ES2262359T3 - Particulas tipo virus sinteticas con epitores heterologos. - Google Patents
Particulas tipo virus sinteticas con epitores heterologos.Info
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Abstract
Una proteína L1 del VPH 6 que comprende un epitope conformacional de una proteína L1 del VPH 11, en el que la proteína L1 del VPH 6 comprende mutaciones en las localizaciones seleccionadas entre: (i) K169, T172, P175 y A178; (ii) T345, T346 y S348; (iii) F49, R53 y A54; y (iv) E262, T270, S276, G277, T280, G283 y N289.
Description
Partículas tipo virus sintéticas con epitopes
heterólogos.
La presente invención se dirige a partículas
tipo virus (VLP, Virus-Like Particles)
recombinantes del virus del papiloma que comprenden epitopes
conformacionales neutralizantes heterólogos. Esta invención también
incluye ácidos nucleicos codificantes de estas partículas VLP y los
análisis que emplean estas partículas VLP sintéticas.
Los tipos 6 y 11 del virus del papiloma humano
(VPH) son los agentes causantes de más del 90% del total de
condilomas genitales y papilomas laríngeos. El VPH es un virus de
ADN que se encuentra dentro de una cápsida compuesta principalmente
de proteína L1. Las proteínas L1 de los tipos 6 y 11 del VPH son muy
similares tanto a nivel de aminoácidos como a nivel de nucleótidos.
Por consiguiente, ha sido difícil desarrollar análisis que
distingan con fiabilidad estos dos tipos de infección.
Los residuos de la L1 del VPH 11
Gly^{131}-Tyr^{132} fueron previamente
identificados como los responsables de la unión con especificidad
de tipo de varios anticuerpos monoclonales neutralizantes del VPH 11
(Ludmerer et al. 1996 "Two Amino Acid Residues Confer Type
Specificity to a Neutralizing, Conformationally Dependent Epitope
on Human Papillomavirus Type 11". J. Virol. 70:
4791-4794). Dentro de este mismo trabajo, se
demostró además que una sustitución del Ser^{346} de la secuencia
L1 del VPH 11 reducía drásticamente la unión del anticuerpo
monoclonal neutralizante H11.H3, y que el efecto era específico de
este anticuerpo. Otros estudios demostraron que varios anticuerpos
neutralizantes del VPH 11 se unían a un tramo de la secuencia L1 del
VPH 11 entre los residuos 120-140, mientras que el
H11.H3 se unía a un sitio completamente distinto (Ludmerer et
al. 1997 "A Neutralizing Epitope of Human Papillomavirus Type
11 is Principally Described by a Continuous Set of Residues which
Overlap a Distinct Linear, Surface-Exposed
Epitope". J. Virol. 71: 3834-3839).
La solicitud de patente relacionada,
WO-A-9718301 (Merck & Co., Inc.)
revela clones de L1 del VPH 6 genéticamente mutados en ciertos
residuos aminoacídicos para que coincidan con la secuencia de L1 del
VPH 11 como sigue: 131, 245, 277 con una tirosina añadida detrás de
131 (VPH 6:4); VPH 6:4\Delta132; VPH 6:4; G131S; 132, 245, 277 y
345 (VPH 6:4b); añadiendo un cambio al VPH 6:4 para que el residuo
345 coincidiera con 346 del VPH 11 (VPH 6:5); añadiendo un cambio
al VPH 6:4b y al VPH 6:5 para que el residuo 438 coincidiera con 439
del VPH 11 (VPH 6:5b y VPH 6:6); un clon con mutaciones en 245 y
277; y un clon mutado en 131 y 132 (VPH 6:2).
Sin embargo, estos estudios no definieron
completamente qué residuos aminoacídicos confieren una unión con
especificidad de tipo para el anticuerpo H11.H3. Además, puede haber
otras regiones de las partículas VLP del VPH 11, no descritas en
estos estudios, que pueden provocar importantes respuestas
conformacionalmente dependientes específicas del VPH 11. Es más,
también se han generado anticuerpos dependientes de las partículas
VLP específicos del VPH 6 (Christensen et al. 1996,
"Monoclonal Antibodies to HPV-6 L1
Virus-Like Particles Identify Conformational and
Linear Neutralizing Epitopes on HPV-11 in Addition
to Type-Specific Epitopes on
HPV-6" Virology 224(2):
477-486). Estos anticuerpos podrían ser útiles en la
evaluación de la infectividad generada por el VPH 6. Sería deseable
determinar los aminoácidos exactos implicados en la especificidad de
las formaciones de epitopes conformacionales específicos del VPH
tipo 6 y del VPH tipo 11 adicional, de manera que sea posible
desarrollar mejores análisis y vacunas.
Esta invención se dirige a una proteína L1
recombinante del virus del papiloma de un primer subtipo que
comprende un epitope conformacional de una proteína L1 del virus
del papiloma de un segundo subtipo. Preferiblemente, la proteína L1
forma parte de una partícula tipo virus (VLP). En algunas
realizaciones, el virus del papiloma es un virus del papiloma
humano (VPH). En una realización específica de esta invención, una
proteína L1 del virus del papiloma humano comprende un epitope
conformacional heterólogo del VPH 6. En otra realización específica
de esta invención, una proteína L1 del virus del papiloma humano
comprende un epitope conformacional heterólogo del VPH 11.
Otro aspecto de esta invención es el de ácidos
nucleicos codificantes de estas proteínas L1 heterólogas,
particularmente ADN.
Otro aspecto de esta invención es el de análisis
que emplean las partículas tipo virus sintéticas.
Otro aspecto de esta invención es el de vacunas
que comprenden ácidos nucleicos y/o proteínas codificadas por los
ácidos nucleicos, en el que las proteínas comprenden un epitope
conformacional heterólogo.
La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
para la proteína L1 de los mutantes de VPH 6 y VPH 11 utilizados en
estos estudios.
La figura 2 son gráficas que muestran que las
sustituciones de aminoácidos en posiciones de importancia
fundamental dentro de la secuencia L1 del VPH6 eliminan la unión de
los anticuerpos monoclonales H6.B10.5, H6.M48 y H6N8. En la primera
gráfica, la barra situada más a la izquierda corresponde a H6.B10.5;
la segunda barra a H6.M48; la tercera barra a H6.C6 y la barra
situada más a la derecha corresponde a H6.J54. En la segunda
gráfica, la barra de la izquierda corresponde a H6.N8 y la de la
derecha a H6.C6.
La figura 3 muestra sustituciones de la
secuencia L1 del VPH 11 que confieren unión de los anticuerpos
monoclonales específicos del VPH 6 H6.B10.5, H6.M48 y H6.N8. La
barra situada más a la izquierda corresponde a H6.B10.5; la
siguiente barra corresponde a H6.M48; la siguiente barra corresponde
a H6.N8 y la barra situada más a la derecha corresponde a
H6.C6.
La figura 4 muestra que tres sustituciones de
aminoácidos en la secuencia L1 del VPH 6 entre los residuos 345 y
348 confieren la unión de los anticuerpos monoclonales del VPH 11
H11.G3 y H11.H3. También muestra que siete sustituciones entre los
residuos 262 y 289 también confieren la unión del anticuerpo
monoclonal del VPH 11 H11.G3. La barra situada más a la izquierda
corresponde a H11.H3; la segunda barra corresponde a H11.B2; la
tercera barra corresponde a H11.G3 y la barra situada más a la
derecha corresponde a H11.C6.
La figura 5 muestra que tres sustituciones en la
secuencia del VPH 6 entre los residuos 49 y 54, o que cuatro
sustituciones en la secuencia del VPH 6 entre los residuos 169 y 178
confieren la unión del anticuerpo monoclonal del VPH 11 H11.A3.2.
La barra situada más a la izquierda corresponde a H11.A3.2; la barra
del medio corresponde a H11.B2 y la barra de la derecha corresponde
a H11.C6.
Como se usan a lo largo de esta memoria y de las
reivindicaciones, los residuos aminoacídicos (tipo salvaje) reciben
una denominación de dos partes que es (i) la abreviatura de
aminoácido estándar de una letra del residuo de tipo salvaje,
seguida por (ii) la posición del aminoácido en la proteína L1. Los
residuos especificados en este formato también serían para un tipo
de VPH determinado. Por ejemplo, "VPH 6 K53" significa el
residuo de lisina de la posición 53 de la L1 del VPH 6.
Como se usan a lo largo de esta memoria y de las
reivindicaciones, los aminoácidos mutados reciben una denominación
de tres partes que es (i) la abreviatura de aminoácido estándar de
una letra del aminoácido de tipo salvaje, (ii) la posición del
aminoácido en la proteína L1 de un determinado tipo de VPH e (iii)
la abreviatura de una letra para el aminoácido que ahora está
presente. Por ejemplo, "T345S" del VPH 6 significa que el
residuo de treonina, que normalmente está presente en la posición
345 de la proteína L1 del VPH 6, ha sido cambiado a serina.
Los anticuerpos monoclonales referidos a lo
largo de esta memoria se encuentran enumerados a continuación
(todos fueron obtenidos del Dr. Neil Christensen de la Universidad
del estado de Pensilvania, Hershey, PA).
H6.B10.5: este anticuerpo es específico de la
proteína L1 del VPH 6 en las partículas VLP.
H6.M48: este anticuerpo es similar al H6.B10.5
en tanto en cuanto se une a la proteína L1 del VPH 6 en las
partículas VLP.
H6.N8: este anticuerpo es similar al H6.B10.5 en
tanto en cuanto se une a la proteína L1 del VPH 6 en las partículas
VLP.
H11.G3: este anticuerpo es específico de las
partículas VLP del VPH 11 y su unión es conformacionalmente
dependiente.
H11.H3: este anticuerpo es específico de las
partículas VLP del VPH 11 y es neutralizante. Se sabe que el
residuo S346 de la L1 del VPH 11 es de una importancia fundamental
para la unión del H11.H3, y que una sustitución en esta posición no
afecta a la unión de los anticuerpos dependientes de las partículas
VLP específicos del VPH 11, que está demostrado que se unen a otros
sitios.
H6.J54: este anticuerpo se une a las partículas
VLP tanto del VPH 6 como del VPH 11, pero no lo hace a las de otros
tipos de VPH.
H6.C6: este anticuerpo se une a las partículas
VLP tanto del VPH 6 como del VPH 11; también se une a material
tanto nativo como desnaturalizado. Puede ser usado para determinar
la producción total de L1.
H11.A3: este anticuerpo se une específicamente a
las partículas VLP del VPH 11, pero en una región diferente que
bien el H11.B2 o el H11.H3.
H11.B2: similar al H11.A3 en tanto en cuanto se
une específicamente a las partículas VLP del VPH 11, pero en una
región diferente que bien el H11.H3 o el H11.A3.
Para desarrollar un análisis que distinguiera
las respuestas del VPH 6 y las del VPH 11, había que determinar los
residuos aminoacídicos que confieren una especificidad de tipo
antigénico a los subtipos del VPH. Por lo tanto, nos centramos en
las regiones del VPH 6 que tienen múltiples divergencias con
respecto al VPH 11 dentro de un tramo corto. Para hacer más
eficiente el procedimiento de análisis, se sintetizaron mutantes
del VPH 6 que estaban múltiplemente mutados en estas regiones, y las
partículas VLP producidas a partir de ellos fueron luego analizadas
en cuanto a los efectos sobre la unión de los anticuerpos.
Para construir las partículas VLP de esta
invención, había que determinar los residuos aminoacídicos que
constituyen los epitopes conformacionales en los que se unen los
anticuerpos monoclonales dependientes de las partículas VLP con
especificidad de tipo. Esto se consiguió mapeando los sitios de
unión de los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a
las partículas VLP de bien el VPH 6 o del VPH 11. La proteína L1 de
bien el VPH 6 o del VPH 11 fue modificada introduciendo
sustituciones aminoacídicas en diversas posiciones y luego
determinando si la proteína mutante se uniría a los anticuerpos
monoclonales específicos bien del VPH 6 o del VPH 11. El mapeado
fue reforzado mediante la demostración de la transferencia de unión
de un monoclonal de uno de estos tipos al otro tipo que había sido
modificado en grado mínimo. Se demostró que las partículas VLP
modificadas usadas para estas transferencias conservan la unión de
otros anticuerpos con especificidad de tipo.
Según esta invención, se ha descubierto que la
proteína L1 del VPH 6 con tres sustituciones de tipo L1 del VPH 11,
en T345, T346 y S348 produce partículas VLP que se unen a los
anticuerpos monoclonales específicos del VPH 11 H11.G3 y H11.H3.
Estos dos anticuerpos se pueden distinguir en que el H11.G3, pero no
el H11.H3, también se puede unir a las partículas VLP del VPH 6 que
contienen siete sustituciones entre los residuos 262 y 290. En
realizaciones específicas de esta invención, las sustituciones son
T345S, T346K y S348A.
Además, observamos que la proteína L1 del VPH 6,
bien con tres sustituciones de tipo L1 del VPH 11 entre los
aminoácidos 49 y 54 (en F49, R53 y A54) o con cuatro sustituciones
de tipo L1 del VPH 11 entre los residuos 169 y 178 (en K169, T172,
P175 y A178) puede unirse al anticuerpo monoclonal dependiente de
las partículas VLP y específico del VPH 11 H11.A3.2. En
realizaciones específicas de esta clase de mutantes, las
sustituciones son (i) la combinación de F49Y, R53K y A54V; e (ii)
K169T, T172S, P175S y A178N.
Por lo tanto, un aspecto de esta invención es
una proteína L1 de VPH 6 recombinante que también presenta un
epitope conformacional neutralizante principal del VPH 11. En una
realización preferida, el epitope conformacional comprende T345S,
T346K y S348A. Estas regiones completas pueden ser transferidas a
otros tipos de VPH mediante alineamiento, generando herramientas
más perfeccionadas para un análisis serológico. Por lo tanto, esta
invención comprende cualquier tipo de virus del papiloma que
comprende un epitope conformacional neutralizante heterólogo del
VPH 11 mapeado en estos estudios.
Esta invención también incluye proteínas L1 del
VPH 6 con sustituciones de tipo VPH 11 entre los residuos
49-54; 169-178 y
261-290, específicamente en (i) F49, R53 y A54; (ii)
K169, T273, P175 y A178; e (iii) E262, T270, S276, G277, T280, G283
y N289. En realizaciones específicas de esta clase de mutantes, las
sustituciones son: (i) F49Y, R53K y A54V; (ii) K169T, T273S, P175S
y A178N; e (iii) E262T, T270D, S276G, G277N, T280S, G283A y N289H.
Estas porciones de la proteína comprenden parte del epitope para los
anticuerpos monoclonales dependientes de las partículas VLP
específicos del VPH 11 H11.A3.2 y H11.G3.
Otro aspecto de esta invención es el de ácidos
nucleicos que codifican las proteínas L1 que comprenden los
epitopes conformacionales heterólogos tratados anteriormente,
incluyendo el epitope conformacional del VPH 11 T345S, T346K y
S348A. Como la proteína L1 y las secuencias de ácidos nucleicos son
conocidas en general, pertenece al alcance de aquellos expertos
habituales en la técnica insertar las mutaciones descritas en la
presente memoria usando técnicas convencionales de ingeniería de
proteínas / ingeniería genética. En una realización preferida, el
ácido nucleico es un ADN, y los codones pueden ser optimizados para
aumentar la expresión vírica para una célula huésped dada.
Otros aspectos de esta invención incluyen
vectores tales como plásmidos que contienen los ácidos nucleicos
codificantes de las proteínas L1 que comprenden un epitope
conformacional del VPH 11 heterólogo. También se incluyen en esta
invención células huésped, particularmente células de levadura, de
bacterias, de insectos y de mamíferos que contienen un ácido
nucleico codificante de una proteína L1 que comprende un epitope
conformacional del VPH 11, esté o no presente en un vector.
En otro aspecto de esta invención, los epitopes
del VPH 6 fueron transferidos al VPH 11. En esta realización la L1
del VPH 11 modificada con dos sustituciones (en Y49 y K53) muestra
un aumento aproximadamente 10 veces mayor en la unión del
anticuerpo monoclonal específico del VPH 6 H6.N8. En el caso del
H6.N8, el nivel de unión fue comparable al observado con las
partículas VLP del VPH 6 prototipo. Esto demuestra que parte del
epitope, incluyendo su especificidad por el tipo 6, está definida
por estos residuos y los residuos circundantes. Las sustituciones
preferidas son las de una combinación de Y49F y K53R.
Otra proteína L1 heteróloga del VPH 11 comprende
tres cambios: en Y49, K53 y V54. La L1 del VPH 11 modificada con
estos tres cambios muestra una unión aproximadamente 4 veces mayor
con respecto al fondo a los anticuerpos monoclonales específicos
del VPH 6 H6.B10.5 y H6.M48, además de unirse al anticuerpo
monoclonal H6.N8 como se trata anteriormente. En realizaciones
específicas de esta clase de mutantes, las sustituciones son Y49F,
K53R y V54A.
Otro mutante de la L1 del VPH 11 engloba siete
cambios en dos regiones (49-54 y
170-179). Estos cambios están en las posiciones
Y49, K53, V54, T170, S173, S176 y N179. La L1 del VPH 11 modificada
con estas siete sustituciones muestra una unión a los anticuerpos
H6.B10.5; H6.M48 y H6.N8 comparable con la observada con las
partículas VLP del VPH 6 prototipo. Estos epitopes del VPH 6 pueden
trasladarse a cualquier tipo de VP deseado. En realizaciones
preferidas, las sustituciones son los residuos del VPH 6 F49, R53,
A54, K169, T172, P175 y A178, colocadas en posiciones equivalentes
del tipo de L1 del VP seleccionado mediante alineamiento.
Otro aspecto de esta invención es el de ácidos
nucleicos codificantes de proteínas L1 que comprenden un epitope
conformacional heterólogo, incluyendo (ii) la combinación de Y49F y
K53R, (iii) la combinación de Y49F, K53R y V54A, (iv) la
combinación de Y49F, K53R, V54A, T170K, S173T, S276P y N179A; y (v)
combinaciones de (ii), (iii) y/o (iv). Como la proteína L1 y las
secuencias de ácidos nucleicos son conocidas en general, pertenece
al alcance de aquellos expertos habituales en la técnica insertar
las mutaciones descritas en la presente memoria usando técnicas
convencionales de ingeniería de proteínas / ingeniería genética. En
una realización preferida, el ácido nucleico es un ADN, y los
codones pueden ser optimizados para aumentar la expresión vírica
para una célula huésped dada. Otros aspectos de esta invención
incluyen vectores tales como plásmidos que contienen los ácidos
nucleicos codificantes de las proteínas L1 que comprenden un epitope
conformacional del VPH 6 heterólogo. También se incluyen en esta
invención células huésped, particularmente células de levaduras, de
bacterias, de insectos y de mamíferos que contienen un ácido
nucleico codificante de una proteína L1 que comprende un epitope
conformacional del VPH 6, esté o no presente en un vector.
Otro aspecto de la invención es la generación de
partículas VLP que puedan provocar respuestas tanto al VPH 6 como
al VPH 11. Las partículas VLP del VPH 6 que contienen sustituciones
de tipo VPH 11 T345S, T346K y S348A presentarán un epitope
neutralizante del VPH 11 principal junto a todas las respuestas al
VPH 6. Las partículas VLP del VPH 11 modificadas para que contengan
sustituciones de VPH 6, tales como la combinación de Y49F y K53R;
la combinación de Y49F, K53R y V54A; o la combinación de Y49F, K53R,
V54A, T170K, S173T, S176P y N179A presentarán el epitope
conformacional específico del VPH 6 conocido junto a la mayoría de
los epitopes del VPH 11, incluyendo los epitopes neutralizantes
principales. Lo último es importante en tanto en cuanto todos los
epitopes neutralizantes conocidos son conformacionalmente
dependientes, y se cree que la dependencia conformacional es una
propiedad necesaria de tales epitopes.
Debido a la elevada identidad entre las
secuencias L1 del VPH 11 y del VPH 6 de tipo salvaje, los análisis
serólogicos actuales no pueden distinguir las respuestas entre estos
dos tipos muy bien. Las partículas VLP modificadas de esta
invención identificarán las respuestas inmunológicas al VPH 6 y VPH
11 ante la infectividad o la inmunización. Las partículas VLP que
provocan respuestas neutralizantes a ambos tipos pueden simplificar
la elaboración de vacunas y descender los costes para el
consumidor.
Otro aspecto de esta invención es el de vacunas
que comprenden bien proteína L1 que comprende un epitope
conformacional heterólogo o el ácido nucleico que codifica estas
proteínas. En realizaciones específicas, la proteína comprende
tanto un epitope del VPH 6 como del VPH 11; cualquiera o ambos puede
ser heterólogo. Esta vacuna conferirá protección frente a la
infección de ambos tipos del VPH, pues se producen los anticuerpos
neutralizantes para ambos epitopes víricos. La vacuna basada en
proteínas puede ser formulada según técnicas convencionales de
formulación de vacunas, e incluye componentes tradicionalmente
conocidos tales como adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables. Esta vacuna puede ser administrada intranasal,
intravenosa, intramuscular o subcutáneamente, bien con o sin una
dosis de refuerzo. Asimismo, las vacunas basadas en ácidos
nucleicos, o específicamente, las vacunas de ADN pueden ser
formuladas y administradas de forma similar.
Los siguientes ejemplos son proporcionados para
definir más a fondo la invención, pero sin limitar la misma a los
detalles de estos ejemplos.
Ejemplo
1
Se clonaron los genes estructurales de la L1
del VPH 6 y de VPH 11 a partir de aislados clínicos usando una PCR
con cebadores diseñados a partir de la secuencia L1 publicada.
Posteriormente, se subclonaron los genes L1 tanto en BlueScript
(Pharmacia) para mutagénesis como en pVL1393 (Stratagene) para la
expresión en células Sf9.
Las mutaciones fueron introducidas en el gen L1
usando el equipo de mutagénesis in vitro Amersham Sculptor
según las recomendaciones del fabricante. El aspecto de la mutación
deseada fue confirmado mediante secuenciación, y el gen mutado fue
subclonado en el pVL1393 para la expresión en células Sf9.
Ejemplo
2
Las células SF9 fueron transfectadas usando el
equipo de transfección BaculoGold (Pharmingen). Las transfecciones
fueron realizadas esencialmente según las instrucciones del
fabricante con las siguientes modificaciones. Se transfectaron 8 x
10^{8} células Sf9 en un plato 100 mM con 4 \mug de ADN
BaculoGold y 6 \mug de ADN de análisis. Las células fueron
cosechadas tras 6 días y analizadas en cuanto a la producción de
partículas VLP.
\newpage
Ejemplo
3
Las células fueron cosechadas seis días después
de la transfección, mediante raspado seguido por una centrifugación
a baja velocidad. Se resuspendieron las células en 300 ml de tampón
de ruptura (NaCl 1 M; Tris 0,2M, pH 7,6) y se homogeneizaron
durante 30 minutos sobre hielo usando Polytron PT 1200 B con una
sonda PT-DA 1205/2-A (Brinkman) en
un tubo Falcon 1259. Se hicieron girar las muestras a 2.500 rpm
durante 3 minutos para aglomerar los restos. Se lavaron los tubos
con 150 ml más de tampón de ruptura, se recogieron los sobrenadantes
en un tubo Microfuge de 1,5 ml y se volvieron a hacer girar durante
5 minutos en un tubo Microfuge de Eppendorf (Brinkman). Se
recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a 4ºC hasta su uso.
Los ensayos ELISA fueron realizados comúnmente el mismo día, aunque
las muestras pueden ser congeladas sobre hielo seco, almacenadas a
-80ºC, descongeladas y analizadas según convenga.
Se diluyeron 5 ml de extracto en 50 ml de BSA al
1% en PBS (solución salina tamponada con fosfato; NaPO_{4} 20 mM,
pH 7,0; NaCl 150 mM) y se colocaron sobre una placa de poliestireno.
Se incubó la placa durante toda la noche a 4ºC. Se separaron los
extractos y se bloqueó la placa con leche en polvo al 5% en PBS.
Todas las etapas de lavado posteriores fueron realizadas con BSA al
1% en PBS. La placa fue incubada a temperatura ambiente con
anticuerpo primario durante 1 hora. Los anticuerpos primarios
(anticuerpos monoclonales generados frente a viriones del VPH 11,
partículas VLP del VPH 11 o partículas VLP del VPH 6) fueron
obtenidos como patrón de ascitis del Dr. Neil Christensen
(Universidad del estado de Pensilvania). Fueron diluidos 10^{5}
veces en BSA al 1% en PBS antes de su uso. Tras un lavado, las
placas fueron incubadas durante 1 hora con anticuerpo secundario.
El anticuerpo secundario, anti IgG (\gamma) de ratón en cabra
marcado con peroxidasa, fue adquirido en Kirkegaard & Perry
Laboratories, Inc. y fue usado en dilución 10^{3} en BSA al 1% en
PBS. Tras un último lavado, se realizó un análisis con peroxidasa
de rábano picante y se leyó la absorbancia a 450 nm.
Ejemplo
4
Predecimos que un anticuerpo monoclonal
específico del VPH 6 (uno que no se une a partículas VLP del VPH 11
estrechamente relacionadas) se uniría a una región en la que hay
varios residuos adyacentes o casi adyacentes entre los genes L1 de
los tipos 6 y 11. Excluyendo el terminal C (se ha observado que el
terminal C no es esencial para la formación de partículas VLP), hay
cinco de tales regiones. Mediante el uso de procedimientos
estándar, generamos clones de prueba que tenían múltiples
sustituciones de tipo 11 en cada una de estas cinco regiones. Sólo
el clon 1393:6:49-53, que alberga sustituciones en
los residuos de L1 49 y 53 (F49Y, R53K) produjo partículas VLP que
tenían un efecto sobre la unión de H6.B10.5, H6.M48 y H6.N8. La
unión del anticuerpo de reacción cruzada con el VPH 11 H6.J54,
también dependiente de las partículas VLP, no fue afectada, lo que
demostró la presencia de partículas VLP.
Ejemplo
5
Basándose en los estudios del ejemplo 4,
generamos mutantes de la L1 del VPH 11 con sustituciones de tipo
VPH 6 en las posiciones de los 60 primeros residuos en las que las
dos secuencias L1 difieren. También generamos mutantes del VPH 11
con una única sustitución bien en Y49F o en K53R. Un tercer clon del
VPH 11 albergaba tres sustituciones de tipo VPH 6 entre los
residuos 49 a 54 (Y49F, K53R y V54A) y un cuarto clon albergaba
tres sustituciones de tipo VPH 6 entre los residuos 49 a 54 y 4
sustituciones entre los residuos 170 a 180 (Y49F, K53R, V54A y
T170K, S173T, S176P, N179A).
Ambos clones 1393:11:K53R y 1393:11:Y49F,K53R
generaron partículas VLP que produjeron una unión aproximadamente
10 veces mayor que el fondo del anticuerpo monoclonal específico del
VPH 6 H6.N8. Un clon adicional, 1393:11:Y49F,K53R,V54A, generó
partículas VLP que mostraron una unión aproximadamente cuatro veces
mayor que el fondo de los anticuerpos monoclonales H6.B10.5 y
H6.M48.
El anticuerpo H6.C6 es de reacción cruzada entre
las L1 del tipo 6 y 11, y se une tanto a material nativo como
desnaturalizado. Por lo tanto, es una medida de la producción total
de L1. Normalizado con respecto a la producción de L1, el nivel de
unión de H6.N8 fue comparable al observado con las partículas VLP
del VPH 6 prototipo. Las partículas VLP producidas a partir del
clon 1393:11:49-54, 170-180, que
albergaba siete sustituciones de tipo VPH 6 sobre dos áreas
distintas de L1 (Y49F, K53R, V54V; y T170K, S173T, S176P, N179A),
mostraron un nivel de unión a los anticuerpos H6.B10.5, H6.M48 y
H6.N8 que era comparable al observado con las partículas VLP del
VPH 6 prototipo.
Se sabe que los anticuerpos H11.B2 y H11.H3,
ambos específicos del tipo 11 y dependientes de las partículas VLP,
se unen a otras regiones de la secuencia L1. Por consiguiente, estas
sustituciones en el terminal N no deberían afectar a su unión. Se
unen a estos constructos mutados N-terminalmente,
demostrando así que estas sustituciones
N-terminales no tenían ningún efecto sobre el
ensamblaje de las partículas VLP o sobre la presentación de
epitopes neutralizantes del VPH 11 de importancia fundamental.
Este resultado es especialmente significativo a
la luz del hecho de que el sitio de unión del anticuerpo H11.B2 fue
previamente mapeado en un tramo de residuos entre Y123 y V142, una
región que queda entre las dos regiones múltiplemente mutadas
tratadas en el presente ejemplo. Esto demuestra que las
perturbaciones estructurales generadas mediante las mutaciones
tratadas en este trabajo están bastante localizadas.
Ejemplo
6
La L1 del VPH 6 fue modificada con sustituciones
de tipo VPH 11 para generar 1393:6:T345S,T346K y A348S. Este clon
fue expresado transitoriamente en células Sf9, y se produjeron
partículas VLP, que fueron analizadas en cuanto a la unión para
ambos anticuerpos H11.G3 y H11.H3. Observamos niveles de unión 10
veces mayores con respecto al fondo, en proporción con la unión a
partículas VLP del VPH 11 prototipo. La unión de los anticuerpos
específicos del VPH 6 H6.B10.5 y H6.M48 no fue perturbada, lo que
demostró que las partículas VLP conservaban su carácter de tipo VPH
6. Además, no se observó la unión de los anticuerpos específicos del
VPH 11 H11.A3 y H11.B2, anticuerpos conocidos por unirse a otros
sitios, demostrando así que la transferencia era específica de
H11.G3 y H11.H3.
Ejemplo
7
La L1 del VPH 6 fue modificada con siete
sustituciones de tipo VPH 11 entre los residuos 262 y 289 (E262T,
T270D, S276G, G277N, T280S, G283A, N289H) para generar el clon
1393:6:262-289. Este clon fue expresado
transitoriamente en células Sf9, y se produjeron partículas VLP que
fueron analizadas en cuanto a la unión. Observamos niveles de unión
10 veces mayores con respecto al fondo del anticuerpo H11.G3. La
unión de los anticuerpos específicos del VPH 6 H6.B10.5 y H6.M48 no
fue perturbada, lo que demostró que las partículas VLP conservaban
su carácter de tipo VPH 6. Además, no se observó la unión de los
anticuerpos específicos del VPH 11 H11.A3 y H11.B2, anticuerpos
conocidos por unirse a otros sitios, demostrando así que la
transferencia era específica de H11.G3.
Ejemplo
8
La L1 del VPH 6 fue modificada con tres
sustituciones de tipo VPH 11 entre los residuos 49 y 54 (F49Y, R53K
y A54V) y cuatro sustituciones de tipo VPH 11 entre los residuos 169
y 178 (K169T, T172S, P175S y A178N), o cuatro sustituciones de tipo
VPH 11 entre los residuos 169 y 178 (K169T, T172S, P175S y A178N)
para generar los clones
1393:6:49-54,169-178 y
1393:6:169-178 respectivamente. Estos clones fueros
expresados transitoriamente en células Sf9, y se produjeron
partículas VLP que fueron analizadas en cuanto a la unión.
Observamos niveles de unión tres veces mayores con respecto al
fondo para el anticuerpo H11.A3.2 con cualquier clon. La unión de
los anticuerpos específicos del VPH 6 H6.B10.5 y H6.M48 no fue
perturbada por el clon 1393:6:169-178, lo que
demostró que las partículas VLP conservaban su carácter de tipo VPH
6. El trabajo descrito en este documento demuestra esa región diana
49-54 de los anticuerpos específicos del VPH 6, por
lo tanto, se espera que las partículas VLP producidas a partir del
clon 1393:6:49-54 no se unan a estos anticuerpos. No
se observó la unión del anticuerpo específico del VPH 11 H11.B2,
anticuerpo conocido por unirse a otros sitios, demostrando así que
la transferencia era específica de H11.A3.2.
Ejemplo
9
Se usan partículas VLP con modificaciones de
tipo VPH 6 para determinar la presencia de una respuesta inmune al
VPH 11 tras una infección o una inmunización vírica con partículas
VLP de VPH 11. Se revisten sobre el pozo de una placa de
microvaloración en forma nativa partículas VLP con modificaciones de
tipo VPH 6 que presentan el epitope neutralizante del VPH 11 a
H11.G3 y/o H11.H3. Tras el bloqueo, el anticuerpo monoclonal del VPH
11 H11.G3 y/o H11.H3 es incubado en formato ELISA con cantidades
crecientes de suero policlonal del VPH 11, suero policlonal del VPH
6 y suero policlonal de prueba. Usando un anticuerpo secundario anti
IgG de ratón en conejo, se visualiza la unión del anticuerpo
monoclonal del VPH 11. Alternativamente, es marcado con ^{125}I,
o directamente acoplado a peroxidasa de rábano picante o a fosfatasa
alcalina, u otro protocolo de visualización ELISA estándar. Una
cantidad creciente de suero policlonal del VPH 11 compite con la
unión hasta que la señal es finalmente reducida hasta el nivel de
fondo. El suero policlonal del VPH 6 no compite, o la competición
es significativamente reducida con respecto a la observada con el
suero policlonal del VPH 11. La competición con el suero de prueba
a niveles comparables con el suero policlonal del VPH 11 demuestra
una respuesta inmune al VPH 11. La falta o una reducción
significativa de competición demuestra la falta de o una respuesta
inmune débil al VPH 11.
Ejemplo
10
Se usan partículas VLP con modificaciones de
tipo VPH 11 para determinar la presencia de una respuesta inmune al
VPH 6 tras una infección o una inmunización vírica con partículas
VLP del VPH 6. Se revisten sobre el pozo de una placa de
microvaloración en forma nativa partículas VLP con modificaciones de
tipo VPH 11 que presentan el epitope del VPH 6 a H6.N8 y/o H6.M48.
Tras el bloqueo, el anticuerpo monoclonal del VPH 6 H6.N8 y/o H6.M48
es incubado en formato ELISA con cantidades crecientes de suero
policlonal del VPH 11, suero policlonal del VPH 6 y suero
policlonal de prueba. Mediante un anticuerpo secundario anti IgG de
ratón en conejo, se visualiza la unión de los anticuerpos
monoclonales del VPH 6 H6.N8 y/o H6.M48. Alternativamente, son
marcados con ^{125}I, o directamente acoplados a peroxidasa de
rábano picante o a fosfatasa alcalina, u otro protocolo de
visualización ELISA estándar. Cantidades crecientes de suero
policlonal del VPH 6 deberían competir con la unión hasta que la
señal fuera finalmente reducida hasta el nivel de fondo. El suero
policlonal del VPH 11 no compite. La competición con el suero de
prueba a niveles comparables con el suero policlonal del VPH 6
demuestra una respuesta inmune a VPH 6. La falta o una reducción
significativa de competición demuestra la falta de o una respuesta
inmune débil al VPH 11.
Ejemplo
11
Partículas VLP del VPH 6 modificadas para
contener sustituciones S131G e Y132, T345S, T346S y S348A, producen
partículas VLP que presentan i) el epitope dependiente de las
partículas VLP y específico de VPH 6 e ii) todos los epitopes
neutralizantes y específicos del VPH 11 conocidos. Alternativamente,
las partículas VLP del VPH 11 modificadas para contener
sustituciones, K53R, o Y49F y K53R, o Y49F, K53R, V54A, T170K,
S173T, S176P, N179A producen partículas VLP que presentan i) el
epitope dependiente de las partículas VLP y específico del VPH 6 e
ii) los principales epitopes neutralizantes y específicos del VPH
11. Estas últimas partículas VLP quiméricas presentan el epitope
específico del tipo 6 conocido, los dos epitopes de tipo 11
neutralizantes conocidos y los epitopes comunes de 6/11. Las
partículas VLP quiméricas de 6/11 son capaces de reemplazar una
inmunización doble con partículas VLP de tipo 6 y de tipo 11 para
estimular respuestas inmunes, con menores costes de
productividad.
<110> Merck & Co., Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PARTÍCULAS TIPO VIRUS
SINTÉTICAS CON EPITOPES HETERÓLOGOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 20333 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US99/29577
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
14-12-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/112.610
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-12-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows
versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 462
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del papiloma
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (4)
1. Una proteína L1 del VPH 6 que
comprende un epitope conformacional de una proteína L1 del VPH 11,
en el que la proteína L1 del VPH 6 comprende mutaciones en las
localizaciones seleccionadas entre:
(i) K169, T172, P175 y A178;
(ii) T345, T346 y S348;
(iii) F49, R53 y A54; y
(iv) E262, T270, S276, G277, T280,
G283 y N289.
2. Una proteína L1 del VPH 6 según la
reivindicación 1 que comprende mutaciones en las localizaciones
seleccionadas entre:
(i) K169T, T172S, P175S y
A178N;
(ii) T345S, T346K y S348A;
(iii) F49Y, R53K y A54V; y
(iv) E262T, T270D, S276G, G277N,
T280S, G283A y N289H.
3. Una proteína L1 del VPH 11 que
comprende un epitope conformacional de una proteína L1 del VPH 6,
en el que la proteína L1 del VPH 11 comprende mutaciones en las
localizaciones seleccionadas entre:
(i) Y49 y K53;
(ii) Y49 , K53 y V54; y
(iii) Y49, K53, V54, T170, S173,
S276 y N179.
4. Una proteína L1 del VPH 11 según la
reivindicación 3 que comprende mutaciones seleccionadas entre:
(i) Y49F y K53R;
(ii) Y49F , K53R y V54A; y
(iii) Y49F, K53R, V54A, T170K,
S173T, S276P y N179A.
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