ES2261921T3 - Procedimiento para determinar la concentracion de particulas de adenovirus. - Google Patents
Procedimiento para determinar la concentracion de particulas de adenovirus.Info
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Abstract
Un procedimiento para calcular el coeficiente de absortividad/extinción (260) para un serotipo de adenovirus, que comprende: a) determinar la concentración de partículas virales de una muestra de una preparación de dicho serotipo de adenovirus; b) tratar una muestra independiente de dicha preparación de virus en condiciones que den como resultado la completa alteración de las partículas virales y la completa alteración de la conformación del ADN del virus; c) determinar la A260 de la muestra de la etapa b); y, d) correlacionar la concentración de partículas virales de la etapa a) con el valor A260 de la etapa c).
Description
Procedimiento para determinar la concentración
de partículas de adenovirus.
La presente invención se refiere a un
procedimiento mejorado para determinar la concentración de
partículas de virus en una preparación de virus. Los procedimientos
descritos en este documento proporcionan un procedimiento sencillo,
preciso y reproducible para determinar la concentración de
partículas virales usando absorbancia a 260 nm. Esta metodología es
especialmente aplicable a la medida espectrofotométrica de la
concentración de partículas de adenovirus. Los procedimientos de la
presente invención aseguran la completa alteración de las partículas
de virus y de la conformación del ADN viral antes de las medidas de
la absorbancia, eliminando por lo tanto errores de medida de la
absorbancia debidos a interferencias por dispersión de la luz y
desplazamiento hipercromático, y de este modo proporcionando un
coeficiente de extinción a 260 nm que está directamente relacionado
con la concentración de proteínas. Esta metodología reduce la
variabilidad entre laboratorios en la determinación de
concentraciones de partículas virales, especialmente concentraciones
de partículas de adenovirus.
La introducción de adenovirus como un vector
para el suministro in vivo de genes transfectados usados en
tratamientos terapéuticos, así como en vacunas, ha dado como
resultado un campo de investigación y desarrollo altamente centrado
que se aplicará en última instancia a muchas enfermedades diana
diferentes. Los estudios clínicos usados para estimar los niveles de
dosificación de partículas de adenovirus transfectadas para una
eficacia apropiada son altamente dependientes de las técnicas que
pueden proporcionar procedimientos precisos y reproducibles para
evaluar la concentración de partículas virales. Varios
procedimientos para determinar la concentración de partículas de
adenovirus usando procedimientos espectroscópicos con diversos tipos
de pre-tratamientos de muestra se han publicado en
la bibliografía (véase, por ejemplo, Lawrence y Ginsberg, 1967,
J. Virol. 1: 851-867; Maizel y col., 1968,
Virology 36: 115-125; Liebermann y Mentel,
1994, J. Virological Methods 50, 281-292;
Huyghe y col., 1995, Human Gene Therapy 6,
1403-1416; Mittereder y col., 1996, J. Virol.
70(11), 7498-7509; Shabram y col., 1997,
Human Gene Therapy 8, 453-465). Maizel y col.
(id) en particular establecieron una correlación entre el contenido
de proteínas de preparaciones de adenovirus y la absorbancia a 260
nm e informaron de una absortividad para preparaciones de adenovirus
purificado de 1,1 x 10^{12} partículas virales por unidad de
absorbancia (UA). Este procedimiento y valor de absortividad se han
citado ampliamente en la bibliografía como base para cuantificar la
concentración de partículas de adenovirus. Sin embargo, aunque la
sencillez de este procedimiento espectroscópico es atractiva, la
aplicación de esta metodología ha dado como resultado una mala
precisión si se compara con la evaluación directa de la
concentración de proteínas, y una variabilidad más alta de lo
esperado dentro del ensayo y entre ensayos mayor de lo que se
esperaría de un procedimiento espectroscópico. Ningún procedimiento,
incluyendo la metodología propuesta por Maizel y col. (id) se ha
aplicado de una manera suficientemente uniforme para proporcionar un
enfoque "universal" para definir la concentración de
adenovirus. Además, muchos de estos procedimientos producen
resultados conflictivos. De hecho, Mittereder y col. (1996, J.
Virol. 70 (11), 7498-7509) exponen en un trabajo
destinado a evaluar la concentración y bioactividad de adenovirus,
que la precisión de la absortividad de las preparaciones de
adenovirus a 260 nm es un área que necesita más investigación. Sería
deseable tener a mano un procedimiento sencillo, preciso y
reproducible para determinar las concentraciones de partículas de
virus, especialmente partículas virales que se utilizan en terapia
génica y/o regímenes de vacunación con genes, tales como un vector
de adenovirus recombinante representativo. La presente invención
trata y satisface estas necesidades describiendo un procedimiento
sencillo, preciso y fácilmente reproducible para determinar la
concentración de partículas virales usando procedimientos
espectroscópicos.
espectroscópicos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento sencillo, preciso y reproducible para determinar la
concentración de partículas virales por espectrofotometría UV,
especialmente para cualquier serotipo de adenovirus. Más
específicamente, se describe un coeficiente absortividad/extinción
preciso en unidades de partículas virales por mililitro por unidad
de absorbancia por centímetro
(pv/ml-UA-cm) para un virus de
muestra, tal como adenovirus, a 260 nanómetros (nm), así como un
procedimiento de absorbancia ultravioleta (UV) para determinar las
concentraciones de partículas de virus en base a este coeficiente
establecido de absortividad/extinción y absorbancias a 260 nm para
preparaciones de virus purificado, tales como preparaciones de
adenovirus. Un virus de muestra preferido es cualquier adenovirus en
el que se conoce un cálculo inicial del peso molecular del ADN,
permitiendo por tanto una serie de cálculos matemáticos sencillos
como se describe en este documento.
Para este fin, la presente invención se refiere
en parte a un procedimiento mejorado para determinar la
concentración de partículas de virus de una preparación de virus a
partir de una medida de absorbancia UV que comprende calcular el
coeficiente de absortividad/extinción (\varepsilon_{260}) para
el serotipo respectivo de la preparación de virus, como se describe
más adelante, medir la A_{260} de una muestra de la preparación de
virus, y determinar la concentración de partículas virales de dicha
muestra viral a partir de las medidas de \varepsilon_{260} y
A_{260}. Como se ha indicado anteriormente, un virus preferido es
cualquier serotipo de adenovirus aunque los serotipos especialmente
preferidos incluyen Ad5, Ad2, Ad24, Ad31, Ad4, Ad12, Ad6, Ad17,
Ad33, Ad42, y Ad16. Debe ser posible poner en práctica esta
metodología mejorada en cualquier muestra de adenovirus en la que se
pueda calcular el peso molecular del genoma del Ad. Por lo tanto,
cualquier Ad del cual se haya sometido previamente a secuenciación
de ADN el genoma es susceptible a la metodología de la presente
invención.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para calcular el coeficiente absortividad/extinción
(\varepsilon_{260}) para un serotipo de virus tal que la
obtención de esta constante permite a futuros procedimientos basados
en UV (tales como los descritos en este documento) determinar la
concentración de partículas para el virus respectivo, siendo dichos
procedimientos sencillos, precisos y reproducibles. El procedimiento
para calcular el (\varepsilon_{260}) para un serotipo de virus
comprende una determinación inicial de la concentración de
partículas virales de una muestra de una preparación del virus de un
serotipo del virus, tratando una muestra independiente de dicha
preparación del virus en condiciones que den como resultado la
completa alteración de las partículas virales y la completa
alteración de la conformación del ADN del virus, determinando la
A_{260} de la muestra independiente y poniendo en correlación la
concentración de partículas virales inicial con el valor de
A_{260}. Se describe en este documento que el cálculo preciso de
\varepsilon_{260} para un serotipo de virus requiere condiciones
de tratamiento que den como resultado la completa alteración de las
partículas de virus y la completa alteración de la conformación del
ADN del virus. Una aplicación preferida de esta metodología
implicaría el cálculo de (\varepsilon_{260}) para cualquier
serotipo de adenovirus aunque siendo especialmente preferida para
serotipos que incluyen Ad5, Ad2, Ad24, Ad31, Ad4, Ad12, Ad6, Ad17,
Ad33, Ad42, y Ad16.
Como se usa en este documento, "Ad" se
refiere a - - adenovirus- -.
Como se usa en este documento, "UV" se
refiere a - - ultravioleta- -.
Como se usa en este documento,
"\varepsilon_{260}" se refiere a - - coeficiente de
absortividad/extinción en unidades de partículas virales por
mililitro por unidad de absorbancia por centímetro
(pv/ml-UA-cm) a 260 nm- -.
Como se usa en este documento, "SDS" se
refiere a - - dodecil sulfato sódico - -.
La Figura 1 muestra datos de diferencia de
absorbancia a 260 nm obtenidos de 26 análisis individuales de un
lote de control de adenovirus presentados como medias en el día para
diversos análisis replicados por día. Las desviaciones típicas en el
día se muestran mediante las barras de error; también se enumeran
las réplicas analizadas por día.
La Figura 2 muestra la representación de
correlación de los datos de concentración de partículas virales para
diez preparaciones de adenovirus diferentes determinados a partir
del análisis de absorbancia UV frente a los del análisis directo de
proteínas. Los datos para la concentración de partículas virales
obtenidos por absorbancia UV se muestran para la aplicación tanto
del valor \varepsilon_{260} obtenido en este documento
(\blacklozenge) como usando el valor \varepsilon_{260}
obtenido por Maizel (\blacksquare).
La presente invención se refiere a un
procedimiento espectroscópico para determinar la concentración de
partículas de virus en una preparación del virus respectivo.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento espectroscópico para determinar la concentración de
partículas de adenovirus en una preparación del adenovirus
respectivo. Lo esencial de la presente invención se centra alrededor
de un procedimiento mejorado para determinar la concentración de
partículas de virus (ejemplificado en este documento con un serotipo
Ad5) en una muestra donde los ácidos nucleicos de la célula huésped
residuales y otros materiales potencialmente contaminantes están en
o por debajo de una concentración que podría influir en la medida de
las partículas de adenovirus en una muestra respectiva. Las
preparaciones de adenovirus ejemplificadas sometidas a esta
metodología mejorada mostraron proporciones de absorbancia
A_{260}/A_{280} que varían de 1,23 a 1,33, mostrando unas
proporciones de ácido nucleico/proteína razonablemente coherentes en
estas preparaciones. Será evidente después de la revisión de esta
memoria descriptiva que una preparación viral que es útil para
poner en práctica la presente invención es una preparación de virus
que se ha purificado de forma razonable de ácidos nucleicos del
huésped y otros contaminantes del huésped de modo que la preparación
del virus respectivo es susceptible a la metodología descrita en
este documento.
Para este fin, la presente invención se refiere
específicamente a un procedimiento de absorbancia ultravioleta (UV)
sencillo, preciso, resistente y reproducible para evaluar la
concentración de partículas de adenovirus que está basado en el
establecimiento de varios requisitos: (1) la evaluación precisa de
la masa viral, tal como por cuantificación directa del contenido de
proteínas del virus; (2) como se ha indicado supra, la prueba
de uniformidad en la composición entre preparaciones a evaluar
teniendo en cuenta los elementos que tienen un impacto significativo
en la medida; y, (3) la seguridad de que el procedimiento analítico
dará como resultado una evaluación igual y coherente de todas las
muestras. Se sabe en la técnica, según lo propuesto por Maizel y
col. (1968, Virology 36: 115-125) que existe
una correlación entre el contenido de proteínas de las preparaciones
de adenovirus y la absorbancia a 260 nm, lo que conduce a un informe
de que la absortividad (valor \varepsilon_{260}) para las
preparaciones de adenovirus purificado es 1,1 x 10^{12} partículas
virales por unidad de absorbancia (UA). Este procedimiento y valor
de absortividad se han citado ampliamente en la bibliografía como
base para cuantificar la concentración de partículas de adenovirus.
Aunque la sencillez de este procedimiento espectroscópico es
atractiva, la aplicación de esta información puede dar como
resultado una mala precisión si se compara con la evaluación directa
de la concentración de proteínas. Investigaciones adicionales
revelaron que el procedimiento de tratamiento de muestra prescrito
usado para preparar las preparaciones de adenovirus para la
evaluación espectroscópica era inadecuado para asegurar la
alteración uniforme de las partículas de virus y el completo
desplegamiento del ADN viral. Esto condujo, a su vez, a
contribuciones variables a las medidas de absorbancia a 260 nm de
(1) los grados variables de hipercromatismo asociados con cantidades
variables de ADN de enrollamiento aleatorio con relación a ADN
helicoidal y (2) un menor grado de luz dispersada causado por
partículas de virus remanentes. La magnitud del efecto
hipercromático, que se muestra como un aumento en la absorbancia a
260 nm, está relacionado con el grado de alteración del ADN (por
ejemplo, véase Tinoco, 1959, J. Amer. Chem. Soc. 82,
4785-4790; Rhodes, 1961, J. Amer. Chem. Soc.
83, 3609-3617; y Painter y Koenig, 1976,
Biopolymers 15, 241-255). Además, puesto que
el factor de Maizel aparentemente se obtiene de un adenovirus que no
está completamente alterado antes de la medida de la absorbancia, y
el período de incubación está definido en términos muy generales (es
decir, durante una noche), es probable que haya dificultades para
conseguir una alteración uniforme del ADN entre experimentos y entre
laboratorios usando los mismos procedimientos. Por tanto, el factor
que Maizel obtuvo de forma empírica, puede no ser aplicable a otros
experimentos en los que el ADN se altera hasta un grado diferente o,
de forma preferible, hasta un grado de alteración completa.
La presente invención abarca avances en dos
áreas relacionadas que dan como resultado la capacidad de incorporar
esta metodología descrita, ahora con la confianza de que la
sencillez iguala tanto la precisión como la reproducibilidad en la
determinación de la concentración de partículas virales.
Concretamente, la presente invención muestra en parte lo siguiente:
(1) la determinación de un coeficiente de absortividad/extinción
preciso para adenovirus a 260 nm para un conjunto dado de
condiciones experimentales en las que el coeficiente de
absortividad/extinción para adenovirus a 260 nm en condiciones de
completa alteración conformacional del ADN se describe en este
documento como de 1,8 x 10^{12}
pv/ml-UA-cm; y, (2) el
establecimiento de condiciones de pre-tratamiento de
la muestra experimental que darán como resultado no sólo la completa
alteración de las partículas virales para evitar interferencias por
dispersión de luz, sino igualmente importante, la completa
alteración de la conformación del ADN para permitir determinaciones
precisas y exactas de las concentraciones de partículas virales de
preparaciones de adenovirus purificado a partir de medidas de
absorbancia a 260 nm, usando el coeficiente de
absortividad/extinción previamente establecido en las mismas
condiciones de pre-tratamiento de muestra indicadas
en (1). Las condiciones de pre-tratamiento
ejemplificadas para el virus Ad5 fueron incubación en dodecil
sulfato sódico (SDS) al 1% a 100ºC durante 4 minutos. El Ejemplo 1
describe la determinación precisa del valor \varepsilon_{260}
obtenido para un adenovirus relacionado con Ad5/Ad2. Será evidente
después de revisar esta memoria descriptiva que pueden utilizarse
por el especialista en la técnica condiciones de
pre-tratamiento alternativas que den como resultado
las alteraciones completas tanto de las partículas virales como de
la conformación del ADN. Dichas alternativas pueden utilizarse para
diversos serotipos de adenovirus así como otros virus, para permitir
tanto el cálculo de (i) un valor \varepsilon_{260} preciso como
(ii) condiciones generales de pre-tratamiento para
medir la concentración de partículas virales.
Como se ha indicado supra, Maizel y col.
(1968, Virology 36: 115-125) demostraron que
la concentración de partículas de adenovirus puede determinarse
midiendo la absorbancia ultravioleta (UV) de adenovirus a 260 nm
usando un coeficiente de absortividad/extinción de adenovirus a 260
nm previamente establecido. La medida de la absorbancia a 260 nm de
la solución de adenovirus requiere un
pre-tratamiento de muestra con dodecil sulfato
sódico (SDS) para alterar las partículas virales para
minimizar/eliminar los efectos de interferencia de dispersión de la
luz de las partículas que conduce a medidas de absorbancia
falsamente elevadas. La determinación del coeficiente de
absortividad/extinción implica la determinación de la concentración
de partículas virales por un procedimiento completamente
independiente, y la correlación de esa concentración con una medida
de absorbancia a 260 nm para la misma solución de adenovirus y la
normalización de la proporción para una unidad de absorbancia (UA)
en una célula óptica de longitud de trayectoria de un centímetro
(cm). Como se ejemplifica en este documento, una etapa inicial
implicó el cálculo de la concentración de partículas de adenovirus
por el procedimiento de Lowry para Proteínas. Además, este
procedimiento independiente para el establecimiento de la
concentración de partículas virales implica determinar la
concentración de proteínas en unidades de masa de proteína por
volumen y convertir la concentración de proteínas en partículas
virales por volumen usando la masa de proteína por virión que se
calcula en base a la información proporcionada por Green y Pina
(id.) (es decir, el peso molecular del ADN de adenovirus es
2,3 x 10^{7} y el hecho de que se considera que el ADN comprende
el 13% de la masa viral en peso seco). El peso molecular del
adenovirus respectivo se conocerá (por ejemplo, para Ad2, véase
Green y Pina; (id.) o calcúlese el PM a partir de la
secuencia de ADN genómico conocida, tal como Nº de Acceso a GenBank
NC001405), donde el peso molecular del ADN viral = 2,3 x 10^{7}
g/mol. Puesto que el ADN es el 13% del peso seco del virión de
adenovirus,
PM \ Total \
del \ Virión = \frac{2.3 \ x \ 10^{7} \ g/mol}{0.13} = 1.77 \ x \
10^{8} \
g/mol
Además, los serotipos de Adenovirus constan sólo
de ADN y proteína, y la proteína comprenderá el 87% del virión:
PM de la
proteína viral = 0,87(1,77 x 10^{8}) = 1,54 x 10^{8}
g/mol
Puesto que la masa de Proteína por partícula
viral = PM de proteína viral dividido por el número de Avogadro:
masa de
proteína/virión = \frac{1.54 \ x \ 10^{8} g/mol}{6.023 \ x \
10^{23} pv/mol} = 2.56 \ x \ 10^{-10} \ \mu g \ de \
prote\text{í}na/pv
La concentración de partículas virales (pv/ml)
de una preparación puede calcularse a partir de la concentración de
proteínas determinada de forma experimental y el factor anterior de
masa de Proteína/pv de la siguiente manera:
Conc.
Partículas Virales (pv/ml) = Conc. Proteína (\mug/ml)/ 2,56 x
10^{-10} (\mug de
proteína/virión)
Posteriormente, se puede calcular el coeficiente
de absortividad/extinción del adenovirus siempre que se determinen
los siguientes parámetros: (1) muestra de adenovirus de
concentración de partículas virales conocida, tal como la
determinada por análisis de Proteínas de Lowry; y (2) medidas de la
Absorbancia a 260 nm de la muestra de Adenovirus en el punto 1 y en
el blanco de matriz, ambos tratados con SDS/diluidos de forma
equivalente.
\varepsilon_{260} =
\frac{C_{L}}{(\Delta
A)_{260}(F)(b)}
donde,
CL es la concentración de partículas
virales en unidades de pv/ml obtenida del análisis de proteínas de
Lowry
\DeltaA_{260} es la diferencia de
absorbancia de la muestra de ensayo menos el blanco de matriz a 260
nm
F es el factor de dilución de muestra usado para
obtener la medida de absorbancia
b es la longitud de trayectoria de la cubeta de
muestra, en este caso, 1cm
Para Adenovirus (tales como serotipo de Grupo C
y cualquier otro con una cantidad similar de pares de bases en el
ADN)
\varepsilon_{260} = \frac{4.9 \ x
\ 10^{11} \ pv/ml}{(0.1352 UA) (2) (1 cm)} = 1.8 \ x \ 10^{12} \
pv/ml - UA-
cm
Finalmente, para calcular la concentración de
partículas virales de absorbancia a 260 nm y \varepsilon_{260},
se requiere lo siguiente: (1) \varepsilon_{260} de Adenovirus
previamente establecido, y (2) medida de la absorbancia a 260 nm de
muestra de ensayo de Adenovirus tratado con SDS y blanco de
matriz
C_{A260}= \Delta A_{260} \ x \ F \
x \ b \ x \
\varepsilon_{260}
donde,
C_{A260} es la concentración de partículas
virales obtenida de la absorbancia a 260 nm
\DeltaA_{260} es la diferencia de
absorbancia de la muestra de ensayo menos el blanco de matriz a 260
nm (es decir, A_{260ensayo} - A_{260blanco})
F es el factor de dilución de muestra usado para
obtener la medida de absorbancia
b es la longitud de trayectoria en cm
\varepsilon_{260} es la absortividad de
adenovirus a 260 nm en unidades de
pv/ml-UA-cm
Un aspecto de la invención es la descripción de
que un pre-tratamiento de muestra con SDS no sólo
altera la cubierta de la partícula viral intacta, sino que también
alterará la conformación del ADN viral, provocando que el ADN
presente un efecto hipercromático (aumento en la absorbancia a
longitudes de onda específicas) después de la alteración de una
conformación alfa-helicoidal en una conformación de
enrollamiento aleatorio. El efecto hipercromático no se consideró en
Maizel y col. (id.). Además, el grado de efecto
hipercromático está relacionado con el grado de alteración del ADN.
Por lo tanto, como se muestra en este documento, las condiciones
experimentales deben definirse de forma crítica teniendo en cuenta
la concentración de SDS (o cualquier otro compuesto alternativo que
de como resultado la completa alteración tanto del virus como del
ADN viral) y el tiempo de incubación antes de la medida de la
absorbancia para obtener grados reproducibles de alteración del ADN
que generarán de este modo medidas de absorbancia coherentes. De
forma ideal, las condiciones que dan como resultado una alteración
completa del ADN deben generar las medidas de absorbancia más
coherentes. La descripción de Maizel y col. (id.) presenta varias
cuestiones, concretamente (i) las condiciones están definidas en
términos muy generales (por ejemplo, "incubación durante una noche
a temperatura ambiente", en lugar de un período de tiempo de
incubación específico y concentraciones contradictorias de SDS del
0,5% frente al 1,0%). El grado de alteración del ADN puede variar
dependiendo de cómo se interpreten estas instrucciones; (ii) se
informó de que SDS al 0,5% con incubación durante una noche no era
suficiente para la alteración completa de las proteínas virales como
se confirmó por estudios de electroforesis en gel de las proteínas;
y (iii) el factor de absortividad se presenta en unidades de
partículas víricas absolutas por unidad de absorbancia: se
pue-
de suponer que este valor está en unidades de pv/ml-UA-cm, lo que puede ser o puede no ser una suposición correcta.
de suponer que este valor está en unidades de pv/ml-UA-cm, lo que puede ser o puede no ser una suposición correcta.
Por tanto, una parte central de la presente
invención es proporcionar un coeficiente de absortividad/extinción
viral a 260 nm preciso generado usando condiciones de
pre-tratamiento de muestra que proporcionan una
alteración completa de la conformación del ADN del virus,
permitiendo de este modo determinaciones precisas y reproducibles de
las concentraciones de partículas de virus en preparaciones de virus
purificado por una técnica sencilla y robusta. Esta metodología se
describe en detalle supra y se ejemplifica en el Ejemplo 1,
que describe un procedimiento coherente y reproducible para
determinar la concentración de partículas de adenovirus. Estos
resultados se basan en análisis espectroscópicos exhaustivos, que
incluyen un procedimiento de preparación de muestra resistente, y
determinaciones rigurosas de la concentración de proteínas. La
aplicación posterior de esta metodología a varias preparaciones de
adenovirus purificado produjo determinaciones espectroscópicas de la
concentración de partículas de virus que están extremadamente bien
correlacionadas con medidas de concentración de proteínas
independientes, confirmando una precisión de ensayo de \pm10% (una
desviación típica relativa, RSD). En su conjunto, el procedimiento
presentado en este documento proporciona un enfoque sencillo,
robusto y resistente para definir la concentración de partículas de
adenovirus que produce un resultado más preciso y exacto que los
procedimientos previamente establecidos.
Los siguientes Ejemplos no limitantes se
presentan para ilustrar mejor la invención.
Materiales y Procedimientos - Las
preparaciones de adenovirus serotipo 5 purificado se proporcionaron
por Merck Research Laboratories, Fermentation and Cell Culture
Department y Vaccine Bioprocess Engineering Department. Sólo se
incluyeron en este estudio preparaciones de adenovirus purificado
con una proporción de absorbancia A_{260}/A_{280} de 1,2 a 1,3.
Los vectores adenovirales tales como los utilizados para
ejemplificar la metodología de la presente invención pueden
construirse usando técnicas conocidas, tales como las revisadas en
Hitt y col. (1997, "Human Adenovirus Vectors for Gene Transfer
into Mammalian Cells" Advances in Pharmacology 40:
137-206). En la construcción de dicho vector
adenoviral, es conveniente a menudo insertarlos en un plásmido o
vector lanzadera. Estas técnicas son conocidas y se describen en
Hitt y col., supra. El vector adenoviral básicamente contiene
secuencias adenovirales (con regiones E1 y E3 no funcionales o
delecionadas) y un cassette de expresión génica (por ejemplo, p55
gag de VIH) flanqueado por sitios de restricción convenientes. La
parte de plásmido del vector lanzadera a menudo contiene un marcador
de resistencia a antibióticos bajo el control transcripcional de un
protómero procariota de modo que la expresión del antibiótico no
sucede en células eucariotas. Pueden usarse genes de resistencia a
ampicilina, genes de resistencia a neomicina y otros marcadores de
resistencia a antibióticos farmacéuticamente aceptables. Para ayudar
en la producción a alto nivel del polinucleótido por fermentación en
organismos procariotas, es ventajoso para el vector lanzadera que
contenga un origen de replicación procariota y sea de alto número de
copias. Varios vectores de clonación procariotas disponibles en el
mercado proporcionan estos beneficios. Es deseable retirar
secuencias de ADN no esenciales. Es también deseable que los
vectores no sean capaces de replicarse en células eucariotas. Esto
minimiza el riesgo de integración de las secuencias de vacuna de
polinucleótidos en el genoma del receptor. Los promotores o
potenciadotes específicos de tejido pueden usarse siempre que sea
deseable limitar la expresión del polinucleótido a un tipo de tejido
particular. Los vectores virales pueden propagarse en diversas
líneas celulares complementarias de E1, incluyendo las líneas
celulares 293 y PER.C6® conocidas. Ambas líneas celulares expresan
el producto del gen E1 adenoviral. PER.C6® se describe en el
documento WO 97/00326 (publicado el 3 de enero, 1997) y en la
Patente de Estados Unidos expedida Nº 6.033.908. Es una línea
celular de retinoblasto humano primario transducido con un segmento
del gen E1 que complementa la producción de adenovirus de
replicación deficiente (FG), pero está diseñado para evitar la
generación de adenovirus de replicación competente por recombinación
homóloga. Se han transformado de forma estable células de particular
interés con un transgén que codifica los genes AD5E1A y E1B, como
PER.C6^{TM}, de 459 pb a 3510 pb ambas inclusive. Se describen
células 293 en Graham y col. (1977, J. Gen. Virol 36:
59-72). Los vectores virales propagados pueden
purificarse a través de cualquier procedimiento conocido en la
técnica que dará como resultado una muestra en la que los ácidos
nucleicos de la célula huésped residuales y otros materiales
potencialmente contaminantes están en o por debajo de una
concentración que influiría en la medida de las partículas de
adenovirus en una muestra respectiva (por ejemplo, véase Huyghe y
col., 1995, Human Gene Therapy 6, 1403-1416;
y Patente de Estados Unidos Nº 6.194.191, expedida para Zhang y col.
el 27 de febrero de 2001).
Concentración de proteínas - Las
concentraciones de proteínas de las muestras de adenovirus se
determinaron por el procedimiento de Lowry (1951, J. Biol.
Chem. 193, 265-275) se calibraron con patrones
de albúmina de suero bovino (BSA) de NIST o Pierce Chemical Company.
Se calculó que el contenido de proteínas por virión era 2,56 x
10^{-10} \mug de proteínas/pv en base al peso molecular del ADN
previamente establecido de 2,3 x 10^{-7} g de ADN/mol de virus
comprendiendo el contenido del ADN viral el 13% del peso seco del
virión para el serotipo 2 de adenovirus (Green y col., 1967,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 57, 1302-1309;
Green y Piña, 1964, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 51,
1251-1259; Green y Piña, 1963, Virology 20,
199-207). La secuencia génica del serotipo 5 de
adenovirus es un 99,4% homóloga con la secuencia génica del serotipo
2 de adenovirus (Green y col., 1979, Virology 93,
481-492), mostrando de este modo la relevancia de
estos cálculos para el ejemplo de Ad5 en este documento. Las
concentraciones de partículas virales se calcularon a partir de
concentraciones de proteínas dividiendo concentraciones de proteína
obtenidas de forma experimental por la constante de 2,56 x
10^{-10} \mug de proteína por virión. Todos los ensayos de
proteínas incluyeron patrones de calibrado de BSA en el intervalo de
2,8 a 20 \mug de BSA y una preparación de referencia de adenovirus
purificado.
Medidas de Absorbancia - Las medidas de
absorbancia de muestras de adenovirus a 260 nm se consiguieron
usando un espectrofotómetro de serie de diodos Beckman ajustado a
absorbancia cero con un fondo de agua. Se usaron cubetas de cuarzo
Sub-micro (Starna Cells) con un volumen de muestra
de 40 \mul y una longitud de trayectoria de 1 cm para las medidas
de absorbancia. Se usó la misma cubeta para medir muestras y
blancos. Las muestras de ensayo se llevaron a dodecil sulfato sódico
(SDS) al 1,0% (p/v), se taparon fuertemente, y se incubaron en un
bloque de calentamiento a 100ºC \pm 1ºC durante 4 minutos. Después
de la incubación, las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y
se mezclaron minuciosamente por un mínimo de cinco ciclos de
inversión y agitación con vórtice antes de las medidas de
absorbancia. Las muestras blanco que contenían la matriz de muestra
de ensayo sin adenovirus se trataron de la misma manera para tener
representar las contribuciones del excipiente y el reactivo a la
absorbancia a 260 nm. Puesto que se observó un lixiviado inesperado
de diferentes especies que absorben UV a partir de tubos de
polipropileno con diferentes grados dependiendo del fabricante del
tubo, se recomienda, y por tanto se prefiere, que las incubaciones
se realicen en tubos de vidrio. Cualquier absorbancia debida al
lixiviado se sustrajo de la muestra de ensayo por la medida del
blanco. Aunque la precisión de la diferencia de absorbancia pareció
no verse afectada por el problema del lixiviado, la exactitud se vio
ligeramente afectada.
Para mantener un nivel aceptable de precisión y
exactitud en el ensayo, sólo se usaron diferencias de absorbancia
entre muestras de ensayo y blancos de matriz de más de 0,05 unidades
de absorbancia (UA). Además, para asegurar que las medidas de
absorbancia eran lineales dentro de los límites de la
instrumentación y de la Ley de Beer, sólo se consideraron aceptables
medidas de absorbancia de menos de 1 UA. Si se observaba un valor de
absorbancia de más de 1 UA para las muestras de ensayo, toda la
medida, incluyendo el pre-tratamiento de la muestra
se repetía usando una dilución apropiada de la muestra de ensayo
original; los blancos de matriz con componentes descritos
anteriormente típicamente tenían valores de absorbancia de menos de
0,1 UA. El registro individual de las medidas de absorbancia de la
muestra de ensayo y el blanco de matriz sirvió para aislar cualquier
variabilidad asociada con la muestra de ensayo de la asociada con la
variabilidad instrumental.
Resultados y Discusión - Ensayo de
Concentración de Proteína - El análisis de la concentración de
proteínas se realizó siete veces durante un período de seis meses
usando una única preparación de referencia (lote A) de adenovirus
purificado. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Las
concentraciones de partículas virales (pv/ml) se calcularon a partir
de las medidas de concentración de proteínas de la siguiente manera:
Peso Molecular (PM) del ADN viral = 2,3 x 10^{7} g/mol de virus
(Green y col., 1967, id.), y el ADN es el 13% del peso
seco del virión (Green y Piña, 1964, id.). Por lo tanto, el
PM de la partícula viral = 1,76 x 10^{8} g/mol de virus y el PM de
las proteínas virales = 1,54 x 10^{8} g/mol; la Masa de proteínas
por partícula viral = PM de la proteína viral/número de Avogadro =
2,56 x 10^{-10} Tg de proteína/partícula viral; la Concentración
de Partículas Virales = Concentración de Proteína/Masa de proteína
por partícula viral. En conjunto, los resultados son muy coherentes,
proporcionando una concentración de partículas virales para este
lote de 4,9 x 10^{11} pv/ml (en base a la concentración de
proteínas) con una RSD del 2,8%.
| Realización de Ensayo | Concentración de Proteínas (\mug/ml) | Concentración de Partículas Virales (x 10^{11} pv/ml) |
| 1 | 124 | 4,8 |
| 2 | 125 | 4,9 |
| 3 | 125 | 4,9 |
| 4 | 127 | 5,0 |
| 5 | 119 | 4,7 |
| 6 | 128 | 5,0 |
| 7 | 130 | 5,1 |
| Media | 125,6 | 4,9 |
| DESV TIP | 3,5 | 0,14 |
| % RSD | 2,8% | 2,8% |
Absorbancia UV. Las once preparaciones de
adenovirus purificado usadas en esta invención mostraron
proporciones de absorbancia A_{260}/A_{280} que variaron de 1,23
a 1,33 (véase Tabla 2), lo que refleja una proporción de ácido
nucleico a proteína razonablemente coherente en estas preparaciones
con ácidos nucleicos de la célula huésped residuales muy por debajo
del nivel que influiría en estos análisis. Por tanto, el uso de la
absortividad a 260 nm de adenovirus generada es relativamente
insensible a la pureza del producto.
\vskip1.000000\baselineskip
| Lote de | Proporción | Concentración de Partículas de | |
| Adenovirus | A_{260}/A_{280} | Virus (x 10^{11} pv/ml) | |
| Ensayo de Proteínas | Ensayo UV Modificado | ||
| A | 1,33 | 4,9 | 4,9 |
| B | 1,27 | 78,1 | 81,7 |
| C | 1,28 | 2,7 | 3,0 |
| D | 1,29 | 3,2 | 3,5 |
| E | 1,23 | 4,5 | 5,3 |
| F | 1,28 | 4,5 | 5,0 |
| G | 1,29 | 6,7 | 7,4 |
| H | 1,28 | 6,5 | 7,2 |
| I | 1,27 | 6,7 | 7,8 |
| J | 1,29 | 4,6 | 4,3 |
| K | 1,26 | 14,3 | 15,2 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de diferencia de absorbancia a 260 nm
entre la muestra de ensayo y el blanco se generaron para la
preparación de control (lote A) de adenovirus purificado para
establecer un valor de absortividad a 260 nm
(\varepsilon_{260}). Las diferencias de absorbancia para esta
única preparación se consiguieron en 26 análisis distintos en nueve
días diferentes a lo largo de un período de siete meses para
proporcionar nuevas percepciones de la variabilidad de ensayo y la
resistencia. Estas medidas de absorbancia se obtuvieron usando una
dilución de dos veces de la muestra de adenovirus purificado con
pre-tratamiento con SDS como se ha descrito
anteriormente. La Figura 1 muestra las nueve medias diarias y
desviaciones típicas diarias para los datos de diferencia de
absorbancia a 260 nm, -A_{260} (es decir,
A_{260-ensayo} menos
A_{260-blanco}) junto con el número de análisis
por día. Los resultados sugieren que se deben ensayar múltiples
preparaciones para obtener un resultado preciso, puesto que se
demostró que los resultados individuales ocasionales diferían hasta
en un 15% de la media global, mientras que, típicamente la media de
tres análisis próximos cualesquiera diferían en aproximadamente el
5%. La similitud global de la variabilidad en el día y entre días
sugiere que la variabilidad ocasionalmente alta observada en dos de
los análisis replicados estaba asociaba probablemente con la
variabilidad en el pipeteado y/o con la evaporación diferencial de
las muestras de pequeño volumen durante el ciclo de
calentamiento/enfriamiento del tratamiento de la muestra. La última
situación puede eliminarse asegurando que los tubos de muestra están
tapados fuertemente durante la incubación de
pre-tratamiento y mezclados minuciosamente por
inversión y agitación con vórtice después de enfriar a temperatura
ambiente, después de la incubación. En cualquier caso, realizando
análisis por triplicado de cualquier muestra dada en el mismo día o
en días diferentes, se esperaría que el resultado medio tuviera una
(RSD) del orden de \pm4%.
La evaluación global de los datos de absorbancia
UV para el lote A proporciona una estimación del valor
\DeltaA_{260} de 0,135 unidades de absorbancia con una RSD del
9,1%. Usando este valor de absorbancia media para el lote A, la
concentración media de partículas virales para el lote A
proporcionada en la Tabla 1, y un factor de dilución de dos, la
absortividad a 260 nm (\varepsilon_{260}) de esta preparación de
adenovirus purificado puede calcularse como 1,8 x 10^{12}
pv/ml-UA-cm. Dado que este valor de
absortividad refleja la variabilidad tanto del ensayo de
concentración de proteínas como del ensayo de absorbancia UV, la
propagación del error da como resultado una precisión final del 9,5%
RSD para la estimación de \varepsilon_{260} de adenovirus. Este
valor de absortividad, basado en siete repeticiones del análisis de
concentración de proteínas y 26 determinaciones independientes del
valor \DeltaA260, proporciona una determinación rigurosa del
\varepsilon_{260} de una preparación de adenovirus purificado.
Por tanto, se puede determinar la concentración de partículas
virales de preparaciones de adenovirus similares usando este valor
\varepsilon_{260} junto con la metodología analítica sencilla,
potente descrita en este informe.
Se analizaron diez preparaciones adicionales de
adenovirus purificado para la absorbancia UV y la concentración de
proteínas usando los mismos procedimientos que los descritos para el
análisis del lote A. La evaluación de diferentes lotes permitió
tanto la aplicación del valor \varepsilon_{260} recién obtenido
para el cálculo de concentraciones de partículas virales, como la
demostración de que la relación entre la concentración de partículas
virales en base a los análisis de absorbancia UV frente a los
análisis de concentración de proteínas no variaba de forma
significativa de lote a lote. Como medida adicional, se calculó la
proporción de absorbancia A_{260}/A_{280} para cada preparación
de virus para evaluar la uniformidad de la pureza relativa de estas
preparaciones. Estos datos se presentan en la Tabla 2.
Las concentraciones de partículas virales
obtenidas exclusivamente a partir de análisis de concentración de
proteínas no incorporan el factor de absortividad y pueden por tanto
considerarse "ortogonales" a la medida espectroscópica. Estos
datos se presentan el la Figura 2 en forma de comparaciones de las
concentraciones de partículas virales obtenidas por absorbancia UV
en relación con las obtenidas de análisis directos de concentración
de proteínas. La correlación entre los dos conjuntos de resultados
es extremadamente buena, proporcionando un valor r^{2} superior a
0,999. Este resultado confirma una proporción de ácido nucleico a
proteína muy uniforme en estas preparaciones de virus.
Adicionalmente, el hecho de que el alcance de la línea de regresión
para el ensayo UV modificado esta muy próximo a 0,1 apoya que el
valor \varepsilon_{260} obtenido en este documento (1,8 x
10^{12} pv/ml-UA-cm) permitirá la
determinación de las concentraciones de partículas virales a partir
de datos de absorbancia UV que están en conformidad bastante precisa
con los obtenidos de estimaciones de la concentración de proteínas
más laboriosas. Además, los resultados de ambos procedimientos
tienen buena correlación con las concentraciones de partículas
virales obtenidas de otro procedimiento "ortogonal", análisis
de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (QPCR), que
cuantifica el contenido de ADN viral de preparaciones de adenovirus
purificado.
Además, la ventaja del procedimiento de
absorbancia UV modificado con absortividad a 260 nm
(\varepsilon_{260}) de adenovirus recién obtenido descrito en
este documento frente al uso del factor de absortividad descrito en
Maizel y col. (1968, Virology 36, 115-125)
llega a ser fácilmente evidente cuando se examina una representación
comparativa similar de la concentración de partículas virales
obtenida de absorbancia UV (en base al factor de Maizel) frente a la
concentración de partículas virales obtenida exclusivamente de la
concentración de proteínas (Figura 2). Como se esperaba, los
resultados usando el factor de Maizel difieren de forma
significativa, con concentraciones de partículas virales que no sólo
son un 40% inferiores a las obtenidas usando el valor
\varepsilon_{260} descrito en este documento, sino que además
muestran una bajada para la correlación de la concentración de
partículas virales (es decir, obtenida de UV frente a obtenida de
proteínas) mucho menor de 1,0. Este último resultado apoya que la
metodología descrita en este documento da como resultado una
evaluación más precisa de la concentración de partículas
virales.
En conjunto, la metodología definida en este
estudio permitió la determinación de un valor de absorbancia a 260
nm para preparaciones de adenovirus purificado que podía usarse
junto con la absortividad a 260 nm de adenovirus recién obtenido
para determinar directamente la concentración de partículas virales
por medio de análisis sencillos, potentes que producen resultados
coherentes con los obtenidos de forma independiente de análisis de
concentración de proteínas por procedimientos clásicos (es decir, el
procedimiento de Lowry). La aplicación de esta metodología y el
valor de absortividad a 260 nm asociado como procedimiento general
para caracterizar preparaciones de adenovirus purificado puede
proporcionar la utilidad general observada durante la pasada década
con el procedimiento de Maizel, pero con resultados más precisos y
resistencia entre laboratorios muy mejorada.
La presente invención no se limita en el alcance
por las realizaciones específicas descritas en este documento. De
hecho, diversas modificaciones de la invención además de las
descritas en este documento se volverán evidentes para los
especialistas en la técnica a partir de la descripción anterior.
Claims (11)
1. Un procedimiento para calcular el coeficiente
de absortividad/extinción (\varepsilon_{260}) para un serotipo
de adenovirus, que comprende:
a) determinar la concentración de partículas
virales de una muestra de una preparación de dicho serotipo de
adenovirus;
b) tratar una muestra independiente de dicha
preparación de virus en condiciones que den como resultado la
completa alteración de las partículas virales y la completa
alteración de la conformación del ADN del virus;
c) determinar la A_{260} de la muestra de la
etapa b); y,
d) correlacionar la concentración de partículas
virales de la etapa a) con el valor A_{260} de la etapa c).
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que las condiciones de tratamiento para la muestra de la etapa b)
comprenden la adición de dodecil sulfato sódico (SDS) a dicha
preparación de virus a una concentración que altera completamente
tanto las partículas de virus como la conformación del ADN del
virus.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que las condiciones de tratamiento para la muestra de la etapa b)
comprenden la adición de al menos dodecil sulfato sódico (SDS)
aproximadamente al 1% seguido por incubación a una temperatura que
de como resultado una completa alteración tanto de las partículas de
virus como de la conformación del ADN del virus.
4. Un procedimiento para calcular del
coeficiente de absortividad/extinción (\varepsilon_{260}) para
un serotipo del virus, que comprende:
a) determinar la concentración de partículas
virales de una muestra de una preparación de virus de dicho serotipo
del virus;
b) tratar una muestra independiente de dicha
preparación de virus en condiciones que den como resultado la
completa alteración de las partículas virales y la completa
alteración de la conformación del ADN del virus;
c) determinar la A_{260} de la muestra de la
etapa b); y,
d) correlacionar la concentración de partículas
virales de la etapa a) con el valor de A_{260} de la etapa c).
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que las condiciones de tratamiento para la muestra de la etapa b)
comprenden la adición de dodecil sulfato sódico (SDS) a dicha
preparación de virus a una concentración que altera completamente
tanto las partículas de virus como la conformación del ADN del
virus.
6. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que las condiciones de tratamiento para la muestra de la etapa b)
comprenden la adición de al menos dodecil sulfato sódico (SDS)
aproximadamente al 1% seguido por incubación a una temperatura que
de como resultado una completa alteración tanto de las partículas de
virus como la conformación del ADN del virus.
7. El procedimiento de la reivindicación 5, en
el que el serotipo del virus es adenovirus 5.
8. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que el serotipo del virus es adenovirus 5.
9. Un procedimiento para determinar de la
concentración de partículas de virus de una preparación de virus a
partir de una medida de absorbancia UV, que comprende:
a) calcular el coeficiente de
absortividad/extinción (\varepsilon_{260}) para el serotipo
respectivo de la preparación de virus mediante el procedimiento de
la reivindicación 1;
b) medir la A_{260} de una muestra de la
preparación de virus; y,
c) determinar la concentración de partículas
virales de dicha muestra viral a partir de las medidas de
\varepsilon_{260} y A_{260} de la etapa a) y la etapa b).
10. El procedimiento de la reivindicación
1, en el que el serotipo del virus es un serotipo de adenovirus.
11. El procedimiento de la reivindicación 1
en el que el serotipo del virus es adenovirus 5.
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