ES2267104T3 - Dimero del peptido trebol. - Google Patents
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Abstract
UN PEPTIDO TREBOLADO QUE CONTIENE UN DOMINIO TREBOLADO UNICO CARACTERIZADO POR ESTAR EN FORMA DE DIMERO.
Description
Dímero del péptido trébol.
La presente invención se refiere a dímeros del
péptido trébol, a un método de preparación de dímeros de péptidos
trébol, a composiciones farmacéuticas que comprenden dímeros del
péptido trébol, y al uso del mismo en el tratamiento de trastornos
gastrointestinales.
Los péptidos trébol forman una familia de
péptidos encontrada principalmente en asociación con el tracto
gastrointestinal. Los péptidos trébol mamíferos contienen uno o más
dominios en trébol característicos (Thim et al., 1989), cada
uno de los cuales se compone por una secuencia de 38 o 39 residuos
aminoácidos donde 6 residuos de media-cistina son
enlazados en la configuración 1-5,
2-4 y 3-6, formando así una
estructura en trébol característica (Thim, 1989).
Los péptidos trébol mamíferos conocidos
actualmente contienen uno o dos dominios en trébol (para revisión
véase Thim, 1994; Poulsom & Wright, 1993; Hoffmann &
Hauser, 1993), mientras que los péptidos de la rana Xenopus
laevis, y las proteínas que contienen uno (Hauser &
Hoffmann, 1991), dos (Hauser et al., 1992a), cuatro
(Hoffmann, 1988) o seis (Hauser & Hoffmann, 1992b) dominios en
trébol han sido descritas. Los péptidos trébol mamíferos que
contienen un dominio son el péptido pS2 asociado al cáncer de mama
hasta ahora conocido del ser humano (Jakowlev et al., 1984,
Prud'homme et al., 1985) y del ratón (Lefebvre et
al., 1993) y el factor trébol intestinal hasta ahora conocido
del ser humano (Podolsky et al., 1993; Hauser et al.,
1993) y de la rata (Suemori et al., 1991; Chinery et
al., 1992). El polipéptido espasmolítico (sp) que contiene dos
dominios en trébol ha sido descrito del hombre (Tomasetto et
al., 1990), del cerdo (Thim et al., 1982) y del ratón
(Tomasetto et al., 1990). En los seres humanos los tres
péptidos trébol hpS2, hITF y hSP son todos expresados en condiciones
normales en el tracto gastrointestinal: hSP y hps2 en la capa
mucosa epitelial del estómago (Tomasetto et al., 1990; Rio
et al., 1988), y hITF en la capa mucosa epitelial del
intestino delgado y colon (Podolsky et al., 1993). La
purificación y caracterización de hSP producido recombinantemente
en la levadura han sido también descritas (Thin et al.,
1993, FEBS Lett. 318(3), págs.345-352).
La función fisiológica de los péptidos trébol no
está muy bien entendida. La expresión aumentada de péptidos trébol
en el tracto gastrointestinal ha sido proporcionada en diferentes
condiciones que comprenden lesiones en las mucosas, tales como la
enfermedad del intestino inflamatorio (Rio et al., 1991;
Poulsom et al., 1992; Wright et al., 1993) y la
ulceración en el estómago y duodeno (Rio et al., 1991; Hanby
et al., 1993; Wright et al., 1990). Consecuentemente
una función de reparación de la mucosa de los péptidos trébol ha
sido sugerida (p. ej. Wright et al., 1993). Una evidencia de
péptidos trébol que promueven la restitución epitelial mucosa
después de una lesión ha sido proporcionada recientemente por
Dignass et al., 1994, Playford et al., 1994 y
Babyatsky et al., 1994. El mecanismo por el cual los péptidos
trébol promueven su función de reparación puede implicar el
entrecruzamiento de glicoproteinas de mucina para formar una capa
de gel viscoelástico resistente a enzimas digestivas (Thim, 1994;
Gajhede et al., 1993).
La clonación del factor trébol intestinal de
dominio único de rata y humano y el uso del factor trébol
intestinal en el tratamiento de lesiones gastrointestinales están
descritos en WO 92/14837.
Hasta ahora se ha encontrado la posibilidad de
preparar dímeros de factores trébol que tienen sólo un dominio en
trébol y que tienen propiedades farmacológicas interesantes.
En consecuencia, la presente invención se
refiere a un péptido trébol que contiene un único dominio en
trébol, el péptido estando caracterizado por estar en forma
dimérica.
Como se ha indicado anteriormente, se cree que
los péptidos trébol contribuyen a la cicatrización de úlceras
pépticas y otras lesiones mucosas por la estabilización de la capa
mucosa del tracto intestinal. El mecanismo de esta estabilización
es hasta ahora desconocido. No obstante, la estructura de rayos X
del polipéptido espasmolítico pancreático porcino (PSP) (ver Gajhede
et al., 1993), que tiene dos dominios en trébol, muestra que
la mayoría de residuos conservados contribuyen a una fisura, de
8-10 \ring{A} de ancho, que se encuentra en cada
uno de los dominios en trébol. Los experimentos de acoplamiento
preliminares han demostrado que la fisura podría alojar parte de una
cadena oligosacárida, por ejemplo el carbohidrato fijado a una
glicoproteína de mucina. Si éste es el caso, la PSP con dos fisuras
de este tipo puede entrecruzar mucinas, ayudándolas a formar un gel
protector sobre el epitelio mucoso. Actualmente no se sabe si los
péptidos trébol con un único dominio en trébol (tal como ITF y pS2)
forman in vivo dímeros para ejercer una función similar, o si
tienen un mecanismo de acción diferente. No obstante, se cree
normalmente que los dímeros de tales péptidos trébol pueden de
hecho entrecruzar mucinas y en consecuencia ser la forma activa de
los péptidos.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método de preparación de un dímero de un péptido
trébol que contiene un único dominio en trébol, el método que
comprende: cultivar una célula huésped adecuada transformada con
una secuencia de ADN que codifica un péptido trébol que contiene un
dominio en trébol bajo condiciones que permiten la producción del
péptido; separar el monómero del péptido trébol resultante y el
dímero del péptido trébol del cultivo por un procedimiento
cromatográfico; y recuperar el dímero del péptido trébol resultante
del
cultivo.
cultivo.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende un dímero de un péptido
trébol que contiene un único dominio en trébol, junto con un
diluyente o vehículo aceptable farmacéutica-
mente.
mente.
En otros aspectos adicionales, la invención se
refiere a un dímero de un péptido trébol que contiene un dominio en
trébol para el uso como un medicamento y para el uso de un dímero
de un péptido trébol que contiene un dominio en trébol para la
preparación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de
trastornos gastrointestinales.
El dímero del péptido trébol puede, en
particular, ser un dímero del factor trébol intestinal (ITF) o un
péptido asociado al cáncer de mama (pS2).
En particular, el péptido trébol es ITF humano.
Cuya secuencia de aminoácidos monomérica es:
- ZEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKP LQEAECTF
donde Z es Glu, Gin o pyrGlu, o pS2 humano, cuya
secuencia de aminoácidos monomérica es:
- ZAQTETCTVAPRERQNCGFPGVTPSQCANKGCCFDDTVRGVPWCFYPNTID VPPEEECEF
donde Z es Glu, GIn o pyrGlu.
En una forma de realización preferida, el dímero
del péptido trébol de la invención tiene un peso molecular
aproximado de 13000. En una forma de realización preferida
adicional, un dímero ITF de la invención está compuesto por dos
monómeros de ITF enlazados por un enlace disulfuro entre dos
residuos de cristeína en la posición 57 de cada monómero. En otra
forma de realización preferida, un dímero de pS2 según la invención
está compuesto por dos monómeros de pS2 enlazados por un enlace
disulfuro entre dos residuos de cisteína en la posición 58 de cada
monómero. El dímero del péptido trébol es preferiblemente producido
por técnicas de ADN recombinante. Con este fin, una secuencia de
ADN que codifica el péptido trébol puede ser aislada preparando un
banco genómico o de cDNA y seleccionando las secuencias de ADN que
codifican para o parte del péptido por hibridación usando sondas de
oligonucleótidos sintéticas conforme a las técnicas estándar (ver
Sambrook et al., Molecular Cloninq: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
York, 1989). Para este objetivo, la secuencia de ADN que codifica
el péptido es preferiblemente de origen humano, es decir derivada de
un banco de ADN genómico o de ADNc humano.
La secuencia de ADN que codifica el péptido
trébol puede también ser preparada sintéticamente por métodos
estándar establecidos, p. ej. el método de fosfoamidita descrito
por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters 22
(1981), 1859-1869, o el método descrito por Mattes
et al., EMBO Journal 3 (1984),
801-805. Según el método de fosfoamidita, los
oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en un sintetizador de ADN
automático, purificado, recocido, ligado y clonado en vectores
adecuados.
La secuencia de ADN puede también ser preparada
por la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores
específicos, por ejemplo como se describe en US 4.683.202, Saiki
et al., Science 239 (1988),
487-491, o Sambrook et al.,
supra.
La secuencia de ADN que codifica el péptido
trébol es normalmente insertada en un vector recombinante que puede
ser cualquier vector que puede convenientemente ser sometido a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector
frecuentemente dependerá de la célula huésped en la que se
introduzca. Así, el vector puede ser un vector de replicación
autónoma, es decir un vector que existe como una entidad
extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma alternativa,
el vector puede ser uno que al introducirse en una célula huésped,
se integre en el genoma de la célula huésped y se replique con
el(los) cromosoma(s)
en el(los) que se ha integrado.
en el(los) que se ha integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión donde la secuencia de ADN que codifica el péptido trébol
está operativamente enlazada a segmentos adicionales requeridos
para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión
está derivado de ADN plásmido o vírico, o puede contener elementos
de ambos. El término, "enlazado operativamente" indica que los
segmentos están dispuestos de modo que funcionan con respecto a los
objetivos a los que están destinados, p. ej. la transcripción se
inicia en un promotor y continúa a través de la secuencia de ADN
que codifica para el polipéptido.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN
que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de
elección y puede derivar de proteínas que codifican genes homólogos
o heterólogos a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción del ADN que codifica el péptido trébol en células
mamíferas son el promotor SV40 (Subramani et al., Mol.
Cell Biol. 1 (1981), 854-864), el
promotor MT-1 (gen de la metalotioneina) (Palmiter
et al., Science 222 (1983),
809-814) o el promotor tardío mayor del adenovirus
2.
Un ejemplo de un promotor adecuado para el uso
en células de insecto es el promotor de polihedrina (US 4.745.051;
Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992)
7-11), el promotor P10 (J.M. Vlak et al.,
J. Gen. Virologv 69, 1988, pp.
765-776), el promotor de la proteína básica del
virus de la polihedrosis Autographa californica (EP 397
485), el promotor del gen 1 temprano inmediato del baculovirus (US
5.155.037; US 5.162.222), o el promotor del gen temprano retardado
39K del baculovirus (US 5.155.037; US 5.162.222).
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes de la levadura incluyen promotores de genes
glicolíticos de levadura (Hitzeman et al., J. Biol.
Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber y
Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982),
419-434) o genes de la
alcohol-deshidrogenasa (Young et al., en
Genetic Enqineerinq of Microorqanisms for Chemicals
(Hollaender et al, eds.), Plenum Press, New York, 1982), o
los promotores TPI1 (US 4.599.311) o
ADH2-4c (Russell et al., Nature
304 (1983), 652-654).
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes del hongo filamentoso son, por ejemplo, el
promotor ADH3 (McKnight et al., The EMBO J.
4 (1985), 2093-2099) o el promotor
tpiA. Ejemplos de otros promotores útiles son los derivados
del gen que codifica la amilasa TAKA de A. oryzae, la
proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la
\alpha-amilasa neutra de A. Níger, la
\alpha-amilasa estable en ácido de A.
Niger, la glucoamilasa de A. Níger o A. awamori
(gluA), la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina
de A. oryzrre, la triosa fosfato isomerasa de A.
oryzae o la acetamidasa de A. nidulans. Son preferidos
los promotores de TAKA-amilasa y de gluA. Los
promotores adecuados están mencionados en, p. ej. EP 238 023 y EP
383 779.
La secuencia de ADN que codifica el péptido
trébol puede también, si fuera necesario, conectarse operativamente
a un terminador adecuado, tal como el terminador de la hormona del
crecimiento humana (Palmiter et al., Science 222;1983, págs.
809-814) o (para huéspedes micóticos) los
terminadores TPI1 (Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1.
1982, págs. 419-434) o ADH3 (McKnight et
al., The EMBO J. 4; 1985, págs.
2093-2099). El vector puede además comprender
elementos tales como señales de la poliadenilación (p. ej. de SV40 o
de la región Elb del adenovirus 5), secuencias potenciadoras
transcripcionales (p. ej. el potenciador SV40) y secuencias
potenciadoras traduccionales (p. ej. aquellas que codifican los
ARNs del adenovirus VA).
El vector recombinante puede además; comprender
una secuencia de ADN que permite que el vector se replique en la
célula huésped en cuestión. Un ejemplo de esta secuencia (cuando la
célula huésped es una célula mamífera) es el origen SV40 de la
replicación.
Cuando la célula huésped es una célula de
levadura, las secuencias adecuadas que permiten que el vector se
replique son el plásmido de levadura 2p, los genes de replicación
REP 1-3 y el origen de replicación.
El vector puede también comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto implementa un defecto en
la célula huésped, tal como el gen que codifica para la
dihidrofolato-reductasa (DHFR) o el gen TPI de
Schizosaccharomyces pombe (descrito por P.R. Russell, Gene
40; 1985, págs. 125-130), o uno que confiere
resistencia a los fármacos, como p. ej. ampicilina, canamicina,
tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina o metotrexato.
Para hongos filamentosos, los marcadores que se pueden seleccionar
incluyen amdS, pyrG argB, niaD o sC.
Para dirigir un péptido trébol de la presente
invención en la vía secretora de las células huéspedes, una
secuencia señal secretora (también conocida como una secuencia
líder, secuencia prepro o secuencia pre) puede ser proporcionada en
el vector recombinante. La secuencia señal secretora se une a la
secuencia de ADN que codifica el péptido trébol en el marco de
lectura correcto. Las secuencias señal secretoras de forma común se
posicionan en 5' para la secuencia de ADN que codifica el péptido.
La secuencia señal secretora puede ser aquella normalmente asociada
con el péptido o puede provenir de un gen que codifica otra
proteína segregada.
Para la secreción a partir de células de
levadura, la secuencia señal secretora puede codificar cualquier
péptido señal que asegure una dirección eficaz del péptido trébol
expresado en el vehículo secretor de la célula. El péptido señal
puede ser un péptido señal producido de forma natural, o una parte
funcional del mismo, o bien puede ser un péptido sintético. Se ha
encontrado que los péptidos señal adecuados son el péptido señal
del \alpha-factor (ver US 4.870.008), el péptido
señal de la amilasa salival del ratón (ver O. Hagenbuchle et
al., Nature 289; 1981, págs.
643-646), un péptido señal de la carboxipeptidasa
modificada (ver L.A. Valls et al., Cell
48;1987, págs. 887-897), el péptido señal
BAR1 de levadura (ver WO 87/02670), o el péptido señal de la
proteasa aspártica 3 (YAP3) de levadura (ver M.
Egel-Mitani et al., Yeast 6;
1990, págs. 127-137).
Para una secreción eficaz en levadura, una
secuencia que codifica un péptido líder puede también ser insertada
debajo de la secuencia señal y encima de la secuencia de ADN que
codifica el péptido trébol. La función del péptido líder es la de
permitir que el péptido expresado se dirija desde el retículo
endoplásmico hasta el aparato de Golgi y después a una vesícula
secretora para la secreción en el medio de cultivo (es decir,
exportación del péptido trébol a través de la pared celular o al
menos a través de la membrana celular en el espacio periplásmico de
la célula de levadura). El péptido líder puede ser el péptido líder
del \alpha-factor de levadura (cuyo uso está
descrito p. ej. en US 4.546.082, US 4.870.008, EP 16 201, EP 123
294, EP 123 544 y EP 163 529). De forma alternativa, el péptido
líder puede ser un péptido líder sintético, es decir, un péptido
líder no encontrado en la naturaleza. Los péptidos líder sintéticos
pueden, por ejemplo, ser construidos como se describe en WO
89/02463 o WO 92/11378.
Para el uso en hongos filamentosos, el péptido
señal puede convenientemente derivar de un gen que codifica una
amilasa o glucoamilasa de Aspergillus sp., un gen que
codifica una lipasa o proteasa de Rhizomucor miehei o una
lipasa de Humicola lanuginosa. El péptido señal está
preferiblemente derivado de un gen que codifica la TAKA amilasa de
A. oryzae, la \alpha-amilasa neutra de
A. Niger, la amilasa estable en ácido de A. Niger, o
la glucoamilasa de A. Niger. Los péptidos señal adecuados
están descritos en, p. ej. EP 238 023 y EP 215 594.
Para el uso en células de insecto, el péptido
señal puede convenientemente derivar de un gen de insecto (ver WO
90/05783), tal como el péptido señal precursor de la hormona
adipocinética de Manduca sexta de lepidóptero (ver US
5.023.328).
Los procedimientos usados para enlazar la
codificación de secuencias de ADN para el péptido trébol, el
promotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia señal
secretora, respectivamente, y para insertarlos en vectores
adecuados conteniendo la información necesaria para la replicación,
son bien conocidos por los expertos en la materia (ver, por
ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloninq: A Laboratorv
Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
La célula huésped donde se introduce la
secuencia de ADN que codifica el péptido trébol puede ser cualquier
célula que sea capaz de producir el péptido en forma dimérica e
incluye la levadura, hongos y células eucarióticas superiores.
Ejemplos de líneas celulares mamíferas adecuadas
son las líneas celulares COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632,
ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL39) o CHO (ATCC CCL 61). Los métodos de
transfección de células mamíferas y de expresión de secuencias de
ADN introducidas en las células están descritos en p. ej. Kaufman y
Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982),
601-621; Southern and Berg, J. Mol. Appl.
Genet, 1 (1982), 327-341; Loyter et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982),
422-426; Wigler et al., Cell 14
(1978), 725; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981),
603, Graham y van der Eb, Virologv 52 (1973), 456; y
Neumann et al., EMBO J. 1 (1982),
841-845.
Ejemplos de células de levaduras adecuadas
incluyen células de Saccharomyces spp. o
Schizosaccharomyces spp., en particular cepas de
Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces kluyveri. Los
métodos para transformar células de levadura con ADN heterólogo y
producir polipéptidos heterólogos a partir de éstas están descritos,
p. ej. en US 4.599.311, US 4.931.373, US 4.870.008;5.037.743, y US
4.845.075. Las células transformadas son seleccionadas por un
fenotipo determinado por un marcador seleccionable, de forma común
por una resistencia a fármacos o por la capacidad para crecer en
ausencia de un nutriente particular, p. ej. la leucina. Un vector
preferido para el uso en levadura es el vector POT1 descrito en US
4.931.373. La secuencia de ADN que codifica el péptido trébol puede
ser precedida por una secuencia señal y opcionalmente una secuencia
líder, p. ej. conforme al modo descrito anteriormente. Otros
ejemplos de células de levadura adecuadas son cepas de
Kluyveromices, tales como K. lacris, Hansenula, p. ej.
H. polimorfa, o Pichia, p. ej. P. pastoris (ver
Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132; 1986,
págs. 3459-3465; US 4.882.279).
Ejemplos de otras células micóticas son células
de hongos filamentosos, p. ej. Aspergillus spp.,
Neurospora spp., Fusarium spp. o Trichoderma
spp., en particular cepas de A. oryzae, A. nidulans o
A. Níger. El uso de Aspergillus spp. para la
expresión de proteínas está descrito en, p. ej., EP 272 277, EP 238
023, EP 184 438. La transformación de F. oxysporum puede,
por ejemplo, efectuarse según se describe por Malardier et
al., 1989, Gene 78: 147-156. La
transformación de Trichoderma spp. puede ser realizada por
ejemplo según se describe en EP 244 234.
Cuando un hongo filamentoso se usa como célula
huésped, se puede transformar con el constructo de ADN de la
invención, convenientemente integrando el constructo de ADN en el
cromosoma huésped para obtener una célula huésped recombinante.
Esta integración está generalmente considerada una ventaja puesto
que la secuencia de ADN es más propensa a mantenerse de forma
estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el
cromosoma huésped puede ser realizada según los métodos
convencionales, p. ej. por recombinación homóloga o heteróloga.
La transformación de células de insecto y la
producción de polipéptidos heterólogos en su interior puede
realizarse según se describe en US 4.745.051; US 4.879.236; US
5.155.037; 5.162.222; EP 397.485. La línea celular del insecto
usado como huésped puede de manera adecuada ser una línea celular de
lepidópteros, tal como células de Spodoptera frigiperda o
células de Trichoplusia ni (ver US 5.077.214). Las
condiciones de cultivo pueden ser de manera adecuada como las que se
describe en, por ejemplo, WO 89/01029 o WO 89/01028, o cualquiera
de las referencias mencionadas.
La célula huésped transformada o modificada
anteriormente descrita es luego cultivada en un medio nutritivo
adecuado bajo condiciones que permiten la expresión del péptido
trébol, tras lo cual todo o parte del péptido resultante puede ser
recuperado del cultivo en forma dimérica. El medio usado para
cultivar las células puede ser cualquier medio convencional
adecuado para crecer las células huésped, tal como medios mínimos o
complejos que contienen suplementos apropiados. Unos medios
adecuados están disponibles por proveedores comerciales o pueden
ser preparados según recetas publicadas (p. ej. en catálogos de la
American Type Culture Collection). El péptido trébol producido por
las células puede luego ser recuperado del medio de cultivo por
procedimientos convencionales, incluyendo la separación de las
células huésped del medio por centrifugado o filtración, la
precipitación de los componentes proteínicos del sobrenadante o
producto filtrado mediante una sal, p. ej. sulfato de amonio, la
purificación por una variedad de procedimientos cromatográficos, p.
ej. la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía por
filtración en gel, la cromatografía de afinidad, o similar,
dependiendo del tipo de polipéptido en cuestión. En un método de la
invención para preparar un dímero del péptido trébol según la
invención, el monómero del péptido trébol y el dímero del péptido
trébol del cultivo son separados por un procedimiento
cromatográfico, a partir del cual se recupera el dímero.
En la composición farmacéutica de la invención,
el dímero del péptido trébol puede ser formulado por cualquiera de
los métodos establecidos de formulación de composiciones
farmacéuticas, p. ej. como se describe en Reminqton's
Pharmaceutical Sciences. 1985. La composición puede estar en una
forma adecuada para la inyección sistémica o infusión y puede, como
tal, ser formulada con agua estéril o una solución salina isotónica
o solución de glucosa. Las composiciones pueden ser esterilizadas
por técnicas de esterilización convencionales que son bien
conocidas en la técnica. Las soluciones acuosas resultantes pueden
ser envasadas para el uso o filtradas bajo condiciones asépticas y
liofilizadas, la preparación liofilizada siendo combinada con la
solución acuosa estéril antes de la administración. La composición
puede contener sustancias auxiliares aceptables farmacéuticamente
según se requiera para aproximarse a condiciones fisiológicas, tales
como agentes tampón, agentes reguladores de la tonicidad y
similares, por ejemplo acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro
de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc.
La composición farmacéutica de la presente
invención puede también ser de administración nasal, transdérmica o
rectal. El vehículo aceptable farmacéuticamente o diluyente
empleado en la composición puede ser cualquier portador sólido
convencional. Ejemplos de portadores sólidos son lactosa, terra
alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de
magnesio y ácido esteárico. De forma similar, el vehículo o
diluyente puede incluir cualquier material de liberación sostenida
conocido en la técnica, tal como gliceril monoestearato o gliceril
diestearato, sólo o mezclado con una cera. La cantidad de un
portador sólido variará mucho, pero normalmente será de
aproximadamente 25 mg a aproximadamente 1 g.
La concentración del dímero del péptido trébol
en la composición puede variar mucho, es decir de aproximadamente
el 5% a aproximadamente el 100% en peso. Una concentración
preferida está en la gama de 50-100% en peso. Una
dosis unitaria de la composición puede normalmente contener de
aproximadamente 1 mg a aproximadamente 200 mg, preferiblemente de
aproximadamente 25 mg a aproximadamente 75 mg, en particular
aproximadamente 50 mg, del dímero.
Como se ha indicado anteriormente, se cree que
el dímero del péptido trébol de la invención es la forma activa del
péptido. Por ello se contempla como ventajoso para el uso para la
prevención o tratamiento de trastornos gastrointestinales. Más
específicamente, se contempla para el uso en el tratamiento de
úlceras gástricas o pépticas, enfermedad del intestino inflamatorio,
enfermedad de Crohn o lesiones en el tracto intestinal provocadas
por una terapia de radiación, bacterias u otras infecciones. La
dosificación del polipéptido administrada a un paciente variará con
el tipo y gravedad de la enfermedad por tratar, pero está
generalmente en la gama de 0.1-1.0 mg/kg de masa
corporal. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un
dímero del péptido trébol de la invención para la preparación de un
medicamento para la profilaxis o tratamiento de trastornos
gastrointestinales, tal como alguno de los trastornos recién
mencionados.
La presente invención está descrita con más
detalle en el ejemplo con referencia a los dibujos anexos, que son
los siguientes:
Fig. 1 Estructura propuesta del factor trébol
intestinal ITF humano. La secuencia de aminoácidos primaria está
tomada de Hauser et al., 1993, y los enlaces disulfuro están
puestos en homología con PSP y pS2 (Thim, 1988).
Fig. 2 HPLC de fase inversa en una columna Vydac
214TP54 de sobrenadante de la cepa HW756 de levadura que expresa
ITF de rata.
Fig. 3 Cromatografía de intercambio iónico en
una columna Fast Flow SP- Sepharose de ITF humano parcialmente
purificado. La cantidad de hITF (monómero) y de hITF (dímero)
fueron determinados por HPLC analítica. Las barras indican las
fracciones agrupadas para una purificación adicional de las formas
monoméricas y diméricas. La línea discontinua muestra la
concentración de NaCl en el solvente de elución.
Fig. 4 HPLC de fase inversa en una columna Vydac
214TP54 C4 de ITF de rata purificado, dímero (A), ITF humano
(monómero) B, e ITF humano (dímero C). Las líneas discontinuas
muestran la concentración de acetonitrilo en el solvente de
elución.
Fig. 5 Espectros de la masa reconstruida de ITF
de rata purificado (dímero) (A), ITF humano (monómero) (B) e ITF
humano (dímero)(C).
Fig. 6 Estructura de la forma dimérica de ITF
humano.
Fig. 7 Mapa de restricción del plásmido KFN
1003.
Fig. 8 Construcción del plásmido pHW756.
Fig. 9 Construcción del plásmido pHW1066.
La donación de rata e ITF humano se efectuó como
se describe en WO 92/14837 y como se describe por Suemori et
al., 1991, y Chinery et al., 1992 (ITF de rata), y
Podolsky et al., 1993, y Hauser et al., 1993 (ITF
humano).
Los plásmidos de expresión pHW756 para la
secreción del ITF de rata y pHW1066 para la secreción de ITF humano
fueron construidos como se destaca en la Fig. 7-9.
El vector de expresión de levadura pKFN1003 (descrito en WO
90/10075) es un derivado del plásmido CPOT (Kawasaki, G.
International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology,
Sept.17-24, 1984, Edinburgh, Scotland, Abstr.
P15.). Tiene el gen TPI de Schizosaccharomyces pombe (POT)
como marcador de la selección (Russell, P.R., Gene 40
(1985), 125-130), y promotor y terminador de la
triosa fosfato isomerasa (TPI) de S. cerevisiae para el
control de la expresión (Alber, T. y Kawasaki, G. J. Mol. Appl.
Genet. 1 (1982), 419-434).
El gen ITF de rata fue inicialmente clonado en
Bluescript. II KS(-) (Stratagene), a partir del cual se propagó
según la Fig. 8. El vector auxiliar pSX54 que proporciona lugares
de clonación útiles, está compuesto de pUC18 y pDN1050
(Diderichsen, B., Poulsen, G.B., J\diameterrgensen, S.T.
Plasmid 30 (1993), 312-315). El
ligador de ADN sintético NcoI-Pf1M1 tiene la
secuencia siguiente:
El ligador codifica para 8 aminoácidos
C-terminales de la secuencia líder como se describe
en Thim, L., Norris, K., Norris, F., Nielsen, P.F., Bjørn. S.,
Christensen, M., Petersen, J. FEBS Lett. 318, (1993),
345-352, con algunos cambios en el codón de
elección, y la parte N-terminal del gen ITF de rata:
QEFVGLSPSQC. La secuencia de aminoácidos señal y líder es tal y
como se describe ibid.:
- MKAVFLVLSLIGFCWAQPVTGDESSVEIPEESLIIAENTTLANVAMAERLEKR.
El gen ITF humano fue clonado en PUC19 y
propagado como se describe en la Fig. 9. El ligador de ADN
sintético NcoI-BsaAI tiene la secuencia
siguiente:
| 2292: | 5'-CATGGCTGAAAGATTGGAAAAGAGAGAAGAATAC-3' | 34 bp |
| 2287: | 5'-GTATTCTTCTCTCTTTTCCAATCTTTCAGC-3' | 30 bp |
El ligador codifica para los 8 aminoácidos
C-terminales de la secuencia líder como se describe
para la construcción de rITF y para los 3 aminoácidos
N-terminales del gen hITF: EEY. La secuencia señal y
líder son las mismas que antes.
Los plásmidos de expresión fueron transformados
en la cepa MT 663 de S. cerevisiae (E2-7B X
El 1-36 a/\alpha, \Deltatpi/\Deltatpi, pep
4-3/pep 4-3) mediante la selección
para el crecimiento en glucosa como única fuente de carbono.
Los transformantes de levadura que expresan el
ITF de rata y humano fueron denominados HW756 y HW1066,
respectivamente.
Los transformantes anteriormente descritos
fueron cultivados a 30ºC durante 72 h en un medio de peptona
dextrosa de levadura (YPD) (Sherman et al., 1981)
suministrado con extracto de levadura adicional (60 Gramos/L). Los
valores de OD a 660 nm de 153 y 232 para HVV756 (rITF) y HW1066
(hITF), respectivamente, fueron alcanzados al final de las
fermentaciones. El pH fue ajustado a 2.5 con 1M de ácido fosfórico
al final de la fermentación, y las células de la levadura fueron
eliminadas por centrifugado a 3000 rpm durante 15 min.
La concentración de rITF en el caldo de
fermentación de levadura y las fracciones obtenidas durante la
purificación fueron medidas por HPLC analítica. Las partes
alícuotas (normalmente 50-200 \muL) fueron
inyectadas sobre una columna de fase inversa C4 HPLC Vydac 214TP54
(0.46 X 25 cM) equilibrada a 30ºC a un nivel de flujo de 1.5
ml/min. con el 0.1% (v/v) de TFA en el 15% (v/v) de acetonitrilo.
Después de 10 min de elución isocrática, la concentración de
acetonitrilo en el solvente de elución aumentó al 55% tras 40 min.
La absorbancia fue medida a 214 nm. Se encontró que tres picos de
elución a 26.5 min., 27.3 min. y 28.2 min. (Fig. 2) representaban
formas dímericas de rITF. Los péptidos fueron cuantificados usando
un hSP calibrado estándar (Thim et al., 1993). El nivel de
expresión para ITF de rata recombinante en el sistema de levadura
presente fue 113 mg/l.
De un fermentador de 10 L, 8.7 L de caldo de
fermentación fue aislado por centrifugado. El sobrenadante fue
diluido con 14.8 L de agua destilada para reducir la conductividad.
La muestra fue bombeada en una columna Fast Flow
S-Sepharose (Pharmacia) (5 x 42 cM) con un nivel de
flujo de 600 mL/h. Antes de la aplicación, la columna fue
equilibrada en 50 mM de tampón del ácido fórmico, pH 3.7. El ITF de
rata fue eluido de la columna por 50 mM de ácido fórmico, pH 3.7
conteniendo 50 mM de NaCl. Las fracciones de 100 mL fueron recogidas
a un nivel de flujo de 600 mUh y analizadas por su contenido en
rITF. Las fracciones de la fase precedente conteniendo rITF fueron
agrupadas (2.3 L) y bombeadas en una columna (5 x 10 cM) de
Amberchrome (G-71). Antes de la aplicación, la
columna fue equilibrada en 10 mM de tampón de acetato amónico, pH
4.8, a un nivel de flujo de 0.5 L/h. Después de la aplicación, la
columna fue lavada con 0.5 L de tampón equilibrado y eluida con 10
mM de tampón de acetato amónico pH 4.8 conteniendo el 60% (v/v) de
etanol a un nivel de flujo de 0.1 L/h. Las fracciones de 10 mL
fueron recogidas y agrupadas según su contenido en rITF. La
concentración del etanol en la agrupación fue aumentada del 60%
(V/V) al 87% (V/V) por la adición de 2 volúmenes de etanol (99.9%,
v/v) y el rITF fue precipitado por enfriamiento hasta dar como
resultado una mezcla a menos 25ºC durante 16 h.
El producto precipitado fue recogido por
centrifugado durante 1 h a 10,000 g a -25ºC y fue redisuelto a la
temperatura ambiente en 130 ml de ácido fórmico 20 mN pH 3.0. La
muestra fue bombeada sobre una columna Fast Flow SP- Sepharose
(Pharmacia) (5 X 20 cM) con un nivel de flujo de 50 mL/h. Antes de
la aplicación, la columna fue equilibrada con 20 mM de ácido
fórmico, pH 3.0. Los péptidos fueron eluidos de la columna por un
gradiente lineal entre 1.5 L de 50 mM de ácido fórmico, pH 3.0 y
1.5 L de ácido fórmico, pH 3.0 conteniendo 0.5 M de NaCl. Las
fracciones (10 mL) fueron recogidas a un nivel de flujo de 80 mUh y
la absorbancia fue medida a 280 nm. Se evaluó el contenido de rITF
de las fracciones. Las fracciones correspondientes a rITF fueron
agrupadas. El ITF de rata fue purificado adicionalmente por HPLC
preparatoria. Las fracciones agrupadas (900 mL) fueron bombeadas
sobre una columna de HPLC preparatoria Vydac 214TP1022 C4 (2.2 X 25
cM) equilibrada al 0.1% (v/v) de TFA. Los péptidos fueron eluidos a
25ºC y a un nivel de flujo de 5 mL/min. con un gradiente lineal
(540 ml) formado a partir de MeCN/H_{2}O/TFA (10:89.9:0.1, v/v/v)
y MeCN/H_{2}O/TFA (65:34.9:0.1, v/v/v). La absorción de UV fue
controlada a 280 nm y las fracciones correspondientes a 10 ml
fueron recogidas y analizadas por su contenido en rITF. Las
fracciones que contenía rITF fueron agrupadas y el volumen fue
reducido al 30% por centrifugado al vacío. De la agrupación
resultante, rITF fue aislado por liofilización. El rendimiento total
de rITF de 8.7 L de medio de fermentación fue 236 mg
correspondiente a un rendimiento de purificación global de 24%.
La concentración de hITF en el caldo de
fermentación de levadura y fracción, obtenida durante la
purificación, fue medida en un sistema de HPLC idéntico a aquél
descrito para rITF. En este sistema, se encontraron dos valores
máximos de la elución a 21.2 min. y 27.1 min. por espectrometría de
masas y análisis de las secuencias para representar una forma
dimérica y monomérica de hITF. El nivel de expresión para ITF
recombinante humano en este sistema de levadura presente fue 90
mg/l.
De un fermentador de 10 L, 8.0 L de caldo de
fermentación fueron aislados por centrifugado. La muestra fue
dializada 3 veces (cada 24 h) contra 40 L de 10 mM de ácido
fórmico, pH 2.5. La muestra fue bombeada (0.25 L/H) sobre una
columna SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) (5 X 40
cM). La columna fue lavada con 5 L de 20 mM de ácido fórmico, pH
2.5, y eluido con un gradiente lineal formado por 5 L de 20 mM de
ácido fórmico, pH 2.5 y 5 L de ácido fórmico, pH 2.5 conteniendo 1
M de NaCl. Las fracciones de 100 ml fueron recogidas y analizadas
por su contenido en hITF (Fig. 3). Dos formas de hITF fueron eluidas
de la columna: una representando una forma monómerica de hITF
(elución a 0.5 M de NaCl) y una representando una forma dimérica de
hITF (elución a 0.78 M de NaCl). La fracción correspondiente a las
dos formas fueron agrupadas por separado.
Cada fracción fue dividida en tres partes
iguales (volumen: aprox. 700 mL) y bombeada sobre una columna Vydac
214TP1022 C4 (2.2 x 25 cM) equilibrada en 0.1% (v/v) de TFA. Los
péptidos fueron eluidos a un nivel de flujo de 4 mL/min. con un
gradiente lineal (540 ml) entre MeCN/H_{2}O/TFA (10:89.9:0.1,
v/v/v) y MeCN/H_{2}O/TFA (65:34.9:0.1, v/v/v). La absorción de UV
fue controlada a 280 nm y las fracciones correspondientes a 10 mL
fueron recogidas y analizadas por su contenido en hITF.
La fracción de la fase precedente que contenía
hITF (monómero) y hITF (dímero) fueron agrupadas por separado y el
pH fue ajustado a 3.0. Las muestras fueron aplicadas por separado
sobre una columna SP-Sepharose HiLoad 16/10
(Pharmacia) (1.6 x 10 cM) equilibrada en 20 mM de ácido fórmico, pH
3.0 conteniendo 40% (v/v) de etanol. La columna fue lavada con 80
mL de tampón de equilibrado y eluida a un nivel de flujo de 4
mL/min. con un gradiente lineal entre 200 mL de 20 mM de ácido
fórmico, pH 3.0; 40% (v/v) de etanol y 200 mL de 20 mM de ácido
fórmico, pH 3.0;40% (v/v) conteniendo 1 M de NaCl. Las fracciones
(5 ml) fueron recogidas y analizadas por su contenido en hITF.
Las facciones que contenían hITF (monómero) y
hITF (dímero), respectivamente, fueron agrupadas y el contenido
peptídico precipitado para ajustar la concentración del etanol al
90% (v/v) y se enfrió la mezcla durante 72 h a -25ºC. El producto
precipitado fue recogido por centrifugado y liofilizado. El
rendimiento total de 8L de caldo de fermentación fue 256 mg de hITF
(monómero) y 133 mg de hITF (dímero) correspondiente a un
rendimiento de la purificación global del 50% y del 65%,
respectivamente, para las formas monoméricas y diméricas.
Después de la hidrólisis en 6 M de HCl a 110ºC
en tubos sellados al vacío durante 24, 48 y 96 h, las muestras (50
\mug) fueron analizadas en un analizador de aminoácidos
automático Beckman (Modelo 121 MB). Media-cistina
fue determinada como el derivado de
S-\beta-(4-piridiletil), después
de la reducción de los enlaces disulfuro por tributilfosfina (Rüegg
& Rudinger, 1974), seguidos del acoplamiento con
4-vinilpiridina (Friedman et al., 1970). La
hidrólisis de muestras tratadas con 4-vinilpiridina
fueron realizadas por 4 M de ácido metanosulfónico o 3 M de ácido
mercaptoetanosulfónico a 110ºC durante 24 h según el modo descrito
anteriormente. El análisis de la secuencia de aminoácidos fue
determinado por degradación de Edman automatizada usando un
secuenciador de fase gaseosa de Applied Biosystems Modelo 470A
(Thim et al., 1987).
El análisis de espectrometría de masas fue
realizado usando un sistema API III LC/MS/MS (Sciex, Thornhill,
Ont., Canadá). El instrumento cuadrúpolo triple tiene una gama
masa-por-carga (m/Z) de 2400 y se
ajusta con una interfaz de electrospray asistida neumáticamente
(también denominada ion-spray) (Bruins et
al.; 1987; Covey et al., 1988). La introducción de la
muestra fue realizada por una bomba de infusión con jeringa (Sage
Instruments, Cambridge, MA) a través de un capilar fundido (75
\muM i.d.) con un índice de flujo líquido establecido en 0.5- 1
\muL/min. La escala m/z del instrumento fue calibrada con los
iones del aducto de amonio cargados individualmente de
polipropilenglicoles (PPGs) bajo resolución de la unidad. La
exactitud de las mediciones de las masas es generalmente mejor que
el 0.02%.
La Fig. 4 muestra los cromatogramas de la HPLC
analítica obtenidos en el rITF purificado (Fig. 4A) y hITF (Fig. 4B
y 4C). El rITF recombinante contiene una mezcla de 3 péptidos muy
relacionados, y no se intentó separar estas formas. Cuando se
analizó por espectrometría de masas mediante electrospray, tres
pesos moleculares dominantes fueron encontrados correspondientes a:
13112.2, 13096.6 y 13078.8 (Fig. 5A). El peso molecular calculado
de ITF de rata en una forma monomérica donde Cys-57
contiene un grupo -SH libre es de 6558.3. El peso molecular
calculado de ITF de rata en una forma dimérica (p. ej. un puente
S-S está establecido entre dos
Cys-57) es de 13114.6. De los pesos moleculares
encontrados para el ITF de rata recombinante está claro que los tres
péptidos representan formas diméricas de rITF. En otros péptidos
trébol donde el residuo aminoácido N-terminal es
GIn, p. ej. PSP (Thim et al., 1985 y Tomasetto et al.,
1990) se sabe que este residuo tiene una tendencia a ciclizarse
para formar un ácido carboxílico de pirrolidona (pyrGlu). En el
caso del ITF de rata que tiene una secuencia
N-terminal predicha de
Gln-Glu-Phe-Val-Gly,
parece razonable constatar que el GIn N-terminal
podría también ciclizarse para formar pyrGlu. Tal derivatización
supondrá una reducción en el peso molecular del ITF de rata
(dímero) en 17 (un pyrGlu) o 34 (dos pyrGlu) unidades de masa,
respectivamente. Los pesos moleculares observados en 13096.6 y
13078.8 (Fig. 5A) corresponden a la forma dimérica de ITF de rata
donde uno, respectivamente dos, residuos Gln
N-terminales se ha ciclizado. El peso molecular
calculado de estas formas son 13097.6 y 13080.6 estando bien de
acuerdo con los valores determinados experimentalmente. Así a
partir de la HPLC (Fig. 4A) y del análisis de masas (Fig. 5A) se
concluye que el ITF de rata recombinante consiste en 3 formas
diméricas diferentes: una que contiene 2 Gln
N-terminales, una que contiene 1 Gln N- terminal y 1
pyrGlu N-terminal y una que contiene 2 pyrGlu
N-terminales. La tabla 1 muestra la composición de
aminoácidos de ITF de rata estando bien de acuerdo con los valores
previstos.
Las Figs. 5A y 5B muestran la pureza de hITF
(monómero) y hITF (dímero), respectivamente según se ha analizado
por HPLC analítica. La forma dimérica (Fig. 5C) parece
relativamente pura mientras que la forma monomérica (Fig. 5B)
parece estar contaminada por el material que se eluye delante del
péptido. No obstante, con la recromatografía del material que se
eluye del valor máximo principal, se obtuvo un cromatograma similar
(resultados no mostrados). Este parece indicar un comportamiento
atípico del hITF (monómero) en columnas de fase inversa mejor que
impurezas. Hemos observado previamente un comportamiento similar de
PSP porcina altamente purificada así como hSP recombinante
altamente purificado (Thim et al., 1993).
El análisis de espectrometría de masas del hITF
(monómero) muestra un peso molecular del valor máximo dominante
correspondiente a 6694.0 (Fig. 5B). El peso molecular, según se ha
calculado a partir de la secuencia de aminoácidos (Fig. 1), es
6574.4 asumiendo que Cys-57 existe en forma -SH. El
análisis de la secuencia de aminoácidos (tabla II) muestra la
secuencia N-terminal prevista de
Glu-Glu-Tyr-Val-Gly-.
El análisis de la composición de aminoácidos (tabla 1) muestra los
valores previstos salvo la presencia de 7.3 (8) cisteínas. Una
cisteína adicional enlazada a Cys-57 del monómero
hITF aumentará el peso molecular a 6694.7 estando muy cerca del
valor determinado por espectrometría de masas (6694.0). En
consecuencia, se constata que en el hITF (monómero),
Cys-57 está enlazado con disulfuro a una cisteína
adicional. El valor máximo del peso molecular inferior en el
espectro de masas (Fig. 5B) puede representar otro derivado de
Cys-57 o puede ser una impureza en la
preparación.
El peso molecular calculado de hITF (dímero),
donde dos monómeros están enlazados por un enlace disulfuro entre
dos residuos Cys-57, es 13146.8. Este está bien de
acuerdo con el valor determinado por espectrometría de masas
(13147, Fig. 5C). El otro valor máximo en el espectro de masas
(13169) probablemente representa el aducto de Na^{+} de hITF
(dímero). El análisis de secuencias (tabla 1) al igual que el
análisis de la composición de aminoácidos (tabla II) están también
bien de acuerdo con los valores previstos.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Babyatsky, M.W., Thim, L.,
Podolsky, D.K. (1994) Gastroenterology 106,
A43 (abstract).
Bruins, A.P., Covey, T.R., &
Henion, J.D. (1987) Anal. Chem. 59, 2642-
2646.
Chinery, R., Poulsom, R.,
Rogers, L.A., Jeffery, R.E. Longcroft, J.M.,
Hanby, A.M., & Wright, N.A. (1992)
Biocliem. J. 285, 5-8.
Covey, T.R., Bonner, R.F.,
Shushan, B.L, & Henion, J.D. (1988)
Rapid Commun. Mass. Spectrom. 2,
249-256.
Dignass, A.,
Lynch-Devaney, K., Kindon, H.,
Thim, L., & Podolsky, D.K. (1994) J.
Clin. Invest, (in press).
Friedman, M., Krull, L.H.,
Cavins, J.F. (1970), J. Biol. Chem. 245, 3868-
3871.
Gajhede, M., Petersen, T.N.,
Henriksen, A., Petersen, J.F.W., Dauter, Z.,
Wilson, K.S., & Thim, L. (1993)
Structure 1, 253-262.
Hanby, A.M., Poulsom, R.,
Elia, G., Singh, S., Longcroft, J.M., &
Wright, N.A. (1993) J. Pathol. 169,
355-360.
Hauser, F., & Hoffmann, W.
(1991) J. Biol. Chem.
266,21206-21309.
Hauser, F., Roeben, C., &
Hoffmann, W. (1992a) J. Biol. Chem. 267,
14451-14455.
Hauser, F., & Hoffmann, W.
(1992b) J. Biol. Chem. 267,
24620-24624.
Hauser, F., Poulsom, R.,
Chinery, R., Rogers, L.A., Hanby, A.M.,
Wright, N.A., & Hoffmann, W. (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. 90,6961-6965.
Hoffmann, W. (1988) J. Biol.
Chem. 263, 7686-7690.
Hoffmann, W., & Hauser, F.
(1993) Trends Biochem. Sci. 7,
239-243.
Jakowlew, S.B., Breathnach, R.,
Jeltsch, J.-M., Masiakowski, P., Chambon, P.
(1984) Nucleic Acid Res. 12,
2861-2878.
Lefebvre, O., Wolf, C.,
Kedinger, M., Chenard, M.-P., Tomasetto, C.,
Chambon, P., & Rio, M.C. (1993) J. Cell.
Biol. 122,191-198.
Playford, R.J., Marchbank, T.,
Chinery, R., Evison, R., Pignattelli, M.,
Bolton, R., Thim, L., & Hanby, A.M.
(1994) Gastroenterology (publicado).
Podolsky, D.K.,
Lynch-Devaney, K., Stow, J.L.,
Oates, P., Murgue, B., DeBeaumont, M.,
Sands, B.E., & Makida, Y.R. (1993) J.
Biol Chem. 268, 6694- 6702.
Poulsom, R., Chinery, R.,
Sarraf, C., Lalani, E.-N., Stamp, E.,
Elia, G., Wright, N. (1992)
Gastroenterology 27, 17-28.
Poulsom, R., & Wright, N.A.
(1993) Am. J. Physiol. 265,
G205-G213.
Prud'homme, J.F., Fridlansky, F.,
Le Cunff, M., Atger, M.,
Mercier-Bodart, C., Pichon, M.-F.,
& Milgrom, E. (1985) DNA 4,
11-21.
Rio, M.C., Bellocq, J.P.,
Daniel, J.Y., Tomasetto, C., Lathe, R.,
Chenard, M.P., Batzenschlager, A., &
Chambon, P. (1988) Science 241,
705-708.
Rio., M.-C., Chenard, M.-P.,
Wolf, C., Marcellin, L., Tomasetto, C.,
Lathe, R., Bellocq, J.-P., & Chambon, P.
(1991) Gastroenterology 100,
375-379.
Rüegg, U. Th., & Rudinger, J.
(1974) Isr. J. Chem 12, 391-401.
Sherman, F., Fink, G.R., &
Hicks, J.B. (1981) Methods in yeast genetics, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Suemori, S.,
Lynch-Devaney, K., & Podolsky,
D.K. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88,
11017-11021.
Thim, L., J\diameterrgensen,
K.H., & Jorgensen, K.D. (1982) Regul.
Peptides 3, 221-230.
Thim, L., Thomsen, J.,
Christensen, M., & J\diameterrgensen, K.H.
(1985) Biochem., Biophys. Acta 827,
410-418.
Thim, L., Hansen, M.T.,
Norris, K., Hoegh, I., Boel, E.,
Forstrom, J., Ammerer, G., & Fiil, L.
(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83,
6766-6770.
Thim, L., Hansen, M.T., &
Soerensen, A.R. (1987) FEBS Lett. 212, 307-
312.
Thim, L. (1989) FEBS Lett.
250, 85-90.
Thim, L., Norris, K.,
Norris, F., Nielsen, P.F., Bj\diameterrn,
S.E., Christensen, M., Petersen, J. (1993)
FEBS Lett. 318, 345-352.
Thim, L. (1994) Digestion
55, 353-360.
Tomasetto, C., Rio, M.,
Gautier, C., Wolf, C., Hareuveni, M.,
Chambon, P., & Lathe, R. (1990) EMBO J.
9, 407- 414.
Wright, N.A., Pike, C., &
Elia, G. (1990) Nature 343,
82-85.
Wright, N.A., Poulsom, R.,
Stamp, G., van Norden, S., Sarraf, C.,
Elia, G., Ahnen, D., Jeffery, R.,
Longcroft, J., Pike, C., Rio, M., &
Chambon, P. (1993) Gastroemerology 104,
12-20.
Claims (19)
1. Dímero de péptido trébol
caracterizado por el hecho de que es una forma dimérica de
un monómero del péptido trébol, dicho monómero conteniendo un único
dominio en trébol.
2. Dímero de péptido trébol según la
reivindicación 1 con un peso molecular aproximado de 13000.
3. Dímero de péptido trébol según la
reivindicación 1 que es un dímero del factor trébol intestinal
(ITF).
4. Dímero de péptido trébol según la
reivindicación 1 o 3 que es un dímero de ITF humano.
5. Dímero de péptido trébol según la
reivindicación 3 o 4, donde el dímero de ITF está compuesto por dos
monómeros de ITF enlazados por un enlace disulfuro entre dos
residuos de cisteína en la posición 57 de cada monómero.
6. Dímero de péptido trébol según la
reivindicación 1 que es un dímero del péptido asociado al cáncer de
mama (pS2).
7. Dímero de péptido trébol según la
reivindicación 1 o 6 que es un dímero de pS2 humano.
8. Dímero de péptido trébol según la
reivindicación 6 o 7, donde el dímero de pS2 está compuesto por dos
monómeros de pS2 enlazados por un enlace disulfuro entre dos
residuos de cisteína en la posición 58 de cada monómero.
9. Método para preparar un dímero de péptido
trébol caracterizado por el hecho de que está en una forma
dimérica de un monómero del péptido trébol, dicho monómero
conteniendo un único dominio en trébol, el método
comprendiendo:
- el cultivo de una célula huésped adecuada
transformada con una secuencia de ADN que codifica un monómero del
péptido trébol conteniendo un dominio en trébol bajo condiciones
que permiten la producción del péptido;
- la separación del monómero del péptido trébol
resultante y del dímero del péptido trébol del cultivo por un
procedimiento cromatográfico; y
- la recuperación del dímero del péptido
trébol.
10. Composición farmacéutica que comprende un
dímero del péptido trébol caracterizado por ser una forma
dimérica de un monómero del péptido trébol, dicho monómero
conteniendo un único dominio en trébol, junto con un diluyente o
vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10, que comprende un dímero del péptido trébol según
cualquiera de las reivindicaciones 2-8.
12. Dímero del péptido trébol
caracterizado por ser una forma dimérica de un monómero del
péptido trébol, dicho monómero conteniendo un único dominio en
trébol, para el uso como un medicamento.
13. Dímero del péptido trébol según cualquiera
de las reivindicaciones 2-8 para el uso como
medicamento.
14. Dímero del péptido trébol
caracterizado por ser una forma dimérica de un monómero del
péptido trébol, dicho monómero conteniendo un único dominio en
trébol, para el uso en la profilaxis o tratamiento de trastornos
gastrointestinales.
15. Dímero del péptido trébol según cualquiera
de las reivindicaciones 2-8 para el uso en la
profilaxis o tratamiento de trastornos gastrointestinales.
16. Dímero del péptido trébol según la
reivindicación 14 o 15, donde dicho trastorno gastrointestinal está
seleccionado de:
- úlceras gástricas y pépticas;
- enfermedad del intestino inflamatorio;
- enfermedad de Crohn; y
- lesiones en el tracto intestinal provocadas
por una terapia de radiación, infección bacteriana u otras
infecciones.
17. Uso de un dímero del péptido trébol
caracterizado por ser una forma dimérica de un monómero del
péptido trébol, dicho monómero conteniendo un único dominio en
trébol, para la preparación de un medicamento para la profilaxis o
tratamiento de trastornos gastrointestinales.
18. Uso según la reivindicación 17, donde dicho
dímero del péptido trébol es un dímero del péptido trébol según
cualquiera de las reivindicaciones 2-8.
19. Uso según la reivindicación 17 o 18, donde
dicho trastorno gastrointestinal está seleccionado de:
- úlceras gástricas y pépticas;
- enfermedad del intestino inflamatorio;
- enfermedad de Crohn; y
- lesiones en el tracto intestinal provocadas
por una terapia de radiación, infección bacteriana u otras
infecciones.
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| EP1842858A3 (en) * | 2001-04-24 | 2008-04-02 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for treating oral and esophageal lesions |
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