fetal, se tiñeron con anticuerpo anti-ratón secundario conjugado con FITC y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados muestran la expresión fuerte de EGFR en la superficie celular de las células A431.

La Figura 2 muestra transferencias Western del EGFR desplazado mediante el anticuerpo monoclonal (Mab) anti-EGFR y la lectina WGA. La proteína EGFR de 170 kDa se detectó fácilmente en los productos desplazados de las células A431 empleando bolas recubiertas de anti-EGFR y WGA.

La Figura 3 muestra una transferencia Western de EGFR activado desplazado y sus fosfoproteínas asociadas detectadas mediante anti-fosfotirosina. La banda de 170 kDa se corresponde con EGFR activado. (La banda de 50 kDa se corresponde con reactividad cruzada del anticuerpo secundario con la cadena pesada de ratón (mIgH) del anticuerpo 528 de ratón desprendido de las bolas). Las bandas restantes representan proteínas asociadas.

Las Figuras 4A y 4B muestran transferencias Western de proteínas asociadas con EGFR desplazado, es decir, Vav2 y Grb2. Ésta muestra ambas Vav-2 y Grb2 asociadas con EGFR en los materiales de desplazamiento del Mab 528. (La banda detectada de 50 kDa de peso molecular corresponde a reactividad cruzada del anticuerpo secundario con la cadena pesada de ratón (mIgH) del anticuerpo 528 desprendido de las bolas).

La Figura 5 muestra una transferencia Western de proteínas Shc asociadas a EGFR desplazadas por el Mab 528 anti-EGFR.

Las Figuras 6A-6F son diagramas de citometría de flujo que muestran la unión del Mab 1G8 anti-PSCA y de WGA a la superficie de las células PC3 transfectadas con un sistema de expresión de PSCA. Las células se tiñeron con anticuerpo control o con 1 \mug de anticuerpo 1G8 IgG1 anti-PSCA de ratón seguido por anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con FITC o con lectina WGA conjugada con FITC durante 30 minutos a 4ºC. Las células se analizaron entonces mediante citometría de flujo. El Mab 1G8 se une a las células PC3-PSCA solamente; la lectina WGA se une a ambas células PC3 y PC3-PSCA.

Las Figuras 7A y 7B son transferencias Western que muestran el desplazamiento específico de PSCA, pero no de EGFR, por el Mab 1G8 anti-PSCA como ligando. WGA medió el desplazamiento de ambos PSCA y EGFR de PC3-PSCA y de EGFR de las células PC3, PC3-PSCA y A431, pero el desplazamiento con el Mab 1G8 anti-PSCA desplazó sólo PSCA (no EGFR) de PC3-PSCA. (Las bandas detectadas de 50 kDa y 25 kDa de peso molecular se corresponden con reactividad cruzada del anticuerpo secundario con las cadenas pesada (mIgH) y ligera (mIgL) del anticuerpo 1G8 de ratón desprendidas de las bolas).

Las Figuras 8A y 8B son transferencias Western que muestran el desplazamiento de PSCA con la lectina WGA. Los resultados muestran el desplazamiento de PSCA mediado por WGA en las células PC3-PSCA, pero lo desplazado no incluye la proteína intracelular Grb2.

Modos de llevar a cabo el invento

El invento proporciona, por primera vez, un método por medio del cual al menos se alcanzan tres objetivos importantes. Primero, el método permite aislar receptores unidos a membrana que se unen específicamente a un ligando directamente de células intactas en una forma que preserva sus conformaciones nativas y restos asociados, proporcionando de este modo un caudal de información acerca de los receptores y de los componentes con los que los receptores se asocian y, por tanto, de las funciones y papeles de los receptores recuperados que no habían estado disponibles con anterioridad. Al averiguar la naturaleza de los restos que están asociados de forma nativa con los receptores, puede determinarse el papel del receptor en las vías celulares, tales como proliferación, diferenciación, supervivencia, apoptosis, transformación y similares. Una vez que se determinan tales papeles, el receptor mismo puede emplearse en el diseño de estrategias apropiadas para controlar la función relevante. Segundo, y relacionado con el primer objetivo, es la seguridad de que los receptores recuperados no son artefactos del experimento al evitar el uso de agentes que revelen moléculas crípticas que no tienen significado biológico, pero que de forma coincidente se unen al ligando usado. Tercero, el método del invento ofrece un sistema de alto rendimiento para la identificación rápida de receptores unidos a membrana a través de un sistema fácil de recuperación de estos receptores de las membranas. Algunos receptores identificados puede que no sean conocidos previamente.

La identificación y caracterización de las interacciones proteína-proteína, proteína-lípido o cualquier otro tipo de interacción exhibida por los receptores es significativa para evaluar el papel biológico del receptor y, por tanto, el papel biológico de los ligandos a los que puede estar unido.

Como se emplea en la presente memoria, "receptor" se refiere a cualquier resto que se une de forma específica a un ligando afín. Típicamente, los receptores son proteínas y pueden o no derivatizarse adicionalmente tal como a través de glicosilación, fosforilación, lipidación, acoplamiento a componentes estructurales adicionales y similares. Se emplea "receptores" en esta memoria como un término genérico y no está limitado a las proteínas que están necesariamente asociadas con una vía celular. Los receptores asociados a membrana incluyen, por ejemplo, receptores acoplados a proteína G, receptores de citoquinas, canales iónicos, receptores de opioides, receptores de hormonas, receptores de retinoides, receptores de esteroides, receptores de factores del crecimiento, integrinas, inmunoglobulinas, receptores de células T, MHC de clase I y II y, en general, cualquier proteína unida a membrana que comprende suficiente exposición en la superficie de la membrana para unirse específicamente a un ligando.

El "ligando" puede ser cualquier agente de unión afín distinto de una lectina no específica, tal agente es específico para un componente de receptor unido a membrana, donde el componente es característico de uno o, en algunos casos, de varios receptores. (Un componente característico puede compartirse por varios receptores, no todos los cuales necesitan tener la misma función biológica, aunque se cree que esto es la excepción). Esto es, el ligando interaccionaría solamente con receptores que reconoce específicamente como un agonista o antagonista o, en el caso de anticuerpos, o de sus fragmentos u de otros imitadores del ligando nativo, sólo el receptor activado por el ligando nativo que se imita. En general, las lectinas se excluyen de la definición de ligandos porque son relativamente inespecíficas. Como muchas proteínas están glicosiladas, las lectinas se unen a gran número de proteínas inespecíficamente. Además, el empleo de lectinas puede requerir el tratamiento de las membranas previo al contacto para exponer los residuos de carbohidratos que están enmascarados, por ejemplo, por residuos de ácido siálico. De este modo, "ligando", como se define en la presente memoria, incluye una clase de sustancias que se unen muy específicamente a un receptor particular al contrario que las lectinas que pueden unirse a multitud de receptores. Mientras que las lectinas se unen a carbohidratos, no todas las proteínas que se unen a carbohidratos son lectinas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden unirse a epitopos específicos de carbohidratos.

El ligando puede ser un ligando que es nativo para el receptor, por ejemplo, una citoquina que normalmente se une a un receptor de citoquinas, pero también puede ser un compuesto sintético que se designa para una unión específica, incluidos los anticuerpos o sus fragmentos. En términos de su naturaleza química, el ligando puede ser una proteína, un lípido, un azúcar o una molécula pequeña. El ligando puede tener otras propiedades características como comprender una estructura de inmunoglobulina o un fragmento de la misma, actividad como una toxina, enzima u otra actividad biológica.

De este modo, con la excepción de las lectinas, según se señala anteriormente, según se emplean en esta memoria, "receptor" y "ligando" se refieren simplemente a un par de unión afín en el que el receptor se asocia con una membrana y el ligando, típicamente, no.

"Proteína", "péptido" y "polipéptido" se emplean indistintamente, a pesar de la longitud de la secuencia de aminoácidos incluida.

Según se emplea en la presente memoria, el término "microentorno" del receptor se refiere a las moléculas en los alrededores inmediatos del receptor y con las que no está asociado covalentemente. Estas moléculas pueden estar implicadas en la transducción de señales a partir de la interacción del receptor con su ligando, o pueden ser moléculas que se activan o inactivan por interacción con el receptor. Estas moléculas pueden interaccionar de forma constitutiva con el receptor o pueden ser interactivas sólo por su unión a un ligando. Estas moléculas pueden residir en la membrana misma o pueden asociarse con el receptor en el citoplasma. Es la naturaleza de estas moléculas en el microentorno inmediato del receptor la que proporciona importante información en cuanto al papel, mecanismo de acción y/o cinética del receptor en el funcionamiento celular. Esta valoración puede ser crítica en una decisión en cuanto a si la acción del receptor sería agonizada o antagonizada, y en cuanto a si es útil para construir anticuerpos, proteínas, células, fármacos o vacunas que interaccionen específicamente con el receptor o produzcan una respuesta inmune a ello. Además, un entendimiento de las moléculas asociadas con el receptor ayudará en el diseño de ensayos de escrutinio para identificar agentes terapéuticos y profilácticos útiles.

Las membranas empleadas como el material de partida en el invento pueden retener su asociación con sus células de origen o pueden separarse de ellas. Para el uso como materiales de partida en el método del invento, habrá sido innecesario someter a las membranas a cualquier "tratamiento de superficie", como sería, por ejemplo, exponer carbohidratos protegidos o receptores crípticos. El "tratamiento de superficie" significa tratamiento diseñado para exponer partes de los receptores no exhibidos de forma nativa por la membrana. Tales tratamientos de superficie pueden incluir, por ejemplo, tratamiento con neuraminidasa para exponer los residuos de carbohidratos; tal tratamiento sería innecesario dentro del contexto del presente invento dado que las lectinas están excluidas de los ligandos que se unen específicamente a los receptores según se describe anteriormente. Realmente, una de las desventajas de los métodos anteriores de la técnica para recuperar receptores expuestos de membrana es que el tratamiento con detergentes u otros reactivos duros pueda exponer restos crípticos que se unan al ligando usado en el método, creando de ese modo un artefacto no característico de la función nativa del ligando. Por tanto, el "tratamiento de la superficie" se evita para asegurar así que la membrana sólo exhiba las partes de los receptores que se exhiben en el estado nativo de la membrana.

Sin embargo, el "microentorno" puede de hecho estar desprovisto de cualquier sustancia que interaccione. En este caso, el receptor se aislará en ausencia de cualquier material asociado; es decir, el microentorno es un hueco. De este modo, "microentorno" no debería entenderse obligar la presencia de sustancias adicionales cuando el receptor se recupera mediante el método del invento. Donde el "receptor" no está asociado de cualquier modo significativo con otras sustancias, se aislará por sí mismo y esto también proporciona información valiosa.

Típicamente, la membrana con la que el receptor se asocia es una membrana de la superficie celular. Sin embargo, el invento también es aplicable para recuperar receptores que están asociados con otras membranas celulares, como membranas nucleares, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, mitocondrias y otros orgánulos celulares. Al aplicar el método a los receptores intracelulares, se aislan primero los núcleos u otros orgánulos y se someten al método del invento en lugar de las células intactas. Las membranas de la superficie celular también pueden aislarse a partir de las células; sin embargo, en el caso de las membranas de la superficie celular, también pueden emplearse células intactas.

Cualquier tipo de célula o tejido que contiene receptores expuestos puede emplearse en el método del invento. Tales células incluyen, generalmente, células eucariotas, tales como células de levadura, células de hongos en general, células derivadas de invertebrados, y células bacterianas. Sin embargo, las células empleadas en el invento son preferiblemente células nucleadas y pueden incluir cualquier célula que exhibe receptores en su superficie. Preferentemente, tales células son células de vertebrados y, más preferentemente, células de mamíferos.

Se emplea una amplia variedad de tales células, incluyendo, sin limitación, células de tejidos adiposo, areolar, conectivo, elástico, epitelial, neural, mucoso, reticular, etc. Las células pueden ser de los tejidos digestivo, mamario, cardiovascular, cutáneo, endocrino, gastrointestinal, hematopoyético, hepatobiliar, linfoide, linforreticular, muscular, reproductor masculino o femenino, respiratorio, esquelético o del tramo urinario. De este modo, las células pueden comprender células hematopoyéticas, incluyendo linfocitos de varios tipos, células progenitoras, células madre, macrófagos, granulocitos. Las células pueden comprender células endoteliales, células mieloides, células tumorales, células derivadas a partir de varias líneas celulares y células derivadas de un gran número de órganos tales como vejiga urinaria, cerebro, mama, colon, corazón, riñón, hígado, pulmón, médula ósea, ovario, páncreas, próstata, piel, estómago, testículos y similares. También pueden usarse células de tejido altamente específicas, como las derivadas de la retina, córnea o coroides. Las células especializadas del sistema inmune o células asociadas con tumores que contienen antígenos asociados a tumor en sus superficies también pueden emplearse.

Por tanto, los receptores asociados con membranas contenidos en o sobre las células tumorales, tales como aquéllos derivados de células de tumores benignos o malignos de próstata, vejiga, riñón, colon, mama, páncreas, hueso, ovario, pulmón, cerebro o tumores no sólidos tales como linfomas y leucemias están disponibles para recuperación y estudio, de acuerdo con el método del invento. Además, las membranas derivadas de células asociadas con varias enfermedades, incluidas las células infectadas, células que exhiben una respuesta autoinmune o células con otras anomalías, se hacen disponibles para elucidar vías y receptores únicos a estas células.

Una ventaja del invento es que una amplia variedad de tipos celulares pueden valorarse por los tipos de receptores exhibidos y, así, puede elucidarse mejor el papel de estos receptores en la diferenciación y crecimiento celulares. Los métodos del invento también permiten perfilar el patrón de receptores en tipos particulares de células y proporcionan la capacidad de contrastar el perfil de receptores de membrana en células que están asociadas con tejidos particulares o en estadios particulares de diferenciación, envejecimiento o que son consideradas anormales, tales como las células enfermas o las células tumorales. Como un ejemplo de tal aplicación, las lectinas pueden emplearse para perfilar los receptores expresados en un tipo particular de tejido normal y contrastarlo con el perfil de receptores en un tejido tumoral del mismo tipo. Conduciendo, de este modo, a identificar aquellos receptores que se expresan diferencialmente en los tejidos tumorales enfermos.

En una aplicación del invento, un único receptor, junto con su microentorno, se retira de la superficie celular u otra membrana celular de elección. En esta realización, se proporciona primero un soporte sólido al que se une un ligando para el receptor deseado. Si el receptor es conocido, un ligando conveniente es un anticuerpo o fragmento del mismo que es inmunoespecífico para el receptor. Tales anticuerpos pueden prepararse mediante inmunización con el receptor previamente aislado (tal aislamiento previo habrá destruido generalmente el microentorno del receptor) o con células que exponen el receptor empleando técnicas de inmunización convencionales o empleando la tecnología de exposición en fago. Los anticuerpos policlonales que son inmunoespecíficos para el receptor pueden recuperarse entonces a partir de los sueros de un individuo inmunizado o los anticuerpos monoclonales pueden prepararse a partir del sujeto. Los anticuerpos también pueden prepararse de forma recombinante de varias maneras como anticuerpos de cadena única. Fragmentos de los anticuerpos, tales como Fab, Fab' y F(ab')_{2} también pueden usarse. Cualquier parte del anticuerpo que sea inmunoespecífica puede usarse como ligando para recuperar el receptor.

Incluso si el receptor es desconocido, pueden prepararse anticuerpos que dan como resultado el aislamiento del receptor previamente desconocido junto con su microentorno conteniendo cualesquiera componentes que el microentorno pueda incluir. Por ejemplo, las células pueden usarse para inmunizar y los anticuerpos monoclonales prepararse a partir del sujeto de inmunización y producirse mediante la tecnología del hibridoma o empleando técnicas recombinantes convencionales, incluida la exposición en fago. Los anticuerpos monoclonales individuales pueden emplearse entonces como ligandos para recuperar los receptores previamente desconocidos a partir de superficies celulares o de membranas derivadas de estas células.

Además de los anticuerpos, pueden obtenerse aptámeros que se unen específicamente al receptor, empleando procedimientos Selex^{TM}, como se sobrentiende en la técnica. Alternativamente, el ligando puede ser un ligando nativo del receptor o puede ser un ligando recuperado elegido arbitrariamente, por ejemplo, a partir de una librería combinatoria, que incluye librerías que contienen moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos y similares.

El ligando seleccionado en estas circunstancias se acopla a un soporte sólido, de modo que sea recuperable un receptor al que el ligando se acompleje. El soporte sólido puede estar en cualquier forma conveniente, incluidas, por ejemplo, bolas compuestas de poliestireno, látex, sefadex, poliacrilamida y similares. También son utilizables las bolas magnéticas, fibras y otras configuraciones geométricas. Particularmente convenientes son las placas multipoci-
llo.

El ligando se acopla al soporte sólido mediante cualquier medio conveniente en el que la unión es suficientemente ceñida para resistir la disociación por corte. Preferible, pero no necesariamente, el ligando está unido covalentemente al soporte. Dependiendo de la elección del ligando y de la naturaleza química del soporte, se seleccionan técnicas de enlazado para obtener la unión deseada. Tales técnicas de enlazado incluyen, por ejemplo, el acoplamiento a través de CNBr o el acoplamiento a través de enlazadores, tales como los disponibles de Pierce Chemical Co., Rockford, IL. El acoplamiento puede ser a través de enlaces peptídicos, enlaces disulfuro, entrelazado a través de glutaraldehído, unión biotina/avidina y similares. Los enlazadores pueden incluir también medios para disociar el ligando del soporte sólido. Por ejemplo, el enlazador puede incluir una parte fotoescindible o una parte que es escindible por enzimas específicas o en respuesta a un reactivo predeterminado que es inocuo para el ligando o para que el receptor a recuperar. La proteína A puede emplearse también para unir anticuerpos, opcionalmente seguidos por un procedimiento de enlazado adicional. La selección de las técnicas de enlazado será patente para el artesano experto.

El soporte sólido, que ha sido provisto, preferentemente, con el ligando unido covalentemente, se trata entonces con las células, tejidos o membranas que contienen el receptor deseado. La membrana puede estar incluida en una célula o tejido intacto, un núcleo u orgánulo intacto, o puede prepararse como una membrana aislada per se. El soporte sólido de ligando derivatizado se trata entonces con la membrana que contiene el receptor bajo condiciones en las que se forma un complejo entre el receptor y el ligando acoplado. Estas condiciones son típicamente condiciones fisiológicas de pH neutral, temperatura ambiente o ligeramente más alta o más baja, y si se emplean células intactas, preferiblemente, presión osmótica apropiada. El tiempo de contacto varía, pero puede ser tan corto como un minuto o tan largo como varias horas o toda la noche. Después de que haya trascurrido tiempo suficiente para que se forme un complejo entre el ligando y el receptor, el soporte sólido se elimina de la muestra que contiene las membranas y, opcionalmente, se lava para eliminar la membrana, células u orgánulos sin unir. El lavado se hace generalmente bajo temperatura y pH fisiológicos estándares también. El soporte sólido así recuperado contiene el ligando acomplejado con el receptor en el que el receptor permanece embebido en la membrana de la preparación de células, núcleos o membranas intactos.

La etapa siguiente es disociar el complejo receptor/ligando de la membrana en la que reside el receptor. Para llevar a cabo esta etapa, se aplica una fuerza suave, tal como una fuerza de cisión. Esta fuerza puede obtenerse de variedad de formas, incluyendo la agitación vorticial, la extrusión, como un pipeteo vigoroso repetitivo, vibración, sonicación bajo condiciones suaves, agitación o cualquier otro método que impone una fuerza de cisión suave. El esfuerzo cortante es tal que el complejo receptor/ligando permanece intacto, mientras que el receptor, junto con los restos asociados, se elimina suavemente de la membrana en la que ha residido. El receptor, entonces, continúa asociado con las moléculas con las que interacciona in situ. Si se han empleado células o tejidos intactos, las células o tejidos pueden permanecer intactos y viables. El hecho de que no se lisen permite evitar la contaminación con restos desprendidos de las células o tejidos lisados. Esta etapa puede denominarse "desplazamiento".

Después de que el receptor, junto con su microentorno, se ha eliminado de la membrana de este modo, el receptor y sus componentes asociados pueden analizarse e identificarse bien sobre el soporte sólido o después de eliminarlo de ahí. La eliminación del receptor del soporte sólido puede efectuarse, por ejemplo, mediante disociación competitiva del complejo ligando/receptor, por escición del complejo ligando/receptor íntegro del soporte mediante liberación del ligando del soporte o al proporcionar condiciones de disociación por medio de las cuales se disocia el complejo ligando/receptor. Por ejemplo, si el ligando es un anticuerpo, un antígeno que se une al anticuerpo en competición con el receptor puede usarse para sacar el receptor fuera de la unión al soporte sólido. Tal disociación puede también llevarse a cabo al alterar las condiciones, de modo que el ligando no se una más a un receptor, por ejemplo, al alterar el pH. Si el enlace empleado para acoplar el ligando al soporte sólido se ha diseñado incluyendo una parte fotoescincible, el complejo entero puede eliminarse por exposición a la longitud de onda apropiada de luz. Si el enlace del ligando se ha diseñado incluyendo un sitio de corte enzimático, el soporte sólido se trata entonces con la enzima apropiada. Vías alternativas para disociar el complejo ligando/receptor liberando el receptor y su microentorno solo incluirían, además de la unión competitiva, el tratamiento con temperaturas elevadas o con disolventes o condiciones de pH que dan como resultado la disociación. Sin embargo, se prefiere la interacción competitiva dado que los métodos alternativos para disociar el complejo pueden disociar también el receptor de los componentes de su micro-
entorno.

El análisis adicional y la identificación del receptor y de sus componentes asociados se lleva entonces a cabo por medios generalmente conocidos en la técnica. La proteína puede secuenciarse y la proteína, sus modificadores postranscripcionales y los materiales acompañantes del microentorno pueden analizarse por métodos cromatográficos, RMN, espectrometría de masas, espectrometría de infrarrojos y similares. Una diversidad de herramientas analíticas está disponible en la actualidad para caracterizar la proteína en sí misma y su microentorno. Pueden emplearse electroforesis en dos dimensiones, transferencia Western y espectrometría de masas, y medios analíticos que disciernen interacciones proteína-proteína. Véase, por ejemplo, Rudert F, et al. Biotechnol Ann Rev (2000) 5:45-86; Link AJ, et al. Nature Biotechnol (1999) 17:676-682; Neubauer G, et al. Proc Natl Acad Sci USA (1997) 94:385-390.

En líneas generales, una realización ilustrativa del invento como sigue: las bolas se recubren con un anticuerpo específico para un antígeno expresado en la superficie celular. Las bolas recubiertas de anticuerpo se exponen a las células que expresan el antígeno, dando como resultado la formación de complejos entre el anticuerpo y los antígenos de la superficie celular. Las células que están unidas a las bolas se eliminan entonces empleando, por ejemplo, el corte, dejando atrás el anticuerpo acomplejado con el antígeno y sus componentes de membrana asociados, los cuales son entonces desplazados de las células. Típicamente, las células que están separadas del complejo son completamente viables. El antígeno con sus componentes de membrana asociados se eluye entonces del complejo anticuerpo/antígeno y se somete a análisis, por ejemplo, mediante espectrometría de masas para identificar el antígeno y los componentes asociados con él, según se describe anteriormente.

El método del invento puede emplearse para recuperar y analizar ambos receptores cuya presencia ya es conocida en general y para recuperar receptores que anteriormente estaban sin identificar. Para recuperar los receptores sin identificar, el ligando específico puede elegirse arbitrariamente y puede comprender una pluralidad de receptores elegidos arbitrariamente. Por ejemplo, puede ser deseable recuperar cualquier receptor embebido en la membrana que pueda formar complejo con un esteroide particular o con una citoquina particular o con un opioide particular o con un antígeno o anticuerpo particulares.

Alternativamente, puede ser deseable recuperar múltiples receptores de forma no específica. Esto puede llevarse a cabo empleando el método del invento proporcionando la parte del receptor expuesta sobre la membrana con un miembro de un par de unión específica, tal como biotinilando genéricamente las proteínas de la superficie de la membrana y utilizando después avidina como ligando. Los receptores recuperados se separan entonces mediante electroforesis y se analizan como se describe en esta memoria.

El método del invento también puede adaptarse a escrutinio de alto rendimiento para permitir identificar receptores a múltiples ligandos. Por ejemplo, partes separadas de un soporte sólido pueden acoplarse a múltiples ligandos y los múltiples ligandos pueden entonces interaccionar con una muestra de membranas la cual, como previamente, puede comprender células intactas, núcleos intactos, orgánulos intactos o preparaciones de membrana per se. El perfil del receptor de la preparación de membranas puede entonces averiguarse en detalle.

Inicialmente, el conjunto de ligandos unidos por la preparación de membranas puede averiguarse mediante marcaje de las membranas (o células o núcleos) y detección de la presencia de marcaje en un soporte sólido. Esto puede hacerse, por ejemplo, utilizando técnicas fluorescentes, colorimétricas, radiomarcaje u otras técnicas bien conocidas para hacer detectables las membranas o mediante marcaje secundario de las membranas por reacción con un reactivo marcado, tal como un anticuerpo marcado. El método del invento de recuperar el receptor conteniendo su microentorno a partir de las membranas puede emplearse entonces, además, para elucidar no sólo el conjunto de receptores de unión a ligandos, sino también la naturaleza del papel del receptor exhibido en la vida de la célula. Los perfiles característicos pueden obtenerse entonces para una diversidad de células y pueden hacerse distinciones entre varias células diferenciadas, células normales, células enfermas, células tumorales y similares.

Una aplicación particularmente útil del método del invento es recuperar e identificar péptidos asociados con la presentación clase I y clase II de HLA. En esta aplicación, los ligandos afines, como anticuerpos, dirigidos a antígenos codificados por haplotipos específicos de MHC se acoplan a un soporte sólido y se incuban con células presentadoras de antígeno. Como resultado, se forma un complejo entre el antígeno clase I o clase II de MHC que lleva el péptido y el ligando afín. El soporte sólido que contiene el complejo se somete entonces a rotura mecánica para disociar el complejo de las células, dejando atrás el complejo de HLA y el péptido unido en el soporte; entonces, el péptido puede eliminarse convenientemente del complejo y analizarse. Este método también puede aplicarse a, por ejemplo, células tumorales para identificar péptidos presentados en la superficie que entonces pueden emplearse para producir una respuesta de célula T citotóxica al tumor, dado que los antígenos asociados a tumor están limitados por MHC.

Otras aplicaciones incluyen recuperar antígenos específicos a células particulares, tales como el antígeno de células madre de la próstata (PSCA), el antígeno de membrana específico de próstata (PMSA), varios marcadores de linfocitos como CD34, CD8, CD4, CD10 y similares, inmunoglobulinas características de las células B, receptores de retinoides, receptores de opiodes, receptores de factores de crecimiento, canales iónicos, integrinas y similares.

De este modo, el método del invento puede emplearse para identificar componentes celulares asociados con vías de transducción de señales, como los asociados con la activación de EGF del receptor de EGF. Los anticuerpos se emplean para obtener el receptor de EGF junto con su microentorno, y los componentes asociados con el receptor de EGF se analizan para identificarlos y caracterizarlos.

Los siguientes Ejemplos tienen el propósito de ilustrar, pero no de limitar el invento.

Ejemplo 1 Desplazamiento del receptor de EGF (EGFR) mediante el Mab anti-EGFR y la lectina aglutinadora de gérmen de trigo (WGA)

El desplazamiento de EGFR en su configuración nativa directamente a partir de la superficie celular de células tumorales humanas se llevó a cabo empleando bolas acopladas con el Mab anti-EGFR y, como control, con la lectina aglutinadora de gérmen de trigo (WGA). El desplazamiento se llevó a cabo sobre células A431 de carcinoma epidermoide humano, las cuales expresan niveles elevados de EGFR en el orden de 1 x 10^{6} receptores por célula, según se muestra por citometría de flujo (Figura 1) y por estudios previos (Sato, et al., Mol Biol Med (1983) 1:511-529; Gill, et al., J Biol Chem (1984) 259(12):7755-7760).

El desplazamiento específico de EGFR se hizo empleando el Mab 528 anti-EGFR IgG2a\kappa de ratón (Santa Cruz Biotechnology Inc.), que tiene una afinidad de aproximadamente 1 x 10^{-9} por el EGFR exhibido en las células. Para comparación, se empleó también WGA, una lectina que se une a restos de carbohidrato N-acetilglucosamina de las proteínas de la superficie celular, incluido EGFR (Zeng, et al., Mol Cell Biochem (1995) 142(2):117).

Bolas de sefarosa 6MB (Amersham Pharmacia Biotech) activadas con bromuro de cianógeno (CNBr) se acoplaron con el anticuerpo 528 anti-EGFR de ratón (IgG2a\kappa), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aproximadamente, 0,1 gramos de bolas recubiertas de 528 o bolas recubiertas de WGA (Amersham Pharmacia Biotech) se incubaron con 5 x 10^{6} células tumorales A431, con o sin estimulación previa con 1 \mug/ml de EGF durante 5 minutos. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, el exceso de células sin unir se lavó 3 veces con PBS mediante asentamiento de las bolas y desecho de las células en el sobrenadante.

Las células unidas a las bolas se eliminaron pipeteando 5-6 veces con una pipeta pasteur. Se dejaron asentar las bolas y las células desprendidas en el sobrenadante se desecharon. El procedimiento se repitió 4-5 veces. El resto de las células unidas a las bolas se eliminaron mediante agitación vorticial suave. Se mostró que las células eliminadas eran viables. Las bolas se dejaron sedimentar y se desechó el sobrenadante.

Las bolas se visualizaron bajo microscopio de luz para confirmar la eliminación completa de las células, se resuspendieron en el tampón de la muestra (0,06 M de Tris-HCl a pH 6,8, 10% de glicerol, 2% de SDS, 5% de \beta-ME, 0,001% de azul de bromofenol), se hirvieron durante 3 minutos y el sobrenadante se cargó en un gel de poliacrilamida SDS-PAGE. El gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se hibridó.

Las transferencias se tiñeron con anticuerpo anti-EGFR de conejo, seguido por anticuerpo anti-conejo conjugado con HRP y se revelaron empleando el kit de quimioluminiscencia ECL (Amersham Pharmacia) (Figura 2). La proteína EGFR de 170 kDa se detectó fácilmente como una banda nítida en el material desplazado de las células A431 empleando el anti-EGFR. En el material de las bolas recubiertas de WGA, las bandas fueron más difusas, ya que se desplaza más proteína. Estos resultados indicaron el desplazamiento exitoso de EGFR a partir de las células A431 mediante el Mab 528. Como se esperaba, se desplazaron niveles similares de proteínas EGFR a partir de células cultivadas en ausencia o en presencia de EGF.

Ejemplo 2 Desplazamiento de proteínas asociadas a EGFR mediante el Mab anti-EGFR y la lectina WGA

La unión de EGF a su receptor, EGFR, desencadena una cascada de eventos bioquímicos celulares que incluyen la autofosforilación en tirosina del receptor, así como la fosforilación de varias moléculas citoplásmicas (Pandey, et al., PNAS (2000) 97:179-184). La autofosforilación de EGFR conduce a su interacción con proteínas de señalización citoplásmicas que contienen dominios de homología de src (SH2) y dominios de interacción fosfotirosina (PID), tales como las proteínas Grb2 y Shc (O'Bryan, et al., J Biol Chem (1998) 273(32):20431). La asociación de las proteínas Grb2 y Shc con EGFR se demostró mediante análisis de transferencia de energía por resonancia fluorescente (Sorkin, et al., Current Biology (2000) 10:1395), mediante inmunoprecipitacion (Hashimoto, et al., J Biol Chem (1999) 274(29):20139-20143; Kimoto, et al., Genes Cells (2000) 5:749-764) y mediante espectometría de masas (Pandey, et al., PNAS (2000) 97:179-184). La combinación de inmunoprecipitación con espectometría de masas identificó que otra proteína que interacciona con EGFR, Vav-2, se fosforila en tirosina tras estimulación mediada por EGF (Pandey, et al., PNAS (2000) 97:179-184).

Para aislar el EGFR activado y las proteínas asociadas con EGFR en su configuración nativa, se llevó a cabo el desplazamiento sobre células A431 estimuladas con EGF, empleando bolas recubiertas del Mab anti-EGFR, según se describe en el Ejemplo 1. Los productos de desplazamiento se migraron en un gel SDS-PAGE y las membranas se tiñeron con el anticuerpo anti-fosfotirosina de ratón (Santa Cruz Biotechnology Inc.), seguido con anticuerpo anti-ratón conjugado con HRP.

Como se muestra en la Figura 3, el desplazamiento de EGFR mediante el Mab 528 a partir de células A431 activadas con EGF condujo al aislamiento de EGFR altamente fosforilado en tirosina frente a las muestras desplazadas a partir de células sin estimular y al lisado de células A431. La detección de un nivel bajo de fosforilación de EGFR en las células sin estimular está de acuerdo con las publicaciones previas que muestran que el Mab anti-EGFR en sí mismo es capaz de estimular la fosforilación y activación de EGFR (Gill, et al., J Biol Chem (1984) 259:7755-7769). El análisis también detectó otras proteínas fosforiladas en tirosina con pesos moleculares aproximados de 95, 90, 85, 70, 65 y 60 kDa, la mayoría de las cuales (90, 85, 70, 65 y 60 kDa) estaban enriquecidas significativamente en los productos de desplazamiento de las células estimuladas con EGF comparado con las células sin estimular. La mayoría de estas proteínas fosforiladas en tirosina están de acuerdo con las identificadas previamente como asociadas con EGFR mediante los estudios de inmunoprecipitación, incluyendo las proteínas Grb2, Vav-2 y Shc (25, 110 y 46/52/66 kDa, respectivamente). (La banda detectada en el peso molecular de \sim50 kDa corresponde a reactividad cruzada del anticuerpo secundario con la cadena pesada del Mab 528 de ratón (mIgH) desprendida de las
bolas).

La caracterización adicional de las muestras desplazadas se llevó a cabo mediante análisis de transferencia Western, empleando anticuerpos de detección específicos para las proteínas Vav-2 (Figura 4A), Grb2 (Figura 4B) y Shc (Figura 5).

El análisis de transferencia Western de las muestras desplazadas por el Mab 528 empleando el anticuerpo anti-Vav-2 detectó fácilmente la proteína Vav-2 (aproximadamente 110 kDa), lo que indica su asociación con EGFR en ambas células A431, estimuladas y sin estimular (Figura 4A). De forma similar, la proteína Grb2 (25 kDa) se detectó también fácilmente en los materiales desplazados con el Mab anti-EGFR (Figura 4B). A señalar, la banda detectada en el peso molecular de \sim50 kDa corresponde a reactividad cruzada del anticuerpo secundario con la cadena pesada del anticuerpo 528 de ratón (mIgH) desplazado de las bolas.

El aislamiento de las proteínas asociadas a EGFR, Vav-2 y Grb2, tanto en células sin estimular como estimuladas podría explicarse por la observación de que el mismo anti-EGFR es capaz de activar EGFR, lo que puede conducir a interaccionar con Vav-2 en ausencia de estimulación de EGF (Gill, et al., J Biol Chem (1984) 259:7755-7760).

Las proteínas Shc pueden existir en 3 isoformas, P46, P52 y P66. Son proteínas adaptadoras que se demuestra se asocian con EGFR y median aguas abajo la señalización que conduce a la activación de JNK (Hashimoto, et al., J Biol Chem (1999) 274(29):20139-20143). La asociación de las proteínas Shc con EGFR en las muestras desplazadas se examinó empleando anticuerpos anti-Shc (Santa Cruz Biotechnology Inc.). La Figura 5 muestra que el desplazamiento con el Mab 528 dio como resultado el aislamiento de las 3 isoformas de Shc. De modo interesante, las isoformas P46 y P66 de Shc se detectaron en niveles similares en los productos de desplazamiento y en el lisado de células completas. Sin embargo, el producto P52 fue menos abundante en los productos de desplazamiento de las células sin estimular comparado con el lisado de células completas, e incluso menos abundante en las células estimuladas frente a las células sin estimular. Esta observación sugiere la unión diferencial de las proteínas Shc al receptor EGFR tras estimulación de EGF.

En conjunto, estos datos muestran que el desplazamiento empleando un Mab específico del receptor o una lectina (WGA) conduce al aislamiento del receptor junto con sus proteínas de interacción específicas. El desplazamiento específico del ligando de EGFR empleando el Mab 528 conduce al aislamiento específico del receptor EGFR en su configuración nativa, sin emplear detergentes, así como de sus proteínas adaptadoras de interacción.

Ejemplo 3 Desplazamiento de PSCA empleando anticuerpos anti-PSCA y lectina WGA

El antígeno de célula madre prostática (PSCA) (Reiter, et al., PNAS (1998) 95:1735-1740; Wu, et al., Oncogene (2000) 19:1288-1296) es inmunoreactivo con el Mab 1G8 (Reiter, et al., PNAS (1998) 95:1735-1740). El Mab 1G8 se une al receptor de PSCA con una afinidad de aproximadamente 1 x 10^{-9} M, mientras que WGA se une de forma específica a restos de N-acetilglucosamina de PSCA, así como a tales restos en otras moléculas de la superficie celular, como EGFR. Los experimentos se llevaron a cabo empleando la línea celular de tumor de próstata PC3, la cual no expresa el receptor de PSCA, o con PC3 tranfectadas de forma estable con el cDNA que codifica PSCA (PC3-PSCA) (Wu, et al., Oncogene (2000) 19:1288-1296).

La Figura 6 muestra la citometría de flujo de células PC3 y PC3-PSCA sin tratar y de estas células tratadas con anticuerpo o lectina. Se muestra que PSCA se expresa sobre la superficie de las células PC3-PSCA (Figura 6E), pero no sobre las células PC3 (Figura 6B) al teñir con el Mab 1G8. La unión de WGA a PSCA soluble se demostró por ELISA (datos no mostrados) y la unión de ambas células PC3 y PC3-PSCA se demostró por citometría de flujo (Figura 6C y 6F).

El desplazamiento se llevó a cabo sobre PC3, PC3-PSCA o el control negativo de PSCA, las células A431, empleando bien bolas recubiertas de Mab 1G8 o WGA, según se describe en el Ejemplo 1. Los productos de desplazamiento se migraron en un gel SDS-PAGE y las membranas se tiñeron con el anticuerpo 3C5 anti-PSCA de ratón (IgG2ak; Wu, et al., Oncogene (2000) 19:1288-96), seguido de anticuerpo IgG2a anti-ratón conjugado con HRP y, entonces, se reveló empleando el kit de quimioluminiscencia ECL. Según se muestra en la Figura 7A, la proteína PSCA altamente glicosilada, similar a la detectada en los lisados de PC3-PSCA, se detectó sólo en los productos desplazados a partir de PC3-PSCA tanto por el Mab 1G8 como por WGA, pero no a partir de la línea PC3 parental o de las células A431.

El revelado de la transferencia con el anticuerpo anti-EGFR de conejo mostró que el desplazamiento de EGFR se obtuvo solamente de forma incidental empleando las bolas recubiertas de lectina WGA, pero no las recubiertas con anti-PSCA (Figura 7B). El mayor nivel de proteína EGFR desplazada a partir de células A431 comparado con las células PC3 y PC3-PSCA concuerda con los mayores niveles superficiales de EGFR en las células A431 comparado con las células PC3. El desplazamiento de PSCA, pero no de EGFR, empleando el Mab 1G8 anti-PSCA, demuestra especificidad del desplazamiento empleando bolas recubiertas de Mab y ausencia de contaminación no específica de proteínas de membranas adicionales no asociadas con PSCA.

Los resultados del desplazamiento llevado a cabo sobre las células PC3 y PC3-PSCA empleando bolas recubiertas de WGA se muestran en las Figuras 8A y 8B. Las transferencias Western de los productos de desplazamiento se tiñeron bien con Mab 3C5 anti-PSCA de ratón (Figura 8A) o con anticuerpo anti-Gbr2 de conejo (Figura 8B). PSCA se detectó en los productos de desplazamiento de PC3-PSCA, pero no de PC3. El revelado de la transferencia con el anticuerpo anti-Grb2 detectó la proteína citoplásmica Gbr2 en los lisados de ambas células PC3 y PC3-PSCA, pero no en los productos desplazados a partir de las bolas recubiertas de WGA. Esto indica que, a diferencia de EGFR, Gbr2 no se asocia con PSCA, una proteína unida a GPI (Reiter, et al., PNAS (1998) 95:1735-40).

Claims

1. Un método para aislar y caracterizar un receptor unido a membrana junto con su microentorno; tal método comprende

(a): proporcionar un soporte sólido acoplado a un ligando que una específicamente dicho receptor, en el que dicho ligando es un agente de unión afín distinto de lectina;

(b): tratar dicho soporte sólido con una muestra que comprende células nucleadas u orgánulos de las mismas que comprenden dichos receptores unidos a membrana, y tales células u orgánulos no se han tratado en su superficie,

: en el que se forma un complejo entre dicho receptor unido a membrana y el ligando, generando de este modo un complejo ligando/receptor que comprende el receptor y su microentorno, tal complejo está acoplado al soporte sólido a través del ligando;

(c): separar el soporte sólido del resto de la muestra;

(d): someter al soporte sólido separado a una fuerza suficiente para disociar el receptor y su microentorno de la membrana, pero insuficiente para romper el complejo ligando/receptor;

: obteniendo de este modo el soporte sólido acoplado a un complejo ligando/receptor por medio del cual el receptor retiene su microentorno, pero se separa de la membrana;

(e): obtener dicho complejo ligando/receptor aislado al eliminar el complejo ligando/receptor que comprende el receptor y su microentorno del soporte sólido; y, opcionalmente,

(f): analizar el microentorno del receptor.

2. El método de la reivindicación 1 en el que la etapa (f) se lleva a cabo.

3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que, en la etapa (d), las células permanecen intactas.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que las células son células de vertebrados.

5. El método de la reivindicación 4 en el que las células son células tumorales o células enfermas.

6. El método de la reivindicación 4 en el que las células son células hematopoyéticas o células de tejidos adiposo, areolar, conectivo, elástico, epitelial, endotelial, neural, mucoso o reticular.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el ligando es un anticuerpo o una parte inmunoespecífica del mismo.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el receptor comprende un antígeno HLA, o un antígeno asociado a un tumor, o en el que el receptor es un receptor de citoquinas, un receptor de hormonas, un receptor de opioides o un receptor de esteroides.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la fuerza se lleva a cabo a través de extrusión, agitación vorticial o vibración o sonicación.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el soporte sólido comprende bolas.

11. El método de la reivindicación 10 en el que dichas bolas son bolas de poliacrilamida, bolas de poliestireno, bolas de sefadex o bolas de látex.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que el soporte sólido es una placa multipocillo.

13. Un método de la reivindicación 1 en el que el ligando se acopla al soporte sólido a través de un enlazador que contiene una parte fotoescindible y dicha eliminación se efectúa por exposición del enlazador a luz.

14. El método de la reivindicación 1 en el que el ligando se acopla al soporte sólido a través de un enlazador que contiene una parte escindible por una enzima y dicha eliminación se efectúa por exposición de dicho enlazador a dicha enzima.

15. Un método para recuperar múltiples receptores junto con sus microentornos; tal método comprende:

\newpage

(a): proporcionar múltiples partes de soporte sólido cada una acoplada a un ligando diferente, en las que dicho ligando es un agente de unión afín distinto de lectina;

(b): tratar una muestra que comprende células nucleadas que comprenden al menos dos receptores de la superficie celular, en el que dichas células no se tratan en su superficie con dicha multitud de partes de soportes sólidos bajo condiciones en las que los complejos ligando/receptor se forman entre dichos ligandos y los receptores en dichas superficies celulares;

(c): eliminar las partes de soporte sólido de la muestra;

(d): someter las partes de soporte sólido a fuerzas suficientes para eliminar los receptores y sus microentornos de la superficie de dichas células, pero insuficientes para romper los complejos ligando/receptor;

(e): obtener dichos complejos aislados de ligando/receptor por eliminación de los complejos ligando/receptor que comprenden los receptores y sus microentornos del soporte sólido; y

(f): analizar los respectivos microentornos de al menos dos receptores.

16. El método de la reivindicación 15 que incluye además identificar los receptores.

17. El método de la reivindicación 16 que comprende identificar los componentes en dicho microentorno.

18. El método de la reivindicación 16 que incluye además organizar los receptores identificados en un perfil característico de la muestra de membrana.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 en el que cada una de dicha multitud de partes se acopla a un ligando diferente.

20. El método de la reivindicación 19 en el que dichos ligandos son anticuerpos monoclonales.