ES2267141T3 - Tratamiento de una hemoglobinopatia. - Google Patents
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Abstract
SE EXPONEN PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR A UN PACIENTE AL QUE SE LE HA DIAGNOSTICADO UNA HEMOGLOBINOPATIA, CARACTERIZADA POR UNA DISMINUCION DE LA AFINIDAD DE LA HEMOGLOBINA RESPECTO AL OXIGENO. LOS PROCEDIMIENTOS INCLUYEN PROPORCIONAR OXIDO NITRICO GASEOSO Y/O MONOXIDO DE CARBONO PARA (I) INHALACION POR EL PACIENTE, O (II) TRATAMIENTO EX VIVO DE LOS ERITROCITOS DEL PACIENTE. COMO VARIANTE, PUEDE ADMINISTRARSE AL PACIENTE UN COMPUESTO DE LIBERACION DEL OXIDO NITRICO.
Description
Tratamiento de una hemoglobinopatía.
Esta solicitud reivindica la prioridad bajo 35
U.S.C. § 119 de U.S. Nº de Serie 06/014.886, presentada el 5 de
Abril de 1996.
Esta invención se realizó al menos en parte con
fondos del gobierno federal bajo la concesión de USPHS
NHLBI-HL 42397, otorgada por the National
Institutes of Health. Por lo tanto, el gobierno tiene ciertos
derechos en la invención.
El campo de la invención es las
hemoglobinopatías.
Un número de hemoglobinopatías está asociado con
una afinidad disminuida del oxígeno por la hemoglobina (Hb).
Ejemplos de tales hemoglobinopatías incluyen la enfermedad de las
células falciformes (SCD) y el rasgo de las células falciformes;
las talasemias; trastornos de Hb-C,
Hb-D, Hb-E, Hb-H,
Hb-I, Hb-O-Arab y
Hb-Kansas; y combinaciones heterocigóticas mixtas
de cualquiera de estas. Quizá la hemoglobinopatía más extensivamente
estudiada es la enfermedad de las células falciformes (SCD), que
resulta de una mutación en el sexto aminoácido desde el extremo N
de la cadena polipeptídica \beta de la hemoglobina
(Hb-S). Esta mutación reemplaza al aminoácido
cargado negativamente glutamato (codificado por GAG) por un residuo
hidrófobo neutro, valina (codificada por GUG). A concentraciones
fisiológicamente pertinentes (por ejemplo, aproximadamente 0,2
g/cm^{3}) y bajo ciertas condiciones tales como hipoxia, las
moléculas de Hb-S se agregan en polímeros de varias
hebras, formando un gel viscoso o similar a un sólido. Esta
polimerización de Hb-S dentro de los glóbulos rojos
(eritrocitos) distorsiona los eritrocitos en una variedad de
conformaciones anormales, algunas de las cuales se asemejan a
hoces. La polimerización de Hb-S también hace que
los eritrocitos se vuelvan más rígidos, disminuyendo la capacidad
de las células para atravesar los vasos estrechos de la
microvasculatura.
Se dice que los individuos que tienen un gen que
codifica hemoglobina de adulto normal (Hb-A) y uno
que codifica Hb-S tienen rasgo de células
falciformes. Tales heterocigotos raramente sufren síntomas clínicos,
pero, por su puesto, pueden pasar el gen mutante a su descendencia.
Se dice que los individuos que son homocigóticos para
Hb-S o una combinación de Hb-S y
Hb-C tienen enfermedad de células falciformes (SCD);
estos individuos se denominan aquí "SS". Los adultos cuyos
glóbulos rojos contienen hemoglobina normal se denominan aquí
"AA".
Clínicamente, la SCD está asociada con hemolisis
crónica, que puede conducir a anemia e ictericia. La SCD también
está asociada con crisis vasooclusivas episódicas, conocidas como
crisis de células falciformes. Durante tal crisis, la
microvascultura puede ocluirse transitoriamente o permanentemente, y
casi cualquier órgano del cuerpo puede dañarse como resultado del
suministro de oxígeno disminuido. Tal daño a los órganos es la
principal causa de la mortalidad y la morbidez asociadas con la SCD.
El infarto (es decir, necrosis de tejido debida a suministro de
sangre insuficiente) del hueso, el bazo, el riñón y los pulmones es
particularmente común y dará como resultado un dolor intenso que
puede durar varios días.
Métodos convencionales para tratar
hemoglobinopatías tales como SCD incluyen realizar transfusiones
sanguíneas en pacientes anémicos para producir un nivel de
hemoglobina de 10 g/dl y/o alcanzar una concentración de hematocrito
total de 30%. Otros métodos implican usar hidroxiurea para reducir
la formación como hoces de los eritrocitos incrementando el nivel
de hemoglobina fetal (Hb-F) en los eritrocitos
(Charache y otros, 1995, N. Eng. J. Med.
332:1317-1322; Goldberg y otros, 1990, N. Eng. J.
Med. 323:366-372). Usando este método, se necesitan
varias semanas de tratamiento para incrementar el nivel de
Hb-F; por lo tanto, este método no es
particularmente útil para responder a una crisis de células
falciformes. Métodos de tratamiento adicionales incluyen
proporcionar terapias de apoyo, tales como terapia de oxígeno,
analgésicos e hidratación. Tal terapia de apoyo se proporciona al
paciente hasta que la crisis se resuelve, lo que habitualmente lleva
varios días.
Para cualquier hemoglobinopatía dada, la
afinidad de la hemoglobina del paciente por el oxígeno puede medirse
generando una curva de disociación de oxihemoglobina (ODC)
característica de la hemoglobina total del paciente. Esta curva
matemática puede generarse representando el porcentaje de saturación
de oxígeno (S_{a}O_{2}) de la hemoglobina resultante sobre el
eje "y" frente a la presión parcial de oxígeno (P_{a}O_{2})
en mm de Hg a lo largo de un amplio intervalo de presiones de
oxígeno (por ejemplo, de 0 a 100 mm de Hg) sobre el eje "x"
(véase, por ejemplo, Bunn y Forget, Hemoglobin: Molecular
Genetics and Clinical Aspects, 1986, W. B. Saunder, Publisher).
La P_{a}O_{2} a la que se produce la saturación de oxígeno
semimáxima de la hemoglobina total se denomina el valor P_{50}.
La hemoglobina que tiene una capacidad disminuida para unirse a
oxígeno se caracteriza por un desplazamiento hacia la derecha de la
ODC, con relación a la ODC obtenida con hemoglobina de adulto
normal (Hb-A); esto puede expresarse
alternativamente como un incremento en la P_{50}, en comparación
con Hb-A. La hemoglobina normal a 37ºC, PaCO_{2},
40 mm de Hg, pH 7,40 y condiciones isotónicas, tiene una P_{50}
de aproximadamente 26 mm de Hg, mientras que la Hb-S
tiene una P_{50} de aproximadamente 37 mm de Hg. El valor de
P_{50} de una hemoglobina de paciente dada puede medirse
fácilmente mediante un equipo disponible comercialmente, tal como
el analizador de la disociación de oxígeno sanguíneo automático
HEMOX-ANALYZER™ (TCS Medical Products Company,
Huntingdon Valley, PA).
Se ha encontrado ahora que puede usarse óxido
nítrico (NO) y/o monóxido de carbono (CO), o un compuesto que
libera NO, para la fabricación de un gas terapéutico para inhalación
por un paciente que se identifica que tiene cualquier clase
particular de hemoglobinopatías, para el tratamiento de dichas
hemoglobinopatías. Estas hemoglobinopatías, que incluyen no solo
SCD y el rasgo de células falciformes sino también trastornos de
Hb-C, Hb-D, Hb-E,
Hb-H, Hb-I y
Hb-Kansas, y combinaciones de estos y otros mutantes
de \beta-globina (por ejemplo, las
\beta-talasemias) con Hb-S, se
caracterizan por una afinidad reducida de la hemoglobina del
paciente por el oxígeno, en comparación con la afinidad por el
oxígeno presentada por la hemoglobina de adulto normal
(Hb-A). El uso implica proporcionar un gas
terapéutico para la inhalación por el paciente, donde el gas
terapéutico incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de NO
gaseoso. En una variación de este uso, el paciente es tratado con
un gas terapéutico que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz
de una combinación de NO y CO. El tratamiento de la invención
incrementa la afinidad de la hemoglobina del paciente por el
oxígeno, haciéndola funcionar más como Hb-A. Esto
puede cuantificarse, si se desea, midiendo la P_{50} o la ODC de
la hemoglobina del paciente (como hemoglobina libre de células o en
eritrocitos intactos) tanto antes como después de que se administre
el tratamiento. Si la hemoglobinopatía del paciente es SCD, los usos
de la invención tienen el beneficio significativo adicional de
disminuir la tendencia de la Hb-S del paciente a
polimerizarse, y por lo tanto la probabilidad de que los
eritrocitos del paciente tomen forma de hoz. Sin limitarse por
ninguna teoría particular, se apunta que un posible mecanismo por
el que puede funcionar la terapia con NO sería afectando a las
membranas o los canales de las membranas de los glóbulos rojos.
Preferiblemente, el gas terapéutico se
proporciona en ausencia de humo de tabaco e incluye NO en una
concentración de al menos 1 parte por millón (ppm) en un gas inerte
tal como nitrógeno (N_{2}) o helio (He), en aire, en aire
complementado con oxígeno adicional (O_{2}) o en otro gas que
contiene O_{2} (por ejemplo, una mezcla de O_{2}/N_{2} que
contiene de 20% a aproximadamente 99% de oxígeno). Se esperará en
general que la concentración de NO o CO en el gas terapéutico sea
al menos 10 ppm y preferiblemente al menos 20 ó 40 ppm. Dependiendo
del espacio de tiempo que el gas es inhalado en una sesión de
tratamiento dada, concentraciones útiles del NO o CO variarían de 1
a 10.000 ppm (por ejemplo, de 20 a 4000 ppm o de 40 a 2000 ppm). Se
espera que un paciente pueda recibir un beneficio terapéutico de
inhalar continuamente o intermitentemente 20, 40, 80, 100, 160 ó
200 ppm de NO o CO durante períodos de tiempo prolongados. Cuando se
usa CO, la dosis debe controlarse de modo que en general la
carboxi-Hb del paciente no supere 20% de la Hb
total. Alternativamente, el NO o CO podría proporcionarse a una
concentración relativamente alta, tal como 300, 400, 500, 1000, 1500
o incluso 2000 ppm, particularmente cuando el paciente inhala gas
terapéutico durante solo un breve período de tiempo antes de
cambiar de nuevo a aire u oxígeno. Cuando el gas terapéutico incluye
CO, un punto de referencia útil sería usar una concentración de CO
que produjera de 2 a 10% de carboxi-Hb en la sangre
del paciente, según se mide mediante medios convencionales. El gas
terapéutico proporcionado para la inhalación también incluiría
preferiblemente oxígeno (por ejemplo, aproximadamente 20% de
oxígeno, tal como en el aire, y hasta casi 100% de oxígeno).
Para minimizar la formación de niveles
potencialmente peligrosos de NO_{2} y otros óxidos superiores de
NO, particularmente cuando se están empleando concentraciones
relativamente altas de NO, debe minimizarse el tiempo en el que el
oxígeno está en contacto con el NO en el gas terapéutico: el NO debe
almacenarse en ausencia de O_{2} y mezclarse con el gas que
contiene O_{2} poco antes de que la mezcla sea inhalada por el
paciente. En general, esto significa llevar a cabo la mezcladura no
más de aproximadamente 10 minutos (preferiblemente no más de
aproximadamente 5 minutos y aún más preferiblemente no más de
aproximadamente 2 minutos) antes de la inhalación del gas
terapéutico por el paciente. Se recomienda que el gas que contiene
NO y el gas que contiene O_{2} se mezclen inmediatamente antes de
la inhalación, tal como en un aparato de flujo continuo como el
descrito posteriormente. El uso de la invención también puede
incluir verificar la concentración de NO y/o NO_{2} en el gas
terapéutico. Típicamente, el gas terapéutico no incluirá más de 5
ppm de NO_{2} y preferiblemente no más de 1 ppm de NO_{2}, en
el punto en el que es inhalado por el paciente. Si se desea, al
menos una porción de cualquier NO_{2} que se forme en el gas
puede recuperarse exponiendo el gas terapéutico a un eliminador de
NO_{2} antes que el paciente inhale el gas.
Un protocolo de tratamiento típico incluye
proporcionar el gas terapéutico al paciente durante al menos un
período de 5 minutos al día durante al menos 10 días consecutivos,
donde la concentración de NO es de 40 a 240 ppm. Esto puede
repetirse varias veces al día. Otro protocolo de tratamiento
adecuado incluye proporcionar al paciente una dosis relativamente
baja (por ejemplo, de 2 a 160 ppm) de NO en aire u O_{2}/N_{2}
(por ejemplo, O_{2} al 50%) continuamente durante 8 horas o más
(por ejemplo, 24 horas o incluso una semana). Otro protocolo más
incluye proporcionar al paciente una dosis alta (por ejemplo, 1000
ppm) de NO durante un período de tiempo corto (por ejemplo, menos
de 15 segundos) según sea necesario para evitar que los eritrocitos
del paciente tomen forma de hoz, o para mejorar la capacidad de
transporte de oxígeno de la hemoglobina del paciente. Esto podría
efectuarse usando un dispositivo inhalador portátil de varias dosis
equipado con un bote de NO comprimido en un gas inerte tal como
N_{2}, con o sin un tubo de respiración cíclica. Puesto que el
beneficio terapéutico parece ser a largo plazo, se espera que este
tratamiento de dosis alta no necesite repetirse más de una vez por
hora, y quizás no más de una o dos veces a la semana. Generalmente,
el gas terapéutico se proporciona al paciente durante al menos 10
segundos (por ejemplo, suficiente para una o dos respiraciones
profundas) y hasta 1 ó 5 minutos. Puesto que el volumen de sangre de
un adulto es preferiblemente 5 litros y el gasto cardíaco es
preferiblemente 5 litros/minuto, llenar los pulmones con el gas que
contiene NO durante 1 minuto en teoría daría como resultado el
tratamiento de todo el volumen de sangre en circulación (suponiendo
mezcladura completa). Una duración de 5 minutos de tratamiento
probablemente sería un objetivo más realista. El protocolo de
tratamiento óptimo para cualquier paciente individual puede ser
establecido fácilmente por el médico del paciente.
También se describen aquí métodos o usos en los
que el paciente puede tratarse mediante la administración de una
cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto liberador de NO (o
donante de NO). Ejemplos de compuestos liberadores de NO incluyen
S-nitrosotioles tales como
S-nitroso-N-acetilpenicilamina,
S-nitrocisteína y otros descritos en WO 92/17445 y
la Patente de EE.UU. Nº 5.427.797 (incorporadas aquí mediante
referencia); nitroprusiato; nitrosoguanidina; trinitrato de
glicerilo; azida; hidroxilamina; y cualquier compuesto de NONOato,
incluyendo los descritos en las Patentes de EE.UU. Nº 4.954.526 y
5.155.137. Ejemplos de compuestos de NONOato incluyen
dietilamina/NONO, dietilentriamina/NONO y
metilaminohexilmetilamina/NONO (ilustrados en Hanson y otros,
Nitric Oxide, Biochemistry, Molecular Biology, and Therapeutic
Implications, Ignarro y Murad, Ed., Academic Press, Nueva York
(1995)). Un compuesto liberador de NO puede proporcionarse en forma
de polvo o como un líquido (por ejemplo, mezclando el compuesto con
un excipiente biológicamente compatible). El compuesto liberador de
NO puede administrarse al paciente solo o junto con NO gaseoso, CO
gaseoso u otro compuesto liberador de NO. Cuando se administra más
de un compuesto al paciente, los compuestos pueden mezclarse entre
sí o pueden administrarse al paciente secuencialmente. Una
cualquiera, o una combinación, de las siguientes rutas de
administración puede usarse para administrar el compuesto o los
compuestos liberadores de NO al paciente: inyección intravenosa,
inyección intraarterial, aporte transcutáneo, aporte oral e
inhalación (por ejemplo, de un gas, polvo o líquido). La inhalación
es la ruta de administración preferida.
En otra variación más de los métodos o usos
descritos anteriormente, el paciente puede ser tratado poniendo en
contacto una porción de los eritrocitos del paciente ex vivo
o in situ con una cantidad terapéuticamente eficaz de NO y/o
CO gaseoso. Por ejemplo, un aparato oxigenador de membrana
extracorpóreo (ECMO), un aparato de "bypass" cardiopulmonar
(CPB) o un aparato oxigenador intravenoso (IVOX) puede adaptarse
para usar para poner en contacto los eritrocitos del paciente con
NO y/o CO gaseoso (por ejemplo, de 1 a 1.000 ppm en un gas que
contiene oxígeno).
En los casos en los que se identifica que el
paciente tiene SCD o una de las combinaciones de
Hb-S que producen formación de células falciformes,
la invención puede usarse para tratar a un paciente que se
identifica que (i) sufre crisis de células falciformes o (ii) tiene
riesgo de incurrir en una crisis de células falciformes. Por
ejemplo, el paciente puede tener SCD y estar a punto de ser sometido
a cirugía con anestesia general. En tal caso, el paciente se trata
de acuerdo con el uso de la invención durante la cirugía y/o menos
de 1 hora antes y/o después de la cirugía, y durante tanto tiempo
como se considere necesario para evitar la crisis de células
falciformes que a menudo resulta de tal cirugía. Los pacientes que
pueden tratarse con la invención incluyen aquellos con o sin una
enfermedad pulmonar conocida (por ejemplo, asma o hipertensión
pulmonar) además de la hemoglobinopatía.
La afinidad reducida de la hemoglobina del
paciente por el oxígeno puede medirse como un desplazamiento hacia
la derecha en la ODC de la hemoglobina del paciente, con relación a
la ODC obtenida con Hb-A. Alternativamente, la
afinidad reducida de la hemoglobina por el oxígeno puede medirse
como un valor de P_{50} incrementado de la hemoglobina del
paciente, con relación a la P_{50} de Hb-A. Si se
desea, la ODC y/o la P_{50} pueden medirse antes y después de
tratar al paciente para proporcionar una indicación de la eficacia
terapéutica del gas terapéutico, el compuesto liberador de NO o el
tratamiento de eritrocitos ex vivo. Un desplazamiento hacia
la izquierda en la ODC del paciente, o una disminución en la
P_{50} del paciente después del tratamiento, con relación a la
ODC o la P_{50} antes del tratamiento, es una indicación de la
eficacia terapéutica del método. Otra indicación de la eficacia del
tratamiento cuando NO es el gas terapéutico es el grado de
nitrosación de Hb, que puede medirse, por ejemplo, usando el método
de Kon y otros, 1977, J. Toxicol. and Environmental Health
2:1109-1113 (incorporado aquí mediante referencia).
Por ejemplo, un nivel de 0,01% a 25% de nitrosación puede tomarse
como correspondiente a un efecto terapéutico. Alternativamente, o
además, la eficacia del tratamiento puede medirse como una
disminución en el dolor, que puede evaluarse con una puntuación en
escala analógica (es decir, 0-10). Si se desea, el
porcentaje de células con conformación anormal (por ejemplo, con
forma de hoz y deformadas) en la sangre del paciente (con o sin
estrés hipóxico u otro que pudiera esperarse que produjera
formación de células falciformes) puede determinarse antes y después
del tratamiento; una disminución en el porcentaje de células con
conformación anormal después del tratamiento proporciona una
indicación de la eficacia terapéutica del método.
Según se usa aquí, una "hemoglobinopatía"
es un trastorno o una enfermedad provocado por, o asociado con, la
presencia de una hemoglobina anormal en la sangre. Se incluyen
hemoglobinopatías en las que está presente en la sangre una
combinación de hemoglobinas anormales (por ejemplo, enfermedad de
células falciformes/Hb-C). Las hemoglobinopatías
que pueden tratarse de acuerdo con la invención se asocian con una
afinidad reducida de la sangre del paciente por el oxígeno o una
tendencia de los eritrocitos del paciente a tomar forma de hoz bajo
estreses hipóxicos u otros.
Se dice que un paciente que es homocigótico para
Hb-S, la hemoglobina de las células falciformes en
la que el ácido glutámico se substituye por valina en la 6ª
posición de la cadena \beta de Hb-A, tiene
"enfermedad de células falciformes". El "rasgo de células
falciformes" es el homólogo heterocigótico, en el que solo uno
de los genes de Hb-A del paciente se reemplaza por
el gen de Hb-S mutante. Un paciente con rasgo de
células falciformes tiene típicamente de 20 a 45% de
Hb-S y el resto Hb-A. En el estado
homocigótico, 75-100% de la hemoglobina es
Hb-S y el resto de la hemoglobina es hemoglobina
fetal (Hb-F) o Hb-A_{2}, ambas de
las cuales se expresan a partir de loci genéticos diferentes que
Hb-A o Hb-S. La SCD hace que la
totalidad o una porción de los eritrocitos en la sangre periférica
del paciente se conformen anormalmente (por ejemplo, conformación
de hoz o luna) cuando se exponen a ciertas condiciones activadoras
tales como bajo contenido de oxígeno o deshidratación. Un paciente
con SCD ocasionalmente experimentará una "crisis" de células
falciformes, caracterizada por vasooclusión que puede afectar casi
a cualquier órgano del cuerpo. El infarto (es decir, necrosis de
tejido debida a una insuficiencia repentina de suministro
sanguíneo) de hueso, bazo, riñón y pulmones es común y da como
resultado dolor intenso y muerte tisular.
La hemoglobinopatía "Hb-C"
es un estado caracterizado por la substitución de ácido glutámico
por lisina en la 6ª posición de la cadena \beta de
Hb-A. La hemoglobinopatía
"Hb-D" resulta de la substitución de ácido
glutámico por glutamina en la posición 121ª de la cadena \beta de
Hb-A. "Hb-E" se caracteriza por
la substitución de ácido glutámico por lisina en la posición 121ª
de la cadena \beta de Hb-A.
"Hb-H" se caracteriza por un homotetrámero de
la cadena \beta. "Hb-I" resulta de la
substitución de lisina por ácido glutámico en la posición 16ª de la
cadena \alpha. "Hb-Kansas" se caracteriza por
la substitución de asparagina por treonina en la posición 102ª de
la cadena \beta de Hb-A. Estas hemoglobinopatías
pueden afectar a la plasticidad y la conformación de eritrocitos
que contienen la hemoglobina mutante, así como a su afinidad por el
oxígeno. Las talasemias dan como resultado que se exprese una
cantidad de \beta-globina menor que la normal a
partir del locus afectado, o la expresión de una forma mutante de
\beta-globina que se sintetiza ineficazmente o es
catabolizada rápidamente de modo que está disponible poca cantidad
para formar Hb funcional. Un paciente que combine
Hb-S con una \beta-talasemia puede
tener poca o ninguna Hb-A normal presente para
contrarrestar los efectos del gen de Hb-S simple, y
así puede tener el equivalente funcional de SCD.
Una cantidad "terapéuticamente eficaz" de
NO gaseoso, CO gaseoso o un compuesto que libera NO es una cantidad
o concentración suficiente para producir uno cualquiera o más de los
siguientes: (i) una reducción en la P_{50} de la hemoglobina del
paciente de al menos 2 mm de Hg; (ii) un desplazamiento hacia la
izquierda específicamente significativo en la ODC del paciente;
(iii) en el caso de la SCD, una disminución de 10% o más en el
número de eritrocitos que se deforman bajo condiciones hipóxicas
(definido como una P_{a}O_{2} de menos de 50 mm de Hg); o (iv)
en el caso de un paciente que presente crisis de células
falciformes, una disminución clínicamente significativa en el dolor
sufrido por el paciente en un momento anterior a que pudiera
esperarse que la crisis se resolviera naturalmente.
La invención proporciona un método simple,
rápido y eficaz para tratar a un paciente que se identifica que
tiene una hemoglobinopatía. Los eritrocitos que tienen hemoglobina
normal no están afectados significativamente por el método de
tratamiento, al menos a niveles por debajo de 100 ppm de NO y 35 ppm
de CO, de modo que el método es seguro para usar incluso en
heterocigotos. Los efectos terapéuticos del tratamiento (por
ejemplo, una reducción en P_{50}) persisten incluso después de
que la hemoglobina ya no se exponga a la fuente de NO o CO. En
contraste con los métodos convencionales para tratar crisis de
células falciformes, que ofrecen solo terapia de apoyo, la
invención puede usarse para prevenir o invertir crisis de células
falciformes reduciendo la polimerización de Hb-S y
así la formación de células que han tomado forma de hoz
recientemente. Debido a que tal formación de células falciformes
puede correlacionarse con el nivel de dolor, la morbidez y la
mortalidad resultantes de la crisis de células falciformes, la
invención mitiga las complicaciones físicas asociadas con la SCD,
de una manera no invasiva.
La Fig. 1 es una representación esquemática de
un circuito de respiración que puede usarse para proporcionar el
gas terapéutico que contiene NO a un paciente en un entorno
clínico.
La Fig. 2 es una representación gráfica de la
P_{50} de eritrocitos Hb-A y Hb-S
humanos recientes enteros después de la exposición in vitro
a aire sin NO, o después de la exposición a 80 ppm de NO en
aire.
La Fig. 3 es una representación gráfica de la
ODC y la P_{50} de eritrocitos Hb-S humanos en
aire y en 80 ppm de NO en aire in vitro. El tratamiento con
NO provoca un desplazamiento hacia la izquierda en la ODC y una
disminución en la P_{50} de eritrocitos Hb-S.
La Fig. 4 es una representación gráfica de la
P_{50} de eritrocitos Hb-S humanos después de la
exposición in vitro a 80 ppm de NO en aire durante diversos
espacios de tiempo (se muestran datos de dos pacientes). Cinco
minutos de tratamiento con NO reducen significativamente la P_{50}
de Hb-S, mientras que el tratamiento con NO
adicional tiene poco si es que tiene algún efecto adicional.
La Fig. 5 es una representación gráfica del
porcentaje de eritrocitos Hb-S humanos falciformes
como una función del porcentaje de saturación de hemoglobina con
oxígeno, en presencia de aire u 80 ppm de NO. El tratamiento con NO
in vitro (80 ppm) disminuye el porcentaje de células
falciformes a todas las concentraciones de oxihemoglobina.
La Fig. 6 es una representación gráfica del
porcentaje de células de apariencia normal (en oposición a células
deformadas o células falciformes) como una función del porcentaje de
saturación de hemoglobina con oxígeno, en presencia de aire u 800
ppm de NO en aire. Más células tratadas con NO tenían una apariencia
normal que las células que se exponían solo a aire.
La Fig. 7 es un gráfico de barras que ilustra la
disminución progresiva en la P_{50} cuando eritrocitos obtenidos
de dos pacientes con SCD se trataban in vitro con
concentraciones progresivas de NO en aire. 1 = 0 ppm de NO; 2 = 10
ppm de NO; 3 = 40 ppm de NO; 4 = 80 ppm de NO.
La Fig. 8 es una gráfica que muestra que el NO
inhalado incrementa la afinidad de los glóbulos rojos por el
oxígeno en pacientes SS (es decir, pacientes de SCD). La reducción
promedio de la P_{50} de los glóbulos rojos en diez estudios con
nueve pacientes SS estables (\square) era aproximadamente 5 mm de
Hg (intervalo 3-7 mm de Hg; p<0,001) después de
que los pacientes respiraran 80 ppm de NO durante 45 minutos. En un
paciente SS, la P_{50} de los glóbulos rojos no cambiaba. Los
adultos normales (\bullet) no mostraban cambio (\leq1 mm de Hg)
en la P_{50} de los glóbulos rojos después de respirar NO,
indicando que los efectos del NO son selectivos para pacientes que
tienen una hemoglobinopatía.
Se tomaron muestras de sangre de tres pacientes
AA y cinco SS mientras respiraban aire una hora después de que se
hubiera interrumpido la respiración de NO. La reducción en la
P_{50} de los glóbulos rojos se mantuvo durante al menos una hora
en tres de cinco pacientes SS. En todos los pacientes, los niveles
de 2,3-DPG y ATP intraeritrocíticos, el pH venoso y
las tensiones de gases sanguíneos no cambiaban después de 45 minutos
de respirar óxido nítrico. En todos los sujetos, no se apreciaban
efectos secundarios clínicos. El nivel de methemoglobina medio
después de 45 minutos de respirar NO era bajo (1,4 \pm 0,5%) para
glóbulos rojos SS y el nivel de methemoglobina volvía a la línea de
base después de 60 minutos, aun cuando los efectos de la terapia
con NO sobre la afinidad por el oxígeno persistieran en tres de los
cinco pacientes SS evaluados.
La invención puede usarse para tratar a un
paciente que se identifica que tiene cualquiera de una variedad de
hemoglobinopatías caracterizadas por una afinidad reducida de la
hemoglobina del paciente por el oxígeno, en comparación con la
afinidad por el oxígeno de hemoglobina de adulto normal. Esta
afinidad reducida por el oxígeno se detecta típicamente como un
desplazamiento hacia la derecha en la ODC de la hemoglobina
afectada, en comparación con la ODC de Hb-A, o por
un incremento en la P_{50} de la hemoglobina afectada, en
comparación con la P_{50} de Hb-A. Tal afinidad
reducida por el oxígeno es característica de hemoglobinas anormales
tales como trastorno Hb-S (observado en la forma
homocigótica como SCD y en la forma heterocigótica como rasgo de
células falciformes), Hb-C, Hb-D,
Hb-E, Hb-H, Hb-I o
Hb-Kansas. Un paciente puede ser homocigótico o
heterocigótico para el gen mutante. Ocasionalmente, un paciente
será un "heterocigoto mixto" que tiene dos genes de
\beta-globina mutantes diferentes. Ejemplos
incluyen las siguientes combinaciones: S/C, S/D,
S/O-Arab, S/Quebec-Chori,
S/\beta-talasemia, S/E, S/Lepore y otras
descritas en Kinney y Ware, Compound Heterozygous States,
Capítulo 29 en Sickle Cell Disease: Basic Principles and
Clinical Practice, Ed. Stephen H. Embury y otros, Raven Press,
Ltd., Nueva York (1994), incorporado aquí mediante referencia.
Métodos y criterios convencionales, incluyendo observaciones
clínicas, análisis genéticos, análisis de proteínas, análisis de ODC
y análisis de P_{50}, pueden usarse para identificar a un
paciente que tiene tal hemoglobinopatía, incluyendo pacientes con
tipos de hemoglobinopatías todavía por descubrir. Se describen
posteriormente pruebas in vitro simples para determinar si es
probable que una hemoglobinopatía dada responda al tratamiento de
acuerdo con la invención. Alternativamente, podría probarse el
tratamiento directamente en el paciente.
En un aspecto de la invención, NO gaseoso o una
combinación de NO y CO se proporciona al paciente para la
inhalación. El uso de NO se describe posteriormente; principios
similares se aplican al uso de una combinación de CO y NO. NO
gaseoso o CO gaseoso comprimido puede obtenerse de un suministrador
comercial, tal como Airco (Murray Hill, N.J.) o Air Products and
Chemicals, Inc. (Allentown, PA). Típicamente, el NO se proporciona
como una mezcla de 200-2000 ppm de NO en N_{2} u
otro gas inerte tal como helio. Es preferible almacenar el NO como
una mezcla que está libre de O_{2}, debido a que el O_{2} puede
reaccionar con NO para formar óxidos de nitrógeno superiores
tóxicos tales como NO_{2}. Si se desea, el gas que contiene NO
puede mezclarse con aire u O_{2} inmediatamente antes de
proporcionar la mezcla para inhalación. Rotámetros calibrados que
se han calibrado previamente con un espirómetro pueden usarse para
mezclar cantidades precisas del gas que contiene NO con aire u
O_{2}, particularmente en un entorno hospitalario. Generalmente,
un gas terapéutico que incluye al menos 21% de oxígeno así como un
nivel terapéutico de NO y/o CO es adecuado para usar en la
invención. La concentración de CO puede determinarse, si se desea,
usando técnicas de detección de infrarrojos estándar. Para limitar
la formación de óxidos de nitrógeno superiores, el NO debe estar en
contacto con oxígeno durante menos de aproximadamente 10 minutos (y
preferiblemente menos de 5 minutos) antes de la inhalación del gas
terapéutico por el paciente. Si se desea, pueden usarse métodos
quimioluminiscentes estándar para medir la cantidad de NO y/o
NO_{2} en el gas terapéutico antes de administrar el gas a un
paciente (véase, por ejemplo, Fontijin y otros, 1970, Anal. Chem.
42:575-579). El NO_{2} puede eliminarse antes de
proporcionar el gas terapéutico al paciente. Métodos de eliminación
apropiados incluyen exponer el gas a soluciones de NaOH, Baralyme o
cal sodada. Estos métodos de eliminación también pueden usarse para
extraer NO_{2} del gas que es exhalado por el paciente, si se
desea, de modo que el NO_{2} no se introduzca a la atmósfera.
El modo preferido de suministrar el gas
terapéutico al paciente es mediante flujo continuo, por ejemplo, en
un circuito de respiración con máscara, en vez de mezcladura
estática en un receptáculo tal como una bolsa de Douglas. Un
circuito de respiración ejemplar se muestra esquemáticamente en la
Fig. 1. Este circuito incluye una fuente de una mezcla presurizada
de NO gaseoso en N_{2}, una fuente de aire u O_{2} gaseoso
conectada a un mezclador para introducir el aire o el O_{2} en el
circuito, un analizador de NO para verificar la concentración de NO
en el gas terapéutico y una válvula en T que no es de respiración
cíclica, que conduce al paciente. Los gases exhalados pueden
eliminarse, si se desea, mediante el sistema de vacío del hospital.
Las concentraciones de NO y NO_{2} dentro del circuito de
respiración pueden analizarse electroquímicamente con detectores
disponibles comercialmente (por ejemplo, el detector de NO de
Exidyne Instrumentation Technologies (modelo Nº 4586) y el detector
de NO_{2} (modelo Nº 4584); Exton, PA). La concentración de
oxígeno puede verificarse con un analizador de oxígeno en línea, si
se desea.
Como una alternativa a usar un circuito de
respiración con máscara, puede usarse un dispositivo inhalador
portátil (con o sin un tubo de respiración cíclica) para
proporcionar el NO al paciente. Ejemplos de dispositivos
inhaladores adecuados que podrían adaptarse para los métodos de la
invención se describen en WO 92/10228 y en las Patentes de EE.UU.
Nº 5.485.827, 5.396.882, 4.667.668; 4.592.348; 4.534.343 y
4.852.561, cada una de las cuales se incorpora aquí mediante
referencia. Otros dispositivos inhaladores se describen en the
Physicians' Desk Reference, Edward R. Barnhar, Publisher.
Generalmente, los dispositivos inhaladores adecuados son portátiles,
es decir, menos de 5 kg y preferiblemente menos de 1 kg, y pueden
ser de un diseño similar a los inhaladores disponibles actualmente
para el tratamiento de ataques de asma. El dispositivo contiene
cualquiera o ambos de (a) NO o CO gaseoso presurizado y (b) un
compuesto liberador de NO. Típicamente, tal dispositivo incluirá un
gas presurizado que contiene al menos 1 ppm (preferiblemente al
menos 5 ppm, más preferiblemente al menos 40 y lo más
preferiblemente al menos 80 ppm) de NO o CO. La concentración de NO
o CO en el gas presurizado puede ser relativamente alta, por
ejemplo 160, 300, 500 ó 1000 ppm. Se contempla que podrían usarse
concentraciones tan altas o incluso superiores a 1500 ppm y 2000
ppm. Si se desea, el dispositivo puede contener una mezcla de NO
gaseoso presurizado y un gas inerte tal como N_{2} o un propelente
líquido tal como un fluorocarbono, por ejemplo freón.
Antes de administrar el gas terapéutico al
paciente, la sangre del paciente puede analizarse, si se desea,
para establecer una línea de base frente a la que puede compararse
la sangre tratada con NO. Típicamente, una muestra de 10 ml de
sangre se extraerá en una jeringa heparinizada y se medirán la
hemoglobina, el hematocrito, la saturación de oxígeno y/o la
saturación de methemoglobina. La ODC, la P_{50} y/o el nivel de
nitrosación de la hemoglobina del paciente y/o la concentración de
2,3-difosfoglicerato en eritrocitos pueden medirse
antes de que se inhale el gas terapéutico. Además, una parte
alícuota de la muestra de sangre puede analizarse con respecto al
grado de formación como hoces de los eritrocitos. Cualquiera o la
totalidad de estos parámetros pueden medirse de nuevo después de la
inhalación del gas terapéutico para proporcionar una medida de la
eficacia terapéutica del gas inhalado. Si se desea, la saturación
de oxígeno de la sangre del paciente puede verificarse mediante
oximetría pulsatoria mientras el paciente respira el gas
terapéutico. Si se desea, muestras de sangre adicionales pueden
extraerse a lo largo del tiempo, a medida que el paciente continúa
respirando el gas terapéutico.
Típicamente, el paciente respirará el gas
terapéutico durante al menos 1 minuto y habitualmente durante de 5
a 30 minutos cuando se están empleando niveles de NO por debajo de
500 ppm (por ejemplo, 80 ppm). Cuanto menor sea la concentración de
NO, mayor puede ser el período de inhalación; por ejemplo, la
inhalación puede ser continua durante más de 24 horas a un nivel
relativamente bajo de 40 u 80 ppm. Pueden usarse niveles de NO
superiores para períodos de tiempo cortos. Si no se detecta
toxicidad (por ejemplo, en la forma de methemoglobinemia
significativa (más de 10%)), el uso de tales niveles superiores
puede extenderse o repetirse según sea necesario durante el
transcurso de un día. Se prevé que algunas hemoglobinopatías puedan
beneficiarse de un tratamiento profiláctico regular con NO o CO,
por ejemplo, tres o más veces al día a lo largo de la vida del
paciente, con tratamientos adicionales siempre que el riesgo de una
crisis sea alto.
Se espera que el CO pueda usarse a una
concentración de 50-100 ppm durante períodos
indefinidos de tiempo, y concentraciones superiores (por ejemplo,
200-500) durante períodos intermedios (tales como
una hora). Cuando se usan CO y NO en combinación, el CO podría
usarse en una concentración de 1-100 ppm y el NO en
una concentración de 1-80 ppm, aunque pueden
emplearse dosis superiores o inferiores cuando esté justificado.
Aunque el régimen terapéutico óptimo para
cualquier paciente dado depende de factores tales como el tipo de
hemoglobinopatía padecido y la gravedad del estado de enfermedad que
presente el paciente, un régimen de terapia adecuado típico implica
respirar un gas terapéutico (que contiene de 2 a 160 ppm de NO o CO)
durante al menos un período de 5 minutos al día durante al menos 10
días consecutivos. Alternativamente, el paciente podría respirar
una concentración muy superior de NO o CO (por ejemplo,
300-2000 ppm) durante un tiempo más corto (por
ejemplo, tan corto como una sola respiración) de una vez a varias
veces al día, según sea necesario. Cuando el paciente está en
crisis de células falciformes, se espera que niveles altos de NO
sean necesarios continuamente basándose en la emergencia hasta que
haya pasado la crisis inmediata. Un paciente con riesgo
significativo de incurrir en una crisis de células falciformes (por
ejemplo, durante una exposición hipóxica esperada) debe mantenerse
con un nivel de NO o CO adecuado para evitar o al menos reducir la
gravedad de la crisis, tanto como continúe el riesgo. Debido a que
un paciente con enfermedad de células falciformes que haya de
someterse a cirugía (por ejemplo, para extirpar un bazo dañado)
tiene alto riesgo de incurrir en una crisis durante o
inmediatamente después de la cirugía, se recomienda que tales
pacientes estén provistos del gas terapéutico durante y después de
la cirugía y preferiblemente también inmediatamente antes de la
cirugía (para cargar la hemoglobina del paciente con
NO).
NO).
Además de emplear NO o CO gaseosos, puede usarse
un compuesto liberador de NO para aportar una cantidad
terapéuticamente eficaz de NO a la hemoglobina del paciente.
Ejemplos de compuestos liberadores de NO adecuados incluyen
S-nitrosotioles tales como
S-nitroso-N-acetilpenicilamina
(SNAP) y S-nitrocisteína; nitroprusiato;
nitrosoguanidina; trinitrato de glicerilo; azida; hidroxilamina y
cualquier compuesto de NONOato. Los criterios para seleccionar
compuestos liberadores de NO adicionales incluyen su estabilidad
durante el almacenamiento antes de la inhalación y su capacidad
para descomponerse para liberar NO a una velocidad terapéuticamente
beneficiosa durante la inyección, el aporte oral o la deposición en
la parte apropiada del tracto respiratorio. Por ejemplo, se ha
mostrado que la SNAP es estable en su forma sólida, pero las
condiciones fisiológicas (tales como en la película de fluido
fisiológico sobre la superficie de la luz bronquional o alveolar),
el compuesto se descompone fácilmente para liberar NO (Ignarro,
Circ. Res. 65:1-21, 1989).
Un compuesto liberador de NO puede administrarse
al paciente mediante cualquiera de una variedad de rutas,
incluyendo inyección intravenosa, inyección intraarterial, aporte
transcutáneo, aporte oral o inhalación. Para la inhalación, el
compuesto liberador de NO puede envasarse en un dispositivo
inhalador, tal como uno de los dispositivos descritos
anteriormente, o puede aportarse a través de un circuito de
respiración tal como el descrito anteriormente. Para facilitar el
aporte, el compuesto liberador de NO puede disolverse en un
excipiente biológicamente compatible (por ejemplo, agua o solución
salina). Alternativamente, el compuesto liberador de NO puede
proporcionarse en forma de polvo. Cuando un compuesto liberador de
NO se inhala en forma sólida o líquida, las partículas o gotículas
se depositan en todo el sistema respiratorio, tendiendo a
depositarse partículas o gotículas mayores cerca del punto de
entrada (es decir, la boca o la nariz) y transportándose
progresivamente las partículas o gotículas menores más adelante en
el sistema respiratorio antes de depositarse en la traquea, los
bronquios y finalmente los alveolos. (Véase, por ejemplo, Hounman
& Morgan, "Particle Deposition" Capítulo 5 en
Respiratory Defense Mechanisms, Part 1, Marcel Dekker, Inc.,
NY; ed. Brain y otros, 1977, p. 125). Un tamaño de
partícula/gotícula de 10 \mum o menos se recomienda para usar en
la invención.
La dosificación óptima del compuesto liberador
de NO para cualquier paciente dado puede determinarse fácilmente y
dependerá de factores tales como la naturaleza del compuesto, el
tipo de hemoglobinopatía y la gravedad del estado de enfermedad.
Cuando se proporciona el compuesto liberador de NO para inhalación,
puede estar en forma sólida o líquida. Una dosificación típica para
un adulto sería aproximadamente 1-5 mg,
independientemente de la ruta de aporte.
Para aportar NO o CO a la sangre de un paciente
ex vivo o in situ, podría adaptarse un aparato de
ECMO, IVOX o CPB estándar para usar un gas que contiene no solo
O_{2} sino también NO y/o CO en una concentración terapéuticamente
eficaz. Típicamente, la sangre del paciente se extrae continuamente
del paciente y se bombea a través del intercambiador de gas ex
vivo, devolviéndose a continuación al paciente. A medida que la
sangre pasa por la membrana permeable a los gases que la separa del
gas terapéutico, moléculas de NO y CO que han sido absorbidas a
través de la membrana entran en la sangre y a continuación
interactúan con la hemoglobina de los eritrocitos. Intercambiadores
in situ tales como IVOX se ponen directamente en la
vasculatura del paciente, en vez de requerir que la sangre sea
bombeada fuera del cuerpo. Otros tipos de dispositivos no diseñados
específicamente para el aporte en la sangre, pero que podrían
adaptarse para el aporte de NO a la sangre de un paciente que lo
necesite, se describen en la solicitud de propietario común USSN
08/036.522, incorporada aquí mediante referencia.
Los experimentos analizados posteriormente
demuestran que la exposición de eritrocitos Hb-S a
niveles atóxicos de NO provoca un desplazamiento hacia la izquierda
en la ODC y una disminución en la P_{50} de la hemoglobina,
indicando que la terapia con NO altera la capacidad de la
hemoglobina anormal para unirse a y liberar oxígeno de modo que se
asemeja más estrechamente a Hb-A. Durante la terapia
con NO, la PO_{2} a la que la hemoglobina normal se desnaturaliza
(es decir, cede su molécula de O_{2}) disminuye. Así, la relación
de Hb-S insaturada a saturada a una presión parcial
de oxígeno dada se reduce durante la terapia con NO. Puesto que la
Hb-S es menos propensa a polimerizarse si está
transportando O_{2}, la probabilidad de que Hb-S
se polimerice a una presión parcial de O_{2} dada se reduce
durante la terapia con NO, con una disminución concomitante en la
formación como hoces de los eritrocitos. Además, los datos
analizados posteriormente sugieren que la terapia con NO puede
afectar directamente a interacciones heme-heme o
provocar un cambio conformacional en la Hb-S
(posiblemente formando un aducto de NO), disminuyendo la tendencia
de Hb-S a polimerizarse independientemente de su
efecto sobre la ODC de Hb-S. Así, se cree que el
tratamiento con NO tiene un efecto beneficioso adicional al
prevenir la polimerización de Hb-S y la formación
como hoces de eritrocitos independientemente de su efecto sobre la
afinidad por el oxígeno, de modo que aun cuando la
Hb-S tratada con NO ceda su O_{2}, los eritrocitos
todavía no toman forma de hoces tan fácilmente.
Experimento
I
Este experimento demuestra que la exposición de
eritrocitos a niveles atóxicos de NO reduce la P_{50} (es decir,
provoca un desplazamiento hacia la izquierda en la ODC) cuando las
células contienen Hb-S, pero no cuando contienen
solamente Hb-A normal. Eritrocitos humanos
recientemente extraídos de pacientes con SCD o controles normales
se lavaron en solución de Colin estándar y se expusieron a 80 ppm de
NO gaseoso en aire durante 15 minutos, usando un tonómetro de
sangre/gas. Usando un analizador automático de la disociación de
oxígeno sanguíneo, la ODC de la hemoglobina se midió tanto antes
como después de la exposición de los eritrocitos a NO. Según se
ilustra en la Fig. 2, la exposición de eritrocitos normales
(Hb-A) a 80 ppm de NO bajo estas condiciones no da
como resultado un cambio significativo en el valor de P_{50} de
Hb-A de 26 mm de Hg. En contraste, la exposición de
Hb-S a 80 ppm de NO en aire provoca una reducción
significativa en el valor de P_{50} de Hb-S en
comparación con la P_{50} de Hb-S en aire solo.
Según se ilustra en la Fig. 2 y en la ODC mostrada en la Fig. 3, la
P_{50} de glóbulos rojos de un paciente con enfermedad de células
falciformes que contienen Hb-S (y posiblemente
otras hemoglobinas, por ejemplo, Hb-C) en aire era
32,5 mm de Hg, mientras que la P_{50} después de la exposición a
NO se reducía hasta 26 mm de Hg. Estos datos también indican que,
según se esperaba, la P_{50} sin exposición a NO de glóbulos rojos
que contenían Hb-S (30,5 mm de Hg) era elevada, con
relación a la P_{50} sin exposición a NO de glóbulos rojos que
contenían Hb-A (27 mm de Hg). Según se muestra en
la Tabla 1, la exposición a NO inducía a una disminución en la
P_{50} de eritrocitos Hb-S que persiste durante
al menos una hora después de que se interrumpa el tratamiento con
NO. Otros experimentos muestran que esa disminución persiste
durante al menos dos horas.
| Exposición Secuencial de Glóbulos Rojos Hb-S | P_{50} |
| Aire (línea de base) | 35 mm de Hg |
| Aire con 80 ppm NO x 15 minutos | 30 mm de Hg |
| Aire x 15 minutos, después de cortar el NO | 30 mm de Hg |
| Aire x 30 minutos, después de cortar el NO | 30 mm de Hg |
| Aire x 60 minutos, después de cortar el NO | 30 mm de Hg |
Experimento
II
Este experimento ilustra que una exposición a 80
ppm de NO en un tonómetro durante menos de cinco minutos es
suficiente para provocar una reducción significativa en la P_{50}
de células que contienen Hb-S. Muestras de
eritrocitos de dos pacientes diferentes con SCD se expusieron a 80
ppm de NO y a aire, durante diversos espacios de tiempo (1, 5, 30 y
60 minutos) y los valores de P_{50} se determinaron.
Aunque la exposición de eritrocitos
Hb-S a 80 ppm de NO durante 1 minuto no alteraba
substancialmente la P_{50} de estas células (Fig. 4), la
exposición de eritrocitos Hb-S a 80 ppm de NO
durante tan poco como 5 minutos conducía a una reducción
significativa en la P_{50} para las muestras de ambos pacientes
(mostrado como líneas separadas en la Fig. 4). Exponer los
eritrocitos a 80 ppm de NO durante 30 ó 60 minutos mantenía la
reducción observada pero no provocaba una reducción adicional
significativa en la P_{50} más allá de la observada con una
exposición de 5 minutos. Exponer los eritrocitos que contienen
Hb-S a aire sin NO durante hasta 60 minutos no
producía cambio significativo en la P_{50} a lo largo del tiempo
(datos no mostrados).
Experimento
III
Este experimento ilustra cómo la concentración
de oxihemoglobina afecta a la capacidad de NO para reducir la
P_{50} de Hb-S. En estos experimentos, dos
matraces que contenían eritrocitos Hb-S humanos se
incubaron en un baño de agua a 37ºC. La concentración de O_{2}
del gas en cada matraz se disminuyó en etapas a intervalos de una
hora desde 20% hasta 16%, 12%, 8%, 4% y a continuación 0% de
O_{2}. Un grupo de matraces también contenía 80 ppm de NO a lo
largo del experimento y ambos grupos contenían 5% de CO_{2} a lo
largo del experimento. Las muestras de eritrocitos se retiraron de
cada matraz después de cada hora (es decir, con cada reducción en
la concentración de oxígeno). Las concentraciones de oxihemoglobina
y methemoglobina se determinaron mediante oximetría de múltiples
longitudes de onda (usando un aparato Ciba-Corning
Co-Oximeter Modelo 270 y métodos convencionales).
La morfología de las células se evaluó usando microscopía óptica
para determinar el porcentaje de eritrocitos normales, deformados y
falciformes en cada muestra. Las células deformadas se definen como
células que no tienen la conformación típica de células normales o
células falciformes.
Según se ilustra en la Fig. 5, el tratamiento
con NO disminuye el porcentaje de células falciformes a todas las
concentraciones de oxihemoglobina. Los eritrocitos expuestos a NO
incurrían en 10%-15% de menos formación de células falciformes que
los eritrocitos de control al mismo porcentaje de saturación de
oxígeno de la hemoglobina. Esto sugiere que 80 ppm de NO pueden
alterar interacciones "heme-heme" o producir su
cambio de conformación de la molécula de hemoglobina anormal de un
modo que es independiente del efecto sobre la afinidad por el
oxígeno, reduciendo la tendencia de la Hb-S para
polimerizarse a una saturación de oxígeno dada. Por otra parte, se
juzgó que un porcentaje de las células tratadas con NO superior que
las células de control era "normal" (en oposición a deformado
o falciforme) a cada porcentaje de saturación de oxígeno de
hemoglobina medido (Fig. 6).
Experimento
IV
Este experimento ilustra que incrementar las
concentraciones de NO produce un efecto creciente sobre la P_{50}
de eritrocitos que contienen Hb-S. Muestras de
eritrocitos de dos pacientes diferentes con SCD se expusieron a
aire (0 ppm de NO; ilustrado en la columna 1 en el gráfico de barras
de la Fig. 7) o a 10 ppm de NO (columna 2), 40 ppm de NO (columna
3) u 80 ppm de NO (columna 4) durante 5 minutos. A continuación se
determinaron los valores de P_{50}. Según se muestra en la Fig.
7, los valores de P_{50} para los eritrocitos de cada paciente
disminuían con la concentración creciente de NO.
Los experimentos analizados posteriormente
demuestran que la inhalación de NO incrementa la afinidad de los
glóbulos rojos para oxígeno en pacientes humanos diagnosticados de
tener SCD. Así, el NO altera la capacidad de la hemoglobina anormal
para unirse a y liberar oxígeno de modo que se asemeja más
estrechamente a Hb-A. En estos estudios, los
pacientes eran tres adultos varones normales de edades de
25-40 años (denominados aquí "AA") y nueve
(siete varones y dos mujeres) adultos clínicamente estables (edades
20-33 años) que eran homocigóticos para
Hb-S (denominados aquí "SS").
Brevemente, en sujetos con SCD, estos
experimentos muestran que respirar NO a 80 ppm en aire disminuía la
presión parcial de oxígeno a la que la hemoglobina se satura al 50%
con oxígeno. Incluso 60 minutos después de interrumpir la
respiración de NO, la P_{50} continuaba disminuyendo. Siguen
detalles de estos experimentos.
Se obtuvieron 50 microlitros de sangre entera
mediante venipunción de adultos AA o SS y se diluyeron con 4 ml de
tampón de fosfato, 10 \mul de solución antiespumante y 20 \mul
de albúmina al 20%. Las muestras de sangre se desnaturalizaron
mediante exposición a nitrógeno (N_{2}) gaseoso al 100% y a
continuación se reoxigenaron con aire usando un analizador Hemox
(TCS Medical Products Company, Huntingdon Valley, PA) para medir la
ODC usando métodos convencionales (Guarnone y otros, 1995,
Haematologica, 80:426-430). La P_{50} se
determinó como la presión parcial de oxígeno a 50% de saturación de
oxihemoglobina. Para asegurar la exactitud de medidas repetidas a
lo largo del tiempo usando glóbulos rojos de SS, muestras de sangre
obtenidas de tres pacientes SS se midieron a 0, 15, 30 y 60 minutos
sin exposición a NO gaseoso; no se detectaron cambios en la
P_{50}.
Se estudiaron tres adultos normales y nueve SCD.
Un paciente SS se estudió dos veces, con un intervalo de tiempo de
un mes entre estudios. La presión sanguínea, los
electrocardiogramas, los ritmos respiratorios y cardíacos y la
oximetría pulsatoria se verificaron continuamente. Los sujetos
respiraban aire y a continuación 80 ppm de NO en aire a través de
un circuito sin respiración cíclica durante 45 minutos. Sangre
venosa se muestreó antes e inmediatamente después de la respiración
de NO. Los sujetos normales y cinco pacientes de SCD tenían una
muestra de sangre adicional extraída una hora después de la
respiración de NO. Las ODCs se midieron ex vivo, según se
describe anteriormente.
Además, las concentraciones de trifosfato de
adenosina (ATP) y 2,3-difosfoglicerato (DPG) en
glóbulos rojos se determinaron usando métodos estándar (Poillon y
otros, 1985, J. Biol. Chem 260:13897-13900). La
methemoglobina se midió usando un CO-Oximeter
(Ciba-Corning Modelo 270, Mayfield, MA) y técnicas
estándar antes y después de la exposición de los glóbulos rojos a
NO. El pH venoso y los gases sanguíneos se midieron usando un
analizador de pH/gases sanguíneos (Ciba-Corning
Modelo 170, Mayfield, MA) y técnicas estándar.
Los datos presentados posteriormente se expresan
como media \pm MEE, excepto cuando se indica. Se usaron pruebas t
de Student pareadas y desapareadas, indicando significación
estadística un valor de P de menos de 0,05. Todas las pruebas eran
de dos colas. Las correlaciones se evaluaron computando el
coeficiente de correlación de Pearson.
Para mostrar que bajas concentraciones de NO
alteran la Hb-S in vivo, la P_{50} en
glóbulos rojos de pacientes AA y SS se midió antes y después de que
los pacientes respiraran 80 ppm de NO en aire durante 45 minutos.
En pacientes SS que respiraban 80 ppm de NO, la P_{50} de los
glóbulos rojos se disminuía (P<0,001), con una reducción
promedio de 4,6 \pm 2 mm de Hg (Fig. 8). En contraste, la P_{50}
de los glóbulos rojos de pacientes AA que respiraban NO no cambiaba
(\leq1 mm de Hg; P=NS), indicando que el efecto del NO es
selectivo para glóbulos rojos en pacientes que tienen una
hemoglobinopatía. El paciente SS que se estudiaba dos veces (con un
mes entre estudios) tenía una reducción significativa en la P_{50}
en ambas ocasiones. En resumen, estos datos muestran que respirar
NO incrementa la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno en
glóbulos rojos de pacientes que tienen enfermedad de células
falciformes.
Para demostrar que respirar NO afecta a la
P_{50} incluso después de que se interrumpa la terapia con óxido
nítrico, la ODC de cinco pacientes SS se midió una hora después de
que se interrumpiera la inhalación de NO. En tres de los cinco
pacientes, la P_{50} de los glóbulos rojos permanecía disminuida,
indicando que el efecto de NO sobre la afinidad por el oxígeno de
glóbulos rojos de SS persiste después de que se interrumpa el NO
(Fig. 8).
Para todos los pacientes que respiraban 80 ppm
de NO en aire durante 45 minutos, las concentraciones de ATP y
2,3-DPG en los glóbulos rojos de los pacientes no
cambiaban en respuesta al NO. Además, la presión sanguínea, los
ritmos respiratorio y cardíaco, los niveles de saturación de oxígeno
transcutáneos (S_{p}O_{2}), el pH de la sangre venosa y los
datos de los electrocardiogramas de los pacientes estaban
inalterados durante la respiración de NO. Los pacientes con
glóbulos rojos SS tenían un nivel de methemoglobina de la línea de
base superior (0,5 \pm 0,2%) que los pacientes con glóbulos rojos
AA (0,1 \pm 0,1%). La exposición a NO conducía a un pequeño
incremento en los niveles de methemoglobina tanto en glóbulos rojos
SS (1,4 \pm 0,7%) como en glóbulos rojos AA (0,7 \pm 0,1%); 60
minutos después de la exposición a NO, estos niveles de
methemoglobina volvían casi a niveles de la línea de base (0,6
\pm 0,3% y 0,2 \pm 0,1%, para pacientes SS y AA,
respectivamente). No existía correlación entre el incremento en los
niveles de methemoglobina y la disminución en los valores de
P_{50} (r = 0,02, n = 10). De hecho, el cambio en la P_{50}
persistía a los 60 minutos después de la exposición a NO en tres de
cinco pacientes SS probados, mientras que los niveles de
methemoglobina habían vuelto hasta valores de la línea de base. En
resumen, estos datos muestran que el NO puede administrarse a
niveles terapéuticamente eficaces sin conducir a niveles de
methemoglobina significativos y sin provocar consecuencias
significativamente perjudiciales para la estadística vital de los
pacientes.
Los experimentos in vitro e in
vivo descritos anteriormente demuestran que la afinidad del
oxígeno para la hemoglobina se incrementa cuando los glóbulos rojos
SS se exponen a bajas concentraciones de óxido nítrico. Esta
afinidad incrementada por el oxígeno persistía durante al menos dos
horas in vitro y al menos una hora in vivo después de
cesar la administración de óxido nítrico. Estos efectos terapéuticos
del tratamiento con NO se obtuvieron sin producir niveles
clínicamente significativos de methemoglobina. Así, estos datos
muestran que la inhalación de óxido nítrico gaseoso puede ser una
terapia eficaz para tratar hemoglobinopatías que se caracterizan
por (a) una afinidad disminuida de la hemoglobina del paciente por
el oxígeno en comparación con la afinidad por el oxígeno de
hemoglobina de adulto normal, o (b) una tendencia de los eritrocitos
del paciente a tomar forma de hoz.
Otras modalidades están dentro de las siguientes
reivindicaciones.
Claims (25)
1. Uso de óxido nítrico (NO) gaseoso para la
fabricación de un gas terapéutico para la inhalación por un paciente
que se ha identificado que tiene una hemoglobinopatía
caracterizada por (a) una afinidad reducida de la hemoglobina
del paciente por el oxígeno en comparación con la afinidad por el
oxígeno de hemoglobina de adulto normal (Hb-A), o
(b) una tendencia de los eritrocitos del paciente a tomar forma de
hoz, para el tratamiento de dicho hemoglobinopatía.
2. Uso de NO gaseoso para la fabricación de un
gas terapéutico para la inhalación por un paciente, cuyos
eritrocitos comprenden hemoglobina de células falciformes
(Hb-S), en el que dicho NO disminuye la
polimerización de Hb-S en dicho paciente.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que el gas terapéutico contiene NO en
una concentración de al menos 1 ppm.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en
el que el gas terapéutico contiene NO en una concentración de al
menos 10 ppm.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en
el que el gas terapéutico contiene NO en una concentración de
40-2000 ppm.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en
el que la concentración de NO en el gas terapéutico está entre
aproximadamente 10 y aproximadamente 100 ppm.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el que la concentración de NO en el gas terapéutico está entre
aproximadamente 40 y aproximadamente 100 ppm.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que la concentración de NO en el gas
terapéutico es aproximadamente 80 ppm y el gas terapéutico se
proporciona al paciente durante al menos un período de 45
minutos.
9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el gas terapéutico proporcionado
para la inhalación comprende además oxígeno, estando el oxígeno en
contacto con el NO en el gas terapéutico durante menos de
aproximadamente 10 minutos antes de la inhalación del gas
terapéutico por el paciente.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que el gas terapéutico comprende al menos 21% de oxígeno.
11. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que durante la administración se
verifica la concentración de NO o la concentración de NO_{2} en el
gas terapéutico.
12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el gas terapéutico se expone a
un eliminador de NO_{2} antes de la administración al
paciente.
13. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que el gas terapéutico no comprende
más de 5 ppm de NO_{2}.
14. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3 a 13, en el que dicha hemoglobinopatía es
enfermedad de células falciformes.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14,
en el que antes de la administración del gas terapéutico, se
identifica que el paciente tiene riesgo de incurrir o se diagnostica
que sufre una crisis de células falciformes.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la hemoglobinopatía se selecciona del grupo que consiste
en rasgo de células falciformes; trastornos de Hb-C,
Hb-D, Hb-E, Hb-H,
Hb-I y Hb-Kansas o una combinación
de Hb-S con un segundo alelo de
\beta-globina mutante.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el gas terapéutico está destinado a la administración en
ausencia de humo de tabaco.
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el gas terapéutico está destinado a la administración al
paciente durante al menos 10 segundos.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18,
en el que el gas terapéutico está destinado a la administración al
paciente durante al menos 5 minutos.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el gas terapéutico comprende además monóxido de carbono
(CO) gaseoso a una concentración de 1 a 10.000 ppm.
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la P_{50} de la hemoglobina del paciente se mide tanto
antes como después de la administración del gas terapéutico, en el
que una disminución en la P_{50} después de que se proporcione el
gas terapéutico, con relación a la P_{50} antes de que se
proporcione el gas terapéutico, es una indicación de la eficacia
terapéutica del gas terapéutico.
22. El uso de acuerdo con la reivindicación 14,
en el que el porcentaje de células falciformes en la sangre del
paciente se determina tanto antes como después de la administración
del gas terapéutico, en el que una disminución en el porcentaje de
células falciformes después de que se proporcione el gas, con
relación al porcentaje de células falciformes antes de que se
proporcione el gas, es una indicación de la eficacia terapéutica
del gas terapéutico.
23. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el nivel de nitrosación de Hb se determina después de que
se proporcione el gas terapéutico.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que la concentración de NO en el gas terapéutico es de 1 a
2.000 ppm y el gas terapéutico se proporciona al paciente al menos
una vez al día durante al menos diez días consecutivos.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el gas terapéutico se proporciona al paciente mientras el
paciente está sometido a cirugía o en una hora antes o después de la
cirugía.
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