ES2262321T3 - Ratones transgenicos portadores de un gen irak modificado. - Google Patents

Ratones transgenicos portadores de un gen irak modificado.

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Abstract

Un ratón transgénico cuyas células somáti cas y germinales contienen una alteración en un gen de IRAK endógeno, en las que la alteración es producida mediante sustitución dirigida por un gen de IRAK no fun cional, y donde dicha alteración tiene como resultado cé lulas deficientes en IRAK procedentes de dicho ratón que tienen una disminución de la activación de JNK, de la ac tivación de p38 y de la inducción de IL-6 en respuesta a IL-1, en comparación con los ratones IRAK de tipo sal vaje.

Description

Ratones transgénicos portadores de un gen IRAK modificado.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a ratones transgénicos en los que está alterado un gen de la serina/treonina quinasa asociada al receptor de la IL-1 (IRAK), produciendo un ratón que carece de proteína IRAK funcional.
Antecedentes de la invención
La interleuquina-1 (IL-1\alpha e IL-1\beta) desempeña una función importante en la inflamación, actuando localmente y sistémicamente para inducir otras citoquinas proinflamatorias, factores quimiotácticos, moléculas de adhesión, proteínas de fase aguda y fiebre (1). Los animales que carecen de la expresión de IL-1 o del receptor de IL-1 tienen respuestas inflamatorias inducidas (2-5). Las respuestas celulares a la IL-1 están mediadas por una cascada de acontecimientos de generación de señales intracelulares, incluyendo la activación de las MAP quinasas activadas por estrés, de la quinasa de c-Jun N-terminal (JNK) y de p38, así como de los factores de transcripción NF-\kappaB (6). Después de la unión de IL-1, el receptor de IL-1 de tipo I forma un complejo con una proteína accesoria del receptor de IL-1 (IL-1R AcP) (7-9). La serina/treonina quinasa asociada al receptor de IL-1 (IRAK), y un homólogo recientemente identificado IRAK-2, son reclutados rápidamente hacia este complejo del receptor a través de la proteína adaptadora MyD88 (10-13). La IRAK resulta fosforilada e interacciona posteriormente con TRAF6, un miembro de la familia de factores asociados con el receptor del TNF (TRAF) (13,14). El TRAF6 ha sido implicado en la activación de JNK y de NF-\kappaB (14,15). El TRAF6 se asocia con la quinasa inductora de NF-\kappaB (NIK), una proteína relacionada con la MAP 3 quinasa que es esencial para la activación del NF-\kappaB mediada por TNF\alpha e IL-1 pero que no tiene efecto sobre la activación de JNK o p38 (15-17). La NIK interacciona con, y puede activar directamente, las I\kappaB quinasas recientemente identificadas (18-20). Las I\kappaB quinasas son responsables de la activación de NF-\kappaB mediante la fosforilación de sus parejas inhibidoras, las proteínas I\kappaB, dando lugar a su degradación por los proteasomas (21).
IRAK e IRAK-2 son homólogas a Pelle, una proteína quinasa de Drosophila identificada genéticamente como importante para la formación del patrón dorsoventral y para la resistencia a patógenos (22,23). Pelle es esencial para la activación de la Dorsal, una proteína similar a NF-\kappaB que está mediada por Toll, un homólogo del receptor de IL-1 en Drosophila (24). La rápida asociación dependiente de IL-1 de IRAK e IRAK-2 con el complejo del receptor de IL-1 y su homología con Pelle, sugieren que IRAK y/o IRAK-2 pueden cumplir funciones importantes en el inicio de la producción de señales por IL-1. Sin embargo, las funciones de IRAK e IRAK-2 en la activación de las múltiples rutas de señalización de IL-1 corriente abajo no han sido determinadas previamente.
Con el fin de analizar minuciosamente la función de IRAK en las rutas de señalización de IL-1, el gen de IRAK fue alterado mediante recombinación homóloga y se prepararon fibroblastos deficientes en IRAK. Se analizaron la activación inducida por IL-1 de JNK, p38 y del factor de transcripción NF-\kappaB, y la posterior inducción de IL-6, en las células deficientes en IRAK.
Resumen de la invención
Para comprender el papel funcional de IRAK en diferentes tipos celulares, se generaron ratones que no expresaban IRAK funcional mediante recombinación homóloga (RH) en células madre embrionarias (ES) y se describen en la presente. Se describen también en la presente líneas celulares que derivan de estos ratones. Estos ratones, incluyendo las líneas celulares derivadas de los mismos, proporcionan un modelo animal valioso y herramientas valiosas para comprender la función de IRAK y evaluar los efectos terapéuticos de fármacos que modulen la función o la expresión de equivalentes de IRAK en células humanas.
Breve descripción de las figuras
Los Paneles A-D de la Figura 1 muestran la alteración del gen de IRAK de ratón.
(A) Mapa del gen y de la construcción de IRAK de ratón. Se utilizó un fragmento de ADN genómico que contenía la porción 5' del gen de IRAK de ratón como región homóloga para recombinación. El fragmento desde el exón 5 hasta el exón 7 del gen fue sustituido por un casete de un gen de resistencia a neomicina (NEO). Un gen de timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK) fue colocado en 3' de la construcción. Los sitios de restricción son BamHI(B), EcoRI(E) y SpeI(S). (B) Alteración del único alelo de IRAK en células madre embrionarias masculinas. ADNs genómicos de células madre embrionarias con el gen de IRAK de tipo salvaje (+) o alterado (-) fueron digeridos con EcoRI e hibridados con la sonda de ADN mostrada en (A). Se muestran también en (A) la banda de ADN de 12 kb del alelo de tipo salvaje y la banda de 2,6 kb del alelo alterado detectadas en la hibridación. (C) Ausencia de la proteína IRAK en las células deficientes en IRAK. Se prepararon células EF embrionarias primarias según está descrito en Materiales y Métodos. Las proteínas de las células EF control (+) y de las células EF deficientes en IRAK (-) fueron separadas mediante SDS 10%-PAGE y la IRAK fue detectada mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo específico de IRAK. La similar carga de proteínas fue demostrada mediante una transferencia posterior con un anticuerpo hacia ERK-2. (D) Se muestran los patrones de ADN de una Transferencia Southern de ratones de tipo salvaje con IRAK y de ratones "knockout" para IRAK heterozigotos y homozigotos.
Los Paneles A-B de la Figura 2 muestran la activación defectuosa de p38 y JNK inducida por IL-1 en células EF deficientes en IRAK. Células EF deficientes en IRAK (-) o control (+) fueron estimuladas con IL-1\alpha (0,1-10 ng/ml) o con TNF\alpha (100 ng/ml) durante 10 minutos a 37ºC, y se llevaron a cabo ensayos de quinasas en el complejo inmune para determinar la actividad de p38 y JNK-1. (A) Fosforilación de MAPKAPK-2 por p38 inmunoprecipitado y fosforilación de c-Jun por JNK-1 inmunoprecipitada. La Transferencia Western para p38 y JNK-1 fue realizada como control de carga. (B) Cuantificación de la activación de p38 y JNK-1. Los ensayos de las quinasas de p38 y JNK-1 fueron cuantificados mediante PhosphorImager (Molecular Dynamics), normalizados respecto a la cantidad de p38 o JNK-1 detectada mediante Transferencia Western para cada muestra y respecto a la actividad en las células EF deficientes en IRAK no estimuladas para cada ensayo. Los datos de p38 son representativos de tres experimentos y los datos de JNK-1 están expresados como la media de dos experimentos.
Los Paneles A-B de la Figura 3 muestran la activación reducida de la ruta de NF-\kappaB por IL-1 en células deficientes en IRAK. (A) Degradación ineficaz de I\kappaB en células EF deficientes en IRAK. Células control (+) y deficientes en IRAK (-) fueron estimuladas con IL-1 durante 15 minutos a 37ºC. Las proteínas de los lisados celulares fueron separadas en SDS-PAGE y se detectó I\kappaB con un anticuerpo específico para I\kappaB-\alpha. Las similares cantidades de carga de muestra fueron demostradas mediante una transferencia posterior del mismo filtro con un anticuerpo específico para ERK-2. La intensidad de las bandas de proteína fue cuantificada mediante densitometría. La cantidad de I\kappaB en las células estimuladas con IL-1 está expresada como el porcentaje de la misma en células no estimuladas. (B) Activación disminuida de NF-\kappaB por IL-1 en células deficientes en IRAK. Células EF fueron estimuladas con IL-1 o con TNF\alpha durante 30 minutos a 37ºC. Se prepararon extractos nucleares y se determinó la actividad de unión a ADN de NF-\kappaB con el ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética. Los datos son representativos de dos experimentos independientes con resultados similares.
Los Paneles A-B de la Figura 4 muestran la inducción disminuida de IL-6 por IL-1 en células deficientes en IRAK. (A) Inducción disminuida de ARNm de IL-6 en células deficientes en IRAK. Células EF control (+) y deficientes en IRAK (-) fueron tratadas con IL-1 o con TNF\alpha durante 3 horas a 37ºC. La expresión de ARNm de IL-6 en diferentes muestras fue detectada mediante hibridación Northern y cuantificada en un PhosphorImager. (B) Inducción disminuida de IL-6 secretada en células deficientes en IRAK. Células EF (parte superior) y SF (parte inferior) control (+) y deficientes en IRAK (-) fueron estimuladas con IL-1 durante 8 horas a 37ºC. La cantidad de IL-6 secretada en los sobrenadantes del cultivo fue determinada mediante ELISA.
Descripción detallada de la invención
Los ratones con el gen de IRAK alterado ("knockout") que fueron generados en la presente invención proporcionan un modelo en el cual el gen de IRAK fue alterado mediante recombinación homóloga (RH). El proceso de generación de los ratones "knockout" puede ser dividido en 4 etapas básicas:
1.
Clonaje del gen de IRAK y preparación de una construcción de ADN para la transfección de células madre embrionarias (ES);
2.
Aislamiento de las células ES en las que el gen de IRAK ha sido alterado mediante RH;
3.
Generación de ratones quiméricos a partir de embriones de ratón inyectados con las células ES "knockout" y
4.
Cría de los ratones quiméricos para obtener ratones "knockout" mediante transmisión de la línea germinal.
La presente invención utiliza un ADN genómico clonado que codifica la proteína IRAK y describe el clonaje y la caracterización del gen de IRAK de ratón. Se generan ratones transgénicos que tienen alterado el gen de IRAK. Las alteraciones del gen existente de forma natural pueden ser modificaciones, deleciones y sustituciones. Las modificaciones y deleciones convierten al gen existente de forma natural en no funcional, produciendo un ratón "knockout". La sustitución del gen que existe de forma natural por un gen procedente de una segunda especie, tiene como resultado un animal que produce el producto génico de la segunda especie. La sustitución del gen que existe de forma natural por un gen con una mutación, tiene como resultado un ratón que produce el producto génico mutado. Estos ratones transgénicos son críticos para los estudios de antagonistas o agonistas de fármacos, para la creación de modelos animales de enfermedades humanas y para el consiguiente tratamiento de trastornos o enfermedades asociados con las respuestas mediadas por IRAK. Un ratón transgénico portador de un "knockout" de IRAK es útil para el establecimiento de un modelo no humano de enfermedades que impliquen a equivalentes de IRAK en el ser humano.
Se generó un ratón transgénico que llevaba el gen de IRAK alterado mediante recombinación homóloga de una construcción de ADN diana con el gen endógeno en el cromosoma. La construcción de ADN fue preparada a partir de un clon genómico de IRAK que fue aislado de una biblioteca de ADN genómico.
El término "ratón" es utilizado en la presente con el fin de que incluya un ratón individual en todas las etapas de su desarrollo, incluyendo las etapas embrionaria y fetal. Un "ratón transgénico" es cualquier ratón que contenga una o más células portadoras de información genética alterada o recibida, directamente o indirectamente, mediante manipulación genética deliberada a nivel subcelular, tal como mediante recombinación dirigida o microinyección o infección con un virus recombinante. El término "ratón transgénico" no tiene la intención de incluir el cruce clásico o la fertilización in vitro, sino que más bien tiene la intención de incluir ratones en los que una o más células están alteradas por, o han recibido, una molécula de ADN recombinante. Esta molécula de ADN recombinante puede estar dirigida específicamente a un locus genético definido, puede estar integrada aleatoriamente en un cromosoma o puede ser ADN de replicación extracromosómica. El término "ratón transgénico en la línea de células germinales" se refiere a un ratón transgénico en el que la alteración genética o la información genética ha sido introducida en una célula de la línea germinal, confiriendo de este modo la capacidad para transferir la información genética a su descendencia. Si tales descendientes poseen de hecho parte de, o toda, esa alteración o esa información genética, son también ratones transgénicos.
La alteración o la información genética puede ser foránea a la especie del ratón a la que pertenece el receptor, o foránea solamente para el receptor individual particular, o puede ser información genética ya poseída por el receptor. En este último caso, el gen alterado o introducido puede ser expresado de forma diferente a la del gen nativo, o puede no ser expresado en absoluto.
El gen de IRAK alterado, en general, no debería codificar enteramente la misma IRAK que la nativa para el ratón huésped, y su producto de expresión debería estar alterado en mayor o menor grado, o estar totalmente ausente. Sin embargo, es concebible que un gen de IRAK modificado más modestamente esté dentro del ámbito de la presente invención.
Los genes utilizados para alterar un gen diana pueden ser obtenidos mediante una amplia variedad de técnicas que incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de fuentes genómicas, preparación de ADNcs a partir de moldes de ARNm aislados, síntesis directa o una combinación de las mismas.
Un tipo de célula diana para la introducción del transgén es la célula madre embrionaria (ES). Las células ES pueden ser obtenidas a partir de embriones preimplantación cultivados in vitro (M.J. Evans y col., Nature 292: 154-156 (1981); M.O. Bradley y col., Nature 309: 255-258 (1984); Gossler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069 (1986); Robertson y col., Nature 322: 445-448 (1986); S.A. Wood y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4582-4584 (1993)). Los transgenes pueden ser introducidos eficazmente en las células ES mediante técnicas estándar tales como transfección de ADN o mediante transducción mediada por retrovirus. Las células ES transformadas resultantes pueden ser combinadas posteriormente con blastocistos de un ratón.
La células ES introducidas colonizan posteriormente el embrión y contribuyen a la línea germinal del ratón quimérico resultante (R. Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988)).
Como la IRAK es un componente independiente de un mecanismo complejo, las proteínas, incluyendo las codificadas por el ADN de IRAK, deben ser examinadas individualmente y como grupo si quiere comprenderse su contribución a los mecanismos. Un abordaje del problema de la determinación de las contribuciones de los genes individuales y de sus productos de expresión, es utilizar genes aislados para inactivar selectivamente el gen de tipo salvaje nativo en células ES totipotentes (tales como las descritas en la presente) y generar posteriormente ratones transgénicos. La utilización de células ES dirigidas a un gen en la producción de ratones transgénicos dirigidos a un gen fue descrita en 1987 (Thomas y col., Cell 51: 503-512 (1987)) y está revisada en más lugares (Frohman y col., Cell 56: 145-147 (1989); Capecchi, Trends in Genet. 5: 70-76 (1989); Baribault y col., Mol. Biol. Med. 6: 481-492 (1989); Wagner, EMBO J. 9: 3025-3032 (1990); Bradley y col., Bio/Technology 10: 534-539 (1992)).
Existen técnicas disponibles para inactivar o alterar cualquier región genética con el fin de producir cualquier mutación deseada mediante la utilización de recombinación homóloga dirigida para insertar cambios específicos en los genes cromosómicos. Se ha descrito que la recombinación homóloga puede ser detectada a frecuencias entre 10^{-6} y 10^{-3} (Lin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1391-1395 (1985); Smithies y col., Nature 317: 230-234 (1985); Thomas y col., Cell 44: 419-428 (1986); Song y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6820-6824 (1987)). Las interacciones plásmido-cromosoma no homólogas son más frecuentes, teniendo lugar a niveles desde 10^{5} veces (Lin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1391-1395 (1985)) a 10^{2} veces (Thomas y col., Cell 44: 419-428 (1986); Song y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6820-6824 (1987)) mayores que la inserción homóloga comparable.
Con el fin de superar esta baja proporción de recombinación dirigida en células ES murinas, se han desarrollado varias estrategias para detectar o seleccionar recombinantes homólogos poco frecuentes. Un procedimiento para detectar acontecimientos de alteraciones homólogas utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para someter a selección grupos de células transformantes por la inserción homóloga, seguido por la selección de clones individuales (Kim y col., Nucleic Acids Res. 16: 8887-8903 (1988); Kim y col., Gene 103: 227-233 (1991)). Alternativamente, se ha desarrollado un procedimiento de selección genética positiva en el que se construye un gen marcador que será activo únicamente si tiene lugar la inserción homóloga, permitiendo que estos recombinantes sean seleccionados directamente (Sedivy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 227-231 (1989)). Uno de los procedimientos más potentes desarrollados para seleccionar recombinantes homólogos es el método de selección positiva-negativa (PNS) desarrollado para genes (tales como IRAK) para los que no existe una selección directa de la alteración (Mansour y col., Nature 336: 348-352 (1988); Capecchi, Science 244: 1288-1292 (1989); Capecchi, Trends in Genet. 5: 70-76 (1989)). El método PNS es más eficaz para dirigir genes que no expresan a niveles elevados debido a que el gen marcador tiene su propio promotor. Los recombinantes no homólogos son seleccionados mediante la utilización del gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK) que flanquea la construcción de ADN. Las células con una inserción no homóloga de la construcción expresan la timidina quinasa del HSV y por tanto son sensibles a los fármacos contra el herpes tales como ganciclovir (GANC) o FIAU (1-(2-desoxi 2-fluoro-B-D-arabinofluranosil)-5-yodouracilo). Mediante esta contraselección, puede incrementarse el número de recombinantes homólogos en los transformantes supervivientes.
Según se utiliza en la presente, un "gen dirigido" o "knockout" es una secuencia de ADN introducida en la línea germinal de un ratón mediante intervención humana, incluyendo, pero sin limitarse a, los métodos descritos en la presente. Los genes dirigidos de la invención incluyen secuencias de ADN que están diseñadas para alterar específicamente genes endógenos cognados.
Todas las aplicaciones anteriores han de ser verificadas en ensayos con animales y finalmente en ensayos clínicos. Un procedimiento para determinar el papel funcional de la diana del fármaco es estudiar los defectos resultantes del gen alterado en un ratón completo. Los ratones "knockout" para IRAK que han sido generados y que se describen en la presente permitirán la definición de la función de IRAK que es crítica para decidir los tipos de moduladores que son más adecuados para terapia.
Cualquier función de IRAK que se detecte en los ratones "knockout" de la presente invención proporcionaría pruebas de la existencia de nuevos subtipos de IRAK alternativos que podrían ser aislados posteriormente de los ratones "knockout" de la presente invención.
La ausencia de IRAK funcional en los ratones "knockout" de la presente invención se confirma, por ejemplo, en análisis del ARN, en la detección de la expresión de la proteína, en ensayos de unión a receptores, en ensayos de actividad enzimática y en otros estudios funcionales de IRAK. Para el análisis de ARN, se preparan muestras de ARN de diferentes órganos de los ratones "knockout" y de detectan los transcritos de IRAK en Transferencias Northern utilizando sondas oligonucleotídicas específicas para el transcrito.
Se producen polisueros y anticuerpos monoclonales que son específicos para la IRAK de ratón. Se estudia la ausencia de IRAK intacta en los ratones "knockout" en, por ejemplo, análisis mediante citometría de flujo, en ensayos de tinción inmunohistoquímica y en ensayos de unión a receptores y/o de actividad enzimática utilizando anticuerpos específicos para IRAK. Alternativamente, se llevan a cabo ensayos funcionales utilizando preparaciones de diferentes tipos celulares recogidos de los ratones "knockout".
La IL-1 es una citoquina proinflamatoria con efectos pleiotrópicos en la inflamación. La unión de IL-1 a su receptor desencadena una cascada de acontecimientos de señalización, incluyendo la activación de las MAP quinasas activadas por estrés, de la quinasa N-terminal de c-Jun (JNK) y la MAP quinasa de p38, así como del factor de transcripción NF-\kappaB. La generación de señales por IL-1 tiene como resultado respuestas celulares a través de la inducción de productos génicos inflamatorios tales como IL-6. Uno de los acontecimientos más tempranos en la producción de señales por IL-1 es la rápida interacción de las quinasas asociadas al receptor de IL-1, IRAK e IRAK-2, con el complejo del receptor. Las funciones relativas de IRAK e IRAK-2 en las rutas de señalización de IL-1 y en las respuestas celulares posteriores no han sido determinadas previamente. Con el fin de evaluar la importancia de IRAK en la producción de señales por IL-1, se prepararon y estudiaron células fibroblastos de ratón deficientes en IRAK.
La presente invención demuestra que la IRAK desempeña una función importante en la activación de múltiples rutas de señalización de IL-1 que dan lugar a la inducción de productos génicos sensibles a IL-1 tales como IL-6. En ausencia de IRAK, la inducción de las actividades JNK y p38 estaba reducida significativamente a todas las concentraciones de IL-1 ensayadas, aunque no se eliminó completamente. La presente invención demuestra que se requiere IRAK para la inducción óptima de las JNK y p38 quinasas y que la pérdida de su función no puede ser compensada completamente por IRAK-2 o por otras quinasas relacionadas. Se ha descrito que la activación de JNK y p38 está mediada por cascadas de quinasas corriente arriba incluyendo las MAP 2-, MAP 3- y MAP 4-quinasas (29). Falta por determinar a qué niveles dentro de estas cascadas puede actuar IRAK para inducir la actividad JNK y p38.
En contraste con los efectos sobre JNK y p38, los defectos en la activación de NF-\kappaB en células deficientes en IRAK pudieron ser solventados por concentraciones elevadas de IL-1. Quinasas relacionadas tales como IRAK-2 pueden ser capaces de activar totalmente la ruta de NF-\kappaB bajo estas condiciones. Sin embargo, la inducción de una respuesta celular a IL-1, tal como la producción de IL-6, está enormemente reducida en las células deficientes en IRAK incluso a concentraciones elevadas de IL-1. Esto sugiere que la activación del NF-\kappaB solo no es suficiente para una inducción óptima de las respuestas celulares mediadas por IL-1. La inducción de IL-6 y de otros productos génicos sensibles a IL-1 puede estar mediada sinérgicamente por múltiples rutas, incluyendo la activación de NF-\kappaB dependiente de IKK/IKB, y las rutas mediadas por JNK/p38. En el caso de la secreción de IL-6, la dramática disminución de su inducción por IL-1 en células deficientes en IRAK, incluso en presencia de activación total de la actividad de unión al ADN de NF-\kappaB, puede ser el resultado de la activación disminuida de las rutas de señalización dependientes de JNK y p38. Esta posibilidad está apoyada por un informe reciente que describe que la p38 quinasa y otras MAP quinasas están implicadas en la expresión del gen de IL-6 inducida por TNF a través de la modulación del potencial de transactivación de NF-\kappaB sin afectar a su actividad de unión al ADN (37).
La observación descrita en la presente de la reducción significativa de múltiples rutas de señalización y de la producción de IL-6 inducida por IL-1 en células deficientes en IRAK, sugiere que moduladores de IRAK o de quinasas relacionadas con IRAK pueden ser terapéuticamente útiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias mediadas por IL-1.
Los ratones modificados genéticamente de la presente invención muestran que la activación mediada por IL-1 de JNK, p38 y NF-\kappaB estaba reducida en fibroblastos embrionarios deficientes en expresión de IRAK. Además, la producción de IL-6 en respuesta a IL-1 estaba también dramáticamente reducida en fibroblastos embrionarios deficientes en IRAK y en fibroblastos de piel preparados a partir de ratones deficientes en IRAK. Estos resultados demuestran que la IRAK desempeña una función proximal esencial en la coordinación de múltiples rutas de señalización de IL-1 para la inducción óptima de respuestas celulares.
Los Ejemplos siguientes se presentan con el fin de ilustrar la presente invención y no deben ser considerados como una limitación del ámbito de esta invención.
Ejemplo 1 Vectorización de Genes
La construcción "knockout" estaba compuesta por 4 partes dispuestas en orden 5' a 3': (1) Un fragmento de ADN BamHI-SpeI de 4,5 kb procedente de un clon genómico de ratón 129/Ola que cubría los exones 1-4 y la región promotora 5' del gen de IRAK utilizada como la región homóloga larga para la recombinación. (2) Un casete de ADN de 1,2 kb que contenía un gen de resistencia a neomicina con su propio promotor y una señal de poliadenilación. (3) Un fragmento de ADN de 1 kb obtenido mediante PCR utilizando un oligonucleótido específico del exón 7 (5'-CTGATCTGGCACCTTTATTGGCA-3') [SEC ID Nº: 1] y un oligonucleótido específico del exón 8 (5'-CCAGAA
GAATGTCCAGTCGTTGA-3') [SEC ID Nº: 2] utilizado como región homóloga corta para la recombinación. (4) Un casete de ADN de la HSV-timidina quinasa con su propio promotor y su propia señal de poliadenilación. El gen de IRAK, el gen de resistencia a neomicina y el gen de la timidina quinasa estaban en la misma orientación de transcripción.
En esta construcción "knockout", el gen de IRAK de ratón estaba alterado por la eliminación de los exones 5, 6 y la mayor parte del exón 7 del gen que codifica la porción N-terminal del dominio quinasa, subdominios I a V, incluyendo aminoácidos conservados implicados en la unión del ATP.
Transfección de células ES con la construcción de ADN de IRAK
Células madre embrionarias (ES) E14 (Hooper y col., 1987, HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature 326: 292-295) fueron mantenidas en estado indiferenciado mediante cocultivo con fibroblastos embrionarios (EF) y en medio de cultivo DMEM (FCS 15%, piruvato de sodio 1 mM, b-mercaptoetanol 0,1 mM, L-glutamina 2 mM, 100 U de penicilina y 100 U de estreptomicina) que contenía 1000 U/ml del factor inhibidor de leucemia (LIF) (Gibco). Las células EF eran cultivos primarios de fibroblastos preparados a partir de fetos de ratón del día 15-17 según el método descrito por Robertson (Robertson, E.J. (1987) Embryo-derived Stem Cell Lines. En: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. E.J. Robertson, ed. (Oxford, Washington DC: IRL Press), p. 71-112). Los EF fueron tratados con 10 mg/ml de mitomicina C (Sigma) en medio de cultivo durante 2 horas para detener la división celular antes de su utilización como células alimentadoras.
Para la transfección del ADN, la construcción de ADN fue linealizada mediante digestión con NotI. El ADN fue precipitado posteriormente mediante 2 volúmenes de etanol enfriado en hielo a -20ºC durante 1 hora. El ADN precipitado fue aglutinado por centrifugación, lavado una vez con 0,5 ml de etanol 70%, secado al aire y disuelto posteriormente a 1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (Gibco). Las células ES fueron recogidas mediante tratamiento con tripsina y resuspendidas a 6,25 x 10^{6} células/ml en medio de cultivo. La construcción de ADN (20 \mug) fue añadida a 0,8 ml de la suspensión de células ES para electroporación a 250 \muF y 340 Voltios utilizando el Gene Pulser (BioRad).
Las células ES transfectadas fueron sembradas en placas de 90 mm revestidas con EF a 2,5 x 10^{6}/placa en medio de cultivo. Dos días después, las células fueron sometidas a selección con fármacos en medio que contenía 400 \mug/ml de G418 (Geneticina, Gibco) y GANC 2 \muM (Citosina, Syntex). El medio de cultivo fue cambiado diariamente. Una muerte celular masiva que comenzó el día 4 fue obvia y la mayoría de las células muertas fueron eliminadas mediante el cambio diario del medio. Las colonias de células supervivientes eran observables bajo el microscopio hacia el día 7, y hacia el día 10 eran visibles en las placas sin necesidad de microscopio.
Selección por recombinación homóloga de las células ES transfectadas mediante PCR
El tamaño de las colonias de ES el día 11 después de la transfección era suficientemente grande para selección por PCR. Para recoger las colonias celulares, el medio de cultivo de las placas de 90 mm fue aspirado y se añadieron 10 ml de PBS. Las colonias celulares individuales fueron localizadas con la ayuda de un estereomicroscopio, recogidas en un volumen de 20 ml con una "Autopipetteman" y transferidas a placas de 96 pocillos. Para preparar una suspensión de células individuales de las colonias de ES, se añadieron 25 \mul por pocillo de tripsina (Gibco) al 0,25% a las placas de 96 pocillos. Después de 8 minutos de tratamiento con tripsina a 37ºC, se añadieron 25 \mul de medio de cultivo. Todas las colonias de ES fueron mantenidas todavía en cultivo como placas maestras mientras se realizaba el proceso de selección mediante PCR por acontecimientos de recombinación homóloga. Para preparar las placas maestras, 60 \mul de cada muestra celular fueron transferidos a placas de 96 pocillos que habían sido revestidas con células EF y contenían 180 \mul/pocillo del medio de cultivo conteniendo G418 y GANC.
Para la primera ronda de selección por PCR, cada muestra de lisado celular fue preparada a partir de 12 colonias celulares que estaban dispuestas como una fila de muestras en las placas de 96 pocillos. Después de la preparación de las placas maestras, las muestras de células restantes de aproximadamente 90 \mul/pocillo en cada fila de las placas, fueron agrupadas. Las células fueron aglutinadas en tubos mediante centrifugación durante 1 minuto. Después de eliminar todo el medio, las células fueron lisadas por la adición de 30 \mul de agua destilada y una breve agitación en vórtex. Los lisados celulares fueron preparados calentando primeramente a 95ºC durante 10 minutos y enfriando hasta temperatura ambiente, seguido por la adición de 1 \mul de proteinasa K (10 mg/ml en agua) con una breve agitación en vórtex, una incubación de 90 minutos a 50ºC para la digestión con la proteinasa K y posteriormente 10 minutos a 95ºC para la inactivación por calor de la proteinasa K.
La PCR se llevó a cabo utilizando el sistema 9600 GeneAmp (Perkin Elmer). Las mezclas de reacción contenían 5 \mul de lisado celular, 4 \muM de cada uno de los dos cebadores oligonucleotídicos, 200 \muM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP, y 5 U de ADN polimerasa AmpliTaq en tampón de PCR (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM y un 0,001% de gelatina p/v). Las condiciones de la reacción fueron 3 ciclos de 2 minutos a 94ºC, 2 minutos a 60ºC y 2 minutos a 72ºC, posteriormente 40 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 15 segundos a 60ºC y 1 minuto a 72ºC, seguido por 7 minutos a 72ºC.
Las células ES con el gen vectorizado fueron detectadas mediante reacción en cadena de la polimerasa utilizando un oligonucleótido específico del gen resistente a neomicina (5'-AACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTG-3') [SEC ID Nº: 3] y un oligonucleótido específico del intrón 8 de IRAK (5'-TCCTCACCTCTTGATGTCTCCAT-3') [SEC ID Nº: 4] y se esperaba que el tamaño del ADN amplificado fuera de 1 kb aproximadamente. Para detectar el fragmento de ADN específico amplificado por PCR, 20 \mul de las muestras de PCR fueron separados según su tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, transferidos a membranas de nailon Hybond-N+ (Amersham) e hibridados con la sonda oligonucleotídica específica del gen de IRAK marcada con ^{32}P (5'-GGATAAGGCTGGGGCTATCCTGATG
TAAAAACTGA-3') [SEC ID Nº: 5]. Las muestras de PCR con una banda de ADN de 1 kb detectadas por la sonda oligonucleotídica fueron consideradas como supuestos grupos positivos para una selección posterior.
Las células ES de las placas maestras estaban listas para ser divididas después de 3-4 días en cultivo. Las colonias celulares de los grupos positivos fueron sometidas a selección individualmente mediante una segunda ronda de PCR con el fin de identificar las colonias individuales positivas. Para mantener los grupos positivos en cultivo, las células de los pocillos fueron tripsinizadas, retirando primeramente el medio de cultivo, lavando una vez con 50 \mul de PBS, tratando con 40 \mul de tripsina al 0,25% durante 5 minutos a 37ºC, seguido por la adición de 90 \mul de medio de cultivo. Las células fueron posteriormente resuspendidas y 20 \mul de las muestras de células fueron transferidos a las placas maestras que habían sido revestidas con EF y llenadas con 200 \mul de medio de cultivo conteniendo G418 y GANC. Las células restantes (110 \mul/pocillo) fueron transferidas a tubos Eppendorf. Se prepararon lisados celulares y las señales de recombinación homóloga fueron amplificadas por PCR y detectadas mediante hibridación, según se describió en los párrafos anteriores.
Confirmación de la recombinación homóloga mediante hibridación Southern genómica
La recombinación homóloga fue confirmada mediante hibridación Southern. Las células ES derivadas de las colonias positivas en la selección por PCR fueron expandidas en cultivo y se extrajo el ADN según está descrito por Maniatis y col. (Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 280-281). Muestras de ADN genómico de las supuestas líneas celulares "knockout" fueron digeridas con el enzima de restricción EcoRI, separadas mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, transferidas a membranas de nailon Hybond-N+ (Amersham) e hibridadas con un fragmento de ADN de \sim440 pb específico para el gen de IRAK de ratón. Este fragmento sonda de ADN fue obtenido mediante PCR utilizando un oligonucleótido específico del intrón 8 (5'-ATGGAGACATCAAGAGGTGAGGAG-3') [SEC ID Nº: 6] y un oligonucleótido específico del exón 9 (5'-CTCATCCAGAAGCACGTTAG-3') [SEC ID Nº: 7]. Esta sonda de ADN no hibridaba con las construcciones de ADN que estaban integradas aleatoriamente en el cromosoma.
Según se esperaba a partir del mapa de restricción del gen de IRAK de ratón, el gen funcional en las células ES parentales fue identificado como una banda de -12 kb y el gen alterado en las células ES "knockout" como una banda de 2,6 kb resultante de un sitio de EcoRI adicional en el gen de resistencia a neomicina (Figura 1A). Se encontró que el gen de IRAK estaba localizado en el cromosoma X mediante análisis FISH. Las células ES E14 eran células diploides derivadas de un embrión masculino y por tanto llevaban solamente una copia del gen de IRAK. En las células ES parentales se detectó únicamente IRAK funcional y en las células ES "knockout" se encontró solamente el gen de IRAK alterado (Figura 1B).
Generación de ratones quiméricos mediante inyección de embriones
Embriones de ratón en la etapa de gestación de 3,5 días fueron recogidos de los úteros de ratones C57BL/6J superovulados. Alrededor de 10-15 células ES fueron inyectadas en la cavidad del blastocele de los embriones. Los embriones inyectados fueron transferidos a los úteros de ratones CD1 pseudopreñados a los 2,5 días de gestación. Los ratones desarrollados a partir de estos embriones nacieron 17 días más tarde. Como las células ES utilizadas derivaban de la cepa de ratones 129 Ola con los genes del color del pelo agouti dominantes, los ratones quiméricos fueron identificados por el color aguoti del pelo procedente de las células derivadas de ES, frente al color negro de los embriones de los ratones C57BL/6J.
Ratones con la línea germinal ES obtenidos mediante la cría de los ratones quiméricos
Los ratones quiméricos fueron cruzados con ratones C57BL/6J. Estos cruces se realizan con el fin de analizar la transmisión en la línea germinal de las células ES. Se espera que algunos ratones de la progenie del cruce sean de color agouti si el macho quimérico tuviera células de la línea germinal derivadas de células ES que lleven los genes dominantes del color del pelo agouti. El gen de IRAK alterado en los ratones fue detectado mediante hibridación genómica según se describió en la sección previa. El ADN genómico es purificado a partir de 1 cm de cola aproximadamente de cada ratón agouti después del destete. El ADN genómico es aislado según está descrito (Laird y col., supra), seguido por extracciones con fenol y fenol:cloroformo y precipitación con etanol. Los ADNs genómicos son digeridos con EcoRI e hibridados con el ADN flanqueante 3' específico para el gen de IRAK según se describió anteriormente. Como el gen de IRAK está ligado al cromosoma X, todos los ratones agouti de la línea germinal femenina son heterozigotos para el gen de IRAK alterado.
Generación de ratones "knockout" homozigotos a partir del cruce de ratones "knockout" heterozigotos
Ratones "knockout" heterozigotos hembra fueron apareados con ratones C57BL/6J o con machos de la misma camada de tipo salvaje. Se esperaba que la mitad de las crías macho llevaran únicamente el gen alterado y la mitad de las crías hembra fueran heterozigotas para el gen alterado. La descendencia superviviente fue genotipada mediante hibridación Southern según se describió anteriormente. Se obtuvieron ratones homozigotos hembra mediante el cruce posterior de hembras heterozigotas con machos "knockout". Los patrones de ADN de los ratones de tipo salvaje, heterozigotos y "knockout" están mostrados en la Figura 1D.
Ejemplo 2 Caracterización de los Ratones "Knockout" para IRAK y de las Células Derivadas de los Ratones
Preparación de anticuerpos hacia IRAK. Se produjo un antisuero policlonal de conejo hacia IRAK contra un péptido (Bio-Synthesis, Inc., Lewisville, TX) correspondiente a los aminoácidos C-terminales (657-677) de la proteína IRAK de ratón (25).
Preparación de fibroblastos embrionarios (EF) y de fibroblastos cutáneos (SF). Para preparar fibroblastos embrionarios, células madre embrionarias con el gen de IRAK alterado fueron inyectadas en blastocistos de C57BL/6J y transferidas a ratones pseudopreñados. Se recogieron embriones en el día 15 de gestación. Se prepararon suspensiones celulares de fibroblastos mediante tratamiento con tripsina de los tejidos embrionarios desmenuzados. Los fibroblastos derivados de las células madre embrionarias fueron enriquecidos mediante el cultivo en DMEM con un 10% de suero de ternera fetal y 1 mg/ml de G418. Los fibroblastos fueron utilizados en los estudios después de 3-4 semanas de cultivo con G418. Las células EF control con el gen de IRAK de tipo salvaje fueron preparadas a partir de embriones de ratones deficientes en CD8 (26). Para preparar los fibroblastos cutáneos, la piel del cuerpo del ratón fue afeitada, cortada en pequeños trozos y sometida posteriormente a tratamiento con tripsina. Los fibroblastos cutáneos en suspensiones celulares fueron cultivados en DMEM con un 10% de suero de ternera fetal.
Estimulación celular. Células control y células deficientes en IRAK (9 x 10^{5}/placa) fueron sembradas durante una noche en placas de cultivo celular de 100 mm con DMEM conteniendo un 5% de suero de ternera fetal. Las células EF fueron mantenidas en presencia de 200 \mug/ml de G418. Antes de cada experimento, las células fueron privadas de alimento en DMEM sin suero durante 4 horas. Las células fueron luego estimuladas con IL-1\beta (R & D Systems, Minneapolis, MN) o con TNF\alpha (Genzyme, Cambridge, MA) a 37ºC. Después de la estimulación, las células fueron extraídas de las placas mediante raspado en PBS enfriado en hielo y utilizadas inmediatamente.
Ensayo de quinasa in vitro . Después de la estimulación, las células fueron lisadas en tampón de lisis NP40 (HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet P40 1%, Na_{3}VO_{4} 1 mM) que contenía un cóctel completo de inhibidores de proteasas sin EDTA (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN), centrifugadas a 16.000xg durante 10 minutos y preaclaradas dos veces con 50 1 de suspensión de GammaBind G Sepharose (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Las MAP quinasas fueron inmunoprecipitadas con 50 1 de la suspensión de GammaBind G Sepharose y 2 \mug de anticuerpo policlonal de conejo específico para los 20 residuos C-terminales de p38a o para los 17 residuos C-terminales de JNK1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Los inmunoprecipitados fueron lavados dos veces con tampón de lisis NP40 y dos veces con tampón de reacción de quinasa (HEPES 25 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, MnCl_{2} 10 mM, \beta-glicerofosfato 20 mM, cóctel completo de inhibidores de proteasas sin EDTA 1X). Las reacciones de quinasa se llevaron a cabo durante 20 minutos a 30ºC en tampón de reacción de quinasa que contenía ATP 50 \muM y 5 \muCi de \gamma-^{32}P-ATP (3000 Ci/mmol, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) con 0,5 \mug de GST-MAPKAPK2 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) como sustrato de p38 o con 2 \mug de GST-c-Jun (BioMol, King of Prussia, PA) como sustrato de JNK-1. Las muestras fueron llevadas a ebullición en tampón de muestra SDS, sometidas a electroforesis en geles de Tris-glicina poliacrilamida al 10% y transferidas a membranas de PVDF (Novex, San Diego, CA). Las bandas fueron cuantificadas en un Sistema PhosphorImager Storm 840 (Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale, CA). Las membranas fueron teñidas para detectar las proteínas p38 y JNK1 utilizando los anticuerpos hacia p38 y JNK1 anteriormente descritos y el sistema de Transferencia Western Vistra ECF (Amersham).
Transferencia Western. Se llevaron a cabo análisis de Transferencia Western según está descrito (27). Para la detección de los niveles de las proteínas IRAK e I\kappaB-\alpha, lisados celulares de NP40 (1 x 10^{5} células/muestra) fueron separados en SDS-PAGE y transferidos a nitrocelulosa (MSI, Westboro, MA). Los filtros fueron inmunotransferidos con antisuero hacia IRAK (dilución 1:1000) o con anticuerpos de conejo hacia I\kappaB-\alpha (Santa Cruz Biotechnology). Las bandas correspondientes a las proteínas específicas fueron detectadas mediante IgG de conejo conjugada a HRP y ECL (Amersham).
Ensayo de desplazamiento de la movilidad de NF-\kappaB. Después de la estimulación, las células de las placas de 100 mm fueron suspendidas en 500 \mul de Tampón A (HEPES 10 mM, pH 7,9, KCl 10 mM, EDTA 100 \muM, EGTA 100 \muM, DTT 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 500 \muM) e incubadas sobre hielo durante 15 minutos. Después de añadir 30 \mul de NP40 al 10%, las muestras fueron centrifugadas a 14000 rpm a 4ºC durante 30 segundos. La pella fue lavada una vez con Tampón A y se añadieron 50 \mul de Tampón B (HEPES 20 mM, pH 7,9, NaCl 400 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM), se agitó en vórtex y se incubó posteriormente durante 30 minutos a 4ºC. Los extractos nucleares se obtuvieron por centrifugación de las muestras a 14000 rpm durante 10 minutos. Las concentraciones de proteína fueron medidas mediante el método BCA (Pierce, Rockford, IL). El oligonucleótido consenso de doble hebra para la unión de NF-\kappaB (Santa Cruz Biotech) fue marcado mediante polinucleótido quinasa de T4. La reacción de unión nuclear se llevó a cabo con 5 \mul de extracto nuclear (10 \mug), 1 \mul de Poli(dI-dC), 1 \mul de sonda marcada (100.000 cpm), 5 \mul de tampón 4X (HEPES 20 mM, pH 7,9, MgCl_{2} 20 mM, EDTA 1 mM) y 8 \mul de glicerol al 25% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los complejos de unión fueron separados en geles de poliacrilamida 6%/TBE 0,5X y detectados mediante autorradiografía.
Análisis de Transferencia Northern y ELISA de IL-6. Para la detección de ARNm de IL-6, células EF cultivadas en placas de 100 mm fueron tratadas con IL-1\beta o TNF\alpha durante 3 horas a 37ºC. El ARN total fue extraído de las células EF con RNAzol (Tel-Test, Inc., Friendwood, TX). El análisis de Transferencia Northern se llevó a cabo según está descrito (28) utilizando una sonda de ADNc de IL-6 de ratón preparada mediante PCR a partir de un molde de ADNc de IL-6 de ratón comercial y oligonucleótidos comerciales (Clontech, Palo Alto, CA). Para la detección de la proteína IL-6 secretada, células EF (5 x 10^{4}/pocillo) y SF (1 x 10^{4}/pocillo) fueron incubadas durante una noche en placas de microvaloración de fondo plano en FCS 10%-DMEM. Después de 2-4 horas de incubación con medio RPMI-1640 con un 1% de FCS bajo en endotoxina (Sigma), las células fueron tratadas durante 8 horas con IL-1\beta de ratón en medio fresco. Los sobrenadantes fueron recogidos posteriormente y analizados para determinar IL-6 utilizando kits de ELISA comerciales (Endogen, Inc., Woburn, MA o Genzyme), con IL-6 de ratón recombinante como estándar.
Células deficientes en IRAK. Con el fin de investigar si IRAK es indispensable para la ruta de señalización de IL-1, se prepararon células EF primarias de ratón deficientes en IRAK a partir de embriones de ratón inyectados con células madre embrionarias que llevaban un gen de IRAK alterado, según se describió en Materiales y Métodos. El gen de IRAK fue alterado por deleción de los exones 5 a 7, que codifican la porción N-terminal del dominio quinasa, subdominios I a V, incluyendo los aminoácidos conservados implicados en la unión al ATP (Fig. 1A). La deleción fue confirmada mediante hibridación Southern (Fig. 1B). La detección del alelo de IRAK alterado únicamente en células madre embrionarias masculinas, sugiere que el gen de IRAK de ratón está localizado en el cromosoma X. Consistente con nuestro hallazgo, se ha descrito también que el gen de IRAK humano está en el cromosoma X (número de acceso del GenBank U52112). La ausencia de proteína IRAK en las células EF que contenían el alelo de IRAK alterado fue demostrada mediante inmunotransferencia con un antisuero anti-IRAK (Fig. 1C). La falta de expresión de IRAK en las células EF deficientes en IRAK nos permitió evaluar la importancia de IRAK en la producción de señales
por IL-1.
Activación defectuosa de JNK y p38 en las células deficientes en IRAK. JNK y p38 son potentemente activados por IL-1, TNF, estrés celular y LPS (29-33). JNK fosforila el dominio de transactivación de c-Jun que está implicado en la activación de genes dependientes de AP-1, incluyendo genes implicados en las respuestas inflamatorias (29-31). El p38 está también implicado en la activación de la expresión génica y la síntesis de proteínas durante la inflamación, incluyendo la síntesis de IL-6 y de prostaglandinas inducida por IL-1 (34). Los acontecimientos proximales responsables de la activación de JNK y p38 inducida por IL-1 se conocen sólo parcialmente. Nosotros comparamos por tanto la activación de JNK y p38 inducida por IL-1 en células EF deficientes en IRAK y en células EF control. La actividad JNK fue medida mediante ensayos de quinasa in vitro de inmunoprecipitados de JNK, utilizando c-Jun como sustrato. La activación de JNK estaba reducida de dos a tres veces en las células deficientes en IRAK a todas las concentraciones de IL-1 analizadas, aunque no se eliminó completamente (Fig. 2). Este defecto en la activación de JNK era específico de IL-1, ya que la actividad JNK inducida por TNF\alpha era comparable en las células control y en las células deficientes en IRAK. La activación de p38 fue medida en inmunoprecipitados de p38 utilizando como sustrato MAPKAPK-2. La activación de p38 inducida por IL-1 estaba también reducida en las células deficientes en IRAK de tres a cinco veces en comparación con las células control, a todas las concentraciones de IL-1 analizadas. En contrate, la actividad p38 inducida por TNF\alpha era similar en las células control y en las células deficientes en IRAK (Fig. 2). Estos resultados demuestran que las actividades JNK y p38 inducidas por IL-1 están ambas reducidas específicamente en las células deficientes en IRAK, e implican a IRAK como el componente de señalización más proximal en la activación de las rutas de JNK y p38.
Activación defectuosa de NF-\kappaB. IL-1 y TNF\alpha son los dos activadores más eficaces de la familia NF-\kappaB de factores de transcripción (21, 35). El NF-\kappaB permanece en un estado inactivo cuando es secuestrado por I\kappaB en el citoplasma. La fosforilación de I\kappaB por las I\kappaB quinasas da lugar a la ubiquitinación y la degradación posterior de I\kappaB por los proteasomas (18-21). El NF-\kappaB liberado es posteriormente translocado hacia el núcleo donde se une a los sitios reguladores en los genes inducidos por NF-\kappaB (21). Los niveles de I\kappaB en células deficientes en IRAK y en células control tratadas con IL-1 fueron determinados mediante inmunotransferencia con un anticuerpo específico de
I\kappaB-\alpha. A concentraciones de IL-1 desde 10 pg/ml a 1 ng/ml, la degradación de I\kappaB era significativamente menor en las células deficientes en IRAK en comparación con las células control (Fig. 3A). Sin embargo, a una concentración de IL-1 de 10 ng/ml, la I\kappaB-\alpha fue degrada casi completamente en las células deficientes en IRAK y en las células control. La inducción por IL-1 de la ruta de NF-\kappaB fue investigada adicionalmente examinando la actividad de unión a ADN de NF-\kappaB en extractos nucleares (Fig. 3B). Se observó una reducción significativa de la activación de NF-\kappaB en las células deficientes en IRAK a concentraciones bajas de IL-1. Consistente con los resultados de la degradación de I\kappaB, la activación de NF-\kappaB era comparable en las células control y en las células deficientes en IRAK a concentraciones elevadas de IL-1.
Inducción defectuosa de IL-6. La producción de señales por IL-1 desencadena respuestas celulares a través de la inducción de varios productos génicos inflamatorios (1). La IL-6 es inducida potentemente por IL-1 a través de la activación de factores de transcripción, incluyendo NF-\kappaB y AP-1, que se unen a los elementos intensificadores del promotor del gen de IL-6 (6). La IL-6 desempeña a su vez una función crucial en la inflamación mediante la mediación de reacciones de fase aguda (36). Con el fin de determinar si los defectos observados en la producción de señales activada por IL-1 tenían como resultado respuestas celulares deterioradas, se midió la inducción de IL-6 en respuesta a IL-1. Los niveles de ARNm de IL-6 inducidos por varias concentraciones de IL-1, eran significativamente menores en las células EF deficientes en IRAK en comparación con las células control (Fig. 4A). Se encontraron también disminuciones similares de la IL-6 secretada por las células deficientes en IRAK en comparación con las células control (Fig. 4B, parte superior), y a varios tiempos después del tratamiento con IL-1. En tres experimentos independientes, la inducción de IL-6 por IL-1 estaba reducida de 3 a 6 veces. Por tanto, la producción de señales por IL-1 reducida en las células deficientes en IRAK tiene como resultado una producción disminuida de IL-6. Con el fin de confirmar los defectos en la generación de señales por IL-1 y en la respuesta celular observada en las células EF deficientes en IRAK, se obtuvieron células fibroblastos cutáneos (SF) de ratones deficientes en la expresión de IRAK, según se describió en Materiales y Métodos. Consistente con la observación en células EF, la producción de IL-6 inducida por IL-1 estaba significativamente disminuida en las células SF deficientes en IRAK en comparación con las células SF preparadas a partir de ºratones de tipo salvaje (Fig. 4B, parte inferior). Se encontró también que la activación de JNK y la degradación de I\kappaB inducidas por IL-1 eran defectuosas en las células SF deficientes
en IRAK.
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ctcatccaga agcacgttag 
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Claims (6)

1. Un ratón transgénico cuyas células somáticas y germinales contienen una alteración en un gen de IRAK endógeno, en las que la alteración es producida mediante sustitución dirigida por un gen de IRAK no funcional, y donde dicha alteración tiene como resultado células deficientes en IRAK procedentes de dicho ratón que tienen una disminución de la activación de JNK, de la activación de p38 y de la inducción de IL-6 en respuesta a IL-1, en comparación con los ratones IRAK de tipo salvaje.
2. El ratón de la reivindicación 1, donde dicho ratón es fértil y transmite el gen de IRAK no funcional a su descendencia.
3. El ratón de la reivindicación 1, en el que el gen de IRAK no funcional ha sido introducido en un ancestro del ratón en una etapa embrionaria mediante microinyección de células madre embrionarias alteradas en los blastocistos del ratón.
4. Una línea celular aislada derivada del ratón transgénico de la reivindicación 1.
5. Un método para producir un ratón transgénico cuyas células somáticas y germinales contengan una alteración en un gen de IRAK endógeno, en el que dicha alteración es generada mediante sustitución dirigida por un gen de IRAK no funcional, comprendiendo dicho método:
(a)
la introducción de una construcción dirigida al gen de IRAK que contiene una secuencia marcadora seleccionable en una célula madre embrionaria de ratón;
(b)
la introducción de dicha célula madre embrionaria de ratón en un blastocisto de ratón;
(c)
el trasplante de dicho blastocisto a un ratón receptor;
(d)
el permitir que dicho blastocisto se desarrolle a término;
(e)
la identificación de un ratón transgénico cuyo genoma contenga una alteración de un gen de IRAK endógeno en al menos un alelo; y
(f)
la cría del ratón de la etapa (e) para obtener un ratón transgénico cuyo genoma contenga una alteración homozigota del gen de IRAK endógeno, donde dicha alteración tiene como resultado células deficientes en IRAK y teniendo dicho ratón una disminución de la activación de JNK, de la activación de p38 y de la inducción de IL-6 en respuesta a IL-1, en comparación con los ratones IRAK de tipo salvaje.
6. El método de la reivindicación 5, en el que la introducción de la etapa (a) es mediante electroporación o microinyección.
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