ES2263764T3 - D-carbamoilasa de arthrobacter crystallopoietes dsm 20117. - Google Patents
D-carbamoilasa de arthrobacter crystallopoietes dsm 20117.Info
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Abstract
D-carbamoilasa de Arthrobacter crystallopoietes según SEQ ID NO: 1.
Description
D-carbamoilasa de
Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117.
La presente invención se refiere a
D-carbamoilasa, a secuencias génicas que codifican
esta enzima, y al uso de la misma. La invención se refiere además a
plásmidos, vectores y microorganismos modificados con la
D-carbamoilasa.
El uso de procesos enzimáticos en la síntesis de
compuestos orgánicos es ventajoso precisamente a escala industrial,
puesto que a menudo son superiores a los procesos químicos normales
con respecto a las selectividades y rendimientos de los productos.
Precisamente, los aminoácidos enantiómeramente concentrados son las
dianas preferidas para uso de procesos enzimáticos, pero en la
naturaleza estos procesos también son de importancia decisiva, por
ejemplo, en la biosíntesis de proteínas y albúminas. Los aminoácidos
enantiómeramente concentrados son además productos importantes con
respecto a la síntesis de compuestos bioactivos o en la alimentación
parenteral.
Las carbamoilasas son enzimas que son capaces de
convertir estereoselectivamente los
N-carbamoilaminoácidos en el L- o
D-aminoácido, a la vez que se retiene el
carbamoilaminoácido enantiómero (ecuación 1).
Ecuación
1
Los N-carbamoilaminoácidos
racémicos se pueden obtener preferiblemente de forma bastante fácil
a partir de hidantoinas mediante hidantoinasas, o mediante reacción
de aminoácidos con KOCN, y por esta razón tales procedimientos se
usan a escala industrial para la preparación de aminoácidos
enantiómeramente concentrados (Drauz K, Kottenhahn M, Makryaleas K,
Klenk H, Bernd M, Angew Chem, (1991). Chemoenzymatic synthesis of
D-\omega-ureidoaminoacids, 103,
704-706; ecuación 2).
Ecuación
2
Las D-carbamoilasas ya se
conocen en la bibliografía (Syldatk et al. en "Enzymatic
Catalysis in Organic Synthesis", eds.: Drauz, Waldmann, VCH, 1ª y
2ª Ed.), pero mayoritariamente no funcionan de forma muy eficaz, o
son inestables (Syldatk C, Müller R, Pietzsch M, Wagner F (1992).
Biocatalytic production of amino acids & derivatives; eds.:
Rozzell D, Wagner F, Hanser Publishers, Munich;
129-176; Louwrier A, Knowles CJ (1996). The
purification and characterization of a novel
D-specific carbamoylase enzyme from Agrobacterium
sp. Enzyme Microb Technol. 19; 562-571; Nanba
H, Ikenaka Y, Yamada Y, Yajima K, Takano M, Takahashi S (1998).
Isolation of Agrobacterium sp. strain KNK712 that produces
N-carbamyl-D-amino
acid amidohydrolase, cloning of the gene for this enzime, and
properties of the enzyme. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62(5)
875-881; Kim DM, Kim GJ, Kim HS (1994). Biotechnol
Lett. (16) 11-16); documento WO 94/00577 A;
Grifantini et al. Efficient conversion of
5-substituted hydantoins to
D-alpha-amino acids using
recombinant Escherichia coli strains, Microbiology, vol. 144,
no. 4, abril 1998, páginas 947-954; Ikenaka et
al. Screening, characterization, and cloning of the gene for
N-carbamyl-D-amino
acid amidohidrolase from thermotolerant soil bacteria, Biosci.
Biotechnol. Biochem., vol. 62, no. 5, mayo 1998, páginas
882-886; Möller et al. Stereo- and
substrate-specificity of a
D-hidantoinase and a
D-N-carbamyl-amino
acid amidohydrolase of Arthrobacter crystallopoietes AM2,
Enzyme and Microbial Technology, vol. 10, no. 10, 1988, páginas
618-625), y por esta razón aún existe la necesidad
de carbamoilasas mejoradas adicionales.
El objeto de la presente invención fue, en
consecuencia, proporcionar carbamoilasas adicionales que están
mejoradas, cuando sea apropiado, con respecto a la técnica
anterior.
El objeto se logró según las reivindicaciones.
La reivindicación 1 protege a la nueva
D-carbamoilasa de A-crystallopoietes
DSM 20117. La reivindicación 2 se refiere a las secuencias génicas
que codifican la D-carbamoilasa según la invención;
la reivindicación 3 se refiere a plásmidos y vectores modificados
con estas secuencias génicas, mientras que la reivindicación 4 se
refiere a un microorganismo ventajoso modificado según la invención;
y las reivindicaciones 5 y 6 protegen usos ventajosos de las
D-carbamoilasas según la invención.
Al proporcionar la
D-carbamoilasa de Arthrobacter
crystallopoietes DSM 20117 (sec. 2), se obtiene la posibilidad
de emplear a ésta ventajosamente en un procedimiento para la
preparación de aminoácidos. Tales procedimientos son conocidos en
principio por el experto (documentos WO0058449, WO0008374,
DE100050123.0 o DE10050124.9, y la bibliografía citada allí). La
enzima se puede usar, para el procedimiento descrito, como la enzima
nativa, o ventajosamente en forma del compuesto preparado mediante
un proceso recombinante. La preparación de las enzimas recombinantes
según la invención se lleva a cabo mediante procesos de ingeniería
genética conocidos por el experto (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis
T (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press;
Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. R.L.
Rodríguez & D.T. Denhardt, eds.: 205-225). Con
respecto a los procedimientos generales (PCR y PCR de fusión, PCR
inversa, clonación, expresión, etc.), se hace referencia a la
siguiente bibliografía y a la citada allí (Riley J, Butler R,
Finniear R, Jenner D, Powell S, Anand R, Smith JC, Markham AF
(1990). A novel, rapid method for the isolation of terminal
sequences from yeast artificial chromosome (YAC) clones. Nucl. Acids
Res. 18, 8186; Triglia T, Peterson MG, Kemp DJ (1988). A procedure
for in vitro amplification of DNA segments that lie outside
the boundaries of known sequences. Nucleic Acids Res. 16, 8186;
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning. Cold
Spring Harbor Laboratory Press; Vectors: A Survey of Molecular
Cloning Vectors and Their Uses. R.L. Rodríguez & D.T. Denhardt,
II).
En otra realización, la invención se refiere a
secuencias génicas que codifican la D-carbamoilasa
según la invención (por ejemplo, sec. 1). Las secuencias génicas que
codifican secuencias de aminoácidos incluyen todas las secuencias
que parecen posibles según la degeneración del código genético.
Un siguiente aspecto de la invención se refiere
a plásmidos o vectores que contienen las secuencias génicas según la
invención.
Plásmidos o vectores posibles son, en principio,
todas las realizaciones disponibles para el experto para este fin.
Tales plásmidos y vectores se pueden encontrar en Studier et
al., Methods Enzymol. 1990, 185, 61-69, o en los
folletos de Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech o Gibco
BRL. Otros plásmidos y vectores preferidos se pueden encontrar en:
DNA cloning: a practical approach. volumen I-III,
editado por D. M. Glover, IRL Press Ltd., Oxford, Washington DC,
1985, 1987; Denhardt, D. T. y Colasanti, J.: A surey of vectors for
regulating expression of cloned DNA in E. coli. En:
Rodríguez, R.L y Denhardt, D.T. (eds.), Vectors, Butterworth,
Stoneham, MA, 1987, p. 179-204; Gene expression
technology. En: Goeddel, D. V. (eds.), Methods in Enzymology,
volumen 185, Academic Press, Inc., San Diego, 1990, Sambrook, J.,
Fritsch, E.F. y Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: a laboratory
manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y.
Los plásmidos con los que el constructo génico
que contiene la secuencia génica según la invención se puede clonar
de una manera muy preferida en el organismo hospedante son:
pKK-177-3H (Roche Biochemicals),
pBTac (Roche Biochemicals), pKK-233 (Stratagene) o
pET (Novagen). Con la excepción de la serie TOPO, que tiene una
resistencia a canamicina integrada, todos los otros plásmidos deben
contener una \beta-lactamasa para resistencia a
ampicilina. Los plásmidos muy preferidos son los siguientes:
\newpage
| Nombre | Propiedades | Cebador implicado |
| pJW2 (fig. 1) | pCRTOPOBluntII con | IPCR1 +/- |
| amplicón de IPCR 1 | ||
| pRW (fig. 2) | pCRTOPOBluntII con | IPCR5+/5- |
| amplicón de IPCR 2 |
La invención se refiere igualmente a
microorganismos que contienen las secuencias génicas según la
invención.
El microorganismo en el que se clona la
secuencia génica se usa para incrementar y obtener una cantidad
suficiente de la enzima recombinante. Los procedimientos para esto
son bien conocidos por el experto (Sambrook et al. 1989,
Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Balbas P. & Bolivar F. 1990, Design and
construction of expression plasmid vectors in E. coli,
Methods Enzymology 185, 14-37). Los microorganismos
que se pueden usar son, en principio, todos los organismos posibles
para el experto, para este fin. Para este fin, se usan
preferiblemente cepas de E. coli. Las siguientes son
preferidas de forma muy particular: E. coli NM 522, JM109,
JM105, RR1, DH5\alpha, TOP 10 o HB101. Más abajo se mencionan
plásmidos con los que el constructo génico que contiene la secuencia
génica según la invención se clona preferiblemente en el organismo
hospedante.
Otros aspectos de la invención se refieren a los
usos de la D-carbamoilasa según la invención. En
principio, estos se pueden emplear en todos los procesos posibles
para el experto, por ejemplo para la preparación de aminoácidos
enantiómeramente concentrados, que se pueden emplear preferiblemente
en alimentación parenteral o en nutrición animal. Sin embargo, los
aminoácidos ópticamente concentrados, preparados de esta manera, se
usan preferiblemente además para la síntesis de compuestos
bioactivos. Los procedimientos para la preparación de aminoácidos
enantiómeramente concentrados son, entre otros, aquellos
procedimientos que se mencionan en los documentos WO0058449,
WO0008374, DE100050123.0 o DE10050124.9 y en la bibliografía citada
en ellos. Estos se pueden llevar a cabo de forma completamente
análoga con la D-carbamoilasa de la presente
invención.
Los procedimientos recién mencionados para la
preparación de aminoácidos se llevan a cabo preferiblemente
partiendo de hidantoinas en el sistema
hidantoinasa/D-carbamoilasa, opcionalmente en
presencia de una hidantoína racemasa o de una enzima que es capaz de
racemización de carbamoilaminoácidos (documentos WO0058449,
WO0008374). El procedimiento según la invención se lleva a cabo de
forma particularmente preferible en un reactor de membrana de enzima
(documento DE 19910691.6).
La carbamoilasa según la invención se puede
usar, en un uso adicional, para la preparación de enzimas
modificadas mediante ingeniería genética. Tales procedimientos son,
en principio, conocidos por el experto (Eigen M. y Gardinger W.
(1984) Evolutionary molecular engineering based on RNA replication.
Pure & Appl. Chem. 56(8), 967-978; Chen
& Arnold (1991) Enzyme engineering for nonaqueous solvents:
random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar
organic media. Bio/Technology 9, 1073-1077; Horwitz,
M y L. Loeb (1986) "Promoters Selected From Random
DNA-Sequences" Proceedings Of The National
Academy Of Sciences Of The United States Of America 83(19):
7405-7409; Dube, D. y L. Loeb (1989) "Mutants
Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The
Active-Site Of The Beta-Lactamase
Gene" Biochemistry 28(14): 5703-5707;
Stemmer PC (1994). Rapid evolution of a protein in vitro by
DNA Shuffling. Nature. 370; 389-391 y Stemmer PC
(1994) DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In
vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 91; 10747-10751).
Se investigó la cepa Arthrobacter
crystallopoietes DSM 20117 con respecto a la conversión de
derivados de hidantoina, en la tesis doctoral de A. Marín
(Stuttgart, 1997). Fue posible purificar homogéneamente, a partir de
ella, D-hidantoinasa, y determinar los primeros 30
aminoácidos del término N.
Sin embargo, una purificación cromatográfica de
una D-carbamoilasa fracasó puesto que es una enzima
evidente y extremadamente inestable. Sin embargo, la clonación de la
D-carbamoilasa según la invención fue posible vía la
ruta indirecta de clonación de D-hidantoinasa.
Mediante el uso de PCR degenerada y de PCR inversa, lo que confirmó
la existencia de un racimo génico hyu, se descodificaron las
secuencias génicas del gen estructural de
D-carbamoilasa a partir de DSM 20117. Entonces, se
hizo posible la producción recombinante de la
D-carbamoilasa en Escherichia coli, y el
producto génico se caracterizó con respecto a su función como una
nueva D-carbamoilasa.
La enzima mencionada, opcionalmente en
combinación con otras enzimas (por ejemplo, hidantoinasa/racemasa,
véanse los documentos WO0058449, WO0008374), se puede usar en forma
libre como compuestos homogéneamente purificados, o como una enzima
preparada mediante un proceso recombinante. Además, también se puede
emplear como un constituyente de un organismo intacto (huésped), o
en combinación con la masa de células rotas de los organismos
hospedantes particulares, la cual se ha purificado en cualquier
grado deseado. También es posible el uso de las enzimas en forma
inmovilizada (Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey y Ralph A.
Messing, "Immobilisierte Biomaterialiern - Techniken und
Anwendungen [Immobilized Biomaterials - Techniques and Uses]",
Angew. Chem. 1982, 94, 836-852). La inmovilización
se lleva a cabo ventajosamente mediante liofilización (Dordick et
al., J. Am. Chem. Soc. 194, 116, 5009-5010;
Okahata et al. Tetrahedron Lett. 1997, 38,
1971-1974; Adlercreutz et al. Biocatalysis
1992, 6, 291-305). Se prefiere de forma muy
particular la liofilización en presencia de sustancias
tensioactivas, tales como Aerosol OT, o polivinilpirrolidona, o
polietilenglicol (PEG), o Brij 52 (éter monocetílico de
dietilenglicol) (Goto et al., Biotechnol. Techniques 1997,
11, 375-378). También es concebible el uso como CLEC
(Vaghjiani et al., Biocat. Biotransform. 2000, 18, 157 y
sig.).
Como muestran los resultados de las conversiones
de N-carbamoilaminoácidos con
D-carbamoilasa, se puede convertir con éxito un
número de diversos sustratos. La actividad de la enzima según la
invención, con respecto a la alanina, es de importancia aquí. La
D-carbamoilasa de Arthrobacter
crystallopoietes DSM 20117 es idéntica a un máximo de 53% a las
D-carbamoilasas descritas hasta ahora.
La producción de la
D-carbamoilasa de la invención comienza aquí a
partir de ADN cromosómico de un organismo que es capaz de convertir
hidantoinas 5'-sustituidas en
D-aminoácidos. Éste se rompe en fragmentos mediante
técnicas conocidas por el experto (la digestión con enzima de
restricción se lleva a cabo aquí, por ejemplo, según las
instrucciones del fabricante del kit de restricción [Roche
diagnostics]). Los fragmentos de ADN se clonan entonces en plásmidos
adecuados, de forma análoga a medidas conocidas (Sambrook J, Fritsch
EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbor
Laboratory Press). Los plásmidos mencionados anteriormente se pueden
considerar como adecuados. La hibridación del ADN plasmídico con el
ADN de una enzima adecuada se logra, a su vez, mediante técnicas de
hibridación conocidas por el experto (Sambrook J, Fritsch EF,
Maniatis T (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory
Press), siendo posible que la hibridación exitosa tenga lugar, por
ejemplo, por medio de amplificación de ADN (PCR), marcado
(fluorescencia, radioactividad) de los oligonucleótidos, o por medio
de librerías de expresión y detección de la actividad. Partiendo de
una señal de hibridación, se identifican y se analizan las regiones
adyacentes con respecto a la presencia de una
D-hidantoinasa o D-carbamoilasa, por
ejemplo, vía una IPCR (Genetic applications of an inverse polymerase
chain reaction, Ochman H, Gerber A.S., Hartl D.L. GENETICS (1988
Nov), 120(3), 621-3; The polymerase chain
reaction, Arnheim, Norman, Genet. Eng. (N. Y.) (1990), 12
115-37) del gen hibridado conocido, vía
secuenciación convencional de ADN y comparación de secuencias o
detección de la actividad. Esto también se lleva a cabo mediante
métodos con los que está familiarizado el experto, es decir, vía la
secuenciación de ADN y análisis de la secuencia de ADN mediante
programas apropiados, tales como por ejemplo el programa GCG (véase
también Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Joseph Sambrook y
David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000).
En el contexto de la invención, los compuestos
ópticamente concentrados (enantiómeramente concentrados,
concentrados en enantiómero) significa la presencia de una antípoda
óptica como una mezcla con la otra en >50% en moles.
Hidantoinas significa los compuestos que derivan
de 2,4-dioxo-imidazolidinas, y que
están sustituidos en la posición 5 con un radical que puede derivar
del radical \alpha de un aminoácido.
Radical \alpha de un aminoácido significa el
radical en el átomo \alpha-C de un
\alpha-aminoácido. Éste puede derivar de un
aminoácido natural, como se describe en
Beyer-Walter, Lehrbuch der organischen Chemie
[Textbook of Organic Chemistry], S. Hirzel Verlag Stuttgart, 22ª
edición, 1991, p. 822 y sig. Además, sin embargo, también se
entiende que significa los radicales en \alpha correspondientes de
los \alpha-aminoácidos no naturales, como se
describen, por ejemplo, en el documento DE19903268.8.
El organismo Arthrobacter
crystallopoietes DSM 20117 está depositado en Deutsche Sammlung
für Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares], con el número
correspondiente, y es accesible al público.
Cuando se menciona la enzima según la invención,
esto significa tanto la enzima nativa homogéneamente purificada como
la enzima correspondiente preparada mediante un proceso
recombinante. Esto también incluye todas las enzimas adicionales con
la misma secuencia peptídica y la misma actividad con respecto a las
secuencias que influyen en la reacción, pero que se han modificado,
por ejemplo enzimas modificadas con un marcador His, o enzimas
modificadas con un codón de partida, etc.
Como el material de partida para los ensayos de
la actividad de célula completa, para el aislamiento del ADN
cromosómico y para el aislamiento enzimático de
D-hidantoinasa, primero se debe proporcionar, en una
cantidad suficiente, una masa celular fisiológicamente uniforme de
Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117. Según el trabajo de
Brans (tesis doctoral, TU Braunschweig, 1991), se usó para esto un
medio semisintético con D,L-lactato como fuente de
carbono, extracto de levadura como un constituyente adicional, e
hidantoína como un inductor para el cultivo en un biorreactor de 50
litros.
| Medio de lactato de sodio | Ácido cítrico | 0,75 g |
| pH 7,2 (V = 1 litro) | ||
| (Brans, 1991) | Extracto de levadura | 1,0 g |
| FeSO_{4} * 7 H_{2}O | 0,01 g | |
| MgSO_{4} * 7 H_{2}O | 0,5 g | |
| CaSO_{4} * 2 H_{2}O | 0,22 g | |
| MnSO_{4} * H_{2}O | 0,055 g | |
| ZnSO_{4} * 7 H_{2}O | 0,005 g | |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 6,0 g | |
| D,L-Metionina | 0,05 g | |
| Hidantoína | 1,0 g | |
| 50% D,L-Lactato | 40 ml | |
| 1 M KH_{2}PO_{4} | 23 ml |
Se incubó toda la noche un primer precultivo (V
= 20 ml), a 30ºC y 110 rpm. Después, todo el precultivo se usó para
la inoculación del segundo precultivo (V = 2 l). Después de la
incubación durante dos días, se usaron 1,5 l del segundo precultivo
como el inóculo para la fermentación (V = 20 l). Puesto que la
hidantoína inductora se consume durante el crecimiento, ésta se
introdujo de forma medida, continuamente, con una bomba de
suministro, de forma que la concentración de hidantoína en el medio
fue constante, 0,2 g/l. Después de cosechar las células, se
dividieron 205 g de BFM en partes alícuotas, y se almacenaron a
-20ºC.
El protocolo de purificación de la
D-hidantoinasa de Arthrobacter
crystallopoietes DSM 20117 está orientado, con algunas
modificaciones, a la purificación proteínica de
D-hidantoinasa descrita por Marín (tesis doctoral,
Uni Stuttgart, 1997). Si es posible, las etapas de purificación se
llevaron a cabo a 4ºC, y la determinación de la actividad de la
hidantoinasa de las fracción se llevó a cabo inicialmente en el
ensayo rápido con detección fotométrica mediante el método de
Ehrlich. Después, se incubaron partes alícuotas de las muestras
positivas con el sustrato patrón
D,L-bencilhidantoina, y se determinó la actividad
exacta por medio de HPLC.
La biomasa obtenida del cultivo (véase I) de
Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 se sometió en primer
lugar, como una suspensión celular del 30%, a ruptura mediante
perlas de vidrio en un molino de bolas agitado. Después de registrar
la cinética de la ruptura, se lograron concentraciones proteínicas
de hasta 16,5 g/l tras un tiempo de ruptura de 20 minutos. El
desecho celular y los constituyentes insolubles se separaron
entonces mediante centrifugación, y el sobrenadante claro se empleó
para la siguiente precipitación con sulfato de protamina. La
viscosidad de la disolución se pudo reducir con esto antes de que se
llevase a cabo una cromatografía en columna con DEAE Streamline.
Las proteínas unidas a la columna se eluyeron
por medio de un gradiente de cloruro de sodio. Se añadió un volumen
igual de (NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M a las fracciones de
Streamline reunidas, activas, a fin de separarlas subsiguientemente
además por medio de una cromatografía de interacción hidrófoba
(HIC). Después, las fracciones con la mayor actividad de
hidantoinasa se combinaron y se separaron de otras proteínas vía una
cromatografía de intercambio aniónico en una columna MonoQ.
En la tabla 2 se resumen los datos de la
purificación de la hidantoinasa; la SDS-PAGE de la
D-hidantoinasa purificada dio un peso molecular de
50 +/- 5 kDa para esta enzima [10% de SDS-PAGE de la
D-hidantoinasa purificada después de la
concentración de las fracciones MonoQ, marcador de peso molecular
ProSieve y L-hidantoinasa de A. aurescens DSM 3745
como patrón interno de 49,7 kDa (May, disertación de la Uni
Stuttgart, 1998)].
| Purificación | Vol. | Prot. | Activ. espec. | Factor de | Rendimiento |
| [ml] | [g/l] | [U/mg] | purificación | [%] | |
| Ruptura celular | 32 | 16 | 1,5 | - | 100 |
| Precipitación con | 29 | 17 | 1,4 | 0,9 | 89 |
| sulfato de protamina | |||||
| Fracciones de | 61 | 3,8 | 1,9 | 1,3 | 57 |
| Streamline combinadas | |||||
| Precip. con sulfato de | 120 | 1,5 | 3,7 | 2,4 | 85 |
| amonio del sobrenadante | |||||
| Fracciones de HIC | 30 | 0,8 | 13,3 | 8,8 | 41 |
| combinadas | |||||
| Fracciones MonoQ | 19 | 0,4 | 30,1 | 19,8 | 29 |
| combinadas |
Las secuenciaciones N-terminales
dieron resultados de secuencias fiables sólo para los primeros 30
aminoácidos. La secuencia dada en el trabajo de Marín, sin embargo,
no permitió que se derivaran cebadores. Por lo tanto, la proteína se
tuvo que dividir en varios péptidos mediante digestión con proteasa,
para determinar la información adicional de la secuencia. Para la
fragmentación enzimática, se usó, con tripsina, una endopeptidasa
que se escinde específicamente tras los aminoácidos lisina y
arginina. Sin embargo, es de esperar una actividad reducida si le
sigue un aminoácido ácido, e incluso es de esperar una ausencia de
hidrólisis si le sigue un radical de prolina. Con una aparición
media de lisina y arginina en las proteínas de 5,7% y 5,4%
respectivamente, es de esperar una longitud media del péptido de
alrededor de 9 aminoácidos, con la digestión completa. La mezcla
peptídica se separó entonces mediante HPLC cuantitativa.
Para digerir la hidantoinasa de Arthrobacter
crystallopoietes DSM 20117 con tripsina, ésta se purificó hasta
las fracciones MonoQ como se describe, y después se concentraron con
un filtro Amicon (corte 30 kDa) y se separó mediante
SDS-PAGE. Para asegurarse de que la proteína también
era D-hidantoinasa, se transfirió una porción del
gel a una membrana vía una transferencia western y se cortó, y se
determinaron los ocho primeros aminoácidos
N-terminales. Con la excepción de la posición 2,
todos los aminoácidos determinados coincidieron con el
N-término determinado por Marín (disertación,
University of Stuttgart, 1997), de forma que se pudo suponer que la
proteína aislada aquí fue la misma enzima que ya había sido descrita
y caracterizada por Marín.
La banda de hidantoinasa se cortó entonces
directamente del gel de poliacrilamida de las fracciones MonoQ
separadas, y se sometió a digestión con tripsina in situ
según las instrucciones del fabricante (Sigma, Steinheim). Los
péptidos se extrajeron del gel con acetonitrilo, y se separaron
entre sí mediante HPLC preparativa.
Las fracciones se secaron en un
Speed-vac, y después se secuenciaron
N-terminalmente vía degradación de Edman.
Globalmente, además del
N-término, se pudieron secuenciar sin ambigüedad
nueve péptidos. Uno de los fragmentos peptídicos tuvo el motivo de
consenso GXXDXHXH de amidasas cíclicas, que participa en la unión de
un átomo de cinc en el centro activo (Abendroth et al., Acta
Cryst. 2000, D56, 1166-1169). Las secuencias
peptídicas que no terminan con una lisina (K) o arginina (R)
interrumpieron la secuenciación prematuramente debido a problemas
técnicos o a una falta de calidad o cantidad de las muestras.
La biomasa húmeda, obtenida mediante cultivo de
Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 sobre medio de
lactado (véase I), también se usó para el aislamiento de ADN
cromosómico. Después de la lisis celular y de la purificación
mediante centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de
cesio, se pudo aislar ADN genómico altamente puro. La calidad se
evaluó registrando un espectro de absorción, a fin de ser capaces de
este modo de descartar la contaminación con fenol. La concentración
de ADN determinada fotométricamente fue 60 \mug ADN/ml.
El ADNc se empleó para una digestión con enzimas
de restricción, y se usó como la matriz para las PCR.
Además del N-término de la
D-hidantoinasa, se pudo obtener información de
secuencia adicional secuenciando péptidos que se originan a partir
de la digestión tríptica (véase III). Los péptidos se emparejaron
con el programa ClustalX con la secuencia proteínica conocida de
Agrobacterium sp. IP I-671 (Thompson et
al., 1997, The ClustalX windows interface: flexible strategies
for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.
Nucleic Acids Research. 24, 4876-4882).
Para derivar cebadores degenerados a partir de
las secuencias peptídicas conocidas, se tuvieron que elegir
secciones de secuencias de dos péptidos que tienen un grado bajo de
degeneración en la composición de los aminoácidos. Para ello, se
escogieron los péptidos 61.61 y 73.31. El cebador 61.61a se empareja
con la hebra más, y el cebador 73.31b se empareja con la hebra menos
del ADN.
| Péptido | Secuencia de ADN derivada | Nombre del | Sec. |
| cebador | |||
| SLVMYETGVAEGK | 5'-GT(AGCT)ATGTA(CT)GA(AG)AC(AGC)GG-3' | 61.61a | 10 |
| (61.61 SEQ. 12) | |||
| QNMDYTLFEGK | 5'-GT(AG)TA(AG)TCCAT(AG)TT(CT)TC-3' | 73.31b | 11 |
| (73.31 SEQ. 13) |
Para reducir adicionalmente el grado de
degeneración del cebador 61.61a, se tomó en cuenta la distribución
de secuencias del codón a partir de Arthrobacter sp. en base
al banco de datos CUTG (Nakamura et al., Nucl. Acids Res.
1999, 27, 292). El triplete de bases "GTA", en la posición 3 de
este oligonucleótido, se pudo ignorar en la construcción del cebador
como resultado, debido a la baja probabilidad de este codón de 10,4%
para el aminoácido valina.
Para estimar la longitud del amplicón de PCR, se
llevó a cabo un alineamiento de los dos cebadores con la
D-hidantoinasa de Agrobacterium sp. IP
I-671. En el alineamiento, la distancia entre los
dos oligos es de 69 aminoácidos, de forma que una PCR con los
cebadores degenerados 61.61a y 73.31b debería de conducir a un
producto de PCR de aprox. 207 pb de longitud.
La PCR se ajustó en el perfil de temperatura
según el lote estándar, a una temperatura de hibridación de 42ºC, y
se optimizó a una concentración de 2 mM con respecto al contenido de
magnesio. El lote de PCR se separó entonces en un gel de agarosa al
3%, y se determinó el tamaño de las bandas con un programa de
ordenador de análisis de imágenes Imagemaster (marcador de peso
molecular D-15 de Novex). La banda que tuvo un
tamaño calculado de 218 pb se eluyó del gel y se ligó en el vector
pCR TOPO BluntII (fig. 3). El plásmido obtenido se denominó pJW1
(fig. 4). La secuenciación subsiguiente del vector mostró homologías
con dihidropirimidinasas ya conocidas, de forma que la primera
sección de ADN estaba así presente en forma clonada en el gen
estructural de D-hidantoinasa.
Para obtener una información adicional de
secuencia a partir de las regiones de ADN flanqueantes, se empleó la
técnica de la PCR inversa (IPCR).
Para la digestión del ADN genómico procedente de
Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117, se usaron las
enzimas de restricción BamHI, EcoRI, SacI,
PstI, BglII, HindIII, SalI, MunI,
y MluI. Los productos digeridos se separaron sobre un gel de
agarosa al 1%, y se fijaron sobre una membrana de nailon por medio
de una transferencia southern.
Para preparar una sonda adecuada, el plásmido
pJW1 linealizado con MunI (fig. 4) se marcó radioactivamente
con ^{32}P-\alpha-ATP, vía una
traducción de mella (Nick Translation Kit de Roche Diagnostics), y
se empleó para la hibridación con la transferencia (marcador de peso
molecular MWM VII).
En base al tamaño de las señales de hibridación
obtenidas de la transferencia southern, el producto de la digestión
con PstI genómico (aprox. 2000 pb) se usó como la matriz en la
siguiente IPCR. Para esto, el producto de la digestión se separó en
un gel de agarosa, se eluyó del gel en el intervalo entre 1500 y
2800 pb (marcador de peso molecular MWM VII), y después se ligó y se
linealizó con MunI. A partir de la secuencia conocida del gen
de hidantoinasa, se pudieron derivar los cebadores IPCR1+ (sec. 3) e
IPCR1- (sec. 4) para la IPCR. La temperatura de hibridación de 60ºC
se derivó de las temperaturas de fusión de los oligos.
Se pudo generar una única banda como el
amplicón, que entonces se eluyó y se clonó en el sistema TOPO (fig.
3). El plásmido formado se denominó pJW2 (fig. 1). La agrupación del
gen hyu reconstruida después de las secuenciaciones de pJW2 contiene
el marco de lectura abierta de hyuH de
D-hidantoinasa, y una porción del marco de lectura
abierta de hyuC_{D} de D-carbamoilasa.
En la siguiente etapa, se debería de clonar el
marco de lectura completo de la D-carbamoilasa,
igualmente vía la técnica de la IPCR. Para ello, se podían
encontrar, a partir de la sección de secuencia conocida de
D-carbamoilasa, enzimas de restricción que
satisfacen los requisitos de la IPCR y que deben de romper tan lejos
como sea posible en el extremo 5' del gen de
D-carbamoilasa. Finalmente, se llevó a cabo una
digestión genómica con las enzimas de restricción SacI,
NaeI, SfuI, NarI y SphI y, tras la
separación en gel de agarosa, se llevó a cabo una transferencia
sobre una membrana de nailon.
El pequeño fragmento de una digestión doble de
pJW1 con NarI/BamHI fue adecuado como una sonda (fig.
4). Se llevó a cabo la separación en un gel, la elución y el marcado
radioactivo subsiguiente por medio de una traducción de mella (Nick
Translation Kit de Roche Diagnostics), y el producto se empleó para
la hibridación.
En base a las señales de hibridación, el
producto de la digestión con NarI religado (1,4 kb) se
escogió como el molde de ADN para la segunda IPCR. Como cebadores,
se emplearon los oligos IPCR5+ (sec. 5) e IPCR5- (sec. 6), a una
temperatura de hibridación de 57ºC.
La banda se clonó en el vector TOPO (fig. 3), y
el plásmido TOPO formado se denominó pRW (fig. 2). Después de
secuenciar el inserto, la agrupación del gen hyu se pudo
reconstruir en un grado tal que el marco de lectura de la
D-carbamoilasa estaba presente al completo.
Después de que se concluyó la secuenciación de
la agrupación del gen hyu, tuvo lugar una investigación de la
secuencia de ADN para determinar marcos de lectura potenciales.
Además del codón de partida atg, también es posible aquí un
codón de partida ttg no habitual, para el comienzo de la
traducción de la D-carbamoilasa, conduciendo este
codón a un alargamiento del N-término en cinco
aminoácidos. Puesto que, a pesar de los indicios, no se pudo
encontrar una prueba clara de la presencia de un codón de partida
ttg raro, se clonaron tanto la ttg- como la
atg-D-carbamoilasa, y se estudiaron
con respecto a su expresión y actividad en Escherichia
coli.
Para ello, las D-carbamoilasas
se amplificaron a partir del ADN genómico de Arthrobacter
crystallopoietes DSM 20117 por medio de la PCR. Aquí se
emplearon diferentes pares de cebadores, de forma que fue posible
clonar tres D-carbamoilasas diferentes: una
D-carbamoilasa con el codón de partida atg sin el
marcador His, y dos D-carbamoilasas con el codón de
partida ttg. Una de estas con la otra sin el marcador de His. En la
construcción del cebador, el triplete de bases ttg de la secuencia
de Arthrobacter se sustituyó en Escherichia coli por un codón
atg (tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
| Nombre del cebador | pMW1 (fig. 5) | pMW2 (fig.6) | pMW3 (véase fig.5) |
| Codón de partida en | ttg | ttg | atg |
| Arthrobacter | |||
| Par de cebador | K_DCn2/c2 | K_DCn2/c3 | K_DCn1/c2 |
| Sitio de restricción | NdeI | NdeI | NdeI |
| N-terminal | |||
| Sitio de restricción | BamHI | BamHI | BamHI |
| C-terminal | |||
| Marcador His_{6} | sí | no | No |
\vskip1.000000\baselineskip
Los amplicones se clonaron en el vector pCR TOPO
BluntII (fig. 3), y el plásmido formado se sometió a una doble
digestión con las enzimas de restricción NdeI y BamHI.
Se usó el vector de expresión de ramnosa pJOE4036 (fig. 7) para
subclonar el fragmento formado de 947 pb de tamaño. Los plásmidos se
transformaron en Escherichia coli JM109, y las células se
indujeron con 0,2 g/l de ramnosa al comienzo de la fase
exponencial.
No se detecta ninguna banda creciente de
proteína al nivel de D-carbamoilasa (34 kDa) con el
codón de partida atg alternativo, mientras que se registra un
incremento claro en la D-carbamoilasa con el codón
de partida ttg. Sin embargo, después de la inducción durante 20
horas, la intensidad de la banda de proteína recombinante disminuye
nuevamente, lo que probablemente se puede atribuir a una digestión
proteolítica de la proteína.
Después de la ruptura celular de los dos clones
con un homogeneizador, se encontró que la actividad de
D-carbamoilasa existía sólo con el clon con el codón
de partida ttg, mientras que la actividad para pMW3
permaneció por debajo del límite de detección.
La D-carbamoilasa está presente
de forma predominante en el sobrenadante. El peso molecular de la
proteína expresada se pudo especificar como 34,6 kDa con la ayuda
del programa Image Master (Amersham Life Sciences, Freiburg). Este
peso molecular coincide bien con el valor calculado para la
D-carbamoilasa con el marcador His (35,4 kDa).
También se pudo determinar, con la ayuda de este programa, que el
contenido de D-carbamoilasa en el sobrenadante
constituye hasta el 30% de la proteína total. Después de registrar
un perfil de expresión, se encontró que la expresión máxima se
alcanza después de un tiempo de inducción de aprox. seis horas. La
actividad específica también muestra su máximo en este punto de
tiempo (2 U/mg para DL-C-Phe).
A fin de ser capaces de caracterizar la
D-carbamoilasa, ésta se purificó. En el proceso de
purificación, la biomasa de la cepa de Escherichia coli
recombinante correspondiente se cultivó en primer lugar, y la
suspensión celular se rompió con un homogeneizador (véase II). La
D-carbamoilasa contenida en el sobrenadante se
purificó entonces vía cromatografía de afinidad por metal (columnas
Talon® de Stratagene). Al volver a tamponar en 0,1 M de KPB, pH 8,0,
por medio de filtración en gel (mediante columnas
PD-10 de Pharmacia), se eliminó el imidazol
contenido en el tampón de elución de la columna Talon. Las etapas de
purificación individuales se documentaron mediante
SDS-PAGE.
La D-carbamoilasa purificada
homogéneamente, con el marcador His y el codón de partida ttg (pMW1
- fig. 1), se usó para la caracterización de la enzima obtenida de
esta manera. La enzima estaba presente en 0,1 M de KPB, pH 8,0.
Para determinar el pH óptimo de la
D-carbamoilasa purificada, se llevaron a cabo
conversiones a diversos valores de pH en un intervalo desde 6,5
hasta 9,0, con DL-C-fenilalanina
como sustrato, a 30ºC. A fin de ser capaces de descartar los efectos
de la concentración, la concentración del tampón de todos los
tampones usados (Tris, fosfato de potasio y
Tris-glicina) se ajustó hasta un valor de 100 mM. El
máximo de actividad de la D-carbamoilasa fue a pH
8.
A fin de investigar la estabilidad térmica de la
D-carbamoilasa a 4ºC, la enzima se almacenó en 0,1 M
de KPB a pH 8,0 durante un período de 4 días en el refrigerador, y
se tomó un valor de medida cada 24 horas. A esta temperatura, la
semivida de la enzima es aproximadamente 100 horas.
A fin de determinar la estabilidad térmica a 20,
30 y 40ºC, la enzima se incubó durante 40 minutos a la temperatura
de reacción particular, y la actividad se determinó cada 5 minutos.
Los resultados se muestran en la fig. 8.
A fin de determinar la temperatura óptima, se
llevó a cabo la conversión de
D,L-carbamoil-fenilalanina en las
condiciones del ensayo estándar a diversas temperaturas. El óptimo
para la temperatura de reacción es alrededor de 30ºC.
Para la determinación de v_{max} y K_{m}, se
representó gráficamente la velocidad de reacción v como función de
la concentración del sustrato. La gráfica para
D-carbamoil-triptófano se muestra en
la fig. 10. El cálculo de los parámetros cinéticos se llevó a cabo
vía el programa Enzumfit (desarrollado en el Institute of Bioprocess
Technology, University of Stuttgart). Para el
D-carbamoil-triptófano, el valor de
K_{m} es 7,5 mM y v_{max} es 2,4 U/mg. La reacción se puede
describir aquí mediante la cinética de
Michaelis-Menten (véase la ecuación 1).
\newpage
Ecuación
1
r =
\frac{r_{max} \cdot [S]}{K_{m} +
[S]}
- r_{max}
- velocidad máxima de reacción
- S
- concentración del sustrato
- K_{m}
- constante de Michaelis-Menten
La determinación del peso molecular en
condiciones desnaturalizantes en gel de SDS, con el programa
Imagemaster (Amersham Life Sciences, Freiburg), dio un valor de 34,6
kDa. Este valor concuerda bien con el valor calculado en base a la
secuencia de aminoácidos de la D-carbamoilasa con el
marcador His (35,46 kDa). Para averiguar si la enzima está presente
en el estado mono- u oligomérico en el estado nativo, se llevó a
cabo una electroforesis en gel nativa con la enzima con marcador His
homogéneamente purificada, a una concentración de acrilamida de 7,5%
en peso. A esta concentración, el intervalo lineal de la separación
está entre 16 y 91 kDa. Después de la calibración del gel con el
marcador proteínico ProSieve, se determinó que el tamaño molecular
de la D-carbamoilasa, con el programa Igemaster, es
75 kDa. En consecuencia, parece que la enzima está presente como un
dímero en el estado
nativo.
nativo.
En una incubación de la
D-carbamoilasa purificada a 25ºC y en presencia de
10 mM de EDTA, no se encontró inactivación de la enzima. No
obstante, se observa una inhibición competitiva de la enzima en
menos de dos horas cuando se incubó con 10 mM de ácido
8-hidroxiquinolinsulfónico (8-HQSA).
A fin de ser capaces de diferenciar la inactivación mediante el
agente complejante de la inactivación térmica, se coincubó una parte
alícuota de la disolución enzimática sin 8-HQSA, y
se monitorizó la actividad con respecto al tiempo.
¿Conclusión? Para reactivar la enzima, se hubo de eliminar el
8-HQSA de la enzima mediante filtración en gel, y la
incubación se tuvo que llevar a cabo en presencia de 2 mM de iones
metálicos. Sin embargo, ni Cu^{2+}, Co^{2+}, Mn^{2+},
Mg^{2+}, Fe^{2+} ni Zn^{2+} condujeron a una reactivación de
la enzima.
Los reactivos sulfhidrílicos (yodo, acetato,
2-nitrobenzoato y benzoato de
para-cloro-mercurio), añadidos a la
enzima en concentraciones de 1 mM, condujeron a una inactivación
completa de la D-carbamoilasa.
Para determinar el espectro del sustrato, la
enzima se incubó a una temperatura de reacción de 30ºC con el
sustrato particular, en presencia de 0,1 M de tampón de fosfato
potásico, pH 8,0. Para asegurar la misma concentración del
D-isómero, se demostró si el sustrato estaba
presente como una mezcla de isómeros a una concentración de 20 mM;
se demostró si el sustrato estaba presente como un isómero puro a
una concentración de 10 mM. Aquí se usó
D,L-carbamoil-fenilalanina como el
sustrato de referencia, y se estableció como 100% (que corresponde a
2 U/ml) en el cálculo de las actividades relativas. Los sustratos de
carbamoílo mostrados con las fórmulas estructurales en la tabla 5 se
convirtieron con las actividades particulares. La
D-carbamoilasa de Arthrobacter
crystallopoietes DSM 20117 es capaz de convertir los compuestos
carbamoílicos con radicales alifáticos y con radicales aromáticos,
convirtiéndose estos últimos de forma más rápida. Una característica
adicional de la D-carbamoilasa encontrada es, por
ejemplo, la clara preferencia por el sustrato
D-carbamoil-alanina, que se
convierte al menos cinco veces mejor que todos los otros sustratos.
Como el único sustrato aquiral entre los compuestos estudiados, la
carbamoil-glicina se convirtió con velocidades de
reacción similares a los carbamoil-aminoácidos con
radicales alifáticos.
\newpage
Los aminoácidos con radicales no naturales,
tales como, por ejemplo,
D,L-para-cloro-fenilalanina,
D,L-carbamoil-terc-leucina
o D,L-carbamoil-piridilalanina,
también se pueden detectar como el producto de reacción tras la
conversión de los sustratos correspondientes.
Al comparar la conversión de D,L-, D- y
L-carbamoil-fenilalanina, se puede
observar que la enzima es enantioespecífica para este sustrato, y
que la mezcla racémica se convierte de forma reproducible más
lentamente que el isómero D puro. De este modo, el isómero L parece
tener un ligero efecto inhibidor sobre la catálisis enzimática a
concentraciones de 10 mM, puesto que la misma concentración del
isómero D estaba presente en los lotes con D- y
D,L-carbamoil-fenilalanina.
Tampoco se convirtieron otros
L-carbamoil-aminoácidos puros, tales
como L-carbamoil-valina o
L-carbamoil-triptófano.
Adicionalmente, se ensayaron el
\beta-ureidopropionato y
\beta-ureidosuccinato
(D,L-carbamoil-aspartato) como un
posible sustrato fisiológico. Ambos compuestos no se convirtieron en
las condiciones de ensayo escogidas.
<110> Degussa-Hüls
Aktiengesellschaft
\vskip0.400000\baselineskip
<120> D-Carbamoilasa de
Arthrobacter crystallopoietes
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 000753 AM
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 948
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arthrobacter
crystallopoietes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(948)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 315
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arthrobacter
crystallopoietes
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador IPCR1+
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgttcacg caccttcttt cacttc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador ICPR1-
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgttgtag cccaggacga cgagc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador ICPR1+
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagggcgatg aagtcgtcgt tgtgaa
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador ICPR5-
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttctggtat gcccctgcct gaagt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador K_DCn2
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacatatggc gaaaaacttg atgctc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador K_DCc2
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggatccgt cattcacgtt gaacgg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador K_DCc2
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggatcctt agtcattcac gttgaacgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador degenerado 61.61a
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtnatgtayg aracvgg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador degenerado 73.31b
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtrtartcca trttytc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arthrobacter
crystallopoietes
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Leu Val Met Tyr Glu Thr Gly Val Ala Glu
Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arthrobacter
crystallopoietes
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Asn Met Asp Tyr Thr Leu Phe Glu Gly
Lys}
Claims (6)
1. D-carbamoilasa de
Arthrobacter crystallopoietes según SEQ ID NO: 1.
2. Secuencias génicas que codifican una
D-carbamoilasa según la reivindicación 1.
3. Plásmido o vector que contiene una
secuencia génica según la reivindicación 2.
4. Microorganismos que contienen una secuencia
génica recombinante según la reivindicación 2.
5. Uso de una D-carbamoilasa
según la reivindicación 1, para la preparación de un aminoácido
enantiómeramente concentrado.
6. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque las hidantoinas se convierten en el
sistema hidantoinasa/D-carbamoilasa, opcionalmente
en presencia de una hidantoína racemasa o de una enzima que es capaz
de racemizar carbamoilaminoácidos.
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