ES2264441T3 - Cribado de alta calidad por medicion de niveles intracelulares de calcio. - Google Patents
Cribado de alta calidad por medicion de niveles intracelulares de calcio.Info
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Abstract
Un procedimiento para determinar in vitro si un compuesto candidato es un agonista o un inhibidor de una proteína usando células que contienen un mensajero sensible al calcio comprendiendo los pasos de: (a) proporcionar células que expresan la proteína y contienen un mensajero sensible al calcio; (b) exponer las células a un quelante de calcio bajo condiciones en las que el quelante entre en la célula y resida intracelularmente; (c) exponer una primera porción de las células a un compuesto candidato y reservando una segunda porción de células no expuestas al compuesto candidato; (d) medir la señal generada en la primera porción y la señal generada en la segunda porción de las células; y (e) comparar la cantidad de señal generada en la primera y segunda porciones de las células donde un aumento en la cantidad de señal en presencia del compuesto candidato indica que el compuesto candidato es un agonista de la proteína. donde la señal generada por el mensajero sensible al calcio es retardada por la presencia del quelante de calcio dentro de las células y la proteína es un receptor acoplado a proteína-G o un canal iónico que está acoplado a un canal de calcio.
Description
Cribado de alta calidad por medición de niveles
intracelulares de calcio.
La invención se relaciona con ensayos en los que
se usan quelantes intracelulares para alterar la cinética de
generación de señal desencadenada por cationes divalentes,
particularmente calcio.
Una variedad de ensayos funcionales basados en
células utilizan medidas de la concentración de calcio intracelular
para evaluar la actividad de proteínas en un ambiente fisiológico
normal. Estos incluyen ensayo para receptores acoplados a
proteína-G (GPCR) y canales iónicos de membrana
plasmática. El gran y rápido aumento de la concentración de calcio
intracelular mediante la estimulación de estos receptores y canales
iónicos puede detectarse mediante sondas sensibles al calcio
intracelular, incluyendo colorantes fluorescentes, proteínas
ligantes de calcio tales como la proteína bioluminiscente,
aequorina, y el chimer de la proteína calmodulina verde fluorescente
modificada (Ungrin, M.D., Singh, L.M.R., Stocco, R., Sas, D.E.,
Abramovitz, M. (1999) An automated aequorin
luminescence-based functional calcium assay for
G-protein-coupled receptors.
Anal. Biochem. 272, 34-42; Takahashi,
A., Camacho, P., Lechleiter, J.D., and Herman, B. (1999).
Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews
79, 1089-1125; Gonzalez, J.E., Oades, K.,
Leychis, Y., Harootunian, A., and Negulescu, P. (1999)
Cell-based assays and instrumentation for screening
ion-channel targets. Drug Discovery Today
4, 431-439; Miyawaki, A., Llopsi,J., Heim,
R., McCaffery, J.M., Adams, J.A., Ikura, M., and Tsien, R.Y. (1997)
Fluorescent indicators for Ca^{2+} based on green fluorescent
proteins and calmodulin. Nature 388,
882-887; Creton, R., Kreiling, J.A., and Jaffe, L.F.
(1999) Calcium imaging with chemiluminescence. Microsc. Res.
Tech. 46, 390-397; Prasher, D., McCann,
R.O., and Cormier, M.J. (1985) Cloning and expression of the cDNA
coding for aequorin, A bioluminescent
calcium-binding protein. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 126, 1259-1268).
La detección de cambios rápidos y transitorios
en la concentración de calcio intracelular requiere instrumental que
simultáneamente mezcle un estimulante con células e inmediatamente
detecte el cambio de fluorescencia o luminiscencia del informador de
calcio. Este requerimiento de una distribución del líquido y
detección de señal simultáneos ha limitado la aplicación de estas
medidas transitorias de calcio en ensayos funcionales basados en
células debido a la ausencia de un instrumental económicamente
viable. La presente invención demuestra la utilidad de un agente
quelante del calcio intracelular para retardar y/o prolongar la
respuesta de señalización de calcio en un formato de cribado de alta
densidad tal como portaobjetos micrograduados de 96, 384, 1526 ó
3456 pocillos. La alteración de la cinética de la señal de calcio en
presencia del quelante mantiene la integridad del ensayo mientras
proporciona mayor tiempo para medir la señal transitoria después de
la adición del estimulante. Por tanto también pueden llevarse a cabo
ensayos funcionales de cribado de alta capacidad con una mayor
variedad de instrumentos de laboratorio.
Los practicantes de la técnica de cribado han
estado tratando de proporcionar procedimientos para prolongar el
tiempo disponible para medir señales fluorescentes o luminiscentes.
Por ejemplo, una idea era añadir un reactivo para alterar o
ralentizar la cinética de una reacción enzimática del informador
celular. Son ejemplos de esta aproximación la transformación de
luminiscencia basada en el destello de la luciferasa en formatos de
luminiscencia incandescente tales como el Kit de Ensayo Génico del
Informador de Luciferasa PACKARD LUCLITE® (ver Patente de EE.UU.
Número 5.618.682 y Solicitud de la Patente EPO 94 102 080.2) o el
Sistema de Ensayo de Luciferasa PROMEGA
STEADY-GLO^{TM} (ver Patente de EE.UU. Número
5.283.179).
Los quelantes intracelulares de calcio se usan
habitualmente para eliminar las respuestas de calcio en una variedad
de sistemas, pero las cinéticas de las respuestas de calcio
intracelular habían sido inicialmente descritas en ausencia de
quelantes (Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J.D., and Herman,
B. (1999). Measurement of intracellular calcium. Physiological
Reviews 79, 1089-1125; Struk, A., Szucs,
G., Kremmer, H., and Melzer, W. (1998) Fura-2
calcium signals in skeletal muscle fibres loaded with high
concentrations of EGTA. Cell Calcium 23,
23-32; Keller, J.N., Guo, Q., Holtsberg, F.W.,
Bruce-Keller, A.J., and Mattson, M.P. (1998)
Increased sensitivity to mitochondrial toxin-induced
apoptosis in neural cells expressing mutant
presenilin-1 is linked to perturbed calcium
homeostasis and enhanced oxyradical production. J. Neurosci.
18, 4439-4450). Sin embargo, en intentos
para comprender las propiedades neuro-protectoras de
BAPTA-AM, se han estudiado con cierto detalle los
efectos de este quelante sobre los transitorios de calcio
intracelular (Tymianski, M., Wallace, M.C., Spigelman, I., Uno, M.,
Carlen, Pl L., Tator, Ch H., and Charlton, M.P. (1993)
Cell-permeant Ca^{2+} chelators reduce early
excitotoxic and ischemic neuronal injury in vitro and in
vivo. Neuron 11, 221-235). Por
ejemplo, cuando se usaron elevadas concentraciones de glutamato
para estimular neuronas del cordón espinal del ratón,
BAPTA-AM fue protector, y afectó primeramente al
tránsito rápido reduciendo la amplitud y retardando el tiempo de
ascenso y caída del tránsito (Tymianski, M., Charlton, M.P., Carlen,
Pl L., and Tator, Ch H. (1994) Properties of neuroprotective
cell-permeant Ca^{2+} chelators: Effects on
[Ca^{2+}]_{i} and glutamate neurotoxicity in
vitro. J. Neurophys. 72,
1973-1992). Se obtuvieron resultados similares
usando influjo de calcio inducido con ionomicina donde los tránsitos
de calcio observados fueron hasta 8 veces más lentos en presencia de
BAPTA-AM (Collatz., M.B., Rudel, R., and Brinkmeier,
H. (1997). Intracellular calcium chelator BAPTA protects cells
against toxic calcium overload but also alters physiological calcium
responses. Cell Calcium 21,
453-459).
\newpage
Ahora se ha descubierto que tamponando el calcio
intracelular con un reactivo ligante del calcio se puede retardar
y/o prolongar la respuesta de señalización de calcio de una forma
que puede ser aplicado prácticamente ensayos de cribado de alto
rendimiento.
La presente invención proporciona ensayos en los
que se usan quelantes intracelulares para alterar la cinética de
generación de señal desencadenada por cationes divalentes,
particularmente la acumulación de calcio en el citoplasma celular.
El uso de un quelante intracelular en el ensayo puede retardar y
prolongar la señal, permitiendo que la señal sea detectada por
instrumental automatizado sin necesidad de manipulación simultánea
de líquido en el momento de la detección.
Un aspecto de esta invención es un ensayo de
elevado rendimiento en el que células que tienen un receptor, que
mediante activación induce un influjo de calcio dentro de la célula,
se ponen en contacto con un quelante de calcio intracelular. En
formas de realización preferidas el quelante es
tetra(acetoximetil)éster de ácido
1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'
tetracético (BAPTA-AM). En formas de realización
particulares, las células también contienen un sistema de generación
de señal basado en aequorina, o basado en colorante fluorescente, o
basado en el chimer de la proteína calmodulina verde fluorescente
modificado. En una realización preferida, el ensayo se desarrolla en
un formato de portaobjetos micrograduado y se usa un instrumento
para detectar la señal en cada
pocillo.
pocillo.
Por "alrededor de" se quiere decir dentro
del 10% al 20% superior o inferior que lo mencionado
particularmente.
Tal como se usa aquí un "agonista" es un
compuesto o molécula que interactúa con y estimula una actividad de
un receptor.
Tal como se usa aquí un "antagonista" es un
compuesto que interactúa con un receptor e inhibe o interfiere en la
activación del receptor.
Tal como se usa aquí un "inhibidor" es un
compuesto o molécula que interactúa con e inhibe o impide la
activación de un receptor.
La Fig. 1 muestra cinéticas de la luminiscencia
dependiente de calcio tras la adición de un quelante intracelular en
un ensayo usando un canal iónico coexpresado con apoaequorina.
La Fig. 2 muestra representación esquemática del
ensayo de luminiscencia funcional basado en células con quelante
intracelular en un ensayo usando un canal iónico coexpresado con
apoaequorina.
La Fig. 3 muestra efecto de un antagonista de
receptor sobre la cinética de la luminiscencia tras la adición de un
quelante intracelular en un canal iónico coexpresado con
apoaequorina.
La Fig. 4 muestra la cinética más o menos el
quelante de calcio intracelular en un ensayo usando un GPCR
coexpresado con apoaequorina.
La Fig. 5 muestra la cinética de la
luminiscencia dependiente de calcio tras la adición de un quelante
intracelular en un ensayo usando un canal iónico.
La Fig. 6 muestra que el BAPTA retarda la
respuesta de calcio en células VR1 como se midió mediante
fluorescencia fluo-3. Se cultivaron las células VR1
en portaobjetos de ensayo de 96 pocillos toda la noche y después se
cargaron con fluo-3 AM 5 \muM durante 30 minutos,
en ausencia o en presencia de la concentración indicada de
BAPTA-AM según se describe en Materiales y Métodos.
Las células se lavaron y se añadió PBS o capsazepina 20 \muM
durante 30 minutos. Después se leyó el portaobjetos en un detector
de fluorescencia VIPR (ex.480 nm; em. 535 nm; Gonzalez, J.E., Oades,
K., Leychis, Y., Harootunian, A., and Negulescu, P. (1999)
Cell-based assays and instrumentation for screening
ion-channel targets. Drug Discovery Today
4, 431-439) y al que se añadió capsaicina 0,5
\muM (A) ó 0,1 \muM (B) tras leer durante 8 s, y se continuó
registrando durante un total de 180 s. Los datos se obtuvieron a 1
Hz y todos los datos se normalizaron a la fluorescencia de base
inicial (2-5 s). Los datos mostrados son la media de
cuatro pocillos idénticos.
La Fig. 7 muestra que el BAPTA retarda la
respuesta del calcio en células VR1 según se midió mediante
luminiscencia de aequorina. VR1 se expresó establemente en células
HEK-293, que también expresan apoaequorina. Se
cultivaron las células en portaobjetos de ensayo de 96 pocillos toda
la noche y después se incubaron durante 2 horas con el sustrato
coelenterazina (5 \muM) para convertir la apoaequorina en
aequorina. Las células se lavaron con PBS y después se incubaron con
la concentración indicada de BAPTA-AM durante 30
minutos. Tras un lavado con PBS, se añadió a las células PBS o
capsazepina 50 \muM durante 30 minutos o más. Entonces los
portaobjetos se leyeron en un luminómetro WALLAC MICROBETA JET. (A)
Los datos se obtuvieron a 1 Hz tras la adición de capsaicina 50 nM.
Los datos son la media de seis pocillos individuales. (B) En
experimentos paralelos, se comparó el tiempo al cual tuvo lugar el
pico de luminiscencia (media de seis determinaciones) tras la
incubación con las concentraciones indicadas de
BAPTA-AM con la concentración de capsaicina añadida
por el WALLAC MICROBETA JET.
La Fig. 8 muestra que el BAPTA retarda la
respuesta del calcio en células hGHSR1A según se midió tanto
mediante fluorescencia como por luminiscencia. Se cultivaron células
que expresan hGHSR1A en portaobjetos de ensayo de 96 pocillos toda
la noche y después se cargaron con (A)
fluo-4-AM 5 \muM durante 70
minutos según se describe en la Fig. 2 o con (B) coelenterazina 5
\muM según se describe en la Fig. 3. Las células se lavaron con
PBS y después se incubaron con las concentraciones indicadas de
BAPTA-AM durante 30 minutos. Las células se lavaron
de nuevo con PBS y luego se incubaron con o sin
L-756,867 10 \muM durante 30 minutos. (A)
Respuesta de fluorescencia en el VIPR (ex.480 nm; em. 535 nm) tras
la adición de ghrelin 100 nM. Los datos se normalizaron a la
fluorescencia de base inicial (2-5 s) y representan
la media de 12 ó 4 pocillos en ausencia o en presencia de
L-756,867, respectivamente. (B) Luminiscencia de
aequorina medida en el WALLAC MICROBETA JET tras la adición de
ghrelin 100 nM. Los datos son la media de 6 pocillos y la gráfica
insertada muestra los datos del BAPTA-AM 20 \muM
en una escala distinta con la desviación estándar para cada
determinación de 1 segundo.
La Fig. 9 muestra que el BAPTA retarda la
respuesta del calcio en células HEK-AEQ según se
midió mediante fluorescencia fluo-4. Las células
HEK-AEQ tienen un mAChR endógeno que se acopla al
InsP_{3} interpuesto en la liberación de calcio a partir de
reservorios intracelulares. (A) Se cultivaron las células toda la
noche en portaobjetos de ensayo de 96 pocillos y después se
incubaron durante 60 minutos con
fluo-4-AM 5 \muM +/- la
concentración indicada de BAPTA-AM. . Las células se
lavaron con PBS y se les añadió PBS o atropina 50 \muM durante 15
minutos. Después se leyó el portaobjetos en un detector de
fluorescencia VIPR (ex.480 nm; em. 535 nm) y al que se añadió
muscarina 10 \muM después de 8 s. Los datos se obtuvieron a 1 Hz y
todos los datos se normalizaron a la fluorescencia de base inicial
(2-5 s). Las líneas representan la media de 6
pocillos individuales. (B) Idéntico a (A) excepto que todos los
pocillos se incubaron con BAPTA-AM 3 \muM y las
concentraciones indicadas de atropina. Antes de la adición de
muscarina 10 \muM, el VIPR leyó la fluorescencia de cada pocillo
durante 5 s. Para determinar la estabilidad de la señal de
fluorescencia, hubo una demora de 5 minutos tras la adición de
muscarina antes de que se leyera el portaobjetos en el VIPR durante
otros 5 s. Los puntos representan la media y desviaciones estándar
del cambio en fluorescencia registrado en 8 pocillos
individuales.
La Fig. 10 muestra la inhibición de respuestas
de luminiscencia medidas 2 minutos después de de añadir ghrelin o
capsaicina. Las células se prepararon para la lectura de
luminiscencia en el WALLAC MICROBETA JET según se describe en la
Fig. 3 sin BAPTA-AM (\Delta), con
BAPTA-AM 3 \muM (\medcirc), o con
BAPTA-AM 10 \muM (\Box). (A) Células hGHSR1A
incubadas con las concentraciones indicadas de
L-756,867. (B) Células VR1 incubadas con la
concentración indicada de capsazepina. Se añadió manualmente ghrelin
100 nM (A) o capsaicina 0,5 \muM (B) a seis pocillos y después de
2 minutos se leyó la luminiscencia durante 10 s. cada punto es la
media y desviación estándar de 1-10
determinaciones.
La presente invención proporciona ensayos en los
que se usan quelantes intracelulares para alterar la cinética de
generación de señal desencadenada por cationes divalentes,
particularmente influjo de calcio dentro de la célula. El uso de un
quelante intracelular en el ensayo puede retardar y prolongar la
señal, permitiendo que la señal sea detectada mediante instrumental
automatizado sin la necesidad de manipulación simultánea de líquido
en el momento de la detección.
La presente invención es aplicable generalmente
para medir niveles intracelulares de calcio mediante fluorescencia,
luminiscencia u otras técnicas de detección porque el receptor, la
enzima o la reacción particular no es inhibida directamente,
solamente se alteran las cinéticas de generación de señal alterando
los niveles de calcio libre. Mientras quelantes específicos de
calcio tales como BAPTA y EGTA se han usado extensivamente para
tamponar niveles extracelulares e intracelulares de calcio, la
presente invención emplea quelantes intracelulares para afectar a la
cinética del mensajero sensible al calcio (sea proteína, enzima o
químico). El resultado es que la señal se retarda y se extiende.
Además la invención tiene aplicación particular para el cribado de
alta capacidad y ensayos funcionales con células completas para
compuestos con actividad biológica.
Como premisa más general, se puede usar
cualquier tipo de proteína o compuesto que rápidamente pueda ligar y
secuestrar calcio intracelular. Se puede probar si un reactivo
ligante de calcio particular es apropiado probándolo en un ensayo
tomado aquí y comparando el resultado con el ensayo desarrollado
usando BAPTA-AM.
La invención incluye el uso de quelantes de
calcio celulares permeables, tales como BAPTA-AM,
tetra(acetoximetil)éster del ácido
1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'
tetracético, para regular cambios en niveles de calcio celulares. El
proceso es aplicable al cribado de compuestos con actividad
biológica donde se miden cambios rápidos y transitorios en el calcio
celular. Los ejemplos incluyen la evaluación de agonistas o
antagonistas del receptor para canales iónicos de calcio o
receptores acoplados a proteína-G (GPCR's), que
obtienen cambios en la concentración de calcio intracelular. La
adición del quelante de calcio BAPTA-AM a las
células tampona la respuesta de calcio y altera la cinética de la
señal de calcio como se midió mediante mensajeros intracelulares
tales como la proteína aequorina bioluminiscente sensible al calcio
o proteínas fluorescentes o sondas sintéticas tales como los
colorantes de calcio fluorescentes (Fura 2, Fluo 3, Quin 2, Indo 1,
etc.).
Cuando un quelante de calcio intracelular tal
como BAPTA-AM se añade a células
(1-50 \muM) la estimulación de los receptores no
se ve afectada pero la señal generada por los mensajeros se retarda
debido al tamponamiento de la concentración de calcio libre mediante
quelación. El resultado es el retraso de la señal dependiente de
calcio (tal como cambios de luminiscencia o fluorescencia) varios
segundos y la prolongación de la señal varios minutos. Mientras
muchos ensayos funcionales para la señalización de calcio se
denominan ensayos "de destello" porque son instantáneos y
transitorios (completos en unos pocos segundos del estímulo) la
adición del reactivo retardante, BAPTA-AM, permite
que la señal sea leída por instrumentos sin manipulación simultánea
de líquido.
Se puede discutir un modelo para cómo la
quelación de calcio por BAPTA podría retardar la luminiscencia de la
aequorina con referencia a la Fig 2. BAPTA-AM se usa
para cargar el quelante de calcio BAPTA dentro de las células antes
de la estimulación. Incrementos del calcio intracelular, tal como
ocurre cuando la capsaicina se liga al receptor VR1, provocarán que
la aequorina oxide la coelenterazina a coelenteramida con liberación
concomitante de fotones. La emisión de luz podría prevenirse si un
quelante de calcio como BAPTA liga el calcio libre más rápidamente
que la aequorina. Las tasas relativas de unión determinarían
entonces la cantidad de calcio que se liga a la aequorina (u otros
mensajeros sensibles al calcio) en oposición a BAPTA. La diferencia
en la tasa de unión puede depender de muchos factores tales como:
tasas de asociación inherentes, concentración libre de calcio y
BAPTA y aequorina disponibles. Ya que BAPTA se puede cargar en las
células a concentraciones al menos 10 veces mayores que su afinidad
por el calcio, es probable que su capacidad para quelar el influjo
de calcio intracelular se determine mediante la concentración de
BAPTA libre obtenida en el citoplasma, no mediante la concentración
de calcio libre. Como el BAPTA libre se une al calcio, un influjo
adicional de calcio inicialmente provocaría luminiscencia de la
aequorina. La inactivación del receptor como otra tamponación del
calcio dentro de la célula, ralentizará finalmente el influjo de
calcio. Entonces la luminiscencia puede prolongarse según el BAPTA y
otra capacidad tamponadora celular devuelve lentamente calcio al
citoplasma de la célula hasta que el calcio regresa a niveles de
reposo o se agota la aequorina.
Esta invención proporciona protocolos que
retardan la respuesta del calcio según se ha medido por mensajeros
sensibles al calcio mediante el uso de un quelante de calcio celular
permeable, por ejemplo, BAPTA-AM. Estos protocolos
son útiles para mensajeros fluorescentes y luminiscentes sensibles
al calcio. Por ejemplo, la señal de calcio causada por activación de
un canal de calcio de apertura mediante ligando en una línea celular
que expresa aequorina puede retardarse varios segundos y prolongarse
la respuesta varios minutos con BAPTA sin reducir
significativamente la producción total de señal. Esto significa que
las señales de calcio rápidas y transitorias que previamente
requerían instrumental que simultáneamente inyectase y midiese estas
señales ahora se pueden desarrollar mediante una multitud de otros
instrumentos. Los procedimientos de esta invención se pueden aplicar
convenientemente a ensayos funcionales con células completas de un
canal iónico de calcio y un receptor acoplado a
proteína-G. En ambos casos la demora de las señales
de fluorescencia o luminiscencia es suficiente para la adición
simultánea de agonista a múltiples pocillos mediante un sistema
externo de manipulación de líquido seguido por una rápida
transferencia en sistemas de imagen de fluorescencia o
luminiscencia, por ejemplo, el PE BIOSYSTEMS NORTHSTAR^{TM} HTS
Workstation.
Se han adoptado prontamente ensayos de
luminiscencia incandescente en posibilidades de cribado de alta
capacidad por sus altas sensibilidades intrínsecas y señales de vida
larga. Las señales para sistemas de quimioluminiscencia tales como
los genes del mensajero de la luciferasa y la
\beta-galactosidasa o para conjugados de la
fosfatasa alcalina son a menudo estables durante varias horas. Los
ensayos de luminiscencia de destello han recibido menos atención
para el cribado primario que los ensayos de incandescencia y han
sido relegados a un papel de cribado más secundario. Hay, sin
embargo, de forma creciente una necesidad de evaluar la actividad de
grandes bibliotecas químicas en ensayos funcionales con células
completas que pueden ser desarrollados en un formato de cribado de
alta capacidad.
Un ejemplo de un ensayo funcional basado en
luminiscencia de destello es la medición de las rutas de
señalización de calcio en células que contienen la proteína
bioluminiscente, aequorina (Button, D., and Brownstein, M. (1993)
Aequoring-expressing mammalian cell lines used to
report Ca^{2+} mobilization. Cell Calcium 14,
663-671). La aequorina es un enzima dependiente de
calcio que produce luz (466 nm) por oxidación de la coelenterazina.
Típicamente, los ensayos celulares funcionales basados en aequorina
para receptores acoplados a proteína-G (GPCRs) o
canales de calcio de apertura mediante ligando se inician mediante
la adición de agonista que incrementa la concentración intracelular
de calcio a partir de reservorios intracelulares o por entrada de
calcio externo. El incremento de la concentración de calcio
intracelular inicia la reacción de la aequorina con su sustrato
dando lugar a una rápida señal de luminiscencia. La cinética de esta
respuesta de luminiscencia de destello se demuestra en la Fig. 1
donde las señales de luminiscencia para la activación de un canal de
calcio de apertura mediante ligando o GPCR alcanzan sus niveles
máximos niveles en sólo unos pocos segundos y son completas en menos
de un minuto. Por lo tanto la detección de estas señales debe
hacerse simultáneamente a la adición del agonista. Para ensayos
desarrollados en portaobjetos micrograduados, esto requiere un
luminómetro que tenga inyección de líquido y habilidades de
detección de muestra simultáneas.
Este requerimiento de distribución de líquido y
detección de la señal simultáneas ha limitado la aplicación de estas
medidas transitorias de calcio en pantallas HTS. Una ventaja
principal de esta invención, usando un quelante para retardar la
cinética del calcio, es que capacita ensayos funcionales HTS sin
instrumental costoso. Con la presentación del FLIPR (MOLECULAR
DEVICES)(Sullivan, E., Tucker, E.M., and Dale, I.L. (1999)
Measurement of [Ca^{2+}] using the fluorometric imaging plate
reader (FLIPR). Calcium Signaling Protocols 114,
125-133), al menos ahora es posible registrar
fluorescencia de portaobjetos con 96 y 384 pocillos con adición
simultánea de líquido, pero este es un instrumento caro que
generalmente no es accesible. Normalmente no hay instrumentos
equivalentes para medir luminiscencia.
Hay disponibles varios detectores comerciales de
luminiscencia y fluorescencia que pueden inyectar líquido
simultáneamente en uno o múltiples pocillos, tal como el WALLAC
VICTOR2 (pocillo sencillo), MICROBETA®JET (seis pocillos), o AURORA
VIPR (ocho pocillos). Típicamente, estos instrumentos requieren de
12 a 96 minutos para leer un portaobjetos de 96 pocillos en modo de
luminiscencia de destello o fluorescencia (1 min/pocillo)
-preferentemente un periodo largo para la mayoría de las
aplicaciones de cribado de alta capacidad. Un procedimiento
alternativo es el de inyectar el estimulante/agonista en todos los
pocillos de muestra al mismo tiempo y medir la luminiscencia en todo
el portaobjetos generando imágenes con una cámara CCD, similar a la
forma en que se leen las respuestas del calcio mediante colorantes
fluorescentes sensibles al calcio en el FLIPR o en instrumentos
FLIPR-384. Se esperan otros sistemas de generación
de imágenes de luminiscencia o fluorescencia con manipulación de
líquido integrada de otros suministradores comerciales tales como la
segunda generación de LEADSEEKER de AMERSHAM, el generador de
imágenes de microportaobjetos ultraHTS WALLAC VIEWLUX^{TM}, y el
generador de imágenes MOLECULAR DEVICES CLIPR.
Recientemente, PE BIOSYSTEMS TROPIX presentó un
luminómetro basado en CCD, el NORTHSTAR^{TM} HTS Workstation. Este
instrumento no tiene capacidad de distribución de líquido simultánea
pero es capaz de distribuir rápidamente líquido en portaobjetos
micrograduados con 96 y 384 pocillos mediante un distribuidor
externo de 8 ó 16 cabezas y después puede transferir rápidamente el
portaobjetos a una cámara CCD que genera imágenes de todo el
portaobjetos. El tiempo total para distribuir el líquido dentro del
portaobjetos y transferirlo al lector puede llevar 10 segundos o
más, no suficientemente rápido para muchos ensayos de destello que
se completan en 5-10 segundos. También se esperaría
que la integración de los sistemas de manipulación de líquido en los
sistemas de detección requiriera inherentemente tiempos de procesado
entre la distribución de líquido y la transferencia del portaobjetos
de 10 segundos o mayores. La presente invención demuestra la
utilidad de un agente quelante de calcio intracelular para retardar
y/o prolongar la respuesta de señalización del calcio
suficientemente para ser medida mediante instrumental sin capacidad
de distribución de líquido simultánea tal como el NORTHSTAR^{TM}
HTS Workstation.
La efectividad de la presente invención se
demuestra en un ensayo celular funcional modelo basado en aequorina
para un canal de calcio de apertura mediante ligando. Para este
ensayo, se cultivaron células HEK293 que co-expresan
el receptor de interés y apoaequorina para confluir en portaobjetos
BIOCOAT micrograduados de
poli-D-lisina blancos opacos con 96
pocillos (BECTON DICKINSON). Las células se mantuvieron en un medio
de crecimiento estándar. Las células se cargaron con un medio de
crecimiento estándar suplementado con 5 \muM de coelenterazina h
(MOLECULAR PROBES, Eugene, OR) durante 2 horas a 37ºC en un
incubador humidificado al 5% de CO_{2}. Después las células
cargadas se lavaron y cargaron con tampón de ensayo.
La adición del agonista provocó la señal
luminiscente rápida y transitoria que se completó en
10-15 segundos (Fig. 1). Se siguió la cinética de la
señal luminiscente de destello usando un instrumento WALLAC
MICROBETA JET donde el agonista se inyectó directamente en los
pocillos que contenían las células cargadas. Como reactivo
tamponador se usó el acetoximetil éster permeable celular
BAPTA-AM. BAPTA es un quelante específico de calcio
que rápidamente se une y libera calcio. La adición de
BAPTA-AM a las células fue igualmente eficaz
incluyendo el quelante durante la carga de células con
coelenterazina o mediante una incubación posterior en medio de
cultivo durante 1 hora a 37ºC y 5% de CO_{2}. Una representación
esquemática de este ensayo aparece en la Fig. 2.
La adición de niveles crecientes de
BAPTA-AM (0-30 \muM) provocó un
retardo inicial en la señal de luminiscencia basada en aequorina
tras la inyección de agonista y prolongó la señal más allá de 30
segundos (Fig. 1). La adición de un antagonista del receptor fue
capaz de bloquear completamente la señal (Fig. 3). La adición
posterior de tampón de lisis (0,1% de tritón X100) demostró que el
descenso en la señal era atribuible al bloqueo competitivo de la
señal de calcio mediada por receptor mediante el antagonista.
Mientras la cinética de la respuesta de la aequorina se alteró
tamponando con BAPTA, el conjunto de la señal no se suprimió
significativamente.
Para demostrar la utilidad genérica de un
reactivo tan retardante de la señal de calcio, el quelante ejemplar
BAPTA-AM se probó en un ensayo celular funcional
basado en aequorina para un receptor acoplado a
proteína-G (GPCR). Como con el canal iónico de
calcio de apertura mediante ligando, se cultivaron células HEK293
que co-expresan el GPCR de interés y apoaequorina en
confluencia en portaobjetos cubiertos de
poli-D-lisina y cargados con
coelenterazina. La adición de BAPTA-AM también
alteró la cinética de la señal de calcio que sigue a la
estimulación con agonista a través de la liberación de calcio de
reservorios intracelulares mediante la ruta de la
proteína-G (Fig. 4). Se llevó a cabo una
demostración adicional de la utilidad genérica del reactivo
retardante cuando la fluorescencia de un colorante sensible al
calcio (Fluo 3, Fluo 4; Fig. 5) se sustituía por la luminiscencia
generada a partir de la respuesta de aequorina para detectar la
fluctuación de la concentración de calcio intracelular tras la
adición de agonista a células HEK293 que expresan un canal iónico de
calcio.
Mientras se elegía el BAPTA-AM
para demostrar el potencial de usar un quelante intracelular en el
tamponamiento de la señal de calcio en células, otros reactivos
ligantes de calcio pueden ser útiles. Estos incluyen otros quelantes
relacionados estructuralmente tales como fura-2 u
otros colorantes fluorescentes, o quelantes fotoactivados tales como
diazo-2, y sus derivados permeables celulares.
Alternativamente, proteínas ligantes de calcio tales como
aequorinas modificadas o chimers GFP de calmodulina podrían
sustituir al BAPTA como reactivos retardantes constitutivos (Tsien,
R. Y. (1980) New calcium indicators and buffers with high
selectivity against magnesium and protons: design, síntesis, and
properties of prototype structures. Biochemistry 19,
2396-2404; González, J.E., Oades, K., Leychis, Y.,
Harootunian, A., and Negulescu, P. (1999) Cell-based
assays and instrumentation for screening
ion-channel targets. Drug Discovery Today
4, 431-439; Ungrin, M.D., Singh, L.M.R.,
Stocco, R., Sas, D.E., Abramovitz, M. (1999) An automated aequorin
luminescence-based functional calcium assay for
G-protein-coupled receptors.
Anal. Biochem. 272, 34-42).
Cualquier cantidad de estos reactivos tiene el
potencial de ser útil como reactivo retardante para los ensayos
funcionales basados en aequorina. Uno con habilidad en la técnica
solamente necesita probar cualquier reactivo particular en el ensayo
considerado aquí y comparar los resultados con aquellos obtenidos
usando BAPTA-AM. Estos reactivos también podrían ser
útiles genéricamente como reactivos retardantes para ensayos
funcionales usando señalización de calcio en general, no
simplemente la del ensayo del mensajero de bioluminiscencia basado
en aequorina.
También se advierte que la adición de un
antagonista del receptor específico puede afectar a la cinética del
tránsito de calcio observado. Para algunas solicitudes el uso de un
antagonista podría ser suficiente para alterar la cinética del
ensayo funcional. En verdad, se han presentado varios productos
comerciales que extienden la fluorescencia y luminiscencia de
destello a un formato de "incandescencia". El kit de ensayo
PACKARD LUCLITE® es un ejemplo de un procedimiento de ensayo que
utiliza un inhibidor de la luciferasa específico para retardar la
cinética de la señal de luminiscencia desde unos pocos minutos hasta
varias horas.
Ensayos de la presente invención se pueden
diseñar en muchos formatos generalmente conocidos en la técnica de
cribado de componentes por su actividad biológica o por ligarse a
receptores. Ensayos de la presente invención pueden explotar
convenientemente la capacidad de quelantes intracelulares de
cationes divalentes de tamponar la cinética de generación de señal
desencadenada por la acumulación de cationes divalentes. La
invención se emplea convenientemente en ensayos funcionales de toda
la célula y ensayos de cribado de alta capacidad para la
señalización de calcio tales como canales de calcio y de GPCR para
prolongar la señal para que pueda leerse mediante lectores
convencionales de portaobjetos. La presente invención generalmente
puede aplicarse a ensayos funcionales de toda la célula para
cualquier canal de calcio, o cualquier receptor o canal iónico que
esté acoplado a un canal de calcio. Por ejemplo, se puede aplicar
la presente invención a un ensayo de un receptor que esté acoplado a
un canal de calcio de apertura mediante voltaje. Sin embargo, para
claridad en la descripción de la aplicación de la invención,
generalmente nos referimos tanto a un canal de calcio como a un
receptor.
El reactivo retardante puede tener utilidad para
practicantes que necesitan examinar la señalización de calcio en
células pero no tienen instrumental para desarrollar inyección y
medida simultaneas de la señal rápida y transitoria. El retardo
proporcionado en ensayos de la presente invención es particularmente
útil para cribado de alta capacidad en ensayos funcionales de toda
la célula donde se usan portaobjetos de 96 pocillos, 384 pocillos,
3456 pocillos u otros formatos. Aquí el retardo de la generación de
señal desencadenada por calcio proporciona la adición de reactivos
y la manipulación de portaobjetos por encima de un marco temporal
prolongado ya que es más susceptible para estas densidades de
portaobjetos. Se puede emplear los quelantes intracelulares en
cualquier ensayo que proporcione una lectura funcional en la que el
tiempo adicional suministrado por el retardo permitiría la
manipulación adicional de las células tales como la adición de otros
reactivos o transferencia de muestra, o si se necesita establecer
un equilibrio cinético.
La presente invención incluye procedimientos de
identificación de compuestos que interaccionan específicamente con
polipéptidos de receptor. Los compuestos que interaccionan con un
receptor pueden estimular o inhibir la actividad de un receptor. La
especificidad de unión de compuestos que tienen afinidad por un
receptor se puede mostrar midiendo la afinidad de los compuestos a
membranas de células recombinantes que expresan un polipéptido de
receptor. La expresión de polipéptidos de receptor y cribado de
compuestos que se unen a un receptor o que inhiben la activación de
un receptor, proporciona un procedimiento eficaz para la selección
rápida de compuestos con afinidad por un receptor.
Por lo tanto, la presente invención incluye
ensayos mediante los que se pueden identificar compuestos que son
agonistas, antagonistas e inhibidores de receptor. Los
procedimientos de ensayo de la presente invención se diferencian de
aquellos descritos en la técnica porque los ensayos actuales
incorporan al menos un paso en el que las células se ponen en
contacto con un quelante intracelular.
La presente invención es ampliamente aplicable a
formatos de ensayo conocidos en la técnica. La presente invención
proporciona convenientemente el uso de instrumental par detectar
señales fluorescentes o luminiscentes de células sin el requisito de
manipulación simultanea de líquido en el momento de la detección.
Los procedimientos generales y formatos de ensayo para identificar
ligandos, agonistas y antagonistas se conocen bien en la técnica y
pueden adaptarse para identificar agonistas y antagonistas de
receptores expresados en células que se ponen en contactos con un
quelante intracelular antes o durante un ensayo. El orden de los
pasos en cualquier procedimiento dado puede variarse o desarrollarse
conjuntamente como reconocerán aquellos con habilidad en la técnica
de ensayos. Lo que sigue es una muestra de la variedad de formatos
que pueden usarse para dirigir un ensayo de la presente
invención.
Las células útiles en la presente invención
contienen un sistema de mensajero sensible al calcio. En algunas
formas de realización, se programa la célula para expresar el
sistema del informador a partir de genes integrados establemente.
Alternativamente, las células se pueden transferir transitoriamente
con ácidos nucleicos que codifican para un informador sensible al
calcio. Más comúnmente, el sistema de informador se compone de una
proteína expresada en la célula, por ejemplo, un chimer de
apoaequorina o de la proteína calmodulina fluorescente verde. Sin
embargo, es concebible que se pueda usar un sistema multiproteína o
un conjunto multipolipeptídico al que sea sensible y genere una
señal en respuesta al calcio. Alternativamente se puede utilizar un
compuesto orgánico no proteínico, incluyendo los colorantes
sensibles al calcio aquí apuntados. Se prefieren los colorantes
permeables a la membrana celular. Los colorantes se pueden atrapar
dentro de las células poniendo las células en contacto con
colorantes de éster o amida derivatizados. Tras la entrada del
colorante la amida o éster se separan atrapando los restos del
colorante dentro de la célula (Tsien, R.Y. (1981) A
non-disruptive technique for loading calcium buffers
and indicators into cells. Nature 290,
527-528).
En consecuencia, la presente invención incluye
un procedimiento para determinar si un compuesto candidato es un
inhibidor de un receptor usando células que contengan un informador
sensible al calcio tal como apoaequorina o un chimer de proteína
calmodulina fluorescente verde, cuyo procedimiento comprende:
(a) transferir células con un vector de
expresión que codifica para un polipéptido de receptor;
(b) permitir a las células transferidas que
crezcan durante un tiempo suficiente para permitir que el receptor
se exprese en las células;
(c) exponer las células a un quelante
intracelular de calcio;
(d) exponer las células a un activador del
receptor en presencia y en ausencia del compuesto;
(e) medir la señal generada en las células;
y
(f) comparar la cantidad de señal en presencia y
en ausencia del compuesto donde un descenso en la cantidad de señal
en presencia del compuesto indica que el compuesto es un inhibidor
de la activación del receptor.
En consecuencia, la presente invención también
incluye un procedimiento para determinar in vitro si un
compuesto candidato es un agonista de un receptor usando células que
contengan un informador sensible al calcio tal como apoaequorina o
un chimer de proteína calmodulina fluorescente verde, cuyo
procedimiento comprende:
(a) transferir células con un vector de
expresión que codifica para un polipéptido de receptor;
(b) permitir a las células transferidas que
crezcan durante un tiempo suficiente para permitir que el receptor
se exprese en las células;
(c) exponer las células a un quelante
intracelular de calcio;
(d) exponer las células a un compuesto de
prueba;
(e) medir la señal generada en las células;
y
(f) comparar la cantidad de señal en presencia y
en ausencia del compuesto donde un aumento de la señal similar a un
agonista conocido indica que el compuesto es un agonista del
receptor. Un aumento de señal más que un control tampón pero menos
que un agonista conocido indica que el compuesto es un agonista
parcial.
Las condiciones bajo las cuales se practica el
paso (d) del procedimiento son condiciones que se usan típicamente
en la técnica para el estudio de interacciones
proteína-ligando: p. ej., pH fisiológico; afecciones
salinas tales como aquellas representadas por tampones tan
comúnmente usados como PBS o en medios de cultivo tisulares; una
temperatura de unos 4ºC a unos 55ºC. En este paso el receptor y el
compuesto candidato se pueden aplicar a la célula secuencialmente o
conjuntamente. Se prefiere que el compuesto candidato se aplique
primero o que el compuesto y el receptor se apliquen
conjuntamente.
En una modificación alternativa de los ensayos
generales descritos anteriormente, las células carecen de un sistema
de informador sensible al calcio endógeno y se transfieren
transitoriamente con el sistema con propósitos de dirigir el ensayo.
Esta modificación puede ser útil con células que expresen
endógenamente o que se transfieran establemente con un receptor que
se desee usar en el ensayo. Una modificación adicional sería un
colorante fluorescente sensible al calcio, tal como
Fluo-3 en lugar de un sistema de informador sensible
al calcio endógeno. En esta modificación se añadiría un paso
adicional entre (b) y (c) donde las células se incuban con
1-10 \muM Fluo-3 AM, un éster de
Fluo-3 permeable a la membrana. Una modificación
adicional a los formatos de ensayo general sería eliminar los pasos
(a) y (b) y en su lugar comenzar con células que expresen
establemente el polipéptido del receptor.
Como una modificación adicional de los
procedimientos descritos anteriormente se puede preparar RNA que
codifique para el receptor como, p.ej., mediante transcripción in
vitro usando un plásmido conteniendo receptor bajo el control de
un promotor T7 bacteriófago, y se puede microinyectar el RNA en
oocitos de Xenopus para provocar la expresión del receptor en los
oocitos. Entonces los oocitos se exponen a un quelante intracelular.
Entonces se prueba la unión de los compuestos al receptor o la
inhibición o activación del receptor expresado en los oocitos. Como
en todos los ensayos de esta invención, se incorpora al ensayo un
paso en el que las células se exponen a un quelante
intracelular.
Los procedimientos de toda la célula anteriores
se pueden usar en ensayos en los que se desee evaluar si un
compuesto puede interaccionar con receptor.
Se usaron líneas celulares parentales HEK293 que
expresan apoaequorina (células 293AEQ17) (Button, D., and
Brownstein, M. (1993) Aequoring-expressing mammalian
cell lines used to report Ca^{2+} mobilization. Cell
Calcium 14, 663-671) para desarrollar
líneas celulares clonales estables que expresan canal iónico de
calcio de apertura mediante ligando o GPCR. Se mantuvieron las
células de canal iónico 293AEQ17 en medio de cultivo conteniendo
DMEM (GIBCOBRL, glucosa elevada, con L-glutamina,
con 110 mg/L piruvato de sodio, con piridoxín HCl), HEPES 25 mM
(GIBCOBRL, stock 1M), 0,5 mg/mL geneticina (GIBCOBRL, 50 mg/mL de
stock), 1 \mug/mL puromicina (CLONTECH), y 10% de suero fetal
bovino (Gemini Bio-Products, inactivado por calor) a
37ºC, 5% de CO_{2}. Las células 293AEQ17 de GPCR se mantuvieron en
medio de cultivo conteniendo DMEM (GIBCOBRL, glucosa elevada, con
L-glutamina, con 110 mg/L piruvato de sodio, con
piridoxín HCl), HEPES 25 mM, 0,5 mg/mL geneticina, 0,2 mg/mL de
higromicina (BOEHRINGER MANHEIM), y 10% de suero fetal bovino
(HYCLONE, descrito) a 37ºC, 5% de CO_{2}.
Se cultivaron las células en confluencia en
frascos de cultivo tisular (T-225, CORNING) y se
recolectaron por tripsinización (Tripsina/EDTA, GIBCOBRL). Las
células se distribuyeron (unas 1 x 10^{5} células/0,2 mL/pocillo)
en portaobjetos de poli-D-lisina
BIOCOAT blancos opacos o de fondo claro con 96 pocillos (BECTON
DICKINSON, Bedford, MA) en medio de cultivo y se incubaron toda la
noche a 37ºC en un incubador humidificado al 5% de CO_{2}. Para
cargar las células con coelenterazina, se retiró el medio de cultivo
mediante aspiración usando un lavador celular TITERTEK, seguido de
adición de medio de cultivo (medio DMEM con 0,1% de suero fetal
bovino y glutatión reducido 0,15 mM) suplementado con coelenterazina
h 5 \muM (MOLECULAR PROBES, Eugene, OR). Para algunos experimentos
se sustituyeron otros análogos de la coelenterazina en el tampón de
carga según se indica. Las células se incubaron más tarde en tampón
de carga durante 2 horas a 37ºC en un incubador humidificado al 5%
de CO_{2}. Entonces se retiró el medio y se lavaron las células
con fosfato de Dulbecco tampón salino con calcio y magnesio (PBS,
GIBCOBRL) conteniendo HEPES 10 mM y 2 mg/mL de glucosa, suplementado
con tetra(acetoximetil)éster de ácido
1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'
tetracético (BAPTA-AM, MOLECULAR PROBES)
0-30 \muM, y solución Pluronic
F-127 al 0,02% (MOLECULAR PROBES) en incubada
durante 1 hora a 37ºC en un incubador humidificado al 5% de
CO_{2}. Alternativamente, se cargaron las células al mismo tiempo
con coelenterazina h y BAPTA-AM durante 2 horas a
37ºC en un incubador humidificado al 5% de CO_{2}. Después las
células se lavaron y cargaron con 90 \muL de PBS suplementado con
HEPES 10 mM y 2 mg/mL de glucosa. Se añadió antagonista o controles
DMSO a los pocillos (10 \muL, 1% DMSO final).
Se evaluó el tamponamiento o retardo potenciales
de la luminiscencia basada en aequorina en un ensayo celular
funcional para un canal de calcio de apertura mediante ligando.
Encontramos que niveles bajos de BAPTA fueron capaces de alterar la
cinética de la señal de luminiscencia tras adición de agonista sin
suprimir significativamente la luz total acumulada según se observó
para la adición de bajos niveles de antagonista (Figs.
1-4).
Se usaron líneas celulares parentales HEK293 que
expresan apoaequorina (células 293AEQ17) para desarrollar líneas
celulares clonales estables que expresan el receptor de capsaicina
VR1 en la rata (Caterina, M.J., Schumacher, M.A., Tominaga, M.,
Rosen, T.A., Levine, J.D., and Julius, D.(1997) The capsaicin
receptor: a heat activated ion channelin the pain pathway.
Nature 389,816-824). Las 293AEQ17 VR1
se mantuvieron en medio de cultivo conteniendo DMEM (GIBCOBRL,
glucosa elevada, con L-glutamina, con 110 mg/L
piruvato de sodio, con piridoxín HCl), HEPES 25 mM (GIBCOBRL, stock
1M), 0,5 mg/mL geneticina (GIBCOBRL, 50 mg/mL de stock), 1 \mug/mL
puromicina (CLONTECH), y 10% de suero fetal bovino (GEMINI
BIO-PRODUCTS, inactivado por calor) a 37ºC, 10% de
CO_{2}.
Se cultivaron células hasta una confluencia del
80-95% en frascos de cultivo tisular
(T-225, CORNING) y se recolectaron por
tripsinización (Tripsina/EDTA, GIBCOBRL). Las células se
distribuyeron (unas 1 x 10^{5} células/0,2 mL/pocillo) en
portaobjetos de poli-D-lisina
BIOCOAT negros de fondo claro con 96 pocillos (BECTON DICKENSON,
Bedford, MA) en medio de cultivo y se incubaron toda la noche a 37ºC
en un incubador humidificado al 10% de CO_{2}. Las células se
lavaron una vez con 200 \muls de PBS enriquecido (PBS de Dulbecco
(GIBCOBRL # 14040-117), HEPES 10 mM, 2 g/L de
glucosa; pH 7,2) y después se incubaron con 100 \mul de
fluo-3 AM 5 \muM (MOLECULAR PROBES #F1241) con o
sin tetra(acetoximetil)éster de ácido
1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'
tetracético (BAPTA-AM, MOLECULAR PROBES #B1205) en
PBS enriquecido conteniendo Pluronic F-127 al
0,02%
(MOLECULAR PROBES #P-3000) durante 30-70 minutos. Los pocillos se lavaron dos veces con 100 \mul de PBS enriquecido, y después se añadieron 100 \mul de PBS enriquecido con o sin antagonista durante 15-30 minutos antes del ensayo en el lector VIPR de fluorescencia de portaobjetos AURORA (ex. 480 nm, em. 535 nm). El BAPTA-AM se puede incubar 30 minutos como un paso separado después de la tinción con fluo-3 y previo a la adición del fármaco, sin diferencias apreciables en la señal. La respuesta de calcio se inició por adición de 100 \mul de la concentración indicada de capsaicina (SIGMA #M2028). El instrumento VIPR se usó para añadir agonista (en 100 \mul de PBS enriquecido) tras registrar una línea basal de 10 seg y la fluorescencia se midió hasta los 300 seg.
(MOLECULAR PROBES #P-3000) durante 30-70 minutos. Los pocillos se lavaron dos veces con 100 \mul de PBS enriquecido, y después se añadieron 100 \mul de PBS enriquecido con o sin antagonista durante 15-30 minutos antes del ensayo en el lector VIPR de fluorescencia de portaobjetos AURORA (ex. 480 nm, em. 535 nm). El BAPTA-AM se puede incubar 30 minutos como un paso separado después de la tinción con fluo-3 y previo a la adición del fármaco, sin diferencias apreciables en la señal. La respuesta de calcio se inició por adición de 100 \mul de la concentración indicada de capsaicina (SIGMA #M2028). El instrumento VIPR se usó para añadir agonista (en 100 \mul de PBS enriquecido) tras registrar una línea basal de 10 seg y la fluorescencia se midió hasta los 300 seg.
Se midieron cambios en el calcio intracelular
usando el colorante fluo-3 y detectando la cinética
de la respuesta después de la adición del agonista del VR1,
capsaicina (0,5 \muM), a células que expresan VR1 usando un lector
VIPR de fluorescencia de portaobjetos (Figs. 5 y 6A). En ausencia de
BAPTA, la respuesta alcanzó el pico en unos 20 seg y descendió al
50% en unos 150 seg. Esta respuesta fue bloqueada completamente por
capsazepina 20 \muM, un competitivo antagonista selectivo del
VR1. La incubación de las células durante 30 minutos con
BAPTA-AM 3 \muM culminó en un retardo de la señal
de fluorescencia con un pico hacia los 40 seg, pero el tiempo de
retardo de la señal del fluo-3 (\approx150 s) no
se vio afectado. Sin embargo, el aumento de la concentración de
BAPTA-AM hasta 10 y 30 \muM provocó un retardo
significativo en el tiempo de respuesta del pico de hasta 100 seg,
con una señal de fluorescencia sostenida que mostró un descenso no
significativo en esta escala de tiempo (3 minutos). Merece la pena
apuntar que la fluorescencia solamente descendió parcialmente
después de los 3 minutos, incluso en ausencia de
BAPTA-AM, y esta caída puede deberse, en parte, a la
fotodecoloración del fluo-3.
Fue importante usar el equilibrio correcto entre
la amplitud de la activación del agonista y la quelación de calcio
por BAPTA. Por lo tanto, los experimentos de graduación son útiles
para establecer parámetros apropiados. Como se esperaba, cuando se
usó una concentración de agonista más baja (Fig. 6B, capsaicina 0,1
\muM) hubo un descenso en la respuesta de fluorescencia y cayó más
rápidamente. A esta baja concentración de agonista, el BAPTA 3
\muM disminuyó la señal pico sin un gran efecto sobre el tiempo
para que la cinética alcance su pico o caiga. Con quelante 30
\muM, la señal estable de calcio sólo es ligeramente mayor en
ausencia de antagonista comparada con la presencia de capsazepina 20
\muM. Sin embargo, incluso esta pequeña señal de fluorescencia se
sostuvo durante 30-180 seg, dando una ventana
fácilmente distinguible comparada con la caída de la señal de
fluorescencia cuando era bloqueada por antagonista.
Se usaron líneas celulares parentales HEK293 que
expresan apoaequorina (células 293AEQ17) para desarrollar líneas
celulares clonales estables que expresan el receptor secretagogo de
tipo 1ª de la hormona del crecimiento (hGHSR1A, Smith, R.G.,
Griffin, P.R., Xu, Y., Smith, A.G.A., Liu, K., Calacay, J.,
Feighner, S.D., Pong, C.-S., Leong, D., Pomes, A., Cheng, K., Van
der Ploeg, L.H.T., Howard, A.D., Schaeffer, J., and Leonard, R.J.
(2000) Adenosine: A partial agonist of the growth hormona
secretagogue receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun.
276, 1306-1313; Bednarek, M.A., Feighner,
S.C., Pong, S-S., McKee, K.K., Hreniuk, D.L., Silva,
M.V., Warren, V.A., Howard, A.D., Van der Ploeg, L.H.Y., and Heck
J.V. (2000) Structure-function studies on the new
growth hormone-releasing peptide, ghrelin: Minimal
sequence of ghrelin necessary for activation of growth hormone
secretagogue receptor 1a. J. Med. Chem. 43,
4370-4376). Las células hGHSR1A y las celulares
parentales 293AEQ17 se mantuvieron en medio de cultivo conteniendo
DMEM (GIBCOBRL, glucosa elevada, con L-glutamina,
con 110 mg/L piruvato de sodio, con piridoxín HCl), HEPES 25 mM
(GIBCOBRL, stock 1M), 0,5 mg/mL geneticina (GIBCOBRL, 50 mg/mL de
stock), 0,2 mg/mL de higromicina (BOEHRINGER MANNHEIM), y 10% de
suero fetal bovino (HYCLONE, descrito) a 37ºC, 10% de CO_{2}.
Se cultivaron células hasta una confluencia del
80-95% en frascos de cultivo tisular
(T-225, CORNING) y se recolectaron por
tripsinización (Tripsina/EDTA, GIBCOBRL). Las células se
distribuyeron (unas 1 x 10^{5} células/0,2 mL/pocillo) en
portaobjetos de poli-D-lisina
BIOCOAT negros de fondo claro con 96 pocillos (BECTON DICKENSON,
Bedford, MA) en medio de cultivo y se incubaron toda la noche a 37ºC
en un incubador humidificado al 10% de CO_{2}. Las células se
lavaron una vez con 200 \muls de PBS enriquecido (PBS de Dulbecco
(GIBCOBRL # 14040-117), HEPES 10 mM, 2 g/L de
glucosa; pH 7,2) y después se incubaron con 100 \mul de
fluo-4 AM 5 \muM (#F14202 respectivamente) con o
sin tetra(acetoximetil)éster de ácido
1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'
tetracético (BAPTA-AM, MOLECULAR PROBES #B1205) en
PBS enriquecido conteniendo Pluronic F-127 al 0,02%
(MOLECULAR PROBES #P-3000) durante
30-70 minutos. Los pocillos se lavaron dos veces con
100 \mul de PBS enriquecido, y después se añadieron 100 \mul de
PBS enriquecido con o sin antagonista durante 15-30
minutos antes del ensayo en el lector VIPR de fluorescencia de
portaobjetos AURORA (ex. 480 nm, em. 535 nm). La respuesta de calcio
se inició por adición de 100 \mul de la concentración indicada de
ghrelin (PHOENIX PHARMACEUTICALS #031031). El instrumento VIPR se
usó para añadir agonista (en 100 \mul de PBS enriquecido) tras
registrar una línea basal de 10 seg y la fluorescencia se midió
hasta los 300 seg.
\newpage
El tránsito de calcio activado por el agonista
del hGHSR1a, el ghrelin (100 nM), monitorizado con
fluo-4, se midió usando el VIPR (Fig. 8A). Las
respuestas de calcio inducidas por ghrelin fueron inhibidas por el
conocido antagonista del GHSR, L-756,867. La
activación del hGHSR provocó un rápido aumento en fluorescencia que
alcanzó un máximo en unos 5 seg y cayó completamente al nivel basal
en unos 100 segundos. La adición de BAPTA (BAPTA-AM
30 \muM) retardó la respuesta de fluorescencia pico de 15 seg a
150 seg, con una señal fluorescente estable de hasta 5 minutos.
Se mantuvieron líneas celulares parentales
HEK293 que expresan apoaequorina (células 293AEQ17) en medio de
cultivo conteniendo DMEM (GIBCOBRL, glucosa elevada, con
L-glutamina, con 110 mg/L piruvato de sodio, con
piridoxín HCl), HEPES 25 mM (GIBCOBRL, stock 1M), 0,5 mg/mL
geneticina (GIBCOBRL, 50 mg/mL de stock) y 10% de suero fetal bovino
(GEMINI BIO-PRODUCTS, inactivado por calor) a 37ºC,
10% de CO_{2}.
Se cultivaron células hasta una confluencia del
80-95% en frascos de cultivo tisular
(T-225, CORNING) y se recolectaron por
tripsinización (Tripsina/EDTA, GIBCOBRL). Las células se
distribuyeron (unas 1 x 10^{5} células/0,2 mL/pocillo) en
portaobjetos de poli-D-lisina
BIOCOAT negros de fondo claro con 96 pocillos (BECTON DICKENSON,
Bedford, MA) en medio de cultivo y se incubaron toda la noche a 37ºC
en un incubador humidificado al 10% de CO_{2}. Las células se
lavaron una vez con 200 \muls de PBS enriquecido (PBS de Dulbecco
(GIBCOBRL # 14040-117), HEPES 10 mM, 2 g/L de
glucosa; pH 7,2) y después se incubaron con 100 \mul de
fluo-4 AM 5 \muM (MOLECULAR PROBES #F14202) con o
sin tetra(acetoximetil)éster de ácido
1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'
tetracético (BAPTA-AM, MOLECULAR PROBES #B1205) en
PBS enriquecido conteniendo Pluronic F-127 al 0,02%
(MOLECULAR PROBES #P-3000) durante
30-70 minutos. Los pocillos se lavaron dos veces con
100 \mul de PBS enriquecido, y después se añadieron 100 \mul de
PBS enriquecido con o sin antagonista durante 15-30
minutos antes del ensayo en el lector VIPR de fluorescencia de
portaobjetos AURORA (ex. 480 nm, em. 535 nm). La respuesta de calcio
se inició por adición de 100 \mul de la concentración indicada de
(+/-) muscarina (SIGMA #M0405). El instrumento VIPR se usó para
añadir agonista (en 100 \mul de PBS enriquecido) tras registrar
una línea basal de 10 seg y la fluorescencia se midió hasta los 300
seg.
El muscimol estimuló un receptor muscarínico
endógeno (Moriya, H., Takagi, Y., Nakanishi, T., Hayashi, M., Tani,
T., and Hirotsu, I. (1999) Affinity profiles of various muscarinic
antagonists for cloned human muscarinic acetylcholine receptor
(MACHR) subtypes and MACHRS in rat heart and submandibular gland.
Life Sciences 25, 2351-2358;
Caulfield, M.P. (1993) Muscarinic
receptors-characterization, coupling and function.
Pharmac. Ther. 58, 319-379) en células
HEK-AEQ17 que dieron una señal de fluorescencia
robusta cuando se medían con fluo-4 usando el VIPR.
La cinética de este tránsito de calcio fue diferente de aquella
medida para el tránsito de calcio del VR1 y hGHSR. La activación
con muscimol (10 \muM) provocó una respuesta rápida de tránsito,
seguida por una respuesta más lenta (Fig. 9A). La respuesta rápida
de tránsito fue muy sensible al BAPTA, y se eliminó mediante niveles
bajos del quelante (BAPTA-AM 3 \muM), pero una
señal de fluorescencia que fuera estable durante al menos 3 minutos
se podría detectar bajo estas condiciones. A una concentración
superior de BAPTA (BAPTA-AM 10 \muM), el aumento
de fluorescencia era muy lento todavía no se había estabilizado
incluso después de 3 minutos.
Se usaron líneas celulares parentales HEK293 que
expresan apoaequorina (células 293AEQ17) para desarrollar líneas
celulares clonales estables que expresan el receptor de capsaicina
VR1 en la rata. Las células 293AEQ17 para VR1 se mantuvieron en
medio de cultivo conteniendo DMEM (GIBCOBRL, glucosa elevada, con
L-glutamina, con 110 mg/L piruvato de sodio, con
piridoxín HCl), HEPES 25 mM (GIBCOBRL, stock 1M), 0,5 mg/mL
geneticina (GIBCOBRL, 50 mg/mL de stock), 1 \mug/mL de puromicina
(CLONTECH), y 10% de suero fetal bovino (GEMINI
BIO-PRODUCTS, inactivado por calor) a 37ºC, 10% de
CO_{2}.
Se cultivaron células hasta una confluencia del
80-95% en frascos de cultivo tisular
(T-225, CORNING) y se recolectaron por
tripsinización (Tripsina/EDTA, GIBCOBRL). Las células se
distribuyeron (unas 1 x 10^{5} células/0,2 mL/pocillo) en
portaobjetos de poli-D-lisina
BIOCOAT blancos de fondo claro con 96 pocillos (BECTON DICKENSON,
Bedford, MA) en medio de cultivo y se incubaron toda la noche a 37ºC
en un incubador humidificado al 10% de CO_{2}. Las células se
cargaron con el sustrato de la aequorina, coelenterazina h
(MOLECULAR PROBES, #C-6780), retirando el medio de
cultivo e incubando las células con 75 \muL de tampón de carga
(DMEM GIBCOBRL #12320-032; 0,1% FBS GEMINI
BIO-PRODUCTS, Inc. #100-107;
coelenterazina h 5 \muM; glutatión reducido 30 \muM) durante 2
horas a 37ºC, 10% de CO_{2}. Después se retiró el tampón de carga
y las células se lavaron dos veces con 100 \mul de PBS enriquecido
(pH 7,2), y después se incubaron con 100 \muL de PBS enriquecido
suplementado con BAPTA-AM 0-30
\muM durante 30-120 min a 37ºC, 10% de CO_{2}.
Entonces las células se lavaron y cargaron con 100 \mul de PBS
enriquecido con o sin el antagonista indicado. La respuesta de
calcio se inició por adición de 100 \mul de la concentración
indicada de capsaicina (SIGMA #M2028) a los pocillos mediante un
WALLAC MICROBETA JET. Para obtener cinéticas más consistentes, se
programó el Jet para que leyera simultáneamente sólo seis pocillos
por determinación.
La respuesta de luminiscencia de destello de la
aequorina tras la activación del VR1 no se retardó tan fácilmente
por BAPTA intracelular, como con la señal de fluorescencia del
fluo-3. Para estos experimentos, se siguieron las
cinéticas de la luminiscencia de destello usando un luminómetro
WALLAC MACROBETA JET que inyecta reactivo y registra emisión de luz
simultáneamente de 6 pocillos de un portaobjetos de 96 pocillos. La
adición de capsaicina (50 nM) provocó una señal de luminiscencia
rápida y transitoria que se completó en gran parte en 30 segundos,
con un nivel pico que ocurrió únicamente en unos 10 seg (Fig. 7A).
La adición de niveles crecientes de BAPTA (BAPTA-AM
0-30 \muM) provocó un retardo progresivo en el
establecimiento de la señal de luminiscencia e aequorina, con una
respuesta máxima a los 30 seg, retardada desde los 10 seg. Esta
señal se prolongó hasta 3 minutos, el máximo tiempo registrado. Para
estos experimentos, era importante usar una concentración baja de
agonista porque a elevada concentración de agonista (0,5 \muM)
incluso BAPTA-AM 30 \muM solamente retardó la
respuesta pico desde unos 5 seg hasta 10 seg (Fig. 7B). Mientras se
alteraron las cinéticas de la respuesta de aequorina tamponando con
BAPTA, la señal completa no se suprimió significativamente ya que la
señal total a una concentración dada de agonista no varió
significativamente usando BAPTA-AM de 0 \muM a 30
\muM.
Se usaron líneas celulares parentales HEK293 que
expresan apoaequorina (células 293AEQ17) para desarrollar líneas
celulares clonales estables que expresan el receptor secretagogo de
tipo 1a de la hormona del crecimiento (hGHSR1A). Las células hGHSR1A
se mantuvieron en medio de cultivo conteniendo DMEM (GIBCOBRL,
glucosa elevada, con L-glutamina, con 110 mg/L
piruvato de sodio, con piridoxín HCl), HEPES 25 mM (GIBCOBRL, stock
1M), 0,5 mg/mL geneticina (GIBCOBRL, 50 mg/mL de stock), 0,2 mg/mL
de higromicina (BOEHRINGER MANNHEIM), y 10% de suero fetal bovino
(HYCLONE, descrito) a 37ºC, 10% de CO_{2}.
Se cultivaron células hasta una confluencia del
80-95% en frascos de cultivo tisular
(T-225, CORNING) y se recolectaron por
tripsinización (Tripsina/EDTA, GIBCOBRL). Las células se
distribuyeron (unas 1 x 10^{5} células/0,2 mL/pocillo) en
portaobjetos de poli-D-lisina
BIOCOAT negros de fondo claro con 96 pocillos (BECTON DICKENSON,
Bedford, MA) en medio de cultivo y se incubaron toda la noche a 37ºC
en un incubador humidificado al 10% de CO_{2}. Las células se
cargaron con el sustrato de la aequorina, coelenterazina h
(MOLECULAR PROBES, #C-6780), retirando el medio de
cultivo e incubando las células con 75 \mul de tampón de carga
(DMEM GIBCOBRL#12320-032; 0,1% FBS GEMINI
BIO-PRODUCTS, Inc. #100-107;
coelenterazina h 5 \muM; glutatión reducido 30 \muM) durante 2
horas a 37ºC, 10% de CO_{2}. Después se retiró el tampón de carga
y las células se lavaron dos veces con 100 \mul de PBS enriquecido
(pH 7,2), y después se incubaron con 100 \muL de PBS enriquecido
suplementado con BAPTA-AM 0-30
\muM durante 30-120 min a 37ºC, 10% de CO_{2}.
Entonces las células se lavaron y cargaron con 100 \mul de PBS
enriquecido con o sin el antagonista indicado. La respuesta de
calcio se inició por adición de 100 \mul de la concentración
indicada de ghrelin (PHOENIX PHARMACEUTICALS #031031) mediante un
WALLAC MICROBETA JET. Para obtener cinéticas más consistentes, se
programó el Jet para que leyera simultáneamente sólo seis pocillos
por determinación.
Tras la adición del agonista de las hGHSR1a
(ghrelin 100 nM, hubo un rápido aumento en la emisión de luz que
alcanzó el pico solamente en 3 seg y desapareció principalmente
después de 30 seg, según se midió en el luminómetro Jet (Fig. 8B).
En contraposición, la adición de BAPTA (BAPTA-AM 30
\muM) disminuyó la señal de luminiscencia a tan sólo el 5% de la
respuesta en ausencia de BAPTA, pero el tiempo para alcanzar la
emisión máxima de luz se retardó hasta los 75 seg (Fig. 8B,
recuadro). Además, mientras se redujo la amplitud de la señal, hubo
una ventana significativa entre la señal en ausencia y en presencia
del antagonista que se puede usar en un ensayo de
experimentación.
Se mantuvieron líneas celulares parentales
HEK293 que expresan apoaequorina (células 293AEQ17) en medio de
cultivo conteniendo DMEM (GIBCOBRL, glucosa elevada, con
L-glutamina, con 110 mg/L piruvato de sodio, con
piridoxín HCl), HEPES 25 mM (GIBCOBRL, stock 1M), 0,5 mg/mL
geneticina (GIBCOBRL, 50 mg/mL de stock) y 10% de suero fetal bovino
(GEMINI BIO-PRODUCTS, inactivado por calor) a 37ºC,
10% de CO_{2}.
Se cultivaron células hasta una confluencia del
80-95% en frascos de cultivo tisular
(T-225, CORNING) y se recolectaron por
tripsinización (Tripsina/EDTA, GIBCOBRL). Las células se
distribuyeron (unas 1 x 10^{5} células/0,2 mL/pocillo) en
portaobjetos de poli-D-lisina
BIOCOAT negros de fondo claro con 96 pocillos (BECTON DICKINSON,
Bedford, MA) en medio de cultivo y se incubaron toda la noche a 37ºC
en un incubador humidificado al 10% de CO_{2}. Las células se
lavaron una vez con 200 \muls de PBS enriquecido (PBS de Dulbecco
(GIBCOBRL # 14040-117), HEPES 10 mM, 2 g/L de
glucosa; pH 7,2) y después se incubaron con 100 \mul de
fluo-4 AM 5 \muM (MOLECULAR PROBES #F14202) con o
sin tetra(acetoximetil)éster de ácido
1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'
tetracético (BAPTA-AM, MOLECULAR PROBES #B1205) en
PBS enriquecido conteniendo Pluronic F-127 al 0,02%
(MOLECULAR PROBES #P-3000) durante
30-70 minutos. Los pocillos se lavaron dos veces con
100 \mul de PBS enriquecido, y después se añadieron 100 \mul de
PBS enriquecido con o sin antagonista durante 15-30
minutos antes del ensayo en el lector VIPR de fluorescencia de
portaobjetos AURORA (ex. 480 nm, em. 535 nm). La respuesta de calcio
se inició por adición de 100 \mul de la concentración indicada de
(+/-) muscarina (SIGMA #M0405) usando un dispositivo manual. El
instrumento VIPR se usó para medir una fluorescencia inicial de 5
seg, y después para registrar otra respuesta de fluorescencia de 5
seg después del retardo de 5 minutos.
Experimentos cinéticos que usan el VIPR e
instrumentos Jet demuestran que niveles bajos de BAPTA intracelular
pueden retardar y prolongar las respuestas de calcio en una variedad
de ensayos funcionales para canales iónicos y de GPCR. Inicialmente
se requiere una aproximación empírica para equilibrar la
concentración del quelante y del agonista usado, pero en cada caso
se desarrolló un ensayo útil basado en fluorescencia o en aequorina
con una respuesta de calcio prolongada.
Una aplicación útil de esta invención es la de
desarrollar condiciones de ensayo que prolongarían la señal de
calcio transitoria suficientemente como para permitir la medida de
la fluorescencia o luminiscencia mediante lectores de portaobjetos
de laboratorio estándar. Para sustituir instrumentos anteriormente
usados, que tienen adición de líquido y registro simultáneos, debe
mantenerse una señal observable siguiente a la adición de agonista
en el orden de varios minutos. Basados en los resultados a partir de
estos experimentos cinéticos, se probó si se podría añadir agonista
a un portaobjetos de 96 pocillos con un dispositivo manual de
pipeteado y después transferir el portaobjetos a un lector apropiado
y mantener aún una señal estable sobre el campo adecuado para
desarrollar ensayos HTS.
Se cargó un portaobjetos de células
HEK-AEQ17 con Fluo-4 5 \muM y
BAPTA-AM 3 \muM. Se tomó una medida inicial de
fluorescencia usando el VIPR (5 seg) y después se añadió muscimol
(10 \muM) al portaobjetos manipulando una pipeta multicanal para
activar el AchR muscarínico endógeno. El portaobjetos se incubó
durante 5 minutos antes de tomar una segunda lectura de
fluorescencia usando el VIPR (5 seg). Incluso 5 minutos después de
la estimulación con muscinol, se detectó un claro aumento en la
señal de fluorescencia. Bajo estas condiciones se observó un
descenso en la señal de fluorescencia dependiente de la dosis con
atropina, dando una K_{I} = 0,7 nM, que estuvo próxima a la
potencia esperada para la atropina (Fig. 9B).
Se usaron líneas celulares parentales HEK293 que
expresan apoaequorina (células 293AEQ17) para desarrollar líneas
celulares clonales estables que expresan el receptor de capsaicina
VR1 en la rata. Las células 293AEQ17 para VR1 y las celulares
parentales 293AEQ17 se mantuvieron en medio de cultivo conteniendo
DMEM (GIBCOBRL, glucosa elevada, con L-glutamina,
con 110 mg/L piruvato de sodio, con piridoxín HCl), HEPES 25 mM
(GIBCOBRL, stock 1M), 0,5 mg/mL geneticina (GIBCOBRL, 50 mg/mL de
stock), 1 \mug/mL puromicina (CLONTECH), y 10% de suero fetal
bovino (GEMINI BIO-PRODUCTS, inactivado por calor) a
37ºC, 10% de CO_{2}.
Se cultivaron células hasta una confluencia del
80-95% en frascos de cultivo tisular
(T-225, CORNING) y se recolectaron por
tripsinización (Tripsina/EDTA, GIBCOBRL). Las células se
distribuyeron (unas 1 x 10^{5} células/0,2 mL/pocillo) en
portaobjetos de poli-D-lisina
BIOCOAT blancos de fondo claro con 96 pocillos (BECTON DICKENSON,
Bedford, MA) en medio de cultivo y se incubaron toda la noche a 37ºC
en un incubador humidificado al 10% de CO_{2}. Las células se
cargaron con el sustrato de la aequorina, coelenterazina h
(MOLECULAR PROBES, #C-6780), retirando el medio de
cultivo e incubando las células con 75 \muL de tampón de carga
(DMEM GIBCOBRL #12320-032; 0,1% FBS GEMINI
BIO-PRODUCTS, Inc. #100-107;
coelenterazina h 5 \muM; glutatión reducido 30 \muM) durante 2
horas a 37ºC, 10% de CO_{2}. Después se retiró el tampón de carga
y las células se lavaron dos veces con 100 \mul de PBS enriquecido
(pH 7,2), y después se incubaron con 100 \muL de PBS enriquecido
suplementado con BAPTA-AM 0-10
\muM durante 30 min a 37ºC, 10% de CO_{2}. Entonces las células
se lavaron y cargaron con 100 \mul de PBS enriquecido con o sin el
antagonista indicado. La respuesta de calcio se inició por adición
de 100 \mul de la concentración indicada de capsaicina (SIGMA
#M2028) al set adecuado de 6 pocillos usando un dispositivo manual.
Se usó el WALLAC MICROBETA JET para medir 10 seg de luminiscencia
después de un retardo de 2 minutos.
Entonces se cargaron las células VR1 con
coelenterazina, se trataron con o sin BAPTA-AM, y
luego se incubaron con concentraciones crecientes del antagonista
capsazepina. Usando una pipeta multicanal manual, se añadió
capsaicina (0,5 \muM) a los portaobjetos de 96 pocillos que
contenían las células que expresan VR1 (Fig. 10B). Tras un lapso de
dos minutos, se leyeron los portaobjetos usando el luminómetro
WALLAC MICROBETA JET. Se observaron curvas complejas de respuesta a
dosis para el antagonista capsazepina. Realmente la señal de
luminiscencia aumentó con la concentración de antagonista hasta un
punto, pero a concentraciones superiores se bloqueó completamente.
Esta curva compleja de respuesta a dosis se observó en presencia y
en ausencia de BAPTA. Con todo, la adición de BAPTA aumentó la
luminiscencia tanto que se pudo medir una señal 4 veces mayor sobre
el campo 2 minutos después de la estimulación con agonista. Además,
los antagonistas de receptor mostraron la potencia esperada en
presencia de BAPTA.
Para comprender mejor la complejidad de las
curvas de respuesta a dosis, se examinaron las cinéticas de la
luminiscencia de aequorina en las células HEK293-AEQ
para VR1 en presencia de concentraciones crecientes de antagonista.
Se encontró el propio antagonista a concentraciones
sub-saturantes provocaba un retardo en la señal de
calcio en ausencia del quelante. Presumiblemente, las cinéticas
retardadas son atribuibles a la competencia entre el agonista y el
antagonista por el receptor. Esto es marcadamente distinto del
mecanismo mediante el cual BAPTA retarda la luminiscencia, que se
debe a la quelación del calcio. Mientras el mecanismo es distinto,
los resultados indican que un antagonista conocido se podría usar
también para retardar el tránsito de calcio. Sin embargo, el uso de
un quelante intracelular debería ser más aplicable universalmente a
cualquier ensayo funcional basado en calcio.
Se usaron líneas celulares parentales HEK293 que
expresan apoaequorina (células 293AEQ17) para desarrollar líneas
celulares clonales estables que expresan el receptor secretagogo de
tipo 1a de la hormona del crecimiento (hGHSR1A). Las células hGHSR1A
se mantuvieron en medio de cultivo conteniendo DMEM (GIBCOBRL,
glucosa elevada, con L-glutamina, con 110 mg/L
piruvato de sodio, con piridoxín HCl), HEPES 25 mM (GIBCOBRL, stock
1M), 0,5 mg/mL geneticina (GIBCOBRL, 50 mg/mL de stock), 0,2 mg/mL
de higromicina (BOEHRINGER MANNHEIM), y 10% de suero fetal bovino
(HYCLONE, descrito) a 37ºC, 10% de CO_{2}.
Se cultivaron células hasta una confluencia del
80-95% en frascos de cultivo tisular
(T-225, CORNING) y se recolectaron por
tripsinización (Tripsina/EDTA, GIBCOBRL). Las células se
distribuyeron (unas 1 x 10^{5} células/0,2 mL/pocillo) en
portaobjetos de poli-D-lisina
BIOCOAT blancos de fondo claro con 96 pocillos (BECTON DICKENSON,
Bedford, MA) en medio de cultivo y se incubaron toda la noche a 37ºC
en un incubador humidificado al 10% de CO_{2}. Las células se
cargaron con el sustrato de la aequorina, coelenterazina h
(MOLECULAR PROBES, #C-6780), retirando el medio de
cultivo e incubando las células con 75 \mul de tampón de carga
(DMEM GIBCOBRL#12320-032; 0,1% FBS GEMINI
BIO-PRODUCTS, Inc. #100-107;
coelenterazina h 5 \muM; glutatión reducido 30 \muM) durante 2
horas a 37ºC, 10% de CO_{2}. Después se retiró el tampón de carga
y las células se lavaron dos veces con 100 \mul de PBS enriquecido
(pH 7,2), y después se incubaron con 100 \muL de PBS enriquecido
suplementado con BAPTA-AM 0-10
\muM durante 30 min a 37ºC, 10% de CO_{2}. Entonces las células
se lavaron y cargaron con 100 \mul de PBS enriquecido con o sin el
antagonista indicado. La respuesta de calcio se inició por adición
de 100 \mul de la concentración indicada de ghrelin (PHOENIX
PHARMACEUTICALS #031031) al set adecuado de 6 pocillos usando un
dispositivo manual. Se usó el WALLAC MICROBETA JET para medir 10 seg
de luminiscencia después de un retardo de 2 minutos.
Las células hGHSR1a se cargaron con
coelenterazina, se trataron con o sin BAPTA-AM, y
luego se incubaron con concentraciones crecientes del antagonista
L-756,867 (Smith, R.G., Griffin, P.R., Xu, Y.,
Smith, A.G.A., Liu, K., Calacay, J., Feighner, S.D., Pong, C.-S.,
Leong, D., Pomes, A., Cheng, K., Van der Ploeg, L.H.T., Howard,
A.D., Schaeffer, J., and Leonard, R.J. (2000) Adenosine: A partial
agonist of the growth hormona secretagogue receptor. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 276, 1306-1313;
Bednarek, M.A., Feighner, S.C., Pong, S-S., McKee,
K.K., Hreniuk, D.L., Silva, M.V., Warren, V.A., Howard, A.D., Van
der Ploeg, L.H.Y., and Heck J.V. (2000)
Structure-function studies on the new growth
hormone-releasing peptide, ghrelin: Minimal sequence
of ghrelin necessary for activation of growth hormone secretagogue
receptor 1a. J. Med. Chem. 43,
4370-4376). Usando una pipeta multicanal manual,
reañadió ghrelin (100 nM) a los portaobjetos de 96 pocillos que
contenían las células hGHSR1a (Fig. 10A). Tras un lapso de dos
minutos, se leyeron los portaobjetos usando el luminómetro WALLAC
MICROBETA JET. Realmente la señal de luminiscencia aumentó con la
concentración de antagonista hasta un punto, pero a concentraciones
superiores se bloqueó completamente. Estas curvas complejas de
respuesta a dosis se observaron en presencia y en ausencia de
BAPTA. Con todo, la adición de BAPTA aumentó la luminiscencia tanto
que se pudo medir una señal 6 veces mayor sobre el campo 2 minutos
después de la estimulación con agonista. Además, los antagonistas de
receptor mostraron la potencia esperada en presencia de BAPTA.
\newpage
Niveles bajos de un quelante intracelular,
BAPTA, pueden ralentizar las cinéticas de los tránsitos de calcio
generados a partir de influjos a través de un canal iónico de
membrana plasmática (VR1) o de liberación de reservorios
intracelulares (canales de apertura mediante InsP_{3}). En las
formas de realización preferidas descritas aquí, el acetoxi metil
éster permeable celular del quelante de calcio, BAPTA, se usó porque
está disponible comercialmente y se puede cargar fácilmente en
células cultivadas en portaobjetos de 96 pocillos. Se han medido
las cinéticas de unión al calcio y la potencia de muchos quelantes
de calcio y han mostrado ligarse rápidamente (2-8 x
10^{8} M^{-1}s^{-1}), pero con tasas y afinidades ampliamente
variables (100-10000 s^{-1}). Estas incluyen
sondas de calcio fluorescentes tales como fura-2, y
el quelante no fluorescente BAPTA, empleado aquí. Los quelantes de
calcio más comúnmente usados, EDTA y EGTA, ligan y liberan calcio
mucho más lentamente (100 veces) comparados con BAPTA y puede que no
sean tan eficaces como BAPTA retardando los cambios muy rápidos de
calcio generados por el canal VR-1.
Las respuestas de calcio podrían bloquearse
completamente a concentraciones suficientemente altas de
BAPTA-AM como las esperadas. Los datos demuestran
que es importante equilibrar la estimulación del receptor y la
concentración de BAPTA intracelular. Puesto que la concentración de
BAPTA intracelular se determina por varios factores incluyendo,
entre otros, tiempo de incubación, temperatura y tipo de célula, la
concentración de BAPTA-AM usada debería dosificarse
cuidadosamente.
Hay otros muchos quelantes de calcio descritos
en la literatura así como proteínas ligantes de calcio que pueden
emplearse para retardar la respuesta medida por mensajeros sensibles
al calcio. Por ejemplo, se pueden generar líneas celulares estables
que expresen proteínas ligantes de calcio, eliminando la necesidad
de cargar células con BAPTA-AM.
Siguiendo la enseñanza de esta descripción de la
invención, solamente se necesita probar cualquier quelante o
proteína ligante para determinar la concentración apropiada que
proporcione eficazmente una ventana que se pueda emplear en el
diseño de un ensayo de alto rendimiento. Cualquier quelante o
proteína ligante particular se puede elegir en base a sus
propiedades, que incluyen, por ejemplo, disponibilidad dentro de una
célula, afinidad por el calcio y tasa de liberación de calcio, y
ejecución completa al retardar una señal fluorescente o
luminiscente.
Claims (7)
1. Un procedimiento para determinar in
vitro si un compuesto candidato es un agonista o un inhibidor de
una proteína usando células que contienen un mensajero sensible al
calcio comprendiendo los pasos de:
- (a)
- proporcionar células que expresan la proteína y contienen un mensajero sensible al calcio;
- (b)
- exponer las células a un quelante de calcio bajo condiciones en las que el quelante entre en la célula y resida intracelularmente;
- (c)
- exponer una primera porción de las células a un compuesto candidato y reservando una segunda porción de células no expuestas al compuesto candidato;
- (d)
- medir la señal generada en la primera porción y la señal generada en la segunda porción de las células; y
- (e)
- comparar la cantidad de señal generada en la primera y segunda porciones de las células donde un aumento en la cantidad de señal en presencia del compuesto candidato indica que el compuesto candidato es un agonista de la proteína.
donde la señal generada por el
mensajero sensible al calcio es retardada por la presencia del
quelante de calcio dentro de las células y la proteína es un
receptor acoplado a proteína-G o un canal iónico que
está acoplado a un canal de
calcio.
2. El procedimiento de la Reivindicación 1 en
el que el paso (a) incluye proporcionar células que se transfieren
transitoriamente con un vector de expresión que dirige la expresión
de la proteína.
3. El procedimiento de la Reivindicación 1 en
el que el mensajero es una proteína.
4. El procedimiento de la Reivindicación 3 en
el que las células se transfieren transitoriamente con un vector de
expresión que dirige la expresión del mensajero.
5. El procedimiento de la Reivindicación 3 en
el que se integra establemente un polinucleótido que dirige la
expresión del mensajero en el genoma de las células.
6. El procedimiento de la Reivindicación 3 en
el que el mensajero es aequorina.
7. El procedimiento de la Reivindicación 1 en
el que el quelante intracelular de calcio es
tetra(acetoximetil)éster del ácido
1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'
tetracético.
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