ES2264809T3 - Proteinas de fusion para el transporte intracelular e intercelular y sus usos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A POLIPEPTIDOS ACOPLADOS Y POLIPEPTIDOS DE FUSION PARA EL TRANSPORTE INTRACELULAR, Y A SU PREPARACION Y UTILIZACION. DICHOS POLIPEPTIDOS CONTIENEN (I) UNA SECUENCIA AMINOACIDA CON LA FUNCION DE TRANSPORTE DE LA PROTEINA DEL VIRUS DEL HERPES VP22 (O UNA HOMOLOGA, P.EJ. PROCEDENTE DE VZV, BHV O MDV) Y (II) OTRA SECUENCIA PROTEINICA SELECCIONADA A PARTIR DE (A) PROTEINAS DE CONTROL DEL CICLO CELULAR; (B) PROTEINAS SUICIDAS; (C) SECUENCIAS ANTIGENICAS O PROTEINAS ANTIGENICAS PROCEDENTES DE ANTIGENOS MICROBIANOS Y VIRALES Y ANTIGENOS TUMORALES; (D) PROTEINAS INMUNOMODULADORAS; Y (E) PROTEINAS TERAPEUTICAS. LAS PROTEINAS ACOPLADAS SE PUEDEN UTILIZAR PARA EL SUMINISTRO INTRACELULAR DE SECUENCIAS PROTEINICAS (II), PARA EJERCER LA FUNCION EFECTORA CORRESPONDIENTE EN LA CELULA DIANA, Y LOS POLIPEPTIDOS DE FUSION SE PUEDEN EXPRESAR A PARTIR DE LOS POLINUCLEOTIDOS CORRESPONDIENTES, VECTORES Y CELULAS HUESPED.

Description

Proteínas de fusión para el transporte intracelular e intercelular y sus usos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a mejoras, modificaciones y avances en relación a las proteínas de transporte, el transporte intracelular y sus aplicaciones. En las realizaciones particulares, la invención se refiere a las proteínas de fusión que comprenden las proteínas de transporte que comprenden secuencias de VP22 del virus herpes o de homólogos o fragmentos de los mismos conjuntamente con secuencias de otras proteínas; y a procedimientos para su preparación y utilización. En las realizaciones particulares, la invención se refiere a proteínas de fusión para el control del ciclo celular, y a materiales y procedimientos para su preparación y utilización. En los ejemplos particulares, la invención se refiere a proteínas de fusión que presentan tanto la funcionalidad p53 de mamífero como la funcionalidad VP22 del virus herpes. Otros aspectos de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención y técnica anterior

Es relevante con respecto a la presente solicitud la solicitud de patente internacional anterior de los presentes inventores nº WO 97/05265 (de O'Hare y Elliott) (publicada después de la fecha de prioridad reivindicada en la presente solicitud) que se refiere a la proteína VP22 y a sus propiedades y usos. De manera similar, el artículo de los inventores (Elliott y O'Hare, en Cell 88:223-233, 1997) se refiere al tráfico intercelular y a la administración de proteínas por parte de una proteína estructural del virus herpes.

Los inventores han demostrado que la proteína VP22 del virión HSV-1 posee un mecanismo no habitual de tráfico intercelular, un efecto descrito particularmente en el documento nº WO 97/05265. VP22 es una proteína de 38kDa que en células de mamífero transfectadas expresantes de forma primaria se encuentra situada predominantemente en el citoplasma, donde se asocia con los microtúbulos celulares (ver el dibujo adjunto, fig. 1b). Sin embargo, una propiedad notable de VP22 es su capacidad para extenderse a lo largo de toda una monocapa de células no expresantes. VP22 se transporta desde el citoplasma de una célula expresante hasta células vecinas, donde se acumula en el núcleo (fig. 1b). El mecanismo de este transporte todavía no se entiende por completo, pero se ha demostrado que es una ruta independiente del Golgi y puede utilizar el citoesqueleto de actina. Se han atribuido propiedades de tráfico intercelular a la proteína Tat de HIV-1 (Ensoli et al., 1993; Fawell et al., 1994) y a un número reducido de otras proteínas no víricas (Jackson et al., 1992), pero ninguna parece demostrar este fenómeno tan acusadamente como VP22. Una propiedad importante adicional de VP22 es que, cuando se aplica exógenamente al medio de una monocapa de células no transfectadas, puede ser incorporada por aquellas células no transfectadas, donde se acumula en el núcleo celular.

La técnica anterior incluye de manera general una diversidad de antígenos, proteínas inmunomoduladoras, proteínas que son condicionalmente citotóxicas o letales tras la administración (en una célula que las contiene) de un fármaco o compuesto activador correspondiente, proteínas para el control del ciclo celular, y otras proteínas diagnósticas y terapéuticas, especialmente en las formas de proteína y de secuencias de polinucleótidos que permiten la manipulación genética mediante técnicas estándar. Se proporcionan posteriormente referencias a algunos ejemplos de estos materiales.

Por ejemplo, entre las proteínas de control del ciclo celular, se conoce la proteína p53 como supresor tumoral. La proteína p53 es una fosfoproteína nuclear de 53 kDa (fig. 1C). La proteína p53 de tipo salvaje y la mutante se han expresado por medio de virus vaccinia recombinantes (Ronen et al., Nucleic Acids Research 20:3435-3441, 1992). La proteína p53 funciona regulando la progresión del ciclo celular y bajo condiciones de daño al ADN a través de un complejo mecanismo de traducción de señales puede inducir la detención del ciclo celular o la apoptosis (Levine 1997). La no síntesis de p53, o más comúnmente la síntesis de una forma mutada de la proteína, puede dar lugar a una proliferación celular descontrolada y a la formación de tumores. Varios grupos han demostrado que la adición exógena de p53 de tipo salvaje funcional puede inducir la detención del ciclo celular y/o la apoptosis, dando lugar a la regresión tumoral, con ejemplos que incluyen los carcinomas cervicales (Hamada et al., 1996) y los xenoinjertos de cáncer de mama (Nielsen et al., 1997). Se han utilizado varios sistemas de administración de p53 in vivo e in vitro, tales como la inyección intravenosa de un complejo de p53:liposoma (Kumar et al., 1997), la transfección directa (Zheng et al., 1996) y la transferencia mediada por adenovirus (Hamada et al., 1996; Sandig et al., 1997), aunque la administración de proteína funcional en un porcentaje suficientemente elevado de células supervivientes sigue resultando difícil.

También son conocidos a partir de la patente US nº 5.484.710 (La Jolla: J.C. Reed et al.) elementos reguladores ligados a genes implicados en la muerte celular, regulados por la proteína p53 supresora tumoral, y proteínas adicionales y sus análogos para el control del ciclo celular.

Se da a conocer una versión de la proteína VP22 etiquetada con un epítopo de 10 aminoácidos del gen UL83 de HCHV (que permite el reconocimiento por un anticuerpo monoclonal) en J. Leslie et al., Virology 220:60-68, 1996.

Sigue resultando deseable proporcionar constructos particulares de administración celular adicionales para proteínas útiles.

Características y descripción de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan proteínas acopladas que comprenden secuencias proteicas de transporte que comprenden secuencias de VP22 de virus herpes o de homólogos o fragmentos del mismo, conjuntamente con secuencias de otras proteínas seleccionadas de entre: (a) proteínas para el control del ciclo celular; (b) proteínas que son condicionalmente citotóxicas o letales tras la administración (para una célula que las contiene) de un fármaco, profármaco o compuesto activador correspondiente (descrito de otra manera en la presente memoria como proteínas suicidas); (c) secuencias antigénicas o proteínas antigénicas (por ejemplo de longitud superior a 12 residuos de aminoácidos) procedentes de antígenos microbianos y víricos y de antígenos tumorales; (d) proteínas inmunomoduladoras; y (e) proteínas terapéuticas. Posteriormente se indican ejemplos de estos tipos de proteínas. De esta manera, el acoplamiento o la fusión a una secuencia de aminoácidos con la función de transporte de la proteína VP22 puede proporcionar un constructo útil de administración celular para proteínas de los tipos indicados (donde lo admita el contexto, los "productos de acoplamiento" y las expresiones similares incluyen la referencia a proteínas de fusión).

Preferentemente, las proteínas acopladas son proteínas de fusión, que convenientemente pueden expresarse en células huésped adecuadas conocidas. Pueden prepararse y manipularse las secuencias de polinucleótidos correspondientes utilizando elementos conocidos per se y técnicas estándar de ADN recombinante y adaptaciones fácilmente disponibles de las mismas. Sin embargo, los productos químicamente acoplados pueden utilizarse para determinadas aplicaciones si se desea, y pueden prepararse a partir de los componentes proteicos individuales de acuerdo con cualquiera de una diversidad de técnicas de acoplamiento químico conocidas per se.

La proteína VP22 o una subsecuencia funcional de la misma, opcionalmente con una cola de polipéptido adicional para el acoplamiento, puede unirse a otras proteínas o ácidos nucleicos mediante acoplamiento químico de cualquier manera estándar adecuada conocida.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión indicadas en la presente memoria, incluyendo secuencias que corresponden a VP22 y a otra proteína de uno de los tipos indicados anteriormente, y casetes de expresión, plásmidos, vectores y células recombinantes que comprenden los polinucleótidos. Estos pueden formarse y utilizarse en modos análogos o fácilmente adaptables a partir de la técnica estándar de ADN recombinante. De esta manera, los polinucleótidos correspondientes pueden codificar un polipéptido de fusión que comprende una secuencia con la función de transporte de la proteína VP22 de virus herpes y una secuencia con una de las funciones especificadas en la presente memoria. El polinucleótido puede encontrarse comprendido en un marco de lectura abierto operativamente ligado a una secuencia promotora adecuada, y puede, de acuerdo con los ejemplos de la invención, formar parte de un vector de expresión, por ejemplo que comprende el polinucleótido transportado en un plásmido. El vector de expresión puede ser, por ejemplo, un vector virus recombinante o un vector de transfección no vírico. Los vectores pueden, por ejemplo, ser análogos o ejemplos de aquellos vectores indicados o descritos en los documentos nº WO 97/05265, o aquéllos indicados o descritos en los documentos nº WO 92/05263, nº WO 94/21807 o nº WO 96/26267. Para secuencias de nucleótidos capaces de transcribirse y traducirse para producir un polipéptido funcional, la degeneración del código genético da lugar a una serie de secuencias de nucleótidos que codifican el mismo polipéptido. La invención incluye todas estas secuencias.

De esta manera, los productos descritos en la presente memoria pueden utilizarse de acuerdo con la invención como proteínas transportables capaces de ser incorporadas por una población diana de células, por ejemplo, de manera que pueda tener lugar dentro de las células diana que han incorporado el producto, una función efectora correspondiente a la secuencia polipeptídica acoplada a la proteína VP22, de entre los tipos indicados anteriormente. De esta manera, por ejemplo, las células diana pueden presentar epítopos del antígeno tumoral deseado en el caso de que la secuencia polipeptídica sea de un antígeno tumoral seleccionado, o encontrarse sometidas a los efectos de control del ciclo celular en el caso de que la secuencia polipeptídica sea de una proteína de control del ciclo celular, o adquirir cierto grado de susceptibilidad a la eliminación o daño celular tras el tratamiento adicional con un profármaco en el que la secuencia polipeptídica es de una "proteína suicida" correspondiente. Durante la utilización, muchos de los productos indicados en la presente invención pueden expresarse como proteínas de fusión en una primera parte de la población diana de células, exportarse desde la misma, y resultar incorporados por una segunda parte de la población diana de células que no produce directamente la proteína. También dentro de la invención se encuentran las células huésped de mamífero y células microbianas que comprenden dichos vectores u otros polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión, y su producción y utilización.

Un polipéptido de fusión tal como se describe en la presente memoria puede transportarse hasta una población diana de células mediante la introducción de un polinucleótido u otro vector que codifica el polipéptido de fusión en una primera parte de la población diana de células, por ejemplo, mediante transfección o microinyección; mediante la expresión del polinucleótido codificante para producir el polipéptido de fusión, provocando de esta manera que sea exportado de dicha primera parte de dicha población diana, y que resulte incorporado por una segunda parte de la población diana de células que no produce directamente el polipéptido de fusión.

Los productos de acoplamiento (incluyendo los productos acoplados químicamente) también pueden ser transportados a una población diana de células mediante la exposición directa de las células a una preparación de los productos de acoplamiento, causando de esta manera que las células diana los incorpore.

En el presente documento, "VP22" se refiere a la proteína VP22 del HSV, por ejemplo de HSV1, y los fragmentos y homólogos activos en transporte de la misma, incluyendo los homólogos activos en transporte de otros virus herpes, incluyendo el virus varicela zóster (VZV), el virus herpes equino (EHV), y el virus herpes bovino (BHV); las proteínas modificadas y mutantes, y los polipéptidos de fusión y productos de acoplamiento con homología entre sí, y con una función de transporte correspondiente a una función de transporte de la proteína VP22 de HSV1; y en este contexto también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los productos anteriormente indicados, sea en la forma de ADN o ARN desnudo, o de un vector, o de secuencias de ácidos nucleicos más grandes, incluyendo dichas secuencias como subsecuencias.

Entre las subsecuencias de la proteína VP22 de virus herpes con actividad de transporte, los presentes inventores han descubierto que, por ejemplo, la actividad de transporte se encuentra presente en los polipéptidos correspondientes a los aminoácidos 60 a 301 y 159 a 301 de la secuencia completa de VP22 de HSV1 (1-301). Para la secuencia, ver, por ejemplo, la figura 4 en WO 97/05265. Un polipéptido consistente en los aminoácidos 175 a 301 de la secuencia de VP22 presenta una actividad de transporte marcadamente reducida, y resulta menos preferente en relación a la presente invención. Por consiguiente, la presente invención se refiere en un aspecto a proteínas acopladas y de fusión que comprenden una subsecuencia de VP22 que contiene una secuencia que se inicia preferentemente desde aproximadamente el aminoácido 159 (o antes, hacia el extremo N-terminal, de la secuencia nativa de VP22), hasta aproximadamente el aminoácido 301, y que presenta (respecto a la secuencia completa de VP22) por lo menos una deleción de por lo menos parte de la secuencia de VP22 que puede extenderse, por ejemplo, desde el extremo N-terminal hasta el punto de inicio indicado, por ejemplo, una deleción de toda o parte de la secuencia entre aproximadamente los aminoácidos 1 y 158. (Menos preferentemente, esta deleción puede extenderse adicionalmente en la dirección C-terminal, por ejemplo, hasta aproximadamente el aminoácido 175). Por ejemplo, se proporcionan secuencias parciales en el intervalo entre aproximadamente los aminoácidos 60 a 301 y aproximadamente los aminoácidos 159 a 301.

Las secuencias de VP22 tal y como se contemplan en la presente memoria se extienden a proteínas homólogas y fragmentos basadas en las secuencias de los homólogos de la proteína VP22 de otros virus herpes, por ejemplo la invención proporciona derivados correspondientes y usos de las secuencias homólogas conocidas de VP22 de VZV (por ejemplo, la totalidad de las partes o las partes homólogas de la secuencia entre los aminoácidos 1 y 302), de MDV (por ejemplo, la totalidad de las partes o las partes homólogas de la secuencia entre los aminoácidos 1-249) y de BHV (por ejemplo la totalidad de las partes o las partes homólogas de la secuencia entre los aminoácidos 1 y 258). Las secuencias de las proteínas correspondientes de HSV2, VZV, BHV y MDV se encuentran disponibles en bases de datos públicas de secuencias de proteína/ácidos nucleicos. De esta manera, por ejemplo, dentro de la base de datos EMBL/Genbank, una secuencia de VP22 de HSV2 se encuentra disponible como el elemento génico UL49 bajo el nº de acceso Z86099, que contiene el genoma completo de la cepa HG52 de HSV2; el genoma completo de VZV, incluyendo el gen/proteína homólogo, se encuentra disponible bajo los números de acceso X04370, M14891, M16612; la secuencia correspondiente de la proteína de BHV se encuentra disponible como "proteína del tegumento del virión del virus herpes bovino 1" bajo el número de acceso U21137; y la secuencia correspondiente de MDV se encuentra disponible como elemento génico UL49 bajo el número de acceso L10283 para "genes de secuencia homóloga del virus herpes gallid de tipo 1". En estas proteínas, especialmente aquéllas de HSV2 y de VZV, pueden llevarse a cabo las deleciones correspondientes, por ejemplo de secuencias homólogas respecto a los aminoácidos 1 a 159 de VP22 de HSV1. Las homologías entre ellas resultan fácilmente accesibles mediante la utilización de algoritmos y programas estándar, por ejemplo aquéllos indicados en el documento nº WO 95/12673, página 9.

Además, las proteínas VP22 quiméricas y las secuencias de proteína también resultan útiles dentro del contexto de la presente invención, por ejemplo, una secuencia proteica de VP22 de HSV1 en la que parte de la misma se ha sustituido por una secuencia homóloga del homólogo de VP22 correspondiente a otro virus herpes. Por ejemplo, en la secuencia del polipéptido 159 a 301 de VP22 de HSV1, las secuencias C-terminal pueden sustituirse de la VP22 de HSV2 o del homólogo de VP22 de BHV.

Se ha descubierto que la deleción de la secuencia C-terminal de 34 aminoácidos de la VP22 de HSV1 elimina la actividad de transporte; de esta manera, esta región de secuencia contiene elementos esenciales para la actividad de transporte. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporcionan polipéptidos acoplados y de fusión que comprenden la secuencia C-terminal de 34 aminoácidos de VP22 o una variante de la misma, conjuntamente con una secuencia de otra proteína seleccionada de entre: (a) proteínas para el control del ciclo celular; (b) proteínas que son condicionalmente citotóxicas o letales tras la administración (a una célula que las contiene) de un fármaco o compuesto activador correspondiente; (c) las secuencias antigénicas o proteínas antigénicas (por ejemplo, de longitud superior a 12 residuos de aminoácidos) de antígenos microbianos y víricos y antígenos tumorales; (d) proteínas inmunomoduladoras; y (e) proteínas terapéuticas. Éstas se proporcionan para su utilización, por ejemplo, mediante la administración en forma de proteínas a células que las incorporan. También se proporcionan los productos acoplados de fragmentos terminales modificados que presentan por lo menos una mutación por inserción o por deleción respecto a la secuencia C-terminal de 34 aminoácidos de la VP22 de HSV1.

También se ha descubierto que las secuencias necesarias para la actividad de transporte contienen una o una pluralidad de motivos de secuencia de aminoácidos o de sus homólogos de la secuencia C-terminal de la VP22 de HSV1 o de otros virus herpes, que pueden seleccionarse de entre RSASR, RTASR, RSRAR, RTRAR, ATATR, y en los que el tercer o cuarto residuo A puede duplicarse, por ejemplo tal como en RSAASR. También se proporcionan polipéptidos correspondientes de fusión con proteínas de los tipos indicados en la presente invención.

Además de sus usos, tales como los indicados en otras partes de la presente invención, los polipéptidos acoplados y de fusión también pueden utilizarse para cultivar anticuerpos que pueden utilizarse de una manera conocida per se en ensayos de unión específica de diagnóstico y de seguimiento, por ejemplo para el seguimiento de la localización intracelular de las proteínas acopladas o de fusión mismas o de sus componentes.

("VP22" en la presente memoria no pretende incluir la proteína VP22 no modificada natural o el gen correspondiente en su asociación natural y no modificada con el virus herpes en sus diversos estados naturales del ciclo vital, por ejemplo en asociación con virus herpes que no ha sido sometido a alteración genómica. Sin embargo, "VP22" sí se refiere, por ejemplo, a la proteína o gen correspondientes de un virus que por ejemplo ha sido alterado con respecto a su gen o función UL49/VP22, o en el que se ha insertado en su genoma un gen de VP22 adicional y/o
híbrido).

Los productos de acoplamiento o proteínas de fusión basados en VP22 pueden presentar un abanico de tamaños moleculares. Los productos pueden ser, en la práctica, de hasta aproximadamente 70 kDa o más, por ejemplo de 90 kDa o de 100 kDa o más con respecto al tamaño de la proteína a acoplar o a fusionar con VP22. Entre las realizaciones de la invención se incluyen ejemplos en los que el péptido de fusión presenta una longitud, por ejemplo, de por lo menos 13 residuos aminoácidos, o de más de aproximadamente 12 residuos aminoácidos de longitud, por ejemplo diferente de un péptido epítopo antigénico de 12 residuos. Las proteínas a fusionar en ocasiones pueden presentar más de aproximadamente 27 ó 32 kDa, por ejemplo pueden ser de un tamaño diferente a 27 kDa. Por ejemplo, una de las proteínas que pueden acoplarse de esta manera, p53, ella misma presenta un tamaño de aproximadamente 53 kDa. El polipéptido acoplado o proteína de fusión, incluyendo el componente de VP22, puede presentar un tamaño de hasta aproximadamente 120 kDa, por ejemplo de hasta aproximadamente 80 ó 100 kDa.

En ocasiones resulta preferente que la secuencia de VP22 se fusione en su extremo N-terminal con la secuencia de la otra proteína seleccionada de uno de los tipos indicados en la presente memoria. Las fusiones C-terminales en ocasiones pueden ser correspondientemente menos preferentes.

En los polipéptidos de la invención, las mutaciones de las secuencias de aminoácidos constituyentes (incluyendo aquéllas de las proteínas inmunomoduladoras y otras proteínas indicadas en la presente memoria) pueden incorporarse en los polipéptidos de fusión y en otras proteínas acopladas. Se incluyen en la presente memoria proteínas que presentan secuencias mutadas de manera que siguen siendo homólogas, por ejemplo en secuencia, en función y en características antigénicas o de otra función, con una proteína que presenta la secuencia parental correspondiente. Estas mutaciones preferentemente pueden ser, por ejemplo, mutaciones que implican cambios conservativos de aminoácidos, por ejemplo cambios entre aminoácidos de propiedades moleculares ampliamente similares. Por ejemplo, los intercambios dentro del grupo alifático alanina, valina, leucina, isoleucina pueden considerarse conservativos. En ocasiones, la sustitución de la glicina por uno de estos aminoácidos también puede considerarse conservativa. Los intercambios dentro del grupo alifático de aspartato y glutamato también pueden considerarse conservativos. Los intercambios dentro del grupo amida de asparagina y glutamina también puede considerarse conservativos. Los intercambios dentro del grupo hidroxi de serina y treonina también pueden considerarse conservativos. Los intercambios dentro del grupo aromático de fenilalanina, tirosina y triptófano también pueden considerarse conservativos. Los intercambios dentro del grupo básico de lisina, arginina e histidina también pueden considerarse conservativos. Los intercambios dentro del grupo que contiene azufre de metionina y cisteína también pueden considerarse conservativos. En ocasiones, la sustitución dentro del grupo metionina y leucina también puede considerarse conservativa. Son grupos de sustitución preferentes asparato-glutamato; asparagina-glutamina; valina-leucina-isoleucina; alanina-valina; fenilalanina-tirosina; y lisina-arginina. En otros aspectos, las secuencias mutadas pueden comprender inserciones y/o deleciones. Las secuencias proteicas mutadas pueden encontrarse adicional o alternativamente codificadas por polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones astringentes con la cadena apropiada del polinucleótido de origen natural que codifica la proteína parental, y puede someterse a ensayo para resultados positivos en ensayos funcionales conocidos relevantes para la proteína parental. Las "condiciones astringentes" son dependientes de la secuencia y son diferentes en diferentes circunstancias. Generalmente, las condiciones astringentes pueden seleccionarse para que sean aproximadamente 5ºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo la fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se híbrida con una sonda perfectamente correspondiente. Habitualmente, las condiciones astringentes son aquéllas en las que la concentración salina es de por lo menos aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 60ºC. Debido a que otros factores pueden afectar a la astringencia de la hibridación, incluyendo, entre otros, la composición de bases y el tamaño de las cadenas complementarias, la presencia de solventes orgánicos y el grado de desapareamiento de bases, la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de cualquiera de ellas.

Acoplamiento con las proteínas de control del ciclo celular

En una clase útil de realizaciones de la invención, la VP22 puede acoplarse con proteínas conocidas per se de control del ciclo celular. De esta manera, en un ejemplo de la invención referido al control del ciclo celular, tal como describe particularmente en un ejemplo posterior, VP22 puede acoplarse con la proteína p53. Un propósito y uso de la presente invención puede ser bloquear la progresión del ciclo celular, especialmente de células malignas.

La VP22 también puede acoplarse útilmente con los inhibidores de quinasa dependientes de ciclina, por ejemplo p16, p21 o p27. La progresión del ciclo celular normal requiere estas proteínas; la ausencia de éstas puede desreprimir el ciclo celular, y pueden utilizarse los productos de acoplamiento correspondientes para el tratamiento de las células de cáncer.

Los productos de acoplamiento a VP22 también pueden utilizarse útilmente en la modulación de la apoptosis, por ejemplo para inducir la muerte celular, del tipo apoptosis, mediante la introducción en una célula de un dominio apoptótico de proteína acoplado a VP22, de manera que, por ejemplo la proteína de apoptosis bax, o su péptido identificado conocido inductor de apoptosis; o proteína relacionada conocida bad o bak. En este caso también, el producto de acoplamiento puede aplicarse en la forma de proteína o de ADN que lo codifica. Los productos de acoplamiento a VP22 pueden utilizarse en la forma de VP22 con proteínas conocidas de la familia bcI2, tal como la bcI2 misma, bcl-xL o bclw, para enmascarar o para inhibir la apoptosis en el caso de que se desee, por ejemplo en el tratamiento de la neurodegeneración.

Pueden utilizarse otros productos de acoplamiento a VP22 para inducir la apoptosis, comprendiendo VP22 unido a proteasas similares a ICE. Los productos de unión a VP2 con inhibidores de las proteasas similares a ICE, por ejemplo los pseudosustratos, pueden utilizarse para enmascarar o para superar a los efectos estimulantes de la apoptosis de las proteasas mismas.

De esta manera, de acuerdo con una realización de la invención se proporciona un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos con la función de transporte de la proteína VP22 del virus herpes y una secuencia con la funcionalidad de control del ciclo celular de la proteína p53. El polipéptido de fusión puede incluir, por ejemplo, la secuencia de p53 sustancialmente de longitud completa o la secuencia de VP22 sustancialmente de longitud completa, o ambas.

La fusión con VP22 de esta manera puede utilizarse para la administración de un agente para el control del ciclo celular, tal como p53. Donde la descripción proporcionada en la presente memoria se refiere a p53 y péptidos relacionados, se entenderá que, donde el contexto lo permita, también se contemplan agentes alternativos de control del ciclo celular, tales como, por ejemplo, aquellos análogos de p53 y otras proteínas de control del ciclo celular indicadas y referidas en la presente memoria, tales como, más generalmente, las parejas alternativas de fusión o de acoplamiento a VP22, o cualquiera de los otros tipos indicados en la presente memoria. Una vez expresadas en un subpoblación de células expresantes, esta proteína de fusión puede transportarse mediante el mecanismo de transporte de VP22 desde la célula expresante al interior de una proporción significativa de células circundantes, y entonces el polipéptido foráneo unido puede ejercer su funcionalidad.

Este aspecto de la invención también proporciona los polinucleótidos correspondientes, que codifican un polipéptido de fusión que comprende una secuencia con la función de transporte de la proteína VP22 del virus herpes y una secuencia con la función reguladora del ciclo celular humana/de mamífero de la proteína p53. El polinucleótido puede encontrarse comprendido en un marco de lectura abierta operablemente ligado a una secuencia promotora adecuada.

El polinucleótido puede, de acuerdo con los ejemplos de la invención, formar parte de un vector de expresión, por ejemplo, que comprenda el polinucleótido transportado en un plásmido. El vector de expresión puede ser, por ejemplo, un vector virus o un vector de transfección no vírico. Los vectores pueden ser, por ejemplo, análogos o ejemplos de ellos descritos y referidos en la patente nº WO 97/05265 o Elliot y O'Hare (1997).

La invención también proporciona un procedimiento de inhibición de la división celular, que comprende exponer las células que presentan p53 activa/libre insuficiente para detener su ciclo celular, al contacto con un polipéptido de fusión tal como se describe en la presente memoria.

Entre los procedimientos de la invención se encuentra un procedimiento de inhibición de la división de las células tumorales, que comprende exponer una célula tumoral presente en una masa celular tumoral, comprendiendo la célula tumoral una cantidad insuficiente de p53 activa/libre para detener su ciclo celular, al contacto con un vector tal como se describe en la presente memoria, provocando de esta manera que la célula exprese un polipéptido de fusión tal como se describe en la presente memoria, y exponer otras células de la masa de células tumorales al contacto con el polipéptido de fusión.

Los presentes inventores han demostrado (ver la descripción posteriormente) que VP22-p53 puede ser transportado por muchas células no transfectadas en una monocapa. La proteína de fusión puede ser funcional en la detención del ciclo celular y/o en la inducción de la apoptosis, por ejemplo tanto en las células expresantes primarias y en las células que han recibido VP22 mediante la extensión célula-a-célula. Por ejemplo, la proteína de fusión puede aplicarse a una línea celular de osteosarcoma p53-negativa SAO2-2 (Diller et al., 1990). La p53 funcional expresada en estas células causa la detención del ciclo celular en el límite entre las fases G y S, y finalmente la muerte celular; lo anterior puede someterse a ensayo utilizando microscopía confocal y anticuerpos contra los marcadores específicos del ciclo celular. La función de la proteína de fusión p53 también puede utilizarse y evaluarse en otras líneas celulares tumorigénicas en las que se encuentra presente p53 pero que contienen mutaciones puntuales específicas y bien caracterizadas que conducen a la falta de funcionalidad.

Varios sistemas de vector, tales como la infección retrovírica o adenovírica, o la inyección de complejos proteína-liposoma, pueden adaptarse fácilmente para constituir ejemplos de la presente invención para la administración de proteínas de control del ciclo celular a células y tejidos de sujetos humanos y animales no humanos que deben tratarse. Por ejemplo, en relación al trabajo sobre la proteína p53 sola, se ha demostrado claramente que la adición de proteína p53 de tipo salvaje puede reducir el crecimiento in vivo de las células cancerosas. Resultarán evidentes al lector experto en la materia varias aplicaciones terapéuticas de administración no invasiva de proteínas de acoplamiento de VP22 con proteínas de control del ciclo celular.

Por ejemplo, puede inyectarse ADN desnudo para una fusión VP22-proteína con una proteína efectora tumoral, tal como p53, en un tumor, por ejemplo un tumor sólido, por ejemplo un tumor sólido seleccionado mediante diagnóstico molecular para la falta de p53 funcional.

Pueden utilizarse virus recombinantes, tales como los indicados anteriormente, codificantes y capaces de expresar VP22-p53 y proteínas de fusión de funcionamiento equivalente. Por ejemplo, un adenovirus puede expresar VP22-p53 y puede prepararse para que sea dependiente de un promotor específico tumoral para regular un gen vírico esencial, tal como E1a. Más generalmente, un vector virus recombinante que porta esta fusión puede ser defectivo, no replicante o de replicación restringida, de manera que la replicación dependa de condiciones que predominan en el tejido o célula diana pero que no predominan en las células normales o en las células que no son diana.

En determinados ejemplos de la invención, la proteína con funcionalidad de p53 puede, por ejemplo, comprender variantes o mutantes de p53, por ejemplo aquellas variantes tales como las indicadas en la especificación nº WO 97/04092 (Rhone Poulenc Rorer SA: Bracco, L., Conseiller, E.) ("New p53 variants e.g. with oligomerisation domain replaced by leucine zipper - useful for treating hyper-proliferative disorders, especially cancer and restenosis"), que describe, inter alia, las proteínas variantes siguientes: (a) variantes de la proteína p53 que presentan por lo menos parte del dominio de oligomerización delecionado y sustituido por un dominio de cremallera de leucina; (b) variantes de p53 preferentemente activas en células transformadas, en las que la totalidad o parte de por lo menos un dominio funcional se ha delecionado y sustituido por un dominio heterólogo preferentemente activo en estas células; (c) variantes de p53 con una deleción en la parte C-terminal, desde el residuo 366, seguido de una secuencia de 19 aminoácidos (codificada por un fragmento de 76 pb reproducido en la especificación) que representa la última parte de la parte alternativamente cortada de la p53 murina, y (d) una proteína quimérica que contiene un dominio transactivante, un dominio de unión a ADN, un dominio de localización nuclear y un dominio de oligomerización, en el que el dominio de unión a ADN y el dominio de localización nuclear comprenden los aminoácidos 75 a 325 o 75 a 336 de la p53 humana de tipo
salvaje.

En ejemplos adicionales de la invención, los vectores y proteínas de fusión pueden codificar o comprender polipéptidos p53 variantes que comprenden secuencias quiméricas de p53, incluyendo dominios de tetramerización heterólogos, que pueden adaptarse a partir de aquéllas descritas en las especificaciones nº WO 96/16989 y nº US 5.573.925 (Wistar Institute of Anatomy & Biology: Halazonetis TD) y utilizarse de maneras correspondientes. En estos ejemplos de la invención, las secuencias de p53 pueden comprender proteína p53 quimérica que presenta una secuencia nativa de p53 y un dominio de tetramerización heterólogo que forma homotetrámeros, de manera que la proteína quimérica resultante no puede heterooligomerizarse con p53 mutante de tipo salvaje o derivada tumoral y que no interfiere con la funcionalidad supresora tumoral de la p53 nativa.

Las proteínas de fusión y los vectores de acuerdo con ejemplos adicionales de la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento de la enfermedad hiperproliferativa, especialmente del cáncer y de las enfermedades autoinmunológicas, por ejemplo la restenosis, y particularmente para el tratamiento de células que presentan una mutación de p53 y que también expresan proteína MDM2 a nivel elevado, incluyendo por ejemplo las células de cáncer relacionadas con HPV. También pueden utilizarse para eliminar células hiperproliferantes in vitro. Estas variantes pueden implicar supresores tumorales activos y estables, y agentes inductores de apoptosis, y se propone que se encuentran activos cuando la proteína de tipo salvaje no lo está, es decir, cuando no se encuentra inactivada por mutantes dominantes negativos u oncogénicos ni por otras proteínas celulares (debido a que el dominio de cremallera de leucina evita la formación de oligómeros mixtos inactivos).

Asimismo, pueden utilizarse las proteínas de fusión y vectores de acuerdo con ejemplos adicionales de la presente invención, en medicamentos para suprimir el fenotipo neoplásico de las células cancerosas que carecen de la proteína p53 de tipo salvaje, de maneras, por ejemplo, correspondientes a la utilización de gen de p35 de tipo salvaje, tal como se describe en la especificación nº EP 0 710 722 (Univ. California: Chen, P., Lee, W.), que describe genes y vectores retrovíricos para los fines inter alia de suprimir el fenotipo neoplásico en las células de cáncer, tales como las células de osteosarcoma, las células de carcinoma pulmonar, las células de carcinoma de colon, las células de linfoma, las células de leucemia, las células del sarcoma del tejido blando o las células de carcinoma de mama, vejiga o próstata.

Asimismo, las proteínas de fusión y vectores también pueden utilizarse de acuerdo con ejemplos adicionales de la presente invención, por ejemplo de maneras correspondientes a aquéllas descritas en la especificación nº WO 95/12660 (Univ. Texas System: Roth, J.A. et al.), que describe adenovirus recombinantes que portan un constructo de vector adenovirus que comprende una región de expresión que codifica p53, y que es capaz de expresar la p53 en, por ejemplo, células malignas humanas, y que de utilizarse inter alia para la administración regional del gen supresor tumoral de p53, hasta las células enfermas, para restaurar la función de p53 de las células deficientes en p53, o para suprimir el crecimiento tumoral en células que presentan p53 anormal, y de esta manera tratar los tumores malignos humanos, tales como el cáncer de mama y de pulmón. Estos adenovirus también pueden utilizarse para análisis in vitro y estudios de mutagénesis de diversos genes de p53.

Asimismo, pueden utilizarse proteínas de fusión y vectores de acuerdo con ejemplos adicionales de la presente invención, como inhibidores de la replicación del virus de la hepatitis B (HBV), de maneras correspondientes a aquéllas descritas en la patente nº US 5.635.473 y nº WO 96/11017 (Mogam Biotechnology Research Institute: H-S, Lee et al.).

Los ensayos de cribado para identificar agentes que incrementan con efectividad el nivel de muerte celular, y que pueden actuar como análogos de p53 y pueden inducir la apoptosis en las células, se describen, por ejemplo, en la patente nº US 5.484.710 (La Jolla: J.C., Reed et al.), particularmente en el ejemplo IV del mismo. También se contemplan como realizaciones alternativas de la invención las proteínas de fusión y materiales relacionados que incorporan la funcionalidad de VP22 y la funcionalidad de la proteína Bax. En relación a la proteína Bax, se hace referencia a la patente nº US 5.484.710 y las referencias citadas en la misma.

Acoplamiento con "proteína suicida"

En una clase adicional de realizaciones de la invención, puede acoplarse o fusionarse útilmente VP22 o una subsecuencia funcional de la misma con, por ejemplo, una "proteína suicida", tal como, por ejemplo, la timidina quinasa conocida, la nitrorreductasa, u otro enzima o fragmento funcional del mismo, según resulte aplicable para un propósito similar. El producto acoplante puede penetrar en las células, que deben tratarse con (en el caso de la timidina quinasa) ganciclovir u otro fármaco (profármaco) de la misma familia, de manera que el profármaco se convierta en las células que contienen el producto de "gen suicida" en una forma activa para eliminar las células.

Se proporcionan ejemplos adecuados de genes suicidas conocidos útiles y los profármacos correspondientes, a los que se hace referencia por ejemplo en la patente nº WO 94/13824 (Univ. Curie Paris: M. Caruso et al.), en la patente nº WO 95/05835 (Baylor College: S. Chen et al.), y en la patente nº WO 93/08288 (Cancer Research Campaign Technology: G., Anzelark et al.) y la patente nº WO 93/01281 (US DHHS: R.M. Blaese et al.) e incluyen, aparte de la timidina quinasa (gen suicida) y ganciclovir/aciclovir (profármaco), nitrorreductasa (gen suicida) y CB1954 (profármaco) y citosina desaminasa (gen suicida) y 5-fluorocitosina (profármaco). Ésta y otras proteínas suicidas y los (pro)fármacos correspondientes también se revisan y se citan sus usos en "Genetic Prodrug Activation Therapy", A. Rigg y K. Sikora, Molecular Medicine Today, agosto de 1997, páginas 359-366.

En el caso de que la fusión VP22-TK se presente en la forma de ADN de cualquiera de las maneras descritas en la patente nº WO 97/05265 o en Elliott y O'Hare (1997), una célula diana puede transfectarse con el gen codificante de esta fusión, y la fusión expresada seguidamente puede translocarse fuera de la célula en la que se expresó y hacia el interior de las células circundantes, produciendo un efecto de eliminación de estas células al tratarlas con ganciclovir, etc., un efecto que es diferente de, y puede ser adicional a, efectos espectador. Alternativamente, tal como en otras realizaciones, esta fusión VP22-TK puede aplicarse directamente en forma de proteína.

Acoplamiento a antígenos

En realizaciones adicionales, la invención se refiere, por ejemplo, a proteínas de transporte relacionadas con VP22 o con sus fragmentos activos fusionados en polipéptidos de fusión o de otra manera acoplados con secuencias o proteínas antigénicas (por ejemplo de longitud superior a 12 residuos aminoácidos) seleccionados, por ejemplo, de entre cualquiera de los materiales antigénicos u otras proteínas y péptidos indicados posteriormente.

Además de los polipéptidos de fusión y productos de acoplamiento, la invención proporciona híbridos acoplantes que comprenden VP22 acoplado a un ADN que puede comprender, por ejemplo elementos reguladores conocidos adecuados, de manera que puede ser transcrito y traducido, y que contiene un marco de lectura abierto que codifica cualquiera de las proteínas indicadas posteriormente.

Acoplamiento a antígenos: VP22 puede acoplarse útilmente con ejemplos de antígenos microbianos y víricos y de antígenos tumorales, tales como aquellos indicados posteriormente.

El tratamiento con los productos de acoplamiento de VP22 que implica antígenos de patógenos tal como se proporcionan en la presente invención pueden inducir respuestas inmunológicas útiles contra patógenos correspondientes. Son ejemplos de estos antígenos las proteínas del virus del papiloma L1 y L2, las proteínas de VIH gag, pol, env y nef, los antígenos de clamidia (tales como la proteína principal de la membrana externa, MOMP) y las proteínas de choque térmico de Chlamydia.

VP22 también puede acoplarse útilmente con antígenos de micobacterias, tales como antígeno de Mycobacterium tuberculosis.

Alternativamente, el antígeno puede ser un antígeno asociado a tumor, en el que la actividad antitumoral de los CTLs asociados con la eliminación de las células tumorales resulta incrementada. Se ha descubierto que citoquinas específicas, tales como el factor \alpha de necrosis tumoral, el interferón gamma, la interleuquina 2, la interleuquina 4 y la interleuquina 7 resultan particularmente útiles en este aspecto. Los antígenos asociados a tumor y su papel en la inmunobiología de determinados cánceres se comenta, por ejemplo, en P. van der Bruggen et al., Current Opinion in Immunology 4(5):608-612, 1992. Son ejemplos particulares de estos antígenos que se contemplan para la utilización en el contexto de la presente solicitud los antígenos E6 y E7 del papilomavirus humano (especialmente, por ejemplo, de los tipos 6, 11, 16, 18, etc.); las proteínas derivadas del virus de Epstein-Barr, por ejemplo, aquéllas identificadas en las referencias 2 y 25 en P. van der Bruggen et al., citados anteriormente: antígenos de la serie MAGE, tales como los identificados en T. Boon, Adv. Cancer Res. 58:177-210, 1992 y/o MZ2-E y otros antígenos, tales como los identificados en P. van der Bruggen et al., Science 254:1643-1647, 1991; proteínas de melanoma, por ejemplo la tirosina humana, y mucinas, tales como aquéllas identificadas en P.O. Livingston, en Current Opinion in Immunology 4(5):624-629, 1992, por ejemplo MUC1, tal como se identifica en J. Burchell et al., Int. J. Cancer 44:691-696, 1989.

Asimismo, la VP22 puede acoplarse útilmente con proteínas víricas, tales como los antígenos glucoproteicos, por ejemplo del virus herpes, tales como gH o gD o gB del virus del herpes simplex, o g50 del virus de la pseudorrabia, como ejemplo de un antígeno de un patógeno animal, en este caso de un virus animal.

De esta manera, VP22 puede acoplarse útilmente con antígenos conocidos de la técnica anterior de tratamiento de los tumores malignos, incluyendo estudios que subrayan el potencial de vacunación terapéutica contra tumores utilizando material autólogo derivado del propio tumor del paciente. La teoría detrás de este enfoque es que las células tumorales pueden expresar una o más proteínas u otras macromoléculas biológicas que son diferentes de las células sanas normales, y por lo tanto pueden utilizarse para dirigir una respuesta inmunológica para reconocer y destruir las células tumorales.

Estas dianas tumorales pueden encontrarse presentes ubicuamente en tumores de un tipo determinado. Un buen ejemplo de lo anterior es el cáncer cervical, donde la gran mayoridad de tumores expresan las proteínas E6 y E7 del papilomavirus humano. En este caso, la diana tumoral no es una autoproteína, y por lo tanto su potencial como marcador tumoroespecífico único para la inmunoterapia del cáncer no está clara.

La evidencia es creciente de que determinadas autoproteínas también pueden utilizarse como antígenos de diana tumoral. Esto se basa en la observación de que se expresan consistentemente en las células tumorales, pero no en las células sanas normales. Entre los ejemplos de éstas se incluyen la familia MAGE de proteínas. Es previsible que se identifiquen más autoproteínas útiles como dianas tumorales.

Los antígenos asociados a tumor y sus papel en la inmunobiología de determinados cánceres se comenta, por ejemplo, en P. van der Bruggen et al., en: Current Opinion in Immunology 4(5):608-612, 1992. Otros antígenos similares, de la serie MAGE, se identifican en T. Boon, Adv. Cancer Res. 58:177-210, 1992, y se identifican MZ2-E y otros antígenos relacionados con tumores en P. van der Bruggen et al., Science 254:1643-1647, 1991; se indican mucinas asociadas a tumores e P.O. Livingston, en: Current Opinion in Immunology 4(5):624-629, 1992, por ejemplo MUC1, tal como se menciona en J. Burchell et al., Int. J. Cancer 44:691-696, 1989.

Acoplamiento a proteínas inmunomoduladoras

Entre las realizaciones de la invención de utilización en la modulación inmunológica se incluyen, por ejemplo, las que se indican a continuación. VP22 puede acoplarse útilmente con ejemplos de citoquinas o de otros compuestos inmunomoduladores, tal como se indica posteriormente. De esta manera, VP22 puede acoplarse útilmente con proteínas inmunomoduladoras, por ejemplo aquéllas que potencian la respuesta inmunológica, incluyendo la citoquina interleuquina 1, la interleuquina 2 y el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF). Estos productos pueden utilizarse, por ejemplo, de maneras análogas a aquéllas indicadas en, por ejemplo, la patente nº WO 96/26267 o nº WO 97/14808, para alterar, por ejemplo para incrementar, una respuesta inmunológica específica de un tipo celular diana, por ejemplo un tipo de célula tumoral, que se ha expuesto al producto sea in vitro o in vivo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "proteína inmunomoduladora" y términos relacionados incluye una proteína o proteínas que potencian o suprimen una respuesta inmunológica del huésped frente a un virus mutante o proteína codificada por el mismo, o contra un antígeno, tal como un inmunógeno de un patógeno o fuente exógena al virus, o un antígeno asociado a tumor. Las proteínas inmunomoduladoras normalmente no son aquellas proteínas utilizadas en la actualidad como inmunógenos (antígenos) en sí mismos. Una proteína inmunomoduladora puede ser un miembro natural de un sistema inmunológico humano o animal no humano, por ejemplo de un sistema inmunológico de mamífero. Alternativamente, una proteína inmunomoduladora puede ser una proteína codificada por un patógeno, que presenta una capacidad de unión funcional con un constituyente natural de dicho sistema inmunológico.

Alternativamente, una proteína inmunomoduladora puede ser una proteína artificial, por ejemplo un fragmento de una proteína inmunomoduladora natural, o una muteína de dicha proteína o fragmento, o una proteína de fusión que incorpore cualquiera de los mismos. Muchas proteínas inmunomoduladoras, y los materiales genéticos que las codifican, y sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, son conocidas de la literatura en esta materia, y se encuentran disponibles en bases de datos de secuencias genéticas, tales como la base de datos EMBL, y varias se encuentran disponibles comercialmente en la forma de material genético de ingeniería genética para la clonación y otras manipulaciones.

Las proteínas inmunomoduladoras acopladas con VP22 tal como se describen en la presente memoria pueden ser útilmente de, por ejemplo, secuencias nativas a la especie que debe recibir el tratamiento con estos productos de acoplamiento o con ADN, por ejemplo en la forma de virus recombinante, por ejemplo una proteína inmunomoduladora de tipo humano para el tratamiento de un sujeto humano.

Entre los ejemplos de proteínas inmunomoduladoras en este contexto se incluyen las citoquinas, las quimoquinas, componentes del complemento, moléculas de adhesión y accesorias del sistema inmunológico y sus receptores de especificidad humana o animal no humana. Entre los ejemplos útiles se incluyen GM-CSF, IL-2, IL-12, linfotactina, CD40 y CD40L. Entre los ejemplos útiles adicionales se incluyen las interleuquinas, por ejemplo las interleuquinas 1 a 15, los interferones alfa, beta o gamma, el factor de necrosis tumoral, el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), el factor de estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF), las quimoquinas tales como la proteína activadora de neutrófilos (NAP), el factor quimoatrayente y activador de macrófagos (MCAF), RANTES, los péptidos inflamatorios de macrófagos MIP-1a y MIP-1b, componentes del complemento y sus receptores, o una molécula accesoria, tal como B7.1, B7.2, ICAM-1, 2 ó 3 y receptores de citoquina.

OX40 y el ligando de OX40 (OX4OL) (gp34) (ver, por ejemplo, las patentes nº WO 95/12673, nº WO 95/21251 y nº WO 21915) son ejemplos útiles adicionales de proteínas inmunomoduladoras. Las proteínas inmunomoduladoras puede ser, para diversos propósitos, de especificidad humana o animal no humana y pueden representarse para los presentes propósitos, según el caso y según resulte conveniente, por dominios extracelulares y otros fragmentos con la actividad de unión de las proteínas de origen natural, y las muteínas de las mismas, y sus proteínas de fusión con otras secuencias polipeptídicas, por ejemplo con dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina. Donde ser insertan secuencias de nucleótidos codificantes de más de una proteína inmunomoduladora, pueden comprender, por ejemplo, más de una citoquina o una combinación de una o más citoquinas y una o más moléculas accesorias/de adhesión.

La respuesta inmunológica inducida por la utilización de dichos productos de acoplamiento a VP22 o por vectores que los codifican puede incluir respuestas inmunológicas de una diversidad de tipos, por ejemplo una respuesta contra una proteína codificada víricamente, y/o una respuesta contra un antígeno del huésped, siendo una respuesta estimulada por un vector vírico o por la expresión de un gen heterólogo codificado por el mismo, por ejemplo el producto acoplante a VP22. Entre los usos de los vectores víricos mutantes tal como se describen en la presente memoria se encuentra, por ejemplo, proteger un sujeto de una especie susceptible frente a la infección por un virus correspondiente de tipo salvaje cuando se trata el sujeto con el mismo, por ejemplo se infecta con el mismo, o por ejemplo, mediante inmunización directa.

Una proteína inmunomoduladora a acoplar con VP22 puede ser ella misma una proteína híbrida o de fusión que comprende una región polipeptídica que presenta homología con, y funcionalidad de, una proteína inmunomoduladora, ligada a una región polipeptídica que presenta otra homología, y opcionalmente otra funcionalidad. Por ejemplo, la proteína inmunomoduladora puede ser, comprender o corresponder en funcionalidad a la proteína gp34 identificada como pareja de unión de la OX-40 humana (ver W. Godfrey et al., J. Exp. Med. 180(2):757-762, 1994, y referencias citadas en la misma, incluyendo S. Miura et al., Mol. Cell Biol. 11(3):1313-1325, 1991). La versión de esta funcionalidad de proteína que puede codificarse en el genoma vírico mutante puede corresponder a la secuencia misma de la gp34 natural, o a un fragmento de la misma, o a un producto de expresión híbrida, por ejemplo basado en el dominio (de unión) extracelular (C-terminal) de gp34 fusionado a otra proteína, por ejemplo a la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina, tal como la IgG1 humana, por ejemplo con el dominio extracelular de gp34 (una proteína membranal de tipo 2) fusionada en su extremo N-terminal con el extremo C-terminal del dominio constante de inmunoglobulina.

Otras proteínas inmunomoduladoras también pueden transportarse y expresarse en dichas formas derivadas e híbridas, incluyendo las formas mutadas, tal como se indica en la presente invención.

En determinados ejemplos, la proteína inmunomoduladora puede comprender una citoquina, preferentemente un factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), por ejemplo la GM-CSF murina o preferentemente humana.

La GM-CSF murina y humana son ambas conocidas: el gen de la GM-CSF murina modifica un polipéptido de 141 aminoácidos, presentando la glucoproteína segregada madura un peso molecular comprendido entre 14 y 30 kdaltons, dependiendo del grado de glucosilación. La GM-CSF genéricamente es un miembro de la familia de los factores de crecimiento hematopoyéticos y se definió e identificó por primera vez por su capacidad de estimular la formación de colonias in vitro en progenitores hematopoyéticos. GM-CSF es un potente activador de la función de neutrófilos, eosinófilos y macrófagos-monocitos, potenciando la migración, fagocitosis, expresión del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) e iniciando una cascada de moléculas bioactivas que estimula adicionalmente el sistema inmunológico. GM-CSF en la actualidad se está evaluando clínicamente para el tratamiento de la neutropenia secundaria a quimioterapia y como adyuvante en la terapia del cáncer.

La secuencia de nucleótidos heteróloga utilizada puede comprender un gen heterólogo, un fragmento génico o una combinación de genes con la condición de que codifique una proteína inmunomoduladora, tal como se ha definido anteriormente.

De acuerdo con los ejemplos de la invención, pueden utilizarse combinaciones de dos o más proteínas inmunomoduladoras para los propósitos indicados en la presente memoria. En los ejemplos particulares, proporcionados a título ilustrativo únicamente y no limitativos, la combinaciones que implican IL2, GMCSF, linfotactina y/o CD4OL pueden utilizarse en combinaciones entre sí o con otros de las proteínas inmunomoduladoras indicadas anteriormente. Cada una de las otras combinaciones binarias de las proteínas inmunomoduladoras indicadas anteriormente también se proporcionan mediante, y dentro del alcance de, la presente invención.

Otros productos de acoplamiento

En determinadas realizaciones la invención puede resultar útil en aplicaciones de terapia génica: de esta manera, por ejemplo, VP22 también puede acoplarse útilmente con ejemplos de genes utilizados o propuestos para ser utilizados en terapia génica, incluyendo: el gene para la adenosina desaminasa humana (ADA), tal como se indica en, por ejemplo, la patente nº WO 92/10564 (K.W. Culver et al.: U.S. Secretary for Commerce & Cellco Inc.), las patentes nº WO 89/12109 y nº EP 0 420 911 (I.H. Pastan et al.): el gen de la fibrosis quística y las variantes indicadas en la patente nº WO 91/02796 (L-C Tsui et al.: HSC Research y University of Michigan), en la patente nº WO 92/05273 (F.S. Collins y J.M. Wilson: University of Michigan) y en la patente nº WO 94/12649 (R.J. Gregory et al.: Genzyme
Corp.).

Asimismo, la VP22 puede acoplarse útilmente con proteínas reguladoras de la transcripción conocidas, tales como NF-AT, que resulta activada por traslocación en el núcleo e induce la transcripción de las interleuquinas, por ejemplo de IL-1. El acoplamiento con VP22 puede utilizarse en la presente memoria para evitar la retención del producto acoplado en el citoplasma.

La invención también incluye proteínas acopladas y de fusión en las que se proporciona una secuencia línker que permite que la proteína de fusión se divida intracelularmente para permitir la separación de la parte antigénica, tal como la indicada anteriormente, de la parte proteica de transporte. Una secuencia de inducción del corte puede comprender, por ejemplo, la subsecuencia de aminoácidos RVCSNPPCETHETGTTNTATATSN u otras secuencias de corte indicadas, por ejemplo, en A.C. Wilson et al., en Genes and Development 9:2445-2458, 1995.

La invención también proporciona procedimientos para el tratamiento de las células con productos de acoplamiento, tal como se describen en la presente memoria, de manera que se produzcan efectos inmunogénicos, inmunomoduladores, citotóxicos/letales o terapéuticos.

Los ejemplos de los materiales y procedimientos tal como se describen en la presente invención resultan útiles en la modulación de la actividad celular, por ejemplo con el objetivo y el efecto de producir o de alterar las respuestas inmunológicas, por ejemplo para la profilaxis o la terapia de las enfermedades, por ejemplo la producción de respuestas inmunológicas contra patógenos o tumores.

Entre otros usos de determinados materiales y procedimientos de la presente invención se incluyen la regulación de la expresión génica en las células, por ejemplo para fines de terapia génica correctora y/o para la reducción o el control del crecimiento y la actividad de las células tumorales. Los tratamientos celulares de acuerdo con la invención pueden ser in vitro, ex vivo o in vivo.

Entre los derivados de VP22 que pueden utilizarse de acuerdo con aspectos de la invención como sustancias activas en transporte y para el acoplamiento con materiales a transportar, para los fines indicados en otras partes de la presente memoria, se encuentran los péptidos que comprenden una secuencia funcional activa en transporte de la sección C-terminal de VP22.

Los ejemplos no limitativos de los procedimientos de tratamiento con los materiales descritos en la presente memoria comprenden el tratamiento de células presentadoras de antígeno o de preparaciones de células que las contienen con una fusión de VP22 y un antígeno, por ejemplo uno de aquellos antígenos indicados anteriormente (o con un vector, por ejemplo un vector vírico que codifica dicha fusión), de manera que se produce el procesamiento del antígeno y la presentación por la vía MHCI de manera que se produce una respuesta de CTL contra el antígeno. Entre los procedimientos proporcionados de esta manera el cebado y la expansión de las células T y la inmunoterapia adoptiva utilizando los materiales obtenidos de esta manera, de una manera de otra manera análoga a los procedimientos conocidos de cebado, expansión e inmunoterapia adoptiva.

Varios sistemas de vector, tales como la infección retrovírica o adenovírica o la inyección de complejos proteína-liposoma, así como los sistemas de vector virus herpes, pueden adaptarse fácilmente para constituir ejemplos de la presente invención. Por ejemplo, el ADN desnudo para una fusión de proteína VP22 con una proteína de uno de los tipos indicados en la presente memoria puede inyectarse en un tejido a tratar, de acuerdo a la naturaleza y propósito de la proteína a administrar. Pueden utilizarse los virus recombinantes tal como se ha indicado, que codifican y pueden expresar las proteínas de fusión de VP22. Un vector virus recombinante que porta dicha fusión puede ser defectivo, no replicante o de replicación limitada de manera que la replicación sea dependiente de las condiciones predominantes en el tejido o célula diana pero no en las células normales o que no son diana.

Los vectores y proteínas de fusión de los ejemplos de la invención pueden resultar útiles en la terapia génica, y para tratar o proteger contra la proliferación celular anormal, especialmente el cáncer pero también la soriasis, la ateroesclerosis y la restenosis arterial, y para inducir la apoptosis de, por ejemplo, linfocitos proliferantes, es decir para inducir la tolerancia, por ejemplo para prevenir el rechazo del trasplante o para el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas, tales como el lupus eritematosis sistémico o la artritis reumatoide.

Además de las aplicaciones terapéuticas médicas, los efectos mostrados en la presente invención también pueden explotarse mediante ensayos, proporcionados por la invención, que se basan en interacciones sustrato-enzima o en la interacción de proteínas expresadas en diferentes poblaciones celulares.

Se describe adicionalmente una realización de la invención, sin pretensión de limitar la invención, haciendo referencia a los dibujos adjuntos y a los materiales y métodos que se describen después:

En los dibujos adjuntos,

- La figura 1 ilustra que:

las células cos-1 transfectadas únicamente con el vector se marcaron mediante inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos para VP22 (figura 1a), p53 (figura 1c) y el epítopo de CMV (figura 1d) para establecer los niveles de marcaje de fondo. Las transfectadas con pc49epB (figura 1b) y marcadas para VP22 demostraron un patrón citoplasmático de VP22 típico, con clara expansión de los núcleos de las células contiguas. Las células transfectadas con el constructo de proteína de fusión VP22-p53 llamado p4953ep+10 se marcaron para VP22 y p53 (figuras 1e y 1f) o VP22 y epítopo (figuras 1g y 1h): la proteína de fusión puede detectarse en los núcleos de las células contiguas a la célula expresante primaria.

- La figura 2 es un mapa de plásmido para ilustrar el p4953ep+10 codificante de una proteína de fusión que comprende secuencias VP22, p53 y una etiqueta epítopo.

- La figura 3 ilustra que:

los extractos de proteína procedentes de células cos-1 transfectadas con un abanico de constructos de plásmido se analizaron mediante transferencia western. El panel mostrado de más a la izquierda se ha sondeado con un anticuerpo contra VP22 y demuestra que los plásmidos pU49epB y pc49epB codificantes de VP22 solo generan una proteína de 38 kDa, la proteína de fusión VP22-p53 expresada a partir de p4953ep+10 produce una proteína de aproximadamente 90 kDa con muy poca degradación.

El panel mostrado de más a la derecha se ha sondeado con un anticuerpo contra p53 y demuestra que las células transfectadas con plásmidos que codifican p53 solo (pcB6+p53) o el constructo de proteína de fusión p4953ep+10 produce proteína p53 de 53 kDa. El constructo p4953ep+10 también sintetiza la proteína de fusión VP22-p53 de 90 kDa, la p53 en esta muestra podría ser un producto de degradación, o más probablemente p53 inducido endógenamente.

Materiales y métodos Cultivo celular y transfección

Las células cos-1 se cultivaron en MEM modificado por Dulbecco suplementado con suero de neonato bovino al 10% a 37ºC con 5% de CO_{2}.

Las transfecciones se llevaron a cabo utilizando el procedimiento de BES/CaCl_{2} (Elliott y O'Hare 1997) con 200 ng de plásmido de ensayo con 1.800 ng de pUB19. Se dejó que se produjesen las transfecciones durante 48 horas, momento en el que se recolectaron las monocapas para análisis de inmunofluorescencia o de transferencia western.

Inmunofluorescencia y anticuerpos

Se fijaron las monocapas celulares sobre cubreobjetos con metanol al 100% durante 15 minutos a temperatura ambiente y se marcaron tal como describen Elliott y O'Hare (1997). Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS + suero al 10%. Se detectó VP22 utilizando un anticuerpo policlonal de conejo AGV30 (1:500), se detectó p53 utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón DO-1 (Santa Cruz Ltd.), el epítopo de CMV se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón CMV LNA (Capricorn Ltd.). Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal MRC600 de Bio-Rad.

Constructos de plásmido

El constructo de proteína de fusión VP22-p53 se generó mediante clonación de un fragmento PCR de p53 de longitud completa C-terminal a VP22 en un sitio único Bam, manteniendo tanto VP22 como el epítopo de CMV en el mismo marco de lectura.

Análisis de transferencia western

Se sondearon filtros western con anti-VP22 (1:10.000), anti-p53 (1:1.000).

Los presentes inventores construyeron un constructo de proteína de fusión VP22-p53 en el mismo marco de lectura, de longitud completa, etiquetado con epítopo (fig. 2). Este vector genera una proteína de fusión de aproximadamente 90 kDa al expresarse en células Cos-1, con muy poca degradación de proteínas según el análisis de transferencia western (fig. 3). A someterlo a ensayo para el transporte mediante tráfico intercelular, la proteína de fusión aparentemente funcionaba exactamente como la VP22 sola. Se encuentra situada en el citoplasma de células transfectadas primarias, según muestra la inmunofluorescencia en monocapas de células Cos-1 marcadas con anticuerpos anti-VP22 (figs. 1e y 1g), anti-p53 (fig. 1f) o anti-epítopo (fig. 1h) y es capaz de desplazarse muy eficazmente hacia el interior de los núcleos de células vecinas. La eficacia relativa de transporte no se ha determinado empíricamente pero aparentemente sólo es ligeramente menor a la de VP22 sola.

En experimentos adicionales, se transfectaron (utilizando la técnica del fosfato de calcio) células de osteosarcoma negativas para p53 con ADN desnudo que codificaba expresablemente (a) VP22 de tipo salvaje, (b) p53 de tipo salvaje, o (c) la proteína de fusión VP22-p53 indicada anteriormente. Las células transfectadas (b) y (c) mostraron la capacidad de experimentar apoptosis, al contrario que las células de control (a), indicando que la proteína de fusión VP22-p53 conserva la funcionalidad de p53.

En variantes del ejemplo proporcionado en la presente memoria, pueden prepararse, si se desea, constructos de deleción de VP22 de tamaño reducido de la proteína de fusión, por ejemplo para mejorar la tasa o grado de transporte, y que se pierda funcionalidad de la proteína.

En variantes adicionales, el orden de los componentes de la fusión puede variarse, por ejemplo las secuencias de p53 y de VP22 pueden incluirse fácilmente en el orden contrario al orden presente en el plásmido mostrado en la figura 2, con resultados satisfactorios.

La presente exposición se extiende a modificaciones y variaciones de la descripción proporcionada en la presente memoria, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, que resultarán evidentes para el lector experto en la materia.

Referencias adicionales

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Claims (15)

1. Polipéptidos acoplados y polipéptidos de fusión, que comprenden:

(i) una secuencia polipeptídica de VP22 de virus herpes, con la propiedad de ser un polipéptido activo en transporte capaz de mediar en el transporte hacia el interior de las células, conjuntamente con:

(ii) una secuencia de proteína o de polipéptido seleccionada de entre:

(a)

una proteína para el bloqueo de la progresión del ciclo celular que es una proteína p53 para el bloqueo de la progresión del ciclo celular, o un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, o

(b)

una proteína suicida que es condicionalmente citotóxica o letal, es decir, citotóxica o letal cuando se administra a una célula que contiene dicha proteína suicida, un profármaco o un compuesto activador correspondiente; o

(c)

una secuencia antigénica microbiana o vírica diferente de un epítopo de 10 aminoácidos de longitud codificado por el gen UL-83 de HCMV; o una secuencia antigénica de una proteína L1 o L2 de virus del papiloma, o un polipéptido gag, pol, env o nef de VIH, o un antígeno de clamidia, o un antígeno micobacteriano o una proteína MAGE, o

(d)

una proteína inmunomoduladora que es una proteína componente del complemento o una proteína receptora de citoquina, o GM-CSF, linfotactina, CD40, CD40L o cualquiera de entre IL-1 a IL-15, interferón alfa, beta o gamma, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de las colonias de macrófagos, factor estimulante de las colonias de granulocitos, proteína activadora de neutrófilos, quimioatrayente y factor activador de macrófagos, MIP-1a o MIP-1b, B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2 o ICAM-3, OX40 u OX40L.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que es un polipéptido de fusión en el que dicha secuencia (ii) es una proteína p53 para el bloqueo de la progresión del ciclo celular o un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina.

3. Polipéptido según la reivindicación 2, en el que dicha secuencia (ii) es una proteína p53 para el bloqueo de la progresión del ciclo celular.

4. Polipéptido según la reivindicación 2, en el que dicha secuencia (ii) es un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina.

5. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia (ii) es de una proteína suicida.

6. Polipéptido según la reivindicación 5, en el que dicha proteína suicida es timidina quinasa o nitrorreductasa.

7. Polipéptido según la reivindicación 1, que es un polipéptido de fusión y comprende una secuencia de unión inductora de corte situada entre las secuencias (i) e (ii).

8. Polipéptido que codifica un polipéptido de fusión según la reivindicación 1.

9. Polipéptido según la reivindicación 8, en el que dicha secuencia codifica un polipéptido de fusión que comprende: (i) una secuencia polipeptídica de VP22 de virus herpes con la propiedad de ser un polipéptido activo en transporte capaz de mediar en el transporte hacia el interior de las células; e (ii) una proteína p53 para el bloqueo de la progresión del ciclo celular, o un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina.

10. Vector de expresión que comprende un polinucleótido según la reivindicación 8.

11. Vector de expresión según la reivindicación 10, en el que dicho polinucleótido es transportado por un vector virus.

12. Vector de expresión según la reivindicación 10, en el que dicho polinucleótido es transportado por un complejo proteína-liposoma.

13. Vector de expresión según las reivindicaciones 11 ó 12, que comprende un polinucleótido según la reivindicación 9.

14. Utilización de un polipéptido de fusión según la reivindicación 2, en la preparación de un medicamento para el bloqueo de la progresión del ciclo celular de las células malignas.

15. Utilización de un vector según la reivindicación 13, en la que dicha secuencia codifica un polipéptido según la reivindicación 3, en la preparación de un medicamento para el bloqueo de la progresión del ciclo celular de las células malignas.