ES2264214T3

ES2264214T3 - Procedimiento para la biotransformacion de compuestos de colchicona en los derivados 3-glucosilo correspondientes.

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Publication number: ES2264214T3
Application number: ES98952675T
Authority: ES
Inventors: Ezio Bombardelli; Cesare Ponzone
Original assignee: Indena SpA
Current assignee: Indena SpA
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-09-30
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2018-09-30
Also published as: IT1295272B1; DE69834736D1; HUP0004840A2; NO20001706D0; KR20010030710A; NO20001706L; HU225686B1; SK4832000A3; PT1019521E; CA2305046A1; CN1188527C; DE69834736T2; HK1031896A1; AU1028399A; CZ295749B6; EP1019521B1; NO320096B1; RU2218409C2; WO1999018229A1; HUP0004840A3

Abstract

Un procedimiento para la preparación de compuestos 3- glucosilcolchicona de fórmula (I): en la que R1 es un resto glucósido, R2 es alcoxi C1-C6 o tioalquilo C1-C6, que comprende la biotransformación de compuestos en los que R1 es OH o metoxi mediante Bacillus megaterium.

Description

Procedimiento para la biotransformación de compuestos de colchicona en los derivados 3-glucosilo correspondientes.

La presente invención se refiere a la biotransformación, realizada mediante cepas microbianas seleccionadas, de compuestos colchicinoides, en los derivados 3-O-glucosilo respectivos. El procedimiento de la presente invención proporciona compuestos glucosilados exclusivamente en C-3 del anillo aromático A, partiendo de los compuestos de colchicona citados con elevados rendimientos y pureza.

Los compuestos obtenidos mediante el procedimiento biotecnológico de la invención, particularmente tiocolchicosona (3-O-glucosiltiocolchicona, es decir, con referencia a la fórmula (I), R_{1} = -OCH_{3} y R_{2} = -SCH_{3}), son principios activos de notable importancia farmacológica, principalmente para la preparación de nuevos medicamentos antitumorales.

Descripción de la invención

Se han hecho numerosos esfuerzos para obtener glucosidaciones altamente específicas de compuestos de fórmula general (I) y compuestos colchicinoides relacionados, mediante reacciones químicas o mediante biotransformación.

La ruta química consiste en secuencias de reacciones complejas, no específicas, que implican de manera no selectiva diferentes sitios moleculares, conduce a una mezcla de derivados glucosidados, algunos de los cuales son inactivos. Por lo tanto, los rendimientos de conversión al producto eficaz específicamente glucosidado en C-3 del anillo aromático, son muy bajos.

El enfoque biológico se refiere sustancialmente a la biotransformación de compuestos colchicinoides, (que están indirectamente relacionados con compuestos de colchicona) tales como colchicina y tiocolchicina, cultivando Centella Asiatica, en monoderivados glucosidados en C-2 y en C-3 del anillo aromático; siendo dicha transformación, por lo tanto, no muy selectiva y proporcionando escasos rendimientos y productividad (Solet, J.M., et al., Phytochemistry 33, 4, 817-820, 1993).

Otros esfuerzos para biotransformar compuestos colchicinoides dieron simplemente desmetilaciones de los grupos metoxi unidos al anillo aromático (en C-2 y en C-3), de todas formas caracterizados siempre por rendimientos y productividad limitados y por una mala regioselectividad.

Por lo tanto, Hufford C.D. et al. (J. Pharm. Sc., 68, 10, 1239-1242, 1979), usando Streptomyces griseus y/o Streptomyces spectabilis, y Bellet P. et al., (documento GB-923421, 1959), usando diferente cepas de Streptomyces y de otras especies de Bacterias y Hongos, trataron de transformar la colchicina y sus derivados en los derivados 3-desmetilados correspondientes. Los resultados de estos procedimientos conocidos confirman lo indicado anteriormente en relación con la no selectividad de las enzimas microbianas implicadas, por ejemplo en C-2, C-3 o C-10 de la molécula alcaloide. Además, los niveles de productividad de dichos sistemas catalíticos son bastante malos, debido a los bajos rendimientos de conversión, las reducidas concentraciones de sustrato que pueden usarse, y la frecuente degradación del anillo de tropolona.

Más recientemente, Poulev et al. (J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33-38, 1995) han obtenido la desmetilación específica usando microorganismos bacterianos, aunque aún con peores rendimientos y productividad.

La actividad enzimática a partir de microorganismos similares a los mencionados anteriormente (Streptomyces, Bacillus, etc.) se ha aplicado a la biotransformación de otros compuestos, tales como maitansinoides (Patente de Estados Unidos Nº 4 361 650: Izawa, M., et al., J. Antibiotics, 34, 12, 1587-1590, 1981). En este caso la reacción catalizada consistía también exclusivamente en una desmetilación, caracterizada por bajos rendimientos de conversión y productividad.

Se han descrito las actividades de glicosil transferasa de \alpha-amilasa de cepas de Bacillus megaterium (Brumm., P.J., et al., Starch, 43, 8, 319-323, 1991), siendo la especificidad del aceptor (exclusivamente glucosa o glucósidos) particularmente alta. Las ciclodextrin-glucosilo transferasas, producidas por la misma fuente microbiana, catalizan una \alpha-1,4-transglucosilación de rubusosida (13-O-\beta-D-glucosil-steviol \beta-D-glucosilo éster), partiendo de almidón. También en esta bioconversión el aceptor de la reacción de transferasa es la fracción glúcido del sustrato (Darise, M., et al., Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483-2488, 1984). Las ciclodextrin-glucosilo transferasas se habían usado anteriormente para la preparación de las ciclodextrinas G6 y 30 G8 de almidón (Kitahata, S., Okada, S., Agric. Biol. Chem., 38, 12, 2413-2417, 1974).

Estos ejemplos ponen de manifiesto la alta especificidad por el sustrato de las actividades de glucosilo transferasa expresadas por Bacillus megaterium que implican únicamente aceptores glucosilo, haciendo imposible, por lo tanto, esperar cualquier reacción sobre metabolitos secundarios que tienen una estructura molecular diferente y compleja, tales como colchiconas. De hecho, no se conocen ejemplos del uso de dichos microorganismos para la conversión enzimática de compuestos colchicona a derivados 3-glucosilo.

Ahora se ha descubierto que las cepas de Bacillus megaterium capaces de crecer en presencia de altas concentraciones de colchicona (R_{1} = -OCH_{3}, R_{2} = -OCH_{3}), 3-desmetil-colchicona y los tio derivados respectivos, tienen una actividad de biotransformación extremadamente alta y muy específica de dichos sustratos en derivados glucosidados exclusivamente en C-3 del anillo aromático. Dicha transformación tiene lugar en tiempos muy cortos, y se caracteriza por rendimientos sorprendentemente altos.

Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de compuestos de 3-O-glucosilcolchicona de fórmula (I):

1

en la que R_{1} es un resto glucósido, particularmente un resto O-glucósido, R_{2} es alcoxi C_{1}-C_{6} o tioalquilo C_{1}-C_{6}, que comprende la biotransformación de compuestos en los que R_{1} es OH o metoxi mediante Bacillus megaterium.

Bacillus megaterium es una bacteria Gram-positiva generadora de esporas con un diámetro de célula mayor de 1,0 \mum; crece de manera aerobia en numerosos medios de cultivo; es positiva a catalasa; hidroliza gelatina. Las cepas de Bacillus megaterium que pueden usarse la invención resultaron capaces de crecer satisfactoriamente y de mantenerse viables también a altas concentraciones de colchicona, tiocolchicona (R_{1} = -OCH_{3}, R_{2} = -SCH_{3}) y derivados 3-desmetilo respectivos (por encima de 2 g/l), como se pone de manifiesto mediante el examen del crecimiento y mediante análisis al microscopio. Las especies congenéricas, tales como Bacillus cereus, ya a concentraciones de sustrato de 1 g/l ponen de manifiesto una dificultad en el crecimiento (absorbancias de 10-15% del control).

La alta selectividad y eficacia de la biotransformación es sorprendente y poco habitual, ya que los niveles de rendimiento varían del 70% al 95%.

Además, los microorganismos usados en la bioconversión son capaces de mantener permanentemente la actividad catalítica, incluso en etapas de fermentación repetidas, proporcionando por lo tanto la bioconversión específica en procedimientos continuos y discontinuos. Por lo tanto, este procedimiento proporciona altos niveles de productividad y reproducibilidad.

La destacada regioselectividad de la reacción asegura, además de unos rendimientos de producción notables, una alta calidad y pureza del producto resultante, proporcionándolo, de esta manera, con una pureza del 100%, con un simple procesado aguas abajo.

Además, son importantes ventajas la reducida frecuencia de la etapa de purificación y recuperación del producto, la economía del procedimiento y la afinidad y seguridad de uso.

Las secuencias operativas utilizables en el procedimiento de la invención comprenden:

A) - Selección de cultivos de Bacillus megaterium capaces de crecer en presencia de altas concentraciones de sustrato de colchicona, partiendo de fuentes naturales o de cepas recogidas.

B) - Selección de los aislados de A), para ensayar la actividad catalítica de transformación en los derivados 3-O-glucosilo correspondientes, mediante ensayos de bioconversión sobre los sustratos específicos, administrados en concentraciones que aumentan gradualmente.

C) - Caracterización microbiológica de las cepas seleccionadas en B).

D) - Aumento gradual en el rendimiento de biotransformación, mediante una selección específica de la diana de la población bacteriana de B).

E) - Estudio y optimización de los parámetros críticos de fermentación, para optimizar la biotransformación.

F) - Estudio y optimización de los procedimientos para la conservación de cultivos de alta productividad, para garantizar inóculos estables y homogéneos para aplicaciones productivas a escala industrial.

G) - Aumento de escala del procedimiento en fermentador, en procedimientos discontinuos, semi-continuos y continuos.

H) - Tratamiento y optimización de los procedimientos para el procesado aguas abajo y para la recuperación del producto.

Específicamente, los microorganismos utilizables en la presente invención pueden seleccionarse partiendo de cultivos de recogida obtenidos de los centros de depósito de cepas, o a partir de muestras de suelo de orígenes diversos, o a partir de cepas industriales preseleccionadas, mediante recuperación selectiva en diferentes medios agar que contienen una fuente de nitrógeno orgánico (peptonas, extractos de levadura, extractos cárnicos, asparagina, etc.), una fuente de carbono (glicerina, almidón, maltosa, glucosa, etc.), con pH de 5 a 8, preferiblemente 6-7. La temperatura de incubación varía de 20º a 45ºC, preferiblemente de 28º-40ºC.

La capacidad del cultivo para crecer en presencia de concentraciones tóxicas de sustrato de colchicona a transformar se evalúa mediante técnicas de dilución escalar y colocando en placas en paralelo, sobre diferente sustratos agarizados, habiendo añadido anteriormente a una parte de los cuales el compuesto de colchicona (por ejemplo: 3-desmetiltiocolchicona) en concentraciones de 0,1 a 3 g/l (como para inhibir el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos).

Las colonias capaces de crecer en las condiciones descritas son extraen en condiciones estériles y se colocan en diferentes medios agarizados, par verificar su pureza y la homogeneidad de crecimiento.

Los medios de cultivo usados para la conservación del cultivo son sustratos microbiológicos típicos, que contienen fuentes de nitrógeno orgánico (peptonas, extractos de levadura, triptona, extractos cárnicos, etc.), una fuente de carbono (glucosa, maltosa, glicerina, etc.), un pH de 5 a 8, preferiblemente 6-7. La temperatura de incubación varía de 20 a 45ºC, preferiblemente 28-40ºC.

Los microorganismos seleccionados se ensayan después para la capacidad de crecer en cultivo sumergido, en presencia de compuestos colchiconoides, y de transformar estos últimos en los derivados 3-glucosilo correspon-
dientes.

Dichos ensayos se realizaron en matraces de 100 ml que contenían 20 ml de medio líquido, con diferentes formulaciones del medio, que comprenden una o más fuentes de nitrógeno orgánico (extractos de levadura, peptonas, triptona, hidrolizados de caseína, extracto cárnico, agua de macerado de maíz, etc.), una o más fuentes de carbono (glucosa, glicerol, almidón, sacarosa, etc.), fuentes inorgánicas de fósforo y nitrógeno, y sales inorgánicas de diversos iones (K^{+}, Na^{+}, Mg^{++}, Ca^{++}, Fe^{++}, Mn^{++}, etc.).

Las muestras de cultivo pueden someterse opcionalmente a tratamientos mutagénicos, mediante las técnicas de mutagénesis convencionales (irradiación con rayos UV, etc.) para inducir mutantes que tienen una actividad de bioconversión específica que puede evaluarse con el mismo procedimiento que antes.

Las muestras de cultivo a partir de cada ensayo de bioconversión, se analizaron para evaluar la producción de derivados 3-glucosilo, mediante análisis por TLC y HPLC.

La capacidad del microorganismo seleccionado para transformar sustratos de colchicona en los derivados 3-glucosilo respectivos se confirmó mediante ensayos de bioconversión en matraces, a una escala de 300 ml, en los mismos caldos de cultivo que se usaron en la etapa de selección.

Los microorganismos que dieron una respuesta positiva se usaron en ensayos para la optimización de la bioconversión, en diferentes caldos de cultivo, en una escala de 300 ml. Los principales parámetros de cultivo y fermentación estudiados son: fuentes de nitrógeno orgánico, fuentes de carbono, sales minerales, temperatura, agitación-aireación, pH, tiempo de incubación, proporción de inóculo, etapas de subcultivo, tiempo y forma de adición del sustrato a transformar. Los microorganismos bacterianos seleccionados, capaces de realizar la biotransformación de la presente invención, pueden crecer en sustratos de cultivo sólidos y líquidos, que contienen una o más fuentes de nitrógeno orgánico, preferiblemente extracto de levadura, extracto cárnico, peptona, triptona, hidrolizados de caseína, agua de macerado de maíz; etc. Las fuentes de carbono útiles para el crecimiento y la biotransformación son glucosa, fructosa, sacarosa, glicerol, extracto de malta, etc., preferiblemente glucosa, fructosa y glicerina. El medio de cultivo contiene además fuentes de fósforo inorgánico y sales de K^{+}, Na^{+}, Mg^{++} NH_{4}^{+} etc.

Los microorganismos seleccionados pueden crecer a temperaturas de 20º a 45ºC, preferiblemente de 28º a 40ºC, un pH entre 5 y 8, preferiblemente 6-7. En las mismas condiciones, los microorganismos considerados son capaces de transformar los compuestos colchiconoides en los derivados 3-glucosilo correspondientes. Dichas transformaciones ocurren en cultivo sumergido, en matraces incubados en un agitador rotatorio, con agitación de 150 a 250 rpm.

Debido a la cinética particular de la biotransformación en cuestión, que está relacionada con el crecimiento microbiano, las condiciones óptimas para los propósitos de biotransformación son las mismas condiciones que son óptimas para el crecimiento. Por lo tanto, los medios de cultivo útiles para promover un buen crecimiento microbiano, tales como los basados, en los componentes orgánicos e inorgánicos citados anteriormente, también son útiles para una buena actividad de biotransformación del sustrato en cuestión. Este último se añade al cultivo en la etapa de fermentación de partida, o en alícuotas fraccionales empezando en el comienzo de la fermentación.

La biotransformación de la invención se basa en una conversión enzimática, que empieza durante la fase de crecimiento exponencial y continúa con una progresión paralela a la del crecimiento; los niveles máximos de conversión a derivado 3-glucosilo (muy alto: hasta el 95%) se alcanzan en las primeras 48-72 horas, dependiendo del tiempo de adición del sustrato. La regioselectividad de la biotransformación es absoluta: no se ha manifestado nunca la presencia de derivados 2-glucosilo en las muestras de cultivo. Los productos resultantes son exclusivamente
extracelulares.

El sustrato a transformar puede añadirse en una solución en acetona o alcohol, en mezclas alcohol-agua, en dioxano, etc. La biotransformación de la invención puede aumentarse de escala hasta el nivel de fermentador, manteniendo sin cambiar las condiciones de cultivo, en particular en lo que respecta al medio de cultivo, temperatura y tiempos de procesado. Para obtener buenos crecimientos, son importantes unos niveles adecuados de agitación-aireación, en particular se necesitan niveles de aireación de 1-2 litros de aire por litro de cultivo por minuto (vvm), preferiblemente de 1,5-2 vvm.

Los productos resultantes de la bioconversión se extraen de los caldos de cultivo después de la separación de la biomasa de la fracción líquida por centrifugación y recuperación del sobrenadante, o microfiltración y recuperación del permeado. El cultivo puede tratarse con alcoholes, en vista de una recuperación óptima del producto.

La purificación y la recuperación de los productos de biotransformación pueden realizarse usando técnicas cromatográficas para la separación sobre resinas de absorción y elución con alcoholes, preferiblemente con metanol. Las soluciones de hidrometanol que contienen el producto pueden purificarse adicionalmente por extracción con disolventes orgánicos lipófilos, preferiblemente con cloruro de metileno. Después de tratamientos adicionales con mezclas de alcoholes y disolventes orgánicos, el producto puede obtenerse en el estado puro a partir de las soluciones de alcohol resultantes por cristalización. La glucosa puede sustituirse con otros azúcares, tales como fructosa o galactosa, sin provocar la pérdida de la actividad glucosilo transferasa.

Los siguientes ejemplos describen la invención con mayor detalle.

Ejemplo 1

Las alícuotas de cultivos de Bacillus megaterium, aislados de suelo agrícola, se resuspenden en 20 ml de solución salina estéril, y se someten a dilución escalar hasta un factor de dilución de 1:10.000.000. Las suspensiones a diversas diluciones se ponen en placas en un medio de cultivo LB-Agar y sobre LB-Agar al que se añade respectivamente tiocolchicona o 3-desmetiltiocolchicona, hasta una concentración final de 2 g/l (véase la Tabla). Los cultivos se incuban a +28ºC, durante 3-4 días, en la oscuridad. Las colonias que crecen en el medio selectivo, añadidas con el compuesto colchicona, se aíslan y purifican poniendo en placas en medio no selectivo; dichas muestras se incuban como en el caso anterior, aunque durante un tiempo más corto (24 horas).

Posteriormente, los cultivos se transfieren al mismo medio de agar, en un tubo de ensayo, y se incuban como en el caso anterior durante 24 horas.

Las alícuotas de cultivos, seleccionadas como se ha descrito, se usan para inocular matraces Erlenmeyer de 100 ml que contenían 20 ml de medio de cultivo ST (Tabla), al que se había añadido tiocolchicona o 3-desmetiltiocolchicona, hasta una concentración final de 0,4 mg/ml. Dichos cultivos se incuban durante una noche a 28ºC, en un agitador rotatorio, a 200 rpm.

La transformación del sustrato de colchicona se comprueba mediante un análisis de alícuotas de caldos de cultivo, tomadas cada 3-4 horas, por TLC 30 sobre gel de sílice, con un sistema eluyente de acetona:acetato de etilo:agua 5:4:1.

Después de 4 días de incubación, las alícuotas de los cultivos, que demostraron una actividad catalítica evidente hacia el derivado 3-glucosilo, se recuperan sobre placas, mediante dilución escalar como se ha descrito anteriormente, para la preparación del nuevo inóculo en el tubo de ensayo. El ensayo de biotransformación en el matraz se repite en las mismas condiciones del caso anterior, aunque usando concentraciones finales mucho mayores de tiocolchicona y 3-desmetiltiocolchicona (1 mg/ml). Los cultivos sencillos más activos (conversión de sustrato igual a o mayor del 70%) se usan para la preparación de inóculos en criotubos congelados.

TABLA Formulación de los medios de cultivo

1) LB-Aqar	10 g/l
Triptona	5 g/l
Extracto de levadura	10 g/l
NaCl	15 g/l
Agar Agar
pH 7
Esterilización: 121ºC x 20'

2) Caldo ST
Glucosa	20 g/l
Glicerol	10 g/l
Peptona	15 g/l
Extracto de levadura	5 g/l
NaCl	3 g/l
NH_{4}Cl	3 g/l
K_{2}HPO_{4}	8 g/l
KH_{2}PO_{4}	3 g/l
MgSO_{4}, 7H_{2}O	0,5 g/l
pH 7
Esterilización: 121ºC x 20'

Ejemplo 2

Se repite el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, empezando con cultivos de Bacillus megaterium, derivados de la siguiente colección de cepas (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Alemania):

DSM 90

DSM 322

DSM 333

DSM 1667

DSM 1670

DSM 1671.

Los cultivos se seleccionan como en el Ejemplo 1 y se les añade tiocolchicona (1 mg/ml) se incuban durante 4 días en un cultivo líquido: el análisis por TLC detecta la transformación que le ocurre al sustrato en tiocolchicosona, con rendimientos de conversión que varían del 30 al 70%.

Ejemplo 3

Las alícuotas de muestras de cultivo en tubo de ensayo, seleccionadas como se ha descrito en el ejemplo anterior, se usan para inocular matraces Erienmeyer de 100 ml que contienen 20 ml de caldo ST.

Los caldos de cultivo se incuban a +30ºC, en un agitador rotatorio a 200 rpm, durante una noche. Después de la incubación, a los cultivos se les añade una solución estéril de glicerol hasta una concentración final del 20%. Los cultivos se dispensan después en criotubos de 2 ml y se sumergen inmediatamente en nitrógeno líquido.

Después de algunos días, el 10% de los cultivos se descongela rápidamente a 37ºC. Las alícuotas de cada criotubo se usan para inocular matraces Erienmeyer de 100 ml que contienen 20 ml de medio ST, que se-incuban posteriormente a +28ºC, durante una noche (precultivo), a 200 rpm. Después de la incubación, se transfieren 2 ml de cada precultivo en condiciones estériles a 20 ml de medio ST nuevo, al que se ha añadido 3-desmetiltiocolchicona hasta una concentración final de 1 g/l. La biotransformación se realiza y se comprueba en las condiciones descritas en el Ejemplo 1. El análisis confirmó que la transformación del sustrato en el derivado 3-glucosilo ocurrió en los términos cuantitativos descritos anteriormente (70% y mayor), proporcionando de esta manera la estabilidad catalítica de los cultivos
congelados.

Controles paralelos de los caldos de cultivos, puestos en LB Agar inmediatamente después de la descongelación, confirman la viabilidad, homogeneidad pureza de los cultivos congelados.

Ejemplo 4

Las alícuotas de cultivos en criotubo, después de la descongelación, se usan para inocular matraces Erienmeyer de 300 ml que contienen 50 ml de medio ST (precultivo). Después de la incubación durante una noche á 30ºC, a 250 rpm, se transfieren 5 ml de precultivo a 50 ml del mismo medio al que se ha añadido 3-desmetil-tiocolchicona hasta una concentración final de 1 g/l. Los cultivos se incuban durante 4 días, en las mismas condiciones como se ha descrito anteriormente.

Cada 4 horas, se toman muestras para evaluar el crecimiento del nivel (midiendo la absorbancia a 600 nm), la producción de tiocolchicosona; (TLC y HPLC, la esterilidad (sobre LB Agar), y para el examen morfológico con microscopio.

El análisis por TLC se realiza como se ha descrito en el Ejemplo 1. Para el análisis por HPLC, a fracciones de 1 ml de caldos de cultivo se les añaden 9 ml de metanol y se centrifugan a 13.000 rpm durante 2 minutos. El contenido de derivado 3-glucosilo del sobrenadante se analiza por HPLC en fase inversa, con elución isocrática, mediante el sistema eluyente agua:acetonitrilo 80:20.

El análisis por HPLC demuestra que, después de 72-96 horas, la bioconversión del sustrato a tiocolchisona se ha completado sustancialmente.

Los rendimientos finales al derivado 3-glucosilo, obtenidos mediante la bioconversión varían entre el 70 y el 85%.

Ejemplo 5

Se repite el procedimiento descrito en el Ejemplo 4, aunque se añade 3-desmetiltiocolchicona a los cultivos en dos fracciones: 0,25 g/l al principio y 0,74 g/l después de 24 horas.

Las respuestas de crecimiento y producción de los cultivos son similares a las obtenidas en el Ejemplo 4, con rendimientos de tiocolchisona de aproximadamente el 90%.

Ejemplo 6

Un litro de caldo ST en un matraz Erlenmeyer (inóculo) se inocula con un cultivo de criotubo. Los matraces se incuban durante una noche a +30º, 250 rpm. El inóculo se transfiere en condiciones estériles a un fermentador de 14 l, que contiene 9 l de caldo STL estéril. Se añade 3-desmetiltiocolchicona hasta una concentración final de 1 g/l (25% al principio, el resto después de 20 horas). La fermentación se realiza manteniendo niveles adecuados de agitación-aireación (agitación hasta 900 rpm; aireación de 1 a 1,5 vvm, dependiendo del crecimiento del cultivo).

Cada 2 horas, se toman muestras de los caldos de cultivo y se someten al siguiente análisis:

- Densidad óptica (OD) a 600 nm,

- Análisis de esterilidad y pureza de la cepa (en LB Agar);

- Morfología al microscopio (tinción Gram);

- Análisis del contenido de tiocolchicosona, por TLC y HPLC, como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 4, respectivamente.

Después de aproximadamente 48 horas de fermentación, la transformación del sustrato a tiocolchisona está casi acabada. El rendimiento final es de aproximadamente el 85%.

Ejemplo 7

Se repite el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, aunque después de 48 horas de fermentación, solo se recupera el 90% de los caldos de cultivo, para extraer el producto (fracción 1). El 10% residual se añade en condiciones estériles al fermentador con 9 l de medio ST estéril nuevo que contenía 10 g de 3-desmetiltiocolchicona. La fermentación se realiza como se ha descrito en el Ejemplo 6. Después de 48 horas, se recogen 9 l de caldos de cultivo y se extraen (fracción 2).

El volumen residual de los caldos de cultivo se añade en condiciones estériles con 9 litros más de medio ST estéril nuevo que contiene 3-desmetiltiocolchicona nuevo (10 g). La fermentación se realiza como en el caso anterior. Después de 48 horas el caldo de cultivo se recoge completamente y se extrae (fracción 3). La actividad de biotransformación de la cepa permaneció estable durante las tres pruebas, con rendimientos de conversión de aproximadamente el 80%.

Ejemplo 8

El caldo de cultivo final de la fermentación (volumen total: aproximadamente 27 l) se concentra al vacío hasta dar un residuo blando y se recoge con etanol.

Después de la separación por filtración, la fracción agua-etanol se concentra a agua, al vacío, y sé purifica por extracciones repetidas con cloruro de metileno. Las fracciones acuosas se concentran y, después de ajustar el pH a 10 con hidróxido sódico, se extraen con mezclas clorometileno-etanol.

Las fases orgánicas combinadas se concentran al vacío. A la suspensión resultante se le añade etanol, se concentra y se deja cristalizar. Se realiza una segunda cristalización con etanol después de las etapas adicionales de redisolución del sólido en mezclas clorometileno-etanol.

Claims

1. Un procedimiento para la preparación de compuestos 3-glucosilcolchicona de fórmula (I):

2

en la que R^{1} es un resto glucósido, R^{2} es alcoxi C_{1}-C_{6} o tioalquilo C_{1}-C_{6}, que comprende la biotransformación de compuestos en los que R_{1} es OH o metoxi mediante Bacillus megaterium.

2. Un procedimiento para la preparación de los compuestos de fórmula (I) en los que R_{1} es un resto O-glucósido.

3. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que las cepas de Bacillus megaterium se seleccionan por su capacidad de crecer en presencia de altas concentraciones de sustrato de colchicona a transformar.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dichas concentraciones varían de 0,1 a 3 g/l.

5. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, en el que Bacillus megaterium se cultiva en un medio sólido o líquido.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho medio comprende al menos una fuente de nitrógeno orgánico.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha fuente de nitrógeno orgánico se selecciona entre el grupo constituido por extracto cárnico, peptona, triptona, hidrolizados de caseína, agua de macerado de maíz.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el medio comprende al menos una fuente de carbono.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha fuente de carbono se selecciona entre el grupo constituido por glucosa, fructosa, glicerol.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho medio comprende al menos una fuente de sales inorgánicas de K^{+}, Na^{+}, Mg^{++} NH_{4}^{+}.

11. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-10, que se realiza a un pH que varía de 5 a 8.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho pH varía de 6 a 7.

13. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-12, que se realiza a una temperatura que varía de 20º a 45ºC.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha temperatura varía de 28 a 40ºC.

15. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-14, que se realiza a un nivel de aireación máximo de 1 a 2 litros de aire por litro de cultivo por minuto (vvm).

16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15 en el que dicho nivel varía de 1,5 a 2 vvm.