ES2264450T3 - Proteina localizadora de beta-catenina nuclear. - Google Patents
Proteina localizadora de beta-catenina nuclear.Info
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Abstract
Una proteína elegida entre el grupo formado por: (a) una proteína que contiene la secuencia de restos aminoácidos de 292 a 439 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2; (b) la proteína según (a), dicha proteína contiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 ó 4; (c) una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10; (d) una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10 y 12; (e) una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos, en la que uno o varios aminoácidos se han añadido, han sufrido deleción o se han sustituido de dicha secuencia de aminoácidos de la proteína según uno cualquiera de los párrafos de (a) a (d), y dicha proteína se fija sobre la Beta-catenina y tiene la actividad de localizar la Beta-catenina del núcleo; (f) una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 60% o más con la secuencia de aminoácidos de la proteínasegún uno cualquiera de los párrafos de (a) a (d) y dicha proteína se fija sobre la Beta-catenina y tiene la actividad de localizar la Beta-catenina del núcleo; y (g) la proteína según los anteriores párrafos (c) o (d), dicha proteína consta de una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 60% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 y se fija sobre la Beta-catenina y tiene la actividad de localizar la Beta-catenina del núcleo.
Description
Proteína localizadora de
\beta-catenina nuclear.
La presente invención se refiere a una nueva
proteína que se fija sobre la \beta-catenina y
localiza la \beta-catenina en el núcleo, a DNA que
codifica a la proteína, a un anticuerpo que reconoce a la proteína,
a un agente terapéutico que contiene esta proteína, a DNA o
anticuerpo, y a un agente de diagnóstico que contiene el
anticuerpo.
El gen de la poliposis adenomatosa del colon
(APC) es un gen que se ha aislado como gen causante de la poliposis
adenomatosa familiar (FAP) (Kinzler, K.W. y Vogelstein, B., Cell
87, 159, 1996). Sin embargo, la anomalía del gen APC no se ha
relacionado con la FAP sino también con un 70-80% de
los casos de cáncer esporádico de colon. El inicio del cáncer de
colon se considera que se desencadena por mutaciones graduales de
múltiples genes que, además del APC, incluyen genes tales como el
K-ras, el p53 y el DCC. Dado que las mutaciones del
gen APC se encuentran en el estadio más precoz entre estos genes, se
considera que la anomalía del gen APC es la primera que se produce
para que se inicie el cáncer de colon.
Con el fin de clarificar el mecanismo que
subyace a la carcinogénesis asociada con la anomalía del gen APC es
necesario determinar las funciones del producto genético, el APC. Se
ha publicado que el APC, que es una proteína de un tamaño de unos
300 kDa, se fija sobre la \beta-catenina, la
glucógeno-sintasa-quinasa-3\beta
(GSK-3\beta) y también sobre el DLG de las células
(Rubinfeld, B. y col., Science 262, 1731, 1993; Su, L.K. y
col., Science 262, 1734, 1993; Rubinfeld, B. y col., Science
272, 1023, 1996; Matsumine, A. y col., Science 272,
1020, 1996). En lo que respecta a las funciones del APC se ha
publicado que el nivel intracelular de la
\beta-catenina se reduce rápidamente cuando el APC
de tipo salvaje se expresa en la línea celular de cáncer de colon
SW480, que tiene mutaciones del gen APC (Munemitsu, S. y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 92, 3046, 1995). La región central, que
contiene una estructura de secuencia con 7 repeticiones, es esencial
para la función del APC y coincide con una región, cuyas mutaciones
se encuentran en muchos casos de cáncer de colon. Se ha publicado
que el nivel intracelular de la \beta-catenina es
elevado en estas células de cáncer de colon (Munemitsu, S. y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3046, 1995; Rubinfeld, B. y
col., Cancer Res. 57, 4624, 1997).
La \beta-catenina es también
conocida como proteína de esqueleto de membrana para la adhesión
celular de la molécula de cadherina y se ha publicado también que
participar en la transducción de señales de las proteínas Wnt
descritas a continuación (Cadigan, K.M. y Nusse, R., Genes Dev.
11, 3286, 1997). El grupo de los genes Wnt es un grupo
genético grande que tiene una gran variedad de funciones en los
procesos de la embriogénesis y morfogénesis precoces de los
animales; el grupo consta de unos 20 tipos de genes en el ratón y
los genes se conservan entre una gran variedad de animales, incluida
la rana claveteada africana (Xenopus laevis), la mosca de los
frutales (Drosophila melanogaster) y nemátodos
(Caenorhabditis elegans). Cuando el Wnt se fija sobre su
receptor rizado (frizzled), se inhibe la actividad de la
glucógeno-sintasas-quinasa-3\beta
(GSK-3\beta) por acción de una molécula de
señalización intracelular desgreñada (dishevelled, dsh). Dado que la
fosforilación de la \beta-catenina mediada por la
GSK-3\beta provoca la degradación de la
\beta-catenina, la inhibición de la actividad de
la GSK-3\beta conduce a una acumulación de la
\beta-catenina en las células. La
\beta-catenina se fija sobre un factor de
transcripción (abreviado a continuación con las siglas TCF), que
pertenece al grupo de los Lef/Tcf, para formar un complejo y, de
este modo, activa el TCF como factor de transcripción. Por ello, la
acumulación de la \beta-catenina conduce a la
formación del complejo
\beta-catenina-TCF que se traspone
al núcleo y de este modo estimula la transcripción de los genes
diana. Entre los Tcf, el Tcf-4 se expresa
específicamente en el epitelio del colon y, por ello, se cree que la
\beta-catenina forma principalmente un complejo
con el Tcf-4 en el cáncer de colon (Korinek, V. y
col., Science 275, 1784, 1997). Se ha publicado además que
hay algunas células de cáncer de colon y algunas células de
melanoma, en las que el gen APC es de tipo salvaje, pero el gen de
la \beta-catenina tiene una mutación y no está
regulado por la GSK-3\beta (Morin, P.J. y col.,
Science 275, 1787, 1997; Rubinfeld, B. y col., Science
275, 1790, 1997). Se estima que la
\beta-catenina se acumula constantemente en estas
células, lo cual conduce a una activación transcripcional por el
complejo \beta-catenina/TCF.
Sobre la base de los hallazgos recién descritos,
la \beta-catenina puede estar involucrada en gran
manera en el inicio del cáncer de colon. Por lo tanto, una sustancia
capaz de inhibir la función de la \beta-catenina
por fijación sobre la misma podría asociarse con el inicio del
cáncer de colon y otros similares y podría ser útil para el
tratamiento, el diagnóstico y similares del mismo. Como molécula que
se fija sobre la \beta-catenina se publicado una
proteína, la axina, que regula negativamente el sistema de
transducción de señales de las proteínas Wnt (Zeng, L. y col., Cell
90, 181, 1997). La axina se fija sobre la
GSK-3\beta y de este modo estimula la
fosforilación de la \beta-catenina (Ikeda, S. y
col., EMBO J. 17, 1371, 1998). Se ha publicado además que la
axina se fija también sobre el APC y la
\beta-catenina, estimulando la degradación de la
\beta-catenina y, de este modo, reduce el nivel de
la \beta-catenina en las células (Kishida, S. y
al., J. Biol. Chem. 273, 10823, 1998); Rubinfeld, B. y col.,
Current Biology 8, 573, 1998; Nakamura, T. y col., Genes
Cells 3, 395, 1998). Sin embargo, no se conoce ninguna
proteína que se fije sobre la \beta-catenina ni
que tenga la función de localizar la
\beta-catenina en el núcleo.
\newpage
La proteína bcl9 (Willis, T.G. y col., Blood
91, 1871, 1998) es un producto de un gen que se ha clonado a
partir del sitio de translocación del cromosoma 1 de la línea
celular CEMO-1, establecida a partir de un paciente
con leucemia linfoblástica aguda de células B precursoras y el nivel
de expresión del gen es anormalmente elevado en las células
CEMO-1. Sin embargo, su asociación con la
\beta-catenina, por ejemplo su fijación sobre la
\beta-catenina, continúa sin conocerse.
Es deseable en la técnica aislar y clarificar la
estructura de las proteínas y del DNA que codifica a la proteínas,
que son útiles para el tratamiento y el diagnóstico del cáncer,
mediante la elucidación del mecanismo del inicio del cáncer
(incluido el cáncer de colon, en el que la
\beta-catenina desempeña un papel) analizando las
proteínas que se fijan sobre la \beta-catenina y
regulan su función y los genes que las codifican.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar una proteína que se fije sobre la
\beta-catenina y tenga la actividad de localizar
la \beta-catenina en el núcleo, el DNA que
codifique a la proteína, un anticuerpo que reconozca a la proteína,
un agente terapéutico que contenga la proteína o el DNA y un agente
de diagnóstico que contenga el anticuerpo, todos ellos son útiles
para el tratamiento y diagnóstico del cáncer.
La presente invención se refiere a:
(1) una proteína que contiene la secuencia de
restos aminoácidos de 292 a 439 de la secuencia representada por la
SEQ ID NO: 2;
(2) la proteína que codifica a la anterior
proteína (1), dicha proteína (2) contiene la secuencia de
aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 ó 4;
(3) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10;
(4) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10 y 12;
(5) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos, en la que uno o varios aminoácidos se han añadido, han
sufrido deleción o se han sustituido de dicha secuencia de
aminoácidos de la proteína según uno cualquiera de los párrafos de
(1) a (4) y dicha proteína se une a la
\beta-catenina y tiene la actividad de localizar
la \beta-catenina del
núcleo;
núcleo;
(6) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos que tiene una homología del 60% o más con la secuencia
de aminoácidos de la proteína según uno cualquiera de los párrafos
de (1) a (4) y dicha proteína se fija sobre la
\beta-catenina y tiene la actividad de localizar
la \beta-catenina del núcleo;
(7) la proteína según los anteriores párrafos
(3) o (4), dicha proteína consta de una secuencia de aminoácidos que
tiene una homología del 60% o más con la secuencia de aminoácidos
representada por la SEQ ID NO: 2 y se fija sobre la
\beta-catenina y tiene la actividad de localizar
la \beta-catenina del núcleo;
(8) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12;
(9) un polipéptido que tiene de 5 a 60 restos
de aminoácido contiguos en la secuencia de aminoácidos de la
proteína según uno cualquiera de los anteriores párrafos de (1) a
(8);
(10) un DNA que codifica a la proteína o al
polipéptido de uno cualquiera de los anteriores párrafos de (1) a
(9);
(11) un DNA que consta de una secuencia de
nucleótidos que contiene los nucleótidos de 874 a 1317 de la
secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1;
(12) un DNA según anterior párrafo (11), dicho
DNA contiene la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID
NO: 1 ó 3;
(13) un DNA que codifica a una proteína que se
fija sobre la \beta-catenina y tiene la actividad
de localizar la \beta-catenina dentro del núcleo y
consta de la secuencia de nucleótidos de las siguientes [1] y
[2]:
- [1]
- la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 9; y
- [2]
- la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 9 y 11;
(14) un DNA que se hibrida con el DNA de uno
cualquiera de los anteriores de (10) a (13) en condiciones
restrictivas (stringent) que codifica a una proteína que se fija
sobre la \beta-catenina del núcleo;
(15) un DNA que consta de una secuencia de
nucleótidos representadas por las SEQ ID NO: 9 y 11 y que consta de
una secuencia de nucleótidos que tiene una homología del 60% o más
con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y codifica a una
proteína que se fija sobre la \beta-catenina y
tiene la actividad de localizar la \beta-catenina
del núcleo;
(16) un DNA que contiene la secuencia de
nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 11;
(17) un DNA recombinante que puede obtenerse
insertando el DNA de uno cualquiera de los anteriores párrafos de
(10) a (16) en un vector;
(18) un transformante obtenible por introducción
del DNA recombinante del anterior párrafo (17) en una célula
hospedante;
(19) un proceso para introducir la proteína o el
polipéptido según una cualquiera de las anteriores párrafos de (1) a
(9), que consiste en los pasos de:
cultivar el transformante del anterior párrafo
(18) en un medio de cultivo;
producir y acumular la proteína o el polipéptido
según uno cualquiera de los anteriores párrafos de (1) a (9) en el
cultivo; y
recuperar la proteína o el polipéptido del
cultivo;
(20) un oligonucleótido que contiene de 10 a 60
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del DNA según
uno cualquiera de los párrafos de (10) a (16) o una secuencia de
nucleótidos complementaria a la anterior, o un derivado de los
oligonucleótidos;
(21) un método de detección o de cuantificación,
a nivel de mRNA, el nivel de expresión de la proteína según uno
cualquiera de las anteriores párrafos de (3) a (7), empleando el DNA
según una cualquiera de los anteriores párrafos de (10) a (16), o el
oligonucleótido o el derivado del mismo según el anterior párrafo
(20);
(22) un método para detectar una enfermedad en
la que el nivel de expresión de la proteína según uno cualquiera de
los párrafos de (3) a (7) se aumenta o se reduce en un paciente, si
se compara con un sujeto sano normal, midiendo y comparando el nivel
de expresión de la proteína en un sujeto sano normal y el sujeto
sometido al ensayo a nivel de mRNA empleando el DNA según uno
cualquiera de los anteriores párrafos de (10) a (16) o el
oligonucleótido o un derivado del mismo según el anterior párrafo
(20);
(23) un agente de diagnóstico para una
enfermedad que presenta un nivel de expresión aumentado o reducido
de la proteína según uno cualquiera de los anteriores párrafos de
(3) a (7) en un paciente por comparación con un sujeto sano normal,
mediante la medición y comparación del nivel de expresión de la
proteína a nivel de mRNA, dicho agente de diagnóstico contiene el
DNA según una cualquiera de los anteriores párrafos de (10) a (16) o
el oligonucleótido o derivado del mismo según el anterior párrafo
(20);
(24) un método para detectar una mutación en un
gen que codifica la proteína según uno cualquiera de los anteriores
párrafos de (3) a (7) empleando el DNA según uno cualquiera de los
anteriores párrafos de (10) a (16), o el oligonucleótido o derivado
del mismo según el anterior párrafo (20);
(25) un método para detectar una enfermedad que
tiene una mutación en el gen que codifica la proteína según uno
cualquiera de los anteriores párrafos de (3) a (7) empleando el DNA
según uno cualquiera de los anteriores párrafos de (10) a (16) o el
oligonucleótido o derivado del mismo según el anterior párrafo
(20);
(26) un agente de diagnóstico para una
enfermedad que tiene una mutación en el gen que codifica la proteína
según uno cualquiera de los anteriores párrafos de (3) a (7)
empleando el DNA según uno cualquiera de los anteriores párrafos de
(10) a (16) o el oligonucleótido o derivado del mismo según el
anterior párrafo (20);
(27) un método para inhibir la expresión de la
proteína según uno cualquiera de los anteriores párrafos de (3) a
(7) a nivel transcripcional empleando el DNA según uno cualquiera de
los anteriores párrafos de (10) a (16) o el oligonucleótido o el
derivado del mismo según el anterior párrafo (20);
(28) un método para inhibir la localización
nuclear de la \beta-catenina, empleando un
oligonucleótido o un DNA seleccionado entre el grupo formado por:
(i) el DNA según uno cualquiera de los anteriores párrafos de (10) a
(16); (ii) el oligonucleótido o derivado del mismo según el anterior
párrafo (20); (iii) un DNA que codifica a la proteína bcl9; (iv) un
oligonucleótido que contiene de 10 a 60 oligonucleótidos contiguos
de la secuencia de nucleótidos del DNA que codifica a la proteína
bcl9; y (v) un oligonucleótido que contiene una secuencia de
nucleótidos complementaria del oligonucleótido de (iv) o un derivado
del mismo;
(29) un agente terapéutico para el cáncer que
consta de un oligonucleótido o de un DNA elegido entre el grupo
formado por: (i) el DNA según uno cualquiera de los anteriores
párrafos de (10) a (16); (ii) el oligonucleótido o derivado del
mismo según el anterior párrafo (20); (iii) un DNA que codifica a la
proteína bcl9; (iv) un oligonucleótido que contiene de 10 a 60
oligonucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del DNA
que codifica a la proteína bcl9; y (v) un oligonucleótido que
contiene una secuencia de nucleótidos complementaria del
oligonucleótido de (iv) o un derivado del mismo;
(30) un vector para la terapia genética que
contiene el DNA según uno cualquiera de los anteriores de (10) a
(16);
(31) un animal transgénico no humano, generado
por introducción del DNA según uno cualquiera de los anteriores
párrafos de (10) a (16);
(32) un método para utilizar el animal
transgénico no humano según el anterior párrafo (31) o un animal
transgénico no humano generado por introducción de una DNA que
codifica a la proteína bcl9 como modelo animal de
carcinogénesis;
(33) un método para evaluar un agente
terapéutico para el cáncer empleando un animal transgénico según el
anterior párrafo (31) o un animal transgénico generado por
introducción de un DNA que codifique a la proteína bcl9;
(34) un animal no humano deficiente
genéticamente, en el que la función de una proteína para fijarse
sobre la \beta-catenina y para localizar la
\beta-catenina dentro del núcleo se ha perdido o
se ha reducido debido a la deleción de la totalidad o de una parte
del DNA según uno cualquiera de los anteriores párrafos de (10) a
(16);
(35) un método para explorar una sustancia que
inhiba la fijación de la proteína bcl9 y la
\beta-catenina, que consta de los pasos
siguientes:
comparar la fijación de la proteína bcl9 y la
\beta-catenina en ausencia [1] o en presencia [2]
de la muestra a ensayar;
(36) un método para explorar una sustancia que
inhiba la fijación de la \beta-catenina y de la
proteína según uno cualquiera de los anteriores párrafos de (1) a
(7), que consisten en los pasos de:
comparar la fijación de la
\beta-catenina y la proteína en ausencia [1] o en
presencia [2] de la muestra a ensayar; y
seleccionar de la muestra a ensayar una
sustancia que inhiba la fijación de la
\beta-catenina y la proteína según uno cualquiera
de los anteriores párrafos de (1) a (7);
(37) un compuesto que puede obtenerse por el
método de exploración según los anteriores párrafos (35) ó (36) o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
(38) un agente terapéutico para el cáncer, que
contiene el compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo
según el anterior párrafo (37);
(39) un anticuerpo que reconoce la proteína o el
polipéptido según uno cualquiera de los anteriores párrafos de (1) a
(9);
(40) un método de detección inmunológica o de
cuantificación de proteína según uno cualquiera de los anteriores
párrafos de (1) a (7) empleando el anticuerpo según el anterior
párrafo (39);
(41) un anticuerpo neutralizador que se fija
sobre la proteína según uno cualquiera de los anteriores párrafos de
(1) a (7) y de este modo inhibe la actividad de la proteína para
fijarse sobre la \beta-catenina y localizar la
\beta-catenina en el núcleo;
(42) un anticuerpo neutralizador que se fija
sobre la proteína bcl9 y de este modo inhibe la actividad de la
proteína bcl9 para fijarse sobre la \beta-catenina
y localizar la \beta-catenina del núcleo;
(43) un método para detectar una enfermedad, en
el que el nivel de expresión de la proteína según uno cualquiera de
los anteriores párrafos de (3) a (7) está aumentado o reducido en un
paciente si se compara con un sujeto sano normal, mediante la
cuantificación y comparación del nivel de expresión de la proteína
en el sujeto sano normal y un sujeto sometido a ensayo con el uso
del anticuerpo del anterior párrafo (39);
(44) un agente de diagnóstico que consta de un
anticuerpo según el anterior párrafo (39) para una enfermedad, en la
que el nivel de expresión de la proteína según uno cualquiera de los
anteriores párrafos de (3) a (7) está aumentado o disminuido en un
paciente, si se compara con el de sujetos sanos normales;
(45) un método para inhibir la activación
transcripcional con un complejo de la
\beta-catenina y el factor de transcripción
perteneciente al grupo Lef/Tcf mediante la inhibición de la función
de la proteína según uno cualquiera de los anteriores párrafos de
(1) a (7) empleando el anticuerpo según el anterior párrafo
(41);
(46) un método para inhibir la activación
transcripcional con un complejo de la
\beta-catenina y el factor de transcripción
perteneciente al grupo Lef/Tcf mediante la inhibición de la función
de la proteína bcl9 empleando un anticuerpo según el anterior
párrafo (42); y
(47) un agente terapéutico para el cáncer que
contiene el anticuerpo según los anteriores párrafos (41) ó
(42).
Las proteínas o polipéptidos de la presente
invención incluyen:
(a) una proteína que contiene la secuencia de
amino
una proteína que contiene la secuencia de restos
aminoácidos de 292 a 439 de la secuencia representada por la SEQ ID
NO: 2;
(b) la proteína que codifica a la anterior
proteína (a), dicha proteína (b) contiene la secuencia de
aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 ó 4;
(c) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10;
(d) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10 y 12;
(e) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos, en la que uno o varios aminoácidos se han añadido, han
sufrido deleción o se han sustituido de dicha secuencia de
aminoácidos de la proteína según uno cualquiera de los párrafos de
(a) a (d) y dicha proteína se une a la
\beta-catenina y tiene la actividad de localizar
la \beta-catenina del núcleo;
(f) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos que tiene una homología del 60% o más con la secuencia
de aminoácidos de la proteína según uno cualquiera de los párrafos
de (a) a (d) y dicha proteína se fija sobre la
\beta-catenina y tiene la actividad de localizar
la \beta-catenina del núcleo;
(g) la proteína según los anteriores párrafos
(c) o (d), dicha proteína consta de una secuencia de aminoácidos que
tiene una homología del 60% o más con la secuencia de aminoácidos
representada por la SEQ ID NO: 2 y se fija sobre la
\beta-catenina y tiene la actividad de localizar
la \beta-catenina del núcleo;
(h) una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12;
(i) un polipéptido que tiene de 5 a 60 restos
de aminoácido contiguos en la secuencia de aminoácidos de la
proteína según uno cualquiera de los anteriores párrafos de (a) a
(h).
La adición, deleción o sustitución de
aminoácido(s) mencionada anteriormente puede realizarse
introduciendo una mutación específica de sitio (posición) en un DNA
que codifica a la proteína que contiene la secuencia de aminoácidos
representada por la SEQ ID NO: 2 mediante una mutagénesis dirigida a
una posición, ya descrita en la bibliografía técnica (Zoller, M.J. y
Smith, M., Nucleic Acids Res. 10, 6487, 1982;
Dalbadie-McFarland, G. y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79, 6409, 1982; Wells, J.A. y col., Gene 34,
315, 1985; Carter, P. y col., Nucleic Acids Res. 13, 4431,
1985; Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488, 1985;
etc.).
El número de aminoácidos a añadir, a suprimir
(delete) o sustituir no se limita específicamente; sin embargo, es
un número que puede añadirse, suprimirse o sustituirse por métodos
convencionales, por ejemplo la mutagénesis dirigida a una posición
recién mencionada, dicho número se sitúa entre uno y varias decenas,
con preferencia de 1 a 20, con preferencia especial de 1 a 10 y
sobre todo de 1 a 5.
Como alternativa, la PCR puede realizarse
utilizando un par de cebadores de PCR, que tiene una secuencia
introducida con una mutación deseada (adición, deleción o
sustitución) en el correspondiente extremo 5' (Ho, S.N. y col., Gene
77, 51, 1989) para introducir la mutación en un DNA que
codifica a la proteína que contiene la secuencia de aminoácidos
representada por la SEQ ID NO: 2. Específicamente, en primer lugar,
utilizando el DNA como molde, se realiza la PCR con un cebador
sentido que corresponde al extremo 5' del DNA y con un cebador
antisentido que corresponde a la secuencia inmediatamente antes (en
dirección al extremo 5') de un sitio de mutación y contiene una
secuencia complementaria de una secuencia mutada para amplificar el
fragmento A (una mutación introducida en su extremo 3') que se
extiende desde el extremo 5' del DNA hasta el sitio de mutación. A
continuación, empleando el mismo DNA como molde, se realiza la PCR
con un cebador sentido que corresponde a la secuencia inmediatamente
después (en dirección al extremo 3') al sitio de mutación y contiene
la secuencia mutada en su extremo 5' y un cebador antisentido que
corresponde al extremo 3' del DNA para amplificar el fragmento B que
se extiende desde el sitio de mutación hasta el extremo 3' del DNA
que se introduce con una mutación en su extremo 5'. Estos
fragmentos amplificados se purifican en cada caso. Seguidamente se
mezclan estos fragmentos y se realiza la PCR sin añadir molde ni
cebadores, la hebra sentido del fragmento A y la hebra antisentido
del fragmento B se hibridan, debido a que tienen sitios de mutación
comunes y la reacción PCR procesa la hebra hibridada como molde y
cebadores para amplificar el DNA introducido con la mutación.
Por otro lado se puede obtener un DNA que
codifique a un fragmento parcial, una especie de mutante de
deleción, de la proteína que localiza a la
\beta-catenina del núcleo, realizando la PCR con
un conjunto de cebadores que corresponden a la secuencia de
nucleótidos en ambos extremos de un fragmento de DNA arbitrario de
un DNA que codifica a una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, empleando el DNA como
molde.
La proteína de la presente invención tiene con
preferencia una homología por lo menos del 60% o más, normalmente
del 80% o más y en particular del 95% o más con la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO: 2 de modo que retenga la función de localizar
a la \beta-catenina en el núcleo.
La homología de las secuencias de aminoácidos y
de secuencias de nucleótidos puede determinarse empleando el BLAST,
un algoritmo desarrollado por Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90, 5873, 1993) o el FASTA (Methods Enzymol.
183, 63, 1990). Se han desarrollado los programas llamados
BLASTN y BLASTX, basados en el algoritmo BLAST (J. Mol. Biol.
215, 403, 1990). Para los análisis BLASTN de una secuencia de
nucleótidos basados en el BLAST, los parámetros se fijan por ejemplo
en puntuación = 100 y longitud de palabra = 12. Para los análisis
BLASTX de secuencias de aminoácidos, basados en el BLAST, los
parámetros se fijan por ejemplo en puntuación = 50 y longitud de
palabra = 3. Cuando se utilizan el BLAST y los programas BLAST de
intervalos (gapped), en ambos programas se emplean los parámetros
por defecto. Los procedimientos específicos para realizar estos
análisis ya son conocidos de los expertos en la materia
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Un ejemplo de la proteína que contiene la
secuencia de aminoácidos, en la que se añaden, suprimen o sustituyen
uno o varios restos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
representada por la SEQ ID NO: 2 que se fija sobre la
\beta-catenina y tiene la actividad de localizar
la \beta-catenina dentro del núcleo incluye una
proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la
SEQ ID NO: 4, que es un fragmento parcial correspondiente a los
restos de 245 a 564 de la secuencia de aminoácidos representada por
la SEQ ID NO: 2.
El DNA de la presente invención incluye:
(j) un DNA que codifica a la proteína o
polipéptido anterior de la presente invención,
(k) un DNA que consta de una secuencia de
nucleótidos que contiene los nucleótidos de 874 a 1317 de la
secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1;
(l) un DNA según anterior párrafo (k), dicho DNA
contiene la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO:
1 ó 3;
(m) un DNA que codifica a una proteína que se
fija sobre la \beta-catenina y tiene la actividad
de localizar la \beta-catenina dentro del núcleo y
consta de la secuencia de nucleótidos de las siguientes [1] y
[2]:
- [1]
- la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 9; y
- [2]
- la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 9 y 11;
(n) un DNA que se hibrida con el DNA de uno
cualquiera de los anteriores de (j) a (m) en condiciones
restrictivas (stringent) que codifica a una proteína que se fija
sobre la \beta-catenina del núcleo;
(o) un DNA que consta de una secuencia de
nucleótidos representadas por las SEQ ID NO: 9 y 11 y que consta de
una secuencia de nucleótidos que tiene una homología del 60% o más
con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y codifica a una
proteína que se fija sobre la \beta-catenina y
tiene la actividad de localizar la \beta-catenina
del núcleo; o
(p) un DNA que contiene la secuencia de
nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 11.
Un DNA que se hibrida en condiciones
restrictivas (stringent) significa, por ejemplo, aquellos DNA que se
obtienen por el método de hibridación de colonias, el método de
hibridación en placa, el método de hibridación de transferencia
Southern (Southern blot) y aquellos que utilizan como sonda el DNA
de la presente invención, por ejemplo el DNA que tiene una secuencia
de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 o un fragmento
parcial del mismo. Tal DNA incluye específicamente aquellos que se
identifican por inmovilización de un DNA derivado de una colonia o
una placa sobre un filtro, sometiendo el filtro a hibridación en
presencia de 0,7 a 1,0 moles/l de NaCl a 65ºC y después lavando el
filtro con una solución de 0,1 a 2x SSC (1x SSC = 150 mmoles/l de
NaCl, 15 mmoles/l de citrato sódico) a 65ºC. La hibridación puede
realizarse con arreglo a métodos descritos en "Molecular Cloning,
A Laboratory Manual", segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989 (que seguidamente se abrevia por "Molecular
Cloning, segunda edición"), "Current Protocols in Molecular
Biology", suplementos 1-38, John Wiley & Sons
(1987-1997) (que seguidamente se abrevia por
"Current Protocols in Molecular Biology"); "DNA cloning 1:
Core Techniques, A Practical Approach", segunda edición,
universidad de Oxford, 1995, y similares. Los DNA hibridables
incluyen en concreto los DNA que tienen una homología por lo menos
del 60%, o más, con preferencia del 70% o más, con mayor preferencia
del 80% o más, con preferencia especial del 90% o más, con
preferencia muy especial del 95% o más y con preferencia máxima del
98% o más de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.
Los oligonucleótidos de la presente invención
incluyen los que tienen una secuencia de 10 a 60 nucleótidos de la
secuencia de nucleótidos del DNA de la presente invención. Sin
embargo, los oligonucleótidos formados por secuencias conocidas de
nucleótidos, por ejemplo los EST o las secuencias diseñadas (draft)
de genoma que ya se han publicado, se excluyen de los
oligonucleótidos de la presente invención.
La presente invención se describe con detalle a
continuación. En la descripción que sigue, una proteína que se fija
sobre la \beta-catenina y tiene la actividad de
localizar la \beta-catenina dentro del núcleo se
denomina "proteína de localización de la
\beta-catenina nuclear" y la proteína de
localización de la \beta-catenina nuclear de la
presente invención que tiene una nueva secuencia de aminoácidos se
denomina "proteína similar a la bcl9" (abreviada a continuación
con proteína B9L), debido a su homología con la bcl9.
Los DNA que codifican a la proteína B9L de la
presente invención (abreviados a continuación con B9L DNA) incluyen
los B9L cDNA de longitud completa, la región del B9L cDNA que
codifica a la proteína B9L (DNA que contiene la secuencia de
nucleótidos representado por la SEQ ID NO: 1) y un DNA que codifica
a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2:
Un B9L cDNA puede obtenerse por un sistema de
dos híbridos de levadura (Fields, S. y col., Nature 340, 245,
1989).
El sistema de dos híbridos de levadura es un
método para detectar la unión entre la proteína X de interés
(llamada en general "anzuelo" (bait) en el método) y una
proteína Y a analizar empleando un factor de transcripción de
levadura Z, por ejemplo el GAL4, que separadamente tiene un dominio
de fijación (BD) de DNA y un dominio de activación (AD) de
transcripción. En primer lugar se prepara un plásmido (plásmido
anzuelo) que puede expresar la X en una célula de levadura
hospedante como proteína de fusión con el dominio de fijación del
DNA de un factor de transcripción Z (llamado a continuación
BD-X). Ambos plásmidos se introducen en una célula
de levadura hospedante para expresar simultáneamente la
BD-X y la AD-Y. Como hospedantes se
emplean células de levadura que tienen un genotipo que pueda
expresar un gen informante (reporter) bajo el control de un promotor
que se activa después de la fijación del factor de transcripción Z.
Cuando la proteína Y tiene la característica de fijarse sobre la
proteína X, la BD-X y la AD-Y se
unen para formar un complejo que después se fija sobre un promotor
mediante el dominio de fijación (BD) de DNA y activa la
transcripción a través del dominio de activación (AD)
transcripcional para expresar el gen informante. Por lo tanto, la
expresión del gen informante puede utilizarse como un marcador para
detectar la unión entre las proteínas X e Y. Puede aislarse un
transformante que lleva un cDNA que codifica a una proteína Y que se
fija sobre la proteína X mediante la exploración de transformantes
empleando proteínas derivadas de una biblioteca de cDNA como
proteína a ensayar Y y la expresión del gen informante como
marcador. Además puede clonarse un cDNA de interés aislando un
plásmido del transformante.
A continuación se describe específicamente un
procedimiento para la clonación del B9L cDNA según el método recién
mencionado empleando un dominio de armadillo de la
\beta-catenina de ratón (abreviado a continuación
por m\beta-catenina-arma) y la
GAL4 de levadura como ejemplos de X anzuelo y factor de
transcripción Z, respectivamente.
En la presente invención se emplea como anzuelo
el \beta-catenina-arma (que
corresponde a la secuencia de aminoácidos de los restos 128 a 683 de
la \beta-catenina del ratón). Para preparar un
plásmido anzuelo es necesario un DNA que codifique al
m\beta-catenina-arma (abreviado a
continuación por
m\beta-catenina-arma-DNA),
que actúa como anzuelo. Dado que los expertos en la materia ya
conocen la secuencia completa de nucleótidos del cDNA de la
\beta-catenina de ratón (GenBank, nº de registro:
M90364; Buts, S. y col., Science 257, 1142, 1992), la
secuencia de nucleótidos correspondiente al
m\beta-catenina-arma-DNA
puede reconocerse fácilmente. Por consiguiente, el
m\beta-catenina-arma-DNA
puede amplificarse y aislarse por el método de la
RT-PCR descrito a continuación (McPherson, M.J. y
col., "PCR, A Practical Approach", Oxford University Press,
1991).
Específicamente se aisla el RNA a partir de un
tejido de ratón o de células que expresan la
\beta-catenina; se sintetiza el cDNA a partir del
RNA; se efectúa la PCR empleando el cDNA como molde, un cebador
sentido que contiene la secuencia de nucleótidos correspondiente al
extremo 5' del
m\beta-catenina-arma-DNA
y un cebador antisentido que contiene una secuencia de nucleótidos
complementaria del extremo 3' de la secuencia de nucleótidos. Cuando
el extremo 5' de cada cebador de la amplificación se diseña para que
tenga una secuencia de un sitio de reconocimiento para enzimas de
restricción de un vector de clonación para el plásmido anzuelo que
se describe a continuación, entonces el fragmento amplificado puede
insertarse eficazmente en el vector de clonación para el plásmido
anzuelo del modo descrito a continuación, empleando los sitios de
enzimas de restricción. Si se quiere que los cebadores tengan las
secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción para la
clonación, estos cebadores se diseñan de tal modo que los codones
del dominio de activación transcripcional del factor de
transcripción estén dentro del marco de los del
m\beta-catenina-arma cuando se
insertan en el vector de clonación.
El vector (que se empleará con preferencia para
insertar el
m\beta-catenina-arma-DNA
obtenido por el método mencionado antes) incluye un vector capaz de
replicarse en la levadura Saccharomyces cerevisiae y que
tiene un gen marcador apropiado para la transformación, p. ej. genes
para la biosíntesis de aminoácidos, tales como el TRP1 y el LEU2, y
puede expresar el dominio de fijación del DNA del GAL4 (abreviado a
continuación por GAL4 BD) bao la regulación de un promotor para la
expresión en levadura, p. ej. un promotor
alcohol-deshidrogenasa (ADH). En tales casos es
preferible emplear un vector que tenga sitios de enzima de
restricción apropiados en la porción C-terminal del
GAL4 BD para la inserción del
m\beta-catenina-arma-DNA
y sea capaz de replicarse en la Escherichia coli, debido a la
conveniencia de manipular, p. ej. purificar un DNA vector, así como
de tener un marcador detectable para la transformación en E.
coli, p. ej. el gen de resistencia a la ampicilina. Tales
vectores incluyen el pGBT9 (Clontech), el pAS1 (Durfee, T. y col.,
Genes and Development 7, 555, 1993), el
pAS2-1 (Clontech) y similares.
Se aisla el
m\beta-catenina-arma-DNA
preparado previamente y después se inserta en un sitio de enzima de
restricción del lado C-terminal del GAL4 BD del
vector del marco del codón.
Con el fin de preparar una biblioteca de cDNA
para la expresión de una proteína de fusión con el dominio de
activación transcripcional de GAL4, el vector a utilizar puede
replicarse con preferencia en la levadura Saccharomyces
cerevisiae, y tiene un gen marcador apropiado para la
transformación, p. ej. genes para la biosíntesis de aminoácidos en
levadura, por ejemplo el TRP1 y el LEU2, y puede expresar el dominio
de activación transcripcional del GAL4 (abreviado a continuación con
GAL4 AD) bajo la regulación de un promotor para la expresión en la
levadura, p. ej. el promotor de
alcohol-deshidrogenasa (ADH). En tales casos es
preferible utilizar un vector que tenga sitios de enzima de
restricción apropiados en la porción C-terminal del
GAL4 AD y que sea capaz también de replicarse en la E. coli,
debido a la conveniencia de manipularlo, p. ej. purificar el DNA
vector, así como de tener un marcador detectable para la
transformación en la E. coli, p. ej. el gen de resistencia a
la ampicilina. Tales vectores incluyen el pGAD (Chien, C.T. y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578, 1991), el pGAD424
(Clontech), el pACT (Durfee, T y col., Genes and Development
7, 555, 1993), el pACT2-1 (Clontech) y
similares.
Está previsto que las proteínas que
interaccionan con la \beta-catenina de las células
se expresan en las mismas células y tejidos que la
\beta-catenina. Se ha publicado que la
\beta-catenina se halla ampliamente expresada en
los tejidos de los adultos y de los embriones. Por lo tanto, es
posible preparar una biblioteca de cDNA obteniendo los cDNA de
tejidos y células de ratón, en los que está previsto que la
\beta-catenina se exprese, e insertándolos en un
sitio de enzima de restricción de la lado C-terminal
del GAL4 AD del vector mencionados anteriormente para la expresión
de la proteína de fusión. En tales casos, cuando el cDNA y el GAL4
AD tienen la misma orientación y están dentro del marco, entonces
puede expresarse la proteína de fusión entre el GAL4 AD y la
proteína codificada por el cDNA. Como alternativa es posible
utilizar una biblioteca, que sea un producto comercial, que pueda
utilizarse en el sistema de dos híbridos de levadura, p. ej. la
biblioteca de cDNA MATCHMAKER (Clontech).
Una levadura que puede emplearse para la
introducción de un plásmido anzuelo preparado según el apartado (1)
y la biblioteca de cDNA preparada según el (2) incluye a las
levaduras pertenecientes al Saccharomyces cerevisiae, en el
que puede introducirse el plásmido anzuelo y la biblioteca de cDNA y
después se requiere: (a) que el gen marcador para la transformación
en el plásmido que se quiere introducir y el gen del factor de
transcripción GAL4 empleando en el sistema de dos híbridos sean
incapaces de expresarse debido a sus deleciones o mutaciones; y (b)
que se haya insertado en la región de promotor de un gen informante
apropiado la secuencia de nucleótidos sobre la que pueda fijarse el
GAL4 BD. En este caso es preferible utilizar un gen informante, cuya
transcripción se detecte fácilmente cuando se inicia con la unión
con el anzuelo, por ejemplo genes para la biosíntesis de
aminoácidos, p. ej. el HIS3, etc. (en este caso, el en podría ser
diferente del empleado como marcador para la transformación del
plásmido anzuelo), el gen lacZ de la
\beta-galactosidasa de la E. coli que es
detectable en la levadura y similares. Por ejemplo, la levadura
hospedante incluye a la cepa CG1945 de Saccharomyces
cerevisiae (Clontech), la cepa HF7C (Clontech), la cepa Y153
(Durfee, T. y col., Genes and Development 7, 555, 1993) la
cepa CGY1::171 (Gill, G. y Ptashne, M., Cell 51, 121, 1987) y
similares.
El plásmido anzuelo preparado en (1) y la
biblioteca de cDNA preparada en (2) pueden introducirse en esta
levadura hospedante para seleccionar los transformantes que
contengan el cDNA que codifica a una proteína capaz de fijarse sobre
la m\beta-catenina-arma empleando
la expresión de gen informante como marcador. Por ejemplo, se
cultivan colonias en un medio mínimo sin histidina y se seleccionan
cuando se emplea como gen informante el gen HIS3 para la biosíntesis
de histidina o bien se seleccionan colonias que expresan color azul
en presencia del X-gal cuando se emplea como gen
informante el gen lacZ de la E. coli.
Dado que las colonias seleccionadas de
transformante contienen ambos tipos de plásmidos, el plásmido
anzuelo y la biblioteca de cDNA, solamente se aisla el plásmido de
la biblioteca cDNA con arreglo al método descrito en las referencias
(Glover, D.M. y Hames, B.D., "DNA Cloning 2, Expression Systems (A
Practical Approach, Series 149)", segunda edición, Oxford
University Press, 1995; Chien, C.T. y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88, 9578, 1991). Se aísla específicamente un DNA completo
que contiene el plásmido a partir de la colonia y después se
transforma con él la E. coli. En este caso, la E. coli
hospedante a utilizar es una cepa que no expresa un gen
correspondiente al gen marcador contenido en la biblioteca de cDNA,
de modo que pueda detectarse la expresión del gen marcador en un
transformante introducido con el gen marcador. Se seleccionan
algunos transformantes introducidos con el gen marcador derivado de
la biblioteca de cDNA a partir de transformantes y se aislan los DNA
plásmidos de los transformantes seleccionados para obtener los
clones cDNA.
Las secuencias de nucleótidos de los clones cDNA
obtenidos en (3) pueden determinarse empleando clones cDNA intactos
o, como alternativa, después de la digestión de los fragmentos del
resto cDNA con enzimas de restricción apropiadas y subclonarse en
vectores de clonación apropiados, p. ej. el pUC118, por un método
empleado habitualmente para analizar secuencias de nucleótidos, p.
ej. el método de secuenciación didesoxi de Sanger y col. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463, 1977) o el secuenciador de DNA
suministrado por Perkin Elmer, etc.
La novedad de la secuencia de nucleótidos
resultante del cDNA puede determinarse verificando que la secuencia
de cDNA no presenta homología significativa con secuencias de
nucleótidos de genes conocidos, depositados en bancos de datos,
cuando se realiza la búsqueda en bancos de datos de secuencias de
nucleótidos, por ejemplo el GenBank, el EMBL y el DDBJ, utilizando
un programa para la búsqueda de homologías, por ejemplo el
BLAST.
Si la secuencia de nucleótidos es nueva,
entonces, tal como se describe en (2), el clon cDNA obtenido en (3)
debería codificar una proteína de fusión, en la que la proteína B9L
está conectada al extremo C del GAL4 AD en el marco. Por
consiguiente, la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada
por el cDNA puede deducirse traduciendo la secuencia de nucleótidos
revelada del cDNA en la secuencia de aminoácidos del mismo marco que
el marco de traducción del GAL4 AD.
Además, los genes conocidos que presentan
homología con la proteína codificada por el cDNA pueden
seleccionarse buscando esta secuencia de aminoácidos en bancos de
datos de secuencias de aminoácidos, por ejemplo el Genpept, el PIR y
el Swiss-Prot, empleando para ello un programa de
búsqueda de homologías, como son el BLAST, el FASTA y el
FrameSearch.
Un cDNA que tenga la nueva secuencia de
nucleótidos, obtenido anteriormente, incluye por ejemplo un cDNA que
contiene una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID NO:
3. El cDNA codifica a una proteína que contiene una nueva secuencia
de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 4.
Sin embargo, los cDNA obtenidos de este modo
probablemente serán cDNA de longitud incompleta, que no conseguirán
codificar la proteína entera de interés. En tales casos, la
secuencia completa de aminoácidos de la proteína de interés podrá
hallarse obteniendo un cDNA de longitud completa por el método
indicado en el siguiente párrafo (5) y traduciendo la secuencia de
nucleótidos del cDNA de longitud completa obtenido en una secuencia
de aminoácidos del mismo marco de la traducción del cDNA de longitud
incompleta. La secuencia de nucleótidos de cada codón de la región
que codifica a la proteína B9L no está restringida a los empleados
en el cDNA e incluye cualquier secuencia de nucleótidos de cualquier
codón que codifica a los mismos aminoácidos en el supuesto de que
codifiquen la totalidad de la secuencia de aminoácidos de la
proteína B9L entera.
Cuando esté previsto que la longitud del B9L
cDNA obtenido en (3) no sea de longitud completa, en base al
análisis de secuencia de nucleótidos de (4) así como por la
información de la longitud del mRNA obtenida en la hibridación
Northern Blot que se describe a continuación, entonces el B9L cDNA
de longitud completa podrá obtenerse con arreglo al método
siguiente.
La biblioteca de cDNA preparada en (2), que
expresa la proteína de fusión, o la biblioteca de cDNA preparada a
partir de tejidos o de células que expresan la
\beta-catenina, en la que se supone que la B9L
está co-expresada o las células, en las que el mRNA
de la \beta-catenina se detectar por Northern
Blotting del modo descrito a continuación, etc., se explora mediante
hibridación de colonias o hibridación de placa, empleando como sonda
el cDNA total obtenido en (3) o una parte del mismo, y después se
seleccionan los clones de cDNA de la longitud, que se supone que es
longitud completa, entre los clones positivos. La obtención de la
biblioteca de cDNA y la hibridación pueden realizarse por métodos
descritos en "Molecular Cloning, segunda edición". Como
alternativa, es posible utilizar bibliotecas de cDNA que son
productos comerciales, por ejemplo de Clontech y otros. La secuencia
de nucleótidos del B9L cDNA de longitud completa de ratón y la
secuencia de aminoácidos de la proteína B9L de ratón pueden hallarse
determinan la secuencia de nucleótidos de los clones cDNA
resultantes por el mismo método que se ha descrito en el párrafo
(4).
Los DNA complementarios se preparan a partir de
tejidos o células, de los que está previsto que expresen la proteína
B9L y después se añade un oligonucleótido adaptador a ambos extremos
de los cDNA. Los fragmentos de DNA complementarios que contienen una
parte extendida en dirección a 5' o a 3' a partir del cDNA obtenido
en (3) pueden obtenerse por RACE (rapid amplification of cDNA ends)
del 5' o por RACE del 3' (Frohman, M.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85, 8998, 1988), en el que se efectúa la PCR empleando un
cebador de la secuencia de nucleótidos de este adaptador y un
cebador diseñado y basado en la secuencia de nucleótidos del clon
cDNA obtenido en (3). La secuencia de nucleótidos del B9L cDNA de
longitud completa puede hallarse determinando la secuencia de
nucleótidos del cDNA resultantes según el mismo método descrito en
(4).
Cuando se analiza la secuencia de nucleótidos
del B9L cDNA determinado en (4) buscando en bancos de datos públicos
de secuencias de nucleótidos si existe homología, las secuencias
idénticas a la del cDNA pueden encontrarse entre secuencias
parciales de clones cDNA aleatorios, los EST, incluso si no existe
una secuencia de nucleótidos idéntica entre los genes conocidos. En
tales casos, estos EST y otros EST que contienen secuencias de
nucleótidos idénticas a los EST y los EST derivados del mismo clon
se reúnen todos como EST derivados del mismo gen. Algunas veces
podrá encontrarse una secuencia de nucleótidos más larga, que se
extiende en dirección a 5' ó a 3', si se compara con el cDNA
obtenido en (4), por montaje o reunión de las secuencias de
nucleótidos de estos EST que se supone se derivan del B9L cDNA. En
tales casos puede realizarse la RT-PCR empleando
como moldes los cDNA o la biblioteca de cDNA que se prepara a partir
de tejido o de células de ratón, que se espera que expresen la
proteína B9L, y un cebador sentido que contiene la secuencia de
nucleótidos del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos obtenida
juntando estos EST o un cebador antisentido que contiene una
secuencia de nucleótidos complementaria de la secuencia de
nucleótidos del extremo 3' para obtener un fragmento de cDNA que
contiene una secuencia extendida en dirección a 5' o a 3', si se
compara con la del cDNA obtenido en (4). Cuando se determina la
secuencia de nucleótidos del fragmento de cDNA y parece que
corresponde al extremo 5' ó 3' del B9L cDNA de longitud completa,
podrá juntarse con la secuencia de nucleótidos del cDNA obtenido en
(4) para hallar la secuencia de nucleótidos del B9L cDNA de longitud
completa de ratón. Cuando se encuentran muchos clones EST
considerados como derivados del B9L cDNA de ratón en bancos de datos
de secuencias de nucleótidos conocidas, entonces podrá determinarse
la secuencia de nucleótidos del B9L cDNA de longitud completa de
ratón, sin realizar una RT-PCR, por unión de la
secuencia de nucleótidos de los clones EST.
Un clon de B9L cDNA de longitud completa puede
prepararse por amplificación del B9L cDNA de longitud completa por
PCR empleando como molde los cDNA o una biblioteca de cDNA preparada
a partir de tejidos o de células de ratón, de los que se espera que
expresen la proteína B9L, con arreglo a los mismos pasos que se han
descrito en (3) y los cebadores que se diseñan en base a la
secuencia de nucleótidos hallada para los extremos 5' y 3' del B9L
cDNA de longitud completa.
Como alternativa, el B9L cDNA de longitud
completa puede prepararse transformando la E. coli con un
clon B9L cDNA de longitud completa que se prepara según (1) ligando
el clon B9L cDNA de longitud completa obtenido en
(5-1) o el cDNA parcial del extremo 5' ó 3' obtenido
en (5-2) o (5-3) con el B9L cDNA
obtenido originalmente empleando sitios de enzimas de restricción
dentro de los cDNA o (2) clonando el clon B9L cDNA de longitud
completa preparado por la anterior PCR en un vector de clonación
apropiado; cultivando la E. coli; y preparando los DNA
plásmidos a partir de la E. coli cultivada.
Se ha depositado el
MM294/pEGFP-C2B9L de Escherichia coli, un
transformante que contiene el pEGFP-C2B9L, que es un
DNA plásmido obtenido del modo anterior, que contiene un DNA que
tiene la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID NO: 1,
en el Organismo Depositario de Patente Internacional del Instituto
Administrativo Independiente, el Instituto Nacional de Ciencia y
Tecnología Industrial Avanzada (Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi,
Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón
305-8566) (el antiguo Instituto Nacional de
Biociencia y Tecnología Humana, Instituto Nacional de Ciencia y
Tecnología Industrial Avanzada
(1-1-3 Higashi,
Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón
305-8566)) con fecha 6 de setiembre de 2000.
Como alternativa, el B9L cDNA de longitud
completa puede sintetizarse químicamente en un sintetizador de DNA
en base a su secuencia de nucleótidos. Tales sintetizadores de DNA
incluyen el sintetizador de DNA modelo 392 de Perking Elmer, que
aplica el método de las fosforamiditas, y similares.
Es importante obtener la proteína B9L y un DNA
que codifique esta proteína de humanos y también la de los ratones
para analizar el mecanismo que subyace al inicio del cáncer de colon
humano así como para tratar y diagnosticar el cáncer. En general,
las proteínas de diferentes especies que tienen la misma función a
menudo tienen secuencias de aminoácidos que no son idénticas, pero
que presentan homología entre sí. Por consiguiente, los DNA que
codifican a las proteínas está previsto también que tengan homología
entre sí. Además, las mutaciones se acumulan en los genes durante la
evolución de los organismos y por ello cabe suponer que cuanto más
próximo sea el linaje filogenético de las especies, tanto mayor será
la homología entre ellas. Por consiguiente, es posible obtener un
B9L cDNA de otros mamíferos, por ejemplo un B9L cDNA humano,
empleando el B9L cDNA de ratón obtenido en (3) o su información de
secuencia de nucleótidos, según el método que se describe a
continuación. Cuando el cDNA obtenido según el método no es un cDNA
de longitud completa, el B9L DNA humano puede obtenerse empleando
métodos similares a los descritos en (5).
Como alternativa, sin obtener el B9L DNA de
ratón se puede obtener directamente el B9L cDNA humano por los
mismos procedimientos descritos en los apartados de (1) a (5) por el
sistema de dos híbridos de levadura empleando una biblioteca de cDNA
humanos y plásmido anzuelo, en el que el dominio armadillo de la
\beta-catenina humana actúa como anzuelo (J. Cell
Biol. 127, 2601, 1994).
Los clones cDNA de la proteína B9L humana pueden
obtenerse a partir de una biblioteca de cDNA preparada empleando el
mismo método de (5-1) a partir de tejido humano,
correspondiente al tejido de ratón que expresa la proteína B9L de
ratón o de células humanas derivadas de tejido humano, o a partir de
una biblioteca de cDNA humano, que sea producto comercial, de
tejidos o células humanas, por hibridación de colonias o por
hibridación en placa, en condiciones relativamente restringidas
(stringent), empleando como sonda un B9L DNA de ratón marcado con
radioisótopo, digoxigenina y similares.
En esta descripción, las condiciones
relativamente restrictivas varían en función de la homología entre
los B9L cDNA humanos y murinos y realizando una hibridación Southern
Blot empleando como sonda un B9L cDNA contra el DNA cromosómico
humano digerido con una enzima de restricción en diversas
condiciones de diferente grado de restricción podrán seleccionar las
condiciones más restrictivas, en las que la banda de hibridación se
detecta claramente. Por ejemplo, las condiciones relativamente
restrictivas para una solución de hibridación sin formamida pueden
determinarse realizando la hibridación en diversas condiciones, en
las que la concentración de sal de la solución de hibridación se
fija en 1 mol/l y en las que la temperatura varía gradualmente entre
68 y 42ºC y lavando en 2x SSC que contiene un 0,5% de
dodecil-sulfato sódico (SDS) a la misma temperatura
de hibridación. Como alternativa, las condiciones relativamente
restrictivas para una solución de hibridación que contiene formamida
pueden determinarse realizando la hibridación a un temperatura fija
de 42ºC, una concentración fija de sal de 6x SSC y una concentración
de formamida que varíe gradualmente entre el 50% y el 0% y lavando a
50ºC en 6x SSC que contiene un 5% de SDS.
La secuencia genómica de los clones EST, que se
cree derivada de B9L cDNA humano, o la secuencia de DNA genómico
humano, que contiene el o los exones del B9L DNA genómico humano,
puede identificarse buscando las secuencias de nucleótidos de DNA
humano, que tienen una homología elevada (especialmente del 80% o
más) con la secuencia de nucleótidos del B9L cDNA de ratón obtenida
en (4), en particular en la región que codifica a la proteína, en
bancos de datos de secuencias de nucleótidos, por ejemplo en el
GenBank, empleando un programa de búsqueda de homologías, como es el
BLAST. Estas secuencias de nucleótidos incluyen los EST humanos de
números de registro U46365 y R24762 del GenBank y las secuencias
diseñadas (draft) de trabajo del DNA de genoma humano con números
de registro del GenBank AP000877, AP002357 y AP000909.
Comparando las secuencias de genoma humano con
la secuencia de nucleótidos del B9L cDNA del ratón y de los EST
humanos puede obtenerse la secuencia del exón que codifica a la
proteína B9L humana, es decir, la secuencia del B9L DNA humano.
Estas secuencias de exón del B9L DNA genómico humano incluyen la
secuencia de nucleótidos representada por las SEQ ID NO: de 5 a 8.
Estos clones EST pueden obtenerse en forma de clones EST del
organismo llamado Integrated Molecular Analysis of Genome Expression
Consortium (I.M.A.G.E. Consortium) de la ATCC. Como alternativa, el
B9L cDNA humano puede obtenerse preparando cebadores que se diseñan
en base a la secuencia del EST humano homólogo o del exón de DNA
genómico humano y amplificando los fragmentos de DNA por
RT-PCR del modo descrito en (3) empleando como molde
un mRNA preparado a partir de tejido humano o de células que se
espera expresen la proteína B9L.
El DNA genómico del gen B9L de ratón o humano
puede obtenerse por exploración según métodos tales como la
hibridación en placa, descrita en "Molecular Cloning, segunda
edición", empleando como sonda el B9L cDNA de ratón o humano
obtenido en (3) o en (6) frente a una biblioteca de DNA genómico
preparada a partir de DNA cromosómico aislado a partir de células o
de tejidos de ratón o humanos.
La estructura de exón-intrón del
gen B9L puede identificarse por comparación de las secuencias de
nucleótidos del B9L DNA genómico y del B9L cDNA. Además, empleando
como sonda la porción del extremo 5' del cDNA puede identificarse la
secuencia de nucleótidos de regiones del gen genómico que regula la
transcripción, por ejemplo el promotor del gen B9L. Tal secuencia es
útil para analizar el mecanismo de la regulación transcripcional del
gen B9L. Además pueden obtenerse clones, en los que el gen B9L del
cromosoma esté inactivado o sustituido por secuencias arbitrarias
empleando la técnica de la recombinación homóloga (Kuehn, M.R. y
col., Nature 326, 295, 1987; Thomas, K.R. y Capecchi, M.R.,
Cell 51, 503, 1987).
Un oligonucleótido que contiene una secuencia
parcial de B9L DNA de la presente invención o una secuencia
complementaria del mismo (abreviada a continuación por
oligonucleótido B9L) puede obtenerse en un sintetizar de DNA
descrito antes en el apartado (5).
Tales oligonucleótidos B9L incluyen
específicamente los DNA que contienen una secuencia idéntica de 10 a
60 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos representada
por la SEQ ID NO: 1 o los DNA que contienen una secuencia
complementaria de la misma. Para el uso de tales DNA como cebadores
sentido o antisentido son preferibles los oligonucleótidos cuya
temperatura de fusión y número de nucleótidos no cambie de modo
extremo.
Además, los derivados de los anteriores
oligonucleótidos (que a continuación se llaman derivados de
oligonucleótido) pueden utilizarse como un oligonucleótido de la
presente invención.
Los ejemplos de derivados de oligonucleótidos
incluyen los derivados de oligonucleótidos, en los que el enlace
fosfodiéster del oligonucleótido se ha convertido en enlace
fosforotioato; los derivados de oligonucleótidos, en los que el
enlace fosfodiéster del oligonucleótido se ha convertido en enlace
N3'-P5'-fosforamidita; los derivados
de oligonucleótidos, en los que el enlace ribosa y fosfodiéster del
nucleótido se ha convertido en un enlace péptido-ácido nucleico; los
derivados de oligonucleótidos, en los que el uracilo del
oligonucleótido se ha sustituido por
C-5-propiniluracilo; los derivados
de oligonucleótidos en los que el uracilo del oligonucleótido se ha
sustituido por un
C-5-tioazoluracilo; los derivados de
oligonucleótidos en los que la citosina del oligonucleótido se ha
sustituido por una
C-5-propinilcitosina; los derivados
de oligonucleótidos en los que la citosina del oligonucleótido se ha
sustituido por una citosina modificada por fenoxazina; los derivados
de oligonucleótidos en los que la ribosa del oligonucleótido se ha
sustituido por la 2'-o-propilribosa;
los derivados de oligonucleótido en los que la ribosa del
oligonucleótido se ha sus-
tituido por una 2'-metoxietoxirribosa y similares (Yokoyama, K., Saibo Kogaku (Tecnología Celular) 16, 1463, 1997).
tituido por una 2'-metoxietoxirribosa y similares (Yokoyama, K., Saibo Kogaku (Tecnología Celular) 16, 1463, 1997).
La proteína bcl9 tiene una homología de
secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 37% con la secuencia
de aminoácidos de la proteína B9L de ratón, obtenida por los métodos
descritos anteriormente. Según la presente invención, la proteína
bcl9 se constata que se fija sobre la
\beta-catenina y por ello se considera como
proteína de localización de la \beta-catenina en
el núcleo. La secuencia de nucleótidos del cDNA de longitud completa
que codifica a la proteína bcl9 humana y la secuencia de aminoácidos
que codifica al cDNA se conocen ya en la técnica (Willis, T.G. y
col., Blood 91, 1871, 1998). Puede obtenerse un DNA o un
oligonucleótido que codifique a la proteína bcl9 a partir del cDNA
humano o DNA genómico por métodos descritos anteriormente
(5-4), (7) y (8). Además, el DNA de la bcl9 de
animales distintos de los humanos, por ejemplo del ratón, puede
obtenerse empleando el mismo método ya descrito anteriormente
(6).
Una proteína de localización de la
\beta-catenina nuclear de la presente invención,
por ejemplo la proteína B9L o la proteína bcl9, o un péptido parcial
de las mismas puede producirse expresando un DNA que codifique a la
proteína de localización de la \beta-catenina
nuclear o un péptido parcial de la misma, preparados en el anterior
párrafo (1) en células hospedantes con arreglo a métodos descritos
en "Molecular Cloning, segunda edición"; Glover, D.M. y Hames,
B.D., "DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach",
segunda edición, Oxford University Press, 1995, etc. Aunque a
continuación se describe como ejemplo un método que toma la proteína
B9L, la proteína bcl9 y los péptidos parciales de la misma pueden
obtenerse también por el mismo método.
En concreto, la proteína B9L de la presente
invención puede producirse preparando un vector recombinante, en el
que el B9L DNA se ha insertado en dirección a 3' (downstream) de un
promotor en un vector de expresión apropiado, introduciendo el
vector en células hospedantes para obtener un transformante que
expresa la proteína B9L y después cultivando el transformante.
El vector de expresión a utilizar es un vector
que es capaz de replicación autónoma o de integración en el
cromosoma de células hospedantes y que contiene un promotor que
dirige la transcripción del B9L DNA en mRNA en células
hospedantes.
Puede utilizarse cualquier tipo de células
hospedantes, incluidas las células procariotas, células de levadura,
células animales, células de insectos, células de plantas y
similares, en el supuesto de que las células puedan expresar el gen
de interés. Pueden utilizarse también animales concretos y
organismos vegetales.
Cuando se emplean como células hospedantes los
procariotas, por ejemplo las bacterias, entonces los vectores de
expresión a utilizar son capaces de replicación autónoma en el
procariota hospedante y el B9L DNA debería colocarse en dirección a
3' (downstream) del promotor que contiene la secuencia de fijación
de ribosoma. Es preferible que la distancia entre la secuencia de
fijación de ribosoma y el codón de iniciación se ajuste
apropiadamente (por ejemplo, de 6 a 18 nucleótidos para el vector
del hospedante E. coli). Es preferible colocar una secuencia
de terminación de la transcripción inmediatamente después en
dirección a 3' (downstream) del B9L DNA, aunque no es esencial para
la invención. Además, el vector debería diseñarse para que contenga
secuencias para la expresión del gen marcador, por ejemplo genes de
resistencia a fármacos, por conveniencias de selección de los
transformantes.
Puede utilizarse cualquier promotor, en el
supuesto de que tenga capacidad para dirigir la expresión en células
hospedantes. Por ejemplo, cuando se emplea la E. coli como
hospedante, los promotores incluyen a los promotores derivados de la
E. coli y fagos, p. ej. el promotor trp (Ptrp), el promotor
lac (Plac), el promotor P_{L}, el promotor T7, el promotor
P_{R}, etc. También es posible utilizar promotores diseñados o
modificados artificialmente, por ejemplo los promotores en los que
están conectados entre sí dos Ptrp formando un tándem, o un promotor
tac, un promotor T7-lac, un promotor let I, etc.
Cuando se emplea como hospedante el Bacillus subtilis, los
promotores incluyen promotores derivados del SPO1 y SPO2 que son
fagos del Bacillus subtilis, así como el promotor PenP.
El vector de expresión se ejemplifica, entre
otros, con el pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1
(Promega), pQE-8 (QIAGEN), pKYP200 (Agric. Biol.
Chem. 48, 669, 1984), pLSA1 (Agric. Biol. Chem. 53,
277, 1989), pGEL1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4306,
1985), Bluescript II SK(-) (Stratagene), pKK223-3
(Amersham Pharmacia Biotech),
pGEX-5X-3 (Amersham Pharmacia
Biotech) y pET14 (Novagen).
Las células hospedantes pueden ser
microorganismos pertenecientes al género Escherichia, al
género Serratia, al género Bacillus, al género
Brevibacterium, al género Corynebacterium, al género
Microbacterium, al género Pseudomonas y similares, por
ejemplo la Escherichia coli XL1-Blue, la
Escherichia coli XL2-Blue, la Escherichia
coli DH1, la Escherichia coli MC1000, la Escherichia
coli KY3276, la Escherichia coli W1485, la Escherichia
coli JM109, la Escherichia coli HB101, la Escherichia
coli nº 49, la Escherichia coli W3110, la Escherichia
coli NY49, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia
liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus
amyloliquefaciens, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium
immariophilum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum
ATCC14066, Corynebacterium glutamicum ATCC13032,
Corynebacterium glutamicum ATCC14067, Corynebacterium
glutamicum ATCC13869, Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354,
Pseudomonas sp. D-0110.
Puede utilizarse cualquier método para
introducir vectores recombinantes, en el supuesto de que tengan la
capacidad de introducir los DNA en las células hospedantes recién
mencionadas. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la electroporación
(Dower, W.J. y col., Nucleic Acids Res. 16, 6127, 1988), los
métodos que emplean ion calcio (Cohen, S.N. y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 69, 2110, 1972; Reid, J.D. y col., Gene
17, 107, 1982) y el método de protoplasto (solicitud de
patente japonesa publicada sin examinar (JP-A) Sho
63-248394; Chan, S. y Cohen, S.N., Mol. Gen. Genet.
168, 111, 1979).
Cuando se utiliza como célula hospedante una
levadura, los vectores a expresión a utilizar incluyen los vectores
que contienen un promotor que dirige la transcripción en la levadura
hospedante, B9L DNA, secuencia de terminación de transcripción y
secuencia capaz de expresar un gen marcador para la transformación
en levadura (p. ej. genes de resistencia a fármacos y genes para la
biosíntesis de aminoácidos, por ejemplo el TRP1, el HIS3 y el LEU2).
Es preferible además utilizar un vector de expresión capaz de
replicación autónoma y capaz de expresar un gen de resistencia a
fármacos que pueda utilizarse como marcador para la transformación
en E. coli por conveniencias de la preparación y del
mantenimiento del vector.
Puede utilizarse cualquier promotor, en el
supuesto de que sea operativo en levaduras. Tales promotores
incluyen por ejemplo los promotores del gen de la
alcohol-deshidrogenasa ADH1 y los genes que
participan en el metabolismo de la galactosa, p. ej. el GAL1, GAL10;
los promotores del gen de la fosfatasa ácida PHO5; los promotores
del gen de la fosfoglicerato-quinasa PGK; los
promotores del gen de la
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
GAP; los promotores de los genes de las proteínas de choque térmico;
los promotores del gen del factor de aparemiento \alpha, el
MF\alpha1; y los promotores del gen de la metalotioneína de cobre
CUP1, derivados del Saccharomyces cerevisiae; así como los
promotores del gen de la alcohol-oxidasa AOX1,
derivados de la Pichia pastoris.
Las células hospedantes incluyen cepas de
levadura pertenecientes al género Saccharomyces, al género
Schizosaccharomyces, al género Pichia y similares, en
especial incluyen al Saccharomyces cerevisiae, al
Schizosaccharomyces pombe, a la Pichia pastoris,
etc.
Puede utilizarse cualquier método para
introducir vectores recombinantes, en el supuesto de que tales
métodos tengan la capacidad de introducir los DNA en las levaduras.
Tales métodos incluyen por ejemplo la electroporación (Becker, D.M.
y Guarente, L., Methods Enzymol. 194, 182, 1991); el método
del esferoplasto (Shortel, D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81, 4889, 1984), el método del acetato de litio (Ito, H. y
col., Journal of Bacteriology 153, 163, 1983), etc.
Cuando se emplean como hospedantes células de
animales, los vectores de expresión a utilizar incluyen los vectores
que contienen un promotor que dirija la transcripción en células
animales hospedantes, B9L DNA, y secuencias de señales para la
terminación de la transcripción y la poliadenilación de los
transcritos.
Es preferible además utilizar un vector de
expresión capaz de replicación autónoma y capaz de expresión del gen
de resistencia a fármacos, que puede utilizarse como marcador para
la transformación en E. coli por conveniencias de la
preparación y del mantenimiento del vector.
Puede utilizarse cualquier promotor, en el
supuesto de que tenga capacidad para dirigir la transcripción en
células de animales. Tales promotores incluyen las secuencias
derivadas de virus, por ejemplo el promotor precoz SV40, el promotor
y elementos de ampliador del gel del citomegalovirus humano IE
(immediate early), los LTR que se originan en retrovirus, por
ejemplo el virus del sarcoma de Rous, el virus I de la leucemia de
células T humanas, el virus de la leucemia murina de Moloney, etc.;
o promotores de genes, por ejemplo del gen de la metalotioneína, el
gen de la \beta-actina, el factor 1 de elongación
y similares, derivados de células de animales. Es posible además
utilizar promotores artificiales, cuyos elementos de promotor
múltiple mencionados anteriormente se combinan entre sí, p. ej. el
promotor SR\alpha creado por combinación del promotor precoz SV40
y el virus I de la leucemia de células T humanas.
Pueden seleccionarse las células, cuyo B9L DNA
se haya integrado en el DNA cromosómico hospedante y que expresa
constitutivamente el B9L, introduciendo un vector de expresión de
B9L que contenga una secuencia para la expresión de un gen de
resistencia a los fármacos, por ejemplo al G418 o a la higromicina,
en las células hospedantes y cultivan las células en presencia del
fármaco. Además, con el fin de aumentar la cantidad de proteína B9L
producida por las células hospedantes se introduce un vector para la
expresión constitutiva de la proteína B9L, que contiene una
secuencia para la expresión del gen de la
dihidrofolato-reductasa (dhfr), en las células
hospedantes y entonces se cultivan las células hasta que la
concentración de metotrexato, un inhibidor de la dhfr, haya
aumentado sucesivamente; y de este modo es posible lograr el éxito
en la amplificación del número de copias del B9L DNA junto con el
del gen dhfr. Tales células hospedantes, en las que se consigue la
amplificación del gen utilizando el gen dhfr, pueden ser células que
no tengan gen dhfr funcional, por ejemplo CHO/dhfr^{-} (ATCC:
CRL-9096) y similares.
Los vectores a utilizar para la obtención del
vector de expresión B9L recién mencionados incluyen específicamente
a título ilustrativo el pEGFP-C2 (Clontech), el
pAGE107 (solicitud de patente japonesa sin examinar, nº 22979/91;
Miyaji, H., Cytotechnology 3, 133, 1990), el
pAS3-3 (solicitud de patente japonesa sin examinar
nº 227075/90), el pCDM8 (Seed, B., Nature 329, 840, 1987), el
pcDNA3.1(+) (Invitrogen), el pREP4 (Invitrogen), el
pBK-RSV (Stratagene), el pSVK3 (Amersham Pharmacia
Biotech), el pcDNA1.1/Amp (Invitrogen) y el pAMo (Sasaki, K., J.
Biol. Chem. 268, 22782, 1993).
Los vectores de expresión de las proteínas B9L
en células animales incluyen el pEGFP-C2B9L, cuyo
B9L cDNA de longitud completa de ratón se inserta en el sitio
EcoRI-SalI del vector pEGFP-C2. La
Escherichia coli MM294/pEGFP-C2B9L, un
transformante que contiene el pEGFP-C2B9L, se ha
depositado con el número de registro FERM BP-7291 en
el Organismo Depositario de Patente Internacional del Instituto
Administrativo Independiente, el Instituto Nacional de Ciencia y
Tecnología Industrial Avanzada (Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi,
Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón
305-8566) (el antiguo Instituto Nacional de
Biociencia y Tecnología Humana, Instituto Nacional de Ciencia y
Tecnología Industrial Avanzada
(1-1-3 Higashi,
Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón
305-8566)) con fecha 6 de setiembre de 2000.
Las células hospedantes incluyen las siguientes
líneas celulares: HeLa, Namalwa y 293, que se derivan de humanos;
COS-1 y COS-7, que son células
renales de mono gris de África; CHO y BHK, que se derivan de
hámster; NHI3T3, que se derivan de células embrionarias de ratón;
mieloma de ratón, SP2/0 y NS0; y mieloma de rata YB2/0.
Puede utilizarse cualquier método para
introducir vectores recombinantes, en el supuesto de que dichos
métodos tengan la capacidad de introducir los DNA en las células de
los animales. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la
electroporación (Miyaji, H. y col., Cytotechnology 3, 133,
1990), el método del fosfato cálcico (solicitud de patente japonesa
sin examinar nº 227075/90), el método de la lipofección (Felgner,
P.L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413, 1987),
etc.
Cuando se emplean células de insectos como
células hospedantes, puede utilizarse el sistema de expresión de
baculovirus (O'Reilly, D.R. y col., "Baculovirus Expression
Vectors: A Laboratory Manual", W.H. Freeman and Company, Nueva
York, 1992; Luckow, V.A. y Summers, M.D. y col., Bio/Technology
6, 47, 1988). En concreto, después de insertar el B9L DNA en
un vector llamado vector de transferencia, tanto el vector como el
baculovirus se introducen seguidamente en las células de insectos;
la recombinación homóloga resultante proporciona un baculovirus
recombinante en el que el B9L DNA lleva insertado, en dirección 3'
(downstream) después de la poliedrina, un gen promotor que es un
promotor de alta eficacia; a continuación, las células de los
insectos pueden infectarse de nuevo con el baculovirus recombinante
y, de este modo, se logra la expresión de la proteína B9L.
Los baculovirus a emplear incluyen el virus de
poliedrosis nuclear de la Autographa californica, el virus de
poliedrosis nuclear del Bombyx mori, etc. Las células de
insectos a utilizar pueden ser la Sf9 y la Sf21, que son células
derivadas de la Spodoptera frugiperda (O'Reilly, D.R. y col.,
"Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual", W.H.
Freeman and Company, Nueva York, 1992), la High5 (Invitrogen), que
es una célula derivada de la Trichoplusia ni y similares.
Como alternativa, pueden utilizarse de por sí las larvas del gusano
de la seda. El vector de transferencia contiene el promotor de
poliedrina y una secuencia derivada de baculovirus para dirigir la
recombinación homóloga, también secuencias para el mantenimiento y
la replicación del vector así como para la inserción de genes ajenos
(una secuencia capaz de replicación autónoma en E. coli y una
secuencia de gen de resistencia a los fármacos). Tales vectores
incluyen específicamente al pVL1392, pVL1393, pBlueBac4 (ambos de
Invitrogen), etc.
La proteína B9L puede producirse empleando
individuos animales. Por ejemplo, la proteína B9L puede producirse
en un organismo animal, cuyo B9L DNA se haya introducido mediante un
método conocido (Colman, A., American Journal of Clinical Nutrition
63, 639S, 1996; Rosen, J.M. y col., American Journal of
Clinical Nutrition 63, 627S, 1996; Wright, G. y col.,
Bio/Technology 9, 830, 1991).
Puede utilizarse cualquier promotor, en el
supuesto de que tenga capacidad para dirigir la expresión en
animales. Se utilizan con preferencia por ejemplo el promotor de
\alpha-caseína, el promotor de
\beta-caseína, el promotor de
\beta-lactoglobulina, el promotor de proteína
ácida de suero y similares, promotores específicos de células de
glándulas mamarias.
Cuando se emplean como hospedantes células de
plantas u organismos vegetales, el B9L puede introducirse según
métodos conocidos (Izawa, T., Sosiki Baiyou (cultivo de tejido)
20, 6, 1994; Hashimoto, T., Sosiki Baiyou (cultivo de tejido)
21, 14, 1995; Miele, L., Trends in Biotechnology 15,
45, 1997.
Para la expresión del B9L DNA puede utilizarse
cualquier promotor, en el supuesto de que sea capaz de dirigir la
expresión genética en células de plantas. Tales promotores incluyen,
por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor,
el promotor actina-1 del arroz, etc. Además, el
intrón 1 del gen de la alcohol-deshidrogenasa del
maíz y similares pueden insertarse entre el promotor y el B9L DNA a
expresar con el fin de aumentar la eficacia de la expresión del B9L
DNA.
Las células hospedantes pueden ser células
vegetales derivadas de la patata, del tabaco, del maíz, del arroz,
de la colza, de la soja, del tomate, del trigo, de la cebada, del
centeno, de la alfalfa, del lino, etc.
Para introducir los vectores recombinantes puede
utilizarse cualquier método, en el supuesto de que el método tenga
la capacidad de introducir los DNA en las células de las plantas.
Tales métodos incluyen por ejemplo los métodos que emplean el
Agrobacterium, la electroporación (Miyaji, H., Cytotechnology
3, 133, 1990), los métodos que emplean cañones de partículas
(cañones de genes), etc.
Las células u órganos vegetales en los que se ha
introducido el B9L DNA pueden cultivarse a gran escala en un
fermentador de tipo jarra. Además, las células vegetales que
contienen los genes introducidos pueden regenerarse para crear
organismos vegetales (plantas transgénicas), en las que se ha
introducido el B9L DNA.
Los microorganismos, las células de animales o
los transformantes derivados de una célula vegetal, que contiene un
vector recombinante que lleva como inserto el B9L DNA de la presente
invención, puede cultivarse con arreglo a un método típico de
cultivo; se deja producir la proteína B9L y acumularse en ellos y
finalmente se recupera la proteína B9L del cultivo con el fin de
producir la proteína B9L.
Los medios a utilizar para el cultivo de
transformantes obtenidos empleando como hospedantes células de
animales incluyen el medio RPMI1640 empleado habitualmente (The
Journal of the American Medical Association 199, 519, 1967),
el medio Eagle's MEM (Eagle, H., Science 122, 501, 1952), el
medio Dulbecco's modified Eagle's (Dulbecco, R. y Freeman, G.,
Virology 8, 396, 1959), el medio 199 (Proceeding of the
Society for the Biological Medicine 73, 1, 1950) y los medios
que contiene suero fetal bovino o similares. Si se desea puede
añadirse al medio un antibiótico, por ejemplo penicilina o
estreptomicina. En general, el cultivo puede realizarse en una
condición tal que el pH se sitúe entre 6 y 8, la temperatura entre
30 y 40ºC, en presencia de un 5% de CO_{2}, durante un tiempo de 1
a 7
días.
días.
Los medios a utilizar para el cultivo de
transformantes obtenidos empleando como células hospedantes células
de insectos incluyen el medio TNM-FH empleado
habitualmente (Pharmingen), el medio Sf-900 II SFM
(Life-Technologies), el medio ExCell400 y ExCell405
(ambos de JRH Biosciences); el medio Grace's Insect Medium (Grace,
T.D.C., Nature 195, 788, 1962) y similares. Las condiciones
preferidas para el cultivo son un pH de 6 a 7, una temperatura de
cultivo de 25 a 30ºC y el cultivo se realiza durante un período de 1
a 5 días. Además, si se desea, puede añadirse al medio durante el
cultivo un antibiótico, por ejemplo la gentamicina.
Cuando el transformante es un individuo animal o
un organismo vegetal, es posible producir la proteína B9L por cría o
cultivo de los anteriores por el método usual, dejando que se
produzca y acumule la proteína B9L y recuperándola del animal
individual o del organismo vegetal.
Específicamente, en el caso de un animal
individual, por ejemplo es posible producir la proteína B9L por cría
del animal transgénico no humano que contenga el B9L DNA, dejar que
produzca la proteína B9L codificada por el DNA recombinante y que se
acumule en el cuerpo del animal y recuperar la proteína B9L del
animal. Los sitios para la producción y acumulación de la proteína
en el animal incluyen, por ejemplo, la leche y los huevos de los
anima-
les.
les.
En el caso de un organismo vegetal se puede
producir por ejemplo la proteína B9L por cultivo de una planta
transgénica que contengan el B9L DNA, dejar que se produzca la
proteína B9L codificada por el DNA recombinante y se acumule en la
planta y recuperar la proteína B9L de la planta.
Para el cultivo de transformantes obtenidos
empleando un hospedante, un procariota como la E. coli o
eucariota, como la levadura, puede utilizarse cualquier medio
natural o medio sintético, en el supuesto de que contenga una fuente
de carbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y similares,
que el organismo pueda asimilar; y el cultivo del transformante
progresa eficazmente en dicho medio.
Puede utilizarse cualquier fuente de carbono,
que puedan asimilar los organismos, incluidas la glucosa, la
fructosa, la sucrosa y las melazas de las mismas; los hidratos de
carbono, como el almidón y los hidrolizados de almidón; los ácidos
orgánicos, por ejemplo el ácido acético y el ácido propiónico; los
alcoholes, por ejemplo etanol y propanol.
La fuente de nitrógeno que puede utilizarse
incluye el amoníaco, el cloruro amónico, las sales amónicas de
ácidos inorgánicos u orgánicos, por ejemplo el sulfato amónico, el
acetato amónico, el fosfato amónico, otros compuestos nitrogenados
así como peptonas, extractos de carne, extractos de levadura, licor
de cereales en remojo, los hidrolizados de caseína, la torta de soja
y los hidrolizados de torta de soja, diversos microorganismos de
fermentación y materiales digeridos por los mismos.
Tales sales inorgánicas incluyen el
dihidrogenofosfato potásico, el hidrogenofosfato dipotásico, el
fosfato magnésico, el sulfato magnésico, el cloruro sódico, el
sulfato ferroso, el sulfato de manganeso, el sulfato de cobre, el
carbonato cálcico, etc.
El cultivo se realiza en general en condicione
aeróbicas, por ejemplo agitando el cultivo o cultivo sumergido
agitado con borboteo de aire. Es preferible efectuar el cultivo
entre 15 y 40ºC y generalmente entre 16 y 96 horas. El pH debería
mantenerse entre 3,0 y 9,0 durante el cultivo. El ajuste del pH
puede efectuarse empleando un ácido inorgánico u orgánico, una
solución alcalina, urea, carbonato cálcico, amoníaco, etc. Si se
desea, puede añadirse al medio durante el cultivo un antibiótico,
por ejemplo la ampicilina o la tetraciclina.
En caso de cultivar microorganismos
transformados con un vector de expresión empleando un promotor
inducible, si se desea, se puede añadir un inductor al medio. Por
ejemplo, en el caso de cultivar microorganismos transformados con un
vector de expresión empleando el promotor lac, puede añadirse al
medio el IPTG o similares; en caso de cultivar microorganismos
transformados con un vector de expresión empleando un promotor trp
se puede añadir al medio el ácido indolacrílico o similares.
Pueden utilizarse los siguientes métodos
generales para el aislamiento y la purificación de las proteínas
para aislar y purificar la proteína B9L acumulada en el cultivo del
transformante mencionado anteriormente.
Cuando las células secretan la proteína B9L, la
proteína B9L se acumula en el medio. Por consiguiente, una vez ha
finalizado el cultivo, puede recuperarse medio solo, del que se han
quitado las células, mediante técnicas como es la separación por
centrifugación. Es posible obtener una muestra purificada del medio
empleando métodos a título individual o en combinación para el
aislamiento y la purificación de las proteínas; en concreto, la
extracción con disolventes; la precipitación por adición de sales,
por ejemplo sulfato amónico y similares; el desalado; la
precipitación con disolventes orgánicos; la cromatografía de
intercambio aniónico empleando resinas, por ejemplo la DEAE
Sepharose, la DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical) y
la Mono-Q (Amersham Pharmacia Biotech); la
cromatografía de intercambio catiónico utilizando resinas del tipo
SP Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech); la cromatografía
hidrófoba empleando resinas del tipo butil-Sepharose
y fenil-Sepharose; la filtración a través de gel
empleando tamices moleculares; la cromatografía de afinidad; el
cromato-enfoque; las técnicas electroforéticas, por
ejemplo el enfoque isoeléctrico, etc.
Cuando se acumula la proteína B9L en las células
del transformante, una vez finalizado el cultivo, se recuperan las
células de transformante del cultivo mediante técnicas tales como la
centrifugación, posteriormente se suspenden en un tampón y después
se disgregan empleando un generador de ultrasonidos, la prensa
francesa (French press) o similares, para obtener el extracto sin
célula.
Si la proteína B9L es soluble en las células,
puede obtenerse la muestra purificada a partir del líquido
sobrenadante después de centrifugar el extracto sin células por el
mismo método empleado para la purificación y el aislamiento a partir
del medio mencionado antes. Como alternativa, cuando la proteína B9L
está presente en forma de cuerpos de inclusión dentro de las
células, el extracto sin célula se trata por centrifugación y
después pueden recuperarse los cuerpos de inclusión de la proteína
B9L en forma de fracción precipitada. Los cuerpos de inclusión de la
proteína B9L se solubilizan en un desnaturalizador de proteínas y
después se dializa la solución resultante para dejarla libre de
desnaturalizador de proteínas o bien de dializa o se diluye de modo
que el nivel de desnaturalizador sea bajo y no desnaturalice la
proteína y se restablezca la estructura terciaria normal de la
proteína B9L. A continuación puede obtenerse
la muestra purificada por el mismo método empleado para el aislamiento y purificación descritos anteriormente.
la muestra purificada por el mismo método empleado para el aislamiento y purificación descritos anteriormente.
Además, la proteína B9L puede producirse por un
sistema de transcripción-traducción "in
vitro" con arreglo a métodos conocidos (Kigawa, T., J.
Biomolecular RMN 6, 129; Spirin, A.S., Science 242,
1162; Kigawa, T. y Yokoyama, S., J. Biochem. 110, 166, 1991).
Específicamente, el B9L DNA se liga por una posición en dirección a
3' (downstream) después de un promotor, de modo que se haga
reaccionar un SP6, T7 o T3 y una RNA-polimerasa
específica de cada promotor entre sí para sintetizar cantidades
grandes del B9L RNA "in vitro". De este modo puede
producirse la proteína B9L mediante un sistema de traducción sin
células, p. ej. un sistema de traducción que utilice lisado de
reticulocitos de conejo o extractos de germen de trigo.
El análisis estructural para la proteína B9L
purificada puede llevarse a cabo por métodos empleados habitualmente
en la química de las proteínas, por ejemplo un método descrito en
"Protein Structural Analysis for Gene Cloning" (H. Hirano,
Tokyo Kagaku Doujin, 1993).
Si la proteína B9L o la proteína bcl9 o los
derivados o fragmentos parciales de las mismas, en los que los
aminoácidos han sufrido sustitución, deleción o adición en la
secuencia de aminoácidos de la proteína o proteínas que tienen
homología con la proteína a nivel de secuencia de aminoácidos
(denominados a continuación homólogos de B9L/bcl9), se fija sobre la
\beta-catenina o no, esto podrá determinarse
detectando la transcripción del gen informante (reporter) en el
sistema de dos híbridos de levadura, descrito en la sección 1,
empleando un vector de expresión de proteína de fusión que contenga
DNA que codifican un dominio de activación transcripcional y la
proteína y un plásmido anzuelo de
\beta-catenina.
Como alternativa, la fijación puede examinarse
mediante los pasos siguientes: mezclando directamente un análogo de
B9L/bcl9 y la \beta-catenina "in
vitro" para realizar la reacción de fijación, o expresando un
análogo de B9L/bcl9 en células para efectuar su fijación sobre las
células; después se realiza una inmunoprecipitación frente a la
mezcla de reacción o lisado celular empleando un anticuerpo contra
la \beta-catenina; y detectando por
inmunotransferencia o similar si el análogo de B9L/bcl9 está
presente en los precipitados. Puede examinarse también sin usar
anticuerpos mediante los pasos siguientes: preparar una proteína de
fusión de un análogo de B9L/bcl9 y una proteína o péptido, por
ejemplo el GST, que facilita la purificación; realizar la reacción
de fijación empleando la \beta-catenina marcada
con S^{35} o similar; purificar la proteína de fusión del análogo
de B9L/bcl9; y detectar por autorradiografía o similar si la
\beta-catenina está presente en la fracción
purificada.
La capacidad de los análogos de B9L/bcl9 de
causar la localización de la \beta-catenina dentro
del núcleo puede examinarse fijando células, en las que estén
forzosamente expresados tanto la \beta-catenina
como el análogo de B9L/bcl9 y células en las que se exprese
forzosamente solo la \beta-catenina y detectando
la \beta-catenina en las células, a saber por
inmunotinción con un anticuerpo
anti-\beta-catenina. En este caso,
la \beta-catenina normal se restringe por
degradación con GSK-3\beta en la célula. Por lo
tanto, el uso de mutantes de sitio de fosforilación, que escapen a
la degradación y por lo tanto acumulen por ejemplo un mutante de
\beta-catenina, en el que la serina 33 se ha
reemplazado por tirosina, aumentará el nivel intracelular de la
\beta-catenina y permitirá una detección más
rápida de la \beta-catenina en la célula. La
\beta-catenina no tiene una localización
intracelular particular y se distribuye de modo omnipresente dentro
de las células, en las que se expresa forzosamente la
\beta-catenina sola. Sin embargo, cuando los
análogos de B9L/bcl9 tienen la actividad de localizar a la
\beta-catenina dentro del núcleo, la
\beta-catenina se detecta más en el núcleo que en
el citoplasma. Tales análogos de B9L/bcl9 con actividad de localizar
la \beta-catenina del núcleo incluyen la proteína
B9L y el fragmento parcial de la misma, codificado por clones cDNA
obtenidos por el sistema de dos híbridos de levadura en la presente
invención (correspondiente a la región que tiene los restos
aminoácidos de 245 a 564 de la secuencia de aminoácidos de la
proteína B9L de ratón; representada por la SEQ ID NO: 4).
La proteína B9L y la proteína bcl9 aumentan el
nivel de localización de la \beta-catenina en el
núcleo. Por lo tanto, se espera que las proteínas favorezcan la
activación transcripcional mediada por el complejo
\beta-catenina/TCF.
El efecto de los análogos B9L/bcl9, incluida las
proteínas B9L y bcl9 propiamente dichas, en la activación
transcripcional por el complejo \beta-catenina/TCF
después de la transducción de señales Wnt, puede examinarse
empleando un plásmido, por ejemplo el pTOPFLASH o el pTOPCAT (ambos
descritos por Korinek, V. y col., Science 275, 1784, 1997),
para ello se coloca un gen informante (reporter), por ejemplo la
luciferasa, la
cloranfenicol-acetil-transferasa o
la \beta-galactosidasa, en dirección 3'
(downstream) después del promotor que contiene la secuencia de
fijación del TCF, de modo que la transcripción se active con el
complejo \beta-catenina/TCF. Se introducen en el
animal el plásmido de expresión del anterior gen informante y un
plásmido de expresión de un mutante de
\beta-catenina, por ejemplo, en el que la serina
33 se haya reemplazado por tirosina, que puede fijarse
constitutivamente sobre una proteína perteneciente al grupo de las
TCF/Lef para activar la transcripción. A continuación se miden y se
comparan los niveles de expresión del gen informante con y sin la
introducción de un plásmido de expresión del análogo de B9L/bcl9,
con lo cual puede determinarse si el análogo de B9L/bcl9 puede
fomentar a continuación la activación transcripcional por el
complejo de \beta-catenina/TCF.
Puede prepararse un anticuerpo policlonal
inmunizando animales utilizando como antígeno la proteína de
longitud total o parcial de una proteína de localización de la
\beta-catenina nuclear, obtenida por el método
descrito en la anterior sección 2 o un péptido parcial de la
proteína de localización de la \beta-catenina
nuclear obtenido por síntesis química en un sintetizador de péptidos
y similares.
Como animales inmunizables pueden utilizarse
conejos, cabras, ratas, ratones, hámsters y similares. La dosis de
antígeno es con preferencia de 50 a 100 \mug por animal.
Para utilizar un péptido parcial como antígeno,
el péptido parcial estará con preferencia conjugado covalentemente
con una proteína vehículo, por ejemplo la KLH o la tioglobulina
bovina.
Después de la primera administración, el
antígeno se administra de 3 a 10 veces a intervalos de 1 a 2
semanas. Pasados de 3 a 7 días de cada tiempo de administración se
extrae sangre del plexo venoso de los fondos de los ojos. Después se
analiza por el método del inmunoensayo enzimático la reactividad del
suero frente al antígeno empleado para la inmunización (Ishikawa,
E., "Kousomeneki Sokuteihou" (métodos de inmunoensayo
enzimático), Ogakushoin, 1978; Harlow, E. y Lane, D., "Antibodies:
A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1988,
etc.
etc.
El anticuerpo policlonal puede obtenerse
recogiendo el suero de mamíferos no humanos que hayan presentado
concentraciones suficientemente altas de anticuerpos en sus sueros
contra el antígeno empleado para la inmunización y separando y
purificando los sueros.
Tales métodos de separación y purificación
incluyen la separación por centrifugación, la precipitación por
adición de sal con sulfato amónico saturado del 40 al 50%, la
precipitación con ácido caprílico (Harlow, E. y Lane, D.,
"Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988) y un procedimiento para procesar empleando métodos
cromatográficos a título individual o combinados, p. ej. utilizando
una columna de DEAE-Sepharose, una columna de
proteína-A o -G, una columna de filtración a través
de gel, etc.
Como fuente de células productoras de
anticuerpos se emplean ratas, cuyos sueros presentan concentraciones
suficientemente altas de anticuerpo contra el antígeno utilizado
para la inmunización, tal como se describe en (1).
De 3 a 7 días después de la última
administración de la sustancia antígeno a las ratas que presentan
concentraciones altas de anticuerpos, se extirpan los bazos de los
animales.
Se seccionan los bazos en piezas pequeñas en
medio MEM y se trituran con fórceps. Después de la centrifugación a
1200 rpm durante 5 minutos se desecha el sobrenadante.
La fracción precipitada resultante de las
células del bazo se trata con tampón Tris-cloruro
amónico (pH 7,65) durante 1 ó 2 minutos para eliminar los
eritrocitos de la sangre, después se lavan las células del bazo 3
veces con MEM. Se utilizan las células de bazo preparadas como
células productoras de anticuerpos.
Las células de mieloma que se van a utilizar son
una línea celular establecida a partir de ratón o de rata. Por
ejemplo, las líneas celulares de mieloma de ratón resistente a la
8-azaguanina (derivado de BALB/c) que pueden
utilizarse incluyen la P3-X63Ag8-U1
(P3-U1) (Yelton, D.E., Curr. Topics Microbiol.
Immunol. 81, 1, 1978; Kohler, G. y Milstein, C., Eur. J.
Immunol. 6, 511, 1976), la SP2/0-Ag14
(SP-2) (Shulman, M. y col., Nature 276, 269,
1978), la P3-X63-8653 (653) (Seeger,
R.C. y col., J. Immunol. 123, 1548, 1979),
P3-X63-Ag (X63) (Kohler, G. y
Milstein, C., Nature 256, 495, 1975) y similares. Se pasan
las células de estas líneas en medio 8-azaguanina
[medio RPMI1640 que contiene 1,5 mmoles/l de glutamina, 5 x
10^{-5} moles/l de 2-mercaptoetanol, 10 \mug/ml
de gentamicina y un 10% de suero fetal bovino (CSL) (que a
continuación se llamará medio normal) que contiene además 15
\mug/ml de 8-azaguanina], pero de 3 a 4 días antes
de la fusión celular, las células se cultivan en el medio normal.
Para la fusión se emplean 2 x 10^{7} o más células.
Se lavan bien las células productoras de
anticuerpos, preparadas del modo descrito en (2-1) y
las células de mieloma de (2-2) con medio MEM o PBS
(1,83 g de fosfato disódico, 0,21 g de dihidrogenofosfato potásico,
7,65 g de cloruro sódico, 1 l de agua destilada; pH 7,2), se mezclan
las células entre sí en una proporción de las células productoras de
anticuerpos frente a las células de mieloma de 5 a 10 frente a 1. Se
somete la mezcla a centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos y se
desecha el líquido sobrenadante.
Se dispersan bien las células mezcladas de la
fracción precipitada. Mientras se agitan las células a 37ºC se
añaden a la mezcla celular de 0,2 a 1 ml (por 10^{8} células
productoras de anticuerpos) de una solución de 2 g de
PEG-1000, 2 ml de MEM y 0,7 ml de DMSO; después se
añaden de 1 a 2 ml de MEM a la misma, varias veces, a intervalos de
1-2 minutos.
Una vez finalizada la adición se preparan las
células por la adición posterior de MEM, de modo que el volumen
total sea de 50 ml.
Se somete la solución resultante a
centrifugación a 900 rpm durante 5 minutos y entonces se desecha el
sobrenadante.
Se dispersan suavemente las células de la
fracción precipitada resultante y después se suspenden con pipeteo
suave mediante una pipeta calibrada en 100 ml de medio HAT (un medio
en el que se añaden al medio normal: 10^{-4} moles/l de
hipoxantina, 1,5 x 10^{-5} moles/l de timidina y 4 x 10^{-7}
moles/l de aminopterina).
Se dispensa a cada hoyo de una placa de cultivo
de 96 hoyos una parte alícuota de 100 \mul de la suspensión.
Después se cultivan las células en una incubadora a 37ºC con un 5%
de CO_{2} durante 7-14 días.
Una vez finalizado el cultivo se utiliza una
parte alícuota del sobrenadante del cultivo para la selección de
hibridomas que reaccionan específicamente con el antígeno empleado
para la inmunización con arreglo al método de inmunoensayo
enzimático descrito en "Antibodies: A Laboratory Manual"
(Harlow, E. y Lane, D., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
capítulo 14, 1988), etc. para obtener las células productoras de
anticuerpos ya mencionadas antes.
Un ejemplo específico de método de inmunoensayo
enzimático es el siguiente:
Una placa apropiada se recubre con una muestra
purificada de la proteína de longitud completa de la presente
invención o con un fragmento parcial de la misma, empleados como
antígeno para la inmunización. El sobrenadante del cultivo de
hibridoma o el anticuerpo purificado obtenido en
(2-4), tal como se describe a continuación, se hace
reaccionar en calidad de anticuerpo primario en la placa y un
anticuerpo de inmunoglobulina anti-rata marcado con
biotina, una enzima, una sustancia quimioluminiscente, un
radioisótopo o similar, se hace reaccionar en calidad de anticuerpo
secundario. A continuación se efectúa la reacción en función de la
sustancia marcadora y se seleccionan las células que presentan la
reactividad específica con la proteína de la presente invención en
calidad de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra
la proteína de la presente invención.
Se clonan los hibridomas dos veces limitando el
método de dilución [con medio HT (medio HAT sin aminopterina) en la
primera clonación y con el medio normal en la segunda]. Las células
que presentan de modo estable concentraciones altas de anticuerpos
se seleccionan como líneas de hibridoma productoras de anticuerpos
monoclonales contra la proteína de la presente invención.
Las células de hibridoma obtenidas en
(2-3), productoras de anticuerpos monoclonales
contra la proteína de la presente invención, se inyectan por vía
intraperitoneal (de 5 a 20 x 10^{6} células por ratón) a ratones
de 8 a 10 semanas de edad o ratones desnudos (= sin pelo), que se
han sometido a la administración intraperitoneal de 0,5 ml de
pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano) y se han
criado durante 2 semanas. Los hibridomas forman un carcinoma
ascítico al cabo de un período de 10 a 21 días.
Se recoge la ascitis de cada ratón que tiene el
tumor ascítico y después se somete a centrifugación a 3000 rpm
durante 5 minutos para separar el material sólido.
Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse
y prepararse a partir del sobrenadante resultante por el mismo
método empleado para la preparación de anticuerpos monoclonales.
La subdivisión de los anticuerpos puede
realizarse empleando un kit de clasificación para anticuerpos
monoclonales de ratón o de rata. La cantidad de proteína puede
calcularse con arreglo al método de Lowry o midiendo la absorbancia
a 280 nm.
Se puede detectar el RNA mensajero de la
proteína localizadora de la \beta-catenina nuclear
empleando DNA que codifiquen a la proteína de localización de la
\beta-catenina nuclear, por ejemplo el B9L DNA que
contiene la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO:
1 o el bcl9 DNA; los fragmentos parciales del DNA, por ejemplo, un
fragmento que contiene 200 bp o más nucleótidos contiguos de la
secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1; o un
oligonucleótido de la proteína que localiza a la
\beta-catenina en el núcleo.
Los métodos para detectar los mRNA de las
proteínas localizadoras de la \beta-catenina
nuclear incluyen el Northern Blotting (transferencia Northern), la
hibridación "in situ", la PCR cuantitativa, la
hibridación diferencial, el DNA chip, el ensayo de protección de la
RNasa y similares. Es posible examinar el nivel de expresión de la
proteína B9L en tejidos o células a nivel de mRNA con arreglo a
estos métodos.
Los métodos anteriores pueden utilizarse para
examinar qué tipos de tejidos o células expresan las proteínas
localizadoras de la \beta-catenina nuclear y qué
tipo de estímulos conducen a cambios en el nivel de expresión dentro
de las células.
Las muestras a utilizar en el método incluyen
las muestras biológicas de tales órganos, tejidos o sangre, que se
recogen de humanos o de animales, o células de cultivo primario o
líneas celulares que se establecen a partir de estas muestras
biológicas.
La transferencia Northern (Northern blotting) es
un método en el que el RNA total o el mRNA se extrae de una muestra
(que seguidamente se denominará "RNA derivado de muestra"); se
separa por electroforesis a través de gel; se transfiere a una
membrana, por ejemplo un filtro de poliamida (Nylon); se realiza la
hibridación con una sonda preparada a partir de un DNA que codifica
a la proteína localizadora de la \beta-catenina
del núcleo o un DNA o un oligonucleótido que tengan la secuencia
parcial del DNA, por marcado con radioisótopo, digoxigenina, biotina
o similares; después se lava para detectar el mRNA que codifica a la
proteína localizadora de la \beta-catenina del
núcleo en forma de banda, sobre la que se ha fijado específicamente
la sonda marcada. El método puede llevarse a la práctica en base al
método y condiciones descritos en "Molecular Cloning, segunda
edición". La intensidad de la banda, es decir, la cantidad de
sonda fijada marcada refleja la cantidad de mRNA de la proteína
localizadora de la \beta-catenina nuclear. Por lo
tanto, la proteína localizadora de la
\beta-catenina nuclear puede cuantificarse por el
nivel de expresión del mRNA detectando sobre el mismo filtro la
banda del mRNA de la actina expresada constitutivamente, de la G3PDH
(gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa)
o similares, dicho nivel de expresión no se altera por el tipo de
tejido o estado clínico y empleando la intensidad de la banda para
la normalización. El tamaño del mRNA de la proteína de localización
de la \beta-catenina nuclear puede determinarse
cargando un grupo de marcadores moleculares de RNA marcado en el
mismo gel de la electroforesis y comparando la posición de la banda
después de la migración con las posiciones de los marcadores
moleculares.
La hibridación "in situ" es un
método en el que se prepara una rebanada sumergida en parafina o una
rebanada criostatizada a partir de una muestra de órgano o de
tejido; se hibrida con una sonda marcada, preparada a partir de DNA
que codifica a la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo o un DNA o un
oligonucleótido que tenga una secuencia parcial del DNA; y después
se lava para detectar las células o el sitio que expresa en detalle
la proteína localizadora de la \beta-catenina del
núcleo. El método puede llevarse a la práctica con arreglo al método
y condiciones descritos en "Current Protocols in Molecular
Biology".
La PCR cuantitativa (Delidow, B.C. y col., Gene
Anal. Tech. 6, 120, 1989) es un método en el que la PCR se
realiza empleando como molde un cDNA sintetizado a partir de RNA
derivado de muestra empleando un cebador oligo-dT y
transcriptasa inversa (que a continuación se llamará cDNA derivado
de muestra), con cebadores oligonucleótidos diseñados en base a la
secuencia de nucleótidos del cDNA que codifica a la proteína
localizadora de la \beta-catenina del núcleo, para
amplificar específicamente un fragmento de DNA derivado del mRNA que
codifica a la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo. La cantidad del
fragmento de DNA amplificado refleja la cantidad de mRNA de la
muestra que codifica a la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo. Por lo tanto, el mRNA
que codifica a la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo puede cuantificarse
empleando como control el resultado de la PCR efectuada para el cDNA
de la activa, la G3PDH
(gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa)
o similares, que se expresa de modo constante entre los tejidos, con
independencia de las condiciones clínicas. Los cebadores
oligonucleótidos se diseñan de modo que se fijen específicamente
sobre un cDNA que codifica a la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo a una temperatura de
fusión que no permita la hibridación entre los cebadores o la
hibridación intracebador y que se libere a la temperatura de
desnaturalización. La cuantificación del fragmento de DNA
amplificado tiene que hacerse dentro de los números de los ciclos de
PCR, en los que los productos amplificados crecen exponencialmente.
Tal número de ciclos de PCR puede determinarse realizando la PCR
para una sola muestra con diferentes números de ciclos y analizando
la cantidad de fragmentos de DNA amplificados con respecto al
aumento del número mediante electroforesis a través de gel.
La hibridación diferencial (Lennon, G.G. y
Lehrbach, H., Trends Genet. 7, 314, 1991) y el DNA chip
(Shalon, D. y col., Genome Res. 6, 639, 1996) son métodos en
los que un DNA que codifica a una proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo o un DNA o un
oligonucleótido que contiene una secuencia parcial del DNA se
inmoviliza sobre una matriz, por ejemplo un filtro, vidrio
portaobjetos o silicona; la hibridación se realiza con una sonda de
cDNA marcada que se sintetiza a partir del RNA derivado de muestra
empleando cebadores oligo-dT, dNTP marcados y
transcriptasa inversa; y el lavado se realiza para detectar los
cambios en el nivel de expresión de la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo dentro de la muestra a
analizar. En ambos métodos, puede detectarse la diferencia de nivel
de expresión del mRNA de la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo entre la muestra a
analizar y la muestra de control mediante la inmovilización de un
DNA para actina o G3PDH cobre el filtro o matriz como control
interno. Además, para la cuantificación cuidadosa puede utilizarse
dNTP con diferentes marcadores para preparar las sondas de cDNA
marcado a partir de la muestra a medir y de la muestra de control, y
dos sondas de cDNA marcado pueden hibridarse simultáneamente sobre
un solo filtro o matriz.
En el ensayo de protección de la RNasa (Pape,
M.E. y col., Genet. Anal. Tech. Appl. 8, 206, 1991), en
primer lugar se liga una secuencia de promotor, por ejemplo del
promotor T7 o del promotor SP6, al extremo 3' de un DNA que codifica
a la proteína localizadora de la \beta-catenina
del núcleo; y después se sintetiza el RNA antisentido marcado de la
proteína localizadora de la \beta-catenina del
núcleo empleando un sistema de transcripción "in vitro"
con el NTP marcado y la RNA-polimerasa específica
del promotor. Se hibrida el RNA antisentido marcado con RNA total o
con mRNA preparado a partir de la muestra para permitir la formación
de un RNA-RNA híbrido con el mRNA de la proteína
localizadora de la \beta-catenina del núcleo de la
muestra. A continuación se digiere con ribonucleasa y se detectan
por electroforesis a través de gel las bandas de la digestión con
ribonucleasa debidas a la formación del híbrido. La expresión de la
proteína localizadora de la \beta-catenina del
núcleo puede cuantificarse a nivel de mRNA cuantificando la banda
protegida.
Los métodos anteriores pueden utilizarse para
diagnosticar enfermedades, en las que el nivel de expresión del mRNA
de la proteína localizadora de la \beta-catenina
del núcleo se incrementa o se reduce en un paciente, si se compara
con el sujeto sano normal mediante la cuantificación y la
comparación de la expresión de la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo a nivel de mRNA entre
las muestras biológicas, por ejemplo órganos, tejidos y sangre, que
se recogen por biopsia del sujeto y del sujeto sano normal (que
actúa de control) o células cultivadas primarias procedentes de las
muestras.
Tales enfermedades incluyen el cáncer, por
ejemplo el cáncer de colon. En el cáncer, por ejemplo el cáncer de
colon, aumenta la expresión de la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo y facilita la
localización de la \beta-catenina del núcleo y la
activación transcripcional por el complejo de
\beta-catenina/TCF, que puede ser una causa de la
canceración de las células. Por lo tanto, la expresión de la
proteína localizadora de la \beta-catenina del
núcleo se considera que aumenta en algunas células cancerosas, por
ejemplo las células de cáncer de colon, si se compara con la de las
células normales. Por lo tanto, cuando se realiza el diagnóstico de
la expresión de la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo y por el método anterior
se encuentra que ha aumentado, es posible que el sujeto tenga
un
cáncer.
cáncer.
La relación entre enfermedades, tales como el
cáncer de colon, y la existencia de una mutación en el gen que
codifica a la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo puede evaluarse
empleando un DNA que codifique a la proteína localizadora de la
\beta-catenina del núcleo o un DNA o un
oligonucleótido que tenga una secuencia parcial del DNA comparando
la secuencia de nucleótidos del DNA genómico de la proteína
localizadora de la \beta-catenina del núcleo en un
grupo de pacientes que sufran la enfermedad y un grupo de control de
personas sanas, cada grupo está formado por un total de 10 a 100
individuos.
Las muestras a ensayar incluyen el DNA genómico
extraído de muestras biológicas, por ejemplo órganos, tejidos y
sangre, recogidas de células humanas o cultivadas primarias
procedentes de las muestras; y cDNA preparado a partir de RNA total
o mRNA extraído de muestras (llamado a continuación DNA de
muestra).
La existencia de mutaciones puede detectarse
amplificando un fragmento de DNA empleando como molde un DNA de
muestra con cebadores diseñados en base a la secuencia de
nucleótidos del B9L DNA, determinando la secuencia de nucleótidos
del fragmento de DNA amplificado y comparando la secuencia
determinada con la del B9L DNA normal.
Los métodos para explorar la presencia de una
mutación del gen B9L relacionada con un trastorno incluye el
análisis de polimorfismo conformacional de hebra simple (SSCP)
(Sheffield, V.C. y col., Genomics 16, 325, 1993), la
digestión de apareamiento incorrecto (mismatch) y la electroforesis
a través de gel con gradiente desnaturalizador.
El análisis SSCP es un método, en el que se
diseñan cebadores, que facilitan la amplificación de fragmentos de
B9L DNA de menos de 200 bp, en base a la secuencia de nucleótidos
del DNA que codifica a la proteína B9L; la PCR se realiza empleando
como molde un DNA derivado de muestra y los cebadores; se
desnaturalizan los fragmentos de DNA amplificados; y se efectúa la
electroforesis a través de un gel de poliacrilamida no
desnaturalizador. Los fragmentos de DNA amplificado pueden
detectarse en forma de banda por marcado de un cebador con un
radioisótopo o con un colorante fluorescente en la PCR o tiñiendo
los fragmentos amplificados del DNA con plata. Dado que la movilidad
en un gel no desnaturalizador se desplaza por diferencias en las
secuencias de nucleótidos, una mutación podrá detectarse comparando
la movilidad de los fragmentos amplificados del DNA de la muestra
con el B9L DNA que tiene una secuencia de nucleótidos normal.
La digestión de apareamiento incorrecto
(mismatch) es un método en el que la PCR se efectúa empleando como
molde un DNA de muestra con cebadores diseñados en base a la
secuencia de nucleótidos del B9L DNA; hibridando los fragmentos
amplificados de DNA con un B9L DNA que tenga una secuencia de
nucleótidos normal, marcado con un radioisótopo o con un colorante
fluorescente; y tratando el DNA hibridado con tetróxido de osmio o
la endonucleasa VII del fago T4 (Dean, M., Nat. Genet. 9,
103, 1995) para digerir el DNA en los sitios en los que presenta
apareamientos incorrectos. Este método es uno de los más sensibles
para detectar mutaciones y puede aplicarse a los DNA de muestra que
contengan kilobases.
La electroforesis a través de gel con gradiente
desnaturalizador (DGGF) (Fischer, S.G. y Lerman, L.S., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80, 1579, 1983; Cariello, N.F. y Skopek, T.R.,
Mutat. Res. 288, 103, 1993) es un método, en el que se
amplifican los fragmentos de DNA empleando como molde un DNA de
muestra con cebadores que se diseñan en base a la secuencia de
nucleótidos del B9L DNA; y los fragmentos amplificados se someten a
electroforesis a través de gel con un gradiente de concentración de
un desnaturalizador químico o un gradiente de temperatura. La
presencia de una mutación puede detectarse por la movilidad que se
desplaza con el cambio de temperatura o la concentración del
desnaturalizador cuando tiene lugar la desnaturalización del
fragmento de DNA debido a una mutación de la secuencia de
nucleótidos. La adición de poli(G:C) al extremo de los
cebadores aumenta la sensibilidad de la detección (Sheffield, V.C. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 232, 1989).
Las mutaciones detectadas con los métodos
anteriores pueden analizarse estadísticamente con arreglo al método
descrito en el "Handbook of Human Genetics Linkage", The John
Hopkins University Press, 1994, para identificar los polimorfismos
de nucleótidos individuales (SNP) relacionados con una
enfermedad.
Una vez se ha identificado la mutación como
asociada a una enfermedad, por ejemplo el cáncer, dicha enfermedad
puede diagnosticarse por análisis del DNA cromosómico mediante
hibridación de Southern con una sonda de oligonucleótido, que puede
hibridarse con el sitio de la mutación. Como alternativa, el
diagnóstico puede efectuarse realizando una PCR con un cebador
oligonucleótido que tena una secuencia normal, correspondiente al
sitio de mutación de la enfermedad en el extremo 3', que se basa en
el hecho de que la amplificación por PCR no tiene lugar, a menos que
el extremo 3' esté apareado. Como alternativa, el diagnóstico puede
realizarse mediante el análisis de secuencia de nucleótidos del
sitio de mutación con cebadores que tengan la secuencia de
nucleótidos B9L.
Además, la anomalía del gen B9L, por ejemplo una
deleción, un cambio en el número de copias, la translocación de
cromosomas, puede detectarse realizando una hibridación de Southern
en el DNA cromosómico digerido con una enzima de restricción
apropiada, empleando como sonda un DNA que codifique la proteína B9L
o un DNA que contenga una secuencia parcial de nucleótido del
DNA.
El ensayo de truncamiento de proteínas (PTT)
(van der Luijt, R. y col., Genomics 20, 1, 1994) es otro
método para explorar una mutación en el DNA. Este método permite la
detección específica del las mutaciones de desplazamiento de marco,
que provocan que un codón de paro en el centro del marco de
traducción conduzca al truncamiento de una proteína, una mutación de
los sitios de empalme, una mutación sin sentido y similares. En el
ensayo PTT se diseña un cebador particular, en el que la secuencia
del promotor T7 y la secuencia de iniciación de la traducción
eucariota están unidas al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos
de un DNA que codifica a la proteína B9L, para amplificar los
fragmentos de cDNA por RT-PCR a partir del RNA
derivado de muestra empleando el cebador. El mRNA se transcribe a
partir del cDNA empleando un sistema de transcripción "in
vitro" que contiene la RNA-polimerasa T7 y se
produce la proteína a partir del mRNA empleando un sistema de
traducción "in vitro". Se realiza la
SDS-PAGE con la proteína para comparar su tamaño
molecular con el de la proteína B9L traducida del mRNA de la
proteína B9L normal. De este modo puede detectarse una mutación que
provoque una deleción en la proteína.
La ubicación cromosómica de un gen que codifica
a la proteína que localiza a la \beta-catenina del
núcleo puede determinarse por métodos tales como el híbrido de
radiación (Science 250, 245, 1990) y la hibridación "in
situ" (Annals of Human Genetics 45, 135, 1981; Cell
52, 51, 1988), empleando el DNA que codifica a la
proteína.
El híbrido de radiación es un método, en el que
se realiza la PCR frente a paneles de múltiples DNA que contienen
fragmentos de cromosomas humanos (fragmentos asignados a una
localización cromosómica específica por análisis que emplean
marcadores cromosómicos), por ejemplo el Gene-Bridge
4, para amplificar específicamente un gen que codifique a la
proteína que localiza a la \beta-catenina del
núcleo y se analiza el resultado de la amplificación para determinar
la ubicación cromosómica detallada del gen.
En la hibridación "in situ", se
hibridan las preparaciones de cromosomas humanos con un DNA que
codifica a la proteína B9L humana como sonda y se detectan las
señales hibridadas para determinar la localización de las señales en
la preparación. Este método permite determinar no solo el número de
cromosomas que contiene el gen de la proteína que localiza a la
\beta-catenina del núcleo, sino también la
ubicación física dentro del cromosoma. Esta sonda puede marcarse con
el radioisótopo H^{3} o biotina, de modo que la señal pueda
detectarse por autorradiografía y avidina marcada con un colorante
fluorescente, el isotiocianato de fluoresceína (FITC),
respectivamente.
Como alternativa, en lugar de detectar
directamente la ubicación cromosómica del gen de la proteína que
localiza a la \beta-catenina del núcleo, como en
los métodos anteriores, se puede investigar en los bancos de datos
de STS (sitios marcados con secuencias) (que contienen información
de los cebadores que se derivan de secuencias de nucleótidos de una
gran variedad de EST, fragmentos de DNA cromosómico, que se
amplifican con los cebadores y la ubicación cromosómica de los
fragmentos) para encontrar una secuencia que sea homóloga de la
secuencia de nucleótidos del DNA que codifica a la proteína B9L.
Cuando se descubre un STS que tiene una secuencia de nucleótidos
idéntica con una parte del DNA que codifica a la proteína que
localiza a la \beta-catenina del núcleo, el STS se
considera que corresponde al gen que codifica a la proteína que
localiza a la \beta-catenina del núcleo dentro del
cromosoma. Por lo tanto, la ubicación cromosómica del STS se supone
que es la ubicación del gen.
Además, una secuencia de nucleótidos de un DNA
genómico humano de los bancos de datos suele ir acompañada de
información sobre su ubicación cromosómica. Por ejemplo, se
describen las secuencias de DNA genómico humano con los números de
registro AP000877 y AP000909 del GenBank, que contienen el exón del
DNA genómico de la B9L humana, obtenido en la anterior sección 1
(6-2), indicando que están ubicadas en el cromosoma
humano 11q23 del banco de datos. Por lo tanto se concluye que el gen
B9L humano está localizado en el cromosoma humano 11q23.
Se ha publicado que el gen bcl9 está ubicado en
el cromosoma humano 1q21.
La información sobre la ubicación cromosómica de
los genes que codifican la proteína que localiza a la
\beta-catenina del núcleo es útil para examinar la
relación entre los genes y las enfermedades. Por ejemplo, está en
marcha la identificación de las regiones, en las que se detecta una
LOH (pérdida de heterocigotidad: una deleción de cromosoma
encontrada en uno del par de un gen) a alta frecuencia en muchos
cánceres como región cromosómica de la que se espera en gran manera
que contenga un gen supresor tumoral (la inactivación de un gen
supresor tumoral se considera que tiene lugar por una mutación en
otro par de genes supresores tumorales, que se halla dentro de la
región con la LOH y conduce al inicio del cáncer). Cuando la región
coincide con la ubicación cromosómica del gen de la proteína que
localiza a la \beta-catenina del núcleo, la
proteína puede participar en el inicio del cáncer, que tiene una LOH
en esta región. En tales casos, cuando se clarifica la asociación
entre la proteína que localiza a la \beta-catenina
del núcleo y el cáncer por análisis de la mutación del gen o por
expresión de la proteína que localiza a la
\beta-catenina del núcleo, entonces el diagnóstico
y el tratamiento de tal cáncer puede realizarse empleando un DNA
que codifique a la proteína que localiza a la
\beta-catenina del núcleo, la proteína que localiza a la \beta-catenina del núcleo o un anticuerpo que reconozca a la proteína.
\beta-catenina del núcleo, la proteína que localiza a la \beta-catenina del núcleo o un anticuerpo que reconozca a la proteína.
En células cancerosas que tienen la mutación del
gen APC o el gen de la \beta-catenina, por ejemplo
las células del cáncer de colon, la \beta-catenina
se acumula debido al defecto de regulación de degradación de la
\beta-catenina y la activación transcripcional del
complejo \beta-catenina/TCF no puede suprimirse.
Esta desrepresión puede asociarse con el inicio del cáncer. Se
considera que la activación transcripcional por el complejo
\beta-catenina/TCF puede suprimirse por supresión
de la transferencia de la \beta-catenina acumulada
en el núcleo inhibiendo la función localizadora de la
\beta-catenina en el núcleo de la proteína que
localiza a la \beta-catenina del núcleo o
suprimiendo la expresión de la proteína que localiza a la
\beta-catenina del núcleo. Las sustancias que
tienen tales funciones pueden utilizarse como agentes terapéuticos
contra el cáncer.
Se define como inhibidor de la proteína que
localiza a la \beta-catenina del núcleo una
sustancia que inhibe la localización nuclear de la
\beta-catenina inhibiendo la fijación de la
proteína que localiza a la \beta-catenina del
núcleo sobre la \beta-catenina.
Puede explorarse tal sustancia que inhibe la
fijación de la proteína que localiza a la
\beta-catenina del núcleo sobre la
\beta-catenina poniendo en contacto la proteína
que localiza a la \beta-catenina del núcleo y la
\beta-catenina y comparando la cantidad fijada de
la proteína que localiza a la \beta-catenina del
núcleo sobre la \beta-catenina en presencia o en
ausencia del compuesto a ensayar.
Por ejemplo, la cantidad de la
\beta-catenina fijada con la proteína que localiza
a la \beta-catenina del núcleo puede estimarse
mezclando y fijando la proteína que localiza a la
\beta-catenina del núcleo sobre la
\beta-catenina, que está marcada con S^{35} o
similar en presencia o en ausencia de un compuesto a ensayar,
aislando la proteína que localiza a la
\beta-catenina del núcleo empleando un anticuerpo
o similar y midiendo la cantidad de la
\beta-catenina marcada que contiene el material
aislado. Cuando la cantidad de \beta-catenina
fijada disminuye en presencia del compuesto de ensayo, por
comparación con la ausencia de dicho compuesto, se considera que el
compuesto es un inhibidor de la fijación de la
\beta-catenina con la proteína que localiza a la
\beta-catenina del núcleo.
Puede examinarse si un inhibidor de este tipo,
que inhibe la unión entre la \beta-catenina y una
proteína que localiza a la \beta-catenina del
núcleo, puede bloquear la localización de la
\beta-catenina del núcleo fijando células que
forzosamente expresan tanto la \beta-catenina como
la proteína que localiza a la \beta-catenina del
núcleo, a cuyas células se ha añadido el compuesto a ensayar o no se
ha añadido, y detectando la \beta-catenina por
inmunotinción empleando un anticuerpo
anti-\beta-catenina. En este caso,
la \beta-catenina normal se degrada en las células
por acción de la GKS-3\beta. Utilizando una
\beta-catenina mutada, por ejemplo un mutante, en
el que la serina 33 está sustituida por la tirosina, que tenga una
mutación en el sitio de fosforilación, entonces la
\beta-catenina mutada se acumula sin degradación.
Por lo tanto, el nivel intracelular de la
\beta-catenina aumenta y resulta fácil detectar la
\beta-catenina cuando se emplea la
\beta-catenina mutada. La
\beta-catenina propiamente dicha no tiene una
tendencia particular de localización intracelular y se distribuye
por igual en células después de la expresión forzada de la
\beta-catenina sola. Sin embargo, cuando un
análogo de proteína B9L/bcl9 tiene una función de localización de la
\beta-catenina del núcleo, se encontrará una
cantidad más grande de \beta-catenina en el número
que en el citoplasma.
La \beta-catenina y la
proteína de localización de la \beta-catenina en
el núcleo empleada para la anterior exploración pueden purificarse a
partir de células o tejidos que expresan las proteínas. Sin embargo,
una cantidad grande de estas proteínas puede obtenerse por cultivo
de un transformante que se haya transformado con un DNA que codifica
a las proteínas y purificándolos con arreglo a método estándar. La
exploración de la presente invención puede realizarse también
empleando células cultivadas que expresen las proteínas o células
cultivadas procesadas. Sin embargo, cuando se emplean células
intactas, es preferible utilizar células que secreten las proteínas.
En esta descripción, las células cultivadas procesadas incluyen
concentrados de células, materiales secados a partir de células,
células obtenidas por centrifugación del líquido sobrenadante del
cultivo, células secadas, células liofilizadas, células tratadas con
detergentes, células sometidas a ultrasonidos, células trituradas
mecánicamente, células tratadas con disolventes, células
tratadas
con enzimas, fracciones de proteínas de células, células fijadas y preparaciones enzimáticas extraídas de las células.
con enzimas, fracciones de proteínas de células, células fijadas y preparaciones enzimáticas extraídas de las células.
Los métodos para inhibir la expresión de la
proteína de localización de la \beta-catenina en
el núcleo incluyen: la supresión de la traducción de la proteína de
localización de la \beta-catenina en el núcleo a
partir de mRNA por administración de un DNA antisentido o un
oligonucleótido antisentido contra la proteína o un vector de
expresión de DNA antisentido; la inhibición de la transcripción por
administración de un oligonucleótido que se fija sobre el promotor
del gen de la proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo para formar una triple
hélice; la degradación del mRNA de la proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo por administración de
una ribozima; y la inhibición de la transcripción por administración
de un compuesto que inhibe específicamente la transcripción del gen
de la proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo.
Para el tratamiento de enfermedades causadas por
niveles disminuidos de expresión de la proteína de localización de
la \beta-catenina en el núcleo, puede
administrarse la proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo o un vector para la
terapia genética que produce la proteína en el cuerpo humano.
Tales vectores para la terapia genética incluyen
los vectores de virus recombinantes que producen una proteína de
localización de la \beta-catenina en el núcleo.
Los vectores de virus recombinantes pueden construirse insertando el
cDNA de longitud completa de la proteína humana de localización de
la \beta-catenina en el núcleo, obtenida con
arreglo al método descrito en la sección 1, en dirección a 3'
(dowstream) de un promotor en un vector vírico. Como alternativa, si
fuera necesario, se prepara un fragmento de DNA de un tamaño
apropiado que contenga la región que codifica a la proteína de
localización de la \beta-catenina en el núcleo
para insertar el fragmento en dirección a 3' (dowstream) del
promotor en un vector vírico. Los vectores víricos recombinantes son
deficientes en genes que codifiquen a las proteínas necesarias para
el empaquetamiento vírico. Por ejemplo, los retrovirus, tales como
el virus de leucemia de Moloney del ratón, carecen de proteínas, por
ejemplo gag, pol y env; los lentivirus, por ejemplo el VIH, carecen
de proteínas del tipo gag, pol, env, vpr, vpu, vif, tat, rev y nef;
los adenovirus carecen de proteínas del tipo E1A y E1B; y los virus
adenoasociados carecen de proteínas del tipo Rep (p5, p19, p40) y
Vp (Cap).
Se introduce un vector vírico recombinante en
una célula de empaquetamiento idónea. A tal fin puede emplearse
cualquier célula que proporcione las proteínas requeridas para el
empaquetamiento del virus, que se hayan perdido en el vector vírico
recombinante, incluidas por ejemplo las células HEK293 derivadas del
riñón humano y los fibroblastos NIH 3T3 de ratón.
Puede utilizarse cualquier vector vírico en el
supuesto de que pueda producir virus recombinantes en las anteriores
células de empaquetamiento y contenga un promotor en una posición
que permita la transcripción de un gen B9L en las células diana.
Puede utilizarse un vector plásmido del tipo MFG (Riviere, I. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6733, 1995), pBabepuro
(Morgenstern, J.P. y Land, H., Nucleic Acid Res. 18, 3587,
1990), LL-CG, CL-CG,
CS-CG y CLG (Miyoshi, H. y col., J. Virol.
72, 8150, 1998) y pAdex1 (Kanegae, Y. y col., Nucleic Acid
Res. 23, 3816, 1995). Puede utilizarse cualquier promotor que
pueda dirigir la expresión en tejido humano, incluidos por ejemplo
el promotor del gen precoz inmediato (IE) de citomegalovirus, el
promotor precoz de SV40, el retrovirus LTR, el promotor de
metalotioneína, los promotores proteicos de choque térmico y
similares. Además, puede utilizarse el mejorador del gen IE de
citomegalovirus con el promotor.
Los anteriores vectores víricos recombinantes
pueden introducirse en las anteriores células de empaquetamiento por
el método del fosfato cálcico, por lipofección (Felgner, P.L. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413, 1987) y
similares.
Como alternativa, la terapia genética sin usar
un vector vírico incluye el método de transfección del gen
terapéutico (US-5 589 466), en el que el DNA
plásmido desnudo se inyecta directamente, se trata de una técnica de
transferencia directa del DNA al tejido deseado. Específicamente, la
proteína de localización de la \beta-catenina en
el núcleo puede expresarse en el tejido, por ejemplo tejido de
cáncer de colon, para dicho tratamiento se requiere la inyección de
un vector de expresión que contenga un DNA que codifique a la
proteína, empleando para ello una jeringuilla, o similar.
Los métodos para detectar la proteína de
localización de la \beta-catenina en el núcleo con
un anticuerpo, que reconozca inmunológicamente a la proteína,
incluyen: la inmunohistoquímica, por ejemplo la inmunotinción de
tejidos y la inmunocitoquímica; la citometría de flujo; la
transferencia western (western blotting); el inmunoensayo enzimático
(EIA), por ejemplo el ensayo ELISA sandwich; y el radioinmunoensayo
(RIA), que puede realizarse con arreglo a la bibliografía técnica
("Monoclonal Antibody Experiment Manual", coordinado por Sakuji
Toyama y Tomie Yasu, Kodan-sha Scientific, 1987;
"Biochemical Experiment Seminar Series 5: Immunobiochemical
Study", Tokyo-Kagaku Dojin, 1986; Goding, J.W.,
"Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", tercera
edición, Academic Press, 1996; Harlow, E. y Lane, D., Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
La inmunohistoquímica es un método, en el que el
tejido o las células se fijan; se hacen reaccionar con un anticuerpo
que reconozca a la proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo y después con un
anticuerpo anti-inmunoglobulina o un fragmento del
mismo, que esté marcado con un colorantes fluorescente, una enzima,
la biotina, oro coloidal, un radioisótopo, o similares; después, si
fuera necesario, se visualiza el anticuerpo marcado; y se examinan
el tejido o las células con el microscopio para detectar la proteína
de localización de la \beta-catenina en el núcleo
en el tejido o en las células. Para el marcado fluorescente se
emplea el isotiocianato de fluoresceína (FITC), el isotiocianato de
tetrametilrodamina o un compuesto similar y se detectan con un
microscopio de fluorescencia. Para el marcado enzimático se emplea
la peroxidasa, la fosfatasa alcalina o similar, que puede detectarse
observando la muestra en un microscopio normal después de la
reacción cromogénica provocada por la adición de un sustrato que
pueda revelarse y formar color por la función de la enzima. Para el
marcado de biotina, se hace reaccionar la avidina, que está
conjugada con una enzima, por ejemplo con una peroxidasa, y después
se realizan procedimientos similares para el anticuerpo marcado con
enzimas. Para el marcado con oro coloidal se detecta la señal
mediante un examen con microscopio electrónico. Para el marcado con
radioisótopo puede utilizarse el I^{125} u otro similar, y la
detección puede efectuarse por recubrimiento con una emulsión
fotosensible y observando con el microscopio normal los granos de
plata que se forman por radiación.
La citometría de flujo es un método en el que
las células recogidas de un sujeto a estudiar se hacen reaccionar
con un anticuerpo que reconozca a la proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo y después con un
anticuerpo anti-inmunoglobulina o un fragmento del
mismo que esté marcado con un colorante fluorescente, por ejemplo el
FITC o la ficoeritrina; y después se mide el fluorcromo en un
citómetro de flujo para detectar la expresión de la proteína de
localización de la \beta-catenina en el núcleo en
las células.
La transferencia western (western blotting) es
un método en el que se recogen las muestras de tejido o las células
de un sujeto a estudiar o materiales homogeneizados de los mismos y
se separan por electroforesis a través de un gel de
SDS-poliacrilamida; después se pinchan sobre una
membrana de PVDF o una membrana de nitrocelulosa; se hace reaccionar
la membrana con un anticuerpo que reconozca a la proteína de
localización de la \beta-catenina en el núcleo o a
un fragmento de la misma, después con un anticuerpo
anti-inmunoglobulina o un fragmento del mismo, que
esté marcado con una enzima, por ejemplo una peroxidasa o una
fosfatasa alcalina, o con un radioisótopo, por ejemplo el I^{125},
para detectar una banda correspondiente a la proteína de
localización de la \beta-catenina en el núcleo.
Cuando se emplea una enzima para el marcado, la detección se realiza
visualizando la banda de la proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo mediante la adición de
un sustrato que revele color por reacción con la enzima o por
autorradiografía sobre una película de rayos X por adición de un
sustrato que emita luz a raíz de la reacción con la enzima. Cuando
se emplea un radioisótopo para el marcado, la banda se detecta por
autorradiografía en una película de rayos X.
En el ensayo ELISA sandwich, una variación de
los inmunoensayos asociados a enzimas, se preparan dos anticuerpos
monoclonales de diferentes sitios de reconocimiento de antígeno, que
reconozcan a la proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo y después se adsorbe
uno de los anticuerpos monoclonales o un fragmento del mismo sobre
una placa y el otro o fragmento del mismo se marca con una enzima,
por ejemplo la peroxidasa o la fosfatasa alcalina. Se prepara el
homogeneizado celular a partir del tejido o células recogidos de un
sujeto a estudiar y se utilizan como muestra a analizar. Se hace
reaccionar la muestra a analizar con el anticuerpo adsorbido en la
placa, la enzima marcada con el anticuerpo
anti-proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo o un fragmento del
mismo, se añade un sustrato que revele color por acción de la enzima
y se mide la intensidad del color con un espectrofotómetro o se
determina la proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo en la muestra.
El radioinmunoensayo es un método, en el que se
realizan procedimientos similares, empleando un anticuerpo marcado
con radioisótopo, por ejemplo el I^{125}, en lugar de la enzima,
para detectar o determinar la proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo en una muestra
mediante la medición de la radiactividad con un contador de
centelleo.
Además del anterior ensayo sandwich se conoce
también ensayos competitivos de los inmunoensayos enzimáticos y del
radioinmunoensayo en los que, en lugar del anticuerpo, se marca una
preparación de una proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo; se hacen reaccionar
una cantidad adecuada de la preparación de la proteína de
localización de la \beta-catenina en el núcleo y
una muestra a analizar con una anticuerpo que reconozca a la
proteína de localización de la \beta-catenina en
el núcleo, que está inmovilizada sobre una placa; y se mide la
actividad enzimática o la radiactividad de la placa para detectar o
determinar la proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo existente en la
muestra.
La anterior proteína de localización de la
\beta-catenina en el núcleo, los compuestos y los
anticuerpos pueden administrarse a título individual como agentes
terapéuticos. Sin embargo, en general, es preferible proporcionar
composiciones farmacéuticas mezclándolos con uno o varios
excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables y formularlos
por cualquier método convencional de la industria farmacéutica. El
agente se administra preferiblemente a través del método más eficaz
para el tratamiento, incluidas la administración oral y la
administración parenteral, por ejemplo la inyección intraoral, la
inyección intrarrespiratoria, la inyección intrarrectal, la
inyección subcutánea, la inyección intramuscular y la inyección
intravenosa. La formulación para la administración incluye el
nebulizador (spray), la cápsula, la tableta, el granulado, el
jarabe, la emulsión, el supositorio, la inyección, el ungüento y
el
emplasto.
emplasto.
Las formulaciones apropiadas para la
administración oral incluyen la emulsión, el jarabe, la cápsula, la
tableta, el polvo y el granulado. Por ejemplo, las preparaciones
líquidas, tales como la emulsión y el jarabe, pueden prepararse
empleando como aditivos el agua; azúcares, por ejemplo sucrosa,
sorbita o fructosa; glicoles, por ejemplo polietilenglicol o
propilenglicol; aceites, por ejemplo aceite de sésamo, aceite de
oliva o aceite de soja; antisépticos, por ejemplo los ésteres
p-hidroxibenzoato; aromas, por ejemplo aroma de
fresa y menta; y similares. Las cápsulas, tabletas, polvos,
granulados y similares pueden prepararse utilizando como aditivos
los excipientes del tipo lactosa, glucosa, sucrosa y manita;
desintegrantes, tales como almidón o alginato sódico; lubricantes,
tales como estearato magnésico y talco; agentes aglutinantes, tales
como el polivinilalcohol, la hidroxipropilcelulosa y la gelatina;
detergentes, tales como ésteres de ácidos grasos; plastificantes,
por ejemplo la glicerina; y similares.
Una formulación apropiada para la administración
parenteral incluye la inyección, el supositorio y el nebulizador
(spray). Por ejemplo, la inyección puede prepararse empleando un
excipiente que contenga una solución salina, una solución de glucosa
o una mezcla de ambos; y similares. Un supositorio puede prepararse
empleando un vehículo, por ejemplo manteca de cacao, grasa
hidrogenada o carbonato. El nebulizador puede prepararse a partir de
la proteína como tal o empleando un vehículo que disperse la
proteína en forma de partículas finas para facilitar su absorción,
pero que no estimule la cavidad oral ni la mucosa respiratoria del
receptor. Un ejemplo específico de tal vehículo incluye la lactosa y
la glicerina. Es posible preparar aerosol o polvo seco en función de
las características de la proteína y del vehículo empleado. Los
componentes descritos anteriormente como aditivos para la
administración oral pueden añadirse también a los agentes
parenterales.
La dosificación y la frecuencia de
administración pueden variar en función del efecto terapéutico
deseado, del método de administración, de la duración del
tratamiento, de la edad, del peso corporal, y similares, pero
normalmente se sitúa entre 10 \mug/kg y 100 mg/kg de peso corporal
del adulto al día.
En la figura 1 se representa una comparación de
las secuencias de aminoácidos del B9L de ratón y del bcl9 humano.
Las secuencias de aminoácidos del B9L del ratón (arriba) y del bcl9
humano (abajo) se representan en la notación de una sola letra. El
asterisco * indica restos idénticos entre el bcl9 humano y el B9L de
ratón y - indica la ausencia del resto correspondiente. El sitio de
fijación de la \beta-catenina está subrayado y la
secuencia similar a la señal de localización en el núcleo se subraya
con doble raya.
En la figura 2 se representa la fijación de la
\beta-catenina y el B9L a las células. El signo +
debajo de cada pista indica el gen expresado. Se representan los
resultados del "Western blotting" empleando como anticuerpo
primario el anticuerpo
anti-\beta-catenina en los lisados
de células inmunoprecipitadas a partir de células
COS-7 que co-expresan la
\beta-catenina S33Y y el GFP-B9L
(pistas central y derecha). Los anticuerpos empleados para la
inmunoprecipitación se indican en la cabecera de cada pista.
Izquierda y centro: anticuerpo anti-GFP; y derecha:
anticuerpo
anti-\beta-catenina.
La presente invención se describe a continuación
con detalle, con referencia a los ejemplos.
Se clona un gen que codifica a una proteína que
se fija sobre la
m\beta-catenina-arma de ratón por
el sistema de dos híbridos de levadura.
Son de conocimiento público (GenBank, nº de
registro: M90364; Science 257, 1142, 1992) la secuencia de
nucleótidos del cDNA de la \beta-catenina de ratón
y la secuencia de aminoácidos de la \beta-catenina
de ratón codificada por el cDNA. La \beta-catenina
de ratón contiene una secuencia repetitiva, que se llama dominio
armadillo (m\beta-catenina-arma)
en la región de los restos de 128 a 683 de su secuencia de
aminoácidos. Se amplifica un fragmento de DNA de la
\beta-catenina de ratón que codifica a esta
porción del m\beta-catenina-arma y
se aísla por PCR empleando como molde el cDNA de células de ratón.
Los cebadores de la PCR se diseñan en base a la secuencia de
nucleótidos de la porción del cDNA que codifica al
m\beta-catenina-arma recién
mencionado. Se analiza la secuencia del fragmento de DNA amplificado
para confirmar que codifica al
m\beta-catenina-arma y después se
inserta el fragmento en un vector pGBT9 (Clontech) entre los sitios
BamHI/SalI para obtener un plásmido para la expresión de la proteína
de fusión GAL4-\beta-catenina, en
la que la \beta-catenina se ha fusionado con el
GAL4-BD.
La exploración se lleva a cabo con la biblioteca
de cDNA fetal de ratón MATCHMAKER (ratón Swiss Webster/NIH; embrión
de 17 días), que es una biblioteca para usar en el sistema de dos
híbridos, suministrada por Clontech. Esta biblioteca de cDNA
contiene el vector pGAD10 (Clontech) con un inserto de cDNA y, como
marcador de selección, el gen LEU2 que participa en la biosíntesis
de la leucina en la levadura y puede expresar proteínas de fusión de
GAL4 AD y proteínas que codifican al cDNA a través del promotor
ADH1. El método específico de exploración se lleva a cabo con
arreglo al manual adjunto a la biblioteca, que son las instrucciones
de Clontech, del modo
siguiente.
siguiente.
De modo específico se introducen tanto la
biblioteca de cDNA fetal de ratón para el sistema de dos híbridos
como el plásmido
GAL4-\beta-catenina, preparado en
(1), en la cepa HF7C de la levadura Saccharomyces cerevisiae
(Clontech). La cepa HF7C es una cepa de levadura que es auxotrófica
para el triptófano, leucina e histidina. Esta cepa tiene el gen HIS3
en el cromosoma, dicho gen participa en la biosíntesis de la
histidina y se ha ligado en dirección a 3' (downstream) del promotor
GAL1, sobre el que se puede fijar el GAL4 BD, así como el gen lacZ
de la \beta-galactosidasa derivada de la E.
coli, ligado en dirección a 3' de una secuencia de nucleótidos,
sobre la que puede fijarse el GAL4 BD en calidad de gen informante
(reporter) (Gene 212, 197, 1998). Un transformante que
contenga tanto el plásmido
GAL4-\beta-catenina como el clon
cDNA de una proteína, que se fija sobre el
m\beta-catenina-arma y expresa las
proteínas de fusión correspondientes, no es auxotrófico para la
histidina y es positivo en actividad de
\beta-galactosidasa. Debido al hecho de que el
GAL4 BD y el GAL4 AD se acercan mucho entre sí por la fijación del
m\beta-catenina-arma y para
activar la transcripción del gen HIS3 y el gen lacZ en dirección a
3' de la secuencia de nucleótidos, sobre la que se fija el GAL4 BD.
Finalmente se selecciona una colonia, que muestra ser positiva en
actividad de \beta-galactosidasa, cultivando 1,2 x
10^{6} transformantes en un medio sin leucina, histidina ni
triptófano.
Se recupera el DNA plásmido a partir del clon
(colonia seleccionada) y se determina la secuencia de nucleótidos
del fragmento de cDNA insertado, que se representa en la SEQ ID NO:
3. Se realiza la búsqueda de homología para la secuencia de
nucleótidos en un banco de datos de secuencias de nucleótidos y se
encuentra que varios EST de ratón son idénticos a esta secuencia.
Sin embargo, no se logra encontrar genes conocidos que tengan una
secuencia de nucleótidos idéntica. Por lo tanto, el anterior
fragmento de cDNA aislado por el sistema de dos híbridos demuestra
tener una nueva secuencia de nucleótidos que codifica a la proteína
que se fija sobre la \beta-catenina de ratón. La
secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el fragmento
de cDNA se representa en la SEQ ID NO: 4. Al fragmento de cDNA que
contiene la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID NO: 3
se falta un codón de paro y la secuencia entera codifica a una
proteína; por lo tanto se considera que forma parte de un cDNA de
longitud completa. Se espera que el cDNA de longitud completa
contenga secuencias extendidas en ambos extremos, el 5' y el 3', de
la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 3. Por lo
tanto, se efectúan el RACE de 5' y el RACE de 3' para amplificar los
fragmentos de cDNA que contienen secuencias de nucleótidos, que se
siguen extendiendo en la dirección 5' y 3', respectivamente y se
determinan sus secuencias. Juntando la secuencia de nucleótidos del
clon cDNA obtenido por el sistema de dos híbridos y las secuencias
del RACE de 5' y de 3' se obtiene la secuencia de nucleótidos
representada en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos
codifica a una proteína que tiene 1494 aminoácidos y se representa
en la SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos del fragmento de
cDNA aislado por el sistema de dos híbridos corresponde a los
nucleótidos de 733 a 1692 de la secuencia de nucleótidos
representada por la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos
codificada por el fragmento de cDNA corresponde a los restos de 245
a 564 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:
2. Estas secuencia de aminoácidos se utiliza para la determinación
de homología frente a las secuencias de aminoácidos del banco de
datos del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) con
el programa de análisis de homología BLAST2. Tal como se indica en
la figura 1, la secuencia presenta una homología global del 37% con
la proteína bcl9 (número de registro CAA73942; Willis, T.G. y col.,
Blood 91, 1871, 1998). Por lo tanto, la proteína que se fija
sobre la \beta-catenina que contiene una secuencia
de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 es una proteína B9L
armada (proteína similar a la bcl9). La anterior proteína bcl9 se
deriva de humanos y todavía no se ha identificado la secuencia de
aminoácidos de la proteína bcl9 de ratón. Sin embargo, hay un par de
clones EST (números de registro AI550007 y AI426858) en el banco de
datos de secuencias de nucleótidos GenBank que se consideran
secuencias de nucleótidos de cDNA que codifica a la proteína bcl9 de
ratón, dicha secuencia de nucleótidos de los clones presenta una
homología del 90% o más con la proteína bcl9 humana (la homología de
la secuencia de nucleótidos que corresponde a la de la proteína B9L
es del 40% o menos). Por lo tanto, la proteína B9L de ratón obtenida
parece que no es la proteína bcl9 de ratón. La proteína B9L es una
proteína rica en prolina, al igual que la proteína bcl9, y contiene
una secuencia similar a la señal de localización en el núcleo.
Por hibridación "Northern blot" empleando
como sonda el anterior cDNA frente al mRNA obtenido a partir del
embrión de ratón (día 13,5), se detecta una banda de mRNA de 7,5
kb.
Se investigan las secuencias de nucleótidos de
DNA humanos que tienen homología con la secuencia de nucleótidos del
B9L cDNA de ratón obtenido en (2) en bancos de datos de secuencias
de nucleótidos, incluido el GenBank, empleando los programas de
análisis de homología, por ejemplo el BLAST. Como resultado, se
identifican clones EST humanos (GenBank, números de registro U46365
y R24762), previsiblemente derivados de B9L cDNA humano y secuencias
de diseño (draft) de trabajo de DNA genómico humano (GenBank,
números de registro AP000877, AP002357 y AP000909) que contienen una
secuencia de exón del B9L DNA genómico humano. Estas secuencias de
diseño (draft) de trabajo se comparan con las secuencias de
nucleótidos del B9L cDNA de ratón y EST humanos para obtener
secuencias de exones que codifican a la B9L humana, representadas en
las SEQ ID NO: de 5 a 8. Las SEQ ID NO: de 5 a 8 son exones que
corresponden a los nucleótidos de 27 a 412, de 413 a 532, de 1183 a
3115 y de 3116 a 3397, respectivamente, dentro de la secuencia de
B9L cDNA de ratón (SEQ ID NO: 1). La SEQ ID NO: 9 representa una
secuencia parcial de nucleótidos del B9L cDNA humano derivado de las
SEQ ID NO: 5 y 6 (correspondientes a los nucleótidos de 27 a 532 de
la secuencia de nucleótidos del B9L cDNA de ratón representada por
la SEQ ID NO: 1). La SEQ ID NO: 10 representa una secuencia parcial
de aminoácidos de la proteína B9L humana, codificada por la
secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 9
(correspondiente a los residuos de 10 a 177 de la secuencia de
aminoácidos de la proteína B9L de ratón, representada en la SEQ ID
NO: 2). La SEQ ID NO: 11 representa una secuencia parcial de
nucleótidos del B9L cDNA humano derivado de las SEQ ID NO: 7 y 8
(correspondientes a los nucleótidos de 1183 a 3397 de la secuencia
del B9L cDNA de ratón, representada en la SEQ ID NO: 1). La SEQ ID
NO: 12 representan una secuencia parcial de aminoácidos de la
proteína B9L humana, codificada por la secuencia de nucleótidos
representada en la SEQ ID NO: 11 (correspondiente a los restos de
395 a 1132 de la secuencia de aminoácidos de la proteína B9L de
ratón, representada en la SEQ ID NO: 2).
La AP000877 y la AP000909 se describen como
ubicadas en el cromosoma humano 11q23 del banco de datos. Por lo
tanto, el gen B9L humano se considera que está ubicado en el
cromosoma humano 11q23.
La fijación directa de la proteína B9L sobre la
\beta-catenina se confirma del modo siguiente. La
proteína que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:
4, codificada por el fragmento B9L cDNA, obtenida por la exploración
de dos híbridos descrita en el ejemplo 1, se emplea en los ejemplos
de 2 a 5 como proteína B9L.
Se sintetiza la proteína B9L marcada con
S^{35} a partir del fragmento de B9L cDNA obtenido por el método
de dos híbridos del ejemplo 1 por transcripción y traducción
"in vitro" empleando la metionina marcada con S^{35} y
un sistema de lisado de reticulocito unido a TNT® (Promega). Se
cultivan la E. coli transformada con el plásmido de expresión
de la proteína de fusión
GST-\beta-catenina (abreviada a
continuación con
GST-\beta-catenina) (Nakamura y
col., Genes to Cells 3, 395, 1998), en el que el DNA de
\beta-catenina de ratón se ha insertado en el
sitio de clonación del vector pGEX5X-1 plásmido de
expresión de la
glutationa-S-transferasa (GST) de la
E. coli (Amersham Pharmacia Biotech) y el
pGEX5X-1, como control, para obtener los
correspondientes lisados bacterianos. Se añade la
glutationa-Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech)
a los lisados para aislar la
GST-\beta-catenina o la GST por
adsorción. Se hace reaccionar la
glutationa-Sepharose 4B, sobre la que se ha
adsorbido la GST-\beta-catenina o
la GST, con la anterior proteína B9L marcada con S^{35} en un
tampón A (Tris-HCl 10 mM, (pH 8,0), NaCl 140 mM,
EGTA 1 mM, leupeptina 10 \mug/ml, aprotinina 10 \mug/ml) que
contiene un 0,1% de Tritón X-100, a 4ºC durante 2 h.
Se lava bien la glutationa-Sepharose 4B con el
tampón A y después se añade el tampón de muestra
SDS-PAGE para eluir las proteínas fijadas en el
tampón de muestra. El líquido eluido y la proteína B9L marcada con
S^{35} se utilizan como muestra para la SDS-PAGE y
después se someten a autorradiografía. El resultado indica que se
detecta una banda correspondiente a la proteína B9L marcada con
S^{35} en la E. coli que expresa la
GST-\beta-catenina, mientras que
no se detecta banda alguna en la E. coli que expresa la GST.
Por lo tanto, se confirma que la proteína B9L se fija directamente
sobre la GST-\beta-catenina
"in vitro" y que el sitio que realiza la fijación con la
proteína B9L está situado dentro del resto
\beta-catenina de la
GST-\beta-catenina.
Se inserta el fragmento B9L cDNA obtenido en el
ejemplo 1 en el vector de expresión pEGFP-C2 de
proteína fluorescente verde (GFP) (Clontech) para construir un
plásmido de expresión para la proteína de fusión
GFP-B9L (abreviada a continuación por
GFP-B9L). Se subclona el cDNA S33Y de
\beta-catenina de ratón mutado, en el que la
serina 33, la posición diana de la fosforilación mediada por
GSK-3\beta, se sustituye por tirosina, en el
vector plásmido de expresión de células animales pMKITneo (Nakamura
y col., Genes to Cells 3, 395, 1998) para construir un
plásmido de expresión de la
S33Y-\beta-catenina. Se
transfectan estos plásmidos empleando la LipofectAMINE (Life
Technologies) en células COS-7 de la línea celular
de riñón de simio (ATCC: CRL-1651) para la expresión
forzada. Después de 24 h se recolectan las células para preparar
lisados celulares mediante la adición del tampón A que contiene un
1% de Tritón X-100. Se hacen reaccionar los lisados
celulares con anticuerpo anti-GFP o con anticuerpo
anti-\beta-catenina a 4ºC durante
1 h, formándose un complejo inmune entre la GFP-B9L
o la S33Y-\beta-catenina y el
anticuerpo correspondiente y después se añade a la solución
reaccionante la proteína G-Sepharose 4B (Amersham
Pharmacia Biotech), que es capaz de fijarse sobre la IgG, para
adsorber el complejo inmune. Se lava la proteína
G-Sepharose 4B con tampón de lisis A y se añade
tampón de muestra SDS-PAGE para eluir el complejo
inmune. Se realiza la SDS-PAGE empleando el líquido
eluido como muestra, transferida a una membrana de
poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF),
Immobilon-P (Millipore) y se detecta la
S33Y-\beta-catenina mediante
Western blotting (transferencia western) empleando anticuerpo
anti-\beta-catenina (Transduction
Laboratory, cultivado en ratón) y anticuerpo
anti-IgG de ratón marcado con fosfatasa alcalina
como anticuerpos primario y secundario, respectivamente. Tal como se
indica en la figura 2 se detecta una banda con el anticuerpo
anti-\beta-catenina en el
inmunoprecipitado obtenido empleando el anticuerpo
anti-GFP, que se emplea para precipitar la
GFP-B9L. Por lo tanto, este resultado confirma que
también la GFP-B9L está fijada sobre la
\beta-catenina en las células.
Se transfectan los plásmidos para la expresión
de la GFP-B9L y la
S33Y-\beta-catenina, construidos
en el ejemplo 3, solos o junto con células NIH 3T3 de ratón
empleando el Effectene (QIAGEN) y se expresan forzosamente. Se
transfecta también, como control, el factor de expresión GFP llamado
pEGFP-C2 a células NIH 3T3 de ratón y se expresa
forzosamente. Pasadas 24 horas se fijan las células con
formaldehído, se tiñen con anticuerpo
anti-\beta-catenina, se hacen
reaccionar con anticuerpo anti IgG de conejo marcado con
isotiocianato de rodamina (RITC) y se observan por microscopía de
fluorescencia para detectar la
S33Y-\beta-catenina en las
células. Se detecta la GFP-B9L directamente por
observación de la GFP en microscopía de fluorescencia (empleando un
filtro de FITC).
El resultado revela que la
S33Y-\beta-catenina está
distribuida por igual en el citoplasma y en el núcleo dentro de las
células que expresan únicamente la
S33Y-\beta-catenina, mientras que
tanto la S33Y-\beta-catenina y la
GFP-B9L se hallan localizadas en el núcleo en las
células que expresan ambas proteínas. Por lo tanto, se pone de
manifiesto que la proteína B9L tiene la característica de fijarse
sobre la \beta-catenina para localizar la
\beta-catenina en el núcleo. La
GFP-B9L también se localiza en el núcleo por la
expresión de la GFP-B9L sola. Debido al hecho de
que, cuando la GFP se expresa sola, la GFP se distribuye por igual
en el citoplasma y en el núcleo, la localización de la
GFP-B9L en el número se confirma que es
independiente de la GFP fijada y depende de la presencia de la
proteína B9L.
Se inserta el B9L cDNA de longitud completa,
obtenido en el ejemplo 1, en el sitio EcoRI-SalI del
pEGFP-C2 para preparar el plásmido
pEGFP-C2B9L para la expresión en células de
animales, cotransfectado con el plásmido de expresión de la
S33Y-\beta-catenina en células 3T3
de ratón y se expresan forzosamente los plásmidos del modo descrito
anteriormente, detectándose la
S33Y-\beta-catenina en las
células. De modo similar al fragmento de proteína B9L obtenido por
el sistema de dos híbridos, se localizan tanto al
S33Y-\beta-catenina como la
GFP-B9L (longitud completa) en el núcleo. Por lo
tanto se confirma que la proteína B9L de longitud completa se fija
sobre la \beta-catenina y localiza la
\beta-catenina en el núcleo.
Tal como se ha descrito en el ejemplo 1, la
proteína B9L se obtiene como proteína de fijación sobre el dominio
armadillo de la \beta-catenina
(\beta-catenina-arma). Para
determinar qué región de la
\beta-catenina-arma se expresan
fragmentos parciales de la
\beta-catenina-arma del modo
descrito a continuación y se examina la fijación de los
correspondientes fragmentos de \beta-catenina con
la proteína B9L. Se emplea como molde para la PCR el plásmido
anzuelo que codifica a la
\beta-catenina-arma preparado en
el ejemplo 1 para amplificar el DNA que codifica (A) casi la
totalidad de la
\beta-catenina-arma
(correspondiente a los restos de 141 a 664 de la secuencia de
aminoácidos de la \beta-catenina de ratón); (b) la
mitad N-terminal de la
\beta-catenina-arma
(correspondiente a los restos de 141 a 390 de la secuencia de
aminoácidos de la \beta-catenina de ratón, es
decir, las repeticiones de armadillo 1-6); y (c) la
mitad C-terminal de la
\beta-catenina-arma
(correspondiente a los restos de 391 a 664 de la secuencia de
aminoácidos de la \beta-catenina de ratón, es
decir, la repeticiones de armadillo 7-12) empleando
un par de cebadores sentido y antisentido representados en las SEQ
ID NO: 13 y 16; 13 y 14; y 15 y 16, respectivamente. Los productos
amplificados se insertan en el vector pGBT9 para preparar los
correspondientes plásmidos anzuelos.
Los correspondientes plásmidos anzuelos se
cotransfectan con el clon que expresa el fragmento B9L cDNA,
obtenido con el sistema de dos híbridos del ejemplo 1 en la cepa de
levadura HF7C y se examina la unión entre la proteína B9L y los
correspondientes fragmentos parciales de
\beta-catenina a través de la existencia de
actividad de \beta-galactosidasa de los
transformantes. El resultado indica que casi la totalidad de la
región y la mitad N-terminal (repeticiones
armadillo 1-6) de la
\beta-catenina-arma son capaces de
fijarse a la proteína B9L, pero no se puede detectar unión alguna de
la mitad N-terminal de la
\beta-catenina-arma (repeticiones
armadillo 7-12). Por lo tanto, se considera que la
proteína B9L se fija sobre la región N-terminal de
la \beta-catenina-arma
(repeticiones armadillo 1-6).
Tal como se describe en el ejemplo 1, se sugiere
que la proteína B9L se fija sobre la
\beta-catenina-arma a través de la
región de los residuos de 245 a 564 de su secuencia de aminoácidos,
debido al hecho de que se aísla una proteína que tiene los restos de
245 a 564 de la secuencia de aminoácidos de la proteína B9L
representada en la SEQ ID NO: 2 en forma de proteína que se fija
sobre la \beta-catenina-arma. Con
el fin de seguir examinando qué región de la B9L se fija sobre la
\beta-catenina-arma se realiza el
sistema de dos híbridos del modo siguiente. Se amplifican por PCR
los fragmentos de DNA que codifican a los restos
245-291, 292-439,
440-564, 245-439 y
292-564, respectivamente, de la secuencia de
aminoácidos de la proteína B9L, representada en la SEQ ID NO: 2, y
se insertan en el vector pGAD424 (Clontech) para preparar plásmidos
de expresión para el sistema de dos híbridos, que expresen los
correspondientes fragmentos parciales de B9L como proteína de fusión
con el GAL4 AD. Se cotransfecta cada plásmido con el plásmido
anzuelo \beta-catenina-arma,
preparado en el ejemplo 1, en la cepa de levadura HF7C y se examina
la fijación de cada fragmento parcial de la proteína B9L sobre la
\beta-catenina-arma en base a la
presencia o ausencia de actividad de
\beta-galactosidasa en los transformantes. El
resultado indica que los fragmentos de proteína B9L que contienen
los restos 292-439, 245-439 o
292-564 de la secuencia de aminoácidos representada
en la SEQ ID NO:2 son capaces de fijarse sobre la
\beta-catenina-arma, mientras que
no se detecta fijación alguna para el fragmento de los restos
245-291 ni 440-564, que carecen de
los restos 292-439. Por lo tanto se constata que la
proteína B9L se fija sobre la
\beta-catenina-arma en la región
de los restos 292-439 de la secuencia de aminoácidos
representada por la SEQ ID NO: 2.
La región determinada para ser la región de
fijación sobre la \beta-catenina del ejemplo 5,
los restos 292-439 de la secuencia de aminoácidos de
la proteína B9L representada en la SEQ ID NO: 2, corresponde a los
restos 244-410 de la proteína bcl9, que es homóloga
de la proteína B9L. Se estudia si esta región de la proteína bcl9
tiene actividad para fijarse sobre la
\beta-catenina, para ello se aplica un método
similar al descrito en el ejemplo 5.
Específicamente, se amplifica por PCR el
fragmento de DNA que codifica a los restos 244-410
de la secuencia de aminoácidos de la proteína bcl9 humana y se
inserta en el vector pGAD424 (Clontech) para preparar un plásmido de
expresión para el sistema de dos híbridos, que exprese el fragmento
parcial (244-410) de la proteína bcl9 como proteína
de fusión con el GAL4 AD. Se cotransfecta el plásmido con el
plásmido anzuelo
\beta-catenina-arma preparado en
el ejemplo 1 en la cepa de levadura HF7C. Se confirma la actividad
de \beta-galactosidasa en el transformante
resultante. Por lo tanto, se pone de manifiesto que la proteína bcl9
se fija sobre la \beta-catenina en la región de
los restos 244-410 de la secuencia de aminoácidos.
La proteína bcl9 tiene una secuencia que recoge las señales de
localización nuclear y por ello es previsible que la proteína se
fije sobre la \beta-catenina y tenga la actividad
de localizar la \beta-catenina dentro del núcleo.
Por consiguiente, la proteína bcl9, los DNA que codifican a la
proteína bcl9, los anticuerpos que reconocen a la proteína bcl9 y
los oligonucleótidos que contienen una secuencia parcial de
nucleótidos de un DNA que codifica a la proteína bcl9 pueden
utilizarse para propósitos similares en calidad de proteína B9L, DNA
que codifiquen a la proteína B9L, anticuerpos que reconocen a la
proteína B9L y oligonucleótidos que contienen una secuencia parcial
de nucleótidos de un DNA que codifica a la proteína B9L. Se ha
publicado que la proteína bcl9 se expresa de modo anormalmente
elevado en la línea celular CEMO-1, establecida a
partir de un paciente que padece leucemia linfoblástica acuda por
células de precursor B (Willis, T.G. y col., Blood 91, 1871,
1998). Esto confirma la hipótesis de que la proteína bcl9 participa
en el desarrollo tumoral potenciando la activación transcripcional
por el complejo \beta-catenina/TCF mediante la
localización de la \beta-catenina dentro del
núcleo, de modo similar al de la proteína B9L.
La presente invención proporciona una nueva
proteína de localización de la \beta-catenina del
núcleo y un DNA que codifica a la proteína. El uso de la proteína de
localización de la \beta-catenina del núcleo y del
DNA que codifica a la proteína permite el desarrollo de agentes de
diagnóstico y de terapia de enfermedades, tales como el cáncer,
relacionadas con la localización nuclear de la
\beta-catenina.
SEQ ID NO: 13, descripción de secuencia
artificial: cebador sentido de la repetición armadillo 1 (en
dirección a 3' desde Asn141) de la \beta-catenina
de ratón que contiene el sitio de reconocimiento MunI en el extremo
5'.
SEQ ID NO: 14, descripción de secuencia
artificial: cebador antisentido de la repetición armadillo 6 (en
dirección a 5' desde Asp390) de la \beta-catenina
de ratón que contiene el sitio de reconocimiento SalI en el extremo
5'.
SEQ ID NO: 15, descripción de secuencia
artificial: cebador sentido para la repetición armadillo 7 (en
dirección a 3' desde Ala391) de la \beta-catenina
de ratón que contiene el sitio de reconocimiento MunI en el extremo
5'.
SEQ ID NO: 16, descripción de secuencia
artificial: cebador antisentido para la repetición armadillo 12 (en
dirección a 5' desde Glu664) de la \beta-catenina
de ratón, que contiene el sitio de reconocimiento SalI en el extremo
5'.
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína de localización de la
beta-catenina en el núcleo
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 00/287876
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-09-22
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4482
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (4482)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1494
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 960
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(960)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 386
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1933
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 506
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2).. (505)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2215
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (2214)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 738
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido para la repetición 1
del armadillo de beta-catenina de ratón (en
dirección a 3' desde el resto aminoácido 141 Asn) con un sitio MunI
en su extremo 5'
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccaattga actatcagga tgacgcgg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido para la
repetición 6 del armadillo de beta-catenina de ratón
(en dirección a 5' desde el resto aminoácido 390 Asp) con un sitio
SalI en su extremo 5'
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgtcgaca tctgaaaggt ttctgagag
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido para la repetición 7
del armadillo de beta-catenina de ratón (en
dirección a 5' desde el resto aminoácido 391 Ala) con un sitio MunI
en su extremo 5'
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccaattga actatcagga tgacgcgg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido para la
repetición 12 del armadillo de beta-catenina de
ratón (en dirección a 5' desde el resto aminoácido 664 Glu) con un
sitio SalI en su extremo 5'
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgtcgacc tcagacattc ggaataggac
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (38)
1. Una proteína elegida entre el grupo formado
por:
(a) una proteína que contiene la secuencia de
restos aminoácidos de 292 a 439 de la secuencia de aminoácidos
representada por la SEQ ID NO: 2;
(b) la proteína según (a), dicha proteína
contiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:
2 ó 4;
(c) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10;
(d) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10 y 12;
(e) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos, en la que uno o varios aminoácidos se han añadido, han
sufrido deleción o se han sustituido de dicha secuencia de
aminoácidos de la proteína según uno cualquiera de los párrafos de
(a) a (d), y dicha proteína se fija sobre la
\beta-catenina y tiene la actividad de localizar
la \beta-catenina del núcleo;
(f) una proteína que contiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una homología del 60% o más con la secuencia
de aminoácidos de la proteína según uno cualquiera de los párrafos
de (a) a (d) y dicha proteína se fija sobre la
\beta-catenina y tiene la actividad de localizar
la \beta-catenina del núcleo; y
(g) la proteína según los anteriores párrafos
(c) o (d), dicha proteína consta de una secuencia de aminoácidos que
tiene una homología del 60% o más con la secuencia de aminoácidos
representada por la SEQ ID NO: 2 y se fija sobre la
\beta-catenina y tiene la actividad de localizar
la \beta-catenina del núcleo.
2. Un DNA elegido entre el grupo formado
por:
(a) un DNA que codifica a la proteína de la
reivindicación 1;
(b) un DNA que consta de una secuencia de
nucleótidos que contiene los nucleótidos de 874 a 1317 de la
secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1;
(c) un DNA según (b), dicho DNA contiene la
secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 ó 3;
(d) un DNA que codifica a una proteína que se
fija sobre la \beta-catenina y tiene la actividad
de localizar la \beta-catenina dentro del núcleo y
consta de la secuencia de nucleótidos de las siguientes (i) y
(ii):
- (i)
- la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 9; y
- (ii)
- la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 9 y 11;
(e) un DNA que se hibrida con el DNA de uno
cualquiera de los anteriores de (a) a (d) en condiciones
restrictivas (stringent) que codifica a una proteína que se fija
sobre la \beta-catenina del núcleo;
(f) un DNA que consta de una secuencia de
nucleótidos representadas por las SEQ ID NO: 9 y 11 y que consta de
una secuencia de nucleótidos que tiene una homología del 60% o más
con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y codifica a una
proteína que se fija sobre la \beta-catenina y
tiene la actividad de localizar la \beta-catenina
del núcleo; y
(g) un DNA que contiene la secuencia de
nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 11.
3. Un DNA recombinante que puede obtenerse
insertando el DNA según la reivindicación 2 en un vector.
4. Un transformante no humano que puede
obtenerse introduciendo el DNA recombinante según la reivindicación
3 en una célula hospedante.
5. Un procedo para producir la proteína según la
reivindicación 1, que consiste en los pasos de:
(a) cultivar el transformante de la
reivindicación 4 en un medio de cultivo;
(b) producir y acumular la proteína de la
reivindicación 1 en el cultivo; y
(c) recoger la proteína del cultivo.
\newpage
6. Un método de detección o cuantificación
"in vitro", a nivel de mRNA, el nivel de expresión de la
proteína según uno cualquiera de los párrafos de (c) a (g) de la
reivindicación 1, empleando el DNA según la reivindicación 2, o un
oligonucleótido que tenga de 10 a 60 nucleótidos contiguos de la
secuencia de nucleótidos del DNA según la reivindicación 2 o un
derivado del mismo.
7. Un método "in vitro" para
detectar una enfermedad, en el que se aumenta o se disminuye el
nivel de expresión de la proteína según uno cualquiera de los
párrafos de (c) a (g) de la reivindicación 1 en un paciente, por
comparación con un sujeto sano normal, midiendo y comparando el
nivel de expresión de la proteína en un sujeto sano normal y en el
sujeto a estudiar a nivel de mRNA empleando el DNA según la
reivindicación 2 o un oligonucleótido que tenga de 10 a 60
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del DNA según
la reivindicación 2 o un derivado del mismo.
8. Un agente de diagnóstico para una enfermedad
que presenta un nivel de expresión aumentado o disminuido de la
proteína según uno cualquiera de los párrafos de (c) a (g) de la
reivindicación 1 en un paciente, por comparación con un sujeto sano
normal, mediante la medición y comparación del nivel de expresión de
la proteína a nivel de mRNA, dicho agente de diagnóstico contiene el
DNA según la reivindicación 2.
9. Un método "in vitro" para
detectar una mutación de un gen que codifica a la proteína según uno
cualquiera de los párrafos de (c) a (g) de la reivindicación 1
empleando el DNA según la reivindicación 2 o un oligonucleótido que
tenga de 10 a 60 nucleótidos contiguos de la secuencia de
nucleótidos del DNA según la reivindicación 2 o un derivado del
mismo.
10. Un método "in vitro" para
detectar una enfermedad, que es una mutación de un gen que codifica
a la proteína según uno cualquiera de los párrafos de (c) a (g) de
la reivindicación 1 empleando el DNA según la reivindicación 2 o un
oligonucleótido que tenga de 10 a 60 nucleótidos contiguos de la
secuencia de nucleótidos del DNA según la reivindicación 2 o un
derivado del mismo.
11. Un agente de diagnóstico para una enfermedad
que tiene una mutación en un gen que codifica a la proteína según
uno cualquiera de los párrafos de (c) a (g) de la reivindicación 1,
que contiene el DNA según la reivindicación 2.
12. Un método "in vitro" para
inhibir la expresión de la proteína según uno cualquiera de (c) a
(g) de la reivindicación 1 a nivel transcripcional empleando el DNA
según la reivindicación 2, o un oligonucleótido que tenga de 10 a 60
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del DNA según
la reivindicación 2 o un derivado del mismo.
13. Un método "in vitro" para
inhibir la localización nuclear de la
\beta-catenina empleando un oligonucleótido o un
DNA elegido entre el grupo formado por:
(i) el DNA según la reivindicación 2;
(ii) un oligonucleótido que tiene de 10 a 60
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del DNA según
la reivindicación 2 o un derivado del mismo;
(iii) un DNA que codifica a la proteína bcl9
(figura 1; abajo);
(iv) un oligonucleótido que tiene de 10 a 60
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del DNA que
codifica a la proteína bcl9 (figura 1; abajo); y
(v) un oligonucleótido que tiene una secuencia
de nucleótidos complementaria del oligonucleótido de (iv), o un
derivado del mismo.
14. Un agente terapéutico para el cáncer que
contiene el DNA según la reivindicación 2.
15. Un vector para la terapia genética que
contiene el DNA según la reivindicación 2.
16. Un animal transgénico no humano generado por
introducción del DNA según la reivindicación 2.
17. Un método para el uso del animal transgénico
no humano según la reivindicación 16 o un animal transgénico no
humano generado por introducción de un DNA que codifica a la
proteína bcl9 (figura 1; abajo) como animal modelo de
carcinogénesis.
18. Un método para evaluar un agente terapéutico
para el cáncer usando un animal transgénico según la reivindicación
16, o un animal transgénico generado por introducción de un DNA que
codifica a la proteína bcl9 (figura 1; abajo).
19. Un animal no humano genéticamente
deficiente, en el que se ha perdido o se ha reducido la función de
una proteína de fijarse sobre la \beta-catenina y
localizar la \beta-catenina en el núcleo, debido a
la deleción de la totalidad o de una parte del DNA según la
reivindicación 2.
20. Un método "in vitro" para
explorar en busca de una sustancia que inhiba la fijación de la
proteína bcl9 (figura 1; abajo) sobre la
\beta-catenina, que consiste en los pasos
siguientes:
(a) comparar la fijación de la proteína bcl9
(figura 1; abajo) sobre la \beta-catenina en
ausencia o en presencia de la muestra a ensayar; y
(b) seleccionar una sustancia que inhiba la
fijación de la proteína bcl9 sobre la
\beta-catenina de la muestra a ensayar.
21. Un método "in vitro" para
explorar en busca de una sustancia que inhiba la fijación de la
\beta-catenina a la proteína según la
reivindicación 1, que consta de los pasos siguientes:
(a) comparar la fijación de la
\beta-catenina a la proteína en ausencia o en
presencia de una muestra a ensayar; y
(b) seleccionar una sustancia que inhiba la
fijación de la \beta-catenina a la proteína según
la reivindicación 1 de la muestra a ensayar.
22. Un anticuerpo que reconoce a la proteína
según la reivindicación 1.
23. Un método para la detección inmunológica o
la cuantificación de la proteína según la reivindicación 1 empleando
el anticuerpo según la reivindicación 22.
24. Un anticuerpo neutralizador que se fija
sobre la proteína según la reivindicación 1 y, de este modo, inhibe
la actividad de la proteína de fijarse sobre la
\beta-catenina y localizar la
\beta-catenina en el núcleo.
25. Un método "in vitro" para
detectar una enfermedad, en el que se aumenta o se disminuye el
nivel de expresión de la proteína según uno cualquiera de (c) a (g)
de la reivindicación 1 en un paciente por comparación con un sujeto
sano normal, mediante la cuantificación y comparación del nivel de
expresión de la proteína del sujeto sano normal y un sujeto a
estudiar utilizando el anticuerpo según la reivindicación 22.
26. Un agente de diagnóstico que contiene el
anticuerpo según la reivindicación 22, para una enfermedad, en la
que el nivel de expresión de la proteína según una cualquiera de (c)
a (g) de la reivindicación 1 ha aumentado o ha disminuido en un
paciente, por comparación con sujetos sanos normales.
27. Un método "in vitro" para
inhibir la activación transcripcional con un complejo de
\beta-catenina y un factor de transcripción
perteneciente al grupo Lef/Tcf mediante la inhibición de la función
de la proteína según la reivindicación 1 con el uso del anticuerpo
según la reivindicación 24.
28. Un método "in vitro" para
inhibir la activación transcripcional con un complejo de
\beta-catenina y el factor de transcripción
perteneciente al grupo Lef/Tcf inhibiendo la función de la proteína
bcl9 (figura 1; abajo) mediante el uso de un anticuerpo que se fija
sobre la proteína bcl9 y, de este modo, inhibe la actividad de la
proteína bcl9 de fijarse sobre la \beta-catenina y
de localizar la \beta-catenina en el núcleo.
29. Un agente terapéutico para el cáncer que
contiene el anticuerpo según la reivindicación 24.
30. El uso del DNA según la reivindicación 2 o
un oligonucleótido que contiene de 10 a 60 nucleótidos contiguos de
la secuencia de nucleótidos del DNA según la reivindicación 2 o un
derivado del mismo para la preparación de una composición de
diagnóstico destinada a detectar o cuantificar, a nivel de mRNA, el
nivel de expresión de la proteína según uno cualquiera de los
párrafos de (c) a (g) de la reivindicación 1.
31. Uso del DNA según la reivindicación 2 o un
oligonucleótido que tenga de 10 a 60 nucleótidos contiguos de la
secuencia de nucleótidos del DNA según la reivindicación 2 o un
derivado del mismo para la fabricación de una composición de
diagnóstico destinada a detectar una enfermedad, en la que el nivel
de expresión de la proteína según uno cualquiera de (c) a (g) de la
reivindicación 1 se aumenta o se disminuye en un paciente por
comparación con un sujeto sano normal, en el que se mide y se
compara el nivel de la proteína en el sujeto sano normal y en sujeto
a estudiar a nivel de mRNA.
32. Uso del anticuerpo según la reivindicación
22 para la fabricación de una composición de diagnóstico para
detectar una enfermedad, en el que se ha aumentado o disminuido el
nivel de expresión de la proteína según uno cualquier de (c) a (g)
de la reivindicación 1 en un paciente, por comparación con un sujeto
sano normal, en el que se cuantifica y se compara el nivel de
expresión de la proteína de un sujeto sano normal con el de un
sujeto a estudiar.
33. Uso del DNA según la reivindicación 2 o un
oligonucleótido que tenga de 10 a 60 nucleótidos contiguos de la
secuencia de nucleótidos del DNA según la reivindicación 2 o un
derivado del mismo para la fabricación de una composición de
diagnóstico destinada a detectar una mutación en un gen o una
enfermedad que tenga una mutación y un gen que codifica a la
proteína según uno cualquiera de los párrafos de (c) a (g) de la
reivindicación 1.
34. Uso del DNA según la reivindicación 2 o un
oligonucleótido que tiene de 10 a 60 nucleótidos contiguos de la
secuencia de nucleótidos del DNA según la reivindicación 2 o un
derivado del mismo para la fabricación de una composición
farmacéutica destinada a la inhibición "in vivo" de la
expresión de la proteína según uno cualquiera de (c) a (g) de la
reivindicación 1 a nivel transcripcional en terapia genética.
35. Uso de un oligonucleótido o un DNA elegido
entre el grupo formado por:
(i) el DNA según la reivindicación 2;
(ii) un oligonucleótido que contiene de 10 a 60
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del DNA según
la reivindicación 2 o un derivado del mismo;
(iii) un DNA que codifica a la proteína bcl9
(figura 1; abajo);
(iv) un oligonucleótido que contiene de 10 a 60
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del DNA que
codifica a la proteína bcl9 (figura 1; abajo);
(v) un oligonucleótido que tiene una secuencia
de nucleótidos complementaria de la del oligonucleótido de (iv) o un
derivado del mismo;
para la fabricación de una
composición farmacéutica destinada a la inhibición "in
vivo" de la localización nuclear de la
\beta-catenina en terapia
genética.
36. Uso de un oligonucleótido o un DNA elegido
entre el grupo formado por:
(i) el DNA según la reivindicación 2;
(ii) un oligonucleótido que contiene de 10 a 60
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del DNA según
la reivindicación 2 o un derivado del mismo;
(iii) un DNA que codifica a la proteína bcl9
(figura 1; abajo);
(iv) un oligonucleótido que contiene de 10 a 60
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del DNA que
codifica a la proteína bcl9 (figura 1; abajo);
(v) un oligonucleótido que tiene una secuencia
de nucleótidos complementaria de la del oligonucleótido de (iv) o un
derivado del mismo para la fabricación de una composición
farmacéutica destinada al tratamiento de un cáncer.
37. Uso del anticuerpo según la reivindicación
24 para la fabricación de una composición farmacéutica destinada a
la inhibición "in vivo" de la activación transcripcional
por un complejo de \beta-catenina y un factor de
transcripción perteneciente al grupo Lef/Tcf mediante la inhibición
de la función de la proteína según la reivindicación 1.
38. Uso de un anticuerpo que se fija sobre la
proteína bcl9 (figura 1; abajo) y, de este modo, inhibe la actividad
de la proteína bcl9 de fijarse sobre la
\beta-catenina y de localizar la
\beta-catenina en el núcleo para la fabricación de
una composición farmacéutica destinada a la inhibición "in
vivo" de la activación transcripcional por un complejo de
\beta-catenina y un factor de transcripción
perteneciente al grupo Lef/Tcf mediante la inhibición de la función
de la proteína bcl9.
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