ES2264800T3 - Composiciones y metodos para el tratamiento y la diagnosis de trastornos inmunitarios. - Google Patents

Composiciones y metodos para el tratamiento y la diagnosis de trastornos inmunitarios.

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ES2264800T3 ES96908594T ES96908594T ES2264800T3 ES 2264800 T3 ES2264800 T3 ES 2264800T3 ES 96908594 T ES96908594 T ES 96908594T ES 96908594 T ES96908594 T ES 96908594T ES 2264800 T3 ES2264800 T3 ES 2264800T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS INMUNOLOGICOS, ESPECIALMENTE TRASTORNOS RELACIONADOS CON LAS CELULAS T HELPER (TH) Y CELULAS SIMILARES A TH. PRIMERO, SE IDENTIFICAN Y DESCRIBEN LOS GENES QUE SE EXPRESAN DIFERENCIALMENTE DENTRO Y ENTRE LAS CELULAS TH Y LAS SUBPLOBACIONES DE CELULAS TH. SEGUNDO, SE IDENTIFICAN Y DESCRIBEN LOS GENES QUE SE EXPRESAN DIFERENCIALMENTE DENTRO DE SUBPOBLACIONES DE CELULAS TH EN LOS TRASTORNOS RELACIONADOS CON SUBPOBLACIONES DE CELULAS TH. LA MODULACION DE LA EXPRESION DE LOS GENES IDENTIFICADOS Y/O LA ACTIVIDAD DE LOS PRODUCTOS GENICOS IDENTIFICADOS PUEDEN UTILIZARSE TERAPEUTICAMENTE PARA MEJORAR LOS SINTOMAS DE TRASTORNOS INMUNOLOGICOS Y PARA MODULAR LA RESPUESTA DE LAS CELULAS TH, POR EJEMPLO, LA RESPUESTA A UN ANTIGENO. ADEMAS, LOS GENES Y/O LOS PRODUCTOS GENICOS IDENTIFICADOS PUEDEN UTILIZARSE PARA EL DIAGNOSTICO DE INDIVIDUOS QUE PRESENTAN O ESTAN PREDISPUESTOS A DICHOS TRASTORNOS INMUNOLOGICOS. TODAVIA MAS, LOS GENES Y/O LOS PRODUCTOS GENICOS IDENTIFICADOS PUEDEN UTILIZARSE PARA DETECTAR RESPUESTA DE CELULAS TH, POR EJEMPLO, LA RESPUESTA A UN ANTIGENO.

Description

Composiciones y métodos para el tratamiento y la diagnosis de trastornos inmunitarios.
1. Introducción
La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento y diagnóstico de trastornos inmunológicos, especialmente trastornos relacionados con las células T adyuvantes (TH) y trastornos relacionados posiblemente con las células de tipo TH.
La presente invención proporciona métodos de diagnóstico y composiciones para el tratamiento de tales trastornos, y métodos para monitorizar la eficacia de compuestos utilizados en pruebas clínicas.
2. Antecedentes de la invención
Están reconocidos dos tipos distintos de linfocitos T: los linfocitos T citotóxicos (CTLs) CD8^{+} y los linfocitos T adyuvantes (células TH) CD4^{+}. Los CTLs reconocen y destruyen las células que exhiben antígenos extraños en sus superficies. Los precursores CTL exhiben receptores de las células T que reconocen péptidos procesados derivados de proteínas extrañas, en asociación con moléculas del MHC clase I, en las superficies de otras células. Este proceso de reconocimiento desencadena la activación, maduración y proliferación de los CTLs precursores, dando como resultado clones CTL capaces de destruir las células que exhiben los antígenos reconocidos como extraños.
Las células TH están implicadas en formas de respuestas efectoras inmunitarias tanto humorales como mediadas por células. Con respecto a la respuesta inmunitaria humoral, o de anticuerpos, los anticuerpos son producidos por linfocitos B a través de interacciones con las células TH. Específicamente, los antígenos extracelulares son endocitosados por las células presentadoras de antígeno (APCs), procesados, y presentados preferentemente en asociación con moléculas de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) a las células TH CD4^{+} restringidas por el MHC de clase II. Estas células TH activan a su vez los linfocitos B, dando como resultado la producción de anticuerpos.
La respuesta inmunitaria mediada por las células, o celular, funciona para neutralizar microbios que habitan en lugares intracelulares. Los antígenos extraños, tales como por ejemplo los antígenos víricos, se sintetizan dentro de las células infectadas y se presentan en las superficies de dichas células en asociación con moléculas de clase I del MHC. Esto conduce luego a la estimulación de los CTLs CD8^{+} de clase I restringidos por el MHC.
Algunos agentes, tales como micobacterias, que causan la tuberculosis y la lepra, son capturados por macrófagos y procesados en vacuolas que contienen enzimas proteolíticas y otras sustancias tóxicas. Si bien estos componentes macrófagos son capaces de destruir y digerir la mayoría de los microbios, agentes tales como las micobacterias sobreviven y se multiplican. Los antígenos de los agentes son procesados, sin embargo, por los macrófagos y presentados preferentemente en asociación con moléculas de clase II del MHC a las células TH CD4^{+} de clase II restringidas por el MHC ^{+}, que son estimuladas para secretar interferón-gamma, el cual, a su vez, activa los macrófagos. Dicha activación da como resultado la exhibición por las células de una capacidad bactericida incrementada.
Las células TH se componen de al menos dos subpoblaciones distintas, denominadas subpoblaciones de células TH1 y TH2. Pruebas existentes sugieren que los subtipos TH1 y TH2 representan poblaciones de células TH extremadamente polarizadas. Si bien tales subpoblaciones fueron descubiertas originalmente en sistemas murinos (revisado en Mosmann, T.R. y Coffmann, R.L., 1989, Ann. Rev. Immunol. 7: 145), la existencia de subpoblaciones semejantes a los de tipo TH1 y TH2 ha sido establecida también en humanos (Del Prete, A.F. et al., 1991, J. Clin. Invest. 88: 346; Wiernenga, E.A. et al., 1990, J. Imm. 144: 4641; Yamamura, M. et al., 1991, Science 254: 277; Robinson, D. et al., 1993, J. Allergy Clin. Imm. 92: 313). Si bien las células semejantes a los de tipo TH1 y semejantes a los de tipo TH2 pueden representar las subpoblaciones de células TH más extremadamente polarizadas, otras subpoblaciones de células TH, tales como las células TH0 (Firestein, G.S. et al., 1989, J. Imm. 143, 518) representan células TH que tienen características de las subpoblaciones de células TH1 y TH2.
Las células semejantes a los de tipo TH1 y semejantes a los de tipo TH2 parecen funcionar como parte de las diferentes funciones efectoras del sistema inmunitario (Mosmann, T.R. y Coffmann, R.L., 1989, Ann. Rev. Imm. 7: 145). Específicamente, las células semejantes a los de tipo TH1 dirigen el desarrollo de la inmunidad mediada por las células, desencadenando las defensas del hospedador mediadas por los fagocitos, y están asociadas con una hipersensibilidad retardada. De acuerdo con ello, las infecciones con microbios intracelulares tienden a inducir respuestas de tipo TH1. Las células TH2 impulsan respuestas inmunitarias humorales, que están asociadas por ejemplo con la defensa contra ciertos parásitos helmínticos, y están involucradas en respuestas de anticuerpos y alérgicas.
Se ha observado que la capacidad de los diferentes tipos de células TH para impulsar respuestas efectoras inmunitarias diferentes es debida a las combinaciones exclusivas de citoquinas que se expresan dentro de una subpoblación de células TH particular. Por ejemplo, se sabe que las células TH1 secretan interleuquina-2 (IL-2), interferón-gamma (IFN-gamma), y linfotoxina, mientras que las células TH2 secretan interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-5 (IL-5) e interleuquina-10 (IL-10).
Se cree que las subpoblaciones TH1 y TH2 proceden de un precursor natural (inexpertas) común (al que se hace referencia como THP). Por ejemplo, las células naturales CD4^{+} de los ratones que expresan un solo receptor transgénico de células T pueden verse inducidas a evolucionar al tipo de células TH1 o TH2. Las condiciones de estimulación de antígenos, con inclusión de la naturaleza y cantidad de antígeno implicadas, el tipo de células presentadores de antígeno y el tipo de moléculas hormonales y de citoquinas presentes parecen representar todos ellos determinantes del patrón de diferenciación de TH1 frente a TH2, perteneciendo quizás el papel decisivo a las citoquinas presentes. Con una serie tan compleja de determinantes posibles, una contabilidad completa de los factores exactos importantes en la conducción de la diferenciación entre TH1 y TH2 se desconoce en gran parte hasta ahora.
Por otra parte, se ha observado recientemente que, además de las células TH CD4^{+}, los CTLs CD8^{+} pueden, en ciertas condiciones, exhibir también perfiles de citoquinas semejantes a los de tipo TH1 o semejantes a los de tipo TH2 (Seder, R.A. et al., 1995, J. Exp. Med. 181: 5-7; Manetti, R. et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 2207-2211; Maggi, E. et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 489-495). Si bien el papel funcional preciso de tales células CD8^{+} semejantes a los de tipo TH se desconoce actualmente, estas subpoblaciones de células parecen tener gran relevancia para las respuestas inmunitarias contra agentes infecciosos tales como virus y parásitos intracelulares.
Una vez que se expanden las subpoblaciones TH1 y TH2, los tipos de células tienden a regularse negativamente uno a otro mediante las acciones de las citoquinas exclusivas de cada uno. Por ejemplo, el IFN-gamma producido por las células TH1 regula negativamente las células TH2, mientras que la IL-10 producida por las células TH2 regula negativamente las células TH1. Además, las citoquinas producidas por TH1 y TH2 antagonizan las funciones efectoras recíprocas (Mosmann, T.R. y Moore, 1991, Immunol. Today 12: 49).
El fracaso en el control o la resolución de un proceso infeccioso es resultado a menudo de una respuesta inmunitaria inadecuada, más bien que insuficiente, y puede ser la base de una diversidad de trastornos inmunológicos distintos. Trastornos de este tipo pueden incluir por ejemplo afecciones atópicas (es decir, afecciones alérgicas mediadas por IgE) tales como asma, alergia, con inclusión de rinitis alérgica, dermatitis, con inclusión de psoriasis, susceptibilidades a patógenos, enfermedad inflamatoria crónica, autoinmunidad organoespecífica, rechazo de injertos y enfermedad de rechazo inverso. Por ejemplo, formas incurables de leishmaniasis humana y murina son resultado de respuestas inmunitarias fuertes pero contraproducentes dominadas por células semejantes a los de tipo TH2. La lepra lepromatosa parece caracterizar también una respuesta semejante de TH2 prevaleciente, pero inadecuada.
Es posible que otro ejemplo pueda ser la infección por el HIV. En este caso, se ha sugerido que un descenso en la relación de células semejantes a los de tipo TH1 con respecto a otras subpoblaciones de células TH puede jugar un papel crítico en la progresión hacia los síntomas de enfermedad. Adicionalmente, se ha indicado que, al menos in vitro, los clones semejantes a los de tipo TH2 parecen ser mantenedores más eficientes de la replicación del virus HIV que los clones semejantes a los de tipo TH1.
Adicionalmente, si bien las respuestas inflamatorias mediadas por TH1 para muchos microorganismos patógenos son beneficiosas, tales respuestas a los auto-antígenos son usualmente deletéreas. Se ha sugerido que la activación preferencial de las respuestas semejantes a los de tipo TH1 es fundamental para la patogénesis de enfermedades autoinmunológicas inflamatorias humanas tales como la esclerosis múltiple y la diabetes dependiente de insulina. Por ejemplo, las citoquinas de tipo TH1 predominan en el fluido cerebroespinal de los pacientes con esclerosis múltiple, las pancreasas de los pacientes de diabetes dependiente de insulina, las glándulas tiroideas de la tiroiditis de Hashimoto, y el intestino de los pacientes con enfermedad de Crohn, lo que sugiere que tales pacientes establecen una respuesta semejante a TH1, no semejante a TH2, al o a los antígenos implicados en la etiopatogénesis de tales trastornos.
Un objetivo primario, por razones tanto diagnósticas como terapéuticas, sería por consiguiente la posibilidad de identificar, aislar y/o direccionar miembros de una subpoblación particular de células TH. Para alcanzar dicho objetivo es necesaria la capacidad de identificar aquellos genes que se expresan diferencialmente dentro de y/o entre tales subpoblaciones de células TH. Hasta la fecha, las investigaciones se han enfocado en la expresión de un número limitado de citoquinas y receptores de citoquinas específicos conocidos en la población de células TH. Sin embargo, las citoquinas ejercen efectos sobre otros tipos de células además de subpoblaciones de células TH específicas, es decir, exhiben una diversidad de efectos pleiotrópicos. Por tanto, sería beneficioso identificar marcadores fiables (v.g., secuencias génicas) de subpoblaciones de células TH cuyos efectos sean específicos de subpoblaciones de células TH, v.g., que, al contrario de las citoquinas secretadas, sean específicos de subpoblaciones de células
TH.
Lederer et al. (J. Immunol. 1994, vol. 152, 77-86) han medido la expresión de construcciones promotor-CAT para demostrar que la expresión diferencial de IL-2 e IL-4 en las células TH1 y TH2 está controlada transcripcionalmente, y ligada a la ausencia de transcripción de IL-2 en las células TH2 activadas a un fracaso para generar proteínas de fijación de promotores del gen de IL-2, particularmente NF-kappa B en el núcleo. Ramsdell et al. (Int. Immunol. 1994, vol. 6, 1545-1553) han demostrado que las células TH1 clonadas expresan niveles altos de Fas-L, el ligando para Fas (CD95), mientras que las células TH1 clonadas expresan niveles bajos. Estos niveles de expresión están correlacionados con la capacidad relativa de los tipos de células TH1 y TH2 para sufrir muerte celular inducida por activación, lo que parece no estar relacionado con la presencia de diversas citoquinas.
3. Sumario de la invención
La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento de trastornos inmunológicos, especialmente trastornos relacionados con las células T adyuvantes (TH) y trastornos relacionados posiblemente con los de las células TH. En primer lugar, se identifican y describen genes que se expresan diferencialmente dentro de y entre las células TH y subpoblaciones de células TH. En segundo lugar, se identifican y describen genes que se expresan diferencialmente dentro de subpoblaciones de células TH en trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. La modulación de la expresión de los genes identificados y/o de la actividad de los productos génicos identificados puede utilizarse terapéuticamente para mejorar síntomas de trastornos inmunológicos y modular la sensibilidad de las células TH por ejemplo la respuesta a un antígeno. Adicionalmente, los genes y/o productos génicos identificados pueden utilizarse para diagnosticar individuos que exhiben o están predispuestos a dichos trastornos inmunológicos. Aún más, los genes y/o productos génicos identificados pueden utilizarse para detectar la sensibilidad de las células TH por ejemplo la sensibilidad a un antígeno.
"Expresión diferencial" tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a diferencias tanto cuantitativas como cualitativas en los patrones de expresión temporal y/o celular de los genes dentro de y entre las subpoblaciones de células TH. Los genes expresados diferencialmente pueden representar "genes de huella dactilar" y/o "genes diana".
"Gen de huella dactilar", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un gen expresado diferencialmente cuyo patrón de expresión puede utilizarse como parte de una evaluación de pronóstico o diagnóstico de trastornos inmunológicos, v.g., trastornos relacionados con las células TH o que, alternativamente, puede utilizarse en métodos para la identificación de compuestos útiles en el tratamiento de dichos trastornos. Por ejemplo, el efecto del compuesto sobre la expresión del gen de huella dactilar exhibida normalmente en conexión con el trastorno puede utilizarse para evaluar la eficacia del compuesto como tratamiento para dicho trastorno, o puede, adicionalmente, utilizarse para monitorizar pacientes sometidos a evaluación clínica para el tratamiento de tales trastornos.
"Patrón de huella dactilar", como se utiliza en esta memoria, hace referencia al patrón generado cuando se determina el patrón de expresión de una serie (que puede comprender desde dos hasta la totalidad de los genes de huella dactilar que existen para un estado dado) de los genes de huella dactilar. Un patrón de huella dactilar puede utilizarse en los mismos métodos de diagnóstico, pronóstico, e identificación de compuestos que la expresión de un solo gen de huella dactilar.
"Gen diana", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un gen implicado en trastornos inmunológicos expresado diferencialmente, v.g., trastornos relacionados con las células TH, tal que la modulación del nivel de expresión del gen diana o de la actividad de un producto del gen diana puede actuar para mejorar el trastorno inmunológico. Los compuestos que modulan la expresión de un gen diana o la actividad del producto del gen diana pueden utilizarse en el tratamiento de trastornos inmunológicos.
Adicionalmente, los "genes de ruta" se definen por la capacidad de sus productos génicos para interaccionar con productos génicos implicados en trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH y/o para interaccionar con productos génicos que están implicados en la diferenciación y función efectora de las subpoblaciones de células TH. Los genes de ruta pueden exhibir también características de genes diana y/o de genes de huella dactilar.
Aunque los genes diana, genes de huella dactilar y/o genes de ruta descritos en esta memoria pueden expresarse diferencialmente dentro de y/o entre subpoblaciones de células TH, y/o pueden interaccionar con productos génicos de subpoblaciones de células TH, los genes pueden estar implicados también en mecanismos importantes para procesos inmunológicos adicionales.
La invención abarca los nucleótidos siguientes, células hospedadoras que expresan dichos nucleótidos y los productos de expresión de tales nucleótidos: (a) nucleótidos que codifican un producto del gen 200 de mamífero expresado diferencialmente que incluye un producto del gen 200 humano y murino; (b) nucleótidos que codifican porciones de un producto del gen 200 expresado diferencialmente y/o de camino que corresponde a sus dominios funcionales, y los productos polipeptídicos codificados por tales secuencias de nucleótidos, y en los cuales, en el caso de productos génicos de tipo receptor, tales dominios incluyen, pero sin carácter limitante, dominios extracelulares (ECD), dominios transmembranales (TM) y dominios citoplásmicos (CD); (c) nucleótidos que codifican mutantes de un producto del gen 200 expresado diferencialmente, en los cuales la totalidad o parte de uno de sus dominios está delecionada o alterada, y que, en el caso de productos génicos de tipo receptor, tales mutantes incluyen, pero sin carácter limitante, receptores solubles en los cuales la totalidad o una porción del TM esta delecionada, y receptores no funcionales en los cuales la totalidad o una porción de CD está delecionada; y (d) nucleótidos que codifican proteínas de fusión que contienen un producto del gen 200 expresado diferencialmente o uno de sus dominios fusionado a otro polipéptido.
La presente invención incluye también los productos de tales genes de huella dactilar, genes diana, y genes de ruta así como anticuerpos para tales productos génicos. Adicionalmente, se describen también la modificación por ingeniería genética y el uso de modelos basados en células y en animales de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH a los cuales pueden contribuir tales productos génicos.
La presente invención se refiere también a métodos para la evaluación de pronóstico y diagnóstico de diversos trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, y para la identificación de individuos que están predispuestos a tales trastornos. Adicionalmente, la invención proporciona métodos para la evaluación de la eficacia de fármacos para trastornos inmunológicos, y la monitorización del progreso de pacientes implicados en pruebas clínicas para el tratamiento de tales trastornos.
Los trastornos relacionados con las subpoblaciones de células TH descritos en esta memoria pueden incluir por ejemplo trastornos afines a los de las células TH1 o semejantes a los de tipo TH1 o pueden, alternativamente, incluir trastornos afines a los de las células TH2 o semejantes a los de tipo TH2. Ejemplos de trastornos relacionados con TH1 o semejantes a los de tipo TH1 incluyen enfermedades y trastornos inflamatorios crónicos, tales como la enfermedad de Crohn, artritis reactiva, con inclusión de la enfermedad de Lyme, diabetes dependiente de insulina, autoinmunidad organoespecífica, con inclusión de esclerosis múltiple, tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Grave, dermatitis de contacto, psoriasis, rechazo de injertos, enfermedad de rechazo inverso y sarcoidosis. Ejemplos de trastornos relacionados con TH2 o semejantes a los de tipo TH2 incluyen afecciones atópicas, tales como asma y alergia, con inclusión de rinitis alérgica, alergias gastrointestinales, con inclusión de alergias alimentarias, eosinofilia, conjuntivitis, nefritis glomerular, ciertas susceptibilidades a patógenos tales como infecciones helmínticas (v.g., leishmaniasis) y ciertas infecciones víricas, con inclusión de HIV, e infecciones bacterianas, con inclusión de tuberculosis y lepra
lepromatosa.
Se contempla adicionalmente que los métodos y composiciones descritos en esta memoria pueden utilizarse en la evaluación de pronóstico y diagnóstico de trastornos que implican otras células inmunitarias, con inclusión de los CTLs CD8^{+}, que exhiben patrones de expresión génica y/o actividad de subpoblaciones de células semejantes a los de tipo TH1. Se contempla además que los métodos y composiciones descritos en esta memoria pueden utilizarse en la mejora de los síntomas causados por trastornos que implican dichas células inmunitarias, especialmente dichos CTLs CD8^{+}, que exhiben patrones de expresión génica y/o actividad de subpoblaciones de células semejantes a los de tipo TH.
La invención proporciona adicionalmente métodos para la identificación de compuestos que modulan la expresión de genes o de actividad de productos génicos implicados en trastornos y procesos relacionados con subpoblaciones de células TH, pertinentes a la diferenciación, mantenimiento y/o función efectora de las subpoblaciones. Aún más, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH que pueden implicar por ejemplo la administración de tales compuestos moduladores a individuos que exhiben síntomas de o tendencias a trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Adicionalmente, el tratamiento puede dar como resultado la estimulación o el agotamiento de una o más de las subpoblaciones de células
TH.
"Estimulación", como se utiliza en esta memoria, puede hacer referencia a un aumento eficaz en el número de células pertenecientes a una subpoblación de células TH por la vía por ejemplo de la proliferación de células de tales subpoblaciones de células TH. El término puede hacer referencia también a un aumento en la actividad de células pertenecientes a una subpoblación de células TH, como se evidenciaría por ejemplo por un aumento por célula en la expresión del patrón de citoquinas específico de la subpoblación de células TH.
"Agotamiento", como se utiliza en esta memoria, puede hacer referencia a una reducción eficaz en el número de células pertenecientes a una subpoblación de células TH, por la vía por ejemplo de una reducción en la proliferación de células de tales subpoblaciones de células TH. El término puede hacer referencia también a una disminución en la actividad de células pertenecientes a una subpoblación de células TH, como se evidenciaría por ejemplo por una disminución por célula en la expresión del patrón de citoquinas específico de la subpoblación de células TH.
La invención está basada, en parte, en estrategias de búsqueda sistemática que implican paradigmas que utilizan células semejantes a los de tipo TH0, TH1, TH2, semejantes a los de tipo TH1 y semejantes a los de tipo TH2. en sistemas que mimetizan la actividad del sistema inmunitario o trastornos inmunológicos, acoplados con ensayos de expresión de genes sensibles y de alta capacidad, para identificar genes expresados diferencialmente dentro de y/o entre subpoblaciones de células TH. En contraste con los enfoques que evalúan meramente la expresión de un solo producto génico conocido que se supone juega un papel en algún proceso o trastorno relacionado con las células inmunitarias, las estrategias y los ensayos de búsqueda utilizados en esta invención permiten la identificación de todos los genes, sean conocidos o nuevos, que se expresan diferencialmente dentro de y entre subpoblaciones de células TH, haciendo posible al mismo tiempo la caracterización de su regulación temporal y función en la respuesta de las células TH y/o en los trastornos mediados por las células TH. Este enfoque y evaluación exhaustivos permiten el descubrimiento de nuevos genes y productos génicos, así como la identificación de una constelación de genes y productos génicos (sean nuevos o conocidos) implicados en nuevos caminos (v.g., caminos de modulación) que juegan un papel importante en las respuestas inmunitarias mediadas por las células TH y trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Así pues, la presente invención hace posible la identificación y caracterización de dianas útiles para pronóstico, diagnóstico, monitorización, diseño racional de fármacos, y/o intervención terapéutica de trastornos del sistema inmunitario.
Los Ejemplos descritos en las Secciones 6 a 8, siguientes, demuestran el uso con éxito de las estrategias de búsqueda de la invención para identificar genes que se expresan diferencialmente entre y/o dentro de subpoblaciones de células TH. La Sección 9 describe la clonación con éxito de un homólogo humano de uno de los genes identificados (el gen 200).
Se ha demostrado que el gen 200 murino se expresa diferencialmente dentro de la subpoblación de células TH1. Específicamente, este gen se expresa a niveles muchas veces superiores en las subpoblaciones de células TH1 que en las subpoblaciones de células TH2.
Una realización "C1" de la presente invención es una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:
(a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23;
(b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción de cDNA del clon contenido en los clones de E. coli depositados como American Type Culture Collection (ATCC) Número de Acceso 69967, Agricultural Research Culture Collection (NRRL) Número de Acceso B-21395, NRRL Número de Acceso B-21415, o NRRL Número de Acceso B-21457, en donde dicha inserción de cDNA se hibrida en condiciones severas "S" a una molécula de ácido nucleico que es el complemento de un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23, y en donde dichas condiciones severas "S" comprenden hibridación a DNA fijado a un filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio al 7% (SDS), EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C; o
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24.
Una realización adicional "C2" de la presente invención es una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno de los dominios peptídicos siguientes representados en Fig. 2 (SEQ ID NO: 10) o Fig. 24 (SEQ ID NO: 24): (a) dominio de secuencia señal; (b) dominio extracelular; (c) dominio extracelular maduro; (d) dominio de serie variable de tipo Ig; (e) dominio transmembranal; o (f) dominio citoplásmico.
Una realización adicional "C5" de la presente invención es una molécula de ácido nucleico aislada que se hibrida a la molécula de ácido nucleico de la realización "C1" (a) o "C1" (b) o su complemento en condiciones severas "S" (descritas arriba bajo la realización "C1" (b)) con condiciones de lavado que son opcionalmente 0,2 x SSC/0,1% SDS a 42°C.
Una realización adicional "C6" de la presente invención es una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que carece de al menos uno de los dominios peptídicos siguientes representados en Fig. 2 (SEQ ID NO: 10) o Fig. 24 (SEQ ID NO: 24): (a) dominio de secuencia señal; (b) dominio extracelular; (c) dominio extracelular maduro; (d) dominio extracelular Ig; (e) dominio transmembranal; o (f) dominio citoplásmico; en donde el polipéptido está codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1, o una porción del mismo.
Una realización adicional "C9" de la presente invención es una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las realizaciones "C1", "C2", "C5" o "C6" y un polipéptido heterólogo.
Una realización adicional "C11" de la presente invención es un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las realizaciones "C1", "C2", "C5", "C6", "C9". Realizaciones adicionales "C13" y "C14" son, respectivamente, una célula hospedadora que comprende el vector de la realización "C11", o una célula hospedadora modificada por ingeniería genética que contiene la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las realizaciones "C1", "C2", "C5", "C6", o "C9". Una realización "C15" es la célula hospedadora de la invención "C14" en asociación operativa con un elemento regulador de secuencia nucleotídica que controla la expresión de la secuencia nucleotídica en la célula hospedadora.
Una realización adicional "C16" de la presente invención es un método para producir un polipéptido codificado por el ácido nucleico de una cualquiera de las realizaciones "C1", "C2", "C5", "C6", o "C9", que comprende: cultivar la célula hospedadora de la realización "C13", "C14" o "C15", de tal modo que el polipéptido se exprese en el cultivo celular, y recuperar el polipéptido del cultivo celular.
Una realización adicional "C17" de la presente invención es un polipéptido aislado que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24; (b) la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23; o (c) la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción de cDNA descrita arriba bajo la realización "C1" (b).
Una realización adicional "C18" de la presente invención es un polipéptido aislado que comprende: (a) los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 1-20, 1-192, 1-214, 21-192, 21-214, 21-281, 193-214, 193-281 y/o 215-281; y/o (b) los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 1-20, 1-200, 1-224, 21-200, 21-224, 21-301, 30-128, 201-224, 201-301, y 225-301.
Una realización adicional "C21" de la presente invención es un polipéptido aislado que está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en las condiciones severas "S" (descritas arriba bajo la realización "C1" (b)) al complemento de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24.
Una realización adicional "C22" de la presente invención es una proteína de fusión que comprende el polipéptido de una cualquiera de las realizaciones "C17", "C18" o "C21" y un polipéptido no emparentado.
Una realización adicional "C24" de la presente invención es un anticuerpo o fragmento de fijación de epítope del mismo que se fija específicamente al polipéptido de una cualquiera de las realizaciones "C17", "C18" o
"C21".
Una realización adicional "C30" de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de fijación de epítope del mismo de la realización "C24" y un vehículo fisiológicamente aceptable.
Una realización adicional "C31" de la presente invención es un polipéptido de fusión de anticuerpos que comprende una región Fc de anticuerpo enlazada a: (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24, o la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción de cDNA arriba descrita bajo la realización "C1" (b); los residuos de aminoácidos 1-20, 1-200, 1-224, 21-200, 21-224, 21-301, 30-128, 201-224, 201-301 y/o 225-301 de SEQ ID NO: 24; o (c) los residuos de aminoácidos 1-20, 1-192, 1-192, 1-214, 21-192, 21-214, 21-281, 193-214, 193-281 y/o 215-281 de SEQ ID NO: 10.
Una realización adicional "C32" de la presente invención es un polipéptido de fusión de anticuerpos que comprende una región Fc de anticuerpo enlazada a una secuencia de aminoácidos que es codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en las condiciones severas "S" (descritas arriba bajo la realización "C1" (b)) al complemento de la molécula de ácido nucleico constituida por SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23.
Una realización adicional "C35" de la presente invención es un método para detectar la expresión del gen 200 en una muestra que comprende: detectar la presencia de un producto del gen 200 o una molécula de RNA que codifica el producto del gen 200, en donde el producto del gen 200 comprende: (a) la secuencia de aminoácidos descrita bajo la realización "C17"(a), "C17"(b) o "C17"(c); (b) los residuos de aminoácidos descritos bajo "C18"(a) o "C18"(b); o (c) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en las condiciones severas "S" (descritas arriba bajo la realización "C1"(b)) a (i) el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8, o una porción del mismo; o (ii) el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23, o una porción del mismo.
Una realización adicional "C40" de la presente invención es un método para diagnosticar un trastorno relacionado con una subpoblación de las células TH que comprende detectar, en una muestra de un paciente que se sospecha padece el trastorno, el nivel de un producto del gen 200 o una molécula de RNA que codifica el producto del gen 200 de tal modo que si el nivel detectado difiere del existente en una muestra de control, se diagnostica un trastorno relacionado con una subpoblación de células TH, en el cual el producto del gen 200 es:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;
(b) la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23;
(c) la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción de cDNA descrita arriba bajo la realización "C1"
(b);
(d) los residuos de aminoácidos 1-20, 1-200, 30-128, 201-224 o 225-301 de SEQ ID NO: 24; o
(e) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en las condiciones severas "S" (descritas arriba bajo la realización "C1"(b)) al complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23.
Una realización adicional "C46" de la presente invención es un método para identificar un compuesto de ensayo que se fija a un producto del gen 200 y/o modula la actividad de un producto del gen 200, que comprende:
(a) poner en contacto un compuesto de ensayo con un producto del gen 200 durante un tiempo suficiente para fijarse a y formar un complejo producto del gen 200/compuesto;
(b) retirar el compuesto de ensayo no fijado; y
(c) detectar el complejo, en donde el producto del gen 200 comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos descrita arriba bajo la realización "C17"(a), "C17"(b) o "C17"(c);
(ii)
la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en las condiciones severas "S" (descritas arriba bajo la realización "C1"(b)) al complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23; o
\newpage
(iii)
la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en las condiciones severas "S" (descritas arriba bajo la realización "C1"(b)) al complemento de la inserción de cDNA descrita arriba bajo la realización "C1"(b); de tal modo que si se detecta un compuesto del gen 200/producto en (c), se identifica un compuesto de ensayo que se fija a un producto del gen 200.
La identificación de marcadores específicos de subpoblaciones de las células TH puede utilizarse en el tratamiento de cierto número de trastornos inmunológicos, especialmente trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Por ejemplo, pueden utilizarse marcadores para la subpoblación TH2 para mejorar afecciones que implican una respuesta inmunitaria IgE inadecuada, con inclusión, pero sin carácter limitante, de los síntomas que acompañan a afecciones atópicas tales como alergia y/o asma. Los anticuerpos de tipo IgE son producidos por células B estimuladas que requieren, al menos en parte, IL-4 producida por la subpoblación de células TH2. Por esta razón, un tratamiento que reduce la concentración efectiva de IL-4 secretada, v.g., por reducción de la actividad o número de células TH2, dará como resultado una reducción en el nivel de IgE circulante, conduciendo, a su vez, a la mejora o eliminación de las afecciones atópicas. Cualquiera de los productos génicos específicos de TH2 descritos en esta memoria puede, por consiguiente, utilizarse como diana para reducir o agotar el número y/o la actividad de las células de la subpoblación de células TH2 para el tratamiento de dichas afecciones.
La identificación de los marcadores específicos de la subpoblación de células TH puede utilizarse adicionalmente en el tratamiento de un trastorno relacionado con la subpoblación de células TH1. Por ejemplo, pueden utilizarse marcadores para la subpoblación de células TH1 para mejorar afecciones que implican una respuesta inmunitaria inadecuada mediada por las células, que incluye, pero sin carácter limitante, trastornos inflamatorios y autoinmunológicos crónicos. Adicionalmente, los animales transgénicos que sobreexpresan o expresan falsamente tales secuencias génicas y/o animales transgénicos "con un gen desactivado" ("knockout") que exhiben poca o ninguna expresión de tales secuencias pueden utilizarse como modelos animales para trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH.
El Ejemplo presentado más adelante en la Sección 11 describe la producción de animales transgénicos en el gen 200.
Las secuencias de genes específicas de la subpoblación de células TH1 y/o productos génicos tales como el gen 200 (cuyo homólogo murino codifica un producto de gen transmembranal de 280 aminoácidos, y cuyo homólogo humano codifica un producto de gen transmembranal de 301 aminoácidos, los dos cuales son miembros de la superfamilia Ig) pueden, por tanto, ser adecuadas para la mejora de tales trastornos relacionados con la subpoblación de células TH1. El producto del gen 200 puede ser particularmente adecuado para un propósito de este tipo en el sentido de que no sólo está restringido a la subpoblación de células TH1, sino que el producto del gen 200 de la superfamilia Ig está, adicionalmente, fijado a la membrana. Por esta razón, ligandos naturales, derivados de ligandos naturales y anticuerpos que se fijan al producto del gen 200 pueden utilizarse para reducir el número de células TH1 presentes por separación física de tales células con respecto a otras células en una población, o, alternativamente, por direccionamiento de la destrucción específica de las células TH1 o inhibición de la proliferación de dichas células TH1. Adicionalmente, compuestos tales como secuencias del gen 200 o productos génicos tales como productos solubles del gen 200, pueden utilizarse para reducir el nivel de actividad de las células TH2, produciendo con ello la mejora de los trastornos relacionados con la subpoblación de células TH1. Por ejemplo, los compuestos pueden competir con el ligando endógeno (es decir, natural) para el producto del gen 200. La reducción resultante en la cantidad de proteína transmembranal del gen 200 fijada al ligando modulará la actividad celular TH2. Las proteínas o péptidos solubles, tales como péptidos que comprenden el dominio extracelular, o porciones (tales como por ejemplo la porción Ig) y/o análogos de los mismos, del producto del gen 200, con inclusión por ejemplo de proteínas de fusión solubles tales como proteínas de fusión provistas de colas Ig, pueden ser particularmente útiles para este propósito. El Ejemplo presentado en la Sección 10, más adelante, describe la construcción y expresión de construcciones y proteínas de fusión con Ig del producto del gen 200.
3.1 Definiciones
La expresión "subpoblación de células TH", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una población de células TH que exhibe un patrón de expresión génica (v.g., un patrón discreto de citoquinas y/o receptor de otras moléculas de la superficie celular) y actividad que son distintos del patrón de expresión y actividad de otras células TH. Tales subpoblaciones de células TH pueden incluir, pero sin carácter limitante, subpoblaciones TH0, TH1, y TH2, que se utilizarán frecuentemente en esta memoria, para claridad y ejemplo, y sin carácter de limitación, como subpoblaciones representativas de células TH.
La expresión "subpoblación de células semejantes a los de tipo TH" (v.g., "semejantes a los de tipo TH1" o "semejantes a los de tipo TH2"), como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto hacer referencia no sólo a una población de células TH CD4^{+} que tienen las propiedades arriba descritas, para una subpoblación de células TH, sino que hace referencia también a células CD4^{-}, que incluyen CTLs CD8^{+}, que exhiben patrones de expresión de citoquinas semejantes a TH.
"Expresión diferencial", como se utiliza en esta memoria, se refiere a diferencias tanto cuantitativas como cualitativas en los patrones de expresión temporal y/o celular de los genes.
"Gen diana", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un gen expresado diferencialmente implicado en trastornos inmunológicos y/o en la diferenciación, mantenimiento y/o función efectora de subpoblaciones de células TH, tal que la modulación del nivel de expresión del gen diana o de la presencia y/o actividad del producto del gen diana puede por ejemplo actuar para dar como resultado el agotamiento o la represión específicos, o, alternativamente, la estimulación o el aumento de una o más subpoblaciones de células TH, conduciendo a su vez a la mejora de los síntomas de trastornos inmunológicos, v.g., trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Un gen diana puede exhibir también características de gen de huella dactilar y/o de gen de ruta.
"Gen de huella dactilar", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un gen expresado diferencialmente cuyos patrón de expresión de mRNA, nivel de proteínas y/o actividad pueden utilizarse como parte de un pronóstico o diagnóstico en la evaluación de trastornos inmunológicos, v.g., trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, o que, alternativamente, pueden utilizarse en métodos para identificación de compuestos útiles para el tratamiento de trastornos de este tipo, mediante por ejemplo evaluación del efecto del compuesto sobre la expresión de genes de huella dactilar exhibida normalmente en relación con la enfermedad. Un gen de huella dactilar puede exhibir también características de gen diana y/o gen de ruta.
"Patrón de huella dactilar", como se utiliza en esta memoria, hace referencia al patrón generado cuando se determina el patrón de expresión de mRNA, el nivel de proteínas y/o la actividad de una serie de genes de huella dactilar (que puede abarcar desde dos hasta la totalidad de los genes de huella dactilar que existen para un estado determinado). Un patrón de huella dactilar puede ser una parte de los mismos métodos descritos anteriormente para la expresión de un solo gen de huella dactilar.
"Genes de camino", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a genes cuyo producto exhibe capacidad para interaccionar con productos génicos implicados en trastornos inmunológicos, v.g., trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH y/o interaccionar con productos génicos que están involucrados en la diferenciación y función efectora de subpoblaciones de células TH. Los genes de ruta puede exhibir también características de gen diana y/o de gen de huella dactilar.
"Modulación negativa", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una reducción en el nivel y/o la actividad de un producto de gen diana con relación al nivel y/o la actividad del producto del gen diana en ausencia del tratamiento modulador. Alternativamente, el término, como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una reducción en el número y/o la actividad de células pertenecientes a la subpoblación de células TH con relación al número y/o actividad de la subpoblación de células TH en ausencia del tratamiento modulador.
"Modulación positiva", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un aumento en el nivel y/o la actividad de producto de gen diana con relación al nivel y/o la actividad del producto del gen en ausencia del tratamiento modulador. Alternativamente, el término, como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un aumento en el número y/o la actividad de células pertenecientes a la subpoblación de células TH, con relación al número y/o la actividad de la subpoblación de células TH en ausencia del tratamiento modulador.
4. Descripción de las figuras
Fig. 1. Análisis de presentación diferencial de RNA procedente de subconjuntos de células TH murinas. Células T esplénicas derivadas de ratones transgénicos en los receptores de células T se diferenciaron in vitro para convertirse en poblaciones polarizadas de subtipos TH1 o TH2. Pista 1: población TH2 24 horas después de la estimulación terciaria; pista 2: población TH1 24 horas después de estimulación terciaria; pista 3: población TH2 una semana después de la estimulación terciaria; pista 4: población TH1 una semana después de la estimulación terciaria; pista 5: línea de células TA3, que se utilizó como célula presentadora de antígeno (APC) para estimulación in vitro. (Esta muestra se utilizó como control negativo). Cada conjunto de pistas está constituido por duplicados (a y b), en los cuales los cDNAs se generaron independientemente a partir de la misma fuente de RNA. La flecha apunta a la secuencia expresada diferencialmente, banda 102. Todas las pistas son productos de una reacción en cadena de polimerasa (PCR) en la cual se utilizó T_{11}GG como el oligonucleótido 3' y se utilizó un oligonucleótido aleatorio 10-mero (Oligo #4, kit OP-D, Operon, Inc.) como el oligonucleótido 5'.
Fig. 17A-17D. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos del gen 200 murino de longitud total. Línea inferior: secuencia de nucleótidos del gen 200 murino (SEQ ID NO: 8); línea superior: secuencia de aminoácidos derivada del producto del gen 200 murino (SEQ ID NO: 10).
Fig. 18. Análisis por transferencia Northern de la expresión del gen 200 murino en líneas de células TH murinas representativas (TH2: CDC25, D10.G4, DAX; TH1: AE7.A, Dorris, D1.1). Los clones se dejaron sin estimular (-) o se estimularon (+) durante 6 horas con anticuerpo anti-CD3 fijado a una placa. Las posiciones de los marcadores de RNA, en kilobases, se muestran para referencia. La flecha señala la posición del mRNA del gen 200.
Fig. 24A-24D. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos del gen 200 humano de longitud total. Línea inferior: secuencia de nucleótidos del gen 200 humano (SEQ ID NO: 23); línea superior: secuencia de aminoácidos derivada del producto del gen 200 humano (SEQ ID NO: 24).
5. Descripción detallada de la invención
Se describen métodos y composiciones para el tratamiento y diagnóstico de trastornos inmunológicos, especialmente trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, que incluyen, pero sin carácter limitante, afecciones atópicas, tales como asma y alergia, con inclusión de rinitis alérgica, psoriasis, los efectos de infección patógena, enfermedades inflamatorias crónicas, autoinmunidad organoespecífica, rechazo de injertos y enfermedad de rechazo inverso. La invención está basada, en parte, en la evaluación de la expresión y el papel de todos los genes que se expresan diferencialmente dentro de y/o entre subpoblaciones de células TH en paradigmas que son fisiológicamente relevantes para trastornos relacionados con la respuesta inmunológica mediada por las células TH y/o las subpoblaciones de células TH. Esto permite la definición de caminos de enfermedad que son útiles tanto diagnóstica como terapéuticamente.
Los genes, denominados "genes diana" y/o "genes de huella dactilar", que se expresan diferencialmente dentro de y entre células TH y subpoblaciones de células TH en estados normales y/o de enfermedad, y/o durante la diferenciación en tales subpoblaciones maduras se describen en la Sección 5.4. Adicionalmente, genes, denominados "genes de ruta", cuyos productos génicos exhiben capacidad para interaccionar con productos génicos implicados en trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH y/o con productos génicos que están involucrados en la diferenciación y función efectora de las subpoblaciones se describen en la Sección 5.4. Los genes de ruta pueden tener adicionalmente características de genes de huella dactilar y/o de genes diana. Métodos para la identificación de tales genes de huella dactilar, diana, y de camino se describen también en las Secciones 5.1 y 5.2.
Adicionalmente, los productos génicos de tales genes de huella dactilar, diana, y de camino se describen en la Sección 5.5, anticuerpos para tales productos génicos se describen en la Sección 5.6, describiéndose en la Sección 5.7 modelos de diferenciación de subpoblaciones de células TH basados en células y en animales y trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH a los cuales pueden contribuir tales productos génicos.
Métodos para evaluación de pronóstico y diagnóstico de diversos trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, para la identificación de individuos que exhiben predisposición a tales trastornos, y para observación de la eficacia de los compuestos utilizados en pruebas clínicas se describen en la Sección 5.11.
Métodos para la identificación de compuestos que modulan la expresión de genes o la actividad de productos génicos implicados en trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH y para la diferenciación y la función efectora de subpoblaciones de células TH se describen en la Sección 5.8, y métodos para el tratamiento de trastornos inmunológicos se describen en la Sección 5.9.
5.1 Identificación de genes expresados diferencialmente
Se describen aquí métodos para la identificación de genes expresados diferencialmente que están implicados en trastornos inmunológicos, v.g., trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, y/o que están implicados en la diferenciación, el mantenimiento y la función efectora de las subpoblaciones. Existen varios niveles en los cuales puede exhibirse la expresión diferencial de tales genes. Por ejemplo, la expresión diferencial puede aparecer en células TH no diferenciadas frente a células TH diferenciadas o en proceso de diferenciación (aunque no necesariamente dentro de una subpoblación de células TH frente a otra), en células TH inexpertas frente a células TH con memoria, dentro de una subpoblación de células TH frente a otra (v.g., subpoblaciones TH1 frente a TH2), en células maduras estimuladas frente a células maduras no estimuladas de una subpoblación de células TH dada o en estados de trastorno relacionados con subpoblaciones de células TH con relación a su expresión en estados normales o estados de trastorno no relacionados con subpoblaciones de células TH. Tales genes expresados diferencialmente pueden representar genes diana y/o genes de huella dactilar.
Métodos para la identificación de tales genes expresados diferencialmente se describen a continuación en la Sección 5.1.1. Métodos para la caracterización ulterior de tales genes expresados diferencialmente, y para su clasificación como genes diana y/o genes de huella dactilar se presentan, más adelante, en la Sección 5.3.
"Expresión diferencial", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a diferencias tanto cuantitativas como cualitativas en los patrones de expresión temporales y/o de tipo de célula de los genes. Así, un gen expresado diferencialmente puede tener cualitativamente su expresión activada o totalmente desactivada por ejemplo en estados normales frente a estados de trastorno relacionados con subpoblaciones de células TH, en una sola subpoblación de células TH frente a otra (v.g., TH1 frente a TH2), en conjuntos de células TH estimulados por antígeno frente a los no estimulados, o en células TH no diferenciadas frente a células TH diferenciadas o en proceso de diferenciación. Un gen de este tipo regulado cualitativamente exhibirá un patrón de expresión dentro de un estado o tipo de célula que es detectable por técnicas estándar en uno solo de dichos estados o tipos de célula, pero no es detectable en ambos.
Alternativamente, un gen expresado diferencialmente puede exhibir un nivel de expresión que difiere, es decir, está aumentado o disminuido cuantitativamente, en estados normales frente a estados de trastorno relacionados con subpoblaciones de células TH, en conjuntos de células TH estimulados por antígeno frente a conjuntos no estimulados, en una sola subpoblación de células TH frente a otra, o en células TH no diferenciadas frente a las diferenciadas o en proceso de diferenciación. Dado que la diferenciación es un suceso multietápico, los genes que se expresan diferencialmente pueden identificarse también en cualquiera de tales etapas de diferenciación intermedias.
El grado en el que difiere la expresión precisa ser sólo lo suficientemente grande para ser visualizado por técnicas de caracterización estándar, tales como por ejemplo la técnica de presentación diferencial que se describe más adelante. Otras técnicas de caracterización estándar por las cuales pueden visualizarse diferencias de expresión incluyen, pero sin carácter limitante, la PCR cuantitativa RT (con transcriptasa inversa) y los análisis Northern y técnicas de protección contra RNasas.
Los genes expresados diferencialmente pueden describirse ulteriormente como genes diana y/o genes de huella dactilar. "Gen de huella dactilar", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un gen expresado diferencialmente cuyo patrón de expresión puede utilizarse como parte de una evaluación de pronóstico o diagnóstico de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, o que, alternativamente, puede utilizarse en métodos para identificación de compuestos útiles para el tratamiento de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Un gen de huella dactilar puede tener también las características de un gen diana o un gen de ruta (véase más adelante, en la Sección 5.2).
"Patrón de huella dactilar", como se utiliza en esta memoria, hace referencia al patrón generado cuando se determina el patrón de expresión de una serie (que puede comprender desde dos hasta la totalidad de los genes de huella dactilar que existen para un estado dado) de genes de huella dactilar. Un patrón de huella dactilar puede utilizarse también en métodos para identificación de compuestos útiles en el tratamiento de trastornos inmunológicos, v.g., por evaluación del efecto del compuesto sobre el patrón de huella dactilar exhibido normalmente en conexión con la enfermedad.
"Gen diana", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un gen expresado diferencialmente implicado en trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH y/o en la diferenciación, el mantenimiento y/o la función efectora de las subpoblaciones de una manera por la cual la modulación del nivel de expresión del gen diana o de la actividad del producto del gen diana puede actuar para mejorar los síntomas de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Por ejemplo, dicha modulación puede dar como resultado el agotamiento o la estimulación de una o más subpoblaciones de células TH, lo cual, a su vez, da lugar a la mejora de los síntomas de un trastorno inmunológico, v.g., un trastorno de las subpoblaciones de células TH.
"Estimulación", como se utiliza en esta memoria, puede hacer referencia a un aumento eficaz del número de células pertenecientes a una población de células T, tal como una subpoblación de células TH, por la vía por ejemplo de la proliferación de células de dicha subpoblación de células TH. El término puede hacer referencia también a un aumento en la actividad de células pertenecientes a una subpoblación de células TH, como podría demostrarse por ejemplo por un aumento por célula en la expresión del patrón de citoquinas específico de la subpoblación de células TH.
"Agotamiento", como se utiliza en esta memoria, puede hacer referencia a una reducción eficaz en el número de células pertenecientes a una población de células T, tal como una subpoblación de células TH, por la vía por ejemplo de una reducción en la proliferación de células de dicha subpoblación de células TH. El término puede hacer referencia también a una liberación en la actividad de células pertenecientes a una subpoblación de células TH, como podría evidenciarse por ejemplo por una disminución por célula en la expresión del patrón de citoquinas específico de la subpoblación de células TH.
Trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH incluyen por ejemplo afecciones atópicas, tales como asma y alergia, con inclusión de rinitis alérgica, los efectos de patógenos, con inclusión de enfermedades víricas, infecciosas, inflamatorias crónicas, psoriasis, glomerulonefritis, autoinmunidad organoespecífica, rechazo de injertos y enfermedad de rechazo inverso. Un gen diana puede tener también las características de un gen de huella dactilar y/o un gen de ruta (como se describe más adelante en la Sección 5.2).
5.1.1 Métodos para la identificación de genes expresados diferencialmente
Pueden utilizarse Una diversidad de métodos para la identificación de genes que están involucrados en estados de trastornos inmunológicos, v.g., estados de enfermedad relacionados con subpoblaciones de células TH, y/o que están involucrados en la diferenciación, el mantenimiento y/o la función efectora de las subpoblaciones. En la Sección 5.1.1.1 se describen paradigmas experimentales que pueden utilizarse para la generación de individuos y muestras que pueden utilizarse para la identificación de tales genes. El material generado en las categorías del paradigma puede caracterizarse en cuanto a la presencia de secuencias génicas expresadas diferencialmente como se describe, más adelante, en la Sección 5.1.1.2.
5.1.1.1 Paradigmas para la identificación de genes expresados diferencialmente
Se describen aquí paradigmas que representan modelos de respuestas inmunológicas normales y anormales. Estos paradigmas pueden utilizarse para la identificación de genes que se expresan diferencialmente dentro de y entre las subpoblaciones de células TH, con inclusión, pero sin carácter limitante, de subpoblaciones TH1 y TH2. Tales genes pueden estar implicados por ejemplo en la diferenciación, el mantenimiento, y/o la función efectora de subpoblaciones de células TH, y en trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Por ejemplo, las células TH pueden verse inducidas a diferenciarse en los estados TH1 o TH2, pueden estimularse con por ejemplo un antígeno extraño, y pueden recogerse en diversos puntos durante el procedimiento para análisis de la expresión de genes diferenciales.
En una realización de un paradigma de este tipo, al que se hace referencia en esta memoria como el "paradigma de las células T transgénicas", se utilizan animales transgénicos, preferiblemente ratones, que han sido modificados por ingeniería genética para expresar un receptor particular de células T, tal que la población de células T predominante del sistema inmunitario de un animal transgénico de este tipo reconoce únicamente un antígeno. Se prefiere un sistema de este tipo debido a que proporciona una fuente para una gran población de células T idénticas cuya inexperiencia puede asegurarse, y cuya respuesta al único antígeno que reconoce la misma está también asegurada. Las células T adyuvantes aisladas de un animal transgénico de este tipo se inducen, in vitro, a la diferenciación en subpoblaciones de células TH tales como subpoblaciones de células TH1, TH2, o TH0. En una realización específica, un grupo de células T adyuvantes (el grupo TH1) se expone a IL-12, una citoquina que se sabe induce diferenciación al estado TH1, un segundo grupo de células T adyuvantes (el grupo TH2) se expone a IL-4, una citoquina que se sabe induce diferenciación al estado TH2, y un tercer grupo se deja entrar en un estado TH no direccionado, por falta de inducción mediada por citoquinas.
Puede utilizarse un segundo paradigma, al que se hace referencia en esta memoria como "paradigma de la línea de células T", que utiliza clones de células TH maduras, tales como líneas de células TH1 y TH2 y semejantes a TH1 y TH2, preferiblemente líneas de células humanas. Tales líneas de células TH pueden incluir, pero sin carácter limitante, las líneas de células murinas bien conocidas siguientes: Doris, AE7, D10.G4, DAX, D1.1 y CDC25. Tales líneas de células T pueden derivarse tanto de individuos normales como de individuos que exhiben trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, tales como por ejemplo enfermedades y trastornos inflamatorios crónicos, tales como enfermedad de Crohn, artritis reactiva, con inclusión de enfermedad de Lyme, diabetes dependiente de insulina, autoinmunidad organoespecífica, con inclusión de esclerosis múltiple, autoinmunidad organoespecífica, tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Grave, dermatitis de contacto, psoriasis, rechazo de injertos, enfermedad de rechazo inverso, sarcoidosis, afecciones atópicas, tales como asma y alergia, con inclusión de rinitis alérgica, alergias gastrointestinales, con inclusión de alergias alimentarias, eosinofilia, conjuntivitis, nefritis glomerular, ciertas susceptibilidades a patógenas tales como infecciones helmínticas (v.g., leishmaniasis) y ciertas infecciones víricas, que incluyen HIV, e infecciones bacterianas, con inclusión de tuberculosis y lepra lepromatosa.
Los clones de células TH pueden estimularse de diversas maneras. Tales métodos de estimulación incluyen, pero sin carácter limitante, métodos farmacológicos, tales como exposición a ésteres de forbol, ionóforos de calcio, o lectinas (v.g., Concanavalina A), por tratamiento con anticuerpos dirigidos contra epítopes de receptores de las células T (v.g., anticuerpos anti-CD3) o exposición, en presencia de una célula presentadora de antígeno (APC) apropiado, a un antígeno que se sabe es reconocido por las células TH particulares. Después de tal estimulación primaria, las células pueden mantenerse en cultivo sin estimulación y por ejemplo en presencia de IL-2, utilizando métodos estándar bien conocidos por los expertos en la técnica. Las células pueden exponerse luego a uno o más ciclos adicionales de estimulación y mantenimiento.
Puede utilizarse también un tercer paradigma, al que se hace referencia en esta memoria como "paradigma in vivo", para descubrir secuencias de genes expresados diferencialmente. La estimulación in vivo de modelos animales constituye la base de este paradigma. La naturaleza in vivo de la estimulación puede demostrar ser especialmente predictiva de las respuestas análogas en pacientes vivos. La estimulación puede realizarse por diversos métodos. Por ejemplo, animales tales como los animales transgénicos descritos anteriormente en esta Sección, pueden inyectarse con un antígeno apropiado y una citoquina apropiada para impulsar la diferenciación deseada de las células TH. Los ganglios linfáticos de drenaje pueden cosecharse luego en diversos momentos después de la estimulación. Los ganglios linfáticos de por ejemplo animales direccionados a TH1 pueden compararse con los de los animales direccionados a TH2.
Una extensa gama de modelos animales, que representan tanto modelos de diferenciación y función inmunológicas normales como los que representan trastornos inmunológicos pueden utilizarse para este paradigma in vivo. Por ejemplo, pueden utilizarse cualquiera de los modelos animales, tanto recombinantes como no recombinantes, descritos más adelante en la Sección 5.7.1,.
Pueden recogerse muestras de células en cualquier momento de un procedimiento de este tipo. Por ejemplo, pueden obtenerse células después de cualquier periodo de estimulación y/o cualquier periodo de mantenimiento. Adicionalmente, pueden recogerse células en diversos momentos a lo largo del proceso de diferenciación de las células TH. El RNA recogido de tales muestras puede compararse y analizarse por ejemplo de acuerdo con métodos descritos más adelante en la Sección 5.1.1.2. Por ejemplo, RNA de los grupos TH0, TH1 y TH2 aislados en un momento dado puede analizarse y compararse luego. Adicionalmente, puede analizarse y compararse también RNA procedente de células estimuladas y no estimuladas dentro de un grupo de células TH dado. Además, el RNA recogido de células TH no diferenciadas puede compararse con RNA recogido de células en diversas etapas durante el proceso de diferenciación que da lugar finalmente a las subpoblaciones de células TH.
5.1.1.2 Análisis del material de paradigma
Con objeto de identificar genes expresados diferencialmente, RNA, sea total o mRNA, puede aislarse a partir de las células TH utilizadas en paradigmas tales como los descritos en la Sección 5.1.1.1. Cualquier técnica de aislamiento de RNA que no seleccione contra el aislamiento de mRNA puede utilizarse para la purificación de tales muestras de RNA. Véase por ejemplo Ausubel, F.M. et al., compiladores, 1987-1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, que se incorpora en esta memoria por referencia en su totalidad. Adicionalmente, pueden procesarse fácilmente grandes números de muestras de células utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como por ejemplo el proceso de aislamiento de RNA en un solo paso de Chomczynski, P. (1989, Patente de EE.UU. Nº 4.843.155), que se incorpora en esta memoria por referencia en su totalidad.
Los materiales transcritos dentro de las muestras de RNA recogidas que representan RNA producido por genes expresados diferencialmente pueden identificarse utilizando una diversidad de métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo pueden utilizarse, escrutinio diferencial (Tedder, T.F. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 208-212), hibridación sustractiva (Hederick, S.M. et al., 1984, Nature 308: 149-153; Lee, S.W. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2825), y, preferiblemente, presentación diferencial (Liang, T. y Pardee, A.B., 1992, Science 257: 967-971; Patente de EE.UU. Nº 5.262.311, que se incorporan en esta memoria por referencia en su totalidad), para identificar secuencias de ácido nucleico derivadas de genes que se expresan diferencialmente.
El escrutinio diferencial implica el escrutinio duplicado de una genoteca de cDNA en el cual se escruta una sola copia de la genoteca con una sonda de cDNA celular total correspondiente a la población de mRNA de un solo tipo de células mientras que se escruta una copia duplicada de la genoteca de cDNA con una sonda de cDNA total correspondiente a la población de mRNA de un segundo tipo de células. Por ejemplo, una sonda de cDNA puede corresponder a una sonda de cDNA celular total de un tipo de célula o tejido derivado de un individuo de control, mientras que la segunda sonda de cDNA puede corresponder a una sonda de cDNA celular total del mismo tipo de célula o tejido derivado de un individuo experimental. Aquellos clones que se hibridan a una sonda pero no a la otra, representan potencialmente clones derivados de genes expresados diferencialmente en el tipo de célula de interés en los individuos de control frente a los experimentales.
Las técnicas de hibridación sustractiva implican generalmente el aislamiento de mRNA tomado de dos fuentes diferentes, la hibridación del mRNA o cDNA monocatenario transcrito inversamente a partir del mRNA aislado, y la eliminación de todas las secuencias hibridadas, y por consiguiente bicatenarias. Los cDNAs monocatenarios no hibridados restantes representan potencialmente clones derivados de genes que se expresan diferencialmente entre las dos fuentes de mRNA. Tales cDNAs monocatenarios se utilizan luego como el material de partida para la construcción de una genoteca que comprende clones derivados de genes expresados diferencialmente.
La técnica de presentación diferencial es un procedimiento que utiliza la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR); realización experimental expuesta en Mullis, K.B., 1987, Patente de EE.UU. Nº 4.683.202), que permite la identificación de secuencias derivadas de genes que se expresan diferencialmente. En primer lugar, el RNA aislado se somete a transcripción inversa en cDNA monocatenario, utilizando métodos estándar que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Iniciadores para la reacción de la transcriptasa inversa pueden incluir, pero sin carácter limitante, iniciadores que contienen oligo-dT, preferiblemente del tipo del iniciador 3' del oligonucleótido descrito más adelante.
Seguidamente, esta técnica utiliza pares de iniciadores PCR, como se describe más adelante, que permite la amplificación de clones que representan un subconjunto reproducible de los transcritos de RNA presentes en cualquier célula dada. La utilización de diferentes pares de iniciadores permite amplificar cada uno de los transcriptos de mRNA sensibilizados presentes en una célula. Entre tales transcritos amplificados pueden identificarse aquéllos que se han producido a partir de genes expresados diferencialmente.
El iniciador oligonucleotídico 3' de los pares de iniciadores puede contener un tramo de oligo-dT de 10-13, preferiblemente 11, nucleótidos dT en su extremo 5', que se hibrida a la cola poli(A) del mRNA o al complemento de un cDNA transcrito inversamente a partir de una cola de mRNA poli(A). Con objeto de aumentar la especificidad del iniciador 3', dicho iniciador puede contener uno o más, preferiblemente dos, nucleótidos adicionales en su extremo 3'. Dado que estadísticamente un solo subconjunto de las secuencias derivadas de mRNA presentes en la muestra de interés se hibridará a tales iniciadores, los nucleótidos adicionales permiten que los iniciadores amplifiquen solamente un subconjunto de las secuencias derivadas de mRNA presentes en la muestra de interés. Se prefiere esto último, debido a que ello permite una visualización y caracterización más exacta y completa de cada una de las bandas que presentan las secuencias amplificadas.
El iniciador 5' puede contener una secuencia de nucleótidos que se espera, estadísticamente, que tenga la capacidad de hibridarse a secuencias de cDNA derivadas de las células o tejidos de interés. La secuencia de nucleótidos puede ser una secuencia arbitraria, y la longitud del iniciador del oligonucleótido 5' puede estar comprendida entre aproximadamente 9 y aproximadamente 15 nucleótidos, prefiriéndose un número de aproximadamente 13 nucleótidos.
Las secuencias iniciadoras arbitrarias hacen que las longitudes de los cDNAs parciales amplificados producidos sean variables, permitiendo con ello que los diferentes clones se separen utilizando electroforesis estándar en gel de secuenciación desnaturalizante.
Deben seleccionarse condiciones de la reacción PCR que optimicen el rendimiento y la especificidad del producto amplificado, y, adicionalmente, permitan obtener productos amplificados de longitudes que puedan resolverse utilizando técnicas estándar de electroforesis en gel. Tales condiciones de reacción son bien conocidas por los expertos en la técnica, y parámetros de reacción importantes incluyen por ejemplo la longitud y secuencia nucleotídicas de los oligonucleótidos iniciadores como se ha expuesto anteriormente, así como las temperaturas y los tiempos de reacción de los pasos de reasociación y elongación.
El patrón de clones resultante de la transcripción inversa y amplificación del mRNA de dos tipos de células diferentes se presenta y se compara por electroforesis en gel de secuenciación. Los genes expresados diferencialmente se indican por diferencias en los dos patrones de bandas.
Una vez que se han identificado las secuencias de genes expresados diferencialmente por técnicas en masa tales como por ejemplo las arriba descritas, debería comprobarse la expresión diferencial de tales genes expresados supuestamente de modo diferencial. La comprobación puede realizarse por ejemplo por técnicas tan bien conocidas como el análisis Northern, la RT/PCR cuantitativa, o la protección contra las RNAsas.
Después de la comprobación, los genes expresados diferencialmente pueden caracterizarse ulteriormente, y pueden identificarse como genes diana y/o genes de huella dactilar, como se expone, más adelante, en la Sección 5.3.
Las secuencias amplificadas de los genes expresados diferencialmente obtenidas por ejemplo por presentación diferencial pueden utilizarse para aislar clones de longitud total del gen correspondiente. La porción codificante de longitud total del gen puede aislarse fácilmente, sin experimentación excesiva, por métodos de biología molecular bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el fragmento amplificado y aislado expresado diferencialmente puede marcarse y utilizarse para escrutar una genoteca de cDNA. Alternativamente, el fragmento marcado puede utilizarse para escrutar una genoteca genómica.
La tecnología PCR puede utilizarse también para aislar secuencias de cDNA de longitud total. Como se ha descrito anteriormente en esta Sección, los fragmentos de genes aislados y amplificados obtenidos por presentación diferencial tienen extremos terminales 5' en algún punto aleatorio dentro del gen y usualmente tienen extremos terminales 3' en una posición correspondiente al extremo 3' de la porción transcrita del gen. Una vez que se obtiene la información de secuencia nucleotídica de un fragmento amplificado, el resto del gen (es decir, el extremo 5' del gen, cuando se utiliza presentación diferencial) puede obtenerse utilizando por ejemplo RT-PCR.
En una realización de un procedimiento de este tipo para la identificación y clonación de secuencias génicas de longitud total, puede aislarse RNA, siguiendo procedimientos estándar, a partir de un tejido o fuente celular apropia-
do(a). Puede realizarse luego una reacción de transcripción inversa sobre el RNA utilizando un iniciador oligonucleotídico complementario al mRNA que corresponde al fragmento amplificado, para la iniciación de la síntesis de la primera cadena. Dado que el iniciador es anti-paralelo al mRNA, la extensión procederá hacia el extremo 5' del mRNA. El híbrido RNA/DNA resultante puede luego "adicionarse de colas" con guaninas utilizando una reacción estándar de transferasa terminal, el híbrido puede digerirse con RNAasa H, y la síntesis de la segunda cadena puede iniciarse luego con un iniciador poli-C. Utilizando los dos iniciadores, la porción 5' del gen se amplifica utilizando PCR. Las secuencias obtenidas pueden aislarse luego y recombinarse con secuencias aisladas previamente para generar un cDNA de longitud total de los genes de la invención expresados diferencialmente. Para una revisión de las estrategias de clonación y técnicas de DNA recombinante, véase v.g., Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Volúmenes 1-3) Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y.
5.2 Métodos para la identificación de genes de camino
Se describen aquí métodos para la identificación de genes de ruta. "Gen de camino", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un gen cuyo producto génico exhibe la capacidad de interaccionar con productos génicos implicados en trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH y/o de interaccionar con productos génicos que están implicados en la diferenciación, el mantenimiento y/o la función efectora de subpoblaciones de células TH. Un gen de ruta puede expresarse diferencialmente y, por consiguiente, puede tener las características de un gen diana y/o gen de huella dactilar, como se ha descrito arriba en la Sección 5.1.
Puede emplearse cualquier método adecuado para detectar interacciones proteína-proteína para identificar productos de genes de ruta por identificación de interacciones entre los productos génicos y productos de genes que se sabe están implicados en trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH y/o implicados en la diferenciación, el mantenimiento, y/o la función efectora de las subpoblaciones. Tales productos de genes conocidos pueden ser proteínas celulares o extracelulares. Aquellos productos génicos que interaccionan con dichos productos de genes conocidos representan productos de genes de ruta y los genes que codifican los mismos representan genes de ruta.
Entre los métodos tradicionales que pueden emplearse se encuentran co-inmunoprecipitación, reticulación y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. La utilización de procedimientos tales como éstos permite la identificación de productos de genes de ruta. Una vez identificado, un producto de gen de ruta puede utilizarse, en asociación con técnicas estándar, para identificar el gen de ruta correspondiente. Por ejemplo, al menos una porción de la secuencia de aminoácidos del producto del gen de ruta puede averiguarse utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo por el método de degradación de Edman (véase, v.g., Creighton, 1983, "Proteins: Structures and Molecular Principles", W.H. Freeman & Co., N.Y., pp. 34-49). La secuencia de aminoácidos obtenida puede utilizarse como guía para la generación de mezclas de oligonucleótidos que pueden utilizarse para escrutar secuencias de genes de ruta. El escrutinio puede realizarse por ejemplo por hibridación estándar o técnicas PCR. Las técnicas para la generación de mezclas de oligonucleótidos y para el escrutinio son bien conocidas. (Véase, v.g., Ausubel, supra, PCR Protocols: A Guide a Methods and Applications, 1990, Innis, M. et al., compiladores Academic Press, Inc., Nueva York).
Adicionalmente, pueden emplearse métodos que dan como resultado la identificación simultánea de genes de ruta que codifican proteínas que interaccionan con una proteína implicada en estados de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH y/o la diferenciación, el mantenimiento, y/o la función efectora de las subpoblaciones. Estos métodos incluyen por ejemplo sondar genotecas de expresión con proteína marcada que se sabe o se supone está involucrada en los trastornos y/o la diferenciación, el mantenimiento, y/o la función efectora de las subpoblaciones, utilizando esta proteína de una manera similar a la técnica bien conocida del sondeo con anticuerpos de genotecas lambda gt11.
Un método que detecta interacciones de proteínas in vivo, el sistema de dos híbridos, se describe en detalle únicamente para propósitos de ilustración y sin carácter de limitación. Una versión de este sistema ha sido descrita (Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582) y está disponible comercialmente de Clontech (Palo Alto, CA).
Resumidamente, utilizando dicho sistema, se construyen plásmidos que codifican dos proteínas híbridas: una está constituida por el dominio de fijación de DNA de una proteína activadora de la transcripción fusionada a una proteína conocida, en este caso, una proteína que se sabe está implicada en la diferenciación o la función efectora de subpoblaciones de células TH, o en trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, y la otra está constituida por el dominio de activación de la proteína activadora fusionado a una proteína desconocida que es codificada por un cDNA que se ha recombinado en este plásmido como parte de una genoteca de cDNA. Los plásmidos se transforman en una cepa de la levadura Saccharomyces cerevisiae que contiene un gen informador (v.g., lacZ) cuya región reguladora contiene los sitios de fijación del activador de la transcripción. Cualquier proteína híbrida no puede activar por sí sola la transcripción del gen informador, y el híbrido de dominios de fijación de DNA no puede hacerlo debido a que no proporciona función de activación, no pudiendo hacerlo tampoco el híbrido del dominio de activación dado que no puede localizarse en los sitios de fijación del activador. La interacción de las dos proteínas híbridas reconstituye la proteína activadora funcional y da como resultado la expresión del gen informador, que es detectado por un ensayo para el producto del gen informador.
El sistema de dos híbridos o una metodología afín puede utilizarse para escrutar genotecas de dominios de activación para proteínas que interaccionan con un producto de gen "cebo" conocido. A modo de ejemplo, y sin carácter de limitación, productos génicos conocidos que se sabe están implicados en trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH y/o con la diferenciación, el mantenimiento, y/o la función efectora de las subpoblaciones pueden utilizarse como los productos del gen cebo. Las secuencias genómicas o de cDNA totales se fusionan al DNA que codifica un dominio de activación. Esta genoteca y un plásmido que codifica un híbrido del producto del gen cebo fusionado al dominio de fijación de DNA se cotransforman en una cepa informadora de levadura, y los transformantes resultantes se escrutan con respecto a aquéllos que expresan el gen informador. Por ejemplo, y sin carácter de limitación, el gen cebo puede clonarse en un vector tal que el mismo se fusiona por traducción al DNA que codifica el dominio de fijación de DNA de la proteína GAL4. Estas colonias se purifican y se aislan los plásmidos responsables de la genoteca para la expresión de genes informadores. La secuenciación del DNA se utiliza luego para identificar las proteínas codificadas por los plásmidos de la genoteca.
Puede prepararse una genoteca de cDNA de la línea de células a partir de la cual deben detectarse las proteínas que interaccionan con el producto del gen cebo utilizando métodos practicados rutinariamente en la técnica. De acuerdo con el sistema particular descrito en esta memoria por ejemplo los fragmentos de cDNA pueden insertarse en un vector tal que aquéllos se fusionan por traducción al domino de activación de GAL4. Esta genoteca puede co-transformarse junto con el plásmido de fusión gen cebo-GAL4 en una cepa de levadura que contiene un gen lacZ impulsado por un promotor que contiene la secuencia de activación de GAL4. Una proteína codificada por cDNA, fusionada al dominio de activación de GAL4, que interacciona con el producto del gen cebo, reconstituirá una proteína GAL4 activa y por consiguiente impulsará la expresión del gen lacZ. Las colonias que expresan lacZ pueden detectarse por su color azul en presencia de X-GAL. El cDNA puede purificarse luego a partir de estas cepas, y utilizarse para producir y aislar la proteína de interacción del gen cebo utilizando métodos practicados rutinariamente en la técnica.
Una vez que se ha identificado y aislado un gen de ruta, el mismo puede caracterizarse ulteriormente como se expone por ejemplo a continuación en la Sección 5.3.
5.3 Caracterización de genes expresados diferencialmente y genes de camino
Genes expresados diferencialmente, tales como los identificados por los métodos expuestos anteriormente en la Sección 5.1, y genes de ruta, tales como los identificados por los métodos arriba expuestos en la Sección 5.2 anterior, así como genes identificados por medios alternativos, pueden caracterizarse ulteriormente utilizando por ejemplo métodos tales como los expuestos en esta memoria. A dichos genes se hará referencia aquí como "genes identificados".
Análisis tales como los descritos en esta memoria proporcionan información acerca de la función biológica de los genes identificados. Además, una evaluación de la función biológica de los genes expresados diferencialmente, permitirá su designación como genes diana y/o genes de huella dactilar.
Específicamente, cualquiera de los genes expresados diferencialmente cuya caracterización ulterior indica que una modulación de la expresión del gen o una modulación de la actividad del producto del gen puede mejorar cualquiera de los trastornos relacionados con las subpoblaciones de células TH de interés, serán designados "genes diana", como se define anteriormente en la Sección 5.1. Dichos genes diana y los productos de los genes diana, junto con los expuestos más adelante, constituirán el foco de las estrategias de descubrimiento de compuestos expuestas, más adelante, en la Sección 5.8. Adicionalmente, tales genes diana, productos de genes diana y/o compuestos moduladores pueden utilizarse como parte de los métodos de tratamiento de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH descritos, más adelante, en la Sección 5.9. Dichos métodos pueden incluir por ejemplo métodos por los cuales la subpoblación de células TH de interés se agota selectivamente o se reprime, o, alternativamente, se estimula o se aumenta.
Cualquiera de los genes expresados diferencialmente cuya caracterización ulterior indica que tales modulaciones no pueden afectar positivamente a los trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH de interés, pero cuyo patrón de expresión contribuye a un patrón de "huella dactilar" de expresión de genes correlativo con por ejemplo un estado de trastorno relacionado con TH1/TH2, se designará como un "gen de huella dactilar". Los "Patrones de huella dactilar" se expondrán con mayor detalle más adelante en la Sección 5.11.1. Debe indicarse que cada uno de los genes diana puede funcionar también como genes de huella dactilar, al igual que pueden hacerlo la totalidad o una porción de los genes de ruta.
Adicionalmente, debe indicarse que los genes de ruta pueden caracterizarse también de acuerdo con métodos tales como los expuestos en esta memoria. Dichos genes de ruta que proporcionan información indicativa de que la modulación de la expresión de un gen o una modulación de la actividad del producto génico puede mejorar cualquier trastorno relacionado con una subpoblación de células TH se designarán también como "genes diana". Dichos genes diana y los productos de genes diana, junto con los expuestos anteriormente, constituirán el foco de las estrategias de descubrimiento de compuestos expuestas, más adelante, en la Sección 5.8 y pueden utilizarse como parte de los métodos de tratamiento descritos más adelante en la Sección 5.9.
En aquellos casos en los cuales la caracterización de un gen de ruta indica que la modulación de la expresión génica o la actividad del producto génico no pueden afectar positivamente a los trastornos relacionados con las subpoblaciones de células TH de interés, pero cuya expresión se expresa diferencialmente y contribuye a un patrón de huella dactilar de la expresión génica correlativo a por ejemplo un estado de trastorno relacionado con TH1/TH2, dichos genes de ruta pueden designarse adicionalmente como genes de huella dactilar.
Pueden utilizarse una diversidad de técnicas para caracterizar ulteriormente los genes identificados. En primer lugar, la secuencia de nucleótidos de los genes identificados, que puede obtenerse por utilización de métodos estándar bien conocidos por los expertos en la técnica, puede utilizarse por ejemplo para revelar homologías a uno o más motivos de secuencia conocidos que pueden proporcionar información con relación a la función biológica del producto del gen identificado.
En segundo lugar, puede realizarse un análisis de la distribución de tejidos y/o tipos de células del mRNA producido por los genes identificados, utilizando métodos estándar bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos métodos pueden incluir por ejemplo análisis Northern, protección contra RNAsas, y RT-PCR. Dichos análisis proporcionan información en cuanto a por ejemplo si los genes identificados se expresan en tipos de células que se espera contribuyan a los trastornos de interés específicos relacionados con subpoblaciones de células TH. Dichos análisis pueden proporcionar también información cuantitativa con relación a la regulación del mRNA en estado estacionario, proporcionando datos concernientes a cuál de los genes identificados exhibe un nivel alto de regulación en tipos de células que puede esperarse contribuyan a los trastornos de interés relacionados con subpoblaciones de células TH. Adicionalmente, pueden utilizarse técnicas estándar de hibridación in situ para proporcionar información concerniente a aquellas células dentro de un tejido o una población de células dada que expresan el gen identificado. Un análisis de este tipo puede proporcionar información relacionada con la función biológica de un gen identificado en lo que respecta a un trastorno dado relacionado con subpoblaciones de células TH en aquellos casos en los cuales se cree que un solo subconjunto de las células dentro de un tejido o una subpoblación de células es relevante para el
trastorno.
En tercer lugar, las secuencias de los genes identificados pueden utilizarse, utilizando técnicas estándar, para situar los genes en mapas genéticos, v.g., mapas genéticos ratón (Copeland, N.G. y Jenkins, N.A., 1991, Trends in Genetics 7: 113-118) y mapas genéticos humanos (Cohen, D., et al., 1993, Nature 366: 698-701). Dicha información de mapeado puede proporcionar información en cuanto a la importancia de los genes para una enfermedad humana, por ejemplo por la identificación de genes que mapean en regiones genéticas a las cuales mapean trastornos genéticos conocidos relacionados con subpoblaciones de células TH. Tales regiones incluyen por ejemplo el locus Scl.1 de ratón, que se sospecha está implicado en la Leishmaniasis, o la región del cromosoma humano 5q31.1 que contiene uno o más loci que se cree regulan la producción de IgE de una manera no específica de antígeno, y pueden, por consiguiente, estar implicados en la alergia, un trastorno relacionado posiblemente con las células TH2 (Marsh, D. et al., 1994, Science 264: 1152-1156).
En cuarto lugar, la función biológica de los genes identificados puede evaluarse más directamente utilizando sistemas relevantes in vivo e in vitro. Sistemas in vivo pueden incluir, pero sin carácter limitante, sistemas animales que exhiben naturalmente los síntomas de trastornos inmunológicos, o aquéllos que se han modificado por ingeniería genética para exhibir dichos síntomas. Adicionalmente, tales sistemas pueden incluir sistemas para la caracterización adicional de la función de diferenciación y efectora del tipo de células, y pueden incluir, pero sin carácter limitante, sistemas de animales transgénicos tales como los descritos anteriormente en la Sección 5.1.1.1, y la Sección 5.7.1, más adelante. Sistemas in vitro pueden incluir, pero sin carácter limitante, sistemas basados en células que comprenden por ejemplo tipos de células TH1 o TH2. Las células de las subpoblaciones TH pueden ser células de tipo salvaje, o pueden ser células de tipo no salvaje que contienen modificaciones que se sabe o se sospecha contribuyen al trastorno de interés relacionado con subpoblaciones de células TH. Dichos sistemas se exponen en detalle, más adelante, en la Sección 5.7.2.
En la caracterización ulterior de la función biológica de los genes identificados, la expresión de estos genes puede modularse dentro de los sistemas in vivo y/o in vitro, es decir, sobreexpresarse o infraexpresarse por ejemplo en animales y/o líneas de células transgénicos(as), y puede ensayarse luego su efecto subsiguiente sobre el sistema. Alternativamente, la actividad del producto del gen identificado puede modularse por aumento o disminución del nivel de actividad en el sistema de interés in vivo y/o in vitro, y ensayarse luego su efecto subsiguiente.
La información obtenida por tales caracterizaciones puede sugerir métodos relevantes para el tratamiento o control de trastornos inmunológicos, tales como trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, que implican el gen de interés. Por ejemplo, un tratamiento relevante puede incluir no sólo una modulación de la expresión génica y/o la actividad del producto génico, sino que puede incluir también un agotamiento o estimulación selectivos de la subpoblación de células TH de interés. Procedimientos de caracterización tales como los descritos en esta memoria pueden indicar en qué casos dicha modulación debería ser positiva o negativa. Como se utiliza en esta memoria, "modulación positiva" hace referencia a un aumento en la expresión génica o la actividad del gen o producto génico de interés, o a una estimulación de una subpoblación de células TH, con relación a la observada en ausencia del tratamiento modulador. "Modulación negativa", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una disminución en la expresión o actividad génica, o un agotamiento de una subpoblación de células TH, con relación a la observada en ausencia del tratamiento modulador. "Estimulación" y "agotamiento" son como se define anteriormente en la Sección 3. Métodos de tratamiento se exponen, más adelante, en la Sección 5.9.
5.4 Genes expresados diferencialmente y genes de camino
Se describen aquí genes expresados diferencialmente tales como los identificados en la Sección 5.1.1 anterior, y genes de ruta tales como los identificados en la Sección 5.2 anteriormente.
Los genes expresados diferencialmente y genes de ruta de la invención se enumeran a continuación en la Tabla 1. Secuencias de genes expresados diferencialmente se muestran en las Figs. 17 y 24. A las secuencias nucleotídicas identificadas por análisis de presentación diferencial se hace referencia aquí como banda 200. A los genes correspondientes a estas secuencias se hace referencia aquí como el gen 200. La Tabla 1 enumera genes expresados diferencialmente identificados por ejemplo por los paradigmas expuestos anteriormente en la Sección 5.1.1.1, y más adelante, en los Ejemplos presentados en las Secciones 6-8.
La Tabla 1 resume información concerniente a la caracterización ulterior de tales genes. La Tabla 2 enumera clones de E. coli, depositados con la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) o la American Type Culture Collection (ATCC), que contienen secuencias encontradas en los genes de la Tabla 1.
En la Tabla 1, la columna encabezada "Exp. Dif." detalla la característica de expresión diferencial por la cual se ha identificado la secuencia.
En esta columna, "TH1" hace referencia a una secuencia correspondiente a un gen expresado preferentemente en células TH1 maduras y totalmente diferenciadas con relación a células TH2. La expresión preferencial puede ser cualitativa o cuantitativa, como se ha descrito anteriormente en la Sección 5.1.
En la Tabla 1 se resumen también patrones de expresión de tejidos. La columna encabezada "Dist. Tejido/Célula" enumera tejidos y/o tipos de células en los cuales se ha ensayado la expresión del gen y si se ha observado la expresión del gen dentro de un tejido o tipo de células dado. Específicamente, "+" indica mRNA detectable del gen de interés. A no ser que se indique otra cosa, "+" hace referencia a todas las muestras de un tejido o tipo de célula dado ensayadas. "Detectable", como se utiliza en esta memoria, es como se ha descrito anteriormente en la Sección 5.1.
El gen enumerado en la Tabla 1 puede obtenerse utilizando métodos de clonación bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluye, pero sin carácter limitante, el uso de sondas apropiadas para detectar el gen dentro de una genoteca apropiada de cDNA o gDNA (DNA genómico). (Véase por ejemplo Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, que se incorpora en esta memoria por referencia en su totalidad). Sondas para las secuencias consignadas en esta memoria pueden obtenerse directamente a partir de los clones aislados depositados con la NRRL, como se indica más adelante en la Tabla 2. Alternativamente, sondas oligonucleotídicas para los genes pueden sintetizarse basándose en las secuencias de DNA expuestas en esta memoria en las Figs. 17 y 24.
Las sondas pueden utilizarse para escrutar genotecas de cDNA preparadas a partir de una célula o línea de células apropiada en las cuales se transcribe el gen. Líneas de células apropiadas pueden incluir por ejemplo las líneas de células Dorris, AE7, D10.G4, DAX, D1.1 y CDC25. Adicionalmente, pueden utilizarse células T inexpertas primarias purificadas derivadas de cepas transgénicas o no transgénicas. Alternativamente, los genes descritos en esta memoria pueden clonarse a partir de una genoteca de cDNA construida de por ejemplo líneas de células NIH 3T3 transfectadas de manera estable con el gen Ha-ras (EJ), células 5C10, y linfocitos de sangre periférica.
TABLA 1 Genes expresados diferencialmente y genes de camino
Gen Exp. Dif. Dist. Tejido/Célula
200 TH1 (+) TH1 
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2 siguiente enumera clones de E. coli aislados que contienen secuencias dentro de los nuevos genes enumerados en la Tabla 1.
TABLA 2
GEN CLON
200 (murino) 200-O
200 (murino) DH10B(Zip)^{TM} que contiene 200-P
200 (murino) 200-AF
200 (humano) feht 200-C
Como se utiliza en esta memoria, "gen expresado diferencialmente" (a saber, gen diana y gen de huella dactilar) o "gen de ruta" hace referencia a (a) un gen que contiene: al menos una de las secuencias de DNA descritas en esta memoria (como se muestran en las Figs. 17 y 24), o contenida en los clones enumerados en la Tabla 2, como están depositados con la NRRL o la ATCC; (b) cualquier secuencia de DNA que codifica la secuencia de aminoácidos codificada por: las secuencias de DNA descritas en esta memoria (como se muestran en Figs. 17 y 24), contenidas en los clones enumerados en la Tabla 2, como están depositados con la NRRL o la ATCC contenida dentro de la región codificante del gen al que pertenecen las secuencias de DNA descritas en esta memoria (como se muestran en Figs. 17 y 24) o contenidas en los clones enumerados en la Tabla 2, como están depositados con la NRRL o la ATCC; (c) cualquier secuencia de DNA que se hibrida al complemento de: las secuencias codificantes descritas en esta memoria (como se muestran en Figs. 17 y 24), contenidas en los clones enumerados en la Tabla 2, como están depositados con la NRRL o la ATCC, o contenidas dentro de la región codificante del gen al que pertenecen las secuencias de DNA descritas en esta memoria (como se muestran en Figs. 17 y 24) o contenidas en los clones enumerados en la Tabla 2, tal como están depositados con la NRRL o la ATCC, en condiciones muy severas, v.g., hibridación a DNA fijado a un filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio al 7% (SDS), DETA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C (Ausubel F.M. et al., compiladores, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en p. 2.10.3), y codifica un producto génico funcionalmente equivalente a un producto génico codificado por un gen de (a) arriba; y/o (d) cualquier secuencia de DNA que se hibrida al complemento de: las secuencias codificantes descritas en esta memoria, (como se muestran en Figs. 17 y 24) que pertenecen o están contenidas en los clones enumerados en la Tabla 2, tal como están depositados con la NRRL o contenidas dentro de la región codificante del gen al que pertenecen las secuencias de DNA descritas en esta memoria (como se muestran en Figs. 17 y 24) o contenidas en los clones, enumerados en la Tabla 2, tal como están depositados con la NRRL o la ATCC, en condiciones menos severas, tales como condiciones moderadamente severas, v.g., lavado en 0,2 x SSC/0,1% SDS a 42°C (Ausubel et al., 1989, supra), pero que codifica todavía un producto génico funcionalmente equivalente a un producto génico codificado por un gen de (a), arriba. La invención incluye también variantes degeneradas de las secuencias (a) a (d).
La invención abarca los nucleótidos siguientes, células hospedadoras que expresan tales nucleótidos y los productos de expresión de dichos nucleótidos: (a) nucleótidos que codifican un producto de gen de mamífero expresado diferencialmente y/o gen de ruta que incluye, pero sin carácter limitante, un producto del gen 200 humano y murino; (b) nucleótidos que codifican porciones de producto de gen expresado diferencialmente y/o gen de ruta que corresponde a sus dominios funcionales, y productos polipeptidicos codificados por tales secuencias de nucleótidos, y en los cuales, en el caso de productos génicos de tipo receptor, dichos dominios incluyen, pero sin carácter limitante, dominios extracelulares (ECD), dominios transmembranales (TM) y dominios citoplásmicos (CD); (c) nucleótidos que codifican mutantes de un producto del gen 200 expresado diferencialmente, en los cuales la totalidad o una parte de uno de sus dominios está delecionada o alterada, y que, en el caso de productos de genes de tipo receptor, dichos mutantes incluyen, pero sin carácter limitante, receptores solubles en los cuales la totalidad o una porción del TM está delecionada, y receptores no funcionales en los cuales la totalidad o una porción de CD está delecionada; y (d) nucleótidos que codifican proteínas de fusión que contienen un producto del gen 200 expresado diferencialmente o uno de sus dominios fusionado a otro polipéptido.
La invención incluye también moléculas de ácido nucleico, preferiblemente moléculas de DNA, que se hibridan a, y son por tanto los complementos de, las secuencias de DNA (a) a (d), en el párrafo anterior. Tales condiciones de hibridación pueden ser altamente severas o menos altamente severas, como se ha descrito arriba. En casos en los cuales las moléculas de ácido nucleico son desoxioligonucleótidos ("oligos"), condiciones altamente severas pueden hacer referencia, v.g., a lavado en 6 x SSC/pirofosfato de sodio al 0,05% a 37°C (para oligos de 14 bases), 48°C (para oligos de 17 bases), 55°C (para oligos de 20 bases), y 60°C (para oligos de 23 bases). Estas moléculas de ácido nucleico pueden actuar como moléculas antisentido de genes diana, útiles por ejemplo en regulación de genes diana y/o como iniciadores antisentido en reacciones de amplificación de secuencias de ácido nucleico de genes diana, genes de huella dactilar, y/o genes de ruta. Adicionalmente, tales secuencias pueden utilizarse como parte de secuencias de ribozima y/o de triple hélice, útiles también para regulación de genes diana. Aún más, tales moléculas pueden utilizarse como componentes de métodos de diagnóstico por los cuales puede detectarse la presencia de, o la predisposición a, un trastorno inmunológico, v.g., un trastorno relacionado con una subpoblación de células TH.
La invención abarca también (a) vectores de DNA que contienen cualquiera de las secuencias codificantes que anteceden y/o sus complementos (es decir, antisentido); (b) vectores de expresión de DNA que contienen cualquiera de las secuencias codificantes que anteceden asociada operativamente a un elemento regulador que dirige la expresión de las secuencias codificantes; y (c) células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que contienen cualquiera de las secuencias codificantes que anteceden asociada operativamente con un elemento regulador que dirige la expresión de las secuencias codificantes en la célula hospedadora. Tal como se utiliza en esta memoria, elementos reguladores incluyen, pero sin carácter limitante, promotores inducibles y no inducibles, intensificadores, operadores y otros elementos conocidos por los expertos en la técnica que dirigen y regulan la expresión. Tales elementos reguladores incluyen, pero sin carácter limitante, el gen temprano inmediato del citomegalovirus hCMV, los promotores tempranos o tardíos del adenovirus SV40, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, las regiones mayores operadoras y promotoras del fago A, las regiones de control de la proteína fd de la envoltura, el promotor para 3-fosfoglicerato-quinasa, los promotores de la fosfatasa ácida, y los promotores de los factores de levadura de apareamiento \alpha. La invención incluye fragmentos de cualquiera de las secuencias de DNA descritas en esta
memoria.
Además de las secuencias génicas arriba descritas, homólogos de estas secuencias génicas y/o secuencias codificantes de longitud total de estos genes, como pueden estar presentes en la misma u otras especies, pueden identificarse y aislarse, sin experimentación excesiva, por métodos de biología molecular bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, pueden existir genes en otros loci genéticos dentro del genoma de la misma especie que codifican proteínas que tienen homología extensa con uno o más dominios de tales productos génicos. Estos genes pueden identificarse también por técnicas similares.
Por ejemplo, la secuencia génica aislada y expresada diferencialmente puede marcarse y utilizarse para escrutar una genoteca de cDNA construida a partir de mRNA obtenido del organismo de interés. Las condiciones de hibridación deberían ser de una severidad menor cuando la genoteca de cDNA se ha derivado de un organismo diferente del tipo de organismo del que se ha derivado la secuencia marcada. El escrutinio de cDNA puede identificar también clones derivados de transcritos separados alternativamente por corte y empalme en la misma o diferentes especies. Alternativamente, el fragmento marcado puede utilizarse para escrutar una genoteca genómica derivada del organismo de interés, nuevamente, utilizando condiciones de severidad apropiadas. Las condiciones de severidad baja son bien conocidas por los expertos en la técnica, y variarán de modo predecible dependiendo de los organismos específicos de los que se derivan la genoteca y las secuencias marcadas. Para orientación con relación a condiciones de este tipo véase por ejemplo Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, Nueva York; y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y.).
Adicionalmente, una secuencia de tipo gen expresado diferencialmente o gen de ruta no conocida con anterioridad puede aislarse por realización de PCR utilizando dos agrupaciones de iniciadores oligonucleotídicos degeneradas diseñadas sobre la base de las secuencias de aminoácidos dentro del gen de interés. El molde para la reacción puede ser cDNA obtenido por transcripción inversa de mRNA preparado a partir de líneas de células o tejidos humanos o no humanos que se sabe o se sospecha expresan un alelo del gen expresado diferencialmente o gen de ruta. El producto de la PCR puede subclonarse y secuenciarse para asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una secuencia de ácido nucleico de tipo gen expresado diferencialmente o gen de ruta.
El fragmento PCR puede utilizarse luego para aislar un clon de cDNA de longitud total por una diversidad de métodos. Por ejemplo, el fragmento amplificado puede utilizarse para escrutar una genoteca de cDNA de bacteriófago. Alternativamente, el fragmento marcado puede utilizarse para escrutar una genoteca genómica.
La tecnología PCR puede utilizarse también para aislar secuencias de cDNA de longitud total. Por ejemplo, puede aislarse RNA, siguiendo procedimientos estándar, a partir de un fuente apropiada de célula o tejido. Puede realizarse una reacción de transcripción inversa sobre el RNA utilizando un iniciador oligonucleotídico específico para el extremo más próximo a 5' del fragmento amplificado para la iniciación de la síntesis de la primera cadena. El híbrido RNA/DNA resultante puede luego "proveerse de colas" con guaninas utilizando una reacción estándar de transferasa terminal, el híbrido puede digerirse con RNAasa H, y la síntesis de la segunda cadena puede iniciarse luego con un iniciador poli-C. De este modo, pueden aislarse fácilmente secuencias situadas aguas arriba del fragmento amplificado. Para una revisión de las estrategias de clonación que pueden utilizarse, véase v.g., Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).
En aquellos casos en que el gen expresado diferencialmente o gen de ruta identificado es el gen normal, o de tipo salvaje, este gen puede utilizarse para aislar alelos mutantes del gen. Un aislamiento de este tipo es preferible en aquellos procesos y trastornos que se sabe o se sospecha tienen una base genética. Los alelos mutantes pueden aislarse a partir de individuos que se sabe o se sospecha poseen un genotipo que contribuye a síntomas relacionados con trastornos de una subpoblación de células TH. Los alelos mutantes y los productos de los alelos mutantes pueden utilizarse luego en los sistemas de ensayo terapéuticos y de diagnóstico descritos más adelante.
Un cDNA de un gen mutante puede aislarse por ejemplo por utilización de PCR, un método que es bien conocido por los expertos en la técnica. En este caso, la primera cadena de cDNA puede sintetizarse por hibridación de un oligonucleótido oligo-dT a mRNA aislado a partir de un tejido que se sabe, o se sospecha, está expresado en un individuo que lleva supuestamente el alelo mutante, y por extensión de la nueva cadena con transcriptasa inversa. La segunda cadena de cDNA se sintetiza luego utilizando un oligonucleótido que se hibrida específicamente al extremo 5' del gen normal. Utilizando estos dos iniciadores, el producto se amplifica luego por PCR, se somete a clonación en un vector adecuado, y se somete a análisis de la secuencia de DNA por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por comparación de la secuencia de DNA del gen mutante con la del gen normal, puede(n) determinarse la o las mutaciones responsables de la pérdida o alteración de la función del producto del gen mutante.
Alternativamente, puede construirse y escrutarse una genoteca genómica o de cDNA utilizando DNA o RNA, respectivamente, a partir de un tejido que se sabe o se sospecha expresa el gen de interés en un individuo que se sabe o se sospecha es portador del alelo mutante. El gen normal o cualquier fragmento adecuado del mismo puede marcarse y utilizarse luego como una sonda para identificar el alelo mutante correspondiente en la genoteca. El clon que contiene este gen puede purificarse luego por métodos practicados rutinariamente en la técnica, y someterse a análisis de la secuencia como se ha descrito anteriormente en esta Sección.
Adicionalmente, puede construirse una genoteca de expresión utilizando DNA aislado de o cDNA sintetizado a partir de un tejido que se sabe o se sospecha expresa el gen de interés en un individuo que se sospecha o se sabe es portador del alelo mutante. De esta manera, productos génicos producidos por el tejido supuestamente mutante pueden expresarse y escrutarse utilizando técnicas estándar de escrutinio de anticuerpos en asociación con anticuerpos generados contra el producto del gen normal, como se describe, más adelante, en la Sección 5.6. (Para técnicas de escrutinio, véase por ejemplo Harlow, E. y Lane, compiladores, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.) En aquellos casos en los cuales la mutación da como resultado un producto génico expresado con función alterada (v.g., como resultado de una mutación de sentido erróneo), es probable que un conjunto de anticuerpos policlonales reaccione cruzadamente con el producto del gen mutante. Los clones de genoteca detectados por su reacción con tales anticuerpos marcados pueden purificarse y someterse a análisis de la secuencia como se describe anteriormente en esta Sección.
5.5 Productos de genes expresados diferencialmente y genes de camino
Los productos de genes expresados diferencialmente y genes de ruta incluyen aquellas proteínas codificadas por los genes expresados diferencialmente y genes de ruta correspondientes a las secuencias génicas descritas en la Sección 5.4 anteriormente como por ejemplo, los péptidos enumerados en las Figs. 17 y 24.
Adicionalmente, los productos de genes expresados diferencialmente y genes de ruta pueden incluir proteínas que representan productos de genes funcionalmente equivalentes. Tales productos génicos incluyen, pero sin carácter limitante, variantes naturales de los péptidos enumerados en Figs. 17 y 24. Un producto génico equivalente expresado diferencialmente o producto génico de camino de este tipo puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de genes expresados diferencialmente o genes de ruta descritas anteriormente en la Sección 5.4, pero que dan como resultado un cambio silencioso, produciendo así un producto de gen expresado diferencialmente o producto de gen de ruta funcionalmente equivalente. Pueden hacerse sustituciones de aminoácidos sobre la base de semejanza en polaridad, carga, solubilidad, carácter hidrófobo, carácter hidrófilo, y/o de la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina; aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina, e histidina; y aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. La expresión "funcionalmente equivalente", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una proteína capaz de exhibir una actividad sustancialmente similar in vivo a la de los productos endógenos de genes expresados diferencialmente o genes de ruta codificados por las secuencias de genes expresados diferencialmente o de camino descritas anteriormente en la Sección 5.4. Alternativamente, cuando se utiliza como parte de ensayos tales como los descritos más adelante en la Sección 5.3, la expresión "funcionalmente equivalente" puede hacer referencia a péptidos capaces de interaccionar con otras moléculas celulares o extracelulares de una manera sustancialmente similar a la forma en la que lo haría la porción correspondiente del producto del gen endógeno expresado diferencialmente o gen de ruta.
Péptidos correspondientes a uno o más dominios del producto del gen 200 expresado diferencialmente (v.g., TM, ECD o CD), productos del gen 200 truncados o delecionados expresados diferencialmente (v.g., en el caso de productos génicos de tipo receptor, proteínas en las cuales los productos del gen de longitud total expresados diferencialmente, un péptido del gen 200 expresado diferencialmente o el producto del gen 200 truncado expresado diferencialmente está fusionado a un proteína no afín están también dentro del alcance de la invención y pueden diseñarse sobre la base del nucleótido del gen 200 expresado diferencialmente y las secuencias de aminoácidos descritas en esta Sección y en la Sección 5.4, anteriormente. Tales proteínas de fusión incluyen, pero sin carácter limitante, fusiones IgFC que estabilizan el gen expresado diferencialmente o gen de ruta y prolongan su semi-vida in vivo; o fusiones con cualquier secuencia de aminoácidos, lo que hace posible que la proteína de fusión se una por anclaje a la membrana celular, permitiendo que se exhiban los péptidos en la superficie celular; o fusiones a una enzima, proteína fluorescente, o proteína luminiscente que proporcionan una función marcadora.
Otras mutaciones a la secuencia codificante del producto génico expresado diferencialmente o producto del gen de ruta pueden hacerse para generar polipéptidos que son más adecuados para la expresión, escalación, etc. en las células hospedadoras seleccionadas. Por ejemplo, pueden delecionarse o sustituirse residuos cisteína con otro aminoácido a fin de eliminar puentes disulfuro; en el caso de proteínas secretadas o transmembranales, pueden alterarse o eliminarse sitios de glicosilación enlazados a N para conseguir por ejemplo la expresión de un producto homogéneo que se recupera y purifica más fácilmente a partir de hospedadores de levadura que se sabe dan lugar a hiperglicosilación de sitios enlazados a N. A este fin, una diversidad de sustituciones de aminoácidos en una o ambas de las posiciones de los aminoácidos primero o tercero de una cualquiera o más de las secuencias de reconocimiento de glicosilación (N-X-S o N-X-T), y/o una deleción de aminoácido en la segunda posición de una cualquiera o más de tales secuencias de reconocimiento impedirán la glicosilación de la proteína en la secuencia modificada del tripéptido. (Véase, v.g., Miyajima et al., 1986, EMBO J. 5(6): 1193-1197).
Los productos génicos expresados diferencialmente o de camino pueden producirse por técnicas de síntesis o por tecnología de DNA recombinante utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Así, se describen en esta memoria métodos para la preparación de los polipéptidos de genes expresados diferencialmente o genes de ruta y péptidos de la invención. En primer lugar, los polipéptidos y péptidos de la invención pueden sintetizarse o prepararse por métodos bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo Creighton, 1983, "Proteins: Structures and Molecular Principles", W.H. Freeman and Co., N.Y., que se incorpora en esta memoria por referencia en su totalidad. Los péptidos pueden por ejemplo sintetizarse sobre un soporte sólido o en solución.
Alternativamente, pueden utilizarse métodos de DNA recombinante que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de proteínas de genes expresados diferencialmente o de camino y señales adecuadas de control de transcripción/traducción. Estos métodos incluyen por ejemplo técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse por ejemplo las técnicas descritas en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que se incorpora por referencia en esta memoria en su totalidad, y Ausubel, 1989, supra. Alternativamente, RNA capaz de codificar secuencias de proteínas de genes expresados diferencialmente o de camino puede sintetizarse químicamente utilizando por ejemplo sintetizadores. Véanse por ejemplo las técnicas descritas en "Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M.J. compilador, IRL Press, Oxford, que se incorpora por referencia en esta memoria en su totalidad. Pueden utilizarse una diversidad de sistemas hospedador-vector de expresión para expresar las secuencias codificantes de los genes expresados diferencialmente o de camino de la invención. Tales sistemas hospedador-expresión representan vehículos por los cuales pueden producirse y purificarse subsiguientemente las secuencias codificantes de interés, pero representan también células que pueden, una vez transformadas o transfectadas con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, exhibir in situ la proteína del gen expresado diferencialmente o de camino de la invención. Éstas incluyen, pero sin carácter limitante, microorganismos tales como bacterias (v.g., E. coli, B. subtilis) transformadas con DNA recombinante de bacteriófago, DNA plasmídico o vectores de expresión de DNA de cósmido que contienen secuencias codificantes de proteínas de genes expresados diferencialmente o de camino; levadura (v.g., Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen las secuencias codificantes de proteínas de los genes expresados diferencialmente o de camino; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (v.g., baculovirus) que contienen las secuencias codificantes de proteínas de los genes expresados diferencialmente o de camino; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (v.g., el virus del mosaico de la coliflor, CAMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (v.g., el plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de proteínas de los genes expresados diferencialmente o de camino; o sistemas de células de mamífero (v.g., COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de las células de mamífero (v.g., el promotor metalotioneína) o de virus de mamífero (v.g., el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7,5K del virus vaccinia).
En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse ventajosamente cierto número de vectores de expresión que dependen del uso propuesto para la proteína del gen expresado diferencialmente o de camino que se expresa. Por ejemplo, cuando debe producirse una gran cantidad de una proteína de este tipo, para la generación de anticuerpos o para escrutar genotecas de péptidos por ejemplo pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de niveles elevados de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero sin carácter limitante, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), en el cual la secuencia codificante de la proteína del gen expresado diferencialmente o gen de ruta puede ligarse individualmente al vector en marco con la región codificante lacZ de tal modo que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509); y análogos. También pueden utilizarse vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión-S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de las células lisadas por adsorción a cuentas de glutatión-agarosa seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan de modo que incluyan sitios de escisión por trombina o proteasa del factor Xa a fin de que la proteína clonada del gen diana pueda liberarse del resto GST.
En un sistema de insecto, se utiliza el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del gen expresado diferencialmente o de camino puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y ponerse bajo control de un promotor AcNPV ( por ejemplo el promotor polihedrina). La inserción con éxito de la secuencia codificante del gen expresado diferencialmente o de camino dará como resultado la desactivación del gen de polihedrina y la producción de virus recombinante no ocluido (es decir, virus que carece de la envoltura proteinácea codificada por el gen de polihedrina). Estos virus recombinantes se utilizan luego para infectar células de Spodoptera frugiperda en las cuales se expresa el gen insertado, (v.g., véase Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, Patente de EE.UU. Nº 4.215.051).
En las células hospedadoras de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En los casos en que se utiliza un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante de interés del gen expresado diferencialmente o de camino puede ligarse a un complejo transcripción de adenovirus/control de traducción, v.g., la secuencia promotor tardío y conductor tripartito. Este gen quimérico puede insertarse luego en el genoma del adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (v.g., la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la proteína del gen expresado diferencialmente o de camino en hospedadores infectados (v.g., véase Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659). Pueden requerirse también señales específicas de iniciación para la traducción eficiente de secuencias codificantes de genes insertadas expresadas diferencialmente o de camino. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos en que se inserta en el vector de expresión apropiado un gen entero expresado diferencialmente o de camino, con inclusión de su propio codón de iniciación y secuencias adyacentes, puede no ser necesaria ninguna señal adicional de control de la traducción. Sin embargo, en los casos en que se inserta solamente una porción de la secuencia codificante del gen expresado diferencialmente o de camino, deben proporcionarse señales de control de la traducción exógenas que incluyen, quizás, el codón de iniciación ATG. Adicionalmente, el codón de iniciación tiene que estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción de la inserción completa. Estas señales de control de la traducción exógenas y los codones de iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de expresión puede mejorarse por la inclusión de elementos intensificadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. adecuados (véase Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544).
Adicionalmente, puede seleccionarse una cepa de células hospedadoras que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico de la manera específica deseada. Tales modificaciones (v.g., glicosilación) y procesamiento (v.g., escisión) de productos proteínicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Células hospedadoras diferentes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación de las proteínas posterior a la traducción. Líneas de células o sistemas hospedadores apropiados pueden seleccionarse para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. A este fin, pueden utilizarse células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilación, y la fosforilación del producto génico. Células hospedadoras de mamífero de este tipo incluyen, pero sin carácter limitante, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38,
etc.
Para la producción a largo plazo y con rendimiento alto de proteínas recombinantes, se prefiere expresión estable. Por ejemplo, líneas de células que expresan de manera estable la proteína del gen expresado diferencialmente o de camino pueden modificarse por ingeniería genética. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación víricos, las células hospedadoras pueden transformarse con DNA controlado por elementos de control de la expresión apropiados (v.g., promotor, intensificador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. A continuación de la introducción del DNA extraño, las células modificables por ingeniería genética pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y se cambian luego a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas de células. Este método puede utilizarse ventajosamente para modificar por ingeniería genética líneas de células que expresan la proteína del gen expresado diferencialmente o de camino. Tales líneas de células modificadas por ingeniería genética pueden ser particularmente útiles en el escrutinio y la evaluación de compuestos que afectan a la actividad endógena de la proteína del gen expresado diferencialmente o de camino.
Pueden utilizarse cierto número de sistemas de selección, con inclusión, pero sin carácter limitante, de los genes de timidina-quinasa del virus del herpes símplex (Wigler, et al., 1977, Cell 11: 223), hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026), y adenina-fosforribosiltransferasa (Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817) que pueden emplearse en células tk^{-}, hgprt^{-} o aprt^{-}, respectivamente. Asimismo, puede utilizarse la resistencia a antimetabolitos como la base de la selección para los genes dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147).
Alternativamente, cualquier proteína de fusión puede purificarse fácilmente utilizando un anticuerpo específico para la proteína de fusión que se expresa. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht et al. permite la purificación fácil de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas de células humanas (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976). En este sistema, el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación de vaccinia de tal modo que el marco de lectura abierto del gen se fusiona por traducción a un marcador amino-terminal constituido por seis residuos histidina. Los extractos de las células infectadas con virus vaccinia recombinante se cargan en columnas de Ni^{2+} ácido nitriloacético-agarosa y las proteínas marcadas con histidina se eluyen selectivamente con tampones que contienen imidazol.
Cuando se utiliza como un componente de sistemas de ensayo tales como los descritos en esta memoria, la proteína del gen expresado diferencialmente o de camino puede marcarse, sea directa o indirectamente, para facilitar la detección de un complejo formado entre la proteína del gen expresado diferencialmente o de camino y una sustancia de ensayo. Puede utilizarse cualquiera de una diversidad de sistemas de marcación adecuados, con inclusión, pero sin carácter limitante, de radioisótopos tales como ^{125}I; sistemas de marcación enzimáticos que generan una señal colorimétrica o luz detectable cuando se exponen a un sustrato; y marcadores fluorescentes.
La marcación indirecta implica el uso de una proteína, tal como un anticuerpo marcado, que se fija específicamente a un producto génico expresado diferencialmente o de camino. Tales anticuerpos incluyen, pero sin carácter limitante, policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab.
En los casos en que se utiliza tecnología de DNA recombinante para producir la proteína del gen expresado diferencialmente o de camino para tales sistemas de ensayo, puede ser ventajoso elaborar por ingeniería genética proteínas de fusión que pueden facilitar la marcación (sea directa o indirecta), inmovilización, solubilidad y/o detección.
Proteínas de fusión que pueden facilitar la solubilidad y/o expresión, y pueden aumentar la semi-vida en sangre de la proteína, pueden incluir, pero sin carácter limitante, proteínas de fusión provistas de colas Ig. Métodos para la elaboración por ingeniería genética de tales proteínas de fusión provistas de colas Ig son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase por ejemplo la Patente de EE.UU. Nº 5.116.964, que se incorpora en esta memoria por referencia en su totalidad. Adicionalmente, además de la región Ig codificada por el vector IgG1, la porción Fc de la región Ig utilizada puede modificarse, por sustitución de aminoácidos, para reducir la activación del complemento y la fijación de Fc. (Véase, v.g., la Patente Europea Nº 239400 B1, de 3 de Agosto de 1994).
Entre las proteínas de fusión solubles provistas de colas Ig que pueden producirse se encuentran proteínas de fusión solubles provistas de colas Ig que contienen productos del gen 200. El gen 200 contenido dentro de tales proteínas de fusión puede comprender, respectivamente por ejemplo el dominio o porciones extracelulares del gen 200, preferiblemente porciones de fijación de ligandos, del mismo.
Los dominios de secuencia señal, extracelulares, transmembranales y citoplásmicos de los productos del gen 200 tanto murino como humano han sido esclarecidos y pueden utilizarse por ejemplo en la construcción de proteínas de fusión producto del gen 200-Ig. Específicamente, el producto del gen 200 murino de 280 aminoácidos (Fig. 2A-2D; SEQ ID NO: 10) contiene una secuencia señal desde aproximadamente el residuo aminoácido 1 hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 20, un dominio extracelular desde aproximadamente el residuo de aminoácido 21 hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 192, un dominio transmembranal desde aproximadamente el residuo de aminoácido 193 al residuo de aminoácido 214, y un dominio citoplásmico desde aproximadamente el residuo de aminoácido 215 al residuo de aminoácido 280. Adicionalmente, el producto de 301 aminoácidos del gen 200 humano (Fig. 4A-4D; SEQ ID NO: 24) contiene una secuencia señal desde el residuo de aminoácido 1 hasta aproximadamente 20, un dominio maduro extracelular desde aproximadamente el residuo de aminoácido 21 al 200, un dominio transmembranal desde aproximadamente el residuo de aminoácido 201 a 224, y un dominio citoplásmico desde aproximadamente el residuo de aminoácido 225 al 301. Dado el esclarecimiento de estos dominios, una persona con experiencia en la técnica podría ser capaz fácilmente de producir proteínas de fusión del producto del gen 200 solubles provistas de colas Ig. El ejemplo presentado, más adelante, en la Sección 10 describe la construcción de proteínas de fusión humanas y murinas producto del gen 200-Ig.
5.6 Anticuerpos específicos para productos génicos expresados diferencialmente o de camino
Se describen aquí métodos para la producción de anticuerpos capaces de reconocer específicamente uno o más epítopes de productos de genes expresados diferencialmente o de camino. Tales anticuerpos pueden incluir, sin carácter limitante, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), y fragmentos de fijación de epítopes de cualquiera de los anteriores. Las colas Ig de tales anticuerpos pueden modificarse para reducir la activación del complemento y la fijación de Fc. (Véase por ejemplo la Patente Europea Nº 239400 B1, de 3 de Agosto de 1994).
Tales anticuerpos pueden utilizarse por ejemplo en la detección de un producto de gen de huella dactilar, gen diana, o gen de ruta en una muestra biológica, y pueden utilizarse como parte de técnicas de diagnóstico. Alternativamente, dichos anticuerpos pueden utilizarse como parte de un método de tratamiento de trastornos inmunológicos, como se describe más adelante en la Sección 5.9. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse para modular la actividad de genes diana, pueden utilizarse para modular la diferenciación de subpoblaciones de células TH, función de mantenimiento y/o efectora o, en el caso de anticuerpos dirigidos contra epítopes de la superficie celular, pueden utilizarse para aislar una subpoblación de células TH de interés, para propósitos de agotamiento o aumento.
Para la producción de anticuerpos para un gen expresado diferencialmente o gen de ruta, pueden inmunizarse diversos animales hospedadores por inyección con una proteína del gen expresado diferencialmente o de camino, o una porción de la misma. Dichos animales hospedadores pueden incluir, pero sin carácter limitante, conejos, ratones y ratas, para nombrar sólo unos pocos. Pueden utilizarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, que incluyen, pero sin carácter limitante, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa bocallave, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno, tal como un producto del gen diana, o un derivado antigénico funcional del mismo. Para la producción de anticuerpos policlonales, animales hospedadores tales como los arriba descritos pueden inmunizarse por inyección con el producto del gen expresado diferencialmente o gen de ruta suplementado con adyuvantes como se ha descrito también arriba.
Los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno particular, pueden obtenerse por cualquier técnica que permita la producción de moléculas de anticuerpos por líneas de células continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero sin carácter limitante, la técnica del hibridoma de Kohler y Milstein (1975, Nature 256: 495-497; y la Patente de EE.UU. Nº 4.376.110), la técnica del hibridoma de las células B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030), y la técnica del hibridoma EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., pp. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina con inclusión de IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el mAb de esta invención puede cultivarse in vitro o in vivo. La producción de títulos altos de mAbs in vivo hace que éste sea el método de producción preferido actualmente.
Adicionalmente, pueden utilizarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454; Patente de EE.UU Nº 4.816.567) por corte y empalme de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón con especificidad de antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como aquéllos que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana.
Alternativamente, pueden utilizarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (Patente de EE.UU. Nº 4.946.778; Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546) y para la producción de anticuerpos monoclonales humanizados (Patente de EE.UU. Nº 5.225.539, que se incorpora en esta memoria por referencia en su totalidad) para producir anticuerpos anti-producto de gen expresado diferencialmente o anti-producto de gen de ruta.
Fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopes específicos pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, fragmentos de este tipo incluyen, pero sin carácter limitante: los fragmentos F(ab')_{2} que pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse por reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}. Alternativamente, pueden construirse genotecas de expresión de Fab (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos monoclonales Fab con la especificidad deseada.
Los anticuerpos para los productos génicos expresados diferencialmente o de camino pueden utilizarse, a su vez, para generar anticuerpos anti-idiotípicos que "mimetizan" tales productos génicos, utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. (Véase, v.g., Greenspan & Bona, 1993, FASEB J 7(5): 437-444; y Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147 (8): 2429-2438). Por ejemplo, en el caso de moléculas de tipo receptor (v.g., productos de los genes 10, 103 y 200), los anticuerpos que se fijan al ECD e inhiben competitivamente la fijación del ligando al receptor pueden utilizarse para generar anti-idiotipos que "mimetizan" el ECD y, por consiguiente, fijan y neutralizan el ligando. Tales anti-idiotipos neutralizantes o fragmentos Fab de tales anti-idiotipos pueden utilizarse en regímenes terapéuticos de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH.
5.7 Ensayos basados en células
Células que contienen y expresan secuencias de genes diana que codifican proteína de gen diana, y, ulteriormente, exhiben fenotipos celulares asociados con un trastorno de interés relacionado con subpoblaciones de células TH, pueden utilizarse para identificar compuestos que exhiben cierta capacidad para mejorar los síntomas de los trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Fenotipos celulares que pueden indicar una capacidad para mejorar los síntomas de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH pueden incluir por ejemplo una inhibición o potenciación de la expresión de marcadores de citoquinas o marcadores de la superficie celular, asociada con la subpoblación de células TH de interés, o, alternativamente, una inhibición o potenciación de subpoblaciones específicas de células TH.
Adicionalmente, el patrón de huella dactilar de la expresión génica de las células de interés puede analizarse y compararse con el patrón de huella dactilar normal del trastorno relacionado con subpoblaciones distintas de las células TH. Aquellos compuestos que hacen que las células que exhiben fenotipos celulares semejantes a un trastorno relacionado con subpoblaciones de células TH produzcan un patrón de huella dactilar que se asemeja más estrechamente a un patrón normal de huella dactilar para la célula de interés pueden considerarse candidatos para ensayos ulteriores relacionados con una capacidad para mejorar los síntomas de un trastorno relacionado con subpoblaciones de células TH.
Células que pueden utilizarse para tales ensayos pueden incluir por ejemplo líneas de células no recombinantes, tales como las líneas de células Dorris, AE7, D10.G4, DAX, D1.1 y CDC25. Adicionalmente, pueden utilizarse también células T inexpertas primarias purificadas derivadas de cepas transgénicas o no transgénicas.
Ulteriormente, células que pueden utilizarse para tales ensayos pueden incluir también líneas de células recombinantes transgénicas. Por ejemplo, los modelos animales de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH de la invención, expuestos anteriormente en la Sección 5.7.1, pueden utilizarse para generar por ejemplo líneas de células semejantes a los de tipo TH1 y/o TH2 que pueden utilizarse como modelos de cultivo de células para el trastorno de interés. Si bien pueden utilizarse cultivos primarios derivados de animales transgénicos de un trastorno relacionado con una subpoblación de células TH, se prefiere la generación de líneas de células continuas. Para ejemplos de técnicas que pueden utilizarse para derivar una línea de células continua a partir de los animales transgénicos, véase Small et al., 1985, Mol. Cell Biol. 5. 642-648.
Alternativamente, células de un tipo de células que se sabe está implicado en trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH pueden transfectarse con secuencias capaces de aumentar o disminuir la cantidad de expresión de genes diana dentro de la célula. Por ejemplo, pueden introducirse secuencias de genes diana en, y sobreexpresarse en, el genoma de la célula de interés, o bien, si están presentes secuencias de genes diana endógenas, aquéllas pueden sobreexpresarse o, alternativamente, pueden alterarse a fin de infraexpresar o desactivar la expresión del gen diana.
Para sobreexpresar una secuencia de gen diana, la porción codificante de la secuencia del gen diana puede ligarse a una secuencia reguladora que es capaz de impulsar la expresión del gen en el tipo de célula de interés. Tales regiones reguladoras serán bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden utilizarse en ausencia de experimentación excesiva.
Para infraexpresión de una secuencia de gen diana endógeno, dicha secuencia puede aislarse y modificarse por ingeniería genética de tal modo que cuando se reintroduce en el genoma del tipo de célula de interés, se desactiven los alelos del gen diana endógeno. Preferiblemente, la secuencia del gen diana modificada por ingeniería genética se introduce por direccionamiento del gen de tal modo que la secuencia diana endógena se altera después de la integración de la secuencia del gen diana modificada por ingeniería genética en el genoma de la célula. El direccionamiento de genes se expone anteriormente en la Sección 5.7.1.
La transfección de ácido nucleico de la secuencia del gen diana puede realizarse utilizando técnicas estándar. Véase por ejemplo Ausubel, 1989, supra. Las células transfectadas deben evaluarse respecto a la presencia de las secuencias del gen diana recombinante, en cuanto a la expresión y acumulación de mRNA del gen diana, y en cuanto a la presencia de la producción de proteínas del gen diana recombinante. En aquellos casos en que se desea una disminución en la expresión del gen diana, pueden utilizarse técnicas estándar para demostrar si se consigue una disminución en la expresión del gen diana endógeno y/o en la producción del producto del gen diana.
5.8 Ensayos de escrutinio para compuestos que interaccionan con el producto del gen diana
Los ensayos siguientes están diseñados para identificar compuestos que se fijan a productos del gen diana, se fijan a otras proteínas celulares que interaccionan con un producto del gen diana, y a compuestos que interfieren con la interacción del producto del gen diana con otras proteínas celulares. Por ejemplo, en el caso del producto del gen 200, que son o se predice son proteínas de tipo receptor transmembranal, dichas técnicas pueden identificar ligandos para tales receptores. Un ligando del producto del gen 200 puede actuar por ejemplo como la base para mejora de trastornos específicos semejantes a los de tipo TH1.
Los compuestos pueden incluir, pero sin carácter limitante, otras proteínas celulares. Adicionalmente, tales compuestos pueden incluir, pero sin carácter limitante, péptidos tales como por ejemplo péptidos solubles, que incluyen, pero sin carácter limitante, péptidos de fusión provistos de colas Ig, que comprenden porciones extracelulares de receptores transmembranales de productos del gen diana, y miembros de genotecas de péptidos aleatorias (véase, v.g., Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354: 82-84; Houghten, R. et al., 1991, Nature 354: 84-86) constituidos por aminoácidos de configuración D y/o L, fosfopéptidos (con inclusión, pero sin carácter limitante, de miembros de genotecas de fosfopéptidos dirigidas, aleatorias o parcialmente degeneradas; véase, v.g., Songyang, Z. et al., 1993, Cell 72: 767-778), anticuerpos (con inclusión, pero sin carácter limitante, de anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos o monocatenarios, y fragmentos Fab, F(ab')_{2} y de genotecas de expresión de Fab, así como fragmentos de fijación de epítope de los mismos), y pequeñas moléculas orgánicas o inorgánicas. En el caso de moléculas diana de tipo receptor, tales compuestos pueden incluir moléculas orgánicas (v.g., peptidomiméticas) que se fijan al ECD y mimetizan la actividad desencadenada por el ligando natural (es decir, agonistas); así como péptidos, anticuerpos, o fragmentos de los mismos, y otros compuestos orgánicos que mimetizan el ECD (o una porción del mismo) y se fijan para "neutralizar" un ligando natural.
Las tecnologías de modelización e investigación por ordenador permiten la identificación de compuestos, o la mejora de compuestos ya identificados, que pueden modular la expresión o actividad de genes diana o genes de ruta. Una vez identificado un compuesto o composición de este tipo, se identifican los sitios o regiones activos(as).
En el caso de compuestos que afectan a moléculas receptoras, tales sitios activos podrían ser típicamente sitios de fijación de ligando, tales como los dominios de interacción del ligando con el receptor propiamente dicho. El sitio activo puede identificarse utilizando métodos conocidos en la técnica que incluyen por ejemplo a partir de las secuencias de aminoácidos de péptidos, a partir de las secuencias de nucleótidos de ácidos nucleicos o a partir del estudio de complejos del compuesto o la composición relevante con su ligando natural. En el último caso, pueden utilizarse métodos químicos o de cristalografía con rayos X para encontrar el sitio activo por descubrimiento del lugar en que se encuentra el ligando complejado en el factor.
A continuación, se determina la estructura geométrica tridimensional del sitio activo. Esto puede hacerse por métodos conocidos, que incluyen cristalografía con rayos X, que pueden determinar una estructura molecular completa. Por otra parte, puede utilizarse NMR en fase sólida o líquida para determinar ciertas distancias intramoleculares. Puede utilizarse cualquier otro método experimental de determinación de estructuras para obtener estructuras geométricas parciales o completas. Las estructuras geométricas pueden medirse con un ligando complejado, natural o artificial, lo cual puede aumentar la exactitud de la estructura del sitio activo determinada.
Si se determina una estructura incompleta o insuficientemente exacta, pueden utilizarse los métodos numéricos de modelización basados en ordenador para completar la estructura o mejorar su exactitud. Puede utilizarse cualquier método de modelización reconocido, con inclusión de modelos paramétricos específicos para biopolímeros particulares tales como proteínas o ácidos nucleicos, modelos dinámicos moleculares basados en el cálculo de movimientos moleculares, modelos de mecánica estadística basados en conjuntos térmicos, o modelos combinados. Para la mayoría de los tipos de modelos, son necesarios campos de fuerzas moleculares estándar, que representan las fuerzas entre los átomos y grupos constituyentes, y pueden seleccionarse partiendo de campos de fuerzas conocidos en físico-química. Las estructuras experimentales incompletas o menos exactas pueden servir como limitaciones en cuanto a las estructuras completas y más exactas calculadas por estos métodos de modelización.
Por último, una vez determinada la estructura de sitio activo, sea experimentalmente, por modelización, o por una combinación, pueden identificarse compuestos moduladores candidato por búsqueda en bases de datos que contienen compuestos junto con información de su estructura molecular. Una investigación de este tipo busca compuestos que tengan estructuras que coincidan con la estructura determinada del sitio activo y que interaccionan con los grupos que definen el sitio activo. Una búsqueda de este tipo puede ser manual, pero preferiblemente está asistida por ordenador. Los compuestos encontrados a partir de esta búsqueda son compuestos moduladores potenciales del producto del gen diana o gen de ruta.
Alternativamente, estos métodos pueden utilizarse para identificar compuestos moduladores mejorados a partir de un compuesto o ligando modulador ya conocido. La composición del compuesto conocido puede modificarse y los efectos estructurales de la modificación pueden determinarse utilizando los métodos de modelización experimentales y de ordenador descritos arriba, aplicados a la misma composición. La estructura alterada se compara luego con la estructura del sitio activo del compuesto para determinar si se obtiene un ajuste o interacción mejorado. De esta manera pueden evaluarse rápidamente variaciones sistemáticas de composición, por ejemplo por variación de grupos laterales, a fin de obtener compuestos o ligandos moduladores modificados de especificidad o actividad mejoradas.
Otros métodos experimentales y de modelización por ordenador, útiles para identificar compuestos moduladores basados en la identificación de sitios activos de genes o productos de genes diana o de camino y factores de transducción y transcripción afines serán evidentes para los expertos en la técnica.
Ejemplos de sistemas de modelización molecular son los programas CHARMm y QUANTA (Polygen Corporation, Waltham, MA). CHARMm realiza las funciones de minimización de energía y dinámica molecular. QUANTA realiza la construcción, modelización gráfica y análisis de la estructura molecular. QUANTA permite la construcción, modificación, visualización, y análisis interactivos del comportamiento recíproco de moléculas.
Numerosos artículos revisan la modelización por ordenador de fármacos interactivos con proteínas específicas, tales como Rotivinen, et al., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97: 159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (16 de Junio, 1988); McKinaly y Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol Toxicol. 29;111-122; Perry y Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis y Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond., 236:125-140 y 141-162; y, con respecto a un receptor modelo para componentes de ácido nucleico, Askew, et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 1082-1090. Otros programas de ordenador que escrutan y representan gráficamente productos químicos están disponibles de compañías tales como BioDesign, Inc. (Pasadena, CA), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canadá), e Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario). Aunque estos están diseñados fundamentalmente para aplicación a fármacos específicos para proteínas particulares, pueden adaptarse para el diseño de fármacos específicos para regiones de DNA o RNA, una vez que se identifica dicha región.
Aunque se han descrito generalmente arriba con referencia al diseño y la generación de compuestos que podrían alterar la fijación, podrían escrutarse también genotecas de compuestos conocidos, con inclusión de productos naturales o productos químicos sintéticos, y materiales biológicamente activos, con inclusión de proteínas, para compuestos que son inhibidores o activadores.
Los compuestos identificados por ensayos tales como los descritos en esta memoria pueden ser útiles por ejemplo en la elaboración de la función biológica del producto del gen diana, y para mejora de los síntomas de trastornos inmunológicos. En aquellos casos por ejemplo en los que una situación de trastorno relacionada con una subpoblación de células TH es resultado de un nivel global inferior de expresión del gen diana, de un producto del gen diana, y/o de la actividad del producto del gen diana en una célula o tejido implicado en un trastorno de este tipo, los compuestos que interaccionan con el producto del gen diana pueden incluir aquéllos que acentúan o aumentan la actividad de la proteína unida al gen diana. Tales compuestos podrían producir un aumento efectivo en el nivel de actividad del gen diana, mejorando de este modo los síntomas. En los casos en que las mutaciones en el gen diana hacen que se produzcan proteínas aberrantes del gen diana que tienen un efecto deletéreo que conduce a un trastorno relacionado con una subpoblación de células TH, o, alternativamente, en casos en los cuales es necesaria la actividad normal del gen diana para que se produzca un trastorno relacionado con una subpoblación de células TH, pueden identificarse compuestos que se fijan a la proteína del gen diana que inhiben la actividad de la proteína unida al gen diana. Ensayos para identificación de compuestos adicionales así como para el ensayo de la eficacia de los compuestos, identificada por ejemplo por técnicas tales como las descritas en la Sección 5.8.1-5.8.3, se exponen, más adelante, en la Sección 5.8.4.
5.8.1 Ensayos de escrutinio in vitro para compuestos que se fijan a un producto del gen diana
Pueden diseñarse sistemas in vitro para identificar compuestos capaces de fijar los productos del gen diana de la invención. Los compuestos identificados pueden ser útiles por ejemplo en modulación de la actividad de productos del gen diana de tipo salvaje y/o mutantes, pueden ser útiles en la elaboración de la función biológica de productos de gen diana, pueden utilizarse en escrutinios para identificar compuestos que alteran las interacciones normales de productos de gen diana, o pueden interrumpir por sí mismos dichas interacciones.
El principio de los ensayos utilizados para identificar compuestos que se fijan al producto del gen diana implica preparar una mezcla de reacción del producto del gen diana y el compuesto de ensayo en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir que los dos componentes interaccionen y se unan, formando así un complejo que puede separarse y/o detectarse en la mezcla de reacción. Estos ensayos pueden conducirse de una diversidad de modos. Por ejemplo, un método para conducir un ensayo de este tipo implicaría anclar el producto del gen diana o la sustancia de ensayo en una fase sólida y detectar los complejos producto del gen diana/compuesto de ensayo anclados en la fase sólida al final de la reacción. En una realización de un método de este tipo, el producto del gen diana puede anclarse en una superficie sólida, y el compuesto de ensayo, que no se ha anclado, puede marcarse, sea directa o indirectamente.
En la práctica, pueden utilizarse convenientemente placas de microtitulación como la fase sólida. El componente anclado puede inmovilizarse por uniones no covalentes o covalentes. La unión no covalente puede realizarse recubriendo simplemente la superficie sólida con una solución de la proteína, seguido por secado. Alternativamente, puede utilizarse un anticuerpo inmovilizado, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, específico para la proteína a Inmovilizar para anclar la proteína a la superficie sólida. Las superficies pueden prepararse previamente y guardarse.
Para realizar el ensayo, el componente no inmovilizado se añade a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Una vez completada la reacción, se retiran los componentes que no han reaccionado (v.g., por lavado) en condiciones tales que cualesquiera complejos formados queden inmovilizados en la superficie sólida. La detección de los complejos anclados en la superficie sólida puede realizarse de diversas maneras. Donde el componente no inmovilizado previamente está pre-marcado, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que se han formado complejos. Donde el componente no inmovilizado previamente no está pre-marcado, puede utilizarse un marcador indirecto para detectar los complejos anclados en la superficie; v.g., utilizando un anticuerpo marcado específico para el componente no inmovilizado previamente (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directa o indirectamente con un anticuerpo anti-Ig marcado).
Alternativamente, puede conducirse una reacción en fase líquida, separar los productos de reacción de los componentes que no han reaccionado, y detectar los complejos; v.g., utilizando un anticuerpo inmovilizado específico para el producto del gen diana o el compuesto de ensayo para anclar cualesquiera complejos formados en solución, y un anticuerpo marcado específico para el otro componente del posible complejo para detectar complejos anclados.
5.8.2 Ensayos para proteínas celulares que interaccionan con la proteína del gen diana
Cualquier método adecuado para detectar interacciones proteína-proteína puede emplearse para identificar nuevas interacciones proteína diana-proteína celular o extracelular. Estos métodos se reseñan en la Sección 5.2.arriba para la identificación de genes de ruta, y pueden utilizarse aquí con respecto a la identificación de proteínas que interaccionan con proteínas diana identificadas.
5.8.3 Ensayos para compuestos que interfieren con la interacción producto del gen diana/macromolécula celular
Los productos del gen diana de la invención pueden interaccionar in vivo con una o más macromoléculas celulares o extracelulares, tales como proteínas. Tales macromoléculas pueden incluir, pero sin carácter limitante, moléculas de ácido nucleico e identificarse dichas proteínas por métodos tales como los descritos anteriormente en la Sección 5.8.2. Para los fines de esta descripción, se hace referencia en esta memoria a tales macromoléculas celulares y extracelulares como "parejas de fijación". Los compuestos que alteran tales interacciones pueden ser útiles en la regulación de la actividad de la proteína del gen diana, especialmente proteínas de genes diana mutantes. Tales compuestos pueden incluir, pero sin carácter limitante, moléculas tales como anticuerpos, péptidos, y análogos, como se describe por ejemplo en la Sección 5.8.1. anteriormente.
El principio básico de los sistemas de ensayo utilizados para identificar compuestos que interfieren con la interacción entre el producto del gen diana y su pareja o parejas de fijación celulares o extracelulares implica preparar una mezcla de reacción que contiene el producto del gen diana y la pareja de fijación en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir que ambos interaccionen y se unan, formando así un complejo. Para ensayar un compuesto en cuanto a actividad inhibidora, la mezcla de reacción se prepara en presencia y ausencia del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo puede incluirse inicialmente en la mezcla de reacción, o puede añadirse en un momento posterior a la adición del producto del gen diana y su pareja de fijación celular o extracelular. Se incuban mezclas de reacción de control sin el compuesto de ensayo o con un placebo. Se detecta luego la formación de cualesquiera complejos entre la proteína del gen diana y la pareja de fijación celular o extracelular. La formación de un complejo en la reacción de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo, indica que el compuesto interfiere con la interacción de la proteína del gen diana y la pareja de fijación interactiva. Adicionalmente, la formación de complejos en mezclas de reacción que contienen el compuesto de ensayo y la proteína del gen diana normal pueden compararse también con la formación de complejos en mezclas de reacción que contienen el compuesto de ensayo y una proteína del gen diana mutante. Esta comparación puede ser importante en aquellos casos en los cuales es deseable identificar compuestos que alteran las interacciones de las proteínas del gen diana mutante pero no las del gen diana normal.
El ensayo para compuestos que interfieren con la interacción de los productos del gen diana y las parejas de fijación puede conducirse en un formato heterogéneo u homogéneo. Los ensayos heterogéneos implican anclar el producto del gen diana o la pareja de fijación en una fase sólida y detectar los complejos anclados en la fase sólida al final de la reacción. En los ensayos homogéneos, se lleva a cabo toda la reacción en fase líquida. En cualquier enfoque, puede variarse el orden de adición de las sustancias reaccionantes para obtener diferente información acerca de los compuestos que se ensayan. Por ejemplo, los compuestos de ensayo que interfieren con la interacción entre los productos del gen diana y las parejas de fijación, v.g., por competición, pueden identificarse conduciendo la reacción en presencia de la sustancia de ensayo; es decir, por adición de la sustancia de ensayo a la mezcla de reacción antes de o simultáneamente a la proteína del gen diana y la pareja de fijación interactiva celular o extracelular. Alternativamente, los compuestos de ensayo que alteran los complejos preformados, v.g., compuestos con constantes de fijación más altas que desplazan uno de los componentes del complejo, pueden ensayarse por adición del compuesto de ensayo a la mezcla de reacción después que se han formado los complejos. Los diversos formatos se describen resumidamente a continuación.
En un sistema de ensayo heterogéneo, o bien la proteína del gen diana o la pareja de fijación interactiva celular o extracelular se ancla sobre una superficie sólida, mientras que la especie no anclada se marca, sea directa o indirectamente. En la práctica, se utilizan convenientemente placas de microtitulación. La especie anclada puede inmovilizarse por uniones no covalentes o covalentes. La unión no covalente puede realizarse simplemente recubriendo la superficie sólida con una solución del producto del gen diana o pareja de fijación y secado. Alternativamente, puede utilizarse un anticuerpo inmovilizado específico para la especie a anclar, a fin de anclar la o las especies a la superficie sólida. Las superficies pueden prepararse previamente y guardarse.
Para realizar el ensayo, la pareja de la especie inmovilizada se expone a la superficie recubierta con o sin el compuesto de ensayo. Una vez terminada la reacción, se eliminan los componentes que no han reaccionado (v.g., por lavado) y cualesquiera complejos formados quedarán inmovilizados en la superficie sólida. La detección de los complejos anclados en la superficie sólida puede realizarse de varias maneras. Donde la especie no inmovilizada está pre-marcada, la detección de marcador inmovilizado en la superficie indica que se han formado complejos. Donde la especie no inmovilizada no está pre-marcada, puede utilizarse un marcador indirecto para detectar complejos anclados en la superficie; v.g., utilizando un anticuerpo marcado específico para la especie inicialmente no inmovilizada (el anticuerpo, a su vez, puede estar marcado directa o indirectamente con un anticuerpo anti-Ig marcado). Dependiendo del orden de adición de los componentes de la reacción, los compuestos de ensayo que inhiben la formación del complejo o que alteran los complejos preformados pueden detectarse.
Alternativamente, la reacción puede conducirse en una fase líquida en presencia o ausencia del compuesto de ensayo, separarse los productos de reacción de los componentes que no han reaccionado, y detectarse los complejos; v.g., utilizando un anticuerpo inmovilizado específico para uno de los componentes de fijación a fin de anclar cualesquiera complejos formados en solución, y un anticuerpo marcado específico para la otra pareja a fin de detectar los complejos anclados. Una vez más, dependiendo del orden de adición de las sustancias reaccionantes a la fase líquida, pueden identificarse compuestos de ensayo que inhiben el complejo o que alteran los complejos preformados.
En una realización alternativa de la invención, puede utilizarse un ensayo homogéneo. En este enfoque, se prepara un complejo preformado de la proteína del gen diana y la pareja de fijación interactiva celular o extracelular en el cual o bien el producto del gen diana o su pareja de fijación está marcado, pero la señal generada por el marcador está apagada debido a formación de complejo (véase, v.g., la Patente de EE.UU. Nº 4.109.496 por Rubenstein que utiliza este enfoque para inmunoensayos). La adición de una sustancia de ensayo que compite con y desplaza una de las especies del complejo preformado dará como resultado la generación de una señal por encima del ruido de fondo. De este modo, pueden identificarse sustancias de ensayo que alteran la interacción proteína del diana/pareja de fijación celular o extracelular.
En una realización particular, el punto del gen diana puede prepararse para inmovilización utilizando técnicas de DNA recombinante descritas anteriormente en la Sección 5.5. Por ejemplo, la región codificante del gen diana puede fusionarse a un gen de glutatión-S-transferasa (GST) utilizando un vector de fusión, tal como pGEX-5X-1, de tal manera que su actividad de fijación se mantiene en la proteína de fusión resultante. La pareja de fijación interactiva celular o extracelular puede purificarse y utilizarse para generar un anticuerpo monoclonal, utilizando métodos practicados rutinariamente en la técnica y descritos arriba, en la Sección 5.6. Este anticuerpo puede marcarse con el isótopo radiactivo ^{125}I por ejemplo por métodos practicados rutinariamente en la técnica. En un ensayo heterogéneo, v.g., la proteína de fusión GST-gen diana puede anclarse a cuentas de glutatión-agarosa. La pareja de fijación interactiva celular o extracelular puede añadirse luego en presencia o ausencia del compuesto de ensayo de una manera que permite que se produzcan interacción y fijación. Al final del período de reacción, el material no fijado puede eliminarse por lavado, y el anticuerpo monoclonal marcado puede añadirse al sistema y permitir que se fije a los componentes complejados. La interacción entre la proteína del gen diana y la pareja de fijación interactiva celular o extracelular puede detectarse por medida de la cantidad de radiactividad que permanece asociada con las cuentas de glutatión-agarosa. Una inhibición satisfactoria de la interacción por el compuesto de ensayo dará como resultado una disminución en la radiactividad medida.
Alternativamente, la proteína de fusión GST-gen diana y la pareja de fijación interactiva celular o extracelular pueden mezclarse una con otra en fase líquida en ausencia de las cuentas de glutatión-agarosa sólidas. El compuesto de ensayo puede añadirse durante o después de la interacción de las especies. Esta mezcla puede añadirse luego a las cuentas de glutatión-agarosa y el material no fijado se elimina por lavado. Una vez más, el grado de inhibición de la interacción producto del gen diana/pareja de fijación puede detectarse por adición del anticuerpo marcado y medida de la radiactividad asociada con las cuentas.
En otra realización de la invención, pueden emplearse estas mismas técnicas utilizando fragmentos de péptidos que corresponden a los dominios de fijación del producto del gen diana y/o la pareja de fijación interactiva celular o extracelular (en los casos en que la pareja de fijación es una proteína), en lugar de una o ambas de las proteínas de longitud total. Puede utilizarse cualquier número de métodos practicados rutinariamente en la técnica para identificar y aislar los sitios de fijación. Estos métodos incluyen, pero sin carácter limitante, mutagénesis del gen que codifica una de las proteínas y escrutinio en cuanto a la interrupción de la fijación en un ensayo de co-inmunoprecipitación. Después de ello pueden seleccionarse las mutaciones de compensación en el gen que codifica la segunda especie en el complejo. El análisis de la secuencia de los genes que codifican las proteínas respectivas revelará las mutaciones que corresponden a la región de la proteína implicada en la unión interactiva. Alternativamente, una proteína puede anclarse a una superficie sólida utilizando métodos descritos anteriormente en esta Sección, y permitir su interacción con y su fijación a su pareja de fijación marcada, que se ha tratado con una enzima proteolítica, tal como tripsina. Después del lavado, un péptido corto marcado que comprende el dominio de fijación puede quedar asociado con el material sólido, que puede aislarse e identificarse por secuenciación de aminoácidos. Asimismo, una vez que se obtiene el gen que codifica la pareja de fijación celular o extracelular, pueden diseñarse por ingeniería genética segmentos cortos del gen que expresan fragmentos peptídicos de la proteína, los cuales pueden ensayarse luego respecto a actividad de fijación y purificarse o sintetizarse.
Por ejemplo, y sin carácter limitante, puede anclarse un producto del gen diana a un material sólido como se ha descrito anteriormente en esta Sección, produciendo una proteína de fusión GST-gen diana y dejando que la misma se fije a cuentas de glutatión-agarosa. La pareja de fijación interactiva celular o extracelular puede marcarse con un isótopo radiactivo, tal como ^{35}S, y escindirse con una enzima proteolítica tal como tripsina. Los productos de escisión pueden añadirse luego a la proteína de fusión GST-gen diana anclada y puede permitirse su fijación. Después de la eliminación por lavado de los péptidos no fijados, el material marcado fijado, que representa el dominio de fijación de la pareja de fijación celular o extracelular, puede eluirse, purificarse, y analizarse en cuanto a secuencia de aminoácidos por métodos bien conocidos. Los péptidos así identificados pueden producirse sintéticamente o fusionarse a proteínas facilitadoras apropiadas utilizando tecnología de DNA recombinante bien conocida.
5.8.4 Ensayos para mejora de los síntomas de trastornos inmunológicos y/o la modulación de la función del producto de gen diana
Cualquiera de los compuestos de fijación, con inclusión pero sin carácter limitante de compuestos tales como los identificados en los sistemas de ensayo que anteceden, puede probarse en cuanto a la capacidad para mejorar los síntomas de trastornos inmunológicos, v.g., trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. A continuación se describen ensayos basados en células y basados en modelos animales para la identificación de compuestos que exhiben dicha capacidad para mejorar los síntomas de trastornos inmunológicos.
En primer lugar, pueden utilizarse sistemas basados en células tales como los descritos anteriormente en la Sección 5.7.2, a fin de identificar compuestos que pueden actuar para mejorar los síntomas de los trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Por ejemplo, dichos sistemas de células pueden exponerse a un compuesto que se sospecha exhibe capacidad para mejorar los síntomas del trastorno, a una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para provocar dicha mejora en las células expuestas. Después de la exposición, se examinan las células para determinar si uno o más de los fenotipos celulares semejantes al trastorno relacionado con la subpoblación de las células TH se ha alterado para asemejarse a un fenotipo que produzca más probablemente una menor incidencia o gravedad de los síntomas del trastorno. Ensayos adicionales basados en células se exponen, más adelante, en la Sección 5.8.4.1.
Considerando como trastorno relacionado con las subpoblaciones de células TH el asma, que es específicamente un trastorno afín semejante a TH2, puede utilizarse cualquier sistema de células TH2 o semejantes a TH2. Después de la exposición a tales sistemas de células, pueden ensayarse compuestos en cuanto a su capacidad para modular el fenotipo semejante a TH2 de dichas células, de tal modo que las células exhiban la pérdida de un fenotipo semejante a TH2. Los compuestos que poseen dicha capacidad moduladora de TH2 representan compuestos que pueden exhibir potencialmente la capacidad para mejorar in vivo los síntomas relacionados con el asma.
Adicionalmente, pueden utilizarse sistemas basados en animales, tales como los descritos arriba en la Sección 5.7.1, para identificar compuestos capaces de mejorar los síntomas semejantes a trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Tales modelos animales pueden utilizarse como sustratos de ensayo para la identificación de fármacos, productos farmacéuticos, terapias, e intervenciones que pueden ser eficaces en el tratamiento de dichos trastornos. Por ejemplo, pueden exponerse modelos animales a un compuesto que se sospecha exhibe capacidad para mejorar los síntomas de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, a una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para provocar dicha mejora de los síntomas en los animales expuestos. La respuesta de los animales a la exposición, y por consiguiente la eficacia del compuesto en cuestión, puede monitorizarse por evaluación de la inversión de los trastornos asociados con los trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH de interés. Con relación a la intervención, cualesquiera tratamientos que inviertan cualquier aspecto de los síntomas semejantes a trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH deberían considerarse como candidatos para la intervención terapéutica correspondiente del trastorno relacionado con la subpoblación de las células TH humanas. Las dosificaciones de los agentes de ensayo pueden determinarse por obtención de curvas dosis-respuesta, como se expone más adelante en la Sección 5.10.
Pueden utilizarse patrones de expresión génica en asociación con sistemas basados en células o basados en animales, para evaluar la capacidad de un compuesto para mejorar síntomas semejantes a trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Por ejemplo, el patrón de expresión de uno o más genes de huella dactilar puede formar parte de un perfil de huella dactilar que puede utilizarse luego en una evaluación de este tipo. Los perfiles de huella dactilar se describen, más adelante, en la Sección 5.11. Los perfiles de huella dactilar pueden caracterizarse para estados conocidos, sean estados de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, o estados diferenciadores de células TH normales, en los sistemas modelo basados en células y/o animales.
5.8.4.1 Métodos para la identificación de compuestos que modulan la función del producto del gen diana
En esta Sección se describen métodos para la identificación de compuestos que actúan como agonistas o antagonistas de los productos receptores del gen diana.
Los compuestos ensayados pueden ser por ejemplo compuestos tales como los identificados por los ensayos descritos anteriormente en las Secciones 5.8.1. a 5.8.3. Tales compuestos pueden incluir, pero sin carácter limitante, péptidos tales como por ejemplo péptidos solubles que incluyen, pero sin carácter limitante, péptidos de fusión provistos de colas Ig, que comprenden porciones extracelulares de receptores transmembranales de productos del gen diana, y miembros de genotecas de péptidos aleatorias (véase, v.g., Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354: 82-84; Houghten, R. et al., 1991, Nature 354: 84-86) constituidas por aminoácidos con configuración D y/o L, fosfopéptidos (con inclusión, pero sin carácter limitante, de miembros de genotecas de fosfopéptidos dirigidas, aleatorias o parcialmente degeneradas; véase, v.g., Songyang, Z. et al., 1993, Cell 72: 767-778), anticuerpos (con inclusión, pero sin carácter limitante, de anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos o monocatenarios, y fragmentos de genotecas de expresión Fab, F(ab')_{2} y FAb, así como fragmentos de fijación de epítope de los mismos), y pequeñas moléculas orgánicas o inorgánicas.
Los ensayos descritos en esta memoria son ensayos funcionales que identifican compuestos que afectan a la actividad receptora del gen diana por afectar al nivel de liberación intracelular de calcio. La modulación (es decir, la agonización o antagonización) de la función del producto receptor del gen diana, podría dar luego como resultado una diferencia en los niveles de calcio intracelular.
Los ensayos comprenden poner en contacto una célula que expresa el receptor del gen diana con un compuesto de ensayo y medir el nivel de calcio intracelular. Aquellos compuestos que producen un perfil intracelular de calcio que difiere del que exhibiría la célula en ausencia del compuesto representan agonistas o antagonistas. Un compuesto agonista causaría un aumento en los niveles de calcio intracelular con relación a las células de control, mientras que un antagonista daría como resultado una disminución en los niveles de calcio intracelular con relación a las células de control.
Se prefiere utilizar células cuyos niveles de calcio intracelular puedan medirse fácilmente. Los oocitos de Xenopus, debido a su gran tamaño, se encuentran entre tales células preferidas debido a que pueden inyectarse fácilmente con compuestos informadores del calcio intracelular. Adicionalmente, pueden utilizarse células de mieloma. Tales compuestos informadores incluyen, pero sin carácter limitante, agentes de fijación de calcio tales como los bien conocidos FURA-2 e INDO-2. Los complejos FURA-2/calcio y los complejos INDO-2/calcio emiten fluorescencia, lo cual hace posible la medida de diferencias en los niveles de calcio intracelular.
Para los propósitos de los ensayos descritos en esta memoria, los oocitos de Xenopus deberían transfectarse con secuencias de nucleótidos que codifiquen la proteína diana de interés. Las células pueden transfectarse y expresar la secuencia de interés por métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica y que pueden incluir por ejemplo técnicas tales como las descritas anteriormente en la Sección 5.5. Los oocitos de Xenopus pueden inyectarse con RNA codificante del producto del gen diana de interés de tal modo que los oocitos inyectados expresen el producto del gen.
Los ensayos descritos en esta Sección pueden, primeramente, utilizarse para identificar compuestos que actúan como agonistas del producto del gen diana de interés. "Agonista" como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un compuesto que modula la actividad del producto del gen diana por aumentar la actividad del producto del gen diana, tal como se evalúa por la capacidad del compuesto para producir un aumento en el aflujo de calcio, conduciendo a un aumento en los niveles de calcio intracelular. Entre dichos agonistas pueden encontrarse por ejemplo el ligando natural para el producto receptor del gen diana.
Los agonistas identificados por tales ensayos pueden actuar como agentes terapéuticos útiles para la mejora de una extensa gama de trastornos relacionados con las células T, que incluyen por ejemplo trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, en casos en los cuales dichos trastornos están causados por un nivel reducido o inexistente de actividad del producto del gen diana. Cualquiera de los compuestos agonistas identificados en esta memoria puede utilizarse por ejemplo como parte de los métodos de tratamiento descritos en la Sección 5.9.2 más adelante. Adicionalmente, dichos agonistas pueden utilizarse para identificar antagonistas del producto receptor del gen diana de interés, v.g., como se describe a continuación.
"Antagonista", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un compuesto que modula la actividad del producto del gen diana por disminución de la actividad del producto del gen diana como se evalúa por la capacidad del compuesto para producir una disminución en el aflujo de calcio. Los agonistas identificados por tales ensayos pueden actuar como agentes terapéuticos útiles para la mejora de una extensa gama de trastornos relacionados con las células T, que incluyen por ejemplo trastornos relacionados con una subpoblación de células TH, en casos en los cuales el trastorno está causado por un nivel incrementado o inadecuado de actividad del producto del gen diana.
Puede realizarse un escrutinio de antagonistas utilizando células que expresan el producto del gen diana como se ha descrito arriba. En aquellos casos en los cuales el trastorno relacionado con las células T está causado por un producto de gen diana mutante, las células utilizadas en el ensayo de antagonistas pueden ser células que expresan el producto receptor del gen diana mutante implicado en el origen del trastorno relacionado con las células T.
Para realizar un escrutinio de antagonistas, una célula que expresa el gen diana se pone en contacto con 1) un agonista del producto del gen diana y 2) un compuesto de ensayo durante un período de tiempo dado. Se mide luego el nivel de calcio intracelular en las células y en células que han estado en contacto con el antagonista solo. Se considera que un compuesto de ensayo es un antagonista si el nivel de liberación de calcio intracelular en presencia del compuesto de ensayo es menor que el nivel de liberación de calcio intracelular en ausencia del compuesto de ensayo.
Cualquiera de los compuestos antagonistas identificados en esta memoria puede utilizarse por ejemplo como parte de los métodos de tratamiento descritos, más adelante, en la Sección 5.9.1.
Entre los compuestos antagonistas potenciales de los productos receptores del gen diana de siete dominios transmembranales descritos en esta memoria se encuentran péptidos que contienen uno o más de los dominios extracelulares del producto receptor del gen diana, siendo preferiblemente aquellos dominios que son responsables de la fijación de ligandos de tal modo que los péptidos actúan para competir con el receptor endógeno del ligando.
5.9 Compuestos y métodos para tratamiento de trastornos inmunológicos y para modulación de la sensibilidad de las células TH
Se describen a continuación métodos y composiciones que pueden utilizarse para mejorar síntomas de trastornos inmunológicos mediante por ejemplo una modulación de la subpoblación de células TH de interés. Dicha modulación puede ser de naturaleza positiva o negativa, dependiendo de la situación específica de que se trate, pero cada suceso de modulación produce un resultado neto en el cual se mejoran los síntomas del trastorno inmunológico. Adicionalmente, se describen a continuación métodos para la modulación de la sensibilidad de las células TH a un antígeno.
"Modulación negativa", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una reducción en el nivel y/o la actividad del producto del gen diana con relación al nivel y/o actividad del producto del gen diana en ausencia del tratamiento modulador. Alternativamente, el término, tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un agotamiento de la subpoblación de células T (v.g., por una reducción en el número de células pertenecientes a la subpoblación de células TH) con relación al número presente en ausencia del tratamiento modulador. "Agotamiento", tal como se utiliza en esta memoria, es como se define arriba en la Sección 3.
"Modulación positiva", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un aumento en el nivel y/o la actividad del producto del gen diana con relación al nivel y/o la actividad del producto del gen en ausencia del tratamiento modulador. Alternativamente, el término, tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una estimulación de la subpoblación de células T (v.g., por un aumento en el número de células pertenecientes a la subpoblación de células TH), con relación al número presente en ausencia del tratamiento modulador. "Estimulación", como se utiliza en esta memoria, es como se ha definido arriba en la Sección 3.
Es posible que pueda producirse un trastorno relacionado con una subpoblación de células TH u otro trastorno inmunológico como resultado de la actividad normal del gen diana durante el curso de por ejemplo la exposición a cierto antígeno que provoca una respuesta inmunológica que conduce al desarrollo del trastorno. Por ejemplo, los trastornos relacionados posiblemente con los de las células TH2, asma y alergia, son candidatos probables de trastornos que poseen un mecanismo de este tipo. Adicionalmente, un trastorno puede producirse, al menos en parte, por un nivel anormalmente alto del producto del gen diana, o por la presencia de un producto del gen diana que exhibe una actividad anormal. Como tal, una técnica que provoca un efecto modulador negativo, es decir, que produce una reducción en el nivel y/o la actividad del producto del gen diana, o alternativamente, produce un agotamiento de la subpoblación de células TH (v.g., por una reducción física en el número de células pertenecientes a la subpoblación de células TH), podría dar lugar a una mejora de los síntomas del trastorno relacionado con la subpoblación de células TH en cualquiera de los escenarios anteriores.
Técnicas moduladoras negativas para la reducción de los niveles de expresión del gen diana o los niveles de actividad del producto del gen diana (sean normales o anormales), y para la reducción en el número de células de una subpoblación específica de células TH se exponen más adelante en la Sección 5.9.1.
Alternativamente, es posible que puedan producirse un trastorno relacionado con una subpoblación de células TH u otros trastornos inmunológicos, al menos en parte, por la ausencia o reducción del nivel de expresión del gen diana, una reducción en el nivel de actividad de un producto del gen diana, o una reducción en el número global de células pertenecientes a una subpoblación de células TH específica. Como tal, una técnica que provoca un efecto modulador positivo, es decir, produce un aumento en el nivel de expresión del gen diana y/o la actividad de los productos de dicho gen, o, alternativamente, una estimulación de la subpoblación de células TH (v.g., por un aumento físico en el número de células pertenecientes a una subpoblación de células TH), podría producir una mejora de los síntomas del trastorno inmunológico.
Por ejemplo, una reducción en el número global de células semejantes a TH1 con relación a las células semejantes a TH2 en un individuo infectado por HIV puede estar en correlación con la progresión del SIDA (Clerci, M. et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 759; Clerci, M. et al.,1993, Science 262: 1721; Maggi, E. et al., 1994, Science 265: 244). Un tratamiento capaz de aumentar el número de células semejantes a TH1 con relación a las células semejantes a TH2 en un individuo infectado por HIV puede, por consiguiente, servir para prevenir o ralentizar la progresión hacia la enfermedad.
Técnicas moduladoras positivas para aumentar los niveles de expresión del gen diana o los niveles de actividad del producto del gen diana, y para aumentar el nivel de las células de subpoblaciones de células TH específicas se exponen, más adelante, en la Sección 5.9.2.
Entre los trastornos inmunológicos cuyos síntomas pueden mejorarse se encuentran trastornos inmunológicos relacionados con TH1 o semejantes a TH1 y trastornos inmunológicos relacionados con TH2 o semejantes a TH2. Ejemplos de trastornos relacionados con TH1 o semejantes a TH1 incluyen enfermedades y trastornos inflamatorios crónicos, tales como enfermedad de Crohn, artritis reactiva, con inclusión de la enfermedad de Lyme, diabetes dependiente de insulina, autoinmunidad organoespecífica, con inclusión de esclerosis múltiple, tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Grave, dermatitis de contacto, psoriasis, rechazo de injertos, enfermedad de rechazo inverso y sarcoidosis. Ejemplos de trastornos relacionados con TH2 o semejantes a TH2 incluyen afecciones atópicas, tales como asma y alergia, con inclusión de rinitis alérgica, alérgicas gastrointestinales, con la inclusión de alérgicas alimentarias, eosinofilia, conjuntivitis, nefritis glomerular, ciertas susceptibilidades a patógenos tales como infecciones helmínticas (v.g., leishmaniasis) y ciertas infecciones víricas, con inclusión de HIV, e infecciones bacterianas, con inclusión de tuberculosis y lepra lepromatosa.
Los métodos descritos en esta memoria pueden utilizarse adicionalmente para modular el nivel de sensibilidad por ejemplo sensibilidad a antígenos, de una subpoblación de células TH. Tales métodos son importantes en el sentido de que muchos trastornos inmunológicos implican respuestas inmunológicas inadecuadas más bien que insuficientes. Por ejemplo, trastornos tales como las afecciones atópicas o alérgicas mediadas por IgE, con inclusión de asma, susceptibilidades a patógenos y enfermedad inflamatoria crónica, implican respuestas inmunológicas mediadas por TH2 fuertes pero contraproducentes. Adicionalmente, una respuesta inmunológica inadecuada a auto-antígenos mediada por TH1 es fundamental para el desarrollo de trastornos tales como esclerosis múltiple, psoriasis, diabetes dependiente de insulina, tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Crohn.
Los métodos para modular la sensibilidad de las células TH pueden comprender por ejemplo poner en contacto un compuesto con una célula TH de tal manera que la sensibilidad de las células T adyuvantes se module con relación a la sensibilidad de las células T adyuvantes en ausencia del compuesto. La modulación puede aumentar o disminuir la sensibilidad de las células TH. Cualquiera de los métodos descritos a continuación en las Secciones 5.9.1-5.9.3.2 puede utilizarse para efectuar una modulación adecuada de la sensibilidad de las células TH.
5.9.1 Técnicas moduladoras negativas
Como se ha expuesto anteriormente, el tratamiento con éxito de ciertos trastornos inmunológicos puede conseguirse por técnicas que sirven para inhibir la expresión o actividad de productos del gen diana, o que, alternativamente, sirven para reducir el número global de células pertenecientes a una subpoblación específica de células TH.
Por ejemplo, compuestos tales como los identificados por los ensayos descritos anteriormente en la Sección 5.8, que exhiben actividad moduladora negativa, pueden utilizarse de acuerdo con la invención para mejorar ciertos síntomas de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Como se ha expuesto anteriormente en la Sección 5.8, tales moléculas pueden incluir, pero sin carácter limitante, péptidos (tales como por ejemplo péptidos que representan porciones extracelulares solubles de receptores transmembranales del producto del gen diana), fosfopéptidos, pequeñas moléculas orgánicas o inorgánicas, o anticuerpos (con inclusión por ejemplo de anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos o monocatenarios, y fragmentos FAb, F(ab')_{2} y de genotecas de expresión de FAb, y fragmentos de fijación de epítopes de los mismos). Técnicas para la determinación de dosis eficaces y la administración de tales compuestos se describen, más adelante, en la Sección 5.10.
Adicionalmente, moléculas antisentido y moléculas de ribozima que inhiben la expresión del gen diana pueden utilizarse también de acuerdo con la invención para reducir el nivel de expresión del gen diana, reduciendo así eficazmente el nivel de actividad del gen diana. Además, pueden utilizarse moléculas de triple hélice en la reducción del nivel de actividad del gen diana. Dichas técnicas se describen, más adelante, en la Sección 5.9.1.1.
Adicionalmente, técnicas para el agotamiento de subpoblaciones específicas de células TH se exponen, más adelante, en la Sección 5.9.3. Tales técnicas pueden aprovechar la ventaja de por ejemplo nuevos marcadores de la superficie celular que son específicos para la subpoblación de células TH a agotar, y pueden incluir destrucción direccionada in vivo o in vitro, o, alternativamente, eliminación selectiva por purificación de la subpoblación de células TH de interés.
El nuevo gen 200, que codifica un producto receptor del gen diana que es un miembro de la superfamilia Ig, exhibe un patrón de expresión génica específico de TH1. El gen 200, especialmente el gen 200 humano, y sus productos pueden utilizarse, por consiguiente, en el tratamiento de trastornos relacionados con la subpoblación de células TH1 tales como por ejemplo enfermedades inflamatorias crónicas, psoriasis, rechazo de injertos y enfermedad de rechazo inverso.
El tratamiento de dicho trastorno puede requerir una reducción en la actividad y/o concentración eficaz de la subpoblación de células TH1 implicada en el trastorno de interés. Así, existen varios métodos por los cuales pueden utilizarse los productos específicos del gen 200 para efectuar dicha reducción en la actividad y/o concentración eficaz de células TH1. Por ejemplo, ligandos naturales, derivados de ligandos naturales y anticuerpos que se fijan al producto del gen 200 pueden utilizarse para reducir el número de células TH1 presentes, o bien por separación física de tales células con respecto a otras células en una población, delecionando con ello la subpoblación de células TH1, o bien, alternativamente, por direccionamiento de la destrucción específica de las células TH1. Dichas técnicas se exponen, más adelante, en la Sección 5.9.3. Adicionalmente, tales compuestos pueden utilizarse para inhibir la proliferación de células TH1.
Adicionalmente, pueden administrarse compuestos que compiten con el ligando endógeno para el producto del gen 200. Tales compuestos podrían fijarse a y "neutralizar" el ligando circulante. La reducción resultante en la cantidad de proteína transmembranal del gen 200 fijada al ligando modulará la actividad celular de TH1. Compuestos que pueden ser particularmente útiles para este propósito incluyen por ejemplo proteínas o péptidos solubles, tales como péptidos que comprenden el dominio extracelular, o porciones y/o análogos de los mismos, del producto del gen 200, que incluyen por ejemplo proteínas de fusión solubles tales como proteínas de fusión provistas de colas Ig o anticuerpos. (Para una exposición de la producción de proteínas de fusión provistas de colas Ig véase por ejemplo la Patente de EE.UU. Nº 5.116.964.).
A este fin, pueden utilizarse péptidos correspondientes al ECD del producto del gen 200, mutantes de deleción solubles del producto del gen 200, o cualquiera de estos dominios o mutantes del producto del gen 200 fusionados a otro polipéptido (v.g., un polipéptido IgFc). Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos anti-idiotípicos o fragmentos Fab de anticuerpos antiidiotípicos que mimetizan el ECD del producto del gen 200 y neutralizan el ligando del producto del gen 200. Tales péptidos de producto del gen 200, proteínas, proteínas de fusión, anticuerpos anti-idiotípicos o Fabs se administran a un individuo en cantidades suficientes para neutralizar Ob y efectuar una mejora de un trastorno relacionado con una subpoblación de células T.
Pueden utilizarse péptidos del producto del gen 200 correspondientes al ECD que tienen la secuencia de aminoácidos que se muestra en Fig. 2 desde aproximadamente el residuo de aminoácido número 21 hasta aproximadamente el 192. Péptidos del producto del gen 200 humano correspondientes al ECD que tienen la secuencia de aminoácidos representada en Fig. 24 desde aproximadamente el residuo de aminoácidos número 21 a aproximadamente el 200. Podrían utilizarse también mutantes en los cuales la totalidad o parte de la secuencia de anclaje hidrófoba (v.g., aproximadamente desde el residuo de aminoácido número 193 al 214 en Fig. 2, o aproximadamente desde el residuo 201 a aproximadamente el 224 en Fig. 24). La fusión de estos péptidos a un polipéptido IgFc debería no sólo aumentar la estabilidad de la preparación, sino aumentar también la semi-vida y actividad de la proteína de fusión in vivo. La región Fc de la porción Ig de la proteína de fusión puede modificarse ulteriormente para reducir la función efectora de la inmunoglobulina. Por ejemplo, secuencias de nucleótidos que codifican la proteína de fusión pueden modificarse para codificar proteínas de fusión que reemplazan residuos cisteína en la región bisagra con residuos serina y/o aminoácidos dentro del dominio CH2 que se cree son necesarios para la fijación de IgC a receptores FC y la activación del complemento.
En una realización alternativa para neutralizar el ligando del producto del gen 200 circulante, células que están modificadas por ingeniería genética para expresar dichas formas solubles o secretadas del producto del gen 200 pueden administrarse a un paciente, después de lo cual aquéllas servirán como "biorreactores" in vivo para proporcionar un suministro continuo de la proteína neutralizadora del ligando del producto del gen 200. Tales células pueden obtenerse del paciente o de un donante con MHC compatible y pueden incluir, pero sin carácter limitante, fibroblastos, células de la sangre (v.g., linfocitos) adipocitos, células musculares, células endoteliales, etc. Las células se modifican por ingeniería genética in vitro utilizando técnicas de DNA recombinante para introducir la secuencia codificante del péptido del producto del gen 200, o proteínas de fusión del producto del gen 200 (expuestas anteriormente) en las células, v.g., por transducción (utilizando vectores víricos, y preferiblemente vectores que integran el transgén en el genoma de la célula) o procedimientos de transfección, con inclusión, pero sin carácter limitante, del uso de plásmidos, cósmidos, YACs, electroporación, liposomas, etc. La secuencia codificante del producto del gen 200 puede ponerse bajo el control de un promotor o promotor/intensificador fuerte constitutivo o inducible a fin de conseguir la expresión y secreción del péptido o proteína de fusión del gen 200. Las células modificadas por ingeniería genética que expresan y secretan el producto del gen 200 deseado pueden introducirse en el paciente sistémicamente, v.g., en la circulación, o por vía intraperitoneal. Alternativamente, las células pueden incorporarse en una matriz e implantarse en el cuerpo, v.g., pueden implantarse fibroblastos modificados por ingeniería genética como parte de un injerto de piel; células endoteliales modificadas por ingeniería genética pueden implantarse como parte de un injerto vascular. (Véase por ejemplo Anderson et al., Patente de EE.UU. Nº 5.399.349; y Mulligan & Wilson, Patente de EE.UU. Nº 5.460.959, cada una de las cuales se incorpora por referencia en esta memoria en su totalidad).
Cuando las células a administrar son células no autólogas, las mismas se pueden administrar utilizando técnicas bien conocidas que impiden el desarrollo de una respuesta inmunológica del hospedador contra las células introducidas. Por ejemplo, las células pueden introducirse en una forma encapsulada que, si bien permite un intercambio de componentes con el entorno extracelular inmediato, no permite que las células introducidas sean reconocidas por el sistema inmunitario del hospedador.
Debe entenderse que, si bien dichos enfoques y técnicas se describen, por razones de claridad, utilizando como ejemplo el producto del gen 200, los mismos pueden aplicarse a cualquiera de los productos de genes diana y/o genes de ruta que tengan tales estructuras de tipo receptor.
5.9.1.1 Enfoques de modulación negativa de ribozima y de triple hélice
Entre los compuestos que pueden exhibir la capacidad para mejorar los síntomas de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH se encuentran ribozimas y moléculas de triple hélice. Tales moléculas pueden diseñarse para reducir o inhibir la actividad del gen diana de tipo salvaje o, en caso apropiado, del gen diana mutante. Métodos para la producción y uso de tales moléculas son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Las ribozimas son moléculas enzimáticas de RNA capaces de catalizar la escisión específica del RNA (para una revisión, véase por ejemplo Rossi, J., 1994, Current Biology 4: 469-471). El mecanismo de acción de las ribozimas implica hibridación específica de la secuencia de la molécula de ribozima al RNA diana complementario, seguida por una escisión endonucleolítica. La composición de las moléculas de ribozima debe incluir una o más secuencias complementarias al mRNA del gen diana, y debe incluir la secuencia catalítica bien conocida responsable de la escisión del mRNA. Para esta secuencia, véase la Patente de EE.UU. Nº 5.093.246, que se incorpora por referencia en esta memoria en su totalidad. Como tales, dentro del alcance de la invención se encuentran moléculas de ribozima modificadas por ingeniería genética con motivo de cabeza de martillo que catalizan específica y eficientemente la escisión endonucleolítica de las secuencias de RNA que codifican proteínas del gen diana.
Pueden utilizarse también moléculas de ribozima diseñadas para escindir catalíticamente transcritos de mRNA de genes diana o genes de ruta a fin de prevenir la traducción del mRNA de los genes diana o de camino y la expresión de los genes diana o de camino. (Véase, v.g., la Publicación Internacional PCT WO 90/11364, publicada el 4 de Octubre de 1990; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225). Si bien las ribozimas que escinden el mRNA en secuencias de reconocimiento específicas del sitio pueden utilizarse para destruir mRNAs del gen diana o de camino, se prefiere el uso de ribozimas con cabeza de martillo. Las ribozimas con cabeza de martillo escinden los mRNAs en lugares dictados por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarios con el mRNA diana. El único requisito es que los mRNA diana tengan la secuencia de dos bases siguiente: 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas con cabeza de martillo es bien conocida en la técnica y se describe más detalladamente en Haseloff y Gerlach, 1988, Nature, 334: 585-591. Preferiblemente, la ribozima se modifica por ingeniería genética de tal modo que el sitio de reconocimiento de la escisión está localizado cerca del extremo 5' del mRNA del gen diana o de camino; es decir, para aumentar la eficiencia y minimizar la acumulación intracelular de transcritos no funcionales de mRNA.
Las ribozimas de la presente invención incluyen también endorribonucleasas de RNA (en lo sucesivo "ribozimas de tipo Cech") tales como la que existe naturalmente en Tetrahymena thermophila (conocida como el RNA IVS, o RNA IVS L-19) y que ha sido descrita extensamente por Thomas Cech y colaboradores (Zaug, et al., 1984, Science, 224: 574-578; Zaug y Cech, 1986, Science 231: 470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324: 429-433; Solicitud de Patente Internacional publicada Nº WO 88/04300 por University Patents Inc.; Been y Cech, 1986, Cell, 47: 207-216). Las ribozimas de tipo Cech tienen un sitio activo de 8 pares de bases que se hibrida a una secuencia de RNA diana, después de lo cual tiene lugar la escisión del RNA diana. La invención abarca aquellas ribozimas de tipo Cech que están direccionadas a secuencias de sitios activos de ocho pares de bases que están presentes en el gen diana o el gen de ruta.
Las ribozimas pueden estar compuestas de oligonucleótidos modificados (v.g., para estabilidad mejorada, direccionamiento, etc.) y deberían suministrarse a las células que expresan el gen diana y de camino in vivo. Un método preferido de suministro implica el uso de una construcción de DNA "que codifica" la ribozima bajo el control de un promotor constitutivo fuerte pol III o pol II, a fin de que las células transfectadas produzcan cantidades suficientes de la ribozima para destruir mensajes endógenos del gen diana o gen de ruta e inhibir la traducción. Dado que las ribozimas son catalíticas, se requiere una concentración intracelular menor para la eficiencia.
En los casos en que la ribozima, y/o las moléculas de triple hélice descritas en esta memoria se utilizan para inhibir la expresión de genes mutantes, es posible que la técnica pueda reducir o inhibir también eficazmente la transcripción (triple hélice) y/o traducción (antisentido, ribozima) del mRNA producido por alelos del gen diana normales que pueda surgir la posibilidad en la que la concentración de producto del gen diana normal presente pueda ser menor que la que es necesaria para un fenotipo normal. En tales casos, para asegurar que se mantienen niveles sustancialmente normales de actividad del gen diana, por consiguiente, pueden introducirse en las células moléculas de ácido nucleico que codifican y expresan polipéptidos del gen diana que exhiben la actividad normal del gen diana por métodos de terapia génica tales como los descritos, más adelante, en la Sección 5.9.2 que no contienen secuencias sensibles a cualquier ribozima, o se están utilizando tratamientos de triple hélice. Alternativamente, en casos en los que el gen diana codifica una proteína extracelular, puede ser preferible coadministrar proteína del gen diana normal a fin de mantener el nivel requerido de actividad del gen diana.
Las moléculas de ribozima y de triple hélice de la invención pueden prepararse por cualquier método conocido en la técnica para síntesis de moléculas de DNA y RNA. Éstos incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligodesoxirribonucleótidos y oligorribonucleótidos bien conocidos en la técnica, tales como por ejemplo síntesis química de fosforamiditos en fase sólida. Alternativamente, pueden generarse moléculas de RNA por transcripción in vitro e in vivo de secuencias de DNA que codifican la molécula de RNA antisentido. Tales secuencias de DNA pueden incorporarse en una gran diversidad de vectores que incorporan promotores de RNA-polimerasa adecuados tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6.
Pueden introducirse diversas modificaciones bien conocidas en las moléculas de DNA como medio para aumentar la estabilidad y la semi-vida intracelular. Modificaciones posibles incluyen, pero sin carácter limitante, la adición de secuencias flanqueantes de ribo- o desoxi-nucleótidos a los extremos 5' y/o 3' de la molécula, o el uso de fosforotioato o 2'-O-metilo en lugar de enlaces fosfodiesterasa en la cadena principal del oligodesoxirribonucleótido.
La expresión endógena del gen diana y/o del gen de ruta puede reducirse también por desactivación o "knocking out" del gen diana y/o gen de ruta o su promotor utilizando recombinación homóloga direccionada. (v.g., véase Smithies et al., 1985, Nature 317:230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512; Thompson et al., 1989 Cell 5: 313-325, cada uno de los cuales se incorpora por referencia en esta memoria en su totalidad). Por ejemplo, puede utilizarse un gen mutante, un gen diana no funcional y/o gen de ruta (o una secuencia de DNA sin relación alguna) flanqueado por DNA homólogo al gen diana y/o gen de ruta endógeno (sean las regiones codificantes o regiones reguladoras del gen diana y/o de camino), con o sin un marcador seleccionable y/o un marcador seleccionable negativo, para transfectar células que expresan el gen diana y/o de camino in vivo. La inserción de la construcción de DNA, por recombinación homóloga direccionada, da como resultado la desactivación del gen diana y/o gen de ruta. Tales enfoques son particularmente adecuados en el campo agrícola en el que pueden utilizarse modificaciones a las células ES (del tallo embrionario) para generar una descendencia animal con un gen diana y/o gen de ruta inactivo (v.g., véase Thomas & Capecchi 1987 y Thomson 1989, supra). Dichas técnicas pueden utilizarse también para generar modelos animales de trastornos relacionados con subpoblaciones de células T. Debe indicarse que este enfoque puede adaptarse para uso en humanos con tal que las construcciones de DNA recombinante se administren directamente o se direccionen al sitio requerido in vivo utilizando vectores víricos apropiados, v.g., vectores de herpesvirus.
Alternativamente, la expresión del gen diana y/o gen de ruta endógeno puede reducirse por direccionamiento de secuencias de desoxirribonucleótidos complementarias a la región reguladora del gen diana y/o de camino (es decir, el promotor y/o intensificadores del gen diana y/o gen de ruta) para formar estructuras de triple hélice que previenen la transcripción del gen diana o de camino en células diana del cuerpo. (Véase en líneas generales, Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6): 569-84; Helene, C. et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660: 27-36; y Maher, L.J. 1992, Bioassays 14(12): 807-15). En otra realización adicional de la invención, la actividad del gen diana y/o gen de ruta puede reducirse utilizando un enfoque "dominante negativo". A este fin, pueden utilizarse construcciones que codifican productos de genes diana y/o genes de ruta defectuosos en enfoques de terapia génica para disminuir la actividad del producto del gen diana y/o gen de ruta en células diana apropiadas.
5.9.2 Técnicas moduladoras positivas
Como se ha expuesto anteriormente, el tratamiento con éxito de ciertos trastornos inmunológicos puede conseguirse por técnicas que sirven para aumentar el nivel de expresión del gen diana o para aumentar la actividad del producto del gen diana, o que, alternativamente, sirven para aumentar eficazmente el número global de células pertenecientes a una subpoblación de células TH específica.
Por ejemplo, compuestos tales como los identificados por los ensayos arriba descritos en la Sección 5.8, que exhiben actividad moduladora positiva pueden utilizarse de acuerdo con la invención para mejorar ciertos síntomas de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Como se ha expuesto en la Sección 5.8 anteriormente moléculas de este tipo pueden incluir, pero sin carácter limitante, péptidos que representan porciones extracelulares solubles de proteínas transmembranales de productos del gen diana, fosfopéptidos, pequeñas moléculas orgánicas o inorgánicas, o anticuerpos (que incluyen por ejemplo anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos o monocatenarios, y fragmentos FAb, F(ab')_{2} y fragmentos de genotecas de expresión de FAb, así como fragmentos de fijación de epítopes de los mismos).
Por ejemplo, un compuesto, tal como una proteína del gen diana, puede, a un nivel suficiente para mejorar los síntomas de trastornos inmunológicos, administrarse a un paciente que exhibe dichos síntomas. Para dicha administración puede utilizarse cualquiera de las técnicas descritas, más adelante, en la Sección 5.10,. Una persona con experiencia en la técnica conocerá fácilmente el modo de determinar la concentración de dosis eficaces y no tóxicas del compuesto, utilizando métodos tales como los descritos, más adelante, en la Sección 5.10.1.
En aquellos casos en los cuales el compuesto a administrar es un compuesto peptídico, pueden administrarse directamente secuencias de DNA que codifican el compuesto peptídico a un paciente que exhibe síntomas de trastornos inmunológicos, a una concentración suficiente para producir un nivel del compuesto peptídico suficiente para mejorar los síntomas del trastorno. Cualquiera de las técnicas expuestas, más adelante, en la Sección 5.10, que permiten la administración intracelular de compuestos, tales como por ejemplo administración de liposomas, puede utilizarse para la administración de tales moléculas de DNA. Las moléculas de DNA pueden producirse por ejemplo por técnicas recombinantes bien conocidas.
En el caso de compuestos peptídicos que actúan extracelularmente, las moléculas de DNA que codifican tales péptidos pueden ser absorbidas y expresadas por cualquier tipo de célula, de tal modo que resulte una concentración circulante suficiente del péptido para la provocación de una reducción en los síntomas de trastorno inmunológico. En el caso de compuestos que actúan intracelularmente, las moléculas de DNA que codifican tales péptidos tienen que ser absorbidas y expresadas por la subpoblación de células TH de interés a un nivel suficiente para producir la reducción de los trastornos inmunológicos.
Cualquier técnica que sirva para administrar selectivamente moléculas de DNA a la subpoblación de células de interés se prefiere, por consiguiente, para las moléculas de DNA que codifican péptidos de acción intracelular. En el caso del asma por ejemplo se prefieren técnicas para la administración selectiva de las moléculas a subpoblaciones de células TH que residen en el interior del tejido pulmonar.
Adicionalmente, en los casos en que el trastorno relacionado con la subpoblación de células TH implica un gen aberrante, los pacientes pueden ser tratados por terapia de reemplazamiento génico. Una o más copias de un gen diana normal o una porción del gen que dirige la producción de una proteína del gen diana normal con la función del gen diana, puede insertarse en las células, utilizando vectores que incluyen, pero sin carácter limitante, adenovirus, virus adeno-asociado, y vectores retrovíricos, además de otras partículas que introducen DNA en las células, tales como liposomas.
Tales técnicas de reemplazamiento génico pueden realizarse in vivo o in vitro. Como anteriormente, para los genes que codifican moléculas extracelulares, el tipo de células que expresan el gen diana es menos importante que el alcance de una concentración circulante suficiente de la molécula extracelular para la mejora de los trastornos inmunológicos. Adicionalmente, como se ha indicado arriba, cuando el gen codifica una célula que actúa intracelularmente o como una molécula transmembranal, el gen tiene que expresarse con el tipo de célula de la subpoblación de células TH de interés. Las técnicas que seleccionan la expresión dentro del tipo de célula de interés son, por consiguiente, preferidas para esta última clase de genes diana. In vivo, dichas técnicas pueden por ejemplo incluir la administración local apropiada de secuencias de genes diana.
Métodos adicionales que pueden utilizarse para aumentar el nivel global de expresión de genes diana y/o genes de ruta y/o la actividad de genes diana y/o de camino incluyen la introducción de células adecuadas que expresan el gen diana y/o el gen de ruta, preferiblemente células autólogas, en un paciente en posiciones y en números que son suficientes para mejorar los síntomas de los trastornos relacionados con la subpoblación de células T. Dichas células pueden ser recombinantes o no recombinantes. Entre las células que pueden administrarse para aumentar el nivel global de expresión del gen diana y/o el gen de ruta en un paciente se encuentran células normales, que expresan el gen diana y/o el gen de ruta. Las células pueden administrarse en el sitio anatómico de expresión, o como parte de un injerto de tejido localizada en un sitio diferente en el cuerpo. Dichos métodos de terapia génica basados en células son bien conocidos por los expertos en la técnica, véase, v.g., Anderson, et al., Patente de EE.UU. Nº 5.399.349; Mulligan & Wilson, Patente de EE.UU. Nº 5.460.959).
In vitro, pueden introducirse secuencias de genes diana en células autólogas. Estas células que expresan las secuencias del gen diana de interés pueden reintroducirse luego, preferiblemente por administración intravenosa, en el paciente de tal modo que resulta una mejora de los síntomas del trastorno.
Alternativamente, pueden administrarse a un paciente células TH pertenecientes a una subpoblación de células TH específica a fin de que el número global de células pertenecientes a dicha subpoblación de células TH con relación a otras células de subpoblaciones de células TH se incremente, lo cual da como resultado una mejora de un trastorno relacionado con una subpoblación de células TH. Técnicas para dicho aumento de una subpoblación de células TH se describen, más adelante, en la Sección 5.9.3.2.
5.9.3 Técnicas moduladoras negativas o positivas
Se describen aquí técnicas moduladoras que, dependiendo de la aplicación específica para la que se utilicen, pueden producir respuestas positivas o negativas que conducen a la mejora de trastornos inmunológicos, con inclusión de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Así, en casos apropiados, los procedimientos de esta Sección pueden utilizarse en asociación con las técnicas moduladoras negativas descritas anteriormente en la Sección 5.9.1 o, alternativamente, en asociación con las técnicas moduladoras positivas descritas anteriormente en la Sección 5.9.2.
5.9.3.1 Técnicas de anticuerpos
Pueden utilizarse anticuerpos que exhiben actividad moduladora para mejorar trastornos inmunológicos tales como trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Dependiendo del anticuerpo específico, el efecto modulador puede ser negativo y puede, por consiguiente, utilizarse como parte de las técnicas descritas anteriormente en la Sección 5.9.1, o puede ser positivo, y puede, por consiguiente, utilizarse en asociación con las técnicas descritas anteriormente en la Sección 5.9.2.
Un anticuerpo que tiene capacidad moduladora negativa hace referencia a un anticuerpo que se fija específicamente a e interfiere con la acción de una proteína. En el caso de un receptor extracelular por ejemplo dicho anticuerpo podría fijar específicamente el dominio extracelular del receptor de una manera que no activa el receptor pero que altera la capacidad del receptor para fijar su ligando natural. Por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra el dominio extracelular del producto del gen 200 pueden funcionar como tales moduladores negativos. Tales anticuerpos pueden generarse utilizando técnicas estándar descritas en la Sección 5.6. anteriormente contra proteínas de tipo salvaje o mutantes de longitud total, o contra péptidos correspondientes a porciones de las proteínas. Los anticuerpos incluyen, pero sin carácter limitante, anticuerpos policlonales, monoclonales, fragmentos FAb, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos, y análogos.
Un anticuerpo que tiene capacidad moduladora positiva hace referencia a un anticuerpo que se fija específicamente a una proteína y, una vez fijado, sirve para activar, directa o indirectamente, la función de la proteína que reconoce. Por ejemplo, un anticuerpo puede fijarse a la porción extracelular de una proteína transmembranal de una manera que hace que la proteína transmembranal funcione como si su ligando endógeno estuviera fijándose a, y por tanto activando por ejemplo un camino de transducción de señales. Tales anticuerpos pueden generarse utilizando técnicas estándar descritas en la Sección 5.6. anteriormente contra proteínas de tipo salvaje o mutantes de longitud total, o contra péptidos correspondientes a porciones de las proteínas. Los anticuerpos incluyen, pero sin carácter limitante, anticuerpos policlonales, monoclonales, fragmentos FAb, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos, y
análogos.
En casos en que la proteína, tal como una proteína diana, a la cual está direccionado el anticuerpo, es intracelular y se utilizan anticuerpos enteros, pueden preferirse anticuerpos internalizadores. Sin embargo, pueden utilizarse lipofectina o liposomas para suministrar el anticuerpo o un fragmento de la región Fab que se fija al epítope del producto del gen en las células. Donde se utilizan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se fija al dominio de fijación de la proteína. Por ejemplo, pueden utilizarse péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio de la región variable del anticuerpo que se fija a la proteína. Tales péptidos pueden sintetizarse químicamente o producirse por tecnología de DNA recombinante utilizando métodos bien conocidos en la técnica (v.g., véase Creighton, 1983, supra; y Sambrook et al., 1989, arriba). Alternativamente, pueden administrarse también anticuerpos monocatenarios, tales como anticuerpos neutralizantes, que se fijan a epítopes intracelulares. Tales anticuerpos monocatenarios pueden administrarse por ejemplo por expresión de secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos monocatenarios dentro de la población de células diana utilizando por ejemplo técnicas como las descritas en Marasco et al. (Marasco, W. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893).
En los casos en que la proteína a la que está dirigido el anticuerpo es extracelular, o es una proteína transmembranal, puede utilizarse cualquiera de las técnicas de administración descritas más adelante en la Sección 5.10 que son apropiadas para administración de péptidos, a fin de administrar eficazmente los anticuerpos a su sitio de acción.
5.9.3.2 Métodos para aumentar o disminuir concentraciones específicas de subpoblaciones de células TH
Las técnicas descritas en esta memoria pueden utilizarse para agotar o aumentar el número total de células pertenecientes a una subpoblación dada de células TH, aumentando o disminuyendo así eficazmente la relación de la subpoblación de células TH de interés a otras subpoblaciones de células TH. Específicamente, se describen técnicas de separación que pueden utilizarse para agotar o aumentar el número total de células presentes dentro de una subpoblación de células TH, y, ulteriormente, se describen técnicas de direccionamiento que pueden utilizarse para agotar subpoblaciones específicas de células TH.
Dependiendo de la aplicación particular, el cambio del número de células pertenecientes a una subpoblación de células TH puede producir respuestas estimuladoras o inhibidoras que conducen a la mejora de los trastornos de subpoblaciones de células TH. Así, en casos apropiados, los procedimientos de esta Sección pueden utilizarse en asociación con las técnicas inhibidoras descritas anteriormente en la Sección 5.9.1 o, alternativamente, en asociación con las técnicas estimuladoras descritas anteriormente en la Sección 5.9.2.
Las técnicas de separación descritas en esta memoria están basadas en la presencia o ausencia de marcadores específicos de la superficie celular, preferiblemente marcadores transmembranales. Dichos marcadores pueden incluir, pero sin carácter limitante, los marcadores del dominio extracelular del producto del gen 200 específicos de TH1.
En casos en los cuales la finalidad de la separación es acrecentar o aumentar el número de células pertenecientes a una subpoblación específica de células TH, los anticuerpos utilizados pueden ser también específicos de marcadores superficiales presentes en células TH no diferenciadas o parcialmente no diferenciadas. Después de la separación, y purificación de tales células TH no diferenciadas o parcialmente diferenciadas, las células pueden cultivarse en tampón fisiológico o medio de cultivo e inducirse su diferenciación por cultivo en presencia de factores apropiados. Por ejemplo, puede añadirse IL-4 para inducir las células TH a diferenciarse en células TH2, mientras que puede añadirse la citoquina IL-12 para inducir las células TH a diferenciarse en células TH1. Después de la diferenciación, las células pueden lavarse, resuspenderse por ejemplo en solución salina tamponada, y reintroducirse en un paciente preferentemente por la vía de administración intravenosa.
Pueden utilizarse técnicas de separación que separan y purifican células, in vitro, a partir de una población de células, tal como células hematopoyéticas autólogas para el paciente de que se trate. Puede obtenerse una población de células que contenga una subpoblación inicial de células TH, tales como células hematopoyéticas, utilizando procedimientos estándar bien conocidos por los expertos en la técnica. Puede utilizarse sangre periférica como una fuente de partida potencial para dichas técnicas, y puede por ejemplo obtenerse por venipuntura y recogida en tubos heparinizados.
Una vez que se ha obtenido la fuente de partida de células autólogas, las células T, tales como células TH1 o TH2, pueden retirarse, y por tanto separarse y purificarse selectivamente, por diversos métodos que utilizan anticuerpos que fijan marcadores específicos presentes en la población de células T de interés, mientras que están ausentes en otras células existentes en la fuente de partida. Estas técnicas pueden incluir por ejemplo citometría de flujo utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) y fluorocromos específicos, separaciones biotina-avidina o biotina-estreptavidina utilizando biotina conjugada a anticuerpos específicos de marcadores de superficie y avidina o estreptavidina fijada a un soporte sólido tal como una matriz de columna de afinidad o superficies de plástico o separaciones magnéticas que utilizan bolitas magnéticas recubiertas con anticuerpo.
La separación por anticuerpos para marcadores específicos puede realizarse por procedimientos de selección negativos o positivos. En la separación negativa, se utilizan anticuerpos que son específicos para marcadores presentes en células no deseadas. Por ejemplo, en el caso de un trastorno relacionado con una subpoblación de células TH1 en el cual sería deseable agotar el número de células TH1, dichos anticuerpos podrían estar dirigidos al dominio extracelular del producto del gen 200, retirarse o lisarse y retener la mezcla deseada remanente.
En la separación positiva, se presentan en las células deseadas de interés anticuerpos específicos para marcadores. Por ejemplo, en el caso de un trastorno relacionado con una subpoblación de células TH1 en el cual sería deseable aumentar el número de células TH1, tales anticuerpos podrían dirigirse al dominio extracelular del producto del gen 200. Las células fijadas por el anticuerpo se separan y se retienen. Debe entenderse que pueden utilizarse separaciones positivas y negativas de modo sustancialmente simultáneo o de manera secuencial.
Una técnica común para la separación basada en anticuerpos es el uso de citometría de flujo tal como por un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). Típicamente, la separación por citometría de flujo se realiza como sigue. La mezcla suspendida de células se centrifuga y se resuspende en un medio. Los anticuerpos que están conjugados al fluorocromo se añaden para permitir la fijación de los anticuerpos a marcadores específicos de la superficie celular. La mezcla de células se lava luego por uno o más pasos de centrifugación y resuspensión. La mezcla se hace pasar a través de un FACS que separa las células basándose en características de fluorescencia diferentes. Están disponibles sistemas FACS en niveles variables de eficiencia y capacidad, con inclusión de análisis multi-color. La célula facilitadora puede identificarse por un perfil característico de dispersión hacia delante y hacia los lados, que está influenciado por el tamaño y la granularidad, así como por la expresión positiva y/o negativa de ciertos marcadores de la superficie celular.
Otras técnicas de separación además de la citometría de flujo pueden proporcionar también separaciones rápidas. Uno de tales métodos es la separación basada en biotina-avidina por cromatografía de afinidad. Típicamente, dicha técnica se realiza incubando células con anticuerpos acoplados a biotina para marcadores específicos, seguido por paso a través de una columna de avidina. Los complejos biotina-avidina-célula se fijan a la columna por la interacción biotina-avidina, mientras que otras células pasan a través de la columna. La especificidad del sistema biotina-avidina es muy adecuada para separación positiva rápida. Los pasos múltiples pueden asegurar la separación de un nivel suficiente de la subpoblación de células TH de interés.
En casos en los cuales el objetivo de la técnica de separación es agotar el número global de células pertenecientes a una subpoblación de células TH, las células derivadas de la fuente de partida de células que se ha agotado ahora eficazmente en células de la subpoblación de células TH pueden reintroducirse en el paciente. Un agotamiento de este tipo de la subpoblación de células TH da como resultado la mejora de los trastornos relacionados con la subpoblación de células TH asociados con la actividad o superactividad de la subpoblación de células TH. La reintroducción de las células agotadas en la subpoblación de células TH puede realizarse por lavado de las células, resuspensión por ejemplo en solución salina tamponada, y administración intravenosa de las células en el paciente.
Si son suficientes la viabilidad y recuperación de las células, las células agotadas en la subpoblación de células TH pueden reintroducirse en los pacientes inmediatamente después de la separación. Alternativamente, células agotadas en la subpoblación de células TH pueden cultivarse y expandirse ex vivo antes de la administración a un paciente. La expansión puede realizarse por técnicas bien conocidas que utilizan tampones fisiológicos o medios de cultivo en presencia de factores de expansión apropiados tales como interleuquinas y otros factores de crecimiento conocidos.
En casos en los cuales el objetivo de la técnica de separación es aumentar o incrementar el número global de células pertenecientes a una subpoblación de células TH, células derivadas de las células de la subpoblación de las células TH purificadas pueden reintroducirse en el paciente, dando así como resultado la mejora de los trastornos relacionados con las subpoblaciones de células TH asociados con una infra-actividad de la subpoblación de células TH.
Las células a reintroducir se cultivarán y expandirán ex vivo antes de la reintroducción. Las células de la subpoblación de células TH purificadas pueden lavarse, resuspenderse por ejemplo en solución salina tamponada, y reintroducirse en el paciente por administración intravenosa.
Las células a expandir pueden cultivarse, utilizando procedimientos estándar, en presencia de un agente de expansión apropiado que induce la proliferación de la subpoblación de las células TH purificadas. Dicho agente de expansión puede ser por ejemplo cualquier citoquina, antígeno, o anticuerpo apropiado. En el caso de las células TH2 por ejemplo el agente de expansión puede ser IL-4, mientras que para las células TH1, el agente de expansión puede ser por ejemplo IL-12.
Antes de ser reintroducidas en un paciente, las células purificadas pueden modificarse por ejemplo por transformación con secuencias génicas que codifican productos de genes de interés. Tales productos génicos deberían representar productos que aumenten la actividad de la subpoblación de células TH purificada o, alternativamente, representar productos que repriman la actividad de una o más de las otras subpoblaciones de células TH. Los procedimientos de transformación de células y expresión génica son bien conocidos para los expertos en la técnica, y pueden ser como se describe anteriormente en la Sección 5.5.
Adicionalmente, pueden utilizarse métodos de direccionamiento bien conocidos en aquellos casos en los cuales el objetivo es agotar el número de células pertenecientes a una subpoblación de células TH específica. Tales métodos de direccionamiento pueden realizarse in vivo o in vitro, y pueden implicar la introducción de agentes de direccionamiento en una población de células tal que los agentes de direccionamiento destruyan selectivamente un subconjunto específico de las células dentro de la población. Técnicas de administración in vivo que pueden ir seguidas por tales agentes de direccionamiento se describen, más adelante, en la Sección 5.10.
Los agentes de direccionamiento comprenden generalmente, en primer lugar, un resto de direccionamiento que, en el caso presente, hace que el agente de direccionamiento se asocie selectivamente con una subpoblación de células TH especificas. Los agentes de direccionamiento comprenden, en segundo lugar, un resto capaz de destruir una célula con la cual se ha asociado el agente de direccionamiento.
Restos de direccionamiento pueden incluir, pero sin carácter limitante, anticuerpos dirigidos a marcadores de la superficie celular encontrados específicamente en la subpoblación de células TH de que se trate, o, alternativamente, a ligandos, tales como factores de crecimiento, que fijan moléculas de tipo receptor que se encuentran exclusivamente en la subpoblación de las células TH consideradas como diana.
En el caso de las células TH1 por ejemplo un resto de direccionamiento de este tipo puede representar un anticuerpo dirigido contra la porción extracelular del producto del gen 200 descrito en esta memoria, o puede, alternativamente, representar un ligando específico para esta molécula específica de TH1 de tipo receptor.
Restos destructivos incluyen cualquier resto capaz de desactivar o destruir una célula a la cual se ha fijado el agente de direccionamiento. Por ejemplo, un resto destructivo puede incluir, pero sin carácter limitante, citotoxinas o agentes radiactivos. Las citotoxinas incluyen por ejemplo toxinas derivadas de plantas, hongos, o bacterias, siendo preferidas generalmente toxinas desglicosiladas de la cadena A de la ricina debido a su potencia y semi-vidas prolongadas.
5.10 Preparaciones farmacéuticas y métodos de administración
Los compuestos, secuencias de ácido nucleico y células de subpoblaciones de células TH descritas en esta memoria pueden administrarse a un paciente a dosis terapéuticamente eficaces para tratar o mejorar trastornos inmunológicos, v.g., trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Una dosis terapéuticamente eficaz hace referencia a aquella cantidad de un compuesto o subpoblación de células TH suficiente para dar como resultado una mejora de los síntomas del trastorno inmunológico, o alternativamente, a aquella cantidad de una secuencia de ácido nucleico suficiente para expresar una concentración del producto génico que da como resultado la mejora de los trastornos relacionados con la subpoblación de células TH o de otros trastornos inmunológicos.
5.10.1 Dosis eficaz
La toxicidad y eficacia terapéutica de los compuestos pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivo de células o animales experimentales, v.g., para determinar el valor DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y el valor DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede representarse como la relación DL_{50}/ DE_{50}. Se prefieren los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Si bien pueden utilizarse compuestos que exhiben efectos tóxicos secundarios, debe tenerse cuidado para diseñar un sistema de suministro que direccione dichos compuestos al sitio del tejido afectado a fin de minimizar un daño potencial a células no infectadas y, por consiguiente, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo de células y estudios en animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen el valor DE_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo de células. Puede formularse una dosis en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración circulante en plasma que incluye el valor CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue una inhibición semi-máxima de los síntomas) tal como se determina en cultivo de células. Dicha información puede utilizarse para determinar más exactamente las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse por ejemplo por cromatografía líquida de alta resolución.
5.10.2 Formulaciones y usos
Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse de manera convencional utilizando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables.
Así, los compuestos y sus sales y disolventes fisiológicamente aceptables pueden formularse para administración por inhalación o insuflación (sea a través de la boca o de la nariz) o administración oral, bucal, parenteral o rectal.
Para administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar por ejemplo la forma de tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglomerantes (v.g., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (v.g., lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (v.g., estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (v.g., almidón de patata o almidón-glicolato de sodio); o agentes humectantes (v.g., lauril-sulfato de sodio). Las tabletas pueden recubrirse por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar por ejemplo la forma de soluciones, jarabes o suspensiones, o las mismas pueden presentarse como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su utilización. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (v.g., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o aceites hidrogenados comestibles); agentes emulsionantes (v.g., lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (v.g., aceite de almendras, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (v.g., p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones pueden contener también sales tampón, aromatizantes, colorantes y agentes edulcorantes en caso apropiado.
Las preparaciones para administración oral pueden formularse adecuadamente para proporcionar una liberación controlada del compuesto activo.
Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera convencional.
Para administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en la forma de una presentación de pulverización aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, v.g., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula que suministra una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de v.g., gelatina para uso en un inhalador o insuflador que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvos adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos pueden formularse para administración parenteral (a saber, intravenosa o intramuscular) por inyección, mediante por ejemplo inyección de tipo bolus o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosis unitarias, v.g., en ampollas o en envases multi-dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes suspendedores, estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede encontrarse en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, v.g., agua estéril exenta de pirógenos, antes de su utilización. Se prefiere que las células de la subpoblación de células TH se introduzcan en los pacientes por administración intravenosa.
Los compuestos pueden formularse también en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, v.g., que contengan bases convencionales de supositorios tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos pueden formularse también como una preparación de acción prolongada. Tales formulaciones de acción duradera pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. Así por ejemplo los compuestos pueden formularse con materiales polímeros o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable, o resinas cambiadoras de iones, o como derivados poco solubles por ejemplo como una sal poco soluble.
Las composiciones pueden, en caso deseado, presentarse en un envase o dispositivo dosificador que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase puede comprender por ejemplo lámina delgada de metal o de plástico, tal como un envase burbuja. El dispositivo de envase o dosificador puede ir acompañado por instrucciones para la administración.
5.11 Técnicas de diagnóstico y observación
Puede emplearse una diversidad de métodos para el diagnostico de trastornos inmunológicos, v.g., trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, la predisposición a dichos trastornos inmunológicos, para observación de la eficacia de los compuestos anti-trastorno inmunológico durante por ejemplo pruebas clínicas y para la observación de pacientes sometidos a evaluación clínica para el tratamiento de dichos trastornos. Adicionalmente, pueden utilizarse numerosos métodos para la detección de las células inmunológicas activadas, v.g., miembros activados de subpoblaciones de células TH.
Dichos métodos pueden utilizar por ejemplo reactivos tales como las secuencias de nucleótidos del gen 200 de huella dactilar descritas en la Sección 5.1., y anticuerpos dirigidos contra péptidos del gen 200 expresados diferencialmente, como se ha descrito anteriormente en las Secciones 5.5. (péptidos) y 5.6 (anticuerpos). Específicamente, donde el gen diana es el gen 200, tales reactivos pueden utilizarse por ejemplo para: 1) la detección de la presencia de la expresión del gen diana, mutaciones del gen diana, la detección de sobre- o infra-expresión de mRNA del gen diana con relación al estado no de trastorno inmunológico o con relación a una subpoblación de células TH desactivada; 2) la detección de una super- o infra-abundancia del producto del gen diana con relación al estado del trastorno no inmunológico o con relación al estado de la subpoblación de células TH desactivadas; y 3) la identificación de células específicas de la subpoblación de células TH (v.g., células TH implicadas en un trastorno inmunológico, o células TH activadas) dentro de una población de células mixta.
Los métodos descritos en esta memoria pueden realizarse por ejemplo por utilización de estuches de diagnóstico pre-envasados que comprenden al menos un ácido nucleico del gen 200 de huella dactilar específico o reactivo de anti-anticuerpo del gen 200 de huella dactilar descrito en esta memoria, que puede utilizarse convenientemente, v.g., en situaciones clínicas, para diagnosticar pacientes que exhiben anormalidades relacionadas con TH1 o TH2.
Cualquier tipo de célula o tejido, preferiblemente células TH, en el cual se expresa el gen 200 de huella dactilar puede utilizarse en los diagnósticos descritos a continuación.
Entre los métodos que pueden utilizarse en esta memoria se encuentran métodos para observar la eficacia de compuestos en pruebas clínicas para el tratamiento de trastornos inmunológicos. Tales compuestos pueden ser por ejemplo compuestos tales como los descritos anteriormente en la Sección 5.9. Un método de este tipo comprende detectar, en una muestra de un paciente, un transcrito del gen 200 o producto del gen 200 que se expresa diferencialmente en una subpoblación de células TH en un estado de trastorno inmunológico con relación a su expresión en la subpoblación de células TH cuando la subpoblación de células se encuentra en un estado normal, o no de trastorno inmunológico.
Cualquiera de las técnicas de detección de ácidos nucleicos descritas, más adelante, en la Sección 5.11.1 o cualquiera de las técnicas de detección de péptidos descritas, más adelante, en la Sección 5.11.2 puede utilizarse para detectar el transcrito del gen o producto del gen que se expresa diferencialmente en la subpoblación de células TH del trastorno inmunológico con relación a su expresión en el estado normal o no de trastorno inmunológico.
Durante las pruebas clínicas por ejemplo la expresión de un solo gen de huella dactilar, o alternativamente, el patrón de huella dactilar de una subpoblación de células TH, puede determinarse para la subpoblación de células TH en presencia o ausencia del compuesto que se ensaya. La eficacia del compuesto puede seguirse por comparación de los datos de expresión obtenidos con los patrones de expresión conocidos correspondientes para la subpoblación de células TH en un estado normal, no de trastorno inmunológico. Los compuestos que exhiben eficacia son aquéllos que alteran la expresión del gen 200 de huella dactilar simple y/o el patrón de huella dactilar de la subpoblación de células TH del trastorno inmunológico para semejarse más estrechamente al de la subpoblación de células TH normal, no del trastorno inmunológico.
La detección del producto o productos de genes expresados diferencialmente en una subpoblación de células TH en un estado de trastorno inmunológico con relación a su expresión en la subpoblación de células TH cuando la subpoblación se encuentra en un estado de trastorno normal, o no de trastorno inmunológico, puede utilizarse también para monitorizar la eficacia de los compuestos potenciales anti-trastorno inmunológico durante pruebas clínicas. Durante las pruebas clínicas por ejemplo el nivel y/o la actividad de los productos de uno o más genes expresados diferencialmente de este tipo pueden determinarse para la subpoblación de células TH en presencia o ausencia del compuesto que se ensaya. La eficacia del compuesto puede seguirse por comparación de los datos obtenidos de nivel y/o actividad de proteínas con los niveles/actividades conocidos correspondientes para la subpoblación de células TH en un estado normal, no de trastorno inmunológico. Los compuestos que exhiben eficacia son aquéllos que alteran el patrón de la subpoblación de células TH del trastorno inmunológico para asemejarse más estrechamente al de la subpoblación de células TH normal, no correspondiente a un trastorno inmunológico.
Los patrones de expresión del gen 200 en subpoblaciones de células TH1 con relación a subpoblaciones de células TH2 puede hacer la detección de transcritos y/o productos de estos genes particularmente adecuada para monitorizar la eficacia de los compuestos en pruebas clínicas para el tratamiento de trastornos inmunológicos relacionados con subpoblaciones de células TH1 tales como por ejemplo esclerosis múltiple, psoriasis o diabetes dependiente de insulina.
Entre los métodos adicionales que pueden utilizarse aquí se encuentran métodos para detectar la sensibilidad de las células TH por ejemplo la sensibilidad a un antígeno, y para detectar células inmunológicas activadas, v.g., miembros activados de las subpoblaciones de células TH. Métodos de detección tales como éstos son importantes en el sentido de que un gran número de trastornos inmunológicos implican respuestas inmunológicas inadecuadas más bien que insuficientes. Tales métodos de detección pueden utilizarse por ejemplo para detectar una predisposición a un trastorno inmunológico.
Métodos para detectar la sensibilidad y/o activación de las células TH pueden comprender por ejemplo detectar en una muestra de células TH un transcrito o producto génico que se expresa diferencialmente en una subpoblación de células TH que se encuentra en un estado activado o sensible (v.g., un estado en el cual la subpoblación de células TH ha estado expuesta a antígeno), con relación a una subpoblación de células TH que se encuentra en un estado desactivado o no sensible.
Cualquiera de las técnicas de detección de ácido nucleico descritas, más adelante, en la Sección 5.11.1 o cualquiera de las técnicas de detección de péptidos descritas más adelante en la Sección 5.11.2 pueden utilizarse para detectar un transcrito génico o producto génico expresado diferencialmente de este tipo.
La detección de sus transcritos y/o productos génicos particularmente adecuados para detectar la activación y/o naturaleza específica de TH1 del gen 200 puede hacer la detección de transcritos y/o productos de este gen particularmente adecuada para la detección de la activación y/o sensibilidad de TH1.
5.11.1 Detección de ácidos nucleicos de genes de huella dactilar
El DNA o RNA del tipo de célula o tejido a analizar puede aislarse fácilmente utilizando procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Pueden realizarse también procedimientos de diagnóstico "in situ" directamente por ejemplo sobre Secciones de tejido (fijadas y/o congeladas) de tejidos de pacientes obtenidos de biopsias o resecciones, de tal modo que no es necesaria ninguna purificación del ácido nucleico. Reactivos de ácido nucleico tales como los descritos en la Sección 5.4 pueden utilizarse como sondas y/o iniciadores para tales procedimientos in situ (véase por ejemplo Nuovo, G.J., 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications", Raven Press, NY). La expresión de células específicas dentro de una población de células puede determinarse también, mediante por ejemplo técnicas in situ tales como las descritas anteriormente, o por técnicas estándar de citometría de
flujo.
Secuencias de nucleótidos del gen 200 de huella dactilar, sean de RNA o DNA pueden utilizarse por ejemplo en ensayos de hibridación o amplificación de muestras biológicas para detectar estructuras y expresión de genes de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH. Tales ensayos pueden incluir, pero sin carácter limitante, análisis Southern o Northern, análisis de polimorfismo conformacional monocatenario, ensayos de hibridación in situ, y análisis por la reacción en cadena de la polimerasa. Tales análisis pueden revelar tanto aspectos cuantitativos del patrón de expresión del gen 200 de huella dactilar, como aspectos cualitativos de la expresión del gen de huella dactilar y/o composición del gen. Es decir, tales técnicas pueden detectar no sólo la presencia de expresión del gen 200, sino que pueden detectar también la cantidad de expresión, particularmente cuáles son las células específicas que están expresando el gen 200 y pueden detectar adicionalmente por ejemplo mutaciones, inserciones, y deleciones puntuales, transposiciones cromosómicas, y/o activación o desactivación de la expresión del gen
200.
Métodos de diagnóstico para la detección de moléculas de ácido nucleico específicas de genes de huella dactilar pueden implicar por ejemplo, poner en contacto e incubar ácidos nucleicos, derivados del tipo de célula o tejido que se analiza, con uno o más reactivos de ácido nucleico marcados como los descritos en la Sección 5.4, en condiciones favorables para la reasociación específica de estos reactivos a sus secuencias complementarias dentro de la molécula de ácido nucleico de interés. Preferiblemente, las longitudes de estos reactivos de ácido nucleico son al menos 15 a 30 nucleótidos. Después de la incubación, todos los ácidos nucleicos no reasociados se separan del híbrido ácido nucleico:molécula de huella dactilar. La presencia de ácidos nucleicos procedentes del tipo de célula o tejido que se han hibridado, si existe alguna de tales moléculas, se detecta a continuación. Utilizando un esquema de detección de este tipo, el ácido nucleico procedente del tejido o tipo de células de interés puede inmovilizarse por ejemplo en un soporte sólido tal como una membrana, o una superficie de plástico tal como la de una placa de microtitulación o cuentas de poliestireno. En este caso, después de la incubación, los reactivos de ácido nucleico marcados no reasociados del tipo descrito en la Sección 5.4 se separan fácilmente. La detección de los reactivos de ácido nucleico de huella dactilar marcados y reasociados remanentes se realiza utilizando métodos estándar bien conocidos por los expertos en la técnica.
Métodos alternativos de diagnóstico para la detección de moléculas de ácido nucleico específicas de genes de huella dactilar pueden implicar su amplificación, v.g. por PCR (la realización experimental expuesta en Mullis, K.B., 1987, Patente de EE.UU. Nº 4.683.202), reacción en cadena de ligasa (Barany, F., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193), replicación de secuencias autosostenida (Guatelli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), sistema de amplificación de la transcripción (Kwoh, D.Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), Replicasa Q-Beta (Lizardi, P.M. et al., 1988, Bio/Technology 6: 1197), o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en números muy bajos.
En una realización de un esquema de detección de este tipo, se obtiene una molécula de cDNA a partir de una molécula de RNA de interés (v.g., por transcripción inversa de la molécula de RNA en cDNA). Tipos de células o tejidos a partir de los cuales puede aislarse dicho RNA incluyen cualquier tejido en el cual se sabe que se expresa el gen 200 de huella dactilar de tipo salvaje, con inclusión, pero sin carácter limitante, de tejidos que contienen tipos de células TH0, TH1 y/o TH2. Se utiliza luego una secuencia comprendida dentro del cDNA como el molde para una reacción de amplificación de ácido nucleico, tal como una reacción de amplificación PCR, o análoga. Los reactivos de ácido nucleico utilizados como reactivos de iniciación de la síntesis (v.g., iniciadores) en los pasos de transcripción inversa y amplificación de ácido nucleico de este método se seleccionan de entre los reactivos de ácido nucleico del gen 200 de huella dactilar descritos en la Sección 5.4. Las longitudes preferidas de tales reactivos de ácido nucleico son al menos 9-30 nucleótidos. Para detección del producto amplificado, la amplificación del ácido nucleico puede realizarse utilizando nucleótidos marcados radiactivamente o no radiactivamente. De modo alternativo, puede producirse suficiente producto amplificado tal que el producto pueda visualizarse por tinción estándar con bromuro de etidio o por utilización de cualquier otro método adecuado de tinción de ácido nucleico.
Además de métodos que están enfocados fundamentalmente en la detección de una secuencia de ácido nucleico de huella dactilar, pueden determinarse también en tales esquemas de detección patrones de huella dactilar. Los patrones de huella dactilar, en este contexto, contienen el patrón de expresión de mRNA de una serie (es decir, de al menos dos) de genes de huella dactilar obtenidos para un tejido o tipo de célula dado en una serie de afecciones dada. Dichas afecciones pueden incluir por ejemplo trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, y afecciones relevantes para procesos implicados en la diferenciación, el mantenimiento y la función efectora de subpoblaciones de células TH.
Trastornos relacionados con células TH1 pueden incluir por ejemplo enfermedades y trastornos inflamatorios crónicos, tales como enfermedad de Crohn, artritis reactiva, con inclusión de enfermedad de Lyme, diabetes dependiente de insulina, autoinmunidad órgano-específica, con inclusión de esclerosis múltiple, tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Grave, dermatitis de contacto, psoriasis, rechazo de injertos, enfermedad de rechazo inverso y sarcoidosis. Los trastornos relacionados con células TH2 pueden incluir por ejemplo afecciones atópicas, tales como asma y alergia, con inclusión de rinitis alérgica, alergias gastrointestinales, con inclusión de alergias alimentarias, eosinofilia, conjuntivitis, nefritis glomerular, ciertas susceptibilidades a patógenos tales como infecciones helmínticas (v.g., leishmaniasis) y ciertas infecciones víricas, con inclusión de HIV, e infecciones bacterianas, con inclusión de tuberculosis y lepra lepromatosa.
Los patrones de huella dactilar pueden generarse por ejemplo por utilización de un procedimiento de presentación diferencial, como se ha expuesto anteriormente en la Sección 5.1.1.2, análisis Northern y/o RT-PCR. Cualquiera de las secuencias del gen 200 descritas anteriormente en la Sección 3.2.1 pueden utilizarse como sondas y/o iniciadores RT-PCR para la generación y comprobación de tales patrones de huella dactilar.
5.11.2 Detección de péptidos de genes diana
Los anticuerpos dirigidos contra péptidos de genes de huella dactilar de tipo salvaje o mutantes, que se han expuesto anteriormente en la Sección 5.6, pueden utilizarse también como diagnósticos y pronósticos de trastornos relacionados con subpoblaciones de células TH, como se describe por ejemplo en esta memoria. Tales métodos de diagnóstico, pueden utilizarse para detectar productos de genes de huella dactilar, anormalidades en el nivel de expresión de proteínas de genes de huella dactilar, o anormalidades en la estructura y/o la localización temporal, tisular, celular, o subcelular de proteínas de genes de huella dactilar. Diferencias estructurales pueden incluir por ejemplo diferencias en el tamaño, la electronegatividad, o la antigenicidad de la proteína del gen 200 de huella dactilar mutante con relación a la proteína del gen 200 de huella dactilar normal.
La proteína del tejido o tipo de célula a analizar puede aislarse fácilmente utilizando métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos de aislamiento de proteínas empleados en esta memoria pueden ser por ejemplo tales como los descritos en Harlow y Lane (Harlow, E. y Lane, D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).
Métodos de diagnóstico preferidos para la detección de moléculas de péptidos de genes de huella dactilar de tipo salvaje o mutantes pueden implicar por ejemplo inmunoensayos en los cuales los péptidos de genes de huella dactilar se detectan por su interacción con un anti-anticuerpo específico del producto del gen de huella dactilar.
Por ejemplo, anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, tales como los descritos arriba, en la Sección 5.6, útiles en la presente invención pueden utilizarse para detectar cuantitativa o cualitativamente la presencia de péptidos del gen 200 de huella dactilar de tipo salvaje o mutantes. Esto puede realizarse por ejemplo por técnicas de inmunofluorescencia que emplean un anticuerpo marcado fluorescentemente (véase más abajo, en esta Sección), acopladas con detección por microscopía óptica, citometría de flujo, o fluorimétrica. Dichas técnicas son especialmente preferidas si los péptidos de genes de huella dactilar se expresan en la superficie celular, tal como por ejemplo sucede con el producto del gen 200. Así pues, las técnicas descritas en esta memoria pueden utilizarse para detectar células específicas, dentro de una población de células, que expresan el producto del gen 200 de huella dactilar de interés.
Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención pueden emplearse adicionalmente en histología, por ejemplo en inmunofluorescencia o microscopía inmunoelectrónica, para detección in situ de péptidos de genes de huella dactilar. La detección in situ puede realizarse por extracción de una muestra histológica de un paciente y aplicación a la misma de un anticuerpo marcado de la presente invención. El anticuerpo (o fragmento) se aplica preferiblemente extendiendo el anticuerpo (o fragmento) marcado sobre una muestra biológica. Por el uso de un procedimiento de este tipo es posible determinar no sólo la presencia de los péptidos del gen 200 de huella dactilar, sino también su distribución en el tejido examinado. Utilizando la presente invención, quienes poseen una experiencia ordinaria percibirán fácilmente que cualquiera de una gran diversidad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) puede modificarse a fin de conseguir dicha detección in situ.
Inmunoensayos para péptidos de genes de huella dactilar de tipo salvaje o mutantes comprenden típicamente incubar una muestra biológica tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recogidas recientemente, o células que se han incubado en cultivo de tejidos, en presencia de un anticuerpo marcado detectablemente, capaz de identificar péptidos del gen 200 de huella dactilar, y detectar el anticuerpo fijado por cualquiera de numerosos métodos bien conocidos en la técnica.
La muestra biológica puede ponerse en contacto con e inmovilizarse sobre un soporte o vehículo en fase sólida tal como nitrocelulosa, u otro soporte sólido que es capaz de inmovilizar células, partículas de células o proteínas solubles. El soporte puede lavarse luego con tampones adecuados, seguido por tratamiento con el anticuerpo específico de genes de huella dactilar marcado detectablemente. El soporte en fase sólida puede lavarse luego una segunda vez con el tampón para eliminar el anticuerpo no fijado. La cantidad de marcador fijado sobre el soporte sólido puede detectarse luego por medios convencionales.
Por "soporte o vehículo en fase sólida" debe entenderse cualquier soporte capaz de fijar un antígeno o un anticuerpo. Soportes o vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros, y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble en cierto grado o insoluble para los propósitos de la presente invención. El material soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible con tal que la molécula acoplada sea capaz de fijarse a un antígeno o anticuerpo. Así, la configuración del soporte puede ser esférica, como en una cuenta, o cilíndrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser plana tal como una hoja, tira de ensayo, etc. Soportes preferidos incluyen cuentas de poliestireno. Los expertos en la técnica conocerán muchos otros vehículos adecuados para la fijación de anticuerpo o antígeno, o podrán averiguar los mismos mediante el uso de experimentación de rutina.
La actividad de fijación de un lote dado de un anti-anticuerpo del producto de genes de huella dactilar de tipo salvaje o mutante se puede determinar de acuerdo con métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica podrán determinar condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación mediante el empleo de experimentación de
rutina.
Una de las maneras en las cuales puede marcarse detectablemente el anticuerpo específico del péptido del gen 200 es por unión del mismo a una enzima y uso en un inmunoensayo enzimático (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2: 1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD); Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31: 507-520; Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol. 73: 482-523; Maggio, E. (compilador), 1980, ENZYME IMMUNOASSAY, CRC Press Boca Raton, FL; Ishikawa, E. et al., (compiladores), 1981, ENZYME IMMUNOASSAY, Kagaku Shoin, Tokio). La enzima que se fija al anticuerpo reaccionará con un sustrato apropiado, preferiblemente un sustrato cromógeno, de tal modo que producirá un resto químico que puede ser detectado por ejemplo por medios espectrofotométricos, fluorimétricos o por medios visuales. Enzimas que pueden utilizarse para marcar detectablemente el anticuerpo incluyen, pero sin carácter limitante, malato-deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-5-esteroide-isomerasa, alcohol de levadura-deshidrogenasa, alfa-glicerofosfato, deshidrogenasa, triosa-fosfato-isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa-oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. La detección puede realizarse por métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromógeno para la enzima. La detección puede realizarse también por comparación visual de la extensión de las reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados análogamente.
La detección puede realizarse también utilizando cualquiera de una diversidad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, por marcación radiactiva de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, es posible detectar péptidos de tipo salvaje o mutantes del gen 200 de huella dactilar mediante el uso de un radioinmunoensayo (RIA) (véase por ejemplo Weintraub, B., Principles de Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzo de 1986. El isótopo radiactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o por autorradiografía.
Es también posible marcar el anticuerpo con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado fluorescentemente se expone a luz de la longitud de onda apropiada, su presencia puede detectarse entonces debido a fluorescencia. Entre los compuestos marcadores fluorescentes utilizados más comúnmente se encuentran isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.
El anticuerpo puede marcarse también detectablemente utilizando metales que emiten fluorescencia tales como ^{152}Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo utilizando grupos formadores de quelatos metálicos tales como ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) o ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA).
El anticuerpo puede marcarse también de modo detectable por acoplamiento del mismo a un puesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado con el compuesto quimioluminiscente se determina luego por detección de la presencia de luminiscencia que se produce durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster oxalato.
Análogamente, puede utilizarse un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en la cual una proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina por detección de la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes importantes para propósitos marcadores son luciferina, luciferasa y equorina.
6. Ejemplo Identificación y caracterización de un gen expresado diferencialmente en células TH1 y TH2
Se demuestra la utilidad del enfoque paradigmático de la invención para la identificación de genes que se expresan diferencialmente en subpoblaciones de células TH.
6.1 Materiales y métodos
Ratones transgénicos: Se obtuvieron células CDN4^{+} inexpertas de los bazos y/o ganglios linfáticos de variedades de ratones transgénicos inexpertos que alojaban un receptor de células T (TCR) que reconocía ovoalbúmina (Murphy et al., 1990, Science 250:1720).
Células T transgénicas específicas de Ova: Suspensiones de células T específicas de Ova se co-cultivaron con antígeno del péptido estimulador y células presentadoras de antígeno esencialmente como se describe en Murphy et al. (Murphy et al., 1990, Science 250: 1720). Resumidamente, se incubaron 2-4 x 10^{6} células T con aproximadamente el doble de células presentadoras de antígeno TA3 en presencia del péptido Ova 0,3 \muM. Los cultivos de TH1 contenían aproximadamente 10 ng/ml de mIL-12 recombinante. Inversamente, las células TH2 recibieron IL-4 (1000 u/ml). Los cultivos se recogieron en diversos momentos después de la iniciación del cultivo. Las células T se purificaron de células TA3 utilizando cuentas magnéticas recubiertas con anti-CD4 (Dynal, Inc.). Las células T se redujeron a un sedimento por centrifugación suave y se lisaron en el volumen apropiado de RNAzol™ (Tel-Test, Friendswood, TX).
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Recogida de tejidos y aislamiento de RNA: Las células se congelaron rápidamente en hielo seco. Las muestras se homogeneizaron luego juntas en un mortero provisto de mano bajo nitrógeno líquido.
Se extrajo el RNA celular total del tejido con RNAzol™ o RNAzolB™ (Tel-Test, Friendswood, TX), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resumidamente, el tejido se solubilizó en una cantidad apropiada de RNAzol™ o RNAzolB™, y se extrajo el RNA por la adición de 1/10 v/v de cloroformo a la muestra solubilizada, seguido por sacudidas enérgicas durante aproximadamente 15 segundos. La mezcla se centrifugó luego durante 15 minutos a 12.000 g y la fase acuosa se retiró a un tubo nuevo. El RNA se precipitó con isopropanol. El sedimento de RNA resultante se disolvió en agua y se re-extrajo con un volumen igual de cloroformo para separar cualquier fenol remanente. El volumen extraído se precipitó con 2 volúmenes de etanol en presencia de acetato de sodio 150 mM. El RNA precipitado se disolvió en agua y se determinó la concentración espectroscópicamente (A_{250}).
Presentación diferencial: El RNA celular total (10-50 \mug) se trató con 20 unidades de DNasa I (Boehringer Mannheim, Alemania) en presencia de 40 unidades de inhibidor de ribonucleasas (Boehringer Mannheim, Alemania). Después de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, el RNA se disolvió en agua tratada con DEPC (pirocarbonato de dietilo).
La presentación diferencial de mRNA se llevó a cabo como se ha descrito arriba en la Sección 5.1.1.2. El RNA (0,4-2 \mug) se sometió a transcripción inversa utilizando la transcriptasa inversa Superscript (GIBCO/BRL). Los cDNAs se amplificaron luego por PCR en un ciclador térmico Perkin-Elmer 9600. Las mezclas de reacción (20 \mul) incluían decanucleótidos arbitrarios y una de doce secuencias T_{11}VN posibles, donde V representa dG, dC o dA, y N representa dG, dT, dA, o dC. Los parámetros para la PCR de 40 ciclos fueron como sigue: mantenimiento a 94°C, 2 minutos; ciclo a 94°C, 15 segundos, 40°C, 2 minutos; rampa hasta 72°, 30 segundos; mantenimiento a 72°C, 5 minutos; mantenimiento a 4°C.
Los productos de amplificación PCR radiomarcados se analizaron por electroforesis sobre geles de poliacrilamida desnaturalizante al 6%.
Reamplificación y subclonación: Las bandas PCR de interés se recuperaron a partir de geles de secuenciación y se reamplificaron.
Resumidamente, se alinearon los autorradiogramas con el gel secado, y la región que contenía las bandas de interés se cortó con un bisturí. El fragmento de gel escindido se eluyó por remojo en 100 \mul de tampón TE (Tris-EDTA) a aproximadamente 100ºC durante 15 minutos. La rodaja de gel se redujo luego a un sedimento por centrifugación breve, y el sobrenadante se transfirió a un tubo de microcentrífuga nuevo. El DNA se combinó con etanol en presencia de acetato de sodio 100 mM y 30 \mug de glucógeno (Boehringer Mannheim, Alemania) y se precipitó en hielo seco durante aproximadamente 10 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos y los sedimentos se lavaron con etanol al 80%. Los sedimentos se resuspendieron en 10 \mul de agua destilada.
Se reamplificaron 5 \mul del DNA eluido en una reacción de 100 \mul que contenía: tampón estándar de polimerasa Taq Cetus, dNTPs 20 \muM, 1 \muM de cada uno de los iniciadores oligonucleotídicos utilizados en la generación inicial del DNA amplificado. Las condiciones de ciclación utilizadas fueron las mismas que las condiciones iniciales utilizadas para generar la banda amplificada, como se ha descrito arriba. Una mitad de la reacción de amplificación se hizo pasar sobre un gel de agarosa al 2% y se eluyó utilizando papel DE-81 (Whatman Paper, Ltd., Inglaterra) como se describe en Sambrook et al., supra. Los fragmentos recuperados se ligaron al vector de clonación pCR™II (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) y se transformaron en la cepa DH5\alpha competente de E. coli (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD). Las colonias se dejaron crecer sobre placas de agar LB que contenían ampicilina (100 \mug/ml) y X-gal (40 \mug/ml) para permitir selección azul/blanco.
Análisis de la secuencia: Después de la subclonación, los fragmentos de cDNA reamplificados se secuenciaron en un Secuenciador Automático de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc. Seattle, WA). La secuencia se obtuvo a partir de cuatro o más transformantes independientes que contenían la misma inserción. La secuencia de nucleótidos que se muestra en esta memoria representa o bien el consenso de la información obtenida de las cuatro secuencias, o la secuencia obtenida de un clon representativo, como se indica. Dichos datos de secuencia primarios se editaron y se recortaron de secuencias vectoras y secuencias altamente repetitivas y se utilizaron para escrutar bases de datos Genbank utilizando el programa BLAST (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410).
Análisis Northern: Las muestras de RNA se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa desnaturalizante que contenía 1-1,5% de agarosa (SeaKem™ LE, FMC BioProducs, Rockland, ME) que contenía 6,3% de formaldehído. Las muestras que contenían 5-20 \mug de RNA total se mezclaron con solución de carga desnaturalizante (formamida desionizada al 72% y azul de bromofenol) y se calentaron a 70ºC durante 5 minutos. Las muestras se pusieron sobre hielo y se cargaron inmediatamente sobre geles. Los geles se pasaron en tampón 1x MOPS (MOPS 100 mM, acetato de sodio 25 mM, EDTA 5 mM). Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron con luz ultravioleta.
Después de completada la electroforesis, los geles se remojaron en hidróxido de sodio 50 mM con agitación suave durante aproximadamente 30 minutos para escindir ligeramente el RNA. Los geles se enjuagaron dos veces en agua y se neutralizaron luego por remojo en Tris-HCL 0,1 M (pH 7,5) durante aproximadamente 30 minutos. Los geles se equilibraron brevemente con 20 x SSC (cloruro de sodio 3 M, citrato de sodio 0,3 M) y se transfirieron luego a membranas de nailon tales como Hybond™, -N, (Amersham, Inc., Arlington Heights, IL) o Zeta-Probe (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) durante una noche en 20 x SSC. Las membranas que contenían RNA transferido se secaron a la estufa a 80°C durante 2 horas para inmovilizar el RNA.
Los fragmentos de DNA a utilizar como sondas eran de diversos tamaños y se marcaron utilizando una técnica de marcación aleatoria con hexámeros. Resumidamente, se utilizaron 25 ng de un fragmento de DNA purificado para generar cada sonda. Los fragmentos se añadieron a una reacción de marcación aleatoria con hexanucleótidos de 20 \mul (Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, IN) que contenía hexámeros aleatorios y una mezcla de los nucleótidos dCTP, dGTP, y dTTP (a una concentración final de 25 \muM cada uno). La mezcla de reacción se desnaturalizó por calentamiento a 100°C durante 10 minutos y se enfrió luego en hielo. Se añadieron 5 \mul de \alpha-^{32}P-dATP (50 \muCi; Amersham Inc., Arlington Heights, IL) y DNA-polimerasa Klenow (2 unidades; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Las reacciones se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Después de la incubación, se añadieron 30 \mul de agua a la reacción de marcación y los nucleótidos no incorporados se separaron por paso de las reacciones a través de una columna de cromatografía BioSpin-6™; (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA). La incorporación específica se determinó utilizando un contador de centelleo. Se utilizaron 1-5 x 10^{6} cpm por ml de mezcla de hibridación.
Membranas de nailon que contenían RNA inmovilizado se prehibridaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las sondas radiomarcadas se desnaturalizaron por calentamiento a 70ºC en formamida desionizada al 50% durante 10 minutos y se añadieron luego a la mezcla de hibridación (que contenía 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, 0,1% de SDS, 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón cizallado, 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt, Tris-HCL 30 mM (pH 8,5), NaPO_{4} 50 mM (pH 6,5). Las hibridaciones se realizaron a 42°C durante una noche. Se bañaron luego las membranas de nailon durante 2 minutos en una solución de lavado de 0,2 x SSC y 0,1% SDS a la temperatura ambiente para separar la mayor parte de la solución de hibridación remanente. Las membranas se bañaron luego dos veces en solución de lavado reciente precalentada a 42°C durante 20 minutos. Los filtros se cubrieron en una envoltura plástica y se expusieron a película autorradiográfica para visualizar los resultados.
6.2 Resultados
Se utilizó un paradigma de células T transgénicas (como se describe anteriormente en la Sección 6.1) para identificar los genes que se expresan diferencialmente entre células TH1 y TH2.
Se aislaron muestras de RNA de poblaciones de células TH1 y TH2 después de estimulación con antígeno secundaria o terciaria. Las muestras se analizaron luego por técnicas de presentación diferencial. La Fig. 1 muestra fragmentos amplificados obtenidos a partir de estas muestras, indicando la flecha un producto PCR que se consideró representaba un cDNA derivado de RNA producido por un gen que se expresa a un nivel más alto en las subpoblaciones de células TH2, con relación a las subpoblaciones de células TH1.
7. Ejemplo Identificación y caracterización de un gen expresado diferencialmente en células TH2
En el Ejemplo presentado en esta Sección, se utilizó el paradigma de células T transgénicas arriba descrito, en las Secciones 5.1.1.1 y 6 para identificar un gen que se expresa diferencialmente en células TH2.
7.1 Materiales y métodos
Análisis RT-PCR: Se realizó una RT-PCR cuantitativa como sigue. 1-2 \mug de RNA total, preparado como se ha descrito arriba en la Sección 6.1, se sometieron a transcripción inversa con iniciadores oligo-dT_{(12-18)} y transcriptasa inversa RNAasa H^{+} Superscrip™ (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). Resumidamente, se combinó el RNA con 1 \mul de oligo-dT (500 \mug/ml) en un volumen total de 11 \mul. La mezcla se calentó a 70°C durante 10 minutos y se enfrió en hielo. Después de una breve centrifugación, el RNA se sometió a transcripción inversa durante 1 hora. Partes alícuotas de cDNA de la primera cadena se guardaron a -20°C hasta poco tiempo antes de su utilización.
Los niveles de expresión se determinaron por amplificación mediante PCR de diluciones en serie de cDNA de la primera cadena. En este procedimiento, el cDNA se diluye serialmente en agua. Las diluciones se amplifican luego por lotes mediante PCR utilizando iniciadores específicos de la secuencia. Todas las reacciones PCR se amplifican en condiciones idénticas. Por consiguiente, la cantidad de producto generada debería reflejar la cantidad de molde de la secuencia que estaba presente inicialmente. Se utilizaron diluciones de 5-10 veces de cDNA y se utilizaron diluciones suficientes de tal modo que la cantidad de producto producida subsiguientemente variaba desde claramente visible por iluminación UV de geles teñidos con bromuro de etidio, hasta inferior a los niveles de detección. El método descrito aquí puede distinguir diferencias de 10 veces en los niveles de expresión.
Se diseñaron iniciadores para la amplificación de las bandas amplificadas secuenciadas, que se seleccionaron utilizando el programa OLIGO (National Biosciences, Plymouth, MN).
Todas las reacciones PCR cuantitativas se llevaron a cabo en una máquina PCR Perkin-Elmer 9600 (Perkin-Elmer). Generalmente, las condiciones de amplificación fueron como sigue: 30-40 ciclos constituidos por una desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, 50-60°C de reasociación durante 30 segundos, y extensión a 72°C durante 1 minuto. Después del sometimiento a ciclos, las reacciones se prolongaron durante 10 minutos a 72°C.
Ensayos de Protección contra RNAsas: Se realizaron ensayos de protección contra RNAsas de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un kit adquirido de Ambion, Inc. En los ensayos de protección contra las RNAsas se utilizaron sondas de RNA derivadas de GenBank Accession No. Y07159. Estas sondas se generaron también de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un kit adquirido de Ambion, Inc. La secuencia de estas sondas de RNA corresponde al extremo 5' del gen, e incluye secuencias codificantes y secuencias 5' no traducidas.
Estimulación con anti-CD-3: Las condiciones fueron como se describe, más adelante, en la Sección 8.1.
Otros procedimientos: Todos los restantes procedimientos de recogida de muestras de células, aislamiento de RNA, presentación diferencial, análisis de secuencia, y Northern realizados en los experimentos descritos en este ejemplo fueron como se describe anteriormente en la Sección 6.1.
7.2 Resultados
Un análisis de presentación diferencial de RNA aislado de muestras de células TH1 y TH2 obtenidas de un estudio de paradigma de células T transgénicas como se ha descrito arriba en la Sección 6.1. Específicamente, se obtuvieron células TH de ratones transgénicos que alojaban un receptor de células T que reconocía ovoalbúmina (Murphy et al., 1990, Science 250: 1720), se estimularon tres veces, y se obtuvo RNA de las células TH1 y TH2. El análisis de presentación diferencial de las muestras de RNA dio como resultado la identificación de bandas que se expresaban diferencialmente en las células TH1 y TH2.
Se aisló el cDNA del gen, se amplificó y se subclonó, y se obtuvo la secuencia de nucleótidos.
8. Ejemplo Identificación de nuevos genes expresados diferencialmente en subpoblaciones de células TH
En el Ejemplo presentado en esta Sección, se describen nuevas secuencias génicas que representan genes que se expresan diferencialmente en subpoblaciones de células TH y/o durante la diferenciación de tales subpoblaciones.
8.1 Materiales y métodos
Paradigma de los clones de células T: Se realizaron búsquedas de paradigmas de clones de células T como se ha descrito arriba en la Sección 5.1.1.1. Específicamente, los paradigmas de clones de células TH utilizaban tres clones diferentes: D10.G4 (TH2), AE7 (TH1) y D1.1 (TH1). Antes de la estimulación, los cultivos de células se enriquecieron en cuanto a células vivas por centrifugación a través de un gradiente de Ficoll. Las células recuperadas se sometieron a recuento y se examinó su viabilidad utilizando exclusión con azul tripán. Las células se reextendieron en placas en matraces T25 o T75 a aproximadamente 5 x 10^{6} células en 5 ml de 1,5 x 10^{6} células en 10 ml de medio de cultivo, respectivamente.
El recubrimiento se realizó, en líneas generales, de acuerdo con Current Protocols in Immunology, 1992, Coligan, J. E. et al., John Wiley & Sons, NY, pp 3.12.4-3.12.6). Específicamente, antes de la extensión en placas, los matraces se recubrieron con anticuerpos anti-CD3-\varepsilon (sobrenadante de hibridoma procedente del hibridoma 145-C11; Pharmingen, Inc., San Diego, CA). Para el recubrimiento, los anticuerpos se resuspendieron en PBS a 1-2 \mug/ml en un volumen suficiente para recubrir el fondo de los matraces. La solución de recubrimiento se incubó en los matraces durante al menos 1 hora a 37°C.
Después de la incubación, la solución de recubrimiento del anticuerpo se separó por aspiración y se añadieron inmediatamente las células. Los matraces se pusieron en una incubadora a 37°C durante 6 horas. Las células se recogieron mediante por ejemplo separación del sobrenadante del cultivo, seguido por lisis directa de las células por adición de solución RNAzol™. El cDNA se produjo como se describe a continuación.
Aislamiento del cDNA: Se recogió el RNA a partir de las células utilizando técnicas descritas anteriormente en la Sección 6.1. El mRNA se purificó directamente, utilizando un Kit de Purificación de mRNA QuickPrep™ (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La genoteca de cDNA de células TH1 se construyó utilizando un Kit de Sistema Lambda SuperScript™ de Gibco BRL, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resumidamente, se utilizaron 4,5 \mug de mRNA purificado como material de partida para la síntesis del cDNA de la primera cadena iniciado con poliA que contenía un sitio de clonación Not-1. La síntesis del cDNA de la segunda cadena se realizó por tratamiento con RNAsa H, seguido por iniciación aleatoria. Se ligaron adaptadores Sal-1 se ligaron al extremo 5' del cDNA bicatenario resultante. El cDNA ligado se digirió con Not-1 y se fraccionó por tamaños. Las fracciones que contenían cDNAs dentro del intervalo de tamaños de 0,5 a 8,0 kb de longitud se clonaron en ramas Sal-1/Not-1 \lambdaZipLox™. El fago recombinante se empaquetó luego utilizando el Kit de Extractos de Empaquetamiento Gigapack™II de Stratagene, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Células de la cepa Y1090 (ZL)™ de E. coli (Gibco BRL) se transformaron con fago recombinante empaquetado y se extendieron a una densidad de 50.000 pfu (unidades formadoras de placas) por cápsula de 150 mm. Las placas se escrutaron por hibridación a una sonda radiomarcada generada a partir de un fragmento de cDNA 200 de banda subclonada. La escisión de las inserciones de cDNA a partir de los clones lambda e introducción del DNA plasmídico recombinante en E. coli DH10B(ZIP)™ (Gibco BRL) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para aislamiento de cDNAs del gen 200, la genoteca de cDNA se escrutó con una sonda generada por marcación de la secuencia entera del subclón O de la banda 200, que se construyó utilizando DNA amplificado obtenido a partir del análisis de presentación diferencial. La secuencia de la banda 200 se escindió del Cloning Vector™ de pCRII (Invitrogen) por digestión con EcoRI. Aproximadamente 1/100.000 placas de la genoteca de cDNA se registraron como positivas cuando se escrutaron con esta sonda. Se seleccionaron para estudio ulterior varios clones, con inclusión de 200-P y 200 AF.
Otros procedimientos: Todas las manipulaciones de las células T transgénicas, la recogida de muestra de células, el aislamiento adicional de RNA, la presentación diferencial, el análisis de la secuencia, y los procedimientos Northern realizados en los experimentos descritos en este ejemplo fueron como se ha descrito arriba en la Sección 6.1.
8.2 Resultados
Las búsquedas del paradigma de las células T transgénicas y el paradigma de los clones de células T se condujeron para identificar secuencias génicas que representan genes expresados diferencialmente dentro de y/o entre subpoblaciones de células TH y/o durante la diferenciación de tales subpoblaciones. En esta memoria se describe uno de varios nuevos genes que se han identificado por estas búsquedas de paradigma. Específicamente, el gen aquí descrito ha sido designado como gen 200. Un sumario de las características de expresión diferencial de las nuevas secuencias génicas descritas en esta memoria se presenta anteriormente en la Tabla 1.
Como se muestra anteriormente en la Tabla 1, el gen 200 se expresa a un nivel más alto dentro de la subpoblación de células TH1, como se revela por el aspecto diferencial de TH1 de la banda amplificada 200. Como se expone a continuación, la secuencia del gen 200 murino se representa en Fig. 2A-2D (SEQ ID NO: 8) pero no aparece en bases de datos publicadas. Dado el patrón de expresión específico de TH1 que exhibe cada una de estas secuencias, el gen 200 y sus productos génicos pueden utilizarse potencialmente como tratamientos para trastornos relacionados con TH1, como diagnósticos para tales trastornos, y/o como parte de métodos para la identificación de compuestos capaces de mejorar trastornos relacionados con TH1.
La banda 200 se utilizó como sonda para identificar y aislar clones de cDNA del gen 200 murino, con inclusión de los clones designados 200-P, 200-AF y 200-O, que han sido depositados con la NRRL, como se resume en la Sección 10, más adelante. Se caracterizaron los clones de cDNA, obteniéndose la secuencia de nucleótidos de longitud total (SEQ ID NO: 8) de la región codificante del gen 200 murino, como se muestra en Fig. 2A-2D. La Fig. 2A-2D representa también la secuencia de aminoácidos derivada del producto del gen 200 murino (SEQ ID NO: 10).
Las búsquedas en bases de datos revelan que el producto del gen 200 es un nuevo receptor que contiene un dominio Ig extracelular, colocándolo así dentro de la superfamilia de receptores Ig. La clonación y caracterización del homólogo humano del gen 200 se describe en el ejemplo presentado más adelante en la Sección 9.
Los resultados de un análisis por transferencia Northern del mRNA del gen 200 murino se muestran en Fig. 3. Los datos representados en Fig. 3 demuestran, en primer lugar, que el gen 200 produce un transcrito de aproximadamente 1,2 kb de longitud, y, en segundo lugar, ilustran la especificidad TH1 de la expresión del gen 200.
Para el estudio, se utilizaron tres clones TH1 (D1.1, Dorris, AE7) y tres clones TH2 (D10G.4, DAX, CDC25), y se aislaron muestras de DNA de células no estimuladas (-) o células que se habían estimulado durante 6 horas con anticuerpo anti-CD3 fijado a una placa (+). Las muestras se sondaron con secuencias del gen 200, y, como se muestra en Fig. 3, el RNA tanto de las células TH1 estimuladas como de las no estimuladas contenía mRNA del gen 200, mientras que ninguna de las muestras obtenidas de células TH2 contenía mRNA del gen 200. Debe indicarse también que la expresión del gen 200 era más alta en cada una de las células TH1 estimuladas con relación a las células TH1 no estimuladas correspondientes.
9. Ejemplo Identificación y caracterización del gen 200 humano
En el Ejemplo aquí representado, se describe la clonación, identificación y caracterización del gen 200 humano, correspondiente al homólogo humano del gen 200 murino.
9.1 Materiales y métodos
Sonda del gen 200 murino: Una inserción EcoRI de aproximadamente 800 pb que contenía aproximadamente 90% del ORF del cDNA del gen 200 murino (femt200) se purificó en gel, se marcó con ^{32}P, y se utilizó para sondar la genoteca de cDNA de linfocitos humanos \lambdagt11 descrita a continuación.
Sonda del gen 200 humano: La inserción de aproximadamente 500 pb del clon de cDNA feht200a del gen 200 humano se marcó con ^{32}P y se utilizó para sondar la genoteca de cDNA de bazo fetal humano descrita a continuación.
Procedimientos de escrutinio: Aproximadamente 10^{6} placas de una genoteca de cDNA de linfocitos humanos \lambdagt11 (catálogo No. HL 1031B; Clontech) se escrutaron por duplicado con la sonda del gen 200 murino arriba descrita. Los filtros se hibridaron con la sonda durante una noche a 65°C en tampón de Church (7% SDS, NaHPO_{4} 250 mM, EDTA 2 \muM, 1% BSA). Al día siguiente, se lavaron los filtros en 2 x SSC/1% SDS durante 30 min a 50°C. Los filtros se expusieron luego a película Kodak a -80°C. Las placas positivas se escrutaron de nuevo en las mismas condiciones.
Una genoteca de cDNA de bazo fetal humano construida utilizando el Sistema de Clonación Uni-Zap de Stratagene se escrutó utilizando la sonda del gen feht200a humano arriba descrita. Aproximadamente 10 placas se hibridaron por duplicado a 65°C en tampón de Schurch durante una noche. Los filtros se lavaron luego durante 30 min a 65°C en 0,1 XSSC, 0,1% SDS y se expusieron a película. Los positivos se confirmaron por escrutinio secundario en las mismas condiciones.
Procedimientos de subclonación/secuenciación: El DNA procedente de los clones positivos obtenidos de la genoteca de cDNA \lambdagt11 se generó por un método de lisis en placa. El DNA purificado se digirió para obtener inserciones de cDNA que se subclonaron en el plásmido bBluescript (Stratagene).
Los clones positivos obtenidos de la genoteca de cDNA de bazo fetal humano se escindieron con fago adyuvante ExAssist, células XL1-Blue y células SOLR como ha sido descrito por Stratagene. Los productos de escisión se extendieron luego sobre placas LB/Amp y se incubaron a 37°C durante una noche. Se seleccionaron las colonias blancas y se preparó DNA para secuenciación.
La secuenciación del DNA se realizó de acuerdo con técnicas estándar.
Análisis por transferencia Northern de la expresión del gen 200 humano: Se llevaron a cabo transferencias Northern como se describe en la Sección 6.1, anteriormente. Se analizaron 15 \mug de RNA total procedente de una diversidad de órganos humanos (Clontech, CA). La sonda marcada con ^{32}P utilizada era el clon feht200a, arriba descrito, que contiene el ORF 5' del gen 200 humano.
9.2 Resultados
La secuencia de longitud total del gen 200 humano se clonó con éxito y se caracterizó, como se describe en esta memoria.
Para clonar el gen 200 humano, se purificó en gel una inserción EcoRI de 800 pb que contenía aproximadamente 90% del ORF de cDNA del gen 200 murino (femt200), se marcó con ^{32}P, y se utilizó para sondar una genoteca de cDNA de linfocitos humanos \lambdagt11. Aproximadamente 10^{6} placas se escrutaron por duplicado, como se describe anteriormente en la Sección 9.1. Se obtuvo una sola placa positiva y se escrutó de nuevo en las mismas condiciones. Una vez puro, este clon se utilizó para generar DNA lambda por un método de lisis en placa, y el DNA lambda se digirió para obtener una inserción de 500 pb (feht 200a) que, después de la secuenciación, se encontró era un homólogo humano del gen 200 murino.
Para obtener un clon codificante del ORF entero del 200 humano, se utilizó una sonda del gen 200 humano para escrutar una genoteca de cDNA de bazo fetal humano, como se describe anteriormente en la Sección 9.1. Se obtuvieron tres clones positivos, dos de los cuales eran positivos después de escrutinio secundario en las mismas condiciones. Los dos clones positivos se subclonaron y se secuenciaron sus inserciones de cDNA. Estos dos clones, marcados feht 200b y feht 200c tenían una longitud aproximada de 1,56 kb y 2,0 kb respectivamente, conteniendo feht 200c la secuencia codificante entera. El clon feht 200c se depositó con el ATCC, como se describe a continuación en la Sección 12.
La secuencia de nucleótidos que contiene el marco de lectura abierto del gen 200 humano completo se representa en Fig. 24 (SEQ ID NO: 23). La secuencia de aminoácidos derivada del producto del gen 200 humano se representa también en Fig. 24 (SEQ ID NO: 24).
La secuencia de residuos de 301 residuos de aminoácidos del producto del gen 200 humano revela que es un receptor de la superficie celular que exhibe dominios distintos, que incluyen una secuencia señal desde el residuo de aminoácido 1 a aproximadamente 20, un dominio extracelular desde aproximadamente el residuo de aminoácido 21 al 200, un dominio transmembranal desde aproximadamente el residuo de aminoácido 201 al 224 y un dominio citoplásmico desde aproximadamente el aminoácido 225 al 301. El dominio extracelular contiene un dominio de ajuste variable de tipo Ig desde aproximadamente el residuo de aminoácido 30 a aproximadamente el residuo de aminoácido 128, colocando así el producto del gen 200 dentro de la superfamilia de receptores Ig.
Se realizó un análisis Northern de la distribución tisular de transcritos del gen 200. Se aislaron 15 \mug de RNA de cerebro, riñón, hígado, pulmón, músculo, próstata, bazo, timo y tráquea, y se analizaron respecto a la expresión del gen 200 humano. Este análisis reveló transcritos del gen 200 humano de aproximadamente 2,2 kb, en tejidos que incluían cerebro, pulmón, traquea, bazo y timo.
Como resumen, el gen 200 humano, correspondiente al análogo humano del gen 200 murino, ha sido clonado y caracterizado con éxito, como se describe en esta memoria. Como se revela por su secuencia de aminoácidos, el producto del gen 200 humano es un receptor de la clase de moléculas de la superfamilia Ig.
10. Ejemplo Construcción y expresión de proteínas de fusión IgG1
En este Ejemplo se describe la construcción y expresión de proteínas de fusión IgG1. Específicamente, se expone la construcción de proteínas de fusión IgG1 del gen 200 humano y murino.
10.1 Materiales y métodos Plásmidos recombinantes que codifican proteínas de fusión IgG1
Generación del vector que codifica la proteína de fusión gen 200 murino-hIgG1: El fragmento codificante de la secuencia señal y el dominio extracelular del gen 200 murino se amplificó a partir de un clon de cDNA que contenía el ORF del gen 200 murino utilizando los oligonucleótidos siguientes:
Oligo directo: 5'-AAA-TTT-ATT-CTC-GAG-GAC-CCA-CGC-GTC-CGG-ATT-TCC-C-3' 
\hskip0.2cm
(SEQ ID NO: 25);
Oligo inverso: 5'-TTA-ATT-TGG-ATC-CCC-AGT-TCT-GAT-CGT-TTC-TTC-AGA-GTC-3' (SEQ ID NO: 26).
Los iniciadores oligonucleotídicos introducen también sitios de restricción XhoI y BamHI en los extremos 5' y 3' de los productos PCR, respectivamente, para facilitar la inserción subsiguiente en vectores de expresión IgG1 (pCD5-CD44-IgG1; véase Aruffo, A. et al., 1991, Cell 61: 1303-1313). El vector pCD5-CD44-IgG1 codifica una proteína que contiene una secuencia señal CD5, un dominio extracelular CD44 y una región Fc de cadena pesada humana IgG1. Para construcción del vector de la proteína de fusión gen 200 murino-hIgG1, las porciones CD5 y CD44 de pCD5-CD44-IgG1 se reemplazaron con secuencias que codificaban la secuencia señal del producto del gen 200 murino y el dominio extracelular.
Las reacciones PCR consistieron en 25 ciclos de amplificación a una temperatura de reasociación de 60°C. En la amplificación se utilizó la DNA-polimerasa termoestable Vent™ (New England Biolabs, Inc.; Beverly, Massachusetts). El producto de la PCR (de aproximadamente 600 pb) se digirió con XhoI y BamHI y se insertó en pCD5-CD44-IgG1 digerido previamente con XhoI y BamHI para separar las secuencias que codificaban la secuencia señal CD5 y el ectodominio CD44.
Generación del vector codificante de la proteína de fusión gen 200 humano-hIgG1: El fragmento codificante de la secuencia señal y el dominio extracelular del gen 200 humano se amplifica a partir de un clon de cDNA que contiene el ORF del 200 humano utilizando los oligonucleótidos siguientes:
Oligo directo: 5'-AAA-TTT-ATT-CTC-GAG-CGC-TAA-CAG-AGG-TGT-CC-3' 
\hskip1.7cm
(SEQ ID NO: 27);
Oligo inverso: 5'-TTA-ATT-TGG-ATC-CCC-TCT-GAT-GGT-TGC-TCC-AGA-GTC-CCG-3' (SEQ ID NO: 28).
Los procedimientos de amplificación y subclonación de pCD5-CD-44-IgG1 son como se ha descrito arriba para la proteína de fusión gen 200 murino-hIgG1.
Marcación metabólica de proteínas de fusión recombinantes: 36 horas después de la transfección transitoria de cultivos COS-7, las células se enjuagaron con medio de crecimiento de reemplazamiento [DMEM agotado en metionina y cisteína (ICN, Inc., CA)]. Después del enjuagado, se añadieron al medio de reemplazamiento 150 \muCI/ml de medio de una mezcla de ^{35}S-cisteína y ^{35}S-metionina (Express^{35}S^{35}S™, Dupont, MA) y las células se cultivaron durante una noche.
Análisis de proteínas recombinantes por SDS PAGE
Se generaron proteínas de fusión hIgG1 por transfección transitoria mediada por LipfectAMINE™ (Gibco, Inc., MD) de células COS-7 de acuerdo con las sugerencias del fabricante para proteínas de fusión gen 200-hIgG1, se mezcló 1 ml de sobrenadante del día cinco con 20 \mul de cuentas Protein A Trisacryl (Pierce, Inc., IL) en presencia de HEPES 20 mM (pH 7,0) durante una noche a 4°C con agitación constante. Las cuentas se lavaron luego 3X con PBS antes de la adicción a tampón de carga. Las cuentas se mezclaron con tampones de carga reductores o no reductores (descritos en Molecular Cloning, Sambrook, Fritsch, y Maniatis, 2ª edición, 1989, con la excepción de que se reemplazó DTT con \beta-mercaptoetanol al 2,5%).
10.2 Resultados
Se describe aquí la construcción y expresión de proteínas de fusión IgG recombinantes. Específicamente, se describen proteínas de fusión producto del gen 200-IgG1. La proteína de fusión producto del gen 200 murino y humano-IgG1 contiene una secuencia señal de producto del gen 200 y una fusión del dominio extracelular a una región Fc de la cadena pesada humana de IgG1.
Se produjeron proteínas de fusión gen 200-hIgG1 por transfección transitoria de células COS-7, como se ha descrito arriba en la Sección 10.1. La inmunoprecipitación con proteína A de los sobrenadantes COS-7 y su análisis por SDS-PAGE demostraron, primeramente, que se producía el péptido IgG-1 correcto como parte de la fusión (como se demostró por la inmunoprecipitación con proteína A de la fusión) y, en segundo lugar, demostraron la expresión sustancial de la proteína de fusión gen 200-IgG1 a una concentración de aproximadamente 1 \mug por ml de sobrenadante de cultivo. Adicionalmente, cuando los sobrenadantes inmunoprecipitados se analizan y se comparan en condiciones reductoras y no reductoras, está claro que la proteína de fusión gen 200-IgG1 sufre oligomerización, como era de esperar, dada la secuencia del péptido de la cadena pesada de IgG1 humana presente en la proteína de fusión. Adicionalmente, el tamaño (a saber, mayor que lo esperado a partir de la secuencia de aminoácidos sola) y el aspecto de las proteínas de fusión a medida que las mismas emigran a través de los geles (a saber, en forma de bandas difusas, en lugar de bandas compactas) indican que, como era de esperar, las proteínas de fusión están glicosiladas.
12. Depósito de microorganismos
Los microorganismos siguientes se depositaron con la Colección de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola (NRRL, Peoria, Illinois, en fecha 19 de Enero de 1995 (200-O), 2 de Marzo de 1995 (E. coli DH10B(Zip)™ que contenía 200-P) y 1 de Junio de 1995 (200-AF) y se les asignaron los números de acceso que se indican a continuación:
Microorganismo \hskip1.5cm Nº de Acceso NRRL
200-O B-21395
E. coli B-21415
DH10B(Zip)™ que contenía
cDNA de 200-P
200-AF B-21457
Los microorganismos siguientes se depositaron con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, Maryland, en fecha 12 de Diciembre de 1995 y se les asignaron los números de acceso indicados a continuación:
Microorganismo \hskip3cm Nº de Acceso ATCC
E. coli, feht 200C 61967
Las reacciones específicas descritas esta memoria tienen por objeto servir únicamente como simples ilustraciones de aspectos individuales dentro del alcance de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Millenium Pharmaceuticals, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO Y DIAGNÓSTICO DE TRASTORNOS INMUNOLÓGICOS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 38
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Huber & Schüssler
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Truderinger Strasse 246
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: 81825 Munich
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: Alemania
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOPORTE LÓGICO: FastSEQ Version 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 96 908 594.3
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-MAR-1996
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN: Correspondiente a PCT/US96/02798
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE PROCURADOR/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Schüssler, Andrea
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: M 4289EU
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 089/42 72 47 48
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 089/42 72 47 49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 357 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 255 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2055 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 496..1509
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
3
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 460 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 414 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 240 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 217 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2710 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 40..885
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
10
11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 337 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 281 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
15
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1257 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 22..1137
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 371 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)LONGITUD:
1230 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 130 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
25
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 122 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGCCATAGA GAGACCTC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCTGTCCA TTATACAGG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAACACGGCA TTGTCACTAA CT 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCATAGAT GGGCACTGTG T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 843 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2236 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 42...944
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Secuencia nucleotídica del gen 200 humano
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
29
30
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 301 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
32
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Oligonucleótido directo
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1...37
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAATTTATTC TCGAGGACCC ACGCGTCCGG ATTTCCC 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Oligonucleótido inverso
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1...39
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTAATTTGGA TCCCCAGTTC TGATCGTTTC TCCAGAGTC 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Oligonucleótido directo
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1...32
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAATTTATTC TCGAGCGCTA ACAGAGGTGT CC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Oligonucleótido inverso
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1...39
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTAATTTGGA TCCCCTCTGA TGGTTGCTCC AGAGTCCCG 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGCGGGTAC CAGTAAATCG TCCTGGGGTG G 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAATAAAGGA TCCCTACATC CAGCAACTAT GTAGTA 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCAATTGA CTAGTGACCC ACGCGTCCGG ATTTC 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACGCGGATC CTCAGGATGG CTGCTGGCTG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAACACACTA GTACTATCCT GTGCCATTGC CATAGAGA 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAATATTGG GCCCTTGGAT CCCAAGTCTG CACACCTGCA CTCC 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAAATCGTC CTGGGGTCTG G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTTCTGATA ACACAAGCAT AAATC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 903 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
35

Claims (54)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:
(a)
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23;
(b)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción de cDNA del clon contenido en los clones de E. coli depositados como American Type Culture Collection (ATCC) Número de Acceso 69967, Agricultural Research Culture Collection (NRRL) Número de Acceso B-21395, NRRL Número de Acceso B-21415, o NRRL Número de Acceso B-21457, en donde dicha inserción de cDNA se hibrida en condiciones severas a una molécula de ácido nucleico que es el complemento de un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23, y en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a un filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65ºC, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C; o
(c)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno de los dominios peptídicos siguientes representados en Fig. 2 (SEQ ID NO: 10) o Fig. 24 (SEQ ID NO: 24):
(a)
dominio de secuencia señal;
(b)
dominio extracelular;
(c)
dominio extracelular maduro;
(d)
dominio de serie variable de tipo Ig;
(e)
dominio transmembranal; o
(f)
dominio citoplásmico.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende:
(a)
los residuos de aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 10;
(b)
los residuos de aminoácidos 21 a 192 de SEQ ID NO: 10;
(c)
los residuos de aminoácidos 1 a 192 de SEQ ID NO: 10;
(d)
los residuos de aminoácidos 193 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(e)
los residuos de aminoácidos 215 a 280 de SEQ ID NO: 10;
(f)
los residuos de aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 24;
(g)
los residuos de aminoácidos 21 a 200 de SEQ ID NO: 24;
(h)
los residuos de aminoácidos 1 a 200 de SEQ ID NO: 24;
(i)
los residuos de aminoácidos 201 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(j)
los residuos de aminoácidos 225 a 301 de SEQ ID NO: 24; o
(k)
los residuos de aminoácidos 30 a 128 de SEQ ID NO: 24.
4. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2 que comprende:
(a)
los nucleótidos 40 a 99 de SEQ ID NO: 8;
(b)
los nucleótidos 40 a 615 de SEQ ID NO: 8;
(c)
los nucleótidos 40 a 882 de SEQ ID NO: 8;
(d)
los nucleótidos 100 a 615 de SEQ ID NO: 8;
(e)
los nucleótidos 616 a 681 de SEQ ID NO: 8;
(f)
los nucleótidos 682 a 882 de SEQ ID NO: 8;
(g)
los nucleótidos 1 a 60 de SEQ ID NO: 23;
(h)
los nucleótidos 1 a 600 de SEQ ID NO: 23;
(i)
los nucleótidos 1 a 903 de SEQ ID NO: 23;
(j)
los nucleótidos 61 a 600 de SEQ ID NO: 23;
(k)
los nucleótidos 90 a 384 de SEQ ID NO: 23;
(l)
los nucleótidos 601 a 672 de SEQ ID NO: 23; o
(m)
los nucleótidos 675 a 903 de SEQ ID NO: 23.
5. Una molécula de ácido nucleico aislada que se hibrida en condiciones severas a la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1(a) o la reivindicación 1(b) o su complemento, en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a un filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C o lavado en 0,2 x SSC/0,1% SDS a 42°C.
6. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que carece de al menos uno de los dominios peptídicos siguientes representados en Fig. 7 (SEQ ID NO: 10) o Fig. 24 (SEQ ID NO: 24).
(a)
dominio de secuencia señal;
(b)
dominio extracelular;
(c)
dominio extracelular maduro;
(d)
dominio extracelular de Ig;
(e)
dominio transmembranal; o
(f)
dominio citoplásmico.
en donde el polipéptido es codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1, o una porción del mismo.
7. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 6, que codifica un polipéptido que carece de al menos una de las secuencias de aminoácidos siguientes:
(a)
los residuos de aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 10;
(b)
los residuos de aminoácidos 1 a 192 de SEQ ID NO: 10;
(c)
los residuos de aminoácidos 1 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(d)
los residuos de aminoácidos 21 a 192 de SEQ ID NO: 10;
(e)
los residuos de aminoácidos 21 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(f)
los residuos de aminoácidos 21 a 281 de SEQ ID NO: 10;
(g)
los residuos de aminoácidos 193 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(h)
los residuos de aminoácidos 193 a 281 de SEQ ID NO: 10;
(i)
los residuos de aminoácidos 215 a 281 de SEQ ID NO: 10;
(j)
los residuos de aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 24;
(k)
los residuos de aminoácidos 1 a 200 de SEQ ID NO: 24;
(l)
los residuos de aminoácidos 1 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(m)
los residuos de aminoácidos 21 a 200 de SEQ ID NO: 24;
(n)
los residuos de aminoácidos 21 a 224 de SEQ (D NO: 24;
(o)
los residuos de aminoácidos 21 a 301 de SEQ ID NO: 24;
(p)
los residuos de aminoácidos 30 a 128 de SEQ ID NO: 24;
(q)
los residuos de aminoácidos 201 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(r)
los residuos de aminoácidos 201 a 301 de SEQ ID NO: 24; y/o
(s)
los residuos de aminoácidos 225 a 301 de SEQ ID NO: 24.
8. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 6 que carece de al menos una de las secuencias de nucleótidos siguientes:
(a)
los nucleótidos 49 a 99 de SEQ ID NO: 8;
(b)
los nucleótidos 40 a 615 de SEQ ID NO: 8;
(c)
los nucleótidos 40 a 882 de SEQ !D NO: 8;
(d)
los nucleótidos 100 a 615 de SEQ ID NO: 8;
(e)
los nucleótidos 616 a 681 de SEQ ID NO: 8;
(f)
los nucleótidos 682 a 882 de SEQ ID NO: 8;
(g)
los nucleótidos 1 a 60 de SEQ ID NO: 23;
(h)
los nucleótidos 1 a 600 de SEQ ID NO: 23;
(i)
los nucleótidos 1 a 903 de SEQ ID NO: 23;
(j)
los nucleótidos 61 a 600 de SEQ ID NO: 23;
(k)
los nucleótidos 90 a 384 de SEQ ID NO: 23;
(l)
los nucleótidos 601 a 672 de SEQ ID NO: 23; y/o
(m)
los nucleótidos 675 a 903 de SEQ 1D NO: 23.
9. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un polipéptido heterólogo.
10. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9 en donde el polipéptido heterólogo comprende un fragmento Fc de inmunoglobulina.
11. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
12. El vector de la reivindicación 11 que comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos que regula la expresión de un producto génico codificado por la molécula de ácido nucleico.
13. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 11 ó 12.
14. Una célula hospedadora modificada por ingeniería genética que contiene la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
15. Una célula hospedadora modificada por ingeniería genética que contiene la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en asociación operativa con un elemento regulador de la secuencia nucleotídica que controla la expresión de la secuencia nucleotídica en la célula hospedadora.
\newpage
16. Un método para producir un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende: cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 13, 14 ó 15, de tal modo que dicho polipéptido se expresa en el cultivo de células, y recuperar el polipéptido a partir de dicho cultivo de células.
17. Un polipéptido aislado que comprende:
(a)
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24;
(b)
la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23; o
(c)
la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción de cDNA del clon contenido dentro de los clones de E. coli depositados como ATCC Número de Acceso 69967, NRRL Número de Acceso B-21395, NRRL Número de Acceso B-21415, o NRRL Número de Acceso B-21457, en donde dicha inserción de cDNA se hibrida en condiciones severas a una molécula de ácido nucleico que es el complemento de un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23, y en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a un filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C.
18. Un polipéptido aislado que comprende:
(a)
los residuos de aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 10;
(b)
los residuos de aminoácidos 1 a 192 de SEQ ID NO: 10;
(c)
los residuos de aminoácidos 1 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(d)
los residuos de aminoácidos 21 a 192 de SEQ ID NO: 10;
(e)
los residuos de aminoácidos 21 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(f)
los residuos de aminoácidos 21 a 281 de SEQ ID NO: 10;
(g)
los residuos de aminoácidos 193 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(h)
los residuos de aminoácidos 193 a 281 de SEQ ID NO: 10;
(i)
los residuos de aminoácidos 215 a 281 de SEQ (D NO: 10;
(j)
los residuos de aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 24;
(k)
los residuos de aminoácidos 1 a 200 de SEQ ID NO: 24;
(l)
los residuos de aminoácidos 1 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(m)
los residuos de aminoácidos 21 a 200 de SEQ ID NO: 24;
(n)
los residuos de aminoácidos 21 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(o)
los residuos de aminoácidos 21 a 301 de SEQ ID NO: 24;
(p)
los residuos de aminoácidos 30 a 128 de SEQ ID NO: 24;
(q)
los residuos de aminoácidos 201 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(r)
los residuos de aminoácidos 201 a 301 de SEQ ID NO: 24; y/o
(s)
los residuos de aminoácidos 225 a 301 de SEQ ID NO: 24.
19. El polipéptido aislado de la reivindicación 17 que tiene una secuencia de aminoácidos que carece de al menos uno, pero no de la totalidad de los dominios peptídidos siguientes de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24: un dominio de secuencia señal, dominio extracelular, dominio extracelular de Ig, dominio transmembranal o dominio citoplásmico.
20. El polipéptido aislado de la reivindicación 19 que tiene una secuencia de aminoácidos que carece de al menos una, pero no de la totalidad de las secuencias de aminoácidos siguientes de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24:
(a)
los residuos de aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 10;
(b)
los residuos de aminoácidos 1 a 192 de SEQ ID NO: 10;
(c)
los residuos de aminoácidos 1 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(d)
los residuos de aminoácidos 21 a 192 de SEQ ID NO: 10;
(e)
los residuos de aminoácidos 21 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(f)
los residuos de aminoácidos 21 a 281 de SEQ ID NO: 10;
(g)
los residuos de aminoácidos 193 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(h)
los residuos de aminoácidos 193 a 281 de SEQ ID NO: 10;
(i)
los residuos de aminoácidos 215 a 281 de SEQ ID NO: 10;
(j)
los residuos de aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 24;
(k)
los residuos de aminoácidos 1 a 200 de SEQ ID NO: 24;
(l)
los residuos de aminoácidos 1 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(m)
los residuos de aminoácidos 21 a 200 de SEQ ID NO: 24;
(n)
los residuos de aminoácidos 21 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(o)
los residuos de aminoácidos 21 a 301 de SEQ ID NO: 24;
(p)
los residuos de aminoácidos 30 a 128 de SEQ ID NO: 24,
(q)
los residuos de aminoácidos 201 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(r)
los residuos de aminoácidos 201 a 301 de SEQ ID NO: 24; y/o
(s)
los residuos de aminoácidos 225 a 301 de SEQ ID NO: 24.
21. Un polipéptido aislado que está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas al complemento de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24, en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a un filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,2 x SSC/0,1% SDS a 42°C o 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C.
22. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17-21 y un polipéptido no afín.
23. La proteína de fusión de la reivindicación 22, en donde el polipéptido no afín es glutatión-S-transferasa (GST), un dominio de IgFc, o el dominio de fijación de DNA de la proteína GAL 4.
24. Un anticuerpo o fragmento de fijación de epítope del mismo que se fija específicamente al polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 17-21.
25. El anticuerpo o fragmento de fijación de epítope del mismo de la reivindicación 24, que es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, y/o un anticuerpo humanizado.
26. El anticuerpo o fragmento de fijación de epítope del mismo de la reivindicación 24, que está enlazado a un resto destructivo y/o una sustancia detectable.
27. El anticuerpo o fragmento de fijación de epítope del mismo de la reivindicación 26, en el cual el resto destructivo es una citotoxina o un agente radiactivo.
28. El anticuerpo o fragmento de fijación de epítope del mismo de la reivindicación 27, en la cual la citotoxina es una toxina derivada de plantas, toxina derivada de hongos, toxina derivada de bacterias, o la toxina desglicosilada de la cadena A de la ricina.
29. El anticuerpo o fragmento de fijación de epítope del mismo de la reivindicación 26, en el cual la sustancia detectable se selecciona del grupo constituido por una enzima, un material fluorescente, un material quimioluminiscente, un material bioluminiscente, y un material radiactivo.
30. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de fijación de epítope del mismo de la reivindicación 24 y un vehículo fisiológicamente aceptable.
31. Un polipéptido de fusión de la región Fc de un anticuerpo que comprende una región Fc de anticuerpo enlazada a:
(a)
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24, o la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción de cDNA del clon contenido en ATCC Número de Acceso 69967, NRRL Número de Acceso B-21395, NRRL Número de Acceso B-21415, o NRRL Número de Acceso B-21457, en donde dicha inserción de cDNA se hibrida en condiciones severas a una molécula de ácido nucleico que es el complemento de un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23, y en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C;
(b)
los residuos de aminoácidos 1-20, 1-200, 1-224, 30-128, 21-200, 21-224, 21-301, 201-224, 201-301 y/o 225-301 de SEQ ID NO: 24; o
(c)
los residuos de aminoácidos 1-20, 1-192, 1-214, 21-192, 21-214, 21-281, 193-214, 193-281 y/o 215-281 de SEQ ID NO: 10.
32. Un polipéptido de fusión Fc de anticuerpo que comprende una región Fc de anticuerpo enlazada a una secuencia de aminoácidos que está codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas al complemento de la molécula de ácido nucleico constituida por SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23, en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 65°C.
33. El polipéptido de fusión región Fc de anticuerpo de la reivindicación 31, en donde la secuencia de aminoácidos comprende un dominio extracelular de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ó 24.
34. El polipéptido de fusión de la región Fc de anticuerpo de la reivindicación 23, en donde el dominio extracelular comprende los residuos de aminoácidos 21-192 de SEQ ID NO: 10 ó 21-200 de SEQ ID NO: 24.
35. Un método para detectar la expresión del gen 200 en una muestra que comprende: detectar la presencia de un producto del gen 200 o una molécula de RNA que codifica el producto del gen 200, en donde el producto del gen 200 comprende:
(a)
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24;
(b)
la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23;
(c)
la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción de cDNA del clon contenido dentro de los clones de E. coli depositados como ATCC Número de Acceso 69967, NRRL Número de Acceso B-21395, NRRL Número de Acceso B-21415, o NRRL Número de Acceso B-21457, en donde dicha inserción de cDNA se hibrida en condiciones severas a una molécula de ácido nucleico que es el complemento de un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23, y en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C;
(d)
los residuos de aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 10;
(e)
los residuos de aminoácidos 1 a 192 de SEQ ID NO: 10;
(f)
los residuos de aminoácidos 1 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(g)
los residuos de aminoácidos 21 a 192 de SEQ ID NO: 10;
(h)
los residuos de aminoácidos 21 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(i)
los residuos de aminoácidos 21 a 281 de SEQ ID NO: 10;
(j)
los residuos de aminoácidos 193 a 214 de SEQ ID NO: 10;
(k)
los residuos de aminoácidos 193 a 281 de SEQ ID NO: 10;
(l)
los residuos de aminoácidos 215 a 281 de SEQ ID NO: 10;
(m)
los residuos de aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 24;
(n)
los residuos de aminoácidos 1 a 200 de SEQ ID NO: 24;
(o)
los residuos de aminoácidos 1 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(p)
los residuos de aminoácidos 21 a 200 de SEQ ID NO: 24;
(q)
los residuos de aminoácidos 21 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(r)
los residuos de aminoácidos 21 a 301 de SEQ ID NO: 24;
(s)
los residuos de aminoácidos 30 a 128 de SEQ ID NO: 24;
(t)
los residuos de aminoácidos 201 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(u)
los residuos de aminoácidos 201 a 301 de SEQ ID NO: 24;
(v)
los residuos de aminoácidos 225 a 301 de SEQ ID NO: 24;
(w)
una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas al complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8, o una porción de la misma, en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C; o
(x)
una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas al complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23, o una porción de la misma, en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C.
36. El método de la reivindicación 35, en donde la muestra está inmovilizada sobre un soporte en fase sólida.
37. El método de la reivindicación 35, en donde el producto del gen 200 se detecta en la muestra por fijación del producto del gen a un anticuerpo dirigido contra el producto del gen 200.
38. El método de la reivindicación 37, en donde el anticuerpo está marcado directa o indirectamente.
39. El método de la reivindicación 35, en donde la muestra comprende moléculas de RNA y el método comprende adicionalmente:
(a)
reasociar iniciadores de moléculas de ácido nucleico a moléculas de RNA en la muestra en condiciones que reasocian selectivamente los iniciadores a moléculas de RNA que codifican el producto del gen 200 y dan como resultado la transcripción inversa de las moléculas de RNA en moléculas de cDNA; y
(b)
determinar si las moléculas de cDNA se han amplificado;
o
(a)
hibridar las sondas de la molécula de ácido nucleico a las moléculas de RNA contenidas en la muestra en condiciones que hibridan selectivamente las sondas a moléculas de ácido nucleico que codifican el producto del gen 200;
(b)
separar las sondas de ácido nucleico no hibridadas de las moléculas de RNA en la muestra; y
(c)
detectar la presencia de sondas de ácido nucleico hibridadas a las moléculas de RNA de la muestra.
40. Un método para diagnosticar un trastorno inmunológico relacionado con una subpoblación de células TH que comprende detectar, en una muestra de un paciente que se sospecha padece el trastorno, el nivel de un producto del gen 200 o una molécula de RNA que codifica el producto del gen 200 de tal manera que si el nivel detectado difiere del existente en una muestra de control, se diagnostica un trastorno relacionado con una subpoblación de células TH, en donde el producto del gen 200 es:
(a)
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;
(b)
la secuencia de aminoácidos codificada con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23;
(c)
la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción de cDNA del clon contenido dentro del clon de E. coli depositado como ATCC Número de Acceso 69967, en donde dicha inserción de cDNA se hibrida en condiciones severas a una molécula de ácido nucleico que es el complemento de un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23, y en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C;
(d)
los residuos de aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 24;
(e)
los residuos de aminoácidos 1 a 200 de SEQ ID NO: 24;
(f)
los residuos de aminoácidos 201 a 224 de SEQ ID NO: 24;
(g)
los residuos de aminoácidos 225 a 301 de SEQ ID NO: 24;
(h)
los residuos de aminoácidos 30 a 128 de SEQ ID NO: 24; o
(i)
una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas al complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23, o una porción de la misma, en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C.
41. El método de la reivindicación 40, en donde el trastorno inmunológico relacionado con una subpoblación de células TH es un trastorno inmunológico relacionado con la subpoblación de células TH1.
42. El método de la reivindicación 41, en donde el trastorno inmunológico relacionado con la subpoblación de células TH1 es esclerosis múltiple, psoriasis o diabetes dependiente de insulina.
43. El método de la reivindicación 41, en donde el nivel del producto del gen 200 se detecta en la muestra del paciente por fijación del producto génico a un anticuerpo dirigido contra el producto del gen 200.
44. El método de la reivindicación 43, en donde el anticuerpo está marcado directa o indirectamente.
45. El método de la reivindicación 41, en donde la muestra del paciente comprende moléculas de RNA y el método comprende adicionalmente:
(a)
reasociar iniciadores de moléculas de ácido nucleico a moléculas de RNA en la muestra en condiciones que reasocian selectivamente los iniciadores a moléculas de RNA que codifican el producto del gen 200 y dan como resultado la transcripción inversa de las moléculas de RNA a moléculas de cDNA;
(b)
reasociar los iniciadores de las moléculas de ácido nucleico a las moléculas de cDNA en condiciones que amplifican selectivamente las moléculas de cDNA; y
(c)
detectar el nivel de moléculas de cDNA que codifican el producto del gen 200 que se han amplificado,
de tal manera que si el nivel de cDNA amplificado a partir de la muestra del paciente difiere con relación al nivel amplificado procedente de una muestra de control, se diagnostica un trastorno inmunológico relacionado con una subpoblación de las células TH; o
(a)
hibridar sondas de moléculas de ácido nucleico a las moléculas de RNA en la muestra en condiciones que hibridan selectivamente las sondas a moléculas de ácido nucleico que codifican el producto del gen 200; y
(b)
detectar el nivel de sondas de ácido nucleico hibridadas a las moléculas de RNA de la muestra,
de tal manera que si el nivel de RNA en la muestra del paciente difiere con relación al nivel detectado en una muestra de control, se diagnostica un trastorno inmunológico relacionado con una subpoblación de las células TH.
46. Un método para identificar un compuesto de ensayo que se fija a un producto del gen 200 y/o modula la actividad de un producto del gen 200, que comprende:
(a)
poner en contacto un compuesto de ensayo con un producto del gen 200 durante un tiempo suficiente para fijarse a y formar un complejo producto del gen 200/compuesto;
(b)
separar el compuesto de ensayo no fijado; y
(c)
detectar el complejo,
en donde el producto del gen 200 comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 24;
\newpage
(ii)
la secuencia de aminoácido codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23;
(iii)
la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción de cDNA en los clones de E. coli depositados como NRRL Número de Acceso B-21415, NRRL Número de Acceso B-21457, NRRL Número de Acceso B-21395, o ATCC Número de Acceso 61967, en donde dicha inserción de cDNA se hibrida en condiciones severas a una molécula de ácido nucleico que es el complemento de un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23, y en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C;
(iv)
la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas al complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23, en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C; o
(v)
la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas al complemento de la inserción de cDNA de los clones de E. coli depositados como NRRL Número de Acceso B-21415, NRRL Número de Acceso B-21457, NRRL Número de Acceso B-21395, o ATCC Número de Acceso 61967, en donde dicha inserción de cDNA se hibrida en condiciones severas a una molécula de ácido nucleico que es el complemento de un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 23, y en donde dichas condiciones severas comprenden hibridación a DNA fijado a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68°C;
de tal manera que si se detecta en (c) un complejo producto del gen 200/compuesto, se identifica un compuesto de ensayo que se fija a un producto del gen 200.
47. El método de la reivindicación 46, en donde el producto del gen 200 es un producto del gen 200 aislado, un producto del gen 200 expresado en una célula modificada por ingeniería genética para expresar un producto del gen 200, o un producto del gen 200 expresado en una célula que expresa naturalmente un producto del gen 200.
48. El método de la reivindicación 46, en donde el producto del gen 200 y un compuesto de ensayo se co-expresan en una célula durante un tiempo suficiente para formar un complejo.
49. El método de la reivindicación 46, en donde el producto del gen 200 y/o el compuesto de ensayo está inmovilizado sobre una superficie sólida.
50. El método de la reivindicación 46, en donde el producto del gen 200 y/o el compuesto de ensayo está marcado directa o indirectamente.
51. El método de la reivindicación 46, en donde el complejo producto del gen 200/compuesto está inmovilizado sobre una superficie sólida.
52. El método de la reivindicación 48, en donde el compuesto de ensayo es un anticuerpo o un fragmento de fijación de epítope del mismo.
53. El método de la reivindicación 46, en donde el compuesto de ensayo es una molécula orgánica pequeña.
54. El método de la reivindicación 48, en donde el complejo dirige la expresión de una secuencia del gen informador en la célula recombinante, y el complejo se detecta por detección de la expresión de la secuencia del gen informador.
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Families Citing this family (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7479269B2 (en) * 1988-11-23 2009-01-20 Genetics Institute, Llc Methods for selectively enriching TH1 and TH2 cells
US20030059428A1 (en) * 1993-02-26 2003-03-27 Boris Skurkovich Treatment of autoimmune diseases
WO2000073452A2 (en) * 1999-06-02 2000-12-07 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
WO2001019991A1 (en) * 1999-09-15 2001-03-22 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
WO2000015797A2 (en) * 1998-09-17 2000-03-23 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US6066322A (en) * 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
US20030069196A1 (en) * 1995-03-03 2003-04-10 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment and diagnosis of immune disorders
US5633161A (en) 1995-03-29 1997-05-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Murine gene fomy030 coding for tumor progression inhibitor
US6825320B1 (en) 1995-03-29 2004-11-30 Millenium Pharmaceuticals, Inc. FOHY03 polypeptides
US6251597B1 (en) 1996-03-29 2001-06-26 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for detecting fohy030
US6794185B1 (en) 1995-03-29 2004-09-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. fohy030 nucleic acid molecules
WO1996039442A1 (en) * 1995-06-06 1996-12-12 Human Genome Sciences, Inc. G-protein receptor htnad29
US20020106741A1 (en) * 1995-06-06 2002-08-08 Human Genome Sciences, Inc. G protein receptor HTNAD29
US6312909B1 (en) 1996-03-29 2001-11-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the diagnosis prevention and treatment of tumor progression
ES2258793T5 (es) * 1996-05-24 2010-01-25 Biogen Idec Ma Inc. Moduladores de la regeneracion tisular.
WO1997046677A1 (fr) * 1996-06-05 1997-12-11 Bml, Inc. PROTEINE SPECIFIQUE DU Th2 HUMAIN, GENE (B19) CODANT POUR CETTE PROTEINE, TRANSFORMANT, VECTEUR DE RECOMBINAISON ET ANTICORPS MONOCLONAL S'Y RAPPORTANT
US20030170864A1 (en) * 2000-05-30 2003-09-11 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1346999A3 (en) * 1997-07-16 2003-10-01 Human Genome Sciences Human secreted protein
WO1999010536A1 (en) * 1997-08-22 1999-03-04 Yale University A process to study changes in gene expression in granulocytic cells
US7160985B2 (en) * 1997-10-29 2007-01-09 Genentech, Inc. Pro180 polypeptide
ZA989497B (en) * 1997-10-20 2000-04-19 Roche Diagnostics Gmbh Positive-negative selection in homologous recombination.
US7193057B2 (en) * 1997-10-29 2007-03-20 Genentech, Inc. Antibodies to a polypeptide encoded by a nucleic acid underexpressed in rectal tumor
JPH11190734A (ja) * 1997-12-26 1999-07-13 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd クローン病の検査方法および検査用キット
EP1749534B1 (en) * 1997-12-31 2013-08-21 University Of Iowa Research Foundation Use of parasitic biological agents from for prevention and control of inflammatory bowel disease
US20050202458A1 (en) * 1998-03-31 2005-09-15 Roberts Bruce L. Antigen-specific cells, methods of generating these cells and uses thereof
WO1999057130A1 (en) * 1998-05-05 1999-11-11 Gene Logic, Inc. A process to study changes in gene expression in t lymphocytes
US7319008B2 (en) * 1998-06-02 2008-01-15 Genentech, Inc. Nucleic acid underexpressed in melanoma
US7351543B2 (en) * 1998-06-02 2008-04-01 Genentech, Inc. Antibodies to a polypeptide encoded by a nucleic acid underexpressed in melanoma
US20030105298A1 (en) 1998-06-16 2003-06-05 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030109681A1 (en) * 1998-06-10 2003-06-12 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6218122B1 (en) * 1998-06-19 2001-04-17 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods of monitoring disease states and therapies using gene expression profiles
US7244817B2 (en) * 1998-09-10 2007-07-17 Genentech, Inc. Pro1357 polypeptide
US7244428B2 (en) * 1998-09-10 2007-07-17 Genentech, Inc. PRO1357 antibodies
US7399828B2 (en) * 1998-09-24 2008-07-15 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6569436B1 (en) 1998-10-05 2003-05-27 The Malaghan Institute Of Medical Research Method of using a vaccine
US7402661B2 (en) * 1998-10-06 2008-07-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20070072248A1 (en) * 1998-10-13 2007-03-29 Arena Pharmaceuticals, Inc. Constitutively activated human G protein coupled receptors
US20030229216A1 (en) * 1998-10-13 2003-12-11 Ruoping Chen Constitutively activated human G protein coupled receptors
US20030009013A1 (en) * 1998-12-30 2003-01-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2362427A1 (en) * 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US7507404B2 (en) * 1999-03-08 2009-03-24 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2003521239A (ja) * 1999-04-09 2003-07-15 キュラジェン コーポレイション 新規ヒトタンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチド
US20080286821A1 (en) * 1999-05-14 2008-11-20 Eaton Dan L Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU3632600A (en) * 1999-05-14 2000-12-05 Genentech Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
AU5309600A (en) * 1999-06-02 2000-12-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment and diagnosis of immune disorders
EP1198568B1 (en) * 1999-07-20 2007-07-25 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CA2384055A1 (en) * 1999-08-31 2001-03-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US6323334B1 (en) 1999-09-24 2001-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules encoding a 103 gene product and uses therefor
US6271002B1 (en) * 1999-10-04 2001-08-07 Rosetta Inpharmatics, Inc. RNA amplification method
CA2390786A1 (en) * 1999-11-30 2001-06-07 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US7300758B2 (en) * 1999-12-09 2007-11-27 Genetech, Inc. Nucleic acid underexpressed in esophageal tumor
US7423127B2 (en) 1999-12-09 2008-09-09 Genentech, Inc. Antibodies to a polypeptide encoded by a nucleic acid overexpressed in melanoma
US7288384B2 (en) * 1999-12-09 2007-10-30 Genentech, Inc. Antibodies to polypeptides encoded by a nucleic acid underexpressed in esophageal tumor
US20060160186A1 (en) * 1999-12-09 2006-07-20 Eaton Dan L Nucleic acid underexpressed in stomach tumor and lung tumor
JP3460673B2 (ja) * 2000-02-04 2003-10-27 浜松ホトニクス株式会社 特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法
AU2001251612A1 (en) * 2000-04-14 2001-10-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Roles of jak/stat family members in tolerance induction
US7442765B2 (en) * 2000-08-24 2008-10-28 Genentech, Inc. Secreted transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2423879A1 (en) * 2000-09-29 2002-04-04 University Of Rochester Method of screening for therapeutics for infectious diseases
US7135278B1 (en) * 2000-09-29 2006-11-14 University Of Rochester Method of screening for therapeutics for infectious diseases
AU2001290316A1 (en) * 2000-10-02 2002-04-15 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Gata-3 expression inhibitor and method of screening the same
EP1334113A4 (en) * 2000-10-20 2007-08-08 Expression Diagnostics Inc EVALUATION OF LEUCOCYTAIRE EXPRESSION LEVEL
AU2002218026A1 (en) 2000-11-09 2002-05-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Cardiovascular disease diagnostic and therapeutic targets
AU2002241520A1 (en) * 2000-11-28 2003-03-03 University Of Cincinnati Blood assessment of injury
IL140537A0 (en) * 2000-12-25 2002-02-10 Hadasit Med Res Service Educated nk t cells and their uses in the treatment of immune-related disorders
WO2002066979A1 (en) * 2001-02-22 2002-08-29 Takara Bio Inc. Method of detecting antigen causative of bronchial asthma
CN101979095A (zh) 2001-05-02 2011-02-23 普渡研究基金会 巨噬细胞介导的疾病的治疗和诊断
WO2002094318A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 University Of Southern California Vector for targeted delivery to cells
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7026121B1 (en) 2001-06-08 2006-04-11 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US6905827B2 (en) * 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
US7553939B2 (en) * 2001-06-29 2009-06-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes and methods of use thereof
US8709412B2 (en) 2001-06-29 2014-04-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modulation of TIM receptor activity in combination with cytoreductive therapy
US7838220B2 (en) * 2001-06-29 2010-11-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes associated with immune disease
US20030129613A1 (en) * 2001-07-05 2003-07-10 Fernandes Elma R. Novel human proteins and polynucleotides encoding them
US7068603B2 (en) * 2001-07-06 2006-06-27 Juniper Networks, Inc. Cross-bar switch
JP2003076656A (ja) * 2001-09-05 2003-03-14 Sony Corp 情報処理システム、情報処理装置および方法、記録媒体、並びにプログラム
WO2003023056A2 (en) * 2001-09-12 2003-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Specific markers for multiple sclerosis
AU2013200694B2 (en) * 2002-01-30 2016-03-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods related to TIM-3, a TH1-specific cell surface molecule
US7470428B2 (en) 2002-01-30 2008-12-30 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods related to TIM-3, a Th1-specific cell surface molecule
US20040043003A1 (en) * 2002-01-31 2004-03-04 Wei Chen Clinical grade vectors based on natural microflora for use in delivering therapeutic compositions
US20040009937A1 (en) * 2002-01-31 2004-01-15 Wei Chen Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the respiratory system
US20050075298A1 (en) * 2002-01-31 2005-04-07 Wei Chen Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the intestinal mucosa
US8043603B2 (en) 2002-02-07 2011-10-25 Endocyte, Inc. Folate targeted enhanced tumor and folate receptor positive tissue optical imaging technology
US8043602B2 (en) * 2002-02-07 2011-10-25 Endocyte, Inc. Folate targeted enhanced tumor and folate receptor positive tissue optical imaging technology
JP3828443B2 (ja) * 2002-03-22 2006-10-04 株式会社東芝 赤外線撮像装置及びその製造方法
DK3072978T3 (en) 2002-05-09 2018-09-17 Brigham & Womens Hospital Inc : 1L1RL-1 AS A CARDIOVASCULAR DISEASE MARKER
EP2025345A1 (en) * 2002-12-30 2009-02-18 Biogen Idec MA Inc. KIM-1 antagonists and use to modulate immune system
WO2004083366A2 (en) * 2003-03-17 2004-09-30 Riikka Lund Methods utilizing novel target genes related to immune-mediated diseases
WO2004084822A2 (en) * 2003-03-21 2004-10-07 The Regents Of Iniversity Of California Methods for inducing immune tolerance
US7892745B2 (en) 2003-04-24 2011-02-22 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US20070248978A1 (en) * 2006-04-07 2007-10-25 Expression Diagnostics, Inc. Steroid responsive nucleic acid expression and prediction of disease activity
WO2004110250A2 (en) 2003-05-30 2004-12-23 Purdue Research Foundation Diagnostic method for atherosclerosis
WO2005019258A2 (en) * 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
WO2005016954A2 (en) * 2003-08-14 2005-02-24 Boston Medical Center Corporation Immunologic activity measure(s) for t “helper” on-associated conditions
US20050069546A1 (en) * 2003-09-30 2005-03-31 Yaron Ilan Educated NKT cells and their uses in the treatment of immune-related disorders
CA2541006C (en) 2003-10-03 2015-02-17 Brigham And Women's Hospital Tim-3 polypeptides
TW200539890A (en) * 2004-03-12 2005-12-16 Brigham & Womens Hospital Methods of modulating immune responses by modulating tim-1, tim-2 and tim-4 function
KR20070037570A (ko) * 2004-03-24 2007-04-05 텔로스 파마슈티칼스 인코포레이티드 백신에 대한 면역반응을 향상시키는 보강제로서의 조성물및 이의 사용 방법
DE112005001901T5 (de) * 2004-08-04 2007-07-12 Aspira Biosystems Inc., Incline Village Einfangen und entfernen von Biomolekülen aus Körperflüssigkeiten unter Verwendung von partiellen molekularen Abdrücken
WO2006029184A2 (en) * 2004-09-08 2006-03-16 Expression Diagnostics, Inc. Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders
FI20041204A0 (fi) * 2004-09-16 2004-09-16 Riikka Lund Menetelmät immuunivälitteisiin sairauksiin liittyvien uusien kohdegeenien hyödyntämiseksi
RU2007128036A (ru) * 2004-12-23 2009-01-27 Пердью Рисерч Фаундейшн (Us) Способ получения изображения позитронно-эмиссионной томографией
KR101213894B1 (ko) * 2005-03-02 2012-12-20 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｔｈ2 매개성 병태를 치료하기 위한 ｋｉｍ-1 항체
EP1885889A4 (en) * 2005-05-11 2010-01-20 Expression Diagnostics Inc METHOD FOR MONITORING THE OPERATING STATUS OF TRANSPLANTS OVER GENLISTS
EP1904183B1 (en) 2005-07-05 2014-10-15 Purdue Research Foundation Pharmaceutical composition for the treatment of osteoarthritis
WO2007022625A1 (en) * 2005-08-22 2007-03-01 Caprion Pharmaceuticals Inc. Peptide reversion methods and uses thereof
US8795633B2 (en) 2005-09-23 2014-08-05 Purdue Research Foundation Multiphoton in vivo flow cytometry method and device
DK2848938T3 (da) * 2006-04-24 2017-11-13 Critical Care Diagnostics Inc Evaluering af effektiviteten af en behandling hos et individ baseret på st2- niveauer
EP2021799B1 (en) * 2006-04-27 2011-07-20 Critical Care Diagnostics, Inc. Interleukin-33 (il-33) for the diagnosis and prognosis of cardiovascular disease
PT2021796E (pt) * 2006-05-01 2012-04-19 Critical Care Diagnostics Inc Diagnóstico de doença cardiovascular
ES2723957T3 (es) * 2006-05-02 2019-09-04 Critical Care Diagnostics Inc Procedimiento de selección de un tratamiento basado en el diagnóstico diferencial entre enfermedad pulmonar y cardiovascular
US8147817B2 (en) * 2006-05-04 2012-04-03 The Brigham And Women's Hospital, Inc. IL-33 in the treatment and diagnosis of diseases and disorders
EP2035452B1 (en) * 2006-06-22 2012-04-25 Novo Nordisk A/S Soluble heterodimeric receptors and uses thereof
WO2008021431A2 (en) * 2006-08-14 2008-02-21 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders
JP2010509570A (ja) 2006-11-03 2010-03-25 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション エクスビボフローサイトメトリーの方法および装置
EP2102367A2 (en) * 2006-11-09 2009-09-23 XDX, Inc. Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus
US8586595B2 (en) * 2007-02-07 2013-11-19 Purdue Research Foundation Positron emission tomography imaging method
WO2008101354A1 (en) * 2007-02-22 2008-08-28 Merck Frosst Canada Ltd Gpr65 as a therapeutic target in allergic airway inflammation
WO2008148001A2 (en) * 2007-05-25 2008-12-04 Purdue Research Foundation Method of imaging localized infections
JP5297389B2 (ja) * 2007-12-21 2013-09-25 国立大学法人富山大学 アレルギー性疾患のバイオマーカーおよびその利用
JP5526122B2 (ja) 2008-04-18 2014-06-18 クリティカル ケア ダイアグノスティクス インコーポレイテッド 主要有害心イベントのリスクを予測する方法
WO2009132928A2 (en) * 2008-05-02 2009-11-05 Siemens Healthcare Diagnostics Gmbh Molecular markers for cancer prognosis
WO2010085665A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Cedars-Sinai Medical Center Targeted delivery system
JP5748653B2 (ja) 2009-04-10 2015-07-15 協和発酵キリン株式会社 抗ｔｉｍ−３抗体を用いた血液腫瘍治療法
EP2272977A1 (en) * 2009-07-08 2011-01-12 Universite Libre De Bruxelles Diagnostic method and kit for the detection of a lymphocytic variant of hypereosinophilic syndrome
AU2011262758B8 (en) 2010-06-11 2014-09-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-tim-3 antibody
US8728742B2 (en) 2011-03-17 2014-05-20 Critical Care Diagnostics, Inc. Methods predicting risk of an adverse clinical outcome
AR091069A1 (es) 2012-05-18 2014-12-30 Amgen Inc Proteinas de union a antigeno dirigidas contra el receptor st2
US10036009B2 (en) 2012-08-03 2018-07-31 Cedars-Sinai Medical Center Isolating traffic-enhancing mutants of drug delivery protein
JP6450679B2 (ja) 2012-08-21 2019-01-09 クリティカル ケア ダイアグノスティクス インコーポレイテッド マルチマーカーリスク層別化
WO2015048312A1 (en) 2013-09-26 2015-04-02 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
PE20170255A1 (es) 2014-01-24 2017-03-22 Dana Farber Cancer Inst Inc Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-1 y usos de las mismas
HUE045065T2 (hu) 2014-01-31 2019-12-30 Novartis Ag TIM-3 antitest molekulák és felhasználásaik
KR102442436B1 (ko) 2014-03-14 2022-09-15 노파르티스 아게 Lag-3에 대한 항체 분자 및 그의 용도
KR20170060042A (ko) 2014-09-13 2017-05-31 노파르티스 아게 Alk 억제제의 조합 요법
JP7231326B2 (ja) 2014-11-10 2023-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｉｌ－３３媒介性障害のための治療及び診断方法
CR20170240A (es) 2014-11-10 2018-04-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-interleucina-33 y sus usos
TW201713332A (zh) 2015-07-14 2017-04-16 協和醱酵麒麟有限公司 包含與抗體組合投予之ｉｄｏ抑制物之腫瘤治療劑
HRP20211058T8 (hr) 2015-07-29 2021-11-26 Novartis Ag Kombinirane terapije koje sadrže molekule antitijela protiv lag-3
WO2017055404A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
EP3464360B1 (en) 2016-05-27 2025-11-12 Agenus Inc. Anti-tim-3 antibodies and methods of use thereof
CN109757103B (zh) 2016-07-14 2024-01-02 百时美施贵宝公司 针对tim3的抗体及其用途
EP3367098A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-29 CeMM - Forschungszentrum für Molekulare Medizin GmbH Methods for determining interaction between biological cells
MY201482A (en) 2017-04-03 2024-02-26 Hoffmann La Roche Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
EP4516809A3 (en) 2017-04-05 2025-09-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
PE20230252A1 (es) 2020-03-13 2023-02-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-interleucina-33 y sus usos de estos
CN116355983A (zh) * 2023-02-22 2023-06-30 广州普锐生物科技有限公司 用于评估受试者免疫年龄的方法、组合物和系统

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) * 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
CA2003455C (en) * 1988-11-23 2000-02-22 Craig B. Thompson Immunotherapy involving cd28 stimulation
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5344755A (en) * 1990-04-21 1994-09-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for detecting immune system dysfunction in asymptomatic, HIV-scropositive individuals
US5601815A (en) * 1992-08-21 1997-02-11 Schering Corp IL-4 and IL-10 to downregulate delayed-type hypersensitivity and cytokine expresion by T-cells
US5576191A (en) * 1994-06-17 1996-11-19 Immunex Corporation Cytokine that binds ST2
US5576423A (en) * 1994-12-02 1996-11-19 Schering Corporation Antibodies to the slam protein expressed on activated T cells
US6066322A (en) * 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders

Also Published As

Publication number Publication date
EP0813538B1 (en) 2006-06-07
US6204371B1 (en) 2001-03-20
US6288218B1 (en) 2001-09-11
AU718245B2 (en) 2000-04-13
US6414117B1 (en) 2002-07-02
EP1757621A3 (en) 2008-02-13
US6084083A (en) 2000-07-04
US5721351A (en) 1998-02-24
WO1996027603A1 (en) 1996-09-12
AU5178396A (en) 1996-09-23
EP0813538A1 (en) 1997-12-29
US20030158399A1 (en) 2003-08-21
DE69636216T2 (de) 2007-04-19
EP1757621A2 (en) 2007-02-28
US6562343B1 (en) 2003-05-13
EP0813538A4 (en) 2001-10-31
JPH11501807A (ja) 1999-02-16
CA2214589A1 (en) 1996-09-12
EP1757621B1 (en) 2011-09-07
US6066498A (en) 2000-05-23
US6066322A (en) 2000-05-23
US7172750B2 (en) 2007-02-06
ATE328891T1 (de) 2006-06-15
DE69636216D1 (de) 2006-07-20
US6156887A (en) 2000-12-05

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