ES2265933T3

ES2265933T3 - Metodo multiplasmido para la preparacion de grandes librerias de policetidos y peptidos no ribosomicos.

Info

Publication number: ES2265933T3
Application number: ES00922192T
Authority: ES
Inventors: Daniel V. Santi; Qun Xue; Gary Ashley
Original assignee: Kosan Biosciences Inc
Current assignee: Kosan Biosciences Inc
Priority date: 1999-04-16
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2020-04-12
Also published as: WO2000063361A2; AU4241800A; DE60028956T2; WO2000063361A3; EP1171583A2; DE60028956D1; ATE331028T1; CA2369633A1; JP2003504006A; EP1171583B1

Abstract

Método para expresar un policétido o un péptido no ribosómico en una célula huésped que emplea una multiplicidad de vectores recombinantes, que pueden ser integrativos o libremente replicantes, caracterizado porque cada uno de los múltiples vectores codifica una parte de la policétido-sintasa o de la péptido no ribosómico-sintasa que produce el policétido o el péptido no ribosómico, comprendiendo dicho método los pasos de introducir los citados vectores en tal célula y cultivarla cuando han sido introducidos dichos vectores bajo condiciones tales que se produzca dicha policétido-sintasa o la péptido no ribosómico-sintasa.

Description

Método multiplásmido para la preparación de grandes librerías de policétidos y péptidos no ribosómicos.

Campo de la invención

La presente invención proporciona compuestos de ADN recombinante y células huésped que contienen nuevos genes de policétido-sintasa (PKS) y nuevos policétidos. La invención se refiere a los campos de química, química medicinal, medicina humana y veterinaria, biología molecular, farmacología, agricultura y ganadería.

Antecedentes de la invención

Los policétidos son productos naturales estructuralmente diversos que incluyen importantes agentes terapéuticos utilizados como antibacterianos (eritromicina), inmunosupresores (FK506), agentes reductores del colesterol (lovastatina) y otros (véase Katz et al., 1993, Polyketide synthesis: prospects for hybrid antibiotics, Annu. Rev. Microbiol. 47: 875-912). Actualmente, existen aproximadamente 7.000 policétidos identificados, pero esto representa solamente una pequeña fracción de lo que la naturaleza es capaz de producir.

La secuenciación del ADN de los genes que codifican varias de las enzimas que producen las policétido-sintasas modulares de tipo 1 (PKSs) ha revelado la organización notablemente lógica de estas enzimas multifuncionales (véase Cortes et al., 1990, An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea, Nature 348: 176-178; Donadio et al., 1991, Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis, Science 252: 675-679; Schwecke et al., 1995, The Biosynthetic gene cluster for the polyketide immunosuppressant rapamycin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843; y August et al., 1998, Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin: deductions from the molecular analysis of the rif biosynthetic gene cluster of Amycolatopsis mediterranei S699, Chem. Biol. 5: 69-79). La aplicación de innovadoras técnicas de combinación a esta organización genética ha provocado la generación de nuevos productos naturales, mediante la adición, supresión o intercambio de dominios o módulos enteros. Véase las Patentes de Estados Unidos Nº 5.672.491; 5.712.146; 5.830.750; 5.843.718; 5.962.290 y 6.022.731. Sería ventajoso tener un tecnología de biosíntesis de combinación práctica que pudiera lograr, y quizá superar, la diversidad de las estructuras de policétidos modulares hasta el momento descubiertas en la naturaleza.

Las PKSs modulares conocidas tienen una organización lineal en módulos, cada uno de los cuales contiene las actividades necesarias para un ciclo de alargamiento de la cadena de policétidos, tal como se ilustra para la 6-desoxieritronolido B-sintasa (DEBS) en la Fig. 1A. El módulo mínimo contiene una ceto-sintasa (KS), una acil-transferasa (AT) y una proteína transportadora de acilo (ACP) que catalizan conjuntamente una extensión de 2-carbonos en la cadena. La especificidad de la AT para el malonil o para un alfa-alquil malonil CoA determina el extensor de 2 carbonos que se está utilizando, y con ello la naturaleza del sustituyente alquilo en carbono alfa de la cadena de policétidos creciente. Después de la condensación de cada unidad de 2-carbonos, el estado de oxidación del carbono beta se conserva como cetona, o se modifica en un grupo hidroxilo, metenilo o metileno, mediante la presencia de una ceto-reductasa (KR), una KR + una deshidratasa (DH), o una KR + DH + una enoil-reductasa (ER), respectivamente. En efecto, la especificidad de la AT y la composición de los dominios catalíticos dentro de un módulo sirven de "código" para la estructura de cada unidad de 2-carbonos. El orden de los módulos en una PKS especifica la secuencia de las distintas unidades de 2-carbonos y el número de módulos determina el tamaño de la cadena de policétidos.

La notable diversidad estructural de los policétidos (véase O'Hagan, The Polyketide Metabolites; Ellis Horwood, Chichester, 1991) se rige por las posibilidades de combinación de los módulos organizadores que contienen los distintos dominios catalíticos, la secuencia y número de módulos y las "enzimas de adaptación" post-PKS que acompañan a los genes PKS. La correspondencia directa entre los dominios catalíticos de los módulos en una PKS y la estructura del producto biosintético resultante permiten una modificación racional de la estructura de los policétidos mediante ingeniería genética.

Durante los últimos años se han llevado a cabo ejemplos de modificación de cada uno de los elementos que codifican la estructura de los policétidos (véase Kao et al., 1996, Evidence for two catalytically independent clusters of active sites in a funcional modular polyketide synthase, Biochemistry 35: 12363-12368; Liu et al., 1997, Biosynthesis of 2-nor-6-deoxyerythronolide B by rationally designed domain substitution, J. Am. Chem. Soc. 119: 10553-10554; McDaniel et al., 1997, Gain-of-function mutagenesis of a modular polyketide synthase, J. Am. Chem. Soc. 119: 4309-4310; Marsden et al., 1998, Engineering broader specificity into an antibiotic-producing polyketide synthase, Science 279:199-202; y Jacobsen et al., 1997, Precursor-directed biosynthesis of erythromycin analogs by an engineered polyketide synthase, Science 277:367-369).

Recientemente se ha preparado una librería de combinación de más de 50 nuevos policétidos mediante modificación sistemática de DEBS, la PKS que produce el macrólido aglicona recursor de eritromicina (véase la solicitud de patente de Estados Unidos Nº de Serie 09/429.349, presentada el 28 de octubre de 1999; la solicitud de patente PCT US99/24483, presentada el 20 de octubre de 1999; y McDaniel et al., 1999, Multiple genetic modification of the erythromycin gene cluster to produce a library of novel "unnatural" natural products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1846-1851). Con un plásmido simple que contenía los genes eryAI, -AII y -AIII que codifican las tres subunidades de DEBS, los dominios de procesamiento de ATs y carbono beta fueron sustituidos por contrapartidas procedentes de PKS de rapamicina (véase Schwecke et al., 1995, supra) que codifican las especificidades alternativas del sustrato y las actividades de procesamiento del carbono beta. La aproximación utilizada consistía en desarrollar "mutaciones" simples, luego combinar secuencialmente las mutaciones simples para producir múltiples cambios en la PKS. Se observó que cuando dos o más mutantes simples de PKS eran funcionales, era muy probable que las combinaciones produjeran también el policétido esperado. Aunque esta estrategia proporcionara mucha seguridad de que los múltiples mutantes serían productivos, la producción de cada policétido necesitaba una ingeniería separada. Así, si se prepararan los mutantes X de eryAI, los mutantes Y de eryAII y los mutantes Z de eryAIII, se necesitaría que los experimentos separados X+Y+Z produjeran el mismo número de policétidos. Esto es, la preparación de librerías muy grandes mediante esta aproximación es laboriosa.

Otra estrategia para preparar grandes números de policétidos es mediante la digestión-religación aleatoria que conduce a la "mutagénesis" de los dominios o módulos de una mezcla de genes de PKS, incluidos los refinamientos realizados en el método de redistribución de ADN (véase Patten et al., 1997, Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals and vaccines, Curr. Op. Biotechnol. 8:724-733). La poca probabilidad esperada de reunir una PKS activa mediante esta aproximación, sin embargo, exigiría un esfuerzo analítico extraordinario (en ausencia de una selección biológica) para detectar clones que produjeran policétidos de entre un número mucho más grande de clones que no son productores.

Sigue existiendo la necesidad de aproximaciones prácticas para crear grandes librerías de policétidos, péptidos no ribosómicos y policétidos/péptidos no ribosómicos mezclados.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para expresar un policétido o un péptido no ribosómicos en una célula huésped empleando múltiples vectores recombinantes que puedan ser integrativos o libremente replicantes. Cada uno de los múltiples vectores codifica un parte de la policétido-sintasa o del péptido no ribosómico-sintasa que produce el policétido o el péptido no ribosómico. En una realización, al menos uno de entre los múltiples vectores codifica una o más proteínas que modifican luego el policétido o péptido no ribosómico producido.

En una realización preferente, los vectores se replican en y/o se integran en el cromosoma de una célula huésped de Streptomyces. Entre los vectores integrantes preferentes se incluyen los vectores derivados de pSET152 y pSAM2. Los vectores replicantes preferentes incluyen aquellos que contienen un replicón derivado de SCP2* o pJV1.

En otra realización, la presente invención proporciona nuevos policétidos. Estos nuevos policétidos incluyen aquellos mostrados en la Figura 3 como compuestos nos. 29-33, 35-42 y 45-59. Otros nuevos policétidos de la invención incluyen los policétidos que se pueden obtener por hidroxilación y/o glicosilación de los compuestos 29-33, 35-42 y 45-59. Los compuestos preferentes de la invención incluyen aquellas macrolactonas de 14 miembros con un hidroxilo en C-6 y/o en C-12 y/o un glicosilo en C-3 y/o en C-5, incluidas aquellas pero sin limitarse a, con un residuo desosaminil en C-5 y un residuo cladinosil en C-3.

Éstas y otras realizaciones, modos y aspectos de la invención se describen con más detalle en la siguiente descripción, ejemplos y reivindicaciones a continuación.

Descripción de las figuras

Figura 1: muestra las formas de tipo salvaje y mutante de genes eryA y proteínas DEBS. La parte A describe los genes eryAI-eryAIII y proteínas como flechas anchas orientadas en la dirección de la transcripción con los dominios en los módulos 1 a 6 de DEBS1-DEBS3 indicados por los símbolos definidos aquí. El primer sustrato, propionil-CoA, está unido al dominio de carga ACP y el (2S)-2-metilmalonil-CoA al módulo 2 ACP. Luego, tiene lugar una condensación descarboxilativa entre el propionato y el malonato de metilo seguida de una reducción de la incipiente beta-cetona para formar el intermedio mostrado unido al ACP del módulo 2. Este intermedio es transferido al ACP del módulo 3 y la secuencia de reacciones se repite en cada uno de los demás módulos con o sin reducción, deshidratación o reducción del doble enlace de la cetona para formar el policétido lineal de 21-carbonos unido al ACP del módulo 6. El policétido lineal luego se cicla y se libera como 6-desoxieritronólido B (6dEB). La parte B describe la sustitución de uno o más de los dominios en DEBS1, DEBS2, o DEBS3 por uno de los dominios o casetes de PKS de rap (rapamicina, o la eliminación del KR. Esto resulta en los cambios correspondientes de los grupos funcionales mostrados en una o más de las posiciones de 6dEB.

Figura 2: muestra un sistema ilustrativo de expresión de tres plásmidos para los genes eryA. En cada vector, el gen eryA se expresa bajo el control del promotor actI "upstream" (aguas arriba) y el gen actII-ORF4 tal como se ha descrito anteriormente (véase Ziermann et al., 2000, A two-vector system for the production of recombinant polyketides in Streptomyces, J. Ind. Microbiol. & Biotech. 24: 46-50; y Kao et al., 1994, Engineered biosynthesis of a complete macrolactone in a heterologous host, Science 265: 509-512). Para facilitar la construcción de las distintas mutaciones de eryA, se introdujo un sitio SpeI (ACTAGT) en nt 10366-10371 del ORF de eryAI mediante la realización de las mutaciones D3455T y A3456S (véase también Kao et al., 1995, Manipulation of macrolide ring size by directed mutagenesis of a modular polyketide synthase, J. Am. Chem. Soc. 117: 9105-9106) en pKOS025-179. Este cambio permite la inserción del segmento de genes mutados entre el sitio PacI y el sitio SpeI de pKOS025-179. Después de la sustitución del fragmento de 6-kb entre los sitios AscI en eryAII (nt 1213 y nt 7290) por un fragmento de 6-kb en AscI que contenía una sustitución específica de AT en un plásmido intermedio, el fragmento resultante PacI-XbaI que contiene el gen mutante eryAII se insertó en pKOS025-143. Todos los mutantes eryAIII fueron construidos mediante la sustitución del segmento en pKOS010-153 entre el sitio simple de BglII en nt 251 y el sitio de EcoRI (nt 9290) que se superpone al codón de terminación.

Figura 3: muestra las estructuras de las macrolactonas producidas por las cepas de Streptomyces lividans que contienen diversas combinaciones de tres plásmidos (Fig. 2 y Tabla 1). Las posiciones en 6dEB (1) que están cambiadas corresponden a las características genéticas de los módulos 2, 3, 5 y 6 de DEBS, tal como se ilustra en la Fig. 1A y la Fig. 2 y como se relaciona en la Tabla 1. Las estructuras 1 - 40 y 49 - 56 son lactonas de 14 miembros y las estructuras 44 a 48 son lactonas de 12 miembros. Los compuestos 49 - 59 con el grupo propilo en C13 se obtuvieron por biosíntesis mutacional con el alelo nulo eryAI KS1º.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos y reactivos para utilizar múltiples vectores recombinantes de ADN para producir policétidos en células huésped recombinantes. En una realización ilustrativa, se proporciona un sistema de tres plásmidos para la expresión heteróloga de 6-desoxieritronólido B-sintasa (DEBS) para facilitar la biosíntesis combinatoria de los policétidos fabricados por policétido-sintasas modulares de tipo I (KPSs). Los genes eryA de PKS que codifican las tres subunidades de DEBS se clonaron individualmente en tres vectores compatibles de Streptomyces que llevaban marcadores de resistencia a los antibióticos mutuamente seleccionables. Una cepa de Streptomyces lividans transformada con los tres plásmidos produjo 6-desoxieritronólido B a un nivel similar al de una cepa transformada con un plásmido simple que contiene los tres genes.

La utilidad de este sistema en la biosíntesis de combinación se demostró a través de la producción de una librería de macrolactonas modificadas de policétidos, utilizando las versiones de cada plásmido construido para contener mutaciones definidas. Las combinaciones de estos conjuntos de vectores se introdujeron en Streptomyces lividans, lo que resultó en cepas que producían un amplio espectro de análogos de 6-desoxieritronólido B. Este método puede aplicarse a cualquier PKS o péptido no ribosómico-sintasa (NRPS) y tiene el potencial de producir miles de nuevos productos naturales, incluidos los que derivan de otra modificación de los productos de PKS o NRPS por las enzimas de adaptación.

Así, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para utilizar múltiples (dos, tres, cuatro o más) vectores recombinantes de ADN, codificando cada uno una parte de una PKS, NRPS o enzima de adaptación, para producir un policétido o un péptido no ribosómico o mezcla de policétido/péptido no ribosómico en una célula huésped. En una realización, los vectores en combinación codifican una PKS o NRPS natural y se produce el producto natural correspondiente. En otra realización, los vectores en combinación codifican proteínas naturales procedentes de dos o más PKS o NRPS distintos naturales. En otra realización, al menos uno de los vectores codifica una proteína que no se encuentra en la naturaleza, que ha sido cambiada por métodos de ADN recombinante para cambiar su estructura y función.

En una realización, la presente invención proporciona un método para crear una librería de policétidos que permite la producción de grandes librerías de policétidos al mismo tiempo que conserva la gran probabilidad de obtener clones productivos mediante la combinación de mutaciones de PKS que son conocidas por ser productivas. El principio implica la clonación de mutantes de marcos abiertos de lectura (ORFs) individuales de una PKS en plásmidos compatibles separados, luego la coexpresión de los ORFs separados en un huésped adecuado para producir la PKS. Utilizando esta aproximación de múltiples plásmidos, con mutantes X de ORF 1, mutantes Y de ORF 2 y mutantes Z de ORF 3, por ejemplo, se puede conseguir rápidamente una librería de combinación de mutantes de X x Y x Z.

Se eligió la DEBS para ilustrar esta aproximación de múltiples plásmidos. La PKS de DEBS se compone de tres subunidades de proteínas > 280 kD, conteniendo cada una dos módulos, que se unen en el complejo completo de PKS (véase Donadio et al., 1991, supra). Con los dos posibles dominios de AT y las cuatro posibles modificaciones de beta-ceto, es decir ocho en cada módulo, son por tanto posibles 8 x 8 = 64 permutaciones para los dos módulos en cada subunidad de DEBS. La construcción de las mutaciones en cada ORF de DEBS por separado exigiría llevar a cabo 64 manipulaciones en cada gen, o un total de 192 de estas manipulaciones. Sin embargo, por cotransformación de una cepa huésped con tres plásmidos, llevando cada uno las 64 permutaciones de una subunidad de DEBS diferente, uno podría generar las PKs mutantes necesarias para lograr, en teoría, una librería de 262.144 policétidos (64^{3}), tales como análogos de 6-desoxieritronólido B (6dEB) (Fig. 1A). Por el contrario, el mismo número de experimentos de mutagénesis realizados en un sistema simple de plásmidos produciría teóricamente sólo 192
policétidos.

La ejecución exitosa de esta estrategia de múltiples plásmidos requiere que las subunidades de DEBS trasladadas desde tres mARNs diferentes interactúen fielmente para dar la PKS activa. Ya se había indicado que éste sería el caso en experimentos in vitro que mostraban que la reconstitución del complejo aislado DEBS1-DEBS2 con DEBS3 forma una PKS funcional (véase Pieper et al., 1995, Cell-free synthesis of polyketides by recombinant erythromycin polyketide synthases, Nature 378:263-266). Además, se ha demostrado recientemente que la coexpresión de las tres subunidades de DEBS a partir de dos plásmidos producía PKS activa in vivo (véase Ziermann et al., 2000, supra). La presente invención puede aplicarse a cualquier PKS o NRPS, incluidas, sin limitarse a, las enzimas PKS, incluida la mutación nula de KS1 que contiene versiones que sintetizan oleandólido y megalomicina (véase la solicitud de patente de Estados Unidos No. de Serie 60/158.305, presentada el 8 de octubre de 1999 y 09/428.517 presentada el 28 de octubre de 1999, así como la solicitud PCT Nº US 99/24478, presentada el 22 de octubre de 1999).

En una realización, el método requiere al menos tres vectores que pueden ser introducidos por separado en Streptomyces o en otra cepa huésped adecuada y que expresan concomitantemente las subunidades funcionales de PKS. Con estos propósitos son preferentes dos de estos vectores: el plásmido pRM1 basado en SCP2* replicante de forma autónoma (véase Kao et al., 1994, Engineered biosynthesis of a complete macrolactone in an heterologous host, Science 265:509-512 y la Patente de Estados Unidos Nº 6.022.731) y el plásmido pSET152 basado en el bacteriófago integrante phiC31 (véase Bierman et al., 1992, Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp., Gene 116:43-49). Se han sometido a prueba varios plásmidos más tal como se ha descrito aquí y tal como se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención.

Cada uno de estos plásmidos adicionales fueron sometidos a prueba utilizando constructos que contenían configuraciones idénticas a un gen eryA "downstream" (aguas abajo) del promotor Streptomyces coelicolor actI y del activador transcripcional actII-ORF4 tal como se ha descrito (véase Ziermann et al., 2000, supra). El plásmido pB45, un plásmido replicante de muchas copias que posee el origen pJV1 (véase Servin-Gonzalez et al., 1995, Sequence and functional analysis of the Streptomyces phaechromogenes plasmid pJV1 reveals a modular organization of Streptomyces plasmids that replicate by rolling circle, Microbiology 141:2499-2510) que lleva el eryAII se introdujo en S. lividans que contenía eryAI sobre pRM1 y eryAIII en el sitio de integración pSET152; en este sistema se produjeron menos de 0,1 mg/l de 6dEB en comparación con los 50 mg/l para el sistema de plásmido simple (véase Kao et al., 1994, supra).

Los múltiples vectores utilizados en el presente método pueden incluir dos o más vectores diferentes que comparten el mismo origen de replicación. Por ejemplo, dos plásmidos de tipo SCP2* que llevan distintos marcadores de antibióticos pueden coexistir y expresar subunidades PKS en Streptomyces sp., tal como se ha citado utilizando plásmidos de gran número de copias (véase Rajgarhia et al., 1997, Minimal Streptomyces sp. strain C5 daunorubicin polyketide biosynthesis genes required for aklanonic acid biosynthesis, J. Bacteriol. 179: 2690-2696). La cotransformación de S. lividans con eryAIII/pSET-apm, eryAI/pRM1-tsr y eryAII/pRM1-hyg (Fig. 2) generó una cepa que produjo también 50 mg/l de 6dEB. Además, después de más de 24 generaciones bajo una doble selección de antibiótico, se pudieron rescatar ambos plásmidos de replicación mediante procedimientos estándar sin cambiar los mapas de restricción (véase Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. John Innes Foundation, Norwich).

Los múltiples vectores de la presente invención pueden incluir dos o más distintos vectores integrantes también. Por ejemplo, el gen eryAII fue clonado en un plásmido integrante específico del sitio pSAM2 (véase Smokvina et al., 1990, Construction of a series of pSAM2-based integrative vectors for use in Actinomycetes, Gene 94: 53-59). La transformación secuencial de Streptomyces lividans con eryAIII/pSET-apm, eryAII/pSAM-hyg y eryAI/pRM1-tsr proporcionó una cepa que produjo 40-50 mg/l de 6dEB. Una ventaja potencial de este sistema sobre el sistema de dos vectores replicantes es que requiere menos antibiótico y evita los problemas potenciales de mantener dos plásmidos que contienen el mismo ori en un huésped Streptomyces (véase Baltz, 1997, Molecular genetic approaches to yield improvement in Actinomycetes, Biotechnology of Antibiotics, 2nd. Edition: pp. 49-62). Sin embargo, tal como se muestra aquí, se pueden utilizar también los dos plásmidos basados en SCP2* y el vector derivado de pSET.

Así, la invención puede ponerse en práctica con gran variedad de vectores de expresión para su utilización en Streptomyces. Los vectores replicantes de expresión de la presente invención incluyen, por ejemplo y sin limitación, aquellos que comprenden un origen de replicación procedente de un vector de bajo número de copias tal como SCP2* (véase Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory manual (The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985); Lydiate et al., 1985, Gene 35: 223-235; y Kieser and Melton, 1988, Gene 65: 83-91), SLP1.2 (Thompson et al., 1982, Gene 20: 51-62) y pSG5(ts) (Muth et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 219: 341-348, y Bierman et al., 1992, Gene 116: 43-49) o un vector de muchas copias, como pIJ101 y pJV1 (véase Katz et al., 1983, J. Gen. Microbiol. 129: 2703-2714; Vara et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 5782-5781; y Servin-Gonzalez, 1993, Plasmid 30:131-140). Los vectores de gran número de copias, sin embargo, en general no son preferentes para la expresión de grandes genes o de múltiples genes. Para los vectores no replicantes e integrantes, y generalmente para cualquier vector, es útil incluir al menos un origen E. coli de replicación, tal como el procedente de pUC, p1P, p1I y pBR. Para los vectores basados en fagos, se puede emplear el fago phiC31 y su derivado KC515 (véase Hopwood et al., supra). Asimismo, se puede emplear, para los propósitos de la presente invención, el plásmido pSET152, el plásmido pSAM, los plásmidos pSE101 y pSE211, todos los cuales integran espegíficamente un sitio en el ADN cromosómico de S. lividans.

Además, se puede emplear una gran variedad de marcadores de selección en los vectores recombinantes de expresión de Streptomyces de la invención. Estos incluyen los genes que confieren una resistencia a los antibióticos seleccionados de entre el grupo formado por aquellos genes que confieren resistencia ermE (confiere la resistencia a la eritromicina y la lincomicina), tsr (confiere la resistencia al tioestreptona), aadA (confiere la resistencia a la espectinomicina y la estreptomicina), aacC4 (confiere resistencia a la apramicina, la canamicina, la gentamicina, la geneticina (G418) y la neomicina), hyg (confiere resistencia a la higromicina) y vph (confiere resistencia a la viomicina). Como alternativa, varios policétidos naturales son coloreados y esta característica puede proporcionar un marcador integrado para identificar las células.

Se construyó una librería ilustrativa de la presente invención. La librería se componía de vectores que codificaban tres mutaciones simples en eryAI (módulo 2), una en eryAII (módulo 3) y siete en eryAIII (módulos 5 ó 6), así como ORFs de tipo salvaje, un mutante nulo de KS1 y una supresión del módulo 6, tal como se muestra en la Tabla 1, a continuación. Para facilitar la clonación, se prepararon vectores que contenían sitios de restricción que permitían la transferencia de casetes de ADN desde los genes mutantes eryA previamente preparados (véase McDaniel et al., 1999, supra, y Fig. 2). Se construyeron catorce de estos vectores de expresión, que comprendían los tres de tipo salvaje y once ORFs mutantes, mediante transferencias de casetes desde los plásmidos previamente preparados en el sistema de plásmido simple.

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TABLA 1 Genotipo de los plásmidos que contienen genes de DEBS^{a}

Vector:	pKOS021	pKOS025	pKOS010
Gen:	eryAI (DEBS1)	eryAII (DEBS2)	eryAIII (DEBS3)
Módulo:	1	3	5 \hskip0,5cm 6
	1. tipo salvaje
	2. AT\rightarrow^{b}rapAT2
	3. KR\rightarrowrapDH/KR4
	4. KR\rightarrowrapDH/ER/KR1
	5. KS1º^{c}
		6. tipo salvaje
		7. AT3\rightarrowrapAT2
			8. tipo salvaje
			9. AT\rightarrowrapAT2
			10. KR\rightarrowenlazador AT/ACP
			11. KR\rightarrowrapDH/KR4
			12. KR\rightarrowrapDH/ER/KR1
			13. módulo 5 + TE^{d}
			14. AT\rightarrowrapAT2
			15. KR\rightarrowenlazador AT/ACP
			16. KR\rightarrowrapDH/KR4
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Los plásmidos con genes mutantes DEBS se construyeron por clonación de los segmentos de ADN especificados en uno de los tres vectores mostrados en la Fig. 2.\end{minipage}
^{b} La flecha significa que el dominio de tipo salvaje fue sustituido por el que se indica.
^{c} Se creó el alelo nulo Cys729Ala mediante mutagénesis de sitio específico.
^{d} Se suprimió el módulo 6 para fusionar su TE a la ACP del módulo 5.

En eryAI, se modificó el módulo 2 sustituyendo AT por rapAT2 (el dominio AT del módulo 2 de la PKS de rapamicina) y KR por rapDH/KR4 (los dominios DH y KR del módulo 4 de la PKS de rapamicina) o rapDH/ER/KR1 (los dominios DH, KR y ER del módulo 1 de la PKS de rapamicina). En eryAII, la AT del módulo 3 fue sustituida por rapAT2; en eryAIII, el módulo 5 fue modificado reemplazando AT por rapAT2 y KR por rapDH/KR4 o rapDH/ER/KR1 o el enlazador AT/ACP, que elimina la actividad de KR del módulo 5 en ery. También, en el módulo 6 AT se sustituyó por rapAT2 y KR por rapDH/KR4 o enlazador AT/ACP. La consecuencia de haber introducido cada uno de estos casetes de genes PKS de rapamicina en los DEBS se muestra en la Fig. 1B; en una posición-alfa determinada en la cadena creciente de carbonos de policétidos se puede eliminar un grupo metilo o se puede cambiar un beta-hidroxilo en una cetona o se puede eliminar por deshidratación para producir un doble enlace, o el doble enlace que resulta de la deshidratación entonces puede ser reducido a un grupo metileno.

La aproximación empleada consistió en introducir primero las ocho variantes de eryAIII individualmente en el sitio de integración pSET de S. lividans, luego en cotransformar las cepas resultantes individualmente con cada uno de las cuatro variantes de eryAI sobre los vectores SCP2*-tsr y dos variantes de eryAII sobre los vectores SCP2*-hyg. Así, a partir de los 14 vectores preparados, se obtuvieron 64 transformantes triples. Se cultivaron las células recombinantes bajo una selección apropiada de antibióticos y se analizaron los extractos en busca de la producción de policétidos por LC/MS. De los 64 transformantes triples, 46 (el 72%) produjeron niveles detectables de uno o más policétidos bajo las condiciones de prueba empleadas (Fig. 3) y se produjeron 43 policétidos diferentes. Estos incluían 6dEB (1) y productos que resultaron de 11 mutantes simples de DEBS (2-12), 26 de dobles (13-38) y cinco (39-43) de triples. Veintiocho (1-28) de los 43 policétidos producidos se prepararon previamente utilizando el sistema de plásmido simple. Quince (29-43) eran nuevos policétidos fácilmente identificables por espectroscopía de masas y correspondencia con los productos esperados basados en los casetes utilizados en la mutagénesis.

En un aspecto, la presente invención proporciona estos nuevos policétidos. Estos nuevos policétidos además pueden ser modificados por enzimas de adaptación, incluidas las enzimas de adaptación de Saccharopolyspora erythraea. Se trata de una gran variedad de diversos organismos que pueden modificar las agliconas de macrólidos para proporcionar compuestos con, o que pueden modificarse fácilmente para obtener, actividades útiles. Por ejemplo, la Saccharopolyspora erythraea puede convertir el 6-dEB o derivados del mismo en diversos compuestos útiles. El eritronólido 6-dEB se convierte, mediante el producto genético eryF, en eritronólido B, el cual, a su vez, es glicosilado por el producto genético eryB para obtener 3-O-micarosileritronólido B, que contiene L-micarosa en C-3. El producto genético eryC de la enzima convierte entonces este compuesto en eritromicina D por glicosilación con D-desosamina en C-5. La eritromicina D, por tanto, se diferencia de 6-dEB debido a la glicosilación y mediante la adición de un grupo hidroxilo en C-6. La eritromicina D puede convertirse en eritromicina B según una reacción catalizada por el producto genético eryG mediante metilación del residuo L-micarosa en C-3. La eritromicina D se convierte en eritromicina C por adición de un grupo hidroxilo en C-12 en una reacción catalizada por el producto genético eryK. La eritromicina A se obtiene a partir de la eritromicina C mediante metilación del residuo micarosa en una reacción catalizada por el producto genético eryG. Los compuestos aglicona proporcionados por la presente invención, por ejemplo los compuestos producidos en Streptomyces lividans, pueden ser suministrados a cultivos de S. erythraea y convertidos en los derivados de las eritromicinas A, B, C y D correspondientes. Para garantizar que sólo se produce el compuesto deseado, se puede utilizar un mutante eryA de erythraea que es incapaz de producir 6-dEB pero que puede seguir llevando las conversiones deseadas (Weber et al., 1985, J. Bacteriol. 164(1): 425-433). Igualmente, se pueden emplear otras cepas mutantes, tal como los mutantes eryB, eryC, eryG y/o eryK, o las cepas mutantes que tienen mutaciones en múltiples genes, para acumular un compuesto preferente. La conversión puede llevarse a cabo también en grandes fermentadoras para la producción comercial.

Además, existen otros organismos útiles que pueden emplearse para hidroxilar y/o glicosilar los compuestos de la invención. Tal como se describe anteriormente, los organismos pueden ser mutantes incapaces de producir el policétido normalmente producido en aquel organismo, la fermentación puede llevarse a cabo en placas o en grandes fermentadoras y los compuestos producidos pueden cambiarse químicamente después de la fermentación. Así, el Streptomyces venezuelae, que produce picromicina, contiene enzimas que pueden transferir un grupo desosaminilo al hidroxilo C-5 y un grupo hidroxilo a la posición C-12. Además, S. venezuelae presenta una actividad de glucosilación que glucosila el grupo 2’-hidroxilo del azúcar desosamina. Esta última modificación reduce la actividad antibiótica, pero el residuo glucosilo se elimina por acción enzimática antes de la liberación del policétido de la célula. Otro organismo, S. narbonensis, contiene las mismas enzimas de modificación que S. venezuelae, excepto la hidroxilasa C-12. Así, la presente invención proporciona compuestos producidos por hidroxilación y glicosilación de las agliconas de macrólidos de la invención mediante la acción de la enzimas endógenas sobre S. narbonensis y S. venezuelae.

Otros organismos adecuados para elaborar los compuestos de la invención incluyen Micromonospora megalomicea, que produce megalomicina A. La megalomicina A contiene la estructura completa de la eritromicina C y su biosíntesis implica también la formación adicional de megosamina (L-rodosamina) y su unión al hidroxilo C-6, seguida de la acilación de los hidroxilos C-3’’’ y(o) C-4’’’ como pasos finales. Otros organismos útiles en la conversión de las agliconas de la presente invención en compuestos modificados incluyen Streptomyces antibioticus, S. fradiae y S. thermotolerans. S. antibioticus produce oleandomicina y contiene enzimas que hidroxilan las posiciones C-6 y C-12, glicosilan el hidroxilo C-3 con oleandrosa y el hidroxilo C-5 con desosamina y forman un epóxido en C-8-C-8a. S. fradiae contiene enzimas que glicosilan el hidroxilo C-5 con micaminosa y luego el 4’-hidroxilo de micaminosa con micarosa, formando un disacárido. S. thermotolerans contiene las mismas actividades que S. fradiae, así como actividades de acilación. Así, la presente invención proporciona los compuestos producidos por hidroxilación y glicosilación de las agliconas de macrólidos de la invención mediante la acción de las enzimas endógenas sobre S. antibioticus, S. fradieae y S. thermotolerans. Además, estas y otras enzimas de adaptación pueden ser clonadas e incorporadas en uno o más de los múltiples vectores utilizados de acuerdo con los métodos de la presente invención para crear librerías de compuestos modificados de policétidos.

Los compuestos resultantes pueden además ser modificados mediante química sintética, es decir para producir los cetólidos correspondientes, útiles como antibióticos (véase, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de Serie 60/172.159, presentada el 17 de diciembre de 1999; 60/140.175, presentada el 18 de junio de 1999; 60/172.154, presentada el 17 de diciembre de 1999; y 60/129.729, presentada el 16 de abril de 1999) o para producir los motilides correspondientes (véase la solicitud provisional de patente de Estados Unidos Nº de Serie 60/183.338, presentada el 18 de febrero de 2000, expediente nº 30062-30053.00, inventores G. Ashley et al.).

En 43 de los 46 transformantes que produjeron los policétidos en la librería ilustrativa descrita aquí, los policétidos aislados tenían las estructuras esperadas de la(s) mutación(es). Sin embargo, tal como se observó en las mutaciones simples correspondientes del gen eryA en el sistema de plásmido simple, se observaron algunos productos adicionales con ciertas mutaciones. En la mayoría de los casos, el dominio rapAT2 en el módulo 3 reconoció y procesó tanto el malonil- como el metilmalonil-CoA y dio los análogos 8-nor esperados más unas cantidades más pequeñas de los análogos 8-metil. En algunos casos se formaron solamente los análogos 8-metil. La especificidad relajada de rapAT2 parece ser dependiente del módulo, porque se observaron solamente los productos esperados con la misma secuencia de rapAT2 en los módulos 2 ó 5 (véase Ruan et al., 1997, Acyltransferase domain substitutions in erythromycin polyketide synthase yield novel erythromycin derivatives, J. Bacteriol. 179: 6416-25).

Del mismo modo, cuando se sustituyó el KR del módulo 5 por los dominios rapDH/KR4 o rapDH/ER/KR1 para dar los análogos esperados 4,5-anhidro y 5-desoxi, respectivamente, se formaron los análogos 5-ceto además de los productos esperados. Esto posiblemente se deba a la transferencia del intermedio beta-cetotio éster desde KR5 a ACP5 a una velocidad competitiva con su reducción por el dominio heterólogo rapKR4. Como no se observaron productos aberrantes con rapDH/KR4 en los módulos 2 ó 6, la no especificidad parece ser dependiente del módulo.

Finalmente, cuando el KR del módulo 2 fue sustituido por el dominio rapDH/ER/KR1 para proporcionar los análogos 11-desoxi, a menudo se observó que los análogos 10,11-deshidro eran productos menores pero significativos. Aquí, el intermedio es procesado por los dominios heterólogos rapKR y DH en el módulo 2, pero la transferencia del intermedio 10,11-deshidro a KS3 debe ser competitiva con la reducción catalizada por ER. Es interesante como, con rapDH/ER/KR1 en el módulo 2 y rapAT2 en el módulo 3, no se detectaron los subproductos 10,11-deshidro. O bien los niveles producidos eran demasiado bajos para la detección con los métodos empleados o el intermedio deshidro aberrante del módulo 2 no fue procesado por el módulo 3 que contenía la sustitución rapAT2.

De los 18 transformantes que no produjeron policétidos a niveles detectables en estos experimentos, dos eran dobles mutantes y 16 eran triples mutantes; sólo uno de estos mutantes fue preparado previamente en el sistema de simple plásmido, en el cual no logró tampoco producir un policétido detectable. Tal como se ha dicho anteriormente, con el sistema de simple plásmido, un mayor número de mutaciones resultó en una disminución de la producción a un nivel no detectable por el método analítico utilizado.

Una ventaja importante del sistema de múltiples plásmidos es que una vez estén disponibles los múltiples plásmidos que codifican los mutantes funcionales de las subunidades PKS, éstos pueden combinarse rápidamente con uno o más mutantes adicionales para ampliar la librería de policétidos. En un ejemplo, se preparó una mutación simple de Cys729Ala en el dominio KS1 del módulo 1 de DEBS1 (véase Jacobsen et al., 1997, supra) que produjo la mutación nula de KS1. El KS1 inactivo impide la propagación de la unidad de inicio y permite la introducción de dicetidotiol ésteres exógenos sintéticos en las posiciones 12 y 13 del producto macrólido de 14 miembros. Se desarrolló primero este sistema utilizando un vector simple, el plásmido pJRJ2. El plásmido pJRJ2 codifica los genes eryAI, eryAII y eryAIII; el gen eryAI contenido en el plásmido comprende la mutación nula de KS1. La mutación nula de KS1 impide la formación del 6-desoxieritronólido B producido por el gen de tipo salvaje salvo que se proporcione un sustrato exógeno. El plásmido pJRJ2 y un proceso para utilizarlo en la preparación de 13 nuevas eritromicinas sustituidas se describe en las publicaciones PCT Nº 99/03986 y 97/02358 y en la solicitud de patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/675.817, presentada el 5 de julio de 1996; 08/896.323, presentada el 17 de julio de 1997; y 09/311.756, presentada el 14 de mayo de 1999). Los sustratos exógenos proporcionados pueden prepararse mediante diversos métodos e incluyen los compuestos descritos en la solicitud de patente PCT Nº PCT/US00/02397 (Expediente Nº 30062-20032.40) y la solicitud de patente de Estados Unidos Nº de Serie 09/492.733 (Expediente Nº 30062-20032.00), ambas presentadas el 27 de enero de 2000 por los inventores G. Ashley et al., y ambas reivindicando la prioridad a la solicitud de patente de Estados Unidos Nº de Serie 60/117.384, presentada el 27 de enero de 1999.

El plásmido que codifica el alelo nulo de KS1 de eryAI (Tabla 1) fue introducido por cotransformación en Streptomyces lividans con el único mutante eryAII y siete mutantes eryAIII (Tabla 1) para proporcionar 16 transformantes. El tratamiento de cada uno de ellos con un propildicétido N-acetilcisteína tioéster, según el trabajo de Jacobsen et al., 1997, y la metodología de las solicitudes de patentes, supra, proporcionaron once nuevos análogos 13-propil-policétidos (49-59, Fig. 3). Así, la presente invención proporciona estos nuevos policétidos así como los compuestos que resultan de su modificación por las enzimas de adaptación post-PKS (oxidasas y glicosilasas) o por métodos de síntesis química. La preparación de estos mismos PKSs por el sistema de simple plásmido habría exigido la preparación de 16 mutantes individuales en lugar del mutante nulo KS1 simple utilizado en el presente método.

En otro ejemplo, se utilizaron las variantes de eryAI y eryAII para preparar una pequeña librería de macrolactonas de 12 miembros. Se mostró anteriormente en el sistema de simple plásmido de eryA que la omisión del módulo 6, junto con la fusión del módulo 5 con el dominio tioesterasa de DEBS3 (Fig. 1A), resulta en la formación de una macrolactona de 12 miembros. Un gen eryAIII truncado que contiene el módulo 5-TE (véase Kao et al., 1995, Manipulation of macrolide ring size by directed mutagenesis of a modular polyketide synthase, J. Am. Chem. Soc. 117:9105-9106 y Tabla 1) se introdujo en Streptomyces lividans y la cepa transformada con permutaciones de los cuatro eryAI y dos eryAII descritas anteriormente. De las ocho lactonas de 12 miembros que podrían haberse producido, se observaron cinco (44-48). El compuesto 44 resulta de la combinación de los genes de tipo salvaje eryAI y eryAII con el constructo del módulo 5-TE, y ha sido preparado previamente en el sistema de simple plásmido; los compuestos 45-48 son nuevos productos que hacen más que doblar el número de macrólidos de 12 miembros conocidos. Estas nuevas macrolactonas constituyen un aspecto importante de la presente invención.

Otros usos de este sistema de múltiples plásmidos es la siguiente. La expresión e ingeniería genética de genes de PKS muy grandes, tales como los involucrados en la biosíntesis de rapamicina (14 módulos) o de rifamicina (10 módulos), puede conseguirse fácilmente mediante este método. Los ORFs para cada una de las subunidades de estos y otros PKSs, tal como los NRPS-PKS mezclados para la epotilona (véase la solicitud de patente de Estados Unidos Nº de Serie 09/443.501, presentada el 19 de noviembre de 1999 y la solicitud de patente PCT US99/27438, presentada el 19 de noviembre de 1999) podrían clonarse y expresarse de la forma utilizada aquí para simplificar en gran medida las manipulaciones genéticas y el análisis estructural/funcional. Así, en esta aplicación del presente método, se puede expresar un policétido natural en una célula huésped recombinante.

De forma similar, sería deseable mezclar los genes de PKS procedentes de vías de acceso totalmente diferentes para facilitar la producción de PKSs heterólogos e híbridos, tal como lo antecede el trabajo de Li et al., que involucra genes híbridos de PKS de eritromicina/picromicina y oleandomicina/picromicina (véase las solicitudes de patentes de Estados Unidos Nº de Serie 09/320.878, presentada el 27 de mayo de 1999 y 09/428.517, presentada el 28 de octubre de 1999; la publicación de patente PCT Nº 99/61599; y la solicitud de patente PCT Nº US99/24478). Este trabajo podría incluir la ampliación de la cadena de carbonos mediante la adición de módulos.

Las librerías de PKS generadas podrían verse influidas y ampliarse mediante la introducción de genes para las enzimas de adaptación que oxiden, hidroxilen, metilen, acilen, glicosilen o modifiquen de otro modo el producto de PKS o un policétido modificado, y los genes que codifican estas enzimas podrían emplearse utilizando un vector adicional en el sistema de múltiples vectores. Varias enzimas de adaptación procedentes de distintos organismos huésped podrían emplearse en el mismo sistema. Los genes para estas enzimas de adaptación pueden obtenerse tal como se describe en las solicitudes y publicaciones de patentes referenciadas en el párrafo anterior y en otros lugares aquí. Véase también la Patente de Estados Unidos Nº 5.998.194.

Finalmente, el método sería útil con cualquier sistema que se componga de proteínas multimodulares, tal como la gran familia de las peptido-sintasas no ribosómicas, que producen muchos compuestos farmacéuticamente importantes como antifúngicos, anticancerígenos y antibióticos. Estos importantes compuestos están hechos de sintetasas multifuncionales, que se componen de complejos de proteínas que contienen entre uno y once módulos, comparables a las PKSs modulares (véase Konz et al., 1999, How do peptide synthase generate structural diversity? Chem. & Biol. 6: 39-48).

La tecnología de múltiples plásmidos permite la realización del potencial total de las PKSs y NRPSs modulares y, por tanto, de las librerías que contienen un repertorio completo de policétidos y péptidos no ribosómicos. El alcance de este objetivo requiere solamente la construcción de un número limitado de mutantes productivos simples de alta expresión que aseguren la producción adecuada de policétidos cuando se combinan las mutaciones. Como todos los elementos para producir una librería de policétidos extraordinariamente amplia están contenidos en este fácil sistema, no existe ni la necesidad ni la ventaja de emprender el desarrollo de sistemas más complicados, menos fiables para alcanzar el mismo objetivo.

Ejemplo 1 Construcción de Plásmidos de Expresión

En cada vector, se expresa el gen eryA bajo el control del promotor actI "upstream" (aguas arriba) y del gen actII-ORF4 tal como se ha descrito anteriormente (véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.672.491 y Ziermann et al., 2000, supra). Para someter a prueba el plásmido replicante de muchas copias que posee el origen pJV1, se construyó el vector lanzadera pKOS025-32 de E. coli basado en pB45 mediante fusión de pB45 con litmus 28 (New England Biolabs) en los sitios BglII y PstI. En pKOS025-32, el fragmento HindIII-XbaI de aprox. 14-kb que contiene el promotor actI y el gen actII-ORF4 se insertó seguido por el gen eryAII para dar pKOS025-35. La configuración de los componentes en el fragmento HindIII-XbaI se muestra en la Fig. 2. El mismo fragmento HindIII-XbaI también fue clonado en el vector lanzadera pOSint1/Hygro (véase Raynal et al., 1998, Structure of the chromosomal insertion site for pSAM2: functional analysis in Escherichia coli, Molecular Microbiology 28: 333-342) para producir el plásmido eryAII/pSAM2-hyg , pKOS038-67.

Ejemplo 2 Transferencia de los Casetes de Mutación en el Sistema de Tres Plásmidos

Los plásmidos que contenían las mutaciones eryAI en el módulo 2 eran pKOS025-179 (AT2\rightarrowrapAT2), pKOS038-1 (KR\rightarrowrapDH/KR4) y pKOS038-3 (KR\rightarrowrapDH/ER/KR1) y fueron elaborados como sigue. Los fragmentos PacI-SpeI que contenían las mutaciones correspondientes fueron transferidos en los plásmidos descritos en la Fig. 2 desde los plásmidos pKOS008-41, pKOS015-56 y pKOS015-57, respectivamente (véase McDaniel et al., 1999, supra, y la solicitud de patente de Estados Unidos Nº de Serie 09/429.349, presentada el 28 de octubre de 1999 y la solicitud de patente PCT US99/24483 presentada el 20 de octubre de 1999). Los plásmidos que contenían las mutaciones eryAIII en el módulo 5 eran pKOS025-1831 (AT\rightarrowrapAT2), pKOS025-1832 (KR\rightarrowAT/enlazador ACP), pKOS025-1833 (KR\rightarrowrapDH/KR4) y pKOS025-1834 (KR\rightarrowrapDH/ER/KR1); y en el módulo 6 eran pKOS025-1841(KR\rightarrowrapDH/KR4), pKOS021-106 (KR\rightarrowAT/enlazador ACP) y pKOS025-1842 (AT\rightarrowrapAT2). Estos se construyeron como sigue. Los fragmentos BglII-EcoRI que contenían las mutaciones correspondientes fueron transferidos a los plásmidos descritos en la Fig. 2 desde los plásmidos pKOS006-188, pKOS016-12, pKOS006-178, pKOS026-11b, pKOS011-25, pKOS011-13 y pKOS015-53, respectivamente (véase McDaniel et al., 1999, supra, y la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de Serie 09/429.349, presentada el 28 de octubre de 1999 y la solicitud de patente PCT US99/24483, presentada el 20 de octubre de 1999). El plásmido pKOS038-20 contiene eryAII con la sustitución AT3\rightarrowrapAT2 en el módulo 3 y se obtuvo mediante transferencia de la mutación desde un subclón previamente preparado pKOS015-28 (véase McDaniel et al., 1999, Supra, y la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de Serie 09/429.349, presentada el 28 de octubre de 1999 y la solicitud de patente PCT US99/24483, presentada el 20 de octubre de 1999).

Ejemplo 3 Transformación de Streptomyces

Se prepararon los transformantes K4-114 y K4-155 de Streptomyces lividans (véase la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de Serie 09/181.833, presentada el 28 de octubre de 1998 y Ziermann et al., 1999, Recombinant polyketide synthesis in Streptomyces: engineering of improved host strain, Bio Techniques 26: 106-110) de acuerdo con los métodos estándar (véase Hopwood et al., 1985, supra) utilizando apramicina (100 \mug/ml), tioestreptona (50 \mug/ml) e higromicina (225 \mug/ml) en placas de regeneración de protoplastos R5. En el sistema de tres plásmidos para el cual eryAII/pSAM2-hyg sustituía eryAII/SCP2*-hyg, S. lividans fue transformado secuencialmente con pKOS010-153, pKOS038-67 y pKOS021-30.

Ejemplo 4 Alimentación de Dicétidos

Se sintetizó (2S,3R)-2-metil-3-hidroxihexanoil-N-acetilcisteamina (NAC) tioéster (propildicétido) de acuerdo con el método descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de Serie 60/117.384, presentada el 27 de enero de 1999, y Nº de Serie 09/492.733 (expediente nº 30062-20032.00), presentada el 27 de enero de 2000, por los mismos inventores y reivindicando la prioridad a la solicitud anterior. Los transformantes triples de Streptomyces lividans que contienen el alelo nulo KS1 de eryAI (véase Jacobsen et al., 1997, supra, y la solicitud de patente PCT Nº 99/03986 y 97/02358) fueron cultivados en 5 ml de medio R5 a 30ºC durante 6 días en una selección adecuada de antibióticos. Al 4º día de incubación, se añadieron al cultivo 300 \mul de una solución de dicétido (4,7 mg/ml en DMSO al 10%) y 50 \mul de ácido pentanoico (2,5 mg/ml).

Ejemplo 5 Producción y Análisis de Análogos de Policétidos

Se cultivaron los transformantes triples de Streptomyces lividans en 5 ml de medio R5 (véase Hopwood et al., 1985, supra) a 30ºC durante 6 días en una selección adecuada de antibióticos. Se extrajo la solución cultivada con 2 x 5 ml de acetato de etilo y las capas orgánicas fueron combinadas y concentradas. Una parte alícuota de 50 \mul de los concentrados se analizó por HPLC en una columna C18 de fase inversa (4,6 mm x 15 cm, Beckman, Fullerton, CA) utilizando un detector basado en PE SCIEX API100 LC/MS (Perkin-Elmer, Foster City, CA). Se realizó una determinación cuantitativa de la producción de policétidos con detección de dispersión de luz de evaporación (Analtec model 500 ELSD, Deerfield, IL). Los policétidos fueron identificados por su espectro de masas y correspondencia con los productos esperados o con los estándares conocidos. En las condiciones de ionización utilizadas, el 6dEB y sus análogos generan modelos de deshidratación de signatura. La producción de los análogos 13-etil de 6dEB oscilaba entre 7 mg/l y menos de 0,1 mg/l y los análogos 13-propil se produjeron en un rango de 0,2 a 20 mg/l. No se determinaron los rendimientos de las lactonas de 12 miembros.

Claims

1. Método para expresar un policétido o un péptido no ribosómico en una célula huésped que emplea una multiplicidad de vectores recombinantes, que pueden ser integrativos o libremente replicantes, caracterizado porque cada uno de los múltiples vectores codifica una parte de la policétido-sintasa o de la péptido no ribosómico-sintasa que produce el policétido o el péptido no ribosómico, comprendiendo dicho método los pasos de introducir los citados vectores en tal célula y cultivarla cuando han sido introducidos dichos vectores bajo condiciones tales que se produzca dicha policétido-sintasa o la péptido no ribosómico-sintasa.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dichos vectores codifican una policétido-sintasa.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha policétido-sintasa se selecciona de entre el grupo formado por DEBS, PKS oleandólido, PKS picromicina, PKS epotilona, PKS megalomicina.

4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dichos vectores codifican una péptido no ribosómico-sintasa.

5. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno de los múltiples vectores codifica una proteína que modifica además el polipéptido o el péptido no ribosómico producido por dicha policétido-sintasa o dicha péptido no ribosómico-sintasa.

6. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno de dichos vectores se replica de forma extracromosómica en dicha célula huésped.

7. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno de dichos vectores se integra en el cromosoma de dicha célula huésped.

8. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha célula huésped es una célula huésped de Streptomyces.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho vector es un derivado de un vector seleccionado de entre el grupo formado por los vectores integrantes pSET152 y pSAM2 y por los vectores replicantes de forma extracromosómica SCP2* y pJV1.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende además el paso de hidroxilación y/o glicosilación del policétido o del péptido no ribosómico.

11. Compuesto que se puede obtener por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y seleccionado de entre el grupo formado por los compuestos mostrados en la Figura 3 como compuestos n. 29-33, 35-42 y 45-59.

12. Compuesto según la reivindicación 11 que es hidroxilado y/o glicosilado y es una macrolactona de 14 miembros con un hidroxilo C-6 y/o un hidroxilo C-12 y/o un glicosilo C-3 y/o C-5.

13. Compuesto según la reivindicación 12, caracterizado porque dicho glicosilo es un residuo desosaminilo en C-5 o un residuo cladinosilo en C-3 o ambos.

14. Compuesto según la reivindicación 11 que es es compuesto número 29 ó 30 de la Figura 3.

15. Compuesto según la reivindicación 11 que es el compuesto número 31 ó 32 de la Figura 3.

16. Compuesto según la reivindicación 11 que es el compuesto número 33 de la Figura 3.

17. Compuesto según la reivindicación 11 que es el compuesto número 35 ó 36 de la Figura 3.

18. Compuesto según la reivindicación 11 que es el compuesto número 37 ó 38 de la Figura 3.

19. Compuesto según la reivindicación 11 que es el compuesto número 39 ó 40 de la Figura 3.

20. Compuesto según la reivindicación 11 que es el compuesto número 41 ó 42 de la Figura 3.

21. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque cada vector de entre los múltiples vectores recombinantes citados se selecciona de entre una librería de vectores recombinantes que comprende (i) un vector recombinante que codifica un primer ORF mutante funcional y (ii) un vector recombinante que codifica un segundo ORF mutante funcional o un ORF de tipo salvaje.