ES2262349T3 - Peptidos inhibidorers de tgf beta 1. - Google Patents
Peptidos inhibidorers de tgf beta 1.Info
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Abstract
Péptidos sintéticos antagonistas, obtenidos de TGFbeta1 o de sus receptores en el organismo, que pueden ser utilizados en la fabricación, tanto por si solos, como las secuencias génicas que los codifican y los sistemas recombinantes que los expresen, en la fabricación de composiciones útiles para el tratamiento de enfermedades hepáticas y más concretamente en casos de fibrosis. Dichas composiciones pueden incluir opcionalmente mimotopos de dichos péptidos activos.
Description
Péptidos inhibidores de TGF\beta1.
El control del crecimiento celular está regulado
por diferentes proteínas del grupo de los factores de crecimiento
(Schalch DS y col (1979) Endocrinology
104:1143-1151). Entre los factores de crecimiento
más importantes implicados en el desarrollo celular, capaces de
actuar por mecanismos autocrinos y paracrinos, se encuentran los
factores transformantes del crecimiento (TGF, del inglés
Transforming Growth Factor) (Braun L. y col. (1988) Cell Biol
85:1539-1543; Lyons RM y Moses HL (1990) Eur. J.
Biochem. 187:467-473).
El término TGF se utilizó por primera vez para
describir la actividad producida por una línea celular transformada
con el virus del sarcoma murino(deLarco JE y Todaro GJ (1978)
Proc. Natl. Acad. Sci. 75:4001-4005; Mizel SB y col.
(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:2205-2208). El
sobrenadante de estas células fue capaz de inducir el normal
crecimiento, en agar blando, de células que necesitan un soporte
sólido para crecer. Estudios más específicos pusieron en evidencia
dos clases de TGF, que se denominaron TGF\alpha y TGF\beta, que
a su vez abarcan familias de proteínas relacionadas. La familia del
TGF\beta está formada por 5 isoformas (Brand T. y Schneider MD
(1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27:5-18) de estructura
dimérica (Schlunneger MP y Grutter MG (1992) Nature
358:430-434; Brand T. y Schneider MD (1995) J. Mol.
Cell Cardiol. 27:5-18). Estudios de las proteínas
maduras, purificadas a partir de una misma especie, han demostrado
un alto grado de identidad entre sus secuencias (Tabla 1).
| % de | TGF\beta1 | TGF\beta2 | TGF\beta3 | TGF\beta4 | TGF\beta5 |
| TGF\beta1 | 100 | ||||
| TGF\beta2 | 71 | 100 | |||
| TGF\beta3 | 72 | 76 | 100 | ||
| TGF\beta4 | 82 | 64 | 71 | 100 | |
| TGF\beta5 | 76 | 66 | 69 | 72 | 100 |
El TGF\beta1 se sintetiza como un precursor de
390 aminoácidos denominado
Pre-Pro-TGF\beta1. En una primera
hidrólisis se produce la liberación de un fragmento hidrófobo de 29
aminoácidos, que da lugar al Pro-TGF\beta1.
Posteriormente se libera el TGF\beta1 maduro mediante otro corte
en una región que precede al extremo amino del TGF\beta1 y que
consta de dos argininas, dando lugar a una proteína de 112
aminoácidos con un peso molecular de 12 kDa. Para dar lugar a la
forma biológicamente activa, dos de estos monómeros se unen entre sí
por medio de puentes disulfuro, obteniéndose un dímero de 25 kDa.
Las modificaciones de esta estructura provocan la pérdida de la
función biológica (Barnard JA y col. (1990) Biochim. Biophys. Acta
1032:79-87).
Se conoce la existencia de diversos dominios
dentro de la estructura del TGF\beta1. Uno de estos dominios se
encuentra localizado entre los aminoácidos 40 y 82 y está implicado
en la unión del TGF\beta1 a sus receptores celulares (Quian SW y
col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:6290-6294;
Burmester JK y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
90:8628-8632).
Se han caracterizado cinco tipos de receptores
específicos para el TGF\beta1 (Cheifetz S y col. (1988) J. Biol.
Chem. 263:17225-17228 y López Casillas F. y col.
(1991) Cell 67:785-795). Estos receptores tienen
distintas afinidades para los diferentes tipos de TGF\beta1. Los
receptores tipo I, II y III son los mejor conocidos hasta el momento
(revisado en Attisano L y col (1994) Biochim. Biophys. Acta
1222:71-80; Derynck R. (1994) Trends Biochem. Sci.
19:548-553; Yingling y col. (1995) Biochim. Biophys.
Acta 1242:115-136). También se han descrito los
receptores de tipo IV (MacKay K. y Danielpour D. (1991) J. Biol.
Chem. 266:9907-9911) y de tipo V (Ichijo H. y col.
(1991) J. Biol. Chem. 266:22459-22464). Se ha
descrito también que los dominios transmembrana y citoplásmicos de
la endoglina (Cheifetz S y col. (1993) J. Biol. Chem.
267:19027-19030; Bellón T. y col. (1993) Eur. J.
Immunol. 23:2340-2345; Yamashita y col. (1995) J.
Biol. Chem. 269: 1995-2001; Zhang H. y col. (1996)
J. Immunol. 156:564-573)) tienen alrededor de un 70%
de analogía con los receptores de tipo III, tanto humano como de
rata.
\newpage
El RIII sería el encargado de unir el
TGF\beta1 y presentarlo a RII que a su vez formaría un complejo
con RI (Yamashita y col. (1994) J. Biol. Chem.
269:20172-20178) o a complejos en los que varias
moléculas de RI se asocian con el RII (Weiss G. y Massagué J. (1996)
EMBO J 15:276-289). La interacción
RII-RI provocaría la fosforilación de RI y la
posterior activación de su serin/treonin-quinasa la
que fosforilaría a segundos mensajeros como las proteínas MADR2
(Macías-Silva M y col., (1996) Cell
87:1215-1224).
El documento WO9625178 describió fragmentos
activos de TGF\beta de 45 aminoácidos. El documento FR2720069
describió la secuencia de aminoácidos modificada de un TGF\beta
casi completo, sin el extremo N del polipéptido natural, y con
cambios, mutaciones o deleciones, en el extremo C, particularmente
en una Phe que se puede sustituir por Ile, Ala o Ser o incluso
delecionarse. El documento WO9229793 describió secuencias de
aminoácidos del receptor de TGF\beta o mayores de 500 aminoácidos
o, cuando eran menores de 15 aminoácidos, que no están relacionadas
con el TGF\beta o sus receptores.
Los efectos producidos son distintos dependiendo
del momento del desarrollo y del tipo celular.
- \bullet
- Aumento de la matriz extracelular, al actuar sobre las células estrelladas hepáticas (células de Ito), principal fuente de proteínas de la matriz (Mustoe TA y col. (1987) Science 237:1333-1336).
- El documento WO9625178 describió fragmentos activos de TGF\beta de 45 aminoácidos. El documento FR2720069 describió la secuencia de aminoácidos modificada de un TGF\beta casi completo, sin el extremo N del polipéptido natural, y con cambios, mutaciones o deleciones, en el extremo C, particularmente en una Phe que se puede sustituir por Ile, Ala o Ser o incluso delecionarse. El documento WO9229793 describió secuencias de aminoácidos del receptor de TGF\beta o mayores de 500 aminoácidos o, cuando eran menores de 15 aminoácidos, que no están relacionadas con el TGF\beta o sus receptores.
- \bullet
- Diferenciación de las células epiteliales y hepatocitos (Florini JR y col. (1986) J. Biol. Chem. 261:16509-16513).
- \bullet
- Inhibición del crecimiento celular durante el proceso de regeneración hepática. Este efecto es de gran importancia en el mantenimiento del reposo celular in vivo (Kato Y y col (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9552-9556).
- \bullet
- Inhibición de la endocitosis del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGF) como se ha observado en cultivos de hepatocitos fetales de rata (Noda M. y Rodan GA (1987) J. Cell Physiol. 133:426-437).
El TGF\beta1 se ha visto asociado a los
procesos de fibrosis hepática (Czaja MJ y col. (1989) J. Cell Biol.
108:2477-2482; Annoni G. y col. (1992) J. Hepatol
14:259-264) provocando un aumento de la producción
de las proteínas de la matriz extracelular, por las células
estrelladas hepáticas (lipocitos o células de Ito), de sus
receptores e inhibiendo la síntesis de las enzimas proteolíticas que
degradan la matriz (Ignotz RA y Massagué J. (1986) J. Biol. Chem.
261:4337-4345). En el hígado el TGF\beta1 induce
la síntesis de colágeno y fibronectina en las células estrelladas
hepáticas (Weiner FR (1990) Hepatology 11:111-117).
También existe una autorregulación aumentando su propia síntesis,
mediante la inducción de su ARNm.
El TGF\beta1 también se ha visto implicado en
el aumento de la síntesis de la
\alpha2-macroglobulina sintetizada por los
hepatocitos y las células estrelladas hepáticas activadas. Mediante
la unión al TGF\beta1 y provocando su inactivación (Bachem MG
(1994) Ann NY Acad. Sci. 737:421-424), se dice que
la \alpha2-macroglobulina elimina el TGF\beta1
de los compartimentos extracelulares.
El estudio de pacientes afectados por un daño
hepático crónico ha mostrado que existe una correlación entre la
expresión del TGF\beta1 y la expresión del ARNm para el
procolágeno tipo I y los niveles séricos de péptido tipo III del
procolágeno (Castilla A. y col. (1991) N. Engl. J. Med.
324:933-940).
Los pacientes con cirrosis hepática tienen una
expectativa de vida más corta de lo normal debido a las
complicaciones que aparecen en el curso de la enfermedad, como la
hipertensión portal o la insuficiencia hepática.
La interacción del TGF\beta1 con los
receptores celulares provoca:
- \bullet
- Activación de la síntesis de procolágeno, fibronectina (Ignotz RA y col. (1987) J. Biol. Chem. 262:6443-6446) y proteínas relacionadas, entre las que se incluyen proteínas de membrana capaces de interactuar con los componentes de la matriz extracelular (Carter WG (1982) J. Biol. Chem. 257:13805-13815).
\newpage
- \bullet
- Inhibición de la síntesis de enzimas proteolíticas capaces de degradar la matriz (Fukamizu H. y Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282).
- \bullet
- Estimulación de la síntesis de inhibidores de enzimas proteolíticas (Fukamizu H. y Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282).
Estos efectos conducen a un aumento de las
interacciones de la célula con la matriz extracelular lo que, junto
a la mayor reorganización de las proteínas que la componen, da lugar
a un aumento en la cantidad total de matriz extracelular (Roberts CJ
y col. (1988) J. Biol. Chem. 263: 4586-4592). Estas
evidencias confirman la implicación del TGF\beta1 en procesos de
cicatrización (Fukamizu H. y Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res.
190:276-282; Barnard JA y col. (1990) Biochim.
Biophys. Acta 1032:79-87).
Existe la posibilidad de utilizar pequeñas
moléculas, péptidos sintéticos, como análogos de moléculas
existentes en el organismo, con el fin de emular su función.
Estudios realizados por LeSateur y col. demuestran la posibilidad de
usar análogos ciclados del factor de crecimiento nervioso (NGF, del
inglés Nerve Growth Factor), emulando la región de giro
\beta, permitiendo su unión al receptor (LeSateur L. y col. (1996)
Nature Biotechnology 14:1120-1122). También es
posible utilizar péptidos como antagonistas de estas moléculas,
evitando que el factor nativo interaccione con su receptor por un
bloqueo mediado por el péptido (Lasarte JJ y col. (1994) J. Acquired
Immune Deficiency Syndromes 7:129-134; LeSateur y
col. (1995) J. Biol. Chem. 270:6564-6569). Estudios
anteriores han demostrado la utilidad de los péptidos sintéticos
como inhibidores de la interacción ligando-receptor
incluso en el caso de que el epítopo de reconocimiento no sea
continuo (Daniels AJ y col. (1995) Mol. Pharmacol.
48:425-432). Otros estudios realizados con el
receptor tipo II del TGF\beta1 y con la fetuina, una glicoproteína
del grupo de receptores tipo II, han demostrado la posibilidad de
usar péptidos ciclados como inhibidores de la interacción del
TGF\beta1 con el RII (Demetriou M. y col. (1996) J. Biol. Chem.
271:12755-12761). Con esta ciclación se consigue
obtener péptidos con una estructura similar a la que se podría
obtener in vivo.
Por las razones indicadas más arriba, pensamos
que péptidos procedentes del receptor tipo III del TGF\beta1 o de
la endoglina, podrían ser inhibidores de la acción del TGF\beta1.
Por lo que decidimos explorar esta posibilidad.
La selección de los péptidos a sintetizar se
realizó de diferente manera según provinieran del receptor tipo III
del TGF\beta1 o de la endoglina.
Los péptidos se eligieron en base a programas
informáticos diseñados en nuestro laboratorio. Uno de estos
programas permite comparar dos secuencias aminoacídicas entre sí,
con el fin de predecir zonas parcialmente complementarias. También
se utilizaron otros programas capaces de predecir las zonas de las
proteínas que se encontrarían más expuestas, en base a la
hidrofobicidad e hidrofilicidad de los aminoácidos que componen su
secuencia.
Los péptidos se sintetizaron mediante el método
de fase sólida (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:
2149-54), utilizando fluorenilmetiloxicarbonil
(Fmoc) como grupo protector temporal del grupo
alfa-amino (Atherton et al. (1989) Journal of
Chemical Society Perkins Transactions 1: 538-546.).
Para la síntesis de pequeñas cantidades de un gran número de
péptidos se utilizó un sintetizador múltiple que permite la síntesis
simultánea de 96 péptidos (Borrás-Cuesta et
al. (1991) Biologicals 19: 187-190). Los
péptidos se conservaron a -80ºC en estado sólido hasta su
utilización.
Los péptidos sintetizados se analizaron y
purificaron mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC),
utilizando un sistema Waters 600E-900 (Millipore
Corp., Bedford, Estados Unidos).
Para el análisis de los péptidos por HPLC
analítica, se utilizó una columna Waters
Radial-Pak^{TM} C_{18} 300 \ring{A} 15 \mum,
8x100 mm (Millipore Corp., Bedford, Estados Unidos). El
péptido se disolvió en una solución de TFA al 0,1% en agua
destilada, a una concentración máxima de 1 mg/ml. La solución de
péptido se inyectó (100 \mul) en la columna y se eluyó en un
gradiente de agua/acetonitrilo (Fig. 15) (Romil Ltd., Cambridge,
Estados Unidos) ambos con TFA al 0,1% a un caudal de 1 ml/minuto.
Las fracciones que contenían el péptido se detectaron por su
absorbancia a 220 nm y 280 nm (photo diode array detector, Waters
991, Millipore Corp., Bedford, Estados Unidos).
Para su purificación se utilizó una columna
Waters Delta-Pak^{TM} C_{18} 300 \ring{A} 15
\mum, 25x100 mm (Millipore Corp., Bedford, Estados Unidos).
El péptido se disolvió y se inyectó (2 ml) en las mismas condiciones
que en el caso anterior, utilizándose el mismo gradiente a un caudal
de 5 ml/min. La fracción que contenía el péptido puro se recogió en
un matraz.
Se utilizó una línea procedente de epitelio de
pulmón de visón, MV-1-Lu
(CCL-64, American Type Cell Culture, Virginia,
Estados Unidos). Las células se cultivaron en frascos de cultivo
de 162 cm^{2} (Costar Corporation, Cambridge, Estados
Unidos) en una estufa a 37ºC y 5% de CO_{2}, hasta alcanzar
la subconfluencia. Se utilizó un medio completo: RPMI 1640 con
L-glutamina (GibcoBRL, Life Technologies Ltd.,
Paisley, Escocia) suplementado con un 5% de suero de ternera
fetal (FCS, Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek,
Israel), HEPES 10 mM (HEPES Buffer 1M,
Bio-Whittaker, Verviers, Bélgica) y antibióticos
(penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 \mug/ml).
Las células
Mv-1-Lu crecidas tal y como se
indica más arriba, se despegaron del fondo de los frascos de cultivo
utilizando 5 ml de tripsina-EDTA (Biological
Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel), se resuspendieron en medio
completo y se centrifugaron a 1500 r.p.m. durante 8 minutos. Tras la
centrifugación las células se resuspendieron en medio completo a una
concentración de 50.000 células/ml. Para la realización del ensayo
se tomaron 10 ml de la suspensión de células y se dispensaron a
placas de 96 pocillos de fondo plano (Costar Corporation,
Cambridge, Estados Unidos) añadiendo 100 \mul/pocillo, y se
incubaron durante toda la noche a 37ºC y 5% de CO_{2}, lo que
permite la adhesión de las células al fondo de los pocillos. Una vez
transcurrido este tiempo se añadieron los péptidos a ensayar en
RPMI, a una concentración final de 200 \mug/ml en presencia de una
concentración de 200 pg/ml de TGF\beta1 en RPMI (R&D
Systems Europe Ltd., Abingdon, Reino Unido). La concentración
final de FCS en el pocillo fue del 2,5%. Tras 24 horas de incubación
se añadió 1 \muCi de timidina tritiada por pocillo
([metil-^{3}H]-thimidyne 25
Ci/mmol, Amersham Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) y
se incubó durante 12 horas adicionales
(Grubeck-Loebenstein B. y col. (1989) J. Clin.
Invest. 83:764-770; Brennan FM y col. (1990) Clin.
Exp. Immunol. 81:278-285).
Una vez terminados los periodos de incubación,
las células se despegaron del fondo de los pocillos con
tripsina-EDTA y se recogieron utilizando un
recolector manual (Titertek cell harvester, Skatron Instruments
Inc., Sterling, Estados Unidos) que lisa las células recogiendo
el ADN en filtros de nitrocelulosa (Filter MAT 11731, Skatron
Instruments Inc., Sterling, Estados Unidos) donde queda fijado.
Los filtros se colocaron individualmente en tubos de polipropileno
de 5 ml a los que se añadió 4 ml de líquido de centelleo
(Biogreen-11, Reactivos Scharlau S.A., Barcelona,
España). La actividad de cada tubo se cuantificó durante 90
segundos en un contador de centelleo \beta LKB (Beta plate
system, LKB, Upssala, Suecia).
Las células
MV-1-Lu se despegaron de los frascos
de cultivo incubándolas a 37ºC durante 10 minutos, con 10 ml de la
solución 1 (NaCl 128 mM, KCl 5 mM,
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonato
25 mM a pH 7,5, glucosa 5 mM y EDTA 1 mM). Las células así
despegadas se resuspendieron en la solución 2 (NaCl 128 mM, KCl 5
mM,
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonato
50 mM a pH 7,5, CaCl_{2} 1,2 mM, MgSO_{4} 1,2 mM y 5 mg/ml de
BSA) y se recogieron por centrifugación a 1000 x g. durante 5
minutos. Tras la centrifugación las células se resuspendieron en la
solución 2 a una concentración de 10^{6} células/ml.
A partir de esta suspensión celular se hicieron
alícuotas de 0,5 ml en placas de 24 pocillos (Greiner GmbH,
Frickenhausen, Alemania) donde se añadieron los péptidos, en 50
\mul de una solución a 0,8 mg/ml, que luego se incubaron durante 2
horas a 4ºC en agitación. Posteriormente se añadió
^{125}I-TGF\beta1 (2 \muCi) a una
concentración final de 277,2 pM
(^{125}I-TGF\beta1 human recombinant
800-2200Ci/mmol, Amersham Life Science,
Buckinghamshire, Reino Unido) y se incubó durante otras dos
horas a 4ºC en agitación.
Tras la incubación, las células se transfirieron
a un tubo de centrífuga donde se centrifugaron en frío a 12.000 x g
durante 1 minuto. Posteriormente se lavaron 2 veces en solución 2
fría y se resuspendieron en 0,5 ml de solución 2 fría, 5 \mul de
dimetilsulfóxido (DMSO 99,5%, Sigma Chemical Co., St. Louis,
Estados Unidos) y disuccimidil-suberato (DSS,
Pierce Chemical Co., Rockford, Estados Unidos) dando una
concentración final 0,25 mM de DSS. La reacción se detuvo a los 15
minutos por dilución, centrifugación y lavado con una solución que
contenía sacarosa 0,25M, Tris 10 mM y EDTA 1 mM a pH 7,4. El
precipitado de células se resuspendió en 0,5 ml de Tritón
X-100 (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, Estados Unidos) 1% v/v, Tris 10 mM a pH 7,0, EDTA 1
mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM, pepstatina a 1\mug/ml
y leupeptina a 1 \mug/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis,
Estados Unidos) y se incubó durante 40 minutos a 4ºC. La
fracción insoluble en detergente se separa por centrifugación a
12.000 x g durante 15 minutos. Las fracciones solubles en detergente
(sobrenadante) e insoluble (precipitado) se congelaron a –20ºC
(Massagué J. y Like B. (1985) J. Biol. Chem.
260:2636-2645).
Las fracciones soluble e insoluble en detergente
se utilizaron para análisis electroforéticos en geles de
acrilamida/bisacrilamida al 7,5% durante 5-6 horas a
220 voltios.
La tinción de las proteínas se realizó con una
solución de comassie brillant blue® R250 (Serva
Feinbiochemica GmbH, Heidelberg, Alemania) en metanol (50%),
ácido acético (10%) y agua destilada, durante 30 minutos. Los
lavados posteriores se realizaron con una solución de metanol (50%),
ácido acético (10%) y agua destilada durante 15 minutos, en el
primer lavado, y metanol (2,5%), ácido acético (0,5%) y agua
destilada, en los siguientes lavados, hasta la eliminación del color
de fondo.
La inhibición de la unión del TGF\beta1,
mediada por los péptidos, a los receptores celulares se midió
mediante el método de inmunofluorescencia directa. Para ello se
utilizó un kit de inmunofluorescencia (Fluorokine rh
TGF\beta-biotin, R&D Systems Europe Ltd.,
Abingdon Reino Unido). Este ensayo está basado en la capacidad
de unión del TGF\beta1 biotinilado a los receptores celulares, de
forma específica y la posterior interacción de la biotina con
avidina marcada con fluoresceína; de tal forma que la intensidad de
la señal dependerá de la cantidad de TGF\beta1 unido a los
receptores celulares.
Las células
MV-1-Lu crecidas en frascos de 162
cm^{2} se despegaron utilizando la solución 1 (descrita
anteriormente) y se resuspendieron en suero fisiológico para su
centrifugación a 500 x g durante 5 minutos. Tras la centrifugación,
las células se resuspendieron de nuevo en suero fisiológico a una
concentración de 4x10^{6} células/ml. Se añadieron 25 \mul de la
suspensión celular a tubos de borosilicato de 12x75 mm, a los que se
añadió el péptido a ensayar en 40 \mul de medio RPMI 1640, dando
una concentración final de 0,42 \mug/\mul y 10 \mul de
TGF\beta1 biotinilado. Como control de la especificidad, se
añadieron 10 \mul de un reactivo biotinilado suministrado con el
kit, como control positivo se añadieron 10 \mul de TGF\beta1
biotinilado y como control negativo se añadieron 20 \mul de un
anticuerpo bloqueante anti-TGF\beta1. En todos
los controles se añadió suero fisiológico hasta alcanzar un volumen
total de 75 \mul. Todos los tubos se incubaron durante 1 hora a
4ºC en oscuridad.
Transcurrido el periodo de incubación se
añadieron 10 \mul de avidina marcada con fluoresceína y se incubó
durante 30 minutos a 4ºC en oscuridad, tras lo cual se añadieron 2
ml de una solución de lavado (RDF1), seguida de centrifugación a 500
x g durante 6 minutos. El precipitado celular se resuspendió en 0,2
ml de PBS frío para el análisis citométrico (FACScan, Becton
Dickinson Immunocytometry Systems, California, Estados Unidos).
Este procedimiento permite medir la fluorescencia emitida por cada
célula al incidir sobre ella un haz de láser mediante un programa
informático (Lisys^{TM}II, Becton Dickinson Immunocytometry
Systems, California, Estados Unidos). En la Fig. 16 se muestra
una imagen típica del análisis por citometría de flujo.
Para la obtención de los datos de inhibición de
la unión del TGF\beta1 a los receptores, se utilizó el control
positivo del ensayo para delimitar los campos correspondientes a las
células marcadas, que se han unido al
TGF\beta1-biotina (M2) y a las células no marcadas
(M1). Una vez delimitados los campos, se calculó el porcentaje de
células que se encontraba dentro de cada uno de ellos. Se hizo lo
mismo con los datos obtenidos cuando se incubaba el péptido con
TGF\beta1-biotina o con las células, según fueran
procedentes de los receptores o del TGF\beta1 respectivamente. Con
estos datos, se calculó el porcentaje de inhibición de cada péptido
utilizando la siguiente fórmula: 100 - ((M2
Péptido-M2 Negativo) x 100/(M2
Positivo-M2 Negativo)).
Se utilizaron ratas blancas macho (raza Wistar
albina), procedentes de camadas simultáneas (5 semanas \pm 1,5
semanas), con el fin de obtener un grupo que fuera homogéneo en edad
y peso inicial. A lo largo de los experimentos, los animales fueron
mantenidos en condiciones de temperatura constante (22ºC) con un
ciclo de luz y oscuridad de 12 horas. Tuvieron libre acceso al agua
y a la comida.
Se indujo cirrosis hepática (CH) mediante
inhalación de tetracloruro de carbono, durante 11 semanas, dos veces
por semana (López Novoa JM y col (1976) Patología
IX:223-240; Camps J. y col. (1987) Gastroenterology
93:498-505). La exposición al CCl_{4} se efectuó
haciendo burbujear aire comprimido, a un caudal de 3 litros/minuto,
a través de un frasco lavador de gases. Se comenzó con un minuto de
exposición, aumentándolo en un minuto por semana hasta llegar a 4
minutos en la cuarta semana. Durante la quinta semana no se
administró CCl_{4}, comenzando de nuevo a la sexta semana con una
exposición de 5 minutos. Este tiempo de exposición se mantuvo hasta
la semana 11. Al agua de bebida se le añadieron 400 mg/l de
fenobarbital (Luminal®, Bayer, Leverkusen, Alemania), desde
una semana antes de iniciar la exposición al CCl_{4} y hasta el
final del periodo de experimentación. Antes de iniciar el
tratamiento, se dejó una semana, en la que no se les administró
CCl_{4}. Durante el tratamiento se les administró una dosis
semanal de CCl_{4}, como recuerdo (Fig. 2).
\newpage
Los animales se distribuyeron en 4 grupos antes
de iniciarse el proceso de inducción de la cirrosis hepática.
Controles Sanos (Co): Animales que no
fueron sometidos al proceso de fibrosis.
Controles Sanos tratados (Co+P144):
Animales que no fueron sometidos al proceso de fibrosis y se les
administró el péptido P144 durante las 3 últimas semanas
(coincidiendo en el tiempo con el tratamiento del grupo de ratas
Tto_{2}).
Controles Cirróticos 1 (Ci_{1}):
Animales sometidos al proceso de inducción de cirrosis por
inhalación de CCl_{4} dos veces por semana. Estos animales se
separaron en 2 grupos al llegar a la quinta semana:
- Controles cirróticos 1 (Ci_{1}): Animales que siguieron sometidos al proceso de inducción de la fibrosis hasta la semana 11, sin administrárseles el péptido P144. Se les administró suero salino en días alternos, durante todo el proceso de inducción (semanas 5 a 11).
- Cirróticos Tratados 1 (Tto_{1}): Animales a los que se les administró el péptido P144 procedente de la secuencia del receptor tipo III, en días alternos, durante el proceso de inducción de la fibrosis, desde la semana 5 hasta la semana 11.
Controles Cirróticos 2 (Ci_{2}):
Animales que siguieron sometidos al proceso de inducción de fibrosis
sin recibir el péptido P144 ni suero salino. Este grupo se
subdividió en otros dos al llegar a la semana 11.
- Controles Cirróticos 2 (Ci_{2}): Animales cirróticos que no fueron sometidos a ningún tipo de tratamiento, manteniéndose como controles. Estos animales recibieron inyecciones de suero salino durante 3 semanas (semanas 13 a 15).
- Cirróticos Tratados 2 (Tto_{2}): Animales cirróticos que fueron tratados con el péptido procedente de la secuencia del receptor tipo III (P144), durante 3 semanas (semanas 13 a 15).
- \bullet
- Grupo Tto_{1}: Estos animales fueron sometidos a tratamiento durante el proceso de fibrosis. El tratamiento con el péptido se inició en la quinta semana, (antes de la exposición al CCl_{4} durante 5 minutos) y se continuó hasta finalizar las once semanas del proceso de inducción de cirrosis.
- \bullet
- Grupo Tto_{2}: Estos animales fueron sometidos a tratamiento después de finalizado el proceso de inducción de cirrosis (11 semanas). El tratamiento se inició una semana después de la última inhalación de CCl_{4} y se continuó durante 21 días.
Antes de iniciar el tratamiento y al finalizarlo
se extrajo sangre a todos los animales que habían sido tratados con
el péptido. El péptido fue administrado por inyección subcutánea en
la zona abdominal a una dosis de 70 \mug/animal en 500 \mul de
suero fisiológico.
Finalizado el tratamiento de los animales con el
péptido, tanto en el modelo con ratas como en el de ratones, los
animales se sacrificaron por decapitación, después de haberles
extraído sangre del plexo retrorbital con un capilar.
Inmediatamente después se procedió a la
disección del hígado y la recogida de muestras.
Se cortaron las muestras y se introdujeron en
formol como solución fijadora, para su posterior examen histológico.
Otros fragmentos se introdujeron en criotubos, que se sumergieron en
nitrógeno líquido y luego se conservaron a -80ºC.
El estudio histológico se realizó en fragmentos
de hígado previamente fijados en formol durante al menos 24 horas,
transcurridas las cuales se introdujeron en etanol (70%).
Tras la deshidratación se incluyeron en bloques
de parafina. De los bloques obtenidos se realizaron cortes seriados
de 3 \mum de espesor, empleando un microtomo de rotación Leitz y
cuchillas de acero. Previamente a la tinción los cortes se
desparafinaron en xilol (AnalaR, BDH, Poole, Reino Unido)
durante 15 minutos, después de calentarlos a 60ºC en una estufa,
durante 15 minutos, y se hidrataron mediante pases sucesivos por
alcoholes de concentración decreciente 100%, 96%, 80% y 70% y
finalmente en agua. Se realizaron las siguientes tinciones:
Hematoxilina-Eosina.
Tricrómico de Masson (Locquin M, y Langeron,
(1985) en Manual de Microscopía Ed. Labor S.A Barcelona): Utiliza un
colorante específico para proteínas colagénicas (verde claro).
Rojo Sirio: Tinción específica para
colágeno.
Para el análisis de imagen de las muestras
obtenidas se utilizó un microscopio de luz (Olympus
BH-2, Tokio, Japón) conectado a una cámara de
vídeo (Sony DXP-950P, Sony Co., Tokio,
Japón), con la que se fotografiaron los diferentes campos de
cada preparación. Se tomaron 6 campos de manera aleatoria a partir
de cada preparación teñida con rojo sirio. Las diferentes imágenes
captadas se analizaron por medio de un programa informático
(Visilog 4.1.5, Noesis, Orsay, Francia) capaz de calcular el
área de fibrosis y el área total de la preparación. Con estos
datos, se calculó un índice de fibrosis (área de fibrosis/área
total) para cada campo. Para poder utilizar este programa, fue
necesario modificar la adquisición de las imágenes mediante la
utilización de filtros de luz polarizada (Olympus
U-POT, Tokio, Japón) y filtros de luz verde
(Olympus IF550, Tokio, Japón) lo que permitió la
automatización del proceso de análisis de las muestras.
Los cortes de 14 \mum que se utilizaron para
esta técnica se obtuvieron de la misma manera que los cortes de 3
\mum anteriormente mencionados. Estos cortes fueron sometidos a un
proceso de desparafinización durante 12 horas en xilol. Una vez
eliminada la parafina, las muestras fueron hidratadas pasándolas por
diferentes grados de alcohol 96%, 80%, 50%, finalizando el proceso
en agua destilada.
Una vez hidratadas, se sometieron a un proceso
de pretinción en una solución de 160 mg de Fast Green FCF (Fluka
Chemika-BioChemika, Buchs, Suiza) en 160 ml de
ácido pícrico saturado (Merck, Darmstadt, Alemania) durante
15 minutos en oscuridad. Las muestras se lavaron por inmersión en
agua hasta que dejaron de colorear el agua de lavado. Una vez
eliminado el colorante sobrante, las muestras se tiñeron durante 30
minutos en oscuridad en una solución de 160 mg de Direct Red 80,
(Fluka Chemika-BioChemika Buchs, Suiza) y 64
mg de Fast Green, ambos colorantes en 160 ml de ácido pícrico
saturado. Se lavaron de nuevo hasta eliminar el colorante sobrante y
luego se despegaron las muestras de los portas mediante el raspado
de la muestra con una espátula pequeña. Los cortes así despegados se
introdujeron en tubos separados que contenían 3 ml de una solución
de NaOH 0,1 N (Quimón, Montplet&Esteban S.A., Barcelona,
España) y metanol (1:1). Se tomaron alícuotas de los diferentes
tubos para su lectura en el espectrofotómetro (Lambda 2 UV/VIS
spectrophotometer, Perkin-Elmer, Norwalk, Estados
Unidos) a longitudes de onda de 540 nm y 630 nm utilizándose
como blanco una alícuota de la solución de NaOH 0,1 N y Metanol
(López de León A. y Rojkind (1985) Histochem Cytochem
33:737-743; Gaudio E. y col. (1993) Int. J. Exp.
Path. 74:463-469).
De acuerdo con los trabajos de Gaudio E. y col.
(1993) Int. J. Exp. Path. 74:463-469), se utilizaron
las siguientes fórmulas encontrar las cantidades de colágeno y de
proteína total:
mg \ Colágeno
= \frac{absorbancia \ a \ 540 \ nm - absorbancia \ a \ 630 \
nm}{37}
mg \
Colágeno/mg \ \text{proteína} \ total = \frac{mg \ Colágeno}{mg \
Colágeno + mg \ \text{proteínas} \ no \
colagénicas}
\text{Proteínas} \ no \
colagénicas = \frac{absorbancia \ a \ 630 \
nm}{3}
Los datos obtenidos en los experimentos in
vivo se sometieron a análisis estadístico. La normalidad de las
variables cuantitativas se comprobó mediante el ensayo de
Shapiro-Wilks.
Debido a que los datos no se ajustaban a una
distribución normal, se realizó un análisis estadístico no
paramétrico. La comparación entre grupos se efectuó mediante la H de
Kruskal-Wallis seguida de la comparación de la U de
Mann-Whitney. Los datos se representaron
gráficamente mediante cajas, representándose la mediana de los datos
(línea gruesa dentro de cada caja), junto con el rango
intercuartílico (altura de la caja), mientras que los bigotes de
cada caja representan las observaciones más altas y más bajas dentro
de un determinado rango intercuartílico.
La asociación entre variables se estudió
mediante la prueba exacta de Fisher. Se realizó una regresión
logística para estudiar la independencia de la asociación de estas
variables.
Se consideró significativo el valor de P igual o
menor que 0,05.
Todos los análisis estadísticos se realizaron
utilizando el programa SPSS para Windows V 6.1.3.
El TGF\beta1 es una citoquina capaz de inhibir
el crecimiento in vitro de la línea celular
MV-1-Lu
(Grubeck-Loebenstein B. y col. (1989) J. Clin.
Invest. 83:764-770; Brennan FM y col. (1990) Clin.
Exp. Immunol. 81:278-285), por lo que esta línea se
utilizó para ensayar el efecto bloqueante de los péptidos sobre el
TGF\beta1. Tras diferentes combinaciones de medios, células y
timidina, se estudió el efecto de distintas concentraciones de
TGF\beta1 sobre la incorporación de
[metil-^{3}H]timidina, por parte de las
células MV-1-Lu en cultivo, para
determinar las condiciones más adecuadas para el ensayo. Estas
condiciones se muestran en la Fig. 3.
Una vez determinadas tanto la concentración
óptima de células MV-1-Lu (5000
células/pocillo) como la menor concentración de TGF\beta1 capaz de
producir una inhibición de alrededor del 90% (200 pg/ml, Fig. 18),
se ensayó el efecto inhibitorio de los péptidos sintéticos a una
concentración de 200 \mug/ml.
Los péptidos sintéticos de la invención que eran
potencialmente inhibidores de la actividad del TGF\beta1, se
ensayaron utilizando la línea celular
MV-1-Lu. Los péptidos se disolvieron
en medio RPMI tamponado, libre de suero de ternera fetal, y se
procedió como sigue:
Los péptidos pertenecientes a la secuencia del
receptor, o complementarios a los picos de hidrofilicidad del
TGF\beta1, se incubaron durante 30 minutos en presencia de esta
citoquina y luego se combinaron con el cultivo celular. Los péptidos
procedentes de la secuencia del TGF\beta1 se añadieron al cultivo
celular antes de la adición del TGF\beta1, dado que interaccionan
con los receptores de la superficie celular. Estas incubaciones se
realizaron en 100 \mul del mismo medio que el utilizado para
añadir las células. Los péptidos activos permitieron el crecimiento
celular en mayor o menor grado dependiendo de su capacidad de
inhibir al TGF\beta1.
En una primera etapa, se sintetizaron péptidos
solapantes procedentes del TGF\beta1. Estos péptidos (Tabla 2) se
sintetizaron pensando que alguno de ellos podría unirse a los
receptores celulares, impidiendo de esta manera la unión del
TGF\beta1 natural a estos receptores.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se indica el número del péptido junto a su
posición en la secuencia completa, así como su secuencia de
aminoácidos. Por comodidad de síntesis, todos los péptidos se
sintetizaron con una alanina añadida en el extremo
C-terminal que no se indica en la tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Fig. 4 se muestra el efecto inhibitorio de
los péptidos de la Tabla 6 sobre la actividad del TGF\beta1.
Puesto que el TGF\beta1 inhibe el crecimiento de las células
MV-1-Lu, la inhibición de esta
citoquina mediante los péptidos conlleva el restablecimiento del
crecimiento de las células
MV-1-Lu.
Como se puede observar en la Fig. 4 el péptido
P12, procedente de la secuencia del TGF\beta1, es el que presenta
una mayor actividad inhibitoria del TGF\beta1. Con el fin de
estudiar con más detalle el efecto inhibitorio del péptido P12, se
realizó un estudio del efecto de la concentración del péptido sobre
la inhibición de la citoquina, el cual se describe a
continuación.
Se estudió el efecto de la concentración del
péptido P12 sobre la inhibición de la actividad del TGF\beta1.
Debido a que este péptido no fue fácilmente soluble en el medio de
ensayo, se prepararon soluciones o suspensiones madre con una
concentración nominal de péptido (aquella que se hubiera logrado si
el péptido se hubiera disuelto completamente) y a partir de ellas se
tomaron alícuotas que se filtraron o bien se usaron directamente
para los ensayos de
inhibición.
inhibición.
En la Fig. 5 se estudia el efecto inhibitorio de
concentraciones nominales de péptido, antes y después de filtrar. Se
observa que el péptido P12, filtrado y sin filtrar, tiene
prácticamente la misma actividad.
Una vez obtenidos los resultados con el péptido
P12, se decidió alargar el péptido, tanto en sentido
N-terminal como C-terminal, y
estudiar el efecto sobre su actividad. Además, se hicieron
modificaciones en su secuencia para mejorar su solubilidad y
estudiar la importancia de las dos cisteínas de su secuencia sobre
la actividad inhibitoria del TGF\beta1. Los péptidos sintetizados
se indican en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la Fig. 6 se muestran los resultados de la
inhibición del TGF\beta1 por parte de los péptidos de la Tabla
3.
En la Fig. 6 se puede observar que el péptido
P29 es activo. Este péptido engloba al péptido P12 probado
anteriormente y tiene 9 aminoácidos mas hacia el extremo
N-terminal (Fig. 4). Estudios realizados por Quian
SW y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.
89:6290-6294) y por Burmester JK y col. (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. 90:8628-8632) mediante la
utilización de proteínas quiméricas recombinantes identificaron una
región del TGF\beta1 que es necesaria para la actividad de esta
citoquina (aminoácidos 40 a 82 en la secuencia del TGF\beta1
maduro). Se especuló que el péptido P29 (aminoácidos 34 a 56 en la
secuencia del TGF\beta1 maduro), al abarcar una zona mayor que el
péptido P12 (aminoácidos 43 a 56), podría adquirir una estructura
tridimensional más semejante a la estructura del TGF\beta1 en
circulación. Por este motivo se utilizó el péptido P29 para ensayos
de unión a los receptores celulares, basados en el marcaje por
afinidad.
El péptido P29 procedente de la secuencia del
TGF\beta1, se utilizó en los ensayos de marcaje por afinidad para
comprobar su capacidad de inhibición de la unión del TGF\beta1 a
sus receptores celulares (Material y Métodos).
Debido a la diferente actividad de los lotes de
^{125}I-TGF\beta1 empleados, las concentraciones
de péptido utilizadas en los ensayos se ajustaron en función de la
concentración del lote ^{125}I-TGF\beta1
utilizado en cada caso. Los resultados de estos ensayos se muestran
en las Figs. 7 y 8.
Se realizaron ensayos posteriores para encontrar
la concentración mínima necesaria para bloquear la unión del
^{125}I-TGF\beta1 a los receptores
celulares.
Con el propósito de encontrar nuevos péptidos
inhibidores de la actividad del TGF\beta1 se sintetizaron péptidos
procedentes del receptor tipo III de rata. Algunos péptidos se
eligieron en base a zonas de su secuencia que fueron predichas como
complementarias a bloques de aminoácidos de la secuencia del
TGF\beta1. Se esperaba que estos péptidos fueran capaces de unirse
al TGF\beta1 libre, secuestrándolo e impidiendo su unión a los
receptores celulares.
Otros péptidos se sintetizaron solapando 10
aminoácidos y cubriendo parte de la zona extracelular del receptor
tipo III (aminoácidos 45 a 410). Se ha descrito que existe un
receptor tipo III soluble que se corresponde con la zona
extracelular del receptor, esta zona se corta de la membrana y actúa
como un secuestrador del TGF\beta1 en circulación (López Casillas
F. y col. (1991) Cell 67:785-795). Estudios
posteriores han descrito dos posibles zonas de unión al TGF\beta1,
una de ellas se encuentra en el extremo N-terminal
del receptor (López-Casillas y col. (1994) J. Cell
Biol. 124:557-568) y la otra se encuentra en la zona
más próxima a la membrana, hacia el extremo
C-terminal (Fukushima D. y col. (1993) J. Biol.
Chem. 268:22710-22715; Pepin MC y col. (1995) FEBS
Lett 377:368-372). Por estos motivos se sintetizaron
péptidos de la zona extracelular de este receptor, suponiendo que
estos péptidos podrían ser capaces de secuestrar el TGF\beta1
circulante.
En la Tabla 4 se muestran los péptidos
sintetizados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se indica el número del péptido y su secuencia.
P39 a P65 son péptidos predichos como complementarios al TGF\beta1
y P66 a P138 son péptidos solapantes que cubren la región
extracelular del receptor. Por comodidad de síntesis todos los
péptidos se sintetizaron con una alanina añadida en el extremo
C-terminal que no se indica en la tabla.
Los péptidos de la Tabla 4 se ensayaron en
cuanto a su capacidad de bloquear el TGF\beta1 en el modelo de
inhibición de la línea celular
MV-1-Lu. Puesto que el TGF\beta1
es capaz de inhibir el crecimiento de esta línea, la inhibición del
TGF\beta1 por parte de los péptidos sería capaz de restablecer el
crecimiento celular. Estos ensayos se muestran en las Figs. 9 a
12.
Como se puede ver en las Figs. 9 a 12, existen
varios péptidos capaces de inhibir en mayor o menor grado el
crecimiento de la línea celular
MV-1-Lu, aunque sólo el péptido P54
es capaz de inhibir casi por completo la actividad del TGF\beta1.
Con el fin de realizar un estudio más a fondo de este péptido, se
realizaron ensayos utilizando diferentes concentraciones de péptido
frente a una concentración fija de TGF\beta1 de 200 pg/ml.
Se estudió el efecto de la concentración del
péptido P54 sobre la inhibición de la actividad del TGF\beta1.
Debido a la poca solubilidad de este péptido, se prepararon
soluciones madre de concentración nominal de péptido, tal y como se
hizo en el caso del péptido P12, y a partir de ellas se tomaron
alícuotas que se filtraron o bien se usaron directamente para los
ensayos de inhibición.
En la Fig. 13 se estudia el efecto inhibitorio
de concentraciones nominales de péptido, antes y después de filtrar.
Se puede observar que en el filtrado del péptido P54 no hay
actividad inhibitoria medible.
Una vez comprobada la capacidad del péptido P54
de inhibir la actividad del TGF\beta1 de una manera dependiente de
la dosis utilizada, se procedió a sintetizar nuevos péptidos,
tomando como base la secuencia del P54, con el fin de intentar
mejorar la solubilidad y con ello su actividad a dosis más bajas.
También se sintetizaron dos péptidos procedentes del receptor de
tipo III humano. Uno de estos péptidos (P144) es equivalente al
péptido P54. El otro péptido (P145) es similar al péptido P106 del
receptor tipo III de rata, que también había mostrado actividad.
Estos nuevos péptidos se muestran en la Tabla 5.
El ensayo de actividad de los péptidos de la
Tabla 5 se muestra en la Fig. 14.
Se realizó un ensayo dosis respuesta con el
péptido P144 procedente de la secuencia del receptor tipo III
humano, con el fin de comprobar si su actividad era dependiente de
la concentración (Fig. 15). Se puede ver como la actividad del
péptido decae conforme se disminuye la concentración de péptido
utilizada en los ensayos.
El péptido P144 procedente de la secuencia del
receptor tipo III humano se utilizó en los ensayos de marcaje por
afinidad para comprobar su capacidad de inhibición de la unión del
TGF\beta1 a sus receptores celulares (Material y Métodos).
Debido a la diferente actividad de los lotes de
^{125}I-TGF\beta1 empleados, las concentraciones
de péptido utilizadas en los ensayos se ajustaron en función de la
concentración del lote de ^{125}I-TGF\beta1
utilizado en cada caso. Los resultados de estos ensayos se muestran
en la Fig. 15.
Una vez comprobada la inhibición de la unión del
TGF\beta1 a sus receptores celulares mediante el péptido P144, se
realizó un nuevo ensayo con el fin de titular el péptido P144. Se
observó que el péptido perdía su actividad a una concentración de
2x10^{5} veces la concentración molar de
^{125}I-TGF\beta1.
En esta serie se sintetizaron los péptidos de la
Tabla 6, procedentes de proteínas capaces de unirse al
TGF\beta1.
\newpage
Se indica el número del péptido junto a su
posición en la secuencia completa, su secuencia de aminoácidos, así
como su procedencia. Por comodidad de síntesis, todos los péptidos
se sintetizaron con una alanina añadida en el extremo
C-terminal que no se indica en la tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
En las Figs. 17 y 18 se indica la actividad
inhibitoria de los péptidos procedentes de la Tabla 10.
Como puede observarse en las Figs. 17 y 18, sólo
el péptido P150 mostró actividad superior al 50%. Sin embargo, los
péptidos P146 y P149, que habían sido descritos como activos por
Demetriou M y col (1996) J. Biol. Chem.
271:12755-12761, no resultaron activos en las
condiciones utilizadas para este ensayo.
Péptidos procedentes del receptor tipo III, se
utilizaron para medir, por citometría de flujo, su capacidad
inhibitoria de la unión del TGF\beta1 a los receptores celulares.
En estos ensayos las células se incuban con el péptido antes de
añadir el TGF\beta1-biotina que se detectará
utilizando avidina-FITC (Material y Métodos).
Posteriormente se mide la fluorescencia emitida por la
avidina-FITC: ésta será directamente proporcional a
la cantidad de TGF\beta1 unido a las células e inversamente
proporcional a la actividad del péptido. En la Fig. 19 y en la Tabla
7 se indican los resultados obtenidos con los péptidos más
relevantes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiene)
El péptido P144 procedente de la secuencia del
receptor tipo III humano, que había resultado activo en los
bioensayos de inhibición del crecimiento de la línea celular
MV-1-Lu, se utilizó en los ensayos
in vivo para estudiar su efecto inhibitorio en la inducción
de cirrosis experimental con CCl_{4}, en un modelo de ratas.
En este modelo, la cirrosis hepática se induce
mediante inhalación de tetracloruro de carbono, durante 11 semanas,
dos veces por semana (López Novoa JM y col. (1976) Patología
IX:223-240; Camps J. y col. (1987) Gastroenterology
93:498-505) tal y como se describe en Material y
Métodos.
El péptido P144 se administró de acuerdo a dos
protocolos:
1. Protocolo 1: El péptido se administró
en días alternos por vía intraperitoneal durante el proceso de
inducción de la cirrosis (11 semanas). Figs. 20 y 21.
2. Protocolo 2: El péptido se administró
en días alternos por vía intraperitoneal durante 3 semanas, una vez
establecida la cirrosis, es decir a las 12 semanas del inicio de la
inducción de la cirrosis. Figs. 22 y 23.
La producción de colágeno en ambos protocolos se
midió mediante dos técnicas:
En las Figs. 24 y 25 se muestra la producción de
colágeno total medida por tinción de cortes de hígado (dos por
animal) con Fast Green y Direct Red, elución del color
y lectura en espectrofotómetro (Material y Métodos) (López de León
A. y Rojkind, (1985) Histochem. Cytochem.
33:737-743; Gaudio E. y col. (1993) Int. J. Exp.
Path. 74:463-469).
En las Figs. 21 y 23 se muestra la producción de
colágeno, medida por análisis de imagen a partir de cortes de hígado
teñidos con rojo sirio, utilizando microscopía de luz (Material y
Métodos).
Como se puede ver en la Fig. 20, se observan
diferencias significativas (P<0,05) entre el grupo de ratas
tratadas con el péptido P144 (Tto_{1}) y el grupo de ratas
cirróticas control (Ci_{1}) al estudiar el cociente colágeno vs
proteína total. En la Fig. 27, las diferencias entre el grupo de
ratas tratadas con el péptido P144 (Tto_{1}) y el grupo de ratas
cirróticas control (Ci_{1}) también son significativas
(P<0,001) al estudiar el área de fibrosis.
Como se puede observar en las Figs. 22 y 23, en
las que se muestran los resultados de las ratas tratadas una vez
establecida la cirrosis, las diferencias entre los grupos de ratas
tratadas con el péptido P144 (Tto_{2}) y las ratas cirróticas sin
tratar (Ci_{2}) no son significativas cuando se utiliza cualquiera
de las dos técnicas de medición de fibrosis.
Las dos técnicas utilizadas para la medición de
colágeno se compararon entre sí mediante una regresión lineal con el
fin de comprobar la aleatoriedad en la elección de los campos a
estudio en cada preparación y con ello la validez del análisis de
imagen, Figs. 24 y 25.
Como se puede observar en las Figs. 24 y 25,
existe una correlación entre ambas técnicas con una R > 0,85 en
ambos casos, que es altamente significativa (F \leq 0,001). Esto
confirma que la adquisición de las imágenes a estudio se realizó de
forma totalmente aleatoria y con ello se confirma la validez de los
datos obtenidos mediante el análisis de imagen.
En la Figs. 26 y 27 se muestran las imágenes
obtenidas por microscopía de luz a partir de preparaciones de hígado
teñidas con rojo sirio a un aumento de 10X obtenidas a partir de
hígados de ratas tratadas durante el proceso de inducción de la
cirrosis (Ci_{1} y Tto_{1}).
Las imágenes de la Fig. 26 fueron obtenidas sin
aplicar ningún tipo de filtro.
La Fig. 27 muestra las imágenes una vez
modificadas para su estudio mediante un software específico. Estas
modificaciones consisten en la aplicación de dos filtros, uno de luz
polarizada y el otro de luz verde, con el fin de mejorar la calidad
de las imágenes y facilitar su estudio de forma automatizada.
Las Figs. 26 y 27 revelan que existen
diferencias entre las imágenes obtenidas de las ratas cirróticas
(Ci_{1}) y las obtenidas de las ratas tratadas con el péptido P144
(Tto_{1}).
Las diferencias de efectividad entre los
protocolos 1 y 2 podrían ser debidas a que la producción de
TGF\beta1 podría ser mucho menor una vez inducida la cirrosis
(protocolo 2) que durante el proceso de inducción de cirrosis con
CCl_{4} (protocolo 1), e incluso podría estar en niveles normales,
por lo que el efecto del tratamiento con el péptido P144 sería menos
notorio en el protocolo 2 que en el protocolo 1.
Cuando se comparan los grupos de ratas
cirróticas no tratadas, al final del proceso de inducción de la
cirrosis (Ci_{1}) con las ratas cirróticas no tratadas a las 4
semanas de finalizada la inducción (Ci_{2}), se observa que
existen diferencias significativas (P = 0,016) entre ambos grupos
(Fig. 28), lo que indicaría que existe una regresión parcial de la
cirrosis al eliminar el agente cirrotizante, observación que ha sido
publicada por diversos autores (Szende-B y col.
(1992) In Vivo 6:355-361; Columbano A (1996)
Carcinogenesis 17:395-400).
Estas diferencias de efectividad entre los dos
protocolos también podrían ser debidas al propio protocolo, ya que
los animales del protocolo 2 se trataron sólo durante 3 semanas en
días alternos, mientras que los animales del protocolo 1 se trataron
por un periodo más amplio de tiempo (7 semanas, también en días
alternos).
Los resultados obtenidos demuestran que es
posible inhibir al TGF\beta1 tanto in vitro como in
vivo mediante péptidos sintéticos procedentes de diferentes
proteínas. En un futuro sería de gran interés intentar aumentar la
actividad biológica de estos péptidos. Ello podría llevarse a cabo
remplazando sistemáticamente cada uno de los aminoácidos de sus
secuencias por los 19 restantes. Una vez logrado el péptido de mayor
actividad sería necesario preparar mimotopos
(McConnell-SJ (1994) Gene
151:115-118; Steward-MW (1995) J.
Virol. 69:7668-7673)del mismo con el fin de
aumentar la vida media en el organismo del agente inhibidor.
Fig. 1. Inhibición de la unión del TGF\beta1 a
las células MV-1-Lu por el péptido
P144, medida por citometría de flujo. A, imagen obtenida al estudiar
las células incubadas con TGF\beta1 biotinilado y reveladas con
avidina-FITC. B, imagen obtenida al estudiar las
células incubadas con avidina-FITC sin previa
adición de TGF\beta1. C, imagen obtenida al estudiar las células
incubadas con TGF\beta1 previamente incubado con el péptido P144 a
una concentración de 0,42 \mug/\mul, el revelado se realizó con
avidina-FITC. En abscisas se indica la fluorescencia
emitida, mientras que en ordenadas se indica el número de células
para cada valor de fluorescencia. También se indican los campos
correspondientes a las células marcadas con el
TGF\beta1-biotina y avidina-FITC
(M2) y a las células no marcadas (M1).
Fig. 2. Representación esquemática del proceso
de cirrosis por CCl_{4}. Con flechas negras se indica cuándo se
administraron a las ratas dos dosis semanales de CCl_{4} y con
flechas negras discontinuas se indica cuándo fue una dosis semanal.
Las flechas grises indican la administración del péptido P144. A:
Controles sanos; B: Controles sanos + P144, B_{1} : con péptido
70 \mug/día; C: Cirróticas; C_{1} con suero salino; C_{2} con
péptido 70 \mug/día; D: Cirróticas con CCl_{4} + Fenobarbital;
D_{1} más suero salino; D_{2} más péptido 70 \mug/día.
Fig. 3. Efecto del TGF\beta1 sobre el
crecimiento de células MV-1-Lu. Las
células se cultivaron a una densidad de 5000 células/pocillo a las
concentraciones de TGF\beta1 indicadas, en pg/ml. Abscisas:
Concentración de TGF\beta1 (pg/ml); Ordenadas: c.p.m.
Fig. 4. (Comparativa) Porcentaje de inhibición
del TGF\beta1 (200 pg/ml) por péptidos del TGF\beta1. Todos los
péptidos fueron ensayados a la concentración de 200 \mug/ml. Una
inhibición del TGF\beta1 del 100% se corresponde con el
crecimiento de células MV-1-Lu que
se obtiene en ausencia de TGF\beta1.
Fig. 5. (Comparativa) Porcentaje de inhibición
de la actividad del TGF\beta1 (200 pg/ml) en presencia de
distintas concentraciones nominales del péptido P12, filtrado
(\Diamondblack) y sin filtrar (\medbullet).
Fig. 6. (Comparativa) Porcentaje de inhibición
del TGF\beta1 (200 pg/ml) por péptidos del TGF\beta1. Todos los
péptidos fueron ensayados a la concentración de 200 \mug/ml. Una
inhibición del TGF\beta1 del 100% se corresponde con el
crecimiento de células MV-1-Lu que
se obtiene en ausencia de TGF\beta1.
Fig. 7. (Comparativa) Autorradiografía de un
ensayo de marcaje por afinidad de los receptores del TGF\beta1.
Calle C1: efecto de la incubación de las células con una
concentración 0,16 \muM de ^{125}I-TGF\beta1
que se corresponde con una actividad de 0,3 \muCi (control
positivo). Calle C2: efecto de la preincubación de las células con
una concentración de TGF\beta1 no radioactivo 10 veces superior a
la de ^{125}I-TGF\beta1 (control negativo).
Calle C3: la preincubación se realizó con el péptido P29 a una
concentración 10^{6} veces superior a la concentración molar de
^{125}I-TGF\beta1. Se puede observar que hay
inhibición de la unión del ^{125}I-TGF\beta1 a
los receptores celulares tipo I, II y III tanto por parte del
péptido P29 como por el TGF\beta1 no radioactivo.
Fig. 8. (Comparativa) Autorradiografía de un
ensayo de marcaje por afinidad de los receptores del TGF\beta1.
Calles C1 a C6: efecto de la preincubación de las células
MV-1-Lu, con distintas
concentraciones del péptido P29 (10^{6}, 8x10^{5}, 6x10^{5},
4x10^{5}, 2x10^{5}, 10^{5} veces la concentración molar de
^{125}I-TGF\beta1 respectivamente), previa a la
adición del ^{125}I-TGF\beta1. Calle C7: efecto
de la preincubación de las células
MV-1-Lu con TGF\beta1 no marcado
(10^{2} veces la concentración molar de
^{125}I-TGF\beta1) previa a la adición del
^{125}I-TGF\beta1 (control negativo). Calle C8:
efecto de la incubación de las células
MV-1-Lu con una concentración 0,42
\muM de ^{125}I-TGF\beta1, que se corresponde
con una actividad de 0,4 \muCi, sin preincubaciones previas
(control positivo).
Fig. 9. Porcentaje de inhibición del TGF\beta1
(200 pg/ml) por péptidos del receptor predichos como complementarios
a zonas del TGF\beta1. Todos los péptidos fueron ensayados a la
concentración de 200 \mug/ml. Una inhibición del TGF\beta1 del
100% se corresponde con el crecimiento de células
MV-1-Lu que se obtiene en ausencia
de TGF\beta1.
Fig. 10. Porcentaje de inhibición del
TGF\beta1 (200 pg/ml) por péptidos solapantes procedentes de la
zona extracelular del receptor tipo III. Todos los péptidos fueron
ensayados a la concentración de 200 \mug/ml. Una inhibición del
TGF\beta1 del 100% se corresponde con el crecimiento de células
MV-1-Lu que se obtiene en ausencia
de TGF\beta1.
Fig. 11. Porcentaje de inhibición del
TGF\beta1 (200 pg/ml) por péptidos solapantes procedentes de la
zona extracelular del receptor tipo III. Todos los péptidos fueron
ensayados a la concentración de 200 \mug/ml. Una inhibición del
TGF\beta1 del 100% se corresponde con el crecimiento de células
MV-1-Lu que se obtiene en ausencia
de TGF\beta1.
Fig. 12. Porcentaje de inhibición del
TGF\beta1 (200 pg/ml) por péptidos solapantes procedentes de la
zona extracelular del receptor tipo III. Todos los péptidos fueron
ensayados a la concentración de 200 \mug/ml. Una inhibición del
TGF\beta1 del 100% se corresponde con el crecimiento de células
MV-1-Lu que se obtiene en ausencia
de TGF\beta1.
Fig. 13. Porcentaje de inhibición de la
actividad del TGF\beta1 (200 pg/ml) en presencia de distintas
concentraciones nominales del péptido P54, filtrado
(\Diamondblack) y sin filtrar (\medbullet).
Fig. 14. Porcentaje de inhibición del
TGF\beta1 (200 pg/ml) por péptidos del receptor procedentes de la
modificación del péptido P54 (P139 a P143) y de los péptidos
procedentes del receptor tipo III humano (P144 y P145). Todos los
péptidos fueron ensayados a la concentración de 200 \mug/ml. Una
inhibición del TGF\beta1 del 100% se corresponde con el
crecimiento de células MV-1-Lu que
se obtiene en ausencia de TGF\beta1.
Fig. 15. Porcentaje de inhibición de la
actividad del TGF\beta1 (200 pg/ml) en presencia de distintas
concentraciones nominales del péptido P144 sin filtrar.
Fig. 16. Autorradiografía de un ensayo de
marcaje por afinidad de los receptores del TGF\beta1. Calle C1: la
preincubación se realizó con el péptido P144 a una concentración
10^{6} veces superior a la concentración molar de
^{125}I-TGF\beta1. Calles C2 y C3: efecto de la
preincubación de las células con una concentración de TGF\beta1
no radioactivo 10 veces superior a la de
^{125}I-TGF\beta1 (control negativo). Calles C4
y C5: efecto de la incubación de las células con una concentración
0,1 \muM de ^{125}TGF\beta1 que se corresponde con una
actividad de 0,2 \muCi (control positivo). Se puede observar que
hay inhibición de la unión del
^{125}I-TGF\beta1 a los receptores celulares
tanto por parte del péptido P144 como por el TGF\beta1 no
radioactivo.
Fig. 17. Porcentaje de inhibición del
TGF\beta1 (200 pg/ml) por péptidos procedentes del receptor tipo
II humano (P146), de la fetuina (P147 a P149) y de la endoglina
(P150 a P154). Todos los péptidos fueron ensayados a la
concentración de 200 \mug/ml. Una inhibición del TGF\beta1 del
100% se corresponde con el crecimiento de células
MV-1-Lu que se obtiene en ausencia
de TGF\beta1.
Fig. 18. (Comparativa) Porcentaje de inhibición
del TGF\beta1 (200 pg/ml) por péptidos procedentes de la
\alpha2-macroglobulina. Todos los péptidos fueron
ensayados a la concentración de 200 \mug/ml. Una inhibición del
TGF\beta1 del 100% se corresponde con el crecimiento de células
MV-1-Lu que se obtiene en ausencia
de TGF\beta1.
Fig. 19. Porcentaje de inhibición de la unión
del TGF\beta1 a células MV-1-Lu
por diferentes péptidos sintéticos. La inhibición se estudió
midiendo el porcentaje de células marcadas (emiten fluorescencia) y
sin marcar (no emiten fluorescencia) para cada péptido (Material y
Métodos).
Fig. 20. Efecto de la administración del péptido
P144 sobre la síntesis de colágeno durante la inducción de cirrosis
experimental con CCl_{4}. En ordenadas se indica el cociente
colágeno vs proteína total. En abscisas se indican los distintos
grupos de ratas: Co= ratas sanas; Co+P144= ratas sanas tratadas con
el péptido P144; Tto_{1}= ratas sometidas a inducción de cirrosis
con CCl_{4} y a las que se les administró el péptido P144 en días
alternos durante este periodo y Ci_{1}= ratas sometidas a
inducción de cirrosis con CCl_{4} durante 11 semanas y que no
fueron tratadas con el péptido P144.
Fig. 21. Efecto de la administración del péptido
P144 sobre la síntesis de colágeno durante la inducción de cirrosis
experimental con CCl_{4}. En ordenadas se indica el cociente entre
el área de fibrosis y el área total en preparaciones de tejido
teñidas con rojo sirio. En abscisas se indican los distintos grupos
de ratas: Co= ratas sanas; Co+P144= ratas sanas tratadas con el
péptido; Tto_{1}= ratas sometidas a inducción de cirrosis con
CCl_{4} y a las que se les administró el péptido P144 en días
alternos durante este periodo y Ci_{1}= ratas sometidas a
inducción de cirrosis con CCl_{4} durante 11 semanas y que no
fueron tratadas con el péptido P144.
Fig. 22. Efecto de la administración del péptido
P144 sobre la síntesis de colágeno una vez inducida la cirrosis con
CCl_{4}. En ordenadas se indica el cociente colágeno vs proteína
total. En abscisas se indican los distintos grupos de ratas: Co=
ratas sanas; Co+P144= ratas sanas tratadas con el péptido;
Tto_{2}= ratas sometidas a inducción de cirrosis con CCl_{4} y a
las que se les administró el péptido P144 en días alternos al final
de este periodo y Ci_{2}= ratas sometidas a inducción de cirrosis
con CCl_{4} durante 11 semanas y que no fueron tratadas con el
péptido P144.
Fig. 23. Efecto de la administración del péptido
P144 sobre la síntesis de colágeno una vez inducida la cirrosis con
CCl_{4}. En ordenadas se indica el cociente entre el área de
fibrosis y el área total en preparaciones de tejido. En abscisas se
indican los distintos grupos de ratas: Co= ratas sanas; Co+P144=
ratas sanas tratadas con el péptido; Tto_{2}= ratas sometidas a
inducción de cirrosis con CCl_{4} y a las que se les administró el
péptido P144 en días alternos al final de este periodo y Ci_{2}=
ratas sometidas a inducción de cirrosis con CCl_{4} durante 11
semanas y que no fueron tratadas con el péptido P144.
Fig. 24. Comparación entre los datos sobre
cantidad de colágeno y área de fibrosis, obtenidos mediante las dos
técnicas utilizadas. En abscisas se indican los valores del cociente
entre el área de fibrosis y el área total, obtenidos mediante el
análisis de imagen. En ordenadas se indican los valores del cociente
entre los \mug de colágeno y los mg de proteína total, obtenidos
mediante el análisis por espectrofotometría de cortes de hígado
teñidos con "Direct Red y Fast Green". Se indica la R^{2}. (F
\leq 0,001).
Fig. 25. Comparación entre los datos sobre
cantidad de colágeno y área de fibrosis, obtenidos mediante las dos
técnicas utilizadas para el estudio de las muestras al final del
protocolo 2. En abscisas se indican los valores del cociente entre
el área de fibrosis y el área total, obtenidos mediante el análisis
de imagen. En ordenadas se indican los valores del cociente entre
los \mug de colágeno y los mg de proteína total, obtenidos
mediante el análisis por espectrofotometría de cortes de hígado
teñidos con "Direct Red y Fast Green". Se indica la R^{2}. (F
\leq 0,001).
Fig. 26. Imágenes representativas de los 24
campos obtenidos por microscopía de luz (10X) a partir de
preparaciones de hígados de ratas teñidas con rojo sirio. Ratas
cirróticas (Ci_{1}) al final de la inducción de cirrosis con
CCl_{4} y ratas cirróticas tratadas (Tto_{1}) con el péptido
P144 durante el proceso de inducción de la cirrosis con CCl_{4}.
Se tomaron diferentes campos a partir de las preparaciones obtenidas
de cada animal (R= rata y C= campo).
Fig. 27. Imágenes representativas de los 24
campos obtenidos por microscopía de luz (10X) a partir de
preparaciones de hígados de ratas teñidas con rojo sirio. Ratas
cirróticas (Ci_{1}) al final de la inducción de cirrosis con
CCl_{4} y ratas cirróticas tratadas (Tto_{1}) con el péptido
P144 durante el proceso de inducción de la cirrosis con CCl_{4}.
Se tomaron diferentes campos a partir de las preparaciones obtenidas
de cada animal (R= rata y C= campo). Se utilizaron luz polarizada y
un filtro verde con el fin de resaltar las fibras de colágeno.
Fig. 28. Comparación entre los dos grupos de
ratas cirróticas no tratadas. Ci_{1} son ratas cirróticas al final
de las 12 semanas de inducción de la cirrosis con CCl_{4},
Ci_{2} son ratas cirróticas a las 4 semanas del final del proceso
de inducción de la cirrosis. P = 0,016. Ordenadas: Área
fibrosis/Área total.
<110> Instituto Científico y Tecnológico
de Navarra (ICTN)
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Péptidos inhibidores de
TGF\beta1
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Dominio
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Procedente de TGF\beta1, posición
319-333 (Comparativo)
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr
Ile Trp}
\sac{Ser Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Dominio
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Procedente de TGF\beta31, posición
322-335 (Comparativo)
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser
Leu Asp}
\sac{Thr}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Dominio
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Deducido como complementario a
TGF\beta1, posición 731-742
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ser Leu Asp Ala Thr Met Ile Trp Thr Met
Met}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Dominio
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Solapado con la región extracelular
del receptor tipo III de rata, posición 245-259
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe G1n Val Asp Ile
Ile Val}
\sac{Asp Ile}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Dominio
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Modificación P54 deducido como
complementario a TGF\beta1, posición 731-742
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ser Leu Met Ile Trp Thr Met Met}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Dominio
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Procedente del receptor tipo III
humano modificado, posición 729-742
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ser Leu Asp Ala Ser Ile Ile Trp Ala Met
Met Gln}
\sac{Asn}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Dominio
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Procedente del receptor tipo III
humano modificado,posición 241-254
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe G1n Val Asp Ile
Thr Ile}
\sac{Asp}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Dominio
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Posición 247-261 de
la Endoglina
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ala Val Leu Ile Leu G1n Gly Pro Pro Tyr
Val Ser}
\sac{Trp Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Dominio
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Posición 445-459 de
la Endoglina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Asp Ser Leu Ser Phe G1n Leu Gly Leu Tyr
Leu Ser}
\sac{Pro His}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Dominio
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Modificación P12, situación
322-335 de TGF\beta1(comparativo)
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys
Leu Gly}
\sac{Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp
Thr}
Claims (4)
1. Un péptido antagonista de la unión del
TGF-beta 1 al receptor tipo III del
TGF-beta 1 o a la endoglina, caracterizado
porque dicho péptido tiene una longitud de 9-15
aminoácidos y se selecciona del grupo que consiste en:
- a)
- un péptido que comprende un fragmento de SEQ ID NO. 3, consistiendo dicho fragmento en al menos 6 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO. 3,
- b)
- un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3,
- c)
- un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO, 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6 y SEQ ID NO. 7, y
- d)
- un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 8 o SEQ ID NO. 9.
2. Uso de al menos uno de los péptidos de la
reivindicación 1, para fabricar una composición farmacéutica útil
para el tratamiento de enfermedades hepáticas.
3. Uso de al menos un ADN que codifica al menos
uno de los péptidos de la reivindicación 1, para fabricar una
composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades
hepáticas.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
2 ó 3, en el que la composición farmacéutica fabricada es útil para
el tratamiento de la fibrosis hepática.
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